CN113151586B - 一种用于检测、鉴别猪伪狂犬病毒ⅰ型和ⅱ型的引物组合、试剂盒及方法 - Google Patents

一种用于检测、鉴别猪伪狂犬病毒ⅰ型和ⅱ型的引物组合、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测、鉴别猪伪狂犬病毒Ⅰ型和Ⅱ型的引物组合、试剂盒及方法。所述引物组合包括：上游引物Ⅰ：5’‑GAAGCCCCCGCGGAACAA‑3’，上游引物Ⅱ：5’‑CGCGGCCTCCACGCCCGC‑3’，下游引物：5’‑GCGAGGGAGGCGTTGGCG‑3’，其中，上游引物Ⅰ与下游引物配合用于扩增Ⅰ型猪伪狂犬病毒获得283bp序列，上游引物Ⅱ与下游引物配合用于扩增Ⅱ型猪伪狂犬病毒获得351bp序列。本研究通过生物信息学分析方法明确可用于基因分型的gC靶基因，并首次利用AS‑PCR原理来设计分型引物，并通过实验筛选到特异性分型的上游引物，而共用保守下游引物，进而减少了体系中的引物种类与数量，降低错配的可能，从而提高扩增效率，最终建立了灵敏度为104的单重PCR和灵敏度为104的双重PCR检测体系。

Description

一种用于检测、鉴别猪伪狂犬病毒Ⅰ型和Ⅱ型的引物组合、试 剂盒及方法
技术领域
本发明涉及生物技术检测技术领域，特别是涉及用于检测、鉴别猪伪狂犬病毒Ⅰ型和Ⅱ型的引物组合、试剂盒及方法。
背景技术
伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)感染猪或其他动物引起的一种急性传染病。1902年匈牙利学者Aladar Aujeszky首次报道本病，故又称奥耶斯基氏病(Aujeszky's disease,AD)。PRV属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，水泡疱疹病毒属成员。PRV病毒颗粒呈球形，大小约为150-180nm，主要由核芯、核衣壳、被膜以及囊膜组成。PRV基因组为双链DNA，全长约150kb，G+C含量高达70％，含有至少70个基因，编码约100种病毒蛋白。
猪是PRV的自然宿主，大部分驯养脊椎动物和部分野生动物对PRV易感，非自然宿主感染后主要表现为神经症状，最后发展为死亡。猪感染PRV后临床症状较多样，发病情况与致死率与感染猪的年龄、健康状况、毒株强弱及感染剂量相关。初生仔猪感染PRV表现为神经症状，多致死；成年猪感染PRV后发病率高，死亡率低，临床上以引起呼吸症状为主；妊娠母猪感染PRV可引起繁殖障碍，出现流产、产死胎、木乃伊胎等症状。PRV常能够在猪外周神经系统建立终生潜伏感染，压力、应激等情况下可被激活，导致猪群发病，所以PRV对生猪养殖危害巨大，造成猪群繁殖率、育成率、生长速度、料肉比等多方面指标下降，造成巨大的经济损失。
一些发达国家曾通过大规模使用gE缺失疫苗和DIVA(区分野毒感染和疫苗免疫)策略净化了该病，但由于PRV具有潜伏感染及多宿主适应等特性，仍是世界养猪业面临的重要威胁。我国于1979年引进了PRV Bartha-K61弱毒株(一种天然gE基因缺失疫苗)，试制成功了PRV冻干疫苗，通过Bartha-K61疫苗的接种有效遏制了PR疫情在我国蔓延。但2011年以后，免疫过Bartha-K61疫苗的猪场爆发PR，从华北蔓延至全国，表现为母猪流产、产死胎，仔猪高致死率，造成养猪业巨大经济损失。研究发现，我国的新PRV流行毒株毒力明显强于经典毒株，传统灭活苗和弱毒苗无法提供有效保护。PRV毒株序列进化分析显示，新PRV毒株在进化树上明显偏离传统PRV毒株(基因Ⅰ型)，命名为基因Ⅱ型。面对我国高密度规模化养殖现状，临床上存在Ⅰ/Ⅱ型野毒株混合感染，I型弱毒疫苗株/Ⅱ型野毒株混合感染的复杂感染形势，我们急需Ⅰ型和Ⅱ型PRV鉴别诊断试剂盒为临床诊断、疫苗免疫效力评价及PRV净化提供必要工具。
目前，区分Ⅰ型和Ⅱ型PRV的检测方法不多，有可以区分PRV经典毒株、变异毒株和Bartha-K61疫苗株的三重实时荧光PCR方法，有可以区分PRVⅠ型、Ⅱ型和Bartha-K61疫苗毒株的双荧光熔解曲线分析方法，但这些方法的建立均基于不同毒株序列的个别差异位点，容易因毒株序列变异导致检测正确率下降。我们发现Ⅰ型和Ⅱ型PRV毒株在gC基因中存在1处稳定差异基序，可用于Ⅰ型和Ⅱ型PRV的鉴别检测。
发明内容
二重PCR的特点是能在同一PCR反应体系中同时检测并鉴别两种病原体，在临床上具有很高的应用价值。因此本研究旨在建立一种能在同一体系中准确、快速区分Ⅰ型或Ⅱ型PRV的二重PCR检测方法。
本研究根据已公布的PRVⅠ型和Ⅱ型毒株序列进行序列分析和比较，发现PRVⅠ型和Ⅱ型毒株的gC基因序列其他部分相对保守，但存在一处21bp的稳定差异基序，因此，我们针对这处差异基序设计PCR扩增的上游引物，即可创建一种有效区分PRVⅠ型和Ⅱ型的PCR鉴别检测方法。虽然PRVⅠ型和Ⅱ型共感染现象普遍，但仍缺乏高效准确的分型鉴别诊断方法，本研究旨在建立一种在同一体系中，简便、快速区分PRVⅠ型和Ⅱ型的PCR检测方法，对PRV感染进行快速准确诊断，为PR的流行病学调查、疫苗免疫效力评价及持续性感染动物的清群和净化提供必要技术手段。
用于检测、鉴别猪伪狂犬病毒Ⅰ型和Ⅱ型的引物组合，包括：
上游引物Ⅰ：5’-GAAGCCCCCGCGGAACAA-3’，
上游引物Ⅱ：5’-CGCGGCCTCCACGCCCGC-3’，
下游引物：5’-GCGAGGGAGGCGTTGGCG-3’，
其中，上游引物Ⅰ与下游引物配合用于扩增Ⅰ型猪伪狂犬病毒获得283bp序列，上游引物Ⅱ与下游引物配合用于扩增Ⅱ型猪伪狂犬病毒获得351bp序列。
本发明又提供了所述的引物组合在检测、鉴别猪伪狂犬病毒Ⅰ型和Ⅱ型中的应用。
本发明还提供了一种用于检测、鉴别猪伪狂犬病毒Ⅰ型和Ⅱ型的试剂盒，包含所述引物组合。所述的试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照包括：至少包含如SEQ ID No.1所示序列的Ⅰ型阳性对照，和至少包含如SEQ ID No.2所示序列的Ⅱ型阳性对照。
本发明又提供了一种非医学诊断为目的的检测、鉴别猪伪狂犬病毒Ⅰ型和Ⅱ型的方法，使用所述引物组合，所述方法包括以下步骤：使用上游引物Ⅰ与下游引物配合扩增样本，若扩增出283bp产物，则样本中含有Ⅰ型猪伪狂犬病毒；使用上游引物Ⅱ与下游引物配合扩增样本，若扩增出351bp产物，则样本中含有Ⅱ型猪伪狂犬病毒。
通过三条引物组成两对引物，两对引物分别可以且仅能够扩增Ⅰ型猪伪狂犬病毒或Ⅱ型猪伪狂犬病毒，从而能够将Ⅰ型猪伪狂犬病毒或Ⅱ型猪伪狂犬病毒鉴别出来。两组PCR检测可以分为2个实验组分别检测，当然，为了检测的方便，最好能够将三条引物放入同一体系中进行检测，且相互不影响。所以，优选的，所述的方法，将上游引物Ⅰ、上游引物Ⅱ与下游引物同时加入反应体系中对样本进行双重PCR扩增，
若扩增产物中只有283bp产物，则说明样本中只有Ⅰ型猪伪狂犬病毒；
若扩增产物中只有351bp产物，则说明样本中只有Ⅱ型猪伪狂犬病毒；
若扩增产物中既有283bp产物又有351bp产物，则说明样本中既有Ⅰ型猪伪狂犬病毒又有Ⅱ型猪伪狂犬病毒；
若没有扩增产物，则说明样本中既没有Ⅰ型猪伪狂犬病毒又没有Ⅱ型猪伪狂犬病毒。
更优选的，双重PCR扩增时的退火温度为71℃～72℃。
进一步优选的，双重PCR扩增的程序设置为：95℃预变性5min；95℃变性30s，72℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸10min。
更优选的，双重PCR扩增时的体系为：2×Phanta Mix BUFFER 12.5μL，DNAPloymerase酶0.5μL，dNTP Mix 0.5μL，模板cDNA 0.5μL，浓度为10μmol/L的上游引物Ⅰ、上游引物Ⅱ与下游引物分别1.0、1.0、2.0μL，补足ddH2O至25μL。
本研究通过生物信息学分析方法明确可用于基因分型的gC靶基因，并首次利用AS-PCR原理来设计分型引物，并通过实验筛选到特异性分型的上游引物，而共用保守下游引物，进而减少了体系中的引物种类与数量，降低错配的可能，从而提高扩增效率。并由于PRV基因组具有高GC含量的特点，本研究对影响PCR反应的关键参数——退火温度进行优化，并经过特异性和灵敏性实验最终建立了灵敏度为104的单重PCR和灵敏度为104的双重PCR检测体系，其中单重PCR的灵敏度和农业部兽用生物制品与化学药品重点实验室报道的PRV野毒检测方法一致。
附图说明
图1为序列比对分析结果图。
图2为PRVⅠ型和PRVⅡ型病毒分型引物验证结果图。其中，图2a和2b分别为：PRVⅠ型病毒分型引物分别扩增PRVⅠ型病毒和PRVⅡ型病毒；泳道M：DNA分子质量标准GeneRuler100bp Plus；泳道1～11：PRVⅠ-F1～F11引物扩增PRVⅠ型病毒和PRVⅡ型病毒；泳道-：阴性对照。图2c和2d分别为PRVⅡ型病毒分型引物分别扩增PRVⅠ型病毒和PRVⅡ型病毒；泳道M：DNA分子质量标准GeneRuler 100bp Plus；泳道1～11：PRVⅡ-F1～F5引物扩增PRVⅠ型病毒和PRVⅡ型病毒；泳道-：阴性对照。
图3为PRVⅠ型和Ⅱ型目的基因PCR扩增结果图。其中泳道M：DNA分子质量标准GeneRuler 100bp Plus；泳道1：PRVⅠ型引物扩增PRVⅠ型模板；泳道2：PRVⅠ型引物扩增PRVⅡ型模板；泳道3：PRVⅡ型引物扩增PRVⅡ型模板；泳道4：PRVⅡ型引物扩增PRVⅠ型模板；泳道5：PRVⅠ、Ⅱ型混合引物扩增PRVⅠ、Ⅱ型混合模板；泳道6：阴性对照。
图4为PRV分型引物退火温度的优化结果图。其中，图4a和4b：PRVⅠ型引物在不同退火温度下分别扩增PRVⅠ型病毒和PRVⅡ型病毒；泳道M：DNA分子质量标准GeneRuler 100bpPlus；泳道1～8：PRVⅠ型引物在退火温度为67、68、69、70、71、72、73、74℃下分别扩增PRVⅠ型病毒和PRVⅡ型病毒。图4c和4d：PRVⅡ型引物在不同退火温度下分别扩增PRVⅠ型病毒和PRVⅡ型病毒；泳道M：DNA分子质量标准GeneRuler 100bp Plus；泳道1～8：PRVⅡ型引物在退火温度为67、68、69、70、71、72、73、74℃下分别扩增PRVⅠ型病毒和PRVⅡ型病毒。图4e：PRV二重混合引物在不同退火温度下扩增PRVⅠ型病毒和PRVⅡ型病毒；泳道M：DNA分子质量标准GeneRuler 100bp Plus；泳道1～8：PRV二重型引物在退火温度为67、68、69、70、71、72、73、74℃下扩增PRVⅠ型病毒和PRVⅡ型病毒。
图5为PRV分型引物特异性检测结果图。其中，图5a：PRVⅠ型引物扩增不同病毒的阳性模板；泳道M：DNA分子质量标准GeneRuler 100bp Plus；泳道1：PRVⅠ型阳性模板；泳道2-7：PDCoV、ASFV、CSFV、PRRSV、PCV2、PCV3阳性模板；泳道-：阴性对照。图5b：PRVⅡ型引物扩增不同病毒的阳性模板；泳道M：DNA分子质量标准GeneRuler 100bp Plus；泳道1：PRVⅡ型为阳性模板；泳道2-7：PDCoV、ASFV、CSFV、PRRSV、PCV2、PCV3阳性模板；泳道-：阴性对照。图5c：PRV二重混合引物扩增不同病毒的阳性模板；泳道M：DNA分子质量标准GeneRuler 100bpPlus；泳道1：PRVⅠ型阳性模板；泳道2：PRVⅡ型为阳性模板；泳道3：PRVⅠ、Ⅱ型混合模板；泳道4～9：PDCoV、ASFV、CSFV、PRRSV、PCV2、PCV3阳性模板；泳道-：阴性对照
图6为PRV分型引物敏感性检测结果图。其中，图6a、6b和6c：PRVⅠ型引物、PRVⅡ型引物、PRV二重混合引物分别扩增不同浓度的PRVⅠ型Ⅱ型模板；泳道M：DNA分子质量标准GeneRuler 100bp Plus；泳道1～10：PRVⅠ型阳性模板、PRVⅡ型阳性模板及PRVⅠ型和PRVⅡ型混合阳性模板，浓度梯度109～100拷贝数。
图7为PRV临床病料的PRV检测结果图。其中，泳道M：DNA分子质量标准GeneRuler100bp Plus；泳道1～44：PRV鉴定引物检测44份临床疑似病料；泳道+：阳性对照；泳道-：阴性对照。
图8为PRV分型检测方法的临床应用检测结果图。其中，图8a：PRVⅠ型检测方法检测方法检测6份PRV阳性病料；泳道M：DNA分子质量标准GeneRuler 100bp Plus；泳道1～6：三种体系分别检测6份阳性临床病料；泳道7：PRVⅠ型引物扩增PRVⅠ型模板；泳道-：阴性对照。图8b：PRVⅡ型检测方法检测6份PRV阳性病料；泳道M：DNA分子质量标准GeneRuler100bpPlus；泳道1～6：三种体系分别检测6份阳性临床病料；泳道7：PRVⅡ型引物扩增PRVⅡ型模板，；泳道-：阴性对照。图8c：PRV二重检测方法检测6份PRV阳性病料；泳道M：DNA分子质量标准GeneRuler 100bp Plus；泳道1～6：三种体系分别检测6份阳性临床病料；泳道7：PRVⅠ、Ⅱ型混合引物扩增PRVⅠ、Ⅱ型混合模板；泳道8：PRVⅠ、Ⅱ型混合引物扩增PRVⅠ型模板；泳道9：PRVⅠ、Ⅱ型混合引物扩增PRVⅡ型模板；泳道-：阴性对照。
具体实施方式
病毒、细胞和质粒：
猪伪狂犬病毒DX阳性毒株(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14326，见公开号为CN107653230A的前期专利申请)、猪伪狂犬病毒HD/c阳性毒株(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14325，见公开号为CN107815441A的前期专利申请)、猪伪狂犬病毒SC阳性毒株DNA和猪伪狂犬病毒Bartha K61阳性毒株DNA(杭州佑本动物疫苗有限公司赠送)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)DNA、非洲猪瘟病毒(ASFV)DNA、猪瘟病毒(CSFV)DNA、猪蓝耳病毒(PRRSV)DNA、猪圆环病毒2型(PCV2)DNA和猪圆环病毒3型(PCV3)DNA由浙江尚亚生物科技有限公司合成。
PRVⅠ型和Ⅱ型gC阳性质粒由安徽通用生物有限公司合成，阳性对照包括：包含如SEQ ID No.1所示序列的Ⅰ型阳性对照和包含如SEQ ID No.2所示序列的Ⅱ型阳性对照。
主要仪器及试剂：
PCR仪为美国艾本德公司产品、核酸电泳仪和核酸凝胶成像仪为伯乐公司产品、DNA及RNA核酸抽提试剂盒为北京天根生物产品。
实施例1：引物的设计与合成
根据GenBank中已发表的PRV-SC、PRV-Bartha等13株PRVⅠ型毒株和PRV-BJ/YT、PRV-TJ、PRV-HN1201等17株PRVⅡ型毒株的全基因序列及PRV gB、gD、gC、gE基因序列，用MAGA7.0软件进行序列比对，筛选确定分型靶序列所在基因位点。
使用MAGA7.0软件进行序列比对，进行PRVⅠ型毒株和PRVⅡ型毒株的全基因组序列分析及PRV gB、gC、gD、gE基因序列分析，筛选确定分型最适靶序列基因为gC，且在其中可以找到Ⅰ型和Ⅱ型毒株的连续21bp特异性差异位点(图1)。
根据Ⅰ型和Ⅱ型的差异位点和保守区域，使用Primer5.0软件分别设计针对PRVⅠ和PRVⅡ的特异性扩增引物Ⅰ-F和Ⅱ-F以及相同的R引物，引物序列见表1，并利用等位基因特异PCR技术(AS-PCR)设计引物并进行PCR验证及筛选。
表1试验中所用引物序列信息
Figure BDA0002909631130000051
Figure BDA0002909631130000061
使用设计的16对PRVⅠ和PRVⅡ的特异性扩增引物，进行引物验证。
验证引物特异性体系为25μL，包括2*Phanta Mix BUFFER 12.5μL，DNAPloymerase酶0.5μL，dNTP Mix 0.5μL，模板cDNA 0.5μL，引物F/R(10μmol/L)量分别1.0μL，补足ddH2O至25μL。反应条件为94℃5min；94℃30s，70℃30s，72℃20s，30个循环；72℃5min；16℃5min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。
确认PRVⅠ-F6/PRV-R和PRVⅠ-F7/PRV-R两对引物可以对针对PRV-Ⅰ型病毒进行分型(如图2a2，b)；PRVⅡ-F5/PRV-R引物可以对针对PRV-Ⅱ型病毒进行分型(如图2c，2d)。
最终选择PRV-Ⅰ和PRV-Ⅱ的特异性分型引物如表2，F为分型特异性上游引物，R为通用下游引物。
表2试验中所用引物序列信息
引物名称 引物序列(5’-3’)
Ⅰ-F GAAGCCCCCGCGGAACAA
Ⅱ-F CGCGGCCTCCACGCCCGC
R GCGAGGGAGGCGTTGGCG
分型引物在不同体系及同一体系检测PRV-Bartha-K61和PRV-DX毒株，取5μl PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见在目的条带附近有特异性条带，大小分别为283bp(Ⅰ型引物)和351bp(Ⅱ型引物)与预期大小一致(图3)，阴性对照扩增不出任何条带，测序结果与预期结果一致。
实施例2：病毒核酸的提取
采用病毒DNA/RNA提取试剂盒(北京天根生物产品)，根据说明书要求提取PRV-SC、PRV-Bartha K61、PRV-HD/c、PRV-DX、PDCoV的DNA或RNA。
实施例3：病毒cDNA合成
使用
Figure BDA0002909631130000071
II Reverse Transcriptase试剂盒，将提取的PDCoV和PRRSV的RNA进行反转录，在RNase-free离心管中配制体系，反应体系如下：模板RNA(1pg-1μg)，5×HiScript II qRT SuperMix 4μl，加RNase-free ddH2O至20μl，用移液器轻轻混匀。反应程序如下：50℃，15min；85℃，5s。反转录获得cDNA模板。
实施例4：PCR反应条件退火温度的优化
对PCR进行退火温度的优化。退火温度设定为67、68、69、70、71、72、73、74℃，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，确定最优退火温度。
为获得PCR特异性扩增的最佳反应条件，以不同的退火温度进行梯度PCR反应。PCR反应结束后，按照常规琼脂糖凝胶电泳方法，取5μL PCR产物进行检测，确定最佳退火温度。PRVⅠ型分型引物退火温度为72℃(图4a，b)，PRVⅡ型分型引物退火温度为71℃(图4c，d)，分型引物退火温度确定为72℃(图4e)。
单重PCR扩增体系：包括2×Phanta Mix BUFFER 12.5μL，DNA Ploymerase酶0.5μL，dNTP Mix 0.5μL，模板cDNA 0.5μL，10μmol/L的上游引物和下游引物分别1.0μL，补足ddH2O至25μL。
PRVⅠ型PCR分型方法优化后的程序设置为：95℃预变性5min；95℃变性30s，72℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸10min。
PRVⅡ型PCR分型方法优化后的程序设置为：95℃预变性5min；95℃变性30s，71℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸10min。
PRV双重PCR分型方法扩增体系：2×Phanta Mix BUFFER 12.5μL，DNA Ploymerase酶0.5μL，dNTP Mix 0.5μL，模板cDNA 0.5μL，浓度为10μmol/L的上游引物Ⅰ、上游引物Ⅱ与下游引物分别1.0、1.0、2.0μL，补足ddH2O至25μL。
PRV双重PCR分型方法优化后的程序设置为：95℃预变性5min；95℃变性30s，72℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸10min。
实施例5：特异性实验
以PDCoV、ASFV、CSFV、PCV、PRRSV的基因组或质粒为模板，采用优化条件扩增，并用引物Ⅰ-F/R扩增PRV-Ⅰ阳性基因组模板，用引物Ⅱ-F/R扩增PRV-Ⅱ阳性模板，以检测该方法的特异性。
结果显示，PRVⅠ和PRVⅡ的目的片段大小分别为283bp和351bp，与预期大小相符，两对引物之间无非特异性扩增，且分别用两对引物单独及混合扩增不同基因型的阳性模板均未出现条带。测序结果经BLAST分析证实与已发表序列一致。用此方法检测PDCoV、ASFV、CSFV、PCV、PRRSV均未出现条带，表明单重PCR(图5a，5b)和双重PCR本方法均具有良好的特异性(图5c)。
实施例6：敏感性实验
测定合成质粒PRV-Ⅰ-gC和PRV-Ⅱ-gC的浓度，换算成质粒的拷贝数，进行10倍梯度稀释，分别按最佳反应条件进行单重和二重PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，验证本方法的敏感性。
根据优化条件对10倍梯度稀释后的质粒进行扩增，结果显示，单重PCR(图6a，6b)和二重PCR(图6c)的最低检测限均为104copies，二者的灵敏性结果一致，表明同一体系中两个基因型间未产生明显的相互抑制，灵敏性较高。
实施例7：重复性实验
将本研究建立的PRV分型PCR检测方法，按照优化好的体系进行3次以上的重复性试验，验证其稳定性，以确保本方法稳定可靠。
应用建立的PRV单重PCR和二重PCR检测方法进行3次重复，核酸电泳后均出现目的基因条带，表明重复性较好。
实施例8：临床样品的检测
将临床采集的44份病料(淋巴组织)，研磨处理并进行PCR扩增，首先用2019年发布的中华人民共和国伪狂犬病检测标准中发布的伪狂犬病毒检测引物对病料进行检测，共检出6份疑似样品，阳性率为13.7％(图7)。按照同样的方法用建立的单重分型PCR检测方法(图8a，8b)和双重分型PCR检测方法(图8c)检测样品，结果分别扩出大小为283bp和351bp的片段，表明该病料中的病毒既有PRVⅠ型，也有PRVⅡ型，将扩增片段送至杭州市尚亚生物公司进行测序，测序分析正确。结果表明，本研究所建立的双重PCR检测方法具有临床应用意义。
Figure RE-IDA0003030733550000011
Figure RE-IDA0003030733550000021
Figure RE-IDA0003030733550000031
Figure RE-IDA0003030733550000041

Claims (1)

1.一种非医学诊断为目的的检测、鉴别猪伪狂犬病毒Ⅰ型和Ⅱ型的方法，其特征在于，使用引物组合，所述引物组合包括：
上游引物Ⅰ：5’-GAAGCCCCCGCGGAACAA-3’，
上游引物Ⅱ：5’-CGCGGCCTCCACGCCCGC-3’，
下游引物：5’-GCGAGGGAGGCGTTGGCG-3’，
所述方法包括以下步骤：将上游引物Ⅰ、上游引物Ⅱ与下游引物同时加入反应体系中对样本进行双重PCR扩增，
若扩增产物中只有283bp产物，则说明样本中只有Ⅰ型猪伪狂犬病毒；
若扩增产物中只有351bp产物，则说明样本中只有Ⅱ型猪伪狂犬病毒；
若扩增产物中既有283bp产物又有351bp产物，则说明样本中既有Ⅰ型猪伪狂犬病毒又有Ⅱ型猪伪狂犬病毒；
若没有扩增产物，则说明样本中既没有Ⅰ型猪伪狂犬病毒又没有Ⅱ型猪伪狂犬病毒，
双重PCR扩增时的退火温度为71℃～72℃，
双重PCR扩增的程序设置为：95℃预变性5min；95℃变性30s，72℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸10min，
双重PCR扩增时的体系为：2×Phanta Mix BUFFER 12.5μL，DNA Ploymerase酶0.5μL，dNTP Mix 0.5μL，模板cDNA0.5μL，浓度为10μmol/L的上游引物Ⅰ、上游引物Ⅱ与下游引物分别1.0、1.0、2.0μL，补足ddH2O至25μL。
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