CN114438260A - 猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重rt-pcr检测方法和试剂盒 - Google Patents

猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重rt-pcr检测方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT‑PCR检测方法和试剂盒，建立的一步法多重RT‑PCR方法对美洲型PRRSV毒株均可以扩增出约408bp、548bp、689bp特异性条带，至少扩增出一条带，对欧洲型毒株仅扩增出约408bp条带，25μL反应体系中3对引物最佳使用量均为0.5μL(10mmol/μL)，最佳退火温度为58℃，循环数为30～35个；对美洲型毒株的检测能力不低于25～50TCID50/mL，具有良好的敏感性；该方法对感染猪的常见重要病毒均未扩增出任何片段，说明特异性良好。本发明成功建立了PRRSV的一步法多重RT‑PCR检测方法，对美洲型毒株和欧洲型毒株均具良好的敏感性和特异性，值得组装成试剂盒推广应用，这为猪繁殖与呼吸综合征的快速准确诊断提供了有效的技术方法。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT-PCR检测方法和试 剂盒
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT-PCR检测方法和试剂盒。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)引起的一种母猪繁殖障碍，仔猪与育成猪出现呼吸系统症状和较高病死率的动物疫病。该病属于国家规定的二类动物疫病，是当前我国猪场威胁最大的常在病原之一。
PRRSV是单股正链有囊膜的RNA病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员，其基因组全长约15kb，编码至少10个开放阅读框(ORF)，基因组从5′端到3′端编码ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、 ORF4、ORF5a、ORF5～ORF7。ORF1a和ORF1b编码病毒的非结构蛋白(nonstructural protein,Nsp)，其中Nsp4在病毒的复制过程中对病毒蛋白表达与加工起核心作用，被称为主要蛋白酶。ORF2a、ORF2b 和ORFs3～7编码组成病毒粒子的结构蛋白(structural protein), 其中ORF4编码的GP4作为关键糖蛋白形成复合体参与病毒粒子，为病毒感染所必需；其中ORF1a编码NSP1b和NSP2蛋白，NSP2是最大的非结构蛋白，不同谱系病毒变异较大，经常发生突变、不同长度的缺失或者插入，导致产生复杂的重组病毒株，是不同基因亚型毒株的特征性标记，也是研究PRRSV流行病学关注度最高的靶基因之一。ORF5编码GP5蛋白，是PRRSV结构中一种糖基化蛋白，含有重要的保护性抗原基因，是研究PRRSV遗传演化的首选靶基因。ORF7编码非糖基化的核衣壳蛋白，又称N蛋白，具有很高的保守性，是早期感染诱导抗体产生的蛋白，是病原分子生物学诊断的首选靶点之一。
随着PRRSV流行毒株的变异加快和多毒株混合重组的严重现象，依赖单个靶基因的诊断极易造成漏检，容易误导养殖户防控蓝耳病。实验室常用的病原分子生物学诊断方法主要是PCR系列方法，最终诊断还得依赖基因测序技术。因此，建立多靶位基因的PRRSV的一步法多重RT-PCR检测诊断技术，既能提高诊断的灵敏度和准确性，又能将目的片段回收测序，便于病毒基因定型来确诊。
发明内容
1.要解决的技术问题
本发明的目的是为了解决现有技术中PRRSV的实验室诊断方法因毒株变异的复杂性容易造成漏检，单个基因的诊断方法敏感性和特异性较低的问题，而提出的猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重 RT-PCR检测方法和试剂盒。
2.技术方案
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT-PCR检测方法，包括以下步骤：
步骤1：实验材料的准备；
步骤2：实验仪器和试剂的选取；
步骤3：引物的设计与合成，比对分析NCBIGenBank数据库中近年来我国流行的欧洲型和美洲型PRRSV全基因序列，利用Lasergene 生物学软件，设计16对特异性引物，由北京擎科生物科技有限公司合成，引物稀释至10mmol/μL使用；
步骤4：引物的筛选，用设计的16对引物按照常规RT-PCR分别扩增PRRSV美洲型的高致病性毒株GSWW15、NADC30样毒株GSWW18、经典毒株VR2332的细胞毒和欧洲型EU细胞毒，筛选特异性较好的3 对引物；
步骤5：病毒核酸的提取，提取PRRSV、CSFV、SVA、FMDV的 RNA，以及疑似PRRSV感染的临床样本，经充分研磨后，4℃离心取上清提取病毒的总RNA；
步骤6：病毒滴度的测定，将Marc-145细胞接种于96孔板，10 倍倍比稀释GSWW15、GSWW18、VR2332毒株细胞培养物上清，并按每孔100μL接种于96孔板中的单层Marc-145细胞上，每个稀释度重复8孔，同时设置正常细胞孔作为对照，每天记录各稀释度出现细胞病变孔数，按照Reed-Muench方法计算TCID50；
步骤7：以PRRSV美洲型细胞毒GSWW15株、GSWW18株、VR2332 株和欧洲型EU株为模板，建立单重RT-PCR反应，分别扩增三个基因片段；将PCR扩增产物置于2％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，其次，在已经优化退火温度的条件下，分别使用上下游引物各0.2μL、0.35 μL、0.5μL、0.65μL、0.8μL、1.0μL、1.2μL，对3对引物的浓度进行优化，以确定最佳引物使用浓度；
步骤8：多重RT-PCR方法的建立和优化，根据单重RT-PCR方法，建立多重RT-PCR方法，将PCR扩增产物置于2％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，根据单重RT-PCR方法的最佳退火温度和引物浓度，在多重RT-PCR的退火温度、引物浓度和反应循环数上进行优化，在已经优化退火温度的条件下，根据单重RT-PCR引物浓度优化结果，固定引物对F1/R1，F3/R3使用量各为0.5μL，对引物对F-2/R2做浓度梯度，分别为0.2μL、0.35μL、0.5μL、0.65μL、0.8μL、1.0μ L、1.2μL，进行多重RT-PCR反应，最后在退火温度和引物浓度优化的基础上，对反应的循环数进行优化，分别设25、30、35、40个循环数，以确定最佳循环数；
步骤9：多重RT-PCR特异性实验，按照已经优化的反应条件，分别以PRRSV美洲型GSWW15株、GSWW18株、VR2332株和欧洲型EU 株的RNA为阳性对照，以常见重要猪病毒SVA、O型FMDV、A型 FMDV、CSFV、PRV、PCV2、ASFV的核酸为模板，ddH2O为阴性对照，检验方法的特异性；
步骤10：多重RT-PCR敏感性实验，将PRRSV GSWW15株、GSWW18 株、VR2332株在Marc-145细胞上繁殖病毒，连续传三代，使用 Marc-145细胞测定最后一代各毒株的TCID50。根据测定结果，将毒液进行10倍梯度稀释，取等量毒液提取RNA，按照已经优化的反应条件，进行多重RT-PCR反应，以检测该方法的敏感性；
步骤11：多重RT-PCR重复性实验，以PRRSV GSWW15株、GSWW18 株、VR2332株和EU株为模板，用已优化的多重RT-PCR方法，每隔两周检测1次，连续检测3次，以评价该方法的可重复性；
步骤12：多重RT-PCR临床样品的检测。
利用该方法检测田间临床疑似样品45份，结果检出15份阳性， 30份阴性，同时用实时荧光RT-PCR方法并行检测，符合率达95.6％。优选地，所述步骤1中实验细胞为Marc-145细胞，用于PRRSV的传代培养；实验病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型GSWW15、GSWW18、 VR2332毒株和欧洲型EU毒株、猪瘟病毒(CSFV)、O型和A型口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)均由中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室保存提供；临床样品为近两年采自我国部分省区的养猪场，共计45份。
优选地，所述步骤2中实验仪器和试剂包括HiScript II One Step RT-PCR Kit2购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(PerfectReal Time)、DNA Marker、RNA 酶抑制剂购自宝生物工程(北京)有限公司，病毒基因RNA提取试剂盒购自Qiagen公司，病毒基因DNA提取试剂盒购自天跟生化科技(北京)有限公司，琼脂糖购自西班牙BioWeste公司，DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司；PCR仪为杭州博日科技有限公司,实时荧光PCR仪为ABI Q5，电泳仪为北京六一生物科技有限公司，凝胶成像系统为陕西恩凡仪器制造有限公司。
优选地，所述步骤5中按照病毒基因DNA提取试剂盒操作说明提取ASFV、PRV、PCV2的DNA。
优选地，所述步骤6中将接种后的Marc-145细胞在37℃、5％CO2细胞培养箱连续培养5d。
优选地，所述步骤7中单重RT-PCR的基础反应体系为25μL，包括2×One stepBuffer Mix 12.5μL，上下游引物各1μL(10mmol/ μL)，RNA模板2μL，One Step Enzyme Mix1μL，RNase Free ddH2O 补足25μL。单重RT-PCR反应程序为：50℃30min；94℃3min；94 ℃30s，57℃30s，72℃45s，30次循环；72℃5min，4℃保持。
优选地，所述步骤7中以此单重RT-PCR方法为基础，在退火温度和引物浓度上进行优化：保持其它条件不变，对退火温度设置10 个梯度进行RT-PCR反应，确定最佳退火温度。
优选地，所述步骤8中反应体系为25μL，包括2×One step Buffer Mix 12.5μL，上下游引物各0.5μL(10mmol/μL)，RNA模板 2μL，One Step Enzyme Mix 1μL，RNase FreeddH2O补足25μL。反应程序为：50℃30min；94℃3min；94℃30s，57℃30s，72℃ 45s，30次循环；72℃5min，4℃保持。
优选地，所述步骤8中根据单重RT-PCR退火温度优化结果，确定多重RT-PCR退火温度范围为51-60℃，设置温度梯度进行多重 RT-PCR反应。
优选地，所述步骤10中PRRSV EU株在PAM细胞上传代培养三代，未观察到明显的细胞病变效应(CPE)，使用核酸微量浓度测定仪测定其RNA浓度，进行10倍梯度稀释，进行多重RT-PCR反应，检测敏感性。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的优点在于：
(1)本发明中，建立的PRRSV一步法多重RT-PCR方法对美洲型的三个PRRSV毒株均可以扩增出约408bp、548bp、689bp特异性条带，对欧洲型毒株仅扩增出约408bp条带，25μL反应体系中3对引物最佳使用量均为0.5μL(10mmol/μL)，最佳退火温度为58℃，循环数为30-35个；对三种美洲型毒株的最低检测能力范围为 25～50TCID50/mL，具有良好的敏感性；该方法对感染猪的常见病毒均未扩增出任何片段，说明特异性良好。
(2)本发明中，成功建立了PRRSV的一步法多重RT-PCR检测方法，对美洲型毒株和欧洲型毒株均具良好的敏感性和特异性值得组装成试剂盒推广应用，这为猪繁殖与呼吸综合征的快速准确诊断提供了有效的技术方法。
附图说明
图1为本发明中按不同浓度的引物及退火温度对3种基因进行 PCR扩增的结果图；
图中A:N基因；B:GP5基因；C:NSP5基因。M:DL2000DNA Marker；1～4:GSWW15株、GSWW18株、VR-2332株、EU株；N:阴性对照；
图2为本发明中多重RT-PCR引物浓度优化结果图；
图中A:GSWW15株；B:GSWW18株；C:VR-2332株；D:EU株。 M:DL2000DNA Marker；1～7:引物F-1、R-1、F-3、R-3引物添加量固定为0.5μL，引物F-2、R-2分别为0.2μL、0.35μL、0.5μL、 0.65μL、0.8μL、1.0μL、1.2μL；N：阴性对照；
图3为本发明中多重RT-PCR退火温度优化结果图；
图中A:GSWW15株；B:GSWW18株；C:VR-2332株；D:EU株；M: DL2000 DNA Marker；1，51℃；2，51.2℃；3，51.7℃；4，52.6℃； 5，53.9℃；6，55.4℃；7，57.2℃；8，58.9℃；9，60℃；N：阴性对照；
图4为本发明中多重RT-PCR扩增周期的优化结果图；
图中A:25个循环；B:30个循环；C:35个循环；D:40个循环； M：DL2000DNA Marker；1～4：GSWW15株、GSWW18株、VR-2332株、 EU株；N：阴性对照；
图5为本发明中多重RT-PCR扩增结果图；
图中M:DL2000DNA Marker；1～4:GSWW15株，GSWW18株，VR-2332 株，EU株；N:阴性对照；
图6为本发明中多重RT-PCR特异性实验结果图；
图中M:DL2000DNA Marker；1-4:GSWW15、GSWW18、VR2332、EU 株作为阳性对照；5:SVA RNA；6：O-FMDV RNA；7:A-FMDV RNA；8:CSFV RNA；9：PRV DNA；10：PCV2 DNA；11：ASFVDNA；N：Negative control。
图7为本发明中多重RT-PCR敏感性试验结果图；
图中：A:GSWW15株；M:Marker；1～6:105.5～100.5TCID50/mL；
B:GSWW18株；M:Marker；1～6:105.4～100.4TCID50/mL；
C:VR-2332株；M:Marker；1～7:106.7～100.7TCID50/mL；
D:EU株；M:Marker；1～6:2.7ng/μL～27pg/μL；
图8为本发明中多重RT-PCR重复性实验结果图；
图中A:第一次；B:第二次；C:第三次；M:DL2000DNA Marker； 1～4:GSWW15株、GSWW18株、VR2332株、EU株；N:阴性对照。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：
参照图1-8，猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT-PCR检测方法，包括以下步骤：
步骤1：实验材料的准备，实验细胞为Marc-145细胞，用于 PRRSV的传代培养；实验病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型 GSWW15、GSWW18、VR2332毒株和欧洲型EU毒株，猪瘟病毒C株 (CSFV)、O型和A型口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2 型(PCV2)均由中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室保存提供；临床样品为近两年采自我国部分省区的养猪场，共计45份。
步骤2：实验仪器和试剂的选取，实验仪器和试剂包括HiScript II One Step RT-PCR Kit2购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司， One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)、DNA Marker、 RNA酶抑制剂购自宝生物工程(北京)有限公司，病毒基因RNA提取试剂盒购自Qiagen公司，病毒基因DNA提取试剂盒购自天跟生化科技(北京)有限公司，琼脂糖购自西班牙BioWeste公司，DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司；PCR仪为杭州博日科技有限公司,实时荧光PCR仪为ABIQ5，电泳仪为北京六一生物科技有限公司，凝胶成像系统为陕西恩凡仪器制造有限公司。
步骤3：比对分析NCBIGenBank数据库中收录的近年来我国流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型和欧洲型全基因组序列，利用Lasergene生物学软件，设计16对特异性引物，由北京擎科生物科技有限公司合成，引物稀释至10mmol/μL使用；
步骤4：引物的筛选，用设计的16对引物按照常规RT-PCR分别扩增PRRSV美洲型的高致病性毒株GSWW15、NADC30样毒株GSWW18、经典毒株VR2332的细胞毒和欧洲型EU细胞毒，筛选出针对ORF7基因、ORF4与ORF5基因和ORF1基因特异性较好的3对引物，引物序列见表1；
表1 PRRSV多重RT-PCR引物
Figure BDA0003488387180000111
步骤5：病毒核酸的提取，利用总RNA提取试剂盒提取PRRSV、 CSFV、SVA、FMDV的RNA；利用DNA提取试剂盒提取ASFV、PCV2和PRV 的DNA。疑似阳性临床样品，经充分研磨后，4℃离心取上清，提取病毒的总RNA；
步骤6：病毒滴度的测定，将Marc-145细胞接种于96孔板，10 倍倍比稀释GSWW15、GSWW18、VR2332细胞培养物上清，并按每孔100 μL接种于96孔板中长满单层Marc-145细胞上，每个稀释度重复8 孔，同时设置正常细胞作为对照，37℃、5％CO2细胞培养箱连续培养5d，每天记录各稀释度出现病变的孔数，按照Reed-Muench方法计算 TCID50；
步骤7：单重RT-PCR方法的建立和优化，以PRRSV四种细胞毒 GSWW15株、GSWW18株、VR2332株、EU株为模板，建立单重RT-PCR 反应，分别扩增三种基因。单重RT-PCR的基础反应体系为25uL，包括2×1step Buffer 12.5μL，上下游引物各1μL(10μmol/L)，RNA 模板2uL，PrimeScript 1Step Enzyme Mix 1μL，RNase Free ddH2O 补足25μL。单重RT-PCR反应程序为：50℃30min；94℃3min；94℃ 30s,57℃30s,72℃45s,30次循环；72℃5min。
将PCR扩增产物置于2％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。以此单重RT-PCR方法为基础，在退火温度和引物浓度上进行优化：保持其他条件不变，对退火温度设置9个梯度，分别使用51℃、51.2℃、 51.7℃、52.6℃、53.9℃、55.4℃、57.2℃、58.9℃、60℃进行RT-PCR 反应，确定最佳退火温度。其次，在已经优化退火温度的条件下，对三对引物的浓度进行优化，使三种基因对应的上下游引物各0.2μ L、0.35μL、0.5μL、0.65μL、0.8μL、1.0μL、1.2μL，以确定最佳引物浓度；
步骤8：三重RT-PCR方法的建立和优化，根据单重RT-PCR方法，构建三重RT-PCR方法；
反应体系为25μL，包括2×One step Buffer Mix 12.5μL，上下游引物各0.5μL(10pmol/ul)，RNA模板2ul，One Step Enzyme Mix 1μL，RNase Free ddH2O补足25μL。反应程序为：50℃30min；94 ℃3min；94℃30s，57℃30s，72℃45s，30次循环；72℃5min， 4℃保持。将PCR扩增产物置于2％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测；
根据单重RT-PCR方法的最佳退火温度和引物浓度，在多重 RT-PCR的退火温度，引物浓度和反应循环数上进行优化；
根据单重RT-PCR退火温度优化结果，确定多重RT-PCR退火温度范围为51-60℃，设置温度梯度进行多重RT-PCR反应；
其次，在已经优化退火温度的条件下，根据单重RT-PCR引物浓度优化结果，固定引物对F1/R1，F3/R3使用量各为0.5μL，对引物对F2/R2做浓度梯度，分别为0.2μL、0.35μL、0.5μL、0.65μL、0.8 μL、1.0μL、1.2μL，进行多重RT-PCR反应；
最后，在优化过的退火温度和引物浓度优化的基础下，对反应的循环数做梯度处理，分别是25、30、35、40个循环数，以确定最佳循环数；
步骤9：多重RT-PCR特异性实验，按照已经优化的反应条件，分别以PRRSVGSWW15株、GSWW18株、VR2332株、EU株的RNA为阳性对照，以常见重要猪病毒CSFV、O型FMDV、A型FMDV、SVA、ASFV、 PRV、PCV2的核酸为模板，ddH2O为阴性对照，检验方法的特异性；
步骤10：多重RT-PCR敏感性实验，将PRRSV GSWW15株、GSWW18 株、VR2332株在Marc-145细胞上繁殖病毒，连续传三代，反复冻融三次，使用Marc-145细胞测定TCID50；
根据测定结果，将毒液进行10倍梯度稀释，取等量稀释病毒分别提取RNA，按照已经优化的反应条件，进行多重RT-PCR反应，以检测该方法的敏感性。PRRSVEU株在PAM细胞上传代培养三代，并未观察到明显的细胞病变效应(CPU)，故使用核酸微量浓度测定仪测定其RNA浓度，进行10倍梯度稀释，进行多重RT-PCR反应，检测敏感性；
步骤11：多重RT-PCR重复性实验，以PRRSV GSWW15株、GSWW18 株、VR2332株、EU株模板，用已经优化的多重RT-PCR方法，每隔两周检测1次，连续检测3次，以评价该方法的重复性；
步骤12：多重RT-PCR临床样品的检测。
采集2018～2021年甘肃、山东、陕西、宁夏、青海、四川等省区集约化养猪场的疑似阳性病料，经充分研磨后4℃离心10min后取 400μL上清提取总RNA，用所优化的多重RT-PCR方法和实时荧光 RT-PCR方法同时检测进行检测，比较两种方法的检测结果，并计算二者的符合率。
本发明中，单重RT-PCR方法的优化：以PRRSV GSWW15株、GSWW18 株、VR2332株、EU株模板，按不同浓度的引物及退火温度对三种基因进行PCR扩增。结果显示，对于N基因，GSWW15株、GSWW18株、 VR2332株、EU株的最佳反应引物量均为上下游各0.5μL，退火温度为57℃；对于GP5基因，GSWW15株、GSWW18株、VR2332株的最佳反应引物量均为上下游各0.5μL，退火温度为58.6℃，EU株无条带；
本发明中，对于NSP2基因，GSWW15株、GSWW18株、VR2332株的最佳反应引物量均为上下游各0.5μL，退火温度为55.1℃，EU株无条带。在此优化后的条件下，GSWW15株、GSWW18株、VR2332株均可观察到408bp、548bp、689bp的条带,EU株可观察到408bp的条带 (图1)，与预期相符。
本发明中，多重RT-PCR方法的建立和优化：构建体系并进行扩增，均扩增出与模板相符的条带。引物浓度优化结果显示，N基因、 GP5基因、NSP2基因引物添加量为0.5μmol时，扩增效果最好(见图2)。退火温度优化结果显示，当温度为58.9℃或60℃时，扩增效果最好(见图3)，本试验选择58.9℃作为退火温度。循环数优化结果显示，当循环数为35时，扩增效果最好(见图4)。
本发明中，用一步法RT-PCR试剂盒验证，结果显示，所优化的引物浓度及退火温度能扩增出相应的目的条带(见图5)。最终得出该三重RT-PCR方法反应体系为25μL：2×1stepBuffer 12.5μ L，primeScript 1step Enzyme Mix 1μL，N基因上、下游引物(10 μmol/L)各0.5μL，GP5基因上、下游引物各0.5μL，NSP5基因上、下游引物各0.5μL，模板2μL，灭菌水补足25μL。反应程序：50℃30min，94℃3min；94℃30s，57℃30s，72℃45 s，30个循环；72℃5min,4℃保持。
本发明中，以PRRSV美洲型和欧洲型的四株毒株的RNA及混合物以及SVA、O-FMDV、A-FMDV、CSFV的RNA，PRV、PCV-2、ASFV的DNA 为模板，ddH2O为阴性对照，用1.7建立的方法进行扩增。结果显示，PRRSV的四株毒株出现相符的目的条带(见图6)，而其他模板及阴性对照未扩增或未扩增出目的条带，证明该方法有很好的特异性。
本发明中，多重RT-PCR敏感性实验：PRRSVGSWW15毒TCID50测定结果为105.5TCID50/mL，经10倍系列稀释后，可测到的最低病毒量为101.5TCID50/mL(见图7)。
本发明中，PRRSV GSWW18毒TCID50测定结果为105.4TCID50/mL，经10倍系列稀释后，可测到的最低病毒量为101.4TCID50/mL(见图 7)。
本发明中，PRRSV VR2332毒TCID50测定结果为105.7TCID50/mL，经10倍系列稀释后，可测到的最低病毒量为101.7TCID50/mL(见图 7)。
本发明中，PRRSV EU毒RNA浓度测定结果为2.7ng/μL，经10 倍系列稀释后，可测到的最低病毒浓度为27pg/μL(见图7)。
本发明中，多重RT-PCR重复性实验：重复性试验结果表明，3 次重复试验均能扩增出均匀一致的目的条带，具有良好的重复性，表明建立的多重RT-PCR方法具有较好的重复性。
本发明中，利用建立的多重RT-PCR，对比荧光定量RT-PCR方法，对采集自全国部分地区的45份仔猪临床样品进行检测。结果显示，该方法检测田间临床疑似样品45份，检出15份阳性，30份阴性，阳性率为33.3％。同时用实时荧光RT-PCR方法并行检测，检出17份阳性，28份阴性，阳性率37.8％，两个方法的符合率达95.6％。随机选取阳性样品5份，回收PCR产物，克隆、测序、比对，证实为相应病毒的基因片段。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：实验材料的准备；
步骤2：实验仪器和试剂的选取；
步骤3：引物的设计与合成，比对分析NCBIGenBank数据库中近年来我国流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型和欧洲型全基因组序列，利用Lasergene.V7.1生物学软件，设计16对特异性引物，由北京擎科生物科技有限公司合成，引物稀释至10mmol/μL使用；
步骤4：引物的筛选，用设计的16对引物按照常规RT-PCR分别扩增PRRSV美洲型的高致病性毒株GSWW15、NADC30样毒株GSWW18、经典毒株VR2332的细胞毒和欧洲型EU细胞毒，筛选特异性较好的3对引物；
步骤5：病毒核酸的提取，提取PRRSV、猪瘟病毒(CSFV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)、O型和A型口蹄疫病毒(FMDV)的RNA，提取伪狂犬病毒(PRV)、圆环病毒2型(PCV2)、非洲猪瘟病毒(ASFV)的DNA，以及疑似PRRSV感染的临床样本，经充分研磨后，4℃离心取上清提取病毒总RNA；
步骤6：病毒滴度的测定，将Marc-145细胞接种于96孔板，10倍倍比稀释PRRSV GSWW15、GSWW18和VR2332毒株细胞培养物上清，并按每孔100μL接种于96孔板中长满单层Marc-145细胞上，每个稀释度重复8孔，同时设置正常细胞孔作为对照，每天记录各稀释度出现细胞病变孔数，按照Reed-Muench方法计算TCID50；
步骤7：单重RT-PCR方法的建立和优化，以PRRSV美洲型细胞毒GSWW15株、GSWW18株、VR2332株和欧洲型EU株为模板，建立单重RT-PCR反应；将PCR扩增产物置于2％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，其次，在已经优化退火温度的条件下，分别使用上下游引物各0.2μL、0.35μL、0.5μL、0.65μL、0.8μL、1.0μL、1.2μL，对3对引物的浓度进行优化，以确定最佳引物使用浓度；
步骤8：多重RT-PCR方法的建立和优化，根据单重RT-PCR方法，建立多重RT-PCR方法，将PCR扩增产物置于2％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，根据单重RT-PCR方法的最佳退火温度和引物浓度，在多重RT-PCR的退火温度、引物浓度和反应循环数上进行优化，在已经优化退火温度的条件下，根据单重RT-PCR引物浓度优化结果，固定引物对F1/R1，F3/R3使用量各为0.5μL，对引物对F2/R2做浓度梯度，分别为0.2μL、0.35μL、0.5μL、0.65μL、0.8μL、1.0μL、1.2μL，进行多重RT-PCR反应，最后在退火温度和引物浓度优化的基础上，对反应的循环数进行优化，分别设25、30、35、40个循环数，以确定最佳循环数；
步骤9：多重RT-PCR特异性实验，按照已经优化的反应条件，分别以PRRSV美洲型GSWW15株、GSWW18株、VR2332株和欧洲型EU株的RNA为阳性对照，以常见重要猪病毒CSFV、O型FMDV、A型FMDV、SVA、ASFV、PRV、PCV2的核酸为模板，ddH2O为阴性对照，检验方法的特异性；
步骤10：多重RT-PCR敏感性实验，将PRRSV GSWW15株、GSWW18株、VR2332株在Marc-145细胞上繁殖病毒，连续传三代，使用Marc-145细胞测定最后一代各毒株的TCID50。根据测定结果，将毒液进行10倍梯度稀释，取等量毒液提取RNA，按照已经优化的反应条件，进行多重RT-PCR反应，以检测该方法的敏感性；
步骤11：多重RT-PCR重复性实验，以PRRSV GSWW15株、GSWW18株、VR2332株和EU株为模板，用已优化的多重RT-PCR方法，每隔两周检测1次，连续检测3次，以评价该方法的可重复性；
步骤12：多重RT-PCR临床样品的检测。
利用该方法检测田间临床疑似样品45份，结果检出15份阳性，30份阴性，同时用实时荧光RT-PCR方法并行检测，符合率达95.6％。
2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤1中实验细胞为Marc-145细胞，用于PRRSV的传代培养；实验病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型GSWW15、GSWW18、VR2332毒株和欧洲型EU毒株、猪瘟病毒(CSFV)、O型和A型口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)均由中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室保存提供；临床样品为近两年采自我国部分省区的养猪场，共计45份。
3.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤2中实验仪器和试剂包括HiScriptIIOne Step RT-PCR Kit2购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)、DNA Marker、RNA酶抑制剂购自宝生物工程(北京)有限公司，病毒基因RNA提取试剂盒购自Qiagen公司，病毒基因DNA提取试剂盒购自天跟生化科技(北京)有限公司，琼脂糖购自西班牙BioWeste公司，DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司；PCR仪为杭州博日科技有限公司,实时荧光PCR仪为ABI Q5，电泳仪为北京六一生物科技有限公司，凝胶成像系统为陕西恩凡仪器制造有限公司。
4.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤5中按照病毒基因DNA提取试剂盒操作说明提取ASFV、PRV、PCV2的DNA。
5.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤6中将接种后的Marc-145细胞在37℃、5％CO2细胞培养箱连续培养5d。
6.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤7中单重RT-PCR的基础反应体系为25μL，包括2x One step Mix 12.5μL，上下游引物各1μL(10mmol/μL)，RNA模板2μL，One Step Enzyme Mix 1μL，RNase FreeddH2O补足25μL。单重RT-PCR反应程序为：50℃30min；94℃3min；94℃30s，57℃30s，72℃45s，30次循环；72℃5min，4℃保持。
7.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤7中以此单重RT-PCR方法为基础，在退火温度和引物浓度上进行优化：保持其它条件不变，对退火温度设置10个梯度进行RT-PCR反应，确定最佳退火温度。
8.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤8中反应体系为25μL，包括2×One step Mix 12.5μL，上下游引物各0.5μL(10mmol/μL)，RNA模板2μL，One Step Enzyme Mix 1μL，RNase Free ddH2O补足25μL。反应程序为：50℃30min；94℃3min；94℃30s，57℃30s，72℃45s，30次循环；72℃5min，4℃保持。
9.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤8中根据单重RT-PCR退火温度优化结果，确定多重RT-PCR退火温度范围为51-60℃，设置温度梯度进行多重RT-PCR反应。
10.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法多重RT-PCR检测方法，其特征在于，所述步骤10中PRRSVEU株在PAM细胞上传代培养三代，未观察到明显的细胞病变效应(CPE)，使用核酸微量浓度测定仪测定其RNA浓度，进行10倍梯度稀释，进行多重RT-PCR反应，检测敏感性。
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CN116144836A (zh) * 2022-09-20 2023-05-23 华中农业大学 一种prrsv的四重荧光定量rt-pcr检测引物组及检测方法

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