CN107475459B

CN107475459B - 同时鉴别美洲型prrsv经典毒株、变异毒株及新型病毒类nadc30毒株的检测方法

Info

Publication number: CN107475459B
Application number: CN201710919048.6A
Authority: CN
Inventors: 吴家强; 刘艳艳; 于江; 王淞; 杨杰; 李建达; 曾昊; 陈智
Original assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Current assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Priority date: 2017-09-30
Filing date: 2017-09-30
Publication date: 2021-02-12
Anticipated expiration: 2037-09-30
Also published as: CN107475459A

Abstract

本发明公开了一种同时鉴别美洲型PRRSV经典毒株、变异毒株及新型病毒类NADC30毒株的检测方法，本发明基于ABI7500荧光定量PCR仪器建立了同时针对PRRSV经典型、型高致病变异株(Nsp2基因第481位缺失“L”氨基酸，533～561位连续缺失29个氨基酸)和NADC30like三种类型毒株的多重实时荧光RT‑PCR反应，基于NSP2基因分别设计3种类型毒株的特异性引物和特异探针，依据相对保守N基因设计PRRSV通用引物及通用探针，可以有效防止因NSP2区突变而造成的漏检，避免假阴性。

Description

同时鉴别美洲型PRRSV经典毒株、变异毒株及新型病毒类 NADC30毒株的检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种同时鉴别美洲型PRRSV经典毒株、变异毒株及新型病毒类NADC30毒株的检测方法。属于分子生物学检测技术领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)引起的一种急性传染病。该病会造成母猪发热、流产、早产、产死胎、木乃伊胎等繁殖障碍，断奶前后的仔猪死亡率升高，以及各种年龄猪呼吸障碍。该病最早于1987年在美国发生，目前世界上两种流行的PRRSV分别是欧洲型(基因Ⅰ型)和美洲型(基因Ⅱ型)。1996年我国首次分离到美洲型CH-la株，此后该病在我国部份地区普遍发生。研究人员从流行毒株缺失变异和猪繁殖与呼吸综合征发生时间顺序以及出现频率推测，所有高致病性猪蓝耳病均来源于CH-1a，流行病学资料也表明所有2006年爆发的高致病HP-PRRSV中国分离毒株均具有相同的来源。田克恭等总结了区别于传统毒株的高致病性流行毒株的特点为：Nsp2基因第481位缺失“L”氨基酸，533～561位连续缺失29个氨基酸。2015年以来新报道在中国大陆出现一种新的类NADC30毒株,该类型病毒毒力性强，造成爆发母猪流产、死胎以及仔猪呼吸道疾病，还会出现多种病原混合、继发感染，给该病的诊断与治疗带来极大的困难，这种新的类NADC30毒株NSP2基因与以往的经典毒株和高致病毒株相比出现了新的大片段130个氨基酸不连续间断缺失变异(在323-433处111个氨基酸和506-524处19个氨基酸)。

当前国内PRRSV毒株种类较多且变异现象普遍发生，给猪蓝耳病的诊断与治疗带来极大的困难，同时类NADC30病毒的出现及尚未出现此病毒疫苗给蓝耳病防控提出了新的挑战。针对上述出现的新的复杂的缺失变异毒株，因此建立一种快速鉴别PRRSV经典毒株、变异毒株及新型病毒类NADC30毒株的各种病毒类型的诊断方法，制定合理的预防控制措施，成为防控该病关键。

目前PRRSV的检测技术有病毒分离法、中和试验、免疫过氧化物酶单层试验、免疫荧光抗体试验、免疫组织化学技术、酶联免疫吸附试验、胶体金免疫层析技术、反转录聚合酶链反应等，以上方法都是通用型的只能鉴定是否感染PRRSV，并不能区分感染那种类型的PRRSV,存在特异性低，容易造成假阳性，准确度不高等局限性。申请号为CN201610192662.2和CN 201610195105.6给出鉴定类NADC30病毒株检测方法，但该方法为普通PCR法，通过琼脂糖凝胶电泳检测开管操作易出现PCR产物污染的风险，造成检测结果的不准确。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种同时鉴别美洲型PRRSV经典毒株Classical-PRRSV、变异毒株HP-PRRSV及新型病毒类NADC30毒株的检测方法。本发明特异性强、准确度高，低成本、灵敏度高、闭管操作安全可靠，为PRRSV美洲型经典毒株、变异株及类NADC30型毒株的同时快速鉴别检测及有效防控蓝耳病提供了新的途径，具有良好的应用前景。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

同时鉴别美洲型PRRSV经典毒株、变异毒株及新型病毒类NADC30毒株的荧光PCR检测引物组合物，包括：

(1)高致病变异毒株HP-PRRSV的特异引物，其核苷酸序列如下：

正向引物序列HP-PRRSVF：5'-GACGTGCCCCCAAGCTGAT-3'，如SEQ ID NO.1所示；

反向引物序列HP-PRRSVR：5'-GGATGCCCATGTTCTGCGA-3'，如SEQ ID NO.2所示；

(2)经典毒株Classical-PRRSV的特异引物，其核苷酸序列如下：

正向引物序列C-PRRSVF：5'-TGGGAAGATTTGGCTGTTAGT-3'，如SEQ ID NO.3所示；

反向引物序列C-PRRSVR：5'-TCACCTGCTGAAACTTACGC-3'，SEQ ID NO.4所示

(3)新变异类NADC30型毒株的特异引物，其核苷酸序列如下：

正向引物序列NA-PRRSVF：5'-CGTATTGGACACCTCTTTTGACTG-3'，如SEQ ID NO.5所示；

反向引物序列NA-PRRSVR：5'-AACTGGACCTAATCTTCCTGCG-3'，如SEQ ID NO.6所示；

(4)美洲型毒株通用引物，其核苷酸序列如下：

正向引物序列PRRSV-UF：5'-TCCAGATGCCGTTTGTGCTT-3'，如SEQ ID NO.7所示；

反向引物序列PRRSV-UR：5'-CCCAACACGAGGCTTTTCAA-3'，如SEQ ID NO.8所示。

同时鉴别美洲型PRRSV经典毒株、变异毒株及新型病毒类NADC30毒株的荧光PCR检测探针组合物，包括：

高致病变异毒株HP-PRRSV的特异性探针，其核苷酸序列如下：

HP-PRRSVP：5'-CGTAGAACTGTGACAACAACGCTGAC-3'，如SEQ ID NO.9所示；

经典毒株Classical-PRRSV的特异性探针，其核苷酸序列如下：

C-PRRSVP：5'-ATGCATCTTCAGGCCGGCGA-3'，如SEQ ID NO.10所示；

新变异类NADC30型毒株的特异性探针，其核苷酸序列如下：

NA-PRRSVP：5'-CCCAAAGGTCTTCGTCGGTATTCC-3'，如SEQ ID NO.11所示；

美洲型毒株通用特异性探针，其核苷酸序列如下：

PRRSV-UP：5'-TCTGGCCCCTGCCCACCA-3'，如SEQ ID NO.12所示。

作为优选的技术方案之一，所述探针序列的5’端修饰有报告基团，3’端修饰有淬灭基团，其中所述的四种探针的报告基团分别为FAM、JOE、ROX、CY5不同荧光素修饰，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1，BHQ2中的任一种。

同时鉴别美洲型PRRSV经典毒株、变异毒株及新型病毒类NADC30毒株的荧光PCR检测试剂盒，包括上述荧光PCR检测引物组合物、探针组合物、阳性对照标准品和多重实时荧光PCR反应扩增体系。

作为优选的技术方案之一，所述试剂盒还包括阴性对照品，为无RNA酶水。

作为优选的技术方案之一，所述阳性对照标准品为经典毒株Classical-PRRSV、高致病变异毒株HP-PRRSV、新变异类NADC30型毒株的NSP2基因的一段标记性序列的重组质粒，其构建方法如下：

a.PRRSV经典毒株SD-1、高致病变异毒株SX-1及类NADC30型毒株基因组RNA的提取按TAKARA Trizol法说明书进行操作；以提取的病毒RNA为模版进行反转录合成Cdna；以SEQID NO.1～SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4,SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.6作为引物对扩增，反应条件为95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃再延伸8min，4℃保存；PCR产物于质量浓度1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定；

b.PCR产物的克隆及序列分析，PCR产物用TaKaRa公司的胶回收试剂盒回收，将回收产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α感受态细胞，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12～16h。经蓝白斑筛选后，用质粒(小量)提取试剂盒提取质粒，将序列测定正确的质粒命名pMD-C(经典毒株)，pMD-H(高致病变异毒株)，pMD-N(类NADC30型毒株)，应用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度计测定质粒浓度，将3种质粒稀释到1ng/μl计算出其拷贝数分别为3.12×108copies/μl，3.19×108copies/μl，3.14×108copies/μl.本发明的试剂盒利用3.12×107copies/μl，3.19×107copies/μl，3.14×107copies/μl浓度的质粒作为阳性对照以及10倍梯度比稀释后作为标准曲线。

作为优选的技术方案之一，所述多重实时荧光PCR反应扩增体系采用20μL反应体系，包括：2×TaqMan Master Mix(pH值为8.9，镁离子浓度为2.5mM，4种dNTP的终浓度各为250μM，Taq酶的用量为1U/反应)加量10μL，引物组合物每对引物终浓度0.25μM，探针组合物各探针终浓度0.05～0.25μM，cDNA用量1～50ng/μL取2μL，用双蒸水补足20μL，如表1所示。

表1.PCR反应扩增体系

同时鉴别美洲型PRRSV经典毒株、变异毒株及新型病毒类NADC30毒株的目的基因序列，包括：

高致病变异毒株NSP2基因目的序列171bp，其核苷酸序列如下：

Gacgtgcccccaagctgatgacacctttgagtgggccggcaccagttcctgcaccgcgtagaactgtgacaacaacgctgacgcaccaggatgagcctctggatttgcctgcgtcctcacagacggaatatgaggctttccccctagcaccatcgcagaacatgggcatcc，如SEQ ID NO.13所示；

PRRSV经典毒株NSP2基因目的序列232bp，其核苷酸序列如下：

tgggaagatttggctgttagtagcccctttgatctcccggccccacctgagccggcaacaccttcaagtgagctggtgattgtgtcctcaccgcaatgcatcttcaggccggcgacacccttgagtgagccggctccaattcccgcacctcgcggaactgtgtctcgaccggtgacacccttgagtgagccgatccctgtgcccgtaccgcggcgtaagtttcagcaggtga，如SEQ ID NO.14所示；

PRRSV类NADC30型毒株NSP2基因目的序列218bp，其核苷酸序列如下：

cgtattggacacctcttttgactgggatgtcgtgcttcctggagttggagtggctgcccaagcagcagaactgcccctcatcaaccggtatcacgctccaaccactgttgtagcccaaaggtcttcgtcggtattccagtctcgaaaagcggaatctgtcaggagccttccagagaacaggcctctccctgccccacgcaggaagattaggtccagtt，如SEQ ID NO.15所示；

PRRSV美洲型通用型引物N基因目的产物182bp，其核苷酸序列如下：

TCCAGATGCCGTTTGTGCTTGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCCTGCCCACCACGTCGAAAGTGCCGCGGGCTTTCATCCGATTGCGGCAAATGATAACCACGCATTTGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACGGTCAACGGCACATTGGTGCCCGGGTTGAAAAGCCTCGTGTTGGG，如SEQ ID NO.16所示。

上述引物组合物、探针组合物或试剂盒在同时鉴别美洲型PRRSV经典毒株、变异毒株及新型病毒类NADC30毒株中的应用。

同时鉴别美洲型PRRSV经典毒株、变异毒株及新型病毒类NADC30毒株的检测方法，具体步骤如下：

(1)PRRSV的RNA提取：对采集的样品采用Trizol法进行病毒RNA提取；

(2)PRRSV实时荧光定量RT-PCR反应：以步骤(1)提取的RNA为模板，使用上述试剂盒进行PCR扩增；

(3)设立各病毒类型的阳性对照、阴性对照及空白对照品，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值ΔRn与扩增曲线Ct值，根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定PRRSV的毒株种类。

作为优选的技术方案之一，步骤(1)中的样品为血清或组织匀浆。

作为优选的技术方案之一，步骤(2)进行PCR扩增时，需在4通道或4通道以上的任何型号的荧光定量PCR仪上进行，扩增程序：42℃30min，95℃3min；95℃10s；62℃34s，在此收集荧光信号，45个循环，根据不同型号的PCR仪的不同要求可以对标记荧光号进行相应的调整。

本发明的有益效果：

本发明基于ABI7500荧光定量PCR仪器建立了同时针对PRRSV经典型、型高致病变异株(Nsp2基因第481位缺失“L”氨基酸，533～561位连续缺失29个氨基酸)和NADC30like三种类型毒株的多重实时荧光RT-PCR反应，基于NSP2基因分别设计3种类型毒株的特异性引物和特异探针，依据相对保守N基因设计PRRSV通用引物及通用探针，可以有效防止因NSP2区突变而造成的漏检，避免假阴性。

本发明所建立的方法进行特异性、灵敏度的验证，并通过Sanger法测序验证方法准确性，结果显示可以准确的将美洲型PRRSV的3种类型的病毒区分开，且灵敏度可达到10个单拷贝数。

此外，本发明建立的方法整个过程都是闭管操作，从而大大减少了体系的污染，且在诊断时间上与传统的普通PCR方法比较自获得待检样品到RNA提取、反应体系配置直到出现检测结果，整个过程仅用2小时内完成，大大缩短了时间，一个反应即可完成3种PRRSV类型的定性检测，大大节约了成本。

本发明具有准确、灵敏、高效率、成本低等优点，对临床样品的准确诊断及养猪业的发展具有很强的实用价值。

附图说明

图1当FAM、CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为高致病性PRRSV。

图2当JOE、CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为经典型PRRSV。

图3当ROX、CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为NADC30like。

图4当FAM、JOE、ROX、CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为HP-PRRSV(高致病)、C-PRRSV(经典)、NA-PRRSV(NADC30like)的混合品。

图5为HP-PRRSVP特异性探针灵敏度扩增曲线图。

图6为C-PRRSVP特异性探针灵敏度扩增曲线图。

图7为NA-PRRSVP特异性探针灵敏度扩增曲线图。

图8为PRRSV-UP特异性探针灵敏度扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定，以下实施例中用到实验试剂材料如无特殊说明，均可通过商业手段获得。本发明中所用实验材料、试剂与仪器如下：

实验材料：NADC30like LZ、高致病SX-1、经典型SD-1毒株、疫苗毒R98株、TJM-F92株、JXA1-R，以及猪瘟病毒(CSFV，疫苗毒C株)、猪细小病毒(PPV，疫苗毒N株)、猪流行性腹泻病毒(PEDV，疫苗毒NB120株)，猪伪狂犬病毒(PRV，疫苗毒Bartha-K61)和猪圆环病毒2型病毒(PCV2，疫苗毒LG株)等疫苗株购自江苏南农高科技股份有限公司、新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，由山东省农科院畜牧兽医研究所猪病研究室保存。

所用试剂：PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect RealTime)，DNA分子量MakerDL2000、电泳上样缓冲液等PCR反应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。引物与探针由生工生物工程(上海)有限公司负责合成。2×TaqMan Master Mix为DBI Bioscience品牌。DNA测序由山东省农业科学院生物技术中心测序中心完成。

所用仪器：ABI 7500荧光定量PCR仪为ABI公司产品，Takara PCR仪为宝生物工程(大连)有限公司产品。5424D型高速离心机为Eppendorf公司产品。

实施例1

1、特异引物及特异探针的设计：在Genbank中下载多个美洲型PRRSV(经典型毒株HN1、SD9521、VR2332、SD1100、CH1a；高致病变异毒株SX1、TJ、JXA1、HUN4；NADC30like：HNyc15、HNjz15、JL580、HENXX1 and SDlz1601)的NSP2基因和N基因序列，用BioEdit软件包进行Clustalw比对，根据不同病毒类型利用Primer 3.0软件设计特异性TaqMan探针、引物。根据美洲型和欧洲型PRRSV的N基因序列保守区设计美洲型PRRSV通用引物及通用探针。

2、引物及探针合成：由上海捷瑞生物有限公司合成。

3、引物、探针序列及探针修饰见表2。

表2引物及序列信息

4、样品模板制备

(1)病毒RNA的提取：使用TaKaRa公司的TRIzol试剂对3种类型的PRRSV、对照病毒PRRSV弱毒疫苗株(R98、ATCC VR-2332株)和变异株(JXA1-R、TJM-F92株)，本实验室分离得到的NADC30like毒株；以及猪瘟病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒等进行RNA提取。使用OMEGA公司DNA提取试剂盒提取猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型基因组DNA,分别提取核酸，方法按照说明书进行。

(2)RT-qPCR扩增：以步骤4中提取的PRRSV及其变异株RNA为模板，使用TaKaRa公司的一步法RT-qPCR试剂盒进行扩增，扩增体系见表1，反应条件为：42℃30min，95℃3min；95℃10s；62℃34s，在此收集荧光信号，45个循环，根据不同型号的PCR仪的不同要求可以对标记荧光号进行相应的调整。

5、结果分析：每次试验设立阳性对照、阴性对照及空白对照，试验结束后打开分析软件，分析实验结果，给出ΔRn(第n个循环时的荧光增加值)与扩增曲线Ct值，根据探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定待测样品毒株类型。结果见图1，当FAM、CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为HP-PRRSV；图2显示当JOE、CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为C-PRRSV；图3当ROX、CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为NA-PRRSV；图4显示FAM、JOE、ROX、CY5荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为HP-PRRSV、C-PRRSV、NA-PRRSV的混合品。

6、阳性重组质粒的构建

以分离的NADC30like LZ、高致病SX-1、经典型SD-1毒株为模板，分别使用NA-PRRSVF/R、HP-PRRSVF/R、C-PRRSVF/R引物PCR扩增，将PCR产物采用T-A克隆方案分别克隆至PMD18-T载体，构建重组质粒，重组质粒DNA抽提纯化按照试剂盒说明书进行，并送往山东省农科院生物技术研究中心测序中心测序鉴定标准品的准确性，通过测序结果比对重组质粒均为目的基因一致。

实施例2多重实时荧光方法验证

1、特异性验证

利用本发明试剂盒方法分别以NADC30like LZ、高致病SX-1、经典型SD-1毒株、疫苗毒R98株、TJM-F92株、JXA1-R，以及猪瘟病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒，猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型病毒为模板进行多重实时荧光PCR扩增验证其引物和探针的特异性。其结果见表3，结果表明本发明所设计的引物及探针具有很强的特异性。

表3.特异性验证试验

2、灵敏度评价

将NADC30like、高致病、经典型毒株阳性标准品定量到10⁷拷贝/μL，依次10倍梯度稀释为1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹、单拷贝/μL，进行灵敏度实验。结果见图5～图8，结果表明本方法的检测灵敏度为1.0×10¹μL^-1，说明本方法具有很高的灵敏度。

实施例3临床可疑样本检测

本发明所建立的同时针对PRRSV经典型、型高致病变异株和NADC30like三种类型毒株的多重实时荧光RT-PCR检测方法对30份临床可疑样本进行检测，样本类型包括猪肺、淋巴结、组织和血清。同时使用病毒分离方法和测序进行检测。其结果见表4，结果显示本发明所建立的方法与病毒分离后测序结果验证完全一致，本方法准确、可靠。

表4临床样本检测结果

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

序列表

<110> 山东省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 同时鉴别美洲型PRRSV经典毒株、变异毒株及新型病毒类NADC30毒株的检测方法

<130> 2017

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<400> 1

gacgtgcccc caagctgat 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<400> 2

ggatgcccat gttctgcga 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<400> 3

tgggaagatt tggctgttag t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<400> 4

tcacctgctg aaacttacgc 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<400> 5

cgtattggac acctcttttg actg 24

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<400> 6

aactggacct aatcttcctg cg 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<400> 7

tccagatgcc gtttgtgctt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<400> 8

cccaacacga ggcttttcaa 20

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<400> 9

cgtagaactg tgacaacaac gctgac 26

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<400> 10

atgcatcttc aggccggcga 20

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<400> 11

cccaaaggtc ttcgtcggta ttcc 24

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<400> 12

tctggcccct gcccacca 18

<210> 13

<211> 182

<212> DNA

<213> artificial

<400> 13

cccgcgtcgc gacgtgcccc caagctgatg acacctttga gtgggccggc accagttcct 60

gcaccgcgta gaactgtgac aacaacgctg acgcaccagg atgagcctct ggatttgcct 120

gcgtcctcac agacggaata tgaggctttc cccctagcac catcgcagaa catgggcatc 180

ct 182

<210> 14

<211> 249

<212> DNA

<213> artificial

<400> 14

gttgggaaga tttggctgtt agtagcccct ttgatctccc ggccccacct gagccggcaa 60

caccttcaag tgagctggtg attgtgtcct caccgcaatg catcttcagg ccggcgacac 120

ccttgagtga gccggctcca attcccgcac ctcgcggaac tgtgtctcga ccggtgacac 180

ccttgagtga gccgatccct gtgcccgtac cgcggcgtaa gtttcagcag gtgaaaagat 240

tgagttcgg 249

<210> 15

<211> 309

<212> DNA

<213> artificial

<400> 15

gcttggctag gcttgagaaa gctcgcccgc caaacgtatt ggacacctct tttgactggg 60

atgtcgtgct tcctggagtt ggagtggctg cccaagcagc agaactgccc ctcatcaacc 120

ggtatcacgc tccaaccact gttgtagccc aaaggtcttc gtcggtattc cagtctcgaa 180

aagcggaatc tgtcaggagc cttccagaga acaggcctct ccctgcccca cgcaggaaga 240

ttaggtccag ttgtggtagt ttggtttcat tgggcggcaa tttccctgac agctgggaag 300

atgcggccg 309

<210> 16

<211> 256

<212> DNA

<213> artificial

<400> 16

tccagatgcc gtttgtgctt gctaggccgc aagtacattc tggcccctgc ccaccacgtc 60

gaaagtgccg cgggctttca tccgattgcg gcaaatgata accacgcatt tgtcgtccgg 120

cgtcccggct ccactacggt caacggcaca ttggtgcccg ggttgaaaag cctcgtgttg 180

ggtggcagaa aagctgttaa gcagggagtg gtaaaccttg ttaaatatgc caaaatgcca 240

aataacaacg gcaagc 256

Claims

1.同时鉴别美洲型PRRSV经典毒株、变异毒株及新型病毒类NADC30毒株的荧光PCR检测引物组合物，其特征在于，包括：

(1)高致病变异毒株HP-PRRSV的特异引物，其核苷酸序列如下：

(2)经典毒株Classical-PRRSV的特异引物，其核苷酸序列如下：

反向引物序列C-PRRSVR：5'-TCACCTGCTGAAACTTACGC-3'，如SEQ ID NO.4所示；

(3)新变异类NADC30型毒株的特异引物，其核苷酸序列如下：

(4)美洲型毒株通用引物，其核苷酸序列如下：

2.同时鉴别美洲型PRRSV经典毒株、变异毒株及新型病毒类NADC30毒株的荧光PCR检测探针组合物，其特征在于，包括：

高致病变异毒株HP-PRRSV的特异性探针，其核苷酸序列如下：

HP-PRRSVP：5'-CGTAGAACTGTGACAACAACGCTGAC-3'，如SEQ ID NO.9所示；

经典毒株Classical-PRRSV的特异性探针，其核苷酸序列如下：

C-PRRSVP：5'-ATGCATCTTCAGGCCGGCGA-3'，如SEQ ID NO.10所示；

新变异类NADC30型毒株的特异性探针，其核苷酸序列如下：

NA-PRRSVP：5'-CCCAAAGGTCTTCGTCGGTATTCC-3'，如SEQ ID NO.11所示；

美洲型毒株通用特异性探针，其核苷酸序列如下：

PRRSV-UP：5'-TCTGGCCCCTGCCCACCA-3'，如SEQ ID NO.12所示。

3.根据权利要求2所述的探针组合物，其特征在于，所述探针序列的5’端修饰有报告基团，3’端修饰有淬灭基团，其中所述的四种探针的报告基团分别为FAM、JOE、ROX、CY5不同荧光素修饰，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1，BHQ2中的任一种。

4.同时鉴别美洲型PRRSV经典毒株、变异毒株及新型病毒类NADC30毒株的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的荧光PCR检测引物组合物、权利要求2所述的探针组合物、阳性对照标准品和多重实时荧光PCR反应扩增体系。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照品，为无RNA酶水。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照标准品为经典毒株Classical-PRRSV、高致病变异毒株HP-PRRSV、新变异类NADC30型毒株的NSP2基因的一段标记性序列的重组质粒。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述多重实时荧光PCR反应扩增体系采用20μL反应体系，包括：2×TaqMan Master Mix 10μL，引物组合物终浓度5μM，探针组合物终浓度1～5μM，cDNA用量1～50ng/μL取2μL，用双蒸水补足20μL。

8.同时鉴别美洲型PRRSV经典毒株、变异毒株及新型病毒类NADC30毒株的目的基因序列，其特征在于，包括：

高致病变异毒株NSP2基因目的序列171bp，其核苷酸序列如下：

Cccgcgtcgcgacgtgcccccaagctgatgacacctttgagtgggccggcaccagttcctgcaccgcgtagaactgtgacaacaacgctgacgcaccaggatgagcctctggatttgcctgcgtcctcacagacggaatatgaggctttccccctagcaccatcgcagaacatgggcatcct，如SEQ ID NO.13所示；

和PRRSV经典毒株NSP2基因目的序列232bp，其核苷酸序列如下：

Gttgggaagatttggctgttagtagcccctttgatctcccggccccacctgagccggcaacaccttcaagtgagctggtgattgtgtcctcaccgcaatgcatcttcaggccggcgacacccttgagtgagccggctccaattcccgcacctcgcggaactgtgtctcgaccggtgacacccttgagtgagccgatccctgtgcccgtaccgcggcgtaagtttcagcaggtgaaaagattgagttcgg，如SEQ ID NO.14所示；

和PRRSV类NADC30型毒株NSP2基因目的序列213bp，其核苷酸序列如下：

Gcttggctaggcttgagaaagctcgcccgccaaacgtattggacacctcttttgactgggatgtcgtgcttcctggagttggagtggctgcccaagcagcagaactgcccctcatcaaccggtatcacgctccaaccactgttgtagcccaaaggtcttcgtcggtattccagtctcgaaaagcggaatctgtcaggagccttccagagaacaggcctctccctgccccacgcaggaagattaggtccagttgtggtagtttggtttcattgggcggcaatttccctgacagctgggaagatgcggccg，如SEQ ID NO.15所示；

和PRRSV美洲型通用型引物N基因目的产物194bp，其核苷酸序列如下：

TCCAGATGCCGTTTGTGCTTGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCCTGCCCACCACGTCGAAAGTGCCGCGGGCTTTCATCCGATTGCGGCAAATGATAACCACGCATTTGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACGGTCAACGGCACATTGGTGCCCGGGTTGAAAAGCCTCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGCTGTTAAGCAGGGAGTGGTAAACCTTGTTAAATATGCCAAAATGCCAAATAACAACGGCAAGC，如SEQ ID NO.16所示。