CN109762932A

CN109762932A - 鉴别HP-PRRSV和NADC30-like毒株的检测引物和探针、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN109762932A
Application number: CN201811606770.5A
Authority: CN
Inventors: 宋涛; 芮萍; 马增军; 严世杰; 郝建香
Original assignee: Hebei Normal University of Science and Technology
Current assignee: Hebei Normal University of Science and Technology
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2019-05-17

Abstract

本发明提供一种鉴别HP‑PRRSV和NADC30‑like毒株的检测引物和探针、试剂盒及应用，所述检测引物如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述探针如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示。本发明进一步公开了一种用于鉴别HP‑PRRSV毒株和NADC30‑like毒株的试剂盒，利用鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒HP‑PRRSV毒株和NADC30‑like毒株两种毒株。本发明引物及方法特异、快速、敏感，能够应用于猪繁殖与呼吸综合征病毒HP‑PRRSV和NADC30‑like两种毒株的鉴别检测。

Description

鉴别HP-PRRSV和NADC30-like毒株的检测引物和探针、试剂盒及应用

技术领域

本发明具体涉及一种用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒HP-PRRSV毒株和NADC30-like 毒株的检测引物和探针、试剂盒及应用，属于猪繁殖与呼吸综合征病毒不同毒株的检测鉴别领域。

背景技术

2006年6月开始，我国南方部分省市猪群中发生了以体温高热不退、皮肤发红、呼吸困难为主要临床症状的疫情，并迅速传遍全国，给我国养猪业造成了巨大经济损失。经流行病学调查、病毒分离、基因分析、动物试验等，最终确定是由PRRSV变异株造成的，并定名为高致病性PRRSV(HP-PRRSV)。之后，HP-PRRSV长期在我国流行，并持续给我国养猪业造成了不可估量的损失。2014年底开始，起源于美国的PRRSV缺失株NADC30-like毒株在我国东部省份被鉴定到，并引发母猪严重的流产或早产，又一次严重打击了给我国养猪业。至此，我国临床猪场中PRRSV的流行以HP-PRRSV和NADC30-like两种毒株共同流行为主。

国内对于临床猪场中PRRSV的检测方法主要有Marc-145细胞传代检测法、酶联免疫吸附试验、RT-PCR技术、荧光抗体检测法、微量血清中和试验等。常规的检测方法存在费时费力、灵敏度低等缺点，而且大部分检测方法不能有效地鉴别HP-PRRSV和NADC30-like毒株， RT-PCR技术虽然能鉴别HP-PRRSV和NADC30-like毒株，但荧光定量RT-PCR检测方法的出现，比普通RT-PCR方法的灵敏性更强、特异性更好、污染几率小，高通量等优势。而且Taqman 探针法荧光定量RT-PCR技术检测出现的假阳性低、结果准确可靠，适用于临床猪群中 HP-PRRSV和NADC30-like毒株的鉴别检测。

发明内容

本发明的目的是提供用于一种鉴别HP-PRRSV和NADC30-like毒株的检测引物和探针。本发明的另一个目的是提供HP-PRRSV和NADC30-like毒株的检测试剂盒及检测方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种用于HP-PRRSV和NADC30-like毒株的检测引物和探针，包括用于检测HP-PRRSV 毒株的检测引物和探针以及用于检测NADC30-like毒株的检测引物和探针，其中：

用于检测HP-PRRSV毒株的检测引物和探针：

nsp2-HV-F:5′-CACCTTCCGTGAGTGCAGAG-3′(SEQ ID NO.1)；

nsp2-HV-R:5′-AATCAGTGAATGAGCCGACA-3′(SEQ ID NO.2)；

nsp2-HV-P:5′-FAM-GAGACACTGACGAGCTGCTTG-BHQ1-3′(SEQ ID NO.3)。

用于检测NADC30-like毒株的检测引物和探针：

nsp2-del-F:5′-CGAATGARCCTGTGCCTGTCCC-3′(SEQ ID NO.4)；

nsp2-del-R:5′-TTCCTTCCACCTGCTGAAGCCCAC-3′(SEQ ID NO.5)；

nsp2-del-P:5′-HEX-CCCTGTGCCCGCACCACGA-BHQ2-3′(SEQ ID NO.6)；

其中，R为A，G。

进一步的，本发明还提供含有所述引物和探针的用于HP-PRRSV和NADC30-like毒株的荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

进一步的，所述试剂盒还包括以下组分：2×RT-PCR Buffer缓冲液、DNA聚合酶、反转录酶、上游引物、下游引物、探针、Total RNA、RNase free H₂O。

作为最优方案，所述RT-PCR反应液的总体积为25μL，所述RT-PCR反应液包括以下组分：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ：12.5μL(购于TaKaRa公司)，PrimeScript RTEnzyme Mix Ⅱ：0.5μL(购于TaKaRa公司)，5U/μL TaKaRa Ex Taq HS：0.5μL(购于TaKaRa公司)， nsp2-HV-F(20μM)：0.6μL，nsp2-HV-R(20μM)：0.6μL，nsp2-HV-P(20μM)：0.4μL，nsp2-del-F (20μM)：0.6μL，nsp2-del-R(20μM)：0.6μL，nsp2-del-P(20μM)：0.4μL，Total RNA：5μL， RNase free H₂O：3.3μL。

进一步的，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。

所述HP-PRRSV和NADC30-like毒株的荧光定量RT-PCR检测试剂盒使用时包括如下步骤：

S1.提取待检样品的RNA；

S2.一步法RT-PCR，利用反转录过程将RNA反转录成cDNA，同时进行荧光定量PCR；

S3.对数据进行处理、判定检测结果；

本发明所述的RNA提取是指用商品化病毒RNA试剂盒提取的RNA或用Trizol法提取的病毒RNA。

本发明中最优反应程序是指1个循环反转录50℃，30min；1个循环cDNA预变性95℃， 1min；40个循环95℃，15sec；60℃，30sec，于60℃进行荧光信号采集。

本发明所述的结果判定：点击荧光定量PCR仪分析界面，取3～15个循环荧光信号为基线。阈值为阈值线刚好超过正常阴性对照的扩增曲线的最高点，无Ct值并且与阳性对照的指数期相交为准。当检测样本的Ct值≤35，且曲线有明显的指数增长期，结果可以直接判定为阳性；当检测样品35<Ct值<40，需要重新检测一次，若Ct值仍<40，且扩增曲线有明显的指数增长期，可判定结果为阳性，否则为阴性；检测结果无Ct值或Ct值为40，结果判定为阴性。

用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株的荧光定量RT-PCR检测引物、探针及试剂盒，包括应用荧光定量RT-PCR方法检测待测样本中是否存在HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株RNA的步骤，其中所述RT-PCR方法应用了以下引物对和探针：序列为：

nsp2-HV-F:5′-CACCTTCCGTGAGTGCAGAG-3′，

nsp2-HV-R:5′-AATCAGTGAATGAGCCGACA-3′，

nsp2-HV-P:5′-FAM-GAGACACTGACGAGCTGCTTG-BHQ1-3′，

nsp2-del-F:5′-CGAATGARCCTGTGCCTGTCCC-3′，

nsp2-del-R:5′-TTCCTTCCACCTGCTGAAGCCCAC-3′，

nsp2-del-P:5′-HEX-CCCTGTGCCCGCACCACGA-BHQ2-3′。

用于鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株的荧光定量RT-PCR检测引物、探针及试剂盒，还包括应用上述荧光定量RT-PCR试剂盒检测待测样本中是否存在HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株RNA的步骤。

与现有技术相比，本发明具有的优点和积极效果是：

本发明根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株的基因序列设计了两对特异性引物，通过对荧光定量RT-PCR反应条件进行相应的优化，具有较好的重复性、灵敏性和特异性，可以分别用于猪繁殖与呼吸综合征病毒HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株的检测，特别是对PRRSV感染的早期快速检测及其对猪源原材料等是否污染HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株的快速监测；本发明采用探针法荧光定量 RT-PCR方法，其假阳性率低于SYBR Green染料法，其检测结果更加准确，与普通PCR检测方法相比，本发明具有特异性高、灵敏性高、重复性好等优点，扩增与检测一步完成，操作省时简单。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为设计HP-PRRSV毒株特异性检测引物和探针时，利用DNAman软件对PRRSV 代表毒株nsp2 HV区部分基因进行序列比对的图谱。

图2为设计NADC30-like毒株特异性检测引物和探针时，利用DNAman软件对PRRSV代表毒株nsp2缺失区部分基因进行序列比对的图谱。

图3为二通道荧光PCR体系中HP-PRRSV毒株nsp2 HV区部分基因检测的灵敏度试验，从左到右依次为1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹拷贝/μL的标准品扩增结果，由图可知，HP-PRRSV毒株nsp2 HV区部分基因检测的灵敏度为1.0×10²拷贝/μL。

图4为二通道荧光PCR体系中NADC30-like毒株nsp2缺失区部分基因检测的灵敏度试验，从左到右依次为1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、 1.0×10¹拷贝/μL的标准品扩增结果，由图可知，NADC30-like毒株nsp2缺失区部分基因检测的灵敏度为1.0×10²拷贝/μL。

图5为二通道荧光PCR体系中检测PRRSV HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株灵敏度的溶解曲线，图中1为检测HP-PRRSV毒株的灵敏度的溶解曲线，2为检测NADC30-like 毒株灵敏度的溶解曲线。

图6为二通道荧光PCR体系中检测PRRSV HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株的特异性试验结果，如图所示，HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株样本为阳性，PRRSV经典毒株、PCV2毒株、PRV毒株和CSFV毒株为阴性。

图7为二通道荧光PCR体系中检测PRRSV HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株的重复性试验，如图所示，同一模板重复进行4次荧光定量RT-PCR反应，HP-PRRSV毒株的所有样品的Ct值介于18.80～19.45之间，最大Ct值相差0.65；NADC30-like毒株的所有样品的Ct值介于13.25～13.61之间，最大Ct值相差0.36。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例：

1.材料

1.1病毒

猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株QHD1株、猪圆环病毒2型(PCV2)Hebei1株和猪伪狂犬病毒(PRV)Rac1株由河北省预防兽医学重点实验室保存，GenBank登陆号分别为MG687491、MG182435和KU962912，猪瘟兔化弱毒株(CSFV)C株、HP-PRRSV 毒株JXA1-R株、PRRSV经典毒株CH-1R株购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.2仪器和试剂

荧光定量PCR仪，美国Bio-Rad公司；台式高速冷冻离心机，德国Ohaus公司；OneStep PrimeScript RT-PCR Kit、pMD18-T载体，大连宝生物公司。

2.方法

2.1引物和探针的选择

在NCBI网站上通过Blast分析查找PRRSV经典毒株、HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株的基因组序列，经过DNAman和MEGA7等软件序列比对，利用Oligo7软件在PRRSV nsp2的高变区(HV)设计多组引物对和探针，对设计的引物对和探针进行优化，最终选取了一对扩增HP-PRRSV nsp2 HV区的特异性引物和探针(分别命名为nsp2-HV-F、nsp2-HV-R 和nsp2-HV-P)，一对扩增NADC30-like毒株的特异性引物和探针(分别命名为nsp2-del-F、 nsp2-del-R和nsp2-del-P)，图1为设计HP-PRRSV毒株特异性检测引物和探针时，PRRSV 代表毒株nsp2 HV区部分序列比对图；图2为设计NADC30-like毒株特异性检测引物和探针时，PRRSV代表毒株nsp2缺失区域部分序列比对图。

所设计引物对和探针序列如下：

用于检测HP-PRRSV毒株的特异性引物：

nsp2-HV-F:5′-CACCTTCCGTGAGTGCAGAG-3′(SEQ ID NO.1)；

nsp2-HV-R:5′-AATCAGTGAATGAGCCGACA-3′(SEQ ID NO.2)；

nsp2-HV-P:5′-FAM-GAGACACTGACGAGCTGCTTG-BHQ1-3′(SEQ ID NO.3)。

用于检测NADC30-like毒株的特异性引物：

nsp2-del-F:5′-CGAATGARCCTGTGCCTGTCCC-3′(SEQ ID NO.4)；

nsp2-del-R:5′-TTCCTTCCACCTGCTGAAGCCCAC-3′(SEQ ID NO.5)；

nsp2-del-P:5′-HEX-CCCTGTGCCCGCACCACGA-BHQ2-3′(SEQ ID NO.6)。

其中，R为A，G。

2.2总RNA提取

模板RNA的制备，以HP-PRRSV JXA1-R毒株和NADC30-like毒株QHD1株的细胞培养物为阳性对照，以正常细胞培养物为阴性对照，待检样品用匀浆破碎后，采用Trizol法提取总RNA。

具体操作步骤如下：分别取阳性对照、阴性对照和待测样品各200μL于1.5mL离心管中，再加入800μL的Trizol于涡旋仪上震荡1min，加入200μL氯仿，于涡旋仪上震荡1min，冰浴5min，12,000rpm离心5min，取400μL上清转入另一1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀后沉淀RNA，室温静置10min，12,000rpm离心10min，再用75％乙醇洗涤沉淀，干燥，最后用20μL DEPC(焦磷酸二乙酯)水溶解沉淀，立即用于荧光定量RT-PCR 扩增或保存-20℃备用。

2.3反转录

每管反转录反应体系含如下成分：2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ12.5μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5μL，TaKaRa Ex Taq HS 0.5μL，nsp2-HV-F(20μM)0.6μL，nsp2-HV-R (20μM)0.6μL，nsp2-HV-P(20μM)0.4μL，nsp2-del-F(20μM)0.6μL，nsp2-del-R(20μM) 0.6μL，nsp2-del-P(20μM)0.4μL，Total RNA5μL，RNase free H₂O 3.3μL。

2.4 pMD18-T-nsp2标准品的制备

将含有HP-PRRSV JXA1-R毒株的nsp2 HV区和NADC30-like QHD1毒株的nsp2缺失(del)区域的阳性扩增产物依次克隆入pMD18-T载体中，筛选阳性重组质粒pMD18-T-nsp2送北京奥科鼎盛生物科技有限公司，采用T7引物进行测序。应用分光光度计对测序正确的pMD18-T-nsp2质粒进行测定其OD₂₆₀，重复5次，参考质粒DNA拷贝数计算方法，计算 pMD18-T-nsp2质粒的浓度为7.54×10⁹拷贝/μL，并定量稀释至1.0×10¹～1.0×10⁸拷贝/μL， -20℃保存备用。

2.5鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株的荧光定量RT-PCR反应条件的优化

2.5.1将步骤2.4中获得的pMD18-T-nsp2重组质粒分别稀释至终浓度1.0×10⁴拷贝/μL 作为检测模板，nsp2-HV-F、nsp2-HV-R、nsp2-HV-P、nsp2-del-F、nsp2-del-R、nsp2-del-P 等引物和探针分别稀释至终浓度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0μmol/L，应用荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司，型号iQ5)采用矩阵法筛选不同浓度的引物和探针组合，筛选出针对HP-PRRSV和NADC30-like毒株最佳引物浓度、探针浓度和最佳反应条件。

2.5.2优化的25μL PCR反应体系中，各上下游引物nsp2-HV-F、nsp2-HV-R、nsp2-del-F、nsp2-del-R的终浓度都为0.3μmol/L，探针nsp2-HV-P、nsp2-del-P的终浓度均为0.2μmol/L。优化的荧光定量RT-PCR反应程序为：1个循环反转录50℃，30min；1个循环cDNA预变性95℃，1min；40个循环95℃，15sec；60℃，30sec，于60℃进行荧光信号采集。

2.5.3反应参数设置

探针检测模式设置为：所有检测孔均设置为FAM和HEV荧光双通道模式。

3.结果分析和判定

反应结束后，调整阈值使阴性质控无Ct值或Ct值为40，FAM荧光Ct值≤35且呈S 型扩增曲线为HP-PRRSV毒株阳性，HEV荧光Ct值≤35且呈S型扩增曲线为PRRSV NADC30-like毒株阳性，若FAM荧光和HEV荧光Ct值均≤35且呈S型扩增曲线则为HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株双阳性；当荧光Ct值均在35～40直接或没有呈S型扩增曲线时，需复检，若Ct值仍<40，且扩增曲线有明显的指数增长期，可判定结果为阳性，否则为阴性；当荧光无Ct值或Ct值为40，结果判定为阴性。

4.灵敏度试验

将步骤2.4获得的pMD18-T-nsp2质粒1.0×10¹～1.0×10⁸拷贝/μL的倍比稀释质粒为模板，应用实施例优化后的荧光定量RT-PCR进行检测，HP-PRRSV毒株引物对检测的灵敏度实验见图3，NADC30-like毒株引物对检测的灵敏度实验见图4。结果证实本试剂盒检测灵敏度为：1.0×10²拷贝/μL。图5为PRRSV灵敏度试验的溶解曲线，结果这两对引物种每对引物各稀释度倍数在特定范围内均存在峰值，且为单峰，说明没有非特异性扩增。

5.特异性试验

将HP-PRRSV JXA1-R株、NADC30-like QHD1株、PRRSV CH-1R株、PCV2 Hebei1 株、PRV Rac1株和CSFV C株提取病毒的核酸进行荧光定量RT-PCR反应，同时设立阴性对照，利用上述的最佳反应体系及其程序进行。检测结果如图6所示，FAM荧光通道显示只有HP-PRRSV JXA1-R株具有相应的Ct值，其他病毒毒株均为阴性；而HEV荧光通道显示只有NADC30-like QHD1株具有相应的Ct值，其他病毒毒株均为阴性。因此，此结果证明建立的鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株的荧光定量 RT-PCR检测方法特异性较好。

6.重复性试验

根据已经优化好的反应条件，对同一样品提取病毒RNA进行荧光定量RT-PCR反应。结果图7所示，同一模板重复进行4次荧光定量RT-PCR反应，结果表明HP-PRRSV毒株的所有样品的Ct值介于18.80～19.45之间，最大Ct值相差0.65；NADC30-like毒株的所有样品的Ct值介于13.25～13.61之间，最大Ct值相差0.36，表明检测样品结果的重复性较好。

7.稳定性试验

分别使用1001、1003、1005等3批试剂盒对20个质控样本进行检测，每个月检测一次，每批试剂盒做3个重复，持续6个月，测定本试剂盒的稳定性。结果显示，这3批试剂盒对20个质控样本进行为期6个月的检测，Ct值变异系数为2.21％～4.56％，小于10％，说明本试剂盒在6个月内具有较好的稳定性。

8.符合性试验

分别用本试剂盒和HP-PRRSV毒株、NADC30-like毒株RT-PCR检测方法对20个质控样本及80份临床样本进行检测，结果二者的符合率为96％，符合预期。

Claims

1.鉴别HP-PRRSV和NADC30-like毒株的检测引物和探针，其特征在于，包括用于检测HP-PRRSV毒株的检测引物和探针以及用于检测NADC30-like毒株的检测引物和探针；其中：

用于检测HP-PRRSV毒株的检测引物和探针：

nsp2-HV-F:5′-CACCTTCCGTGAGTGCAGAG-3′(SEQ ID NO.1)；

nsp2-HV-R:5′-AATCAGTGAATGAGCCGACA-3′(SEQ ID NO.2)；

nsp2-HV-P:5′-FAM-GAGACACTGACGAGCTGCTTG-BHQ1-3′(SEQ ID NO.3)；

用于检测NADC30-like毒株的检测引物和探针：

nsp2-del-F:5′-CGAATGARCCTGTGCCTGTCCC-3′(SEQ ID NO.4)；

nsp2-del-R:5′-TTCCTTCCACCTGCTGAAGCCCAC-3′(SEQ ID NO.5)；

nsp2-del-P:5′-HEX-CCCTGTGCCCGCACCACGA-BHQ2-3′(SEQ ID NO.6)；

其中，R为A，G。

2.用于鉴别HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1所述的检测引物和探针。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含用于25μL荧光定量RT-PCR反应体系的试剂：荧光定量一部分RT-PCR反应液2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ12.5μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5μL，TaKaRa Ex Taq HS 0.5μL，nsp2-HV-F(20μM)0.6μL，nsp2-HV-R(20μM)0.6μL，nsp2-HV-P(20μM)0.4μL，nsp2-del-F(20μM)0.6μL，nsp2-del-R(20μM)0.6μL，nsp2-del-P(20μM)0.4μL，Total RNA 5μL，RNase free H₂O 3.3μL。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性对照标准品和阴性对照标准品。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照标准品为重组质粒pMD18-T-nsp2。

6.用于鉴别HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

S1.提取待检样品的RNA；

S3.对数据进行处理、判定检测结果。

7.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，所述RNA提取是指用商品化病毒RNA试剂盒提取的RNA或用Trizol法提取的病毒RNA。

8.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，所述荧光定量RT-PCR反应条件为：1个循环反转录50℃，30min；1个循环cDNA预变性95℃，1min；40个循环95℃，15sec；60℃，30sec，于60℃进行荧光信号采集。

9.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，应用荧光定量RT-PCR方法检测待测样本中是否存在HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株RNA的步骤，其中所述RT-PCR方法应用了以下引物对和探针，序列为：

nsp2-HV-F:5′-CACCTTCCGTGAGTGCAGAG-3′，

nsp2-HV-R:5′-AATCAGTGAATGAGCCGACA-3′，

nsp2-HV-P:5′-FAM-GAGACACTGACGAGCTGCTTG-BHQ1-3′，

nsp2-del-F:5′-CGAATGARCCTGTGCCTGTCCC-3′，

nsp2-del-R:5′-TTCCTTCCACCTGCTGAAGCCCAC-3′，

nsp2-del-P:5′-HEX-CCCTGTGCCCGCACCACGA-BHQ2-3′。

10.HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株的检测鉴别方法，其特征在于，该检测鉴别方法包括：

S4.点击荧光定量PCR仪分析界面，取3～15个循环荧光信号为基线；阈值为阈值线刚好超过正常阴性对照的扩增曲线的最高点，无Ct值并且与阳性对照的指数期相交为准；

当检测样本的Ct值≤35，且曲线有明显的指数增长期，结果可以直接判定为阳性；当检测样品35<Ct值<40，需要重新检测一次，若Ct值仍<40，且扩增曲线有明显的指数增长期，可判定结果为阳性，否则为阴性；检测结果无Ct值或Ct值为40，结果判定为阴性。