CN103074452A - 一种同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同步检测十五种出血发热病原体及其检测方法，该试剂盒包括DEPC水、5×RT缓冲液、反转录引物、反转录酶、X溶液、10×PCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品，特点是反转录引物包括九种出血发热病原体与人RNA内参的RT扩增引物，基因序列如SEQ ID NO.1～NO.10所示，PCR引物包括余下六种出血发热病原体、人DNA内参和反应内参的正反向PCR扩增引物以及上述九种出血发热病原体与人RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如SEQ ID NO.10～NO.36所示，优点是特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果。

Description

一种同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及出血发热病原体的检测试剂盒及其检测方法，尤其是涉及一种基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒及其检测方法。

背景技术

发热伴出血是危害人类健康的重要传染病，流行广，病情危急，病死率高，危害极大。由于该病有发热症状，故常被误诊为上呼吸道感染。另外常规实验室检查如血液生化检查、血清学检测、以及病毒分离等手段不能快速准确鉴别各种病原体，造成延误治疗甚至使疫情蔓延。因此急需一种高效的出血发热病原体诊断方法。

目前，我国出血发热病原体的传统检测方法主要包括以下几种：

（1）一般实验室检查：发病早期检测是否存在蛋白尿、血液转氨酶水平是否升高、白细胞以及淋巴细胞细胞总数变化等。优点：成本低；对实验室硬件要求低。缺点：初期判断，不能确诊。

（2）免疫学检查：应用最广泛的是酶联免疫技术（ELISA）：一般先用一抗与抗原发生特异性结合，然后用通用的酶标记的二抗与一抗发生特异性结合，再将酶显色，之后观察结果。优点：1）样品通量较高：利用96孔酶标板，一块平板可完成多个样品的检测；2）较敏感：利用酶联的特性，可将原来的抗原信号放大；3）快捷：在时间上，比传统的培养基微生物培养检查法要缩短很多。但存在如下缺点：1）易出现假阳性：由于洗涤和抗原包被的操作，或由于抗原表面决定簇类似而发生交叉反应，故易出现假阳性；2）耗时耗力：制作抗体是非常耗时耗力的工作；3）灵敏度不确定：实验的灵敏度取决于抗体的好坏，而每个抗体的好坏不一，质量难以控制；4）无法检测多变异的病原体。

（3）病原体检查：即直接做影像及活组织检查，或病原体分离培养，之后在显微镜、电镜下观察，做出诊断。优点：成本低；对实验室硬件要求低。缺点：1）耗时长：一般需3-5天或更长；2）诊断效率低：只能单菌纯培养；对一些表型特征变异的病原体，用形态学经验很难辨别；此外，由于抗生素的滥用，细菌在检测过程中生长受到抑制，导致假阴性的结果；3）工作量巨大：由于对每个抽检样品的每种菌都必须进行检测，工作量非常巨大，特别是部分对培养环境要求较为苛刻的菌，更加大了检测的工作量和难度。

（4）分子生物学——PCR检测方法：目前经常应用的有实时荧光定量PCR、免疫PCR、反转录PCR等，都是针对病原体的特异性靶基因进行检测。其中，荧光定量PCR检测方法最为成熟。荧光定量PCR技术的优点：灵敏性高，并可精确定量，在对李氏杆菌、沙门氏菌、肉毒杆菌、大肠杆菌等的检测中都取得了良好效果。2004年，中国发布了实施荧光定量PCR检测禽流感H7亚型的国家标准。2009年，美国FDA批准了用荧光定量PCR检测猪流感H1N1亚型的试剂盒。但也存在如下缺点：1）通量低：一次只能检测一个病原成分，如需要检测多种病原菌，就需要多台PCR仪同时工作，效率低，周期长，对大批量的多种病原污染的样品更是无从下手；2）成本相对较高：因一次只能检测一个病原体，当一个样品同时需要检测多种病原菌时，必须一个一个检测，成本相对增高。

（5）分子生物学——基因芯片法：基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针），有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。优点：1）高通量并行检测：当一个样品同时需要检测多种病原菌时，一次实验即可得出全部结果；2）操作简便快速：整个检测只需4-8小时基本可以出结果；但也存在如下缺点：1）技术成本昂贵、复杂：每个样品需要一个芯片，成本大于￥1000/样品，不利于大规模推广；2）探针的合成与固定比较复杂，特别是制作高密度的探针阵列，是主要的限速步骤；3）不能精确定量，重复性差；4）灵敏度较低：芯片法需核酸量较大，一般须先做多重PCR扩增，由于引物较多，容易自身产生二聚体，发夹结构，或由于Tm值不同，而导致扩增目的片段效率不同，进而影响检测的灵敏度；5）由于芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准。

GenomeLab^TMGeXP多重基因表达遗传分析系统基于贝克曼公司成熟的毛细管电泳分离技术及高灵敏度的激光诱导荧光技术研发而成，一束8道的毛细管陈列设计充分利用了96孔板的排列特性，降低了使用更大的陈列带来的花费和复杂性。采用多重PCR方法，通过Beckman Coulter染色标记，在同一个EP管中同时分析多个基因的表达，能快速有效地检测基因的表达状况，克服了上述出血发热病原体的传统检测方法存在的缺陷，具有以下优点：

1、高通量：本系统采用双（96孔）板、自动加样和样品追踪技术，实现单个反应检测30-40个位点，可同时做192个反应（如192个患者样品，每个样品检测30种腹泻病毒，30个位点），一天出结果；对于交叉感染患者，本方法可一次性给出准确报告，避免漏检。

2、准确性强：GeXP采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性；

3、敏感性高，结果重复性好：GeXP系统克服了传统PCR扩增方法的不均等扩增造成的偏差，提高了对一套目的基因进行定量的速度和敏感性，采用激光诱导荧光-PMT，具有超高灵敏度；

4、方法简便，使用经济：GeXP提供从试剂、多重PCR引物设计、结果及定量表达谱分析等全套实验方案；每个样品的检测成本少于￥50，利于大规模推广；

5、精确定量、灵活性强：可精确定量病原体基因拷贝数，可随时根据需求调整检测的靶基因。

6、易于实现自动化：就样品制备而言，Biomek系列自动液体处理仪可以与GeXP分析仪和Ampligrid扩增仪完全匹配，集成的条形码阅读器保证了准确的样品追踪和结果报告。

目前，国内外还没有关于基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒及其检测方法的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果的基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒及其检测方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒，包括DEPC水、5×RT缓冲液，反转录引物、反转录酶、X溶液、10×PCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品，所述的反转录引物包括以下表1中九种出血发热病原体的RT扩增引物及人RNA内参的RT扩增引物，所述的PCR引物包括表1中余下六种出血发热病原体的正反向PCR扩增引物、人DNA内参的正反向PCR扩增引物、反应内参的正反向PCR扩增引物以及上述九种出血发热病原体的PCR扩增引物及人RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如下表1所示：

表1

所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。

所述的阳性对照品为连接有设计上述十五种出血发热病原体、RNA内参、DNA内参和反应内参的引物的基因保守序列的pMD18-T的克隆载体。

一种利用同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒的检测出血发热病原体的方法，具体包括以下步骤：

（1）采集样本并提取核酸

采集出血发热患者的血液或咽拭子的分离培养物，从分离培养物中提取核酸；

（2）以患者核酸为模板进行RT反应

取5-20ng/ul的核酸样品RNA5μL，DEPC水8μL，5×RT缓冲液4μL，RT引物溶液2μL，RT酶1μL混匀后加入到96孔样品板上进行反转录，反应条件：48°C1分钟；42°C60分钟；95°C5分钟；4°C直至收取RT产物；其中反转录引物溶液中各RT引物浓度均为500nM，所述的RT引物包括九种出血发热病原体与人RNA内参的RT扩增引物，基因序列如序列表中SEQ ID NO.1～NO.10所示；

（3）以反转录产物为模板进行PCR反应

取RT产物8.6μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM的氯化镁4μL，PCR引物溶液2μL，DNA聚合酶1.4μL，X溶液2μL混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：95°C10分钟；94°C30秒钟，55°C30秒钟，70°C1分钟，循环35次；70°C1分钟；4°C直至收取PCR产物；其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记，PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为200nM，PCR引物包括包括余下六种出血发热病原体、人DNA内参与反应内参的正反向PCR扩增引物以及上述九种出血发热病原体与人RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如序列表中SEQ ID NO.10～NO.36所示；

（4）GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品

取PCR产物1μL，GeXP遗传分析仪配套的上样缓冲液38.75μL，DNA Marker0.5μL，矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品，将GeXP遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比，判断出血发热病原体的种类。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒及其检测方法，由于该试剂盒引入了针对汉坦病毒、登革病毒、新疆出血热病毒、埃博拉病毒、新布尼亚病、基孔肯雅病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、马尔堡病毒、鼠疫杆菌、脑膜炎奈瑟菌、猪链球菌、化脓性链球菌、钩端螺旋体、立克次体（恙虫病）等等所设计的特异性扩增引物，可以同时针对15种出血发热病原体进行检测，一天之内可完成192个患者样品的检测，既节约了生产成本和检测成本，又提高了检测效率及缩短了时间；人DNA和人RNA完整性的对照内参，确保在检验过程中对样品质量的判断，避免假阴性；正常反应对照内参（RXN control）：监控PCR反应效率，避免假阴性，使得检测具有更好的灵敏度和特异性，从而避免了其他检测方法特异性不高的问题。

综上所述，本发明基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒及其检测方法，可以同时针对15种出血发热病原体进行检测，检测敏感性高，特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率，还能够有效解决常规PCR的易污染问题；具有非竞争性内对照体系，可靠性强，无假阴性结果，利用GeXP遗传分析系统灵敏、准确定量、快速、高通量的技术优势，将为疾控中心、医院及其它医疗机构提供一种灵敏、准确、快速且低成本的多重基因检测方案。

附图说明

图1为GeXP遗传分析仪的毛细电泳分离样品结果标准图谱。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例一

本发明一种同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒，包括DEPC水（无RNA酶/DNA酶超纯水），5×RT缓冲液，反转录引物（RT primer mix）、RT酶（全称反转录酶Reversetranscripatase）、X溶液，10×PCR缓冲液，PCR引物（PCR Primer Mix），25mM氯化镁溶液，DNA聚合酶（Taq DNA Polymerase），阳性对照品（各目标病原体克隆所得，包含目标片段质粒，用于质控整个反应体系），5×RT缓冲液，10×PCR缓冲液、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶订于sigma公司。

上述反转录引物包括以下表1中九种出血发热病原体的RT扩增引物及人RNA内参的RT扩增引物，上述PCR引物包括表1中余下六种出血发热病原体的正反向PCR扩增引物、人DNA内参的正反向PCR扩增引物、反应内参的正反向PCR扩增引物以及上述九种出血发热病原体的PCR扩增引物及人RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如表1所示：

表1出血发热病原体多重基因检测寡核苷酸序列

上述X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）和通用引物，该通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，通用引物正向扩增引物带荧光标记。

上述阳性对照品连接有设计上述十五种出血发热病原体、RNA内参、DNA内参和反应内参的引物的基因保守序列的pMD18-T的克隆载体。

上述针对人DNA的内参，可检测样品中DNA提取的有效性。

上述针对人RNA的内参，可检测样品中RNA提取的有效性。

上述以质粒pcDNA3.1为模板的反应内参，用于监测PCR反应的正常进行。

具体实施例二

本发明一种同步检测十五种出血发热病原体的检测方法，检测的出血发热病原体汉坦病毒、登革病毒、新疆出血热病毒、埃博拉病毒、新布尼亚病、基孔肯雅病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、马尔堡病毒、鼠疫杆菌、脑膜炎奈瑟菌、猪链球菌、化脓性链球菌、钩端螺旋体、立克次体（恙虫病）等（见表1），采集患者样品（血液、咽拭子等）提取核酸，以患者核酸为模板进行反转录和PCR反应，最终用毛细电泳方法分离样品，具体步骤如下：

1、生产基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒，试剂盒中包括的组分同上述实施例1；

2、采集样本并提取核酸

采集患者的血液、咽拭子等的分离培养物，从分离培养物中提取核酸；

3、以患者核酸为模板进行反转录（RT）反应

1）按以下比例在96孔样品板上加入试剂和样品（RT板见表2）：

表2RT反应试剂和样品混合比例

注：在RT反应中加入阳性对照品，阳性对照品做平行对照试验，所述阳性对照品为由各目标病原体克隆所得，包含目标片段质粒。

2）混匀后按以下温度孵育（见表3）：

表3RT反应条件

步骤	温度	时间
			1	48°C	1分钟
2	42°C	60分钟
			3	95°C	5分钟
4	4°C	持续:直至收取RT产物

4、以反转录产物为模板进行PCR反应

1）按以下比例在96孔样品板上加入试剂和样品（PCR板见表4）：

表4PCR反应试剂和样品混合比例

PCR反应试剂	量/孔
		10×PCR缓冲液	2μL
25mM MgCl2	4μL
		PCR引物	2μL
DNA聚合酶	1.4μL
		X溶液	2μL
RT产物	8.6μL
		Total	20μL

注：X溶液包括三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）和通用引物，通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，通用引物正向扩增引物带荧光标记。

2）混匀后按以下温度进行热循环反应（见表5）：

表5PCR反应条件

步骤	温度	时间
			1	95°C	10分钟
2	94°C	30秒钟
			3	55°C	30秒钟
4	70°C	1分钟
			5	N/A	重复2-4步骤34次（共35次）
6	70°C	1分钟
			7	4°C	持续:直至收取PCR产物

5、GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品

1）制备GeXP样品（见表6）：

表6GeXP样品混合比例

GeXP样品	量/孔
		上样缓冲液（Beckman GeXP系统配套试剂）	38.75μL
DNA大小标准400	0.5μL
		PCR产物	1μL
矿物油	1滴

2）毛细电泳分离样品

将GeXP样品加入96孔毛细管电泳分离板上适当数目的孔中进行毛细管电泳分离；毛细管电泳分离是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术，具体程序为90℃变性120秒，进样电压2kv，30秒，分离电压6kv，35分钟。6、结果分析（见GenomeLab GeXP遗传分析仪说明书）

根据GeXP遗传分析仪自有软件上默认的参数对结果进行片段大小分析，其横坐标表示片段大小，纵坐标为信号强弱。将GeXP遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比，判断出血发热病原体的种类。标准图谱如图1所示，其结果能准确检测出十五种出血发热病原体，各目标片段大小间隔适中，且信号不至于过饱和，各靶标间信号相对持平，且没有宽峰、双峰等现象。

具体实施例三

检测试剂盒灵敏度、特异性分析

灵敏度分析：将阳性对照按一定拷贝数倍比稀释后，经PCR扩增和毛细管电泳检测直至检测不到信号，该拷贝数即为最低检测线，也就是试剂盒的灵敏度。最高灵敏度可检测到40拷贝。

特异性分析：单重PCR扩增经毛细管电泳检测为目标片段大小的单峰。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒，包括DEPC水、5×RT缓冲液，反转录引物、反转录酶、X溶液、10×PCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品，其特征在于所述的反转录引物包括以下表中九种出血发热病原体的RT扩增引物及人RNA内参的RT扩增引物，所述的PCR引物包括表中余下六种出血发热病原体的正反向PCR扩增引物、人DNA内参的正反向PCR扩增引物、反应内参的正反向PCR扩增引物以及上述九种出血发热病原体的PCR扩增引物及人RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如下表所示：

2.根据权利要求1所述的一种同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒，其特征在于：所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。

3.根据权利要求1所述的一种同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照品为连接有设计上述十五种出血发热病原体、RNA内参、DNA内参和反应内参的引物的基因保守序列的pMD18-T的克隆载体。

4.一种利用权利要求1-3中任一项所述的同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒的检测出血发热病原体的方法，其特征在于具体包括以下步骤：

（1）采集样本并提取核酸

采集出血发热患者的血液或咽拭子的分离培养物，从分离培养物中提取核酸；

（2）以患者核酸为模板进行RT反应

取5-20ng/ul的核酸样品RNA5μL，DEPC水8μL，5×RT缓冲液4μL，RT引物溶液2μL，RT酶1μL混匀后加入到96孔样品板上进行反转录，反应条件：48°C1分钟；42°C60分钟；95°C5分钟；4°C直至收取RT产物；其中反转录引物溶液中各RT引物浓度均为500nM，所述的RT引物包括九种出血发热病原体与人RNA内参的RT扩增引物，基因序列如序列表中SEQ ID NO.1～NO.10所示；

（3）以反转录产物为模板进行PCR反应

取RT产物8.6μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM的氯化镁4μL，PCR引物溶液2μL，DNA聚合酶1.4μL，X溶液2μL混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：95°C10分钟；94°C30秒钟，55°C30秒钟，70°C1分钟，循环35次；70°C1分钟；4°C直至收取PCR产物；其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记，PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为200nM，PCR引物包括包括余下六种出血发热病原体、人DNA内参与反应内参的正反向PCR扩增引物以及上述九种出血发热病原体与人RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如序列表中SEQ ID NO.10～NO.36所示；

（4）GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品

取PCR产物1μL，GeXP遗传分析仪配套的上样缓冲液38.75μL，DNA Marker0.5μL，矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品，将GeXP遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比，判断出血发热病原体的种类。

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