CN106011296A - 一种结核分枝杆菌Rv1768基因微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒 - Google Patents

一种结核分枝杆菌Rv1768基因微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测结核分枝杆菌的特异性引物和探针组合，采用微滴数字PCR技术检测全血中结核分枝杆菌特有的,而其他细菌和人体不具有的目的基因Rv1768的拷贝数含量。具有快速、敏感、特异等优点，可用于结核分枝杆菌检测和预防中。

Description

一种结核分枝杆菌Rv1768基因微滴数字PCR绝对定量检测试 剂盒
技术领域
本发明涉及试剂盒检测技术领域，具体的说涉及一种检测结核分枝杆菌的微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒。
背景技术
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)，俗称结核杆菌，是引起人结核病的主要病原菌，其感染引起的结核病(Tuberculosis，TB)是全球三大传染病杀手之一。据2015年最新流行病学统计，全球2014年新增结核病例约960万人，并导致约150万人死亡。全球约有将近1/3的人口感染过结核分枝杆菌，其中90-98％为潜伏感染，其中的2-10％会发展为活动性结核。近年来，由于耐药株的流行、艾滋病与结核病联合发病，使结核病的治疗难度加大并且严重威胁着人类健康。因此早期明确的诊断对于结核病的治疗及传播的控制具有极其重要的意义。
目前临床上应用的结核病诊断技术主要有结核菌素(PPD)试验、痰细菌培养、抗酸染色、血清学抗体检测、定量PCR、IFN-γ的ELISpot或T-Spot检测等方法(Mitchison DA.The diagnosis and therapy of tuberculosis during the past 100years[J].Am JRespir Crit Care Med,2005,171(7):699-706.)。但是以上方法在临床应用中各有灵敏度低、耗时、或特异性差,或不能检测T细胞免疫缺陷的感染者等缺点(Mitchison D A.Thediagnosis and therapy of tuberculosis during the past100years[J].Am J RespirCrit Care Med,2005,171(7):699-706.)，如PPD试验的假阳性率高，无法区分是MTB感染还是卡介苗(BCG)接种；抗体的检测无法诊断感染早期抗原出现而抗体还未产生的“窗口期”；采用痰涂片等抗酸染色检测由于痰液取样均一性较差等因素造成诊断准确性下降，并且该方法灵敏度较低,检出率仅约为33％(全国结核病流行病学抽样调查技术指导组.2000年全国结核病流行病学抽样调查报告[J].中国防痨杂志,2002(02):3-46.)。由于血液中结核分枝杆菌含量极低，一般技术很难以血液样本中结核基因进行准确检测(Lima J F,Guedes GM,Lima J F,Lira L A,Santos F C,Arruda M E,Montenegro L M,Schindler HC.Single-tube nested PCR assay with in-house DNA extraction for Mycobacteriumtuberculosis detection in blood and urine[J].Rev Soc Bras Med Trop,2015,48(6):731-738.)。最近发展的实时定量PCR(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)技术具有较快速、灵敏度高、特异性较强的优点，qPCR技术检测的是结核特异基因的含量，但样本通常仅是限于病人痰液而不是血液(由于血液中结核菌含量很低)，或对少数免疫低下病人血液(血液中结核菌含量高于正常人的)的检测。qPCR要求目的基因拷贝数相对较高，对目的基因做出相对定量分析，可能会出现假阳性(如探针保存不当而部分降解)和假阴性结果(对于低拷贝数时)。并且在分析外源基因拷贝数时必须依赖于标准曲线和已知拷贝数的基因，而标准曲线的制备容易受各种因素的影响，故此法对诊断标准的统一性仍值得商榷。因此，亟待开发新型、有效的结核病诊断方法，特别是亟需开发结核早期诊断试剂、和婴幼肺结核和肺内外结核诊断新方法。
微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)是近年来兴起的一种新的核酸绝对定量技术，又称为第三代PCR技术。ddPCR技术通过将微量样品极度稀释实现理论上的单分子扩增。与qPCR相比，ddPCR不需要通过CT值来计算目的基因的拷贝数，所以扩增效率并不会对结果产生影响。通过相应仪器对反应结果进行测量后，可以直接通过计数的方法或者使用泊松分布的统计学方法来得到样本的具体浓度。该技术的提出仅仅只有十几年的光景，但是它的进步与发展却相当迅速。ddPCR兼具qPCR方法的优点，其相对qPCR具有更高的灵敏度和更多元分析的能力，为临床诊断提供独特的分析优势，并且也不需要标准曲线的制备。ddPCR已经报道用于拷贝数很低的石蜡包埋肝组织中HBV(Hepatitis B Virus，HBV)的检测(Huang J T,Liu Y J,Wang J,Xu Z G,Yang Y,Shen F,Liu X H,Zhou X,Liu SM.Next generation digital PCR measurement of hepatitis B virus copy number informalin-fixed paraffin-embedded hepatocellular carcinoma tissue[J].ClinChem,2015,61(1):290-296.)。目前，ddPCR已被用于病毒的分析及肿瘤分子标志物稀有突变的检测，与疾病相关的基因拷贝数变异检测以及其他病原微生物的检测RNA和基因表达分析等，对HIV感染者体内HIV病毒DNA低拷贝检测灵敏度也有针对性报道(Persaud D,GayH,Ziemniak C,Chen Y H,Piatak M J,Chun T W,Strain M,Richman D,LuzuriagaK.Absence of detectable HIV-1viremia after treatment cessation in an infant[J].N Engl J Med,2013,369(19):1828-1835.)。因此，ddPCR在复杂的异质样品中的稀有序列检测方面具有明显的技术优势，能够完成很多qPCR无法完成的检测任务。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测结核分枝杆菌的微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒，用于结核分枝杆菌的高灵敏度、高特异性、快速、定量精确检测。
本发明的第一个技术目的是提供用于检测结核分枝杆菌的特异性引物和探针，其核苷酸序列分别为：
Rv1768-F:5’CGGCAACAGATTTGGCGAACA3’(Seq ID No:2)；
Rv1768-R:5’CGCTCCGAACAACGCGGCTAT3’(Seq ID No:3)；
Rv1768-P:5’-FAM-TTAGTGCAGCCAACGCGGCCGCG-BQ1-3’(Seq ID No:4)；
本发明提供了上述特异性引物和探针组合在制备结核分枝杆菌检测试剂盒或检测试剂中的应用。
本发明提供了一种含有上述特异性引物和探针组合的试剂盒。所述试剂盒优选为微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒。
本发明的另一个技术目的在于提供一种具有检测结核分枝杆菌的微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒，其中包含一对特异性引物和1条探针，其核苷酸序列分别为：
Rv1768-F:5’CGGCAACAGATTTGGCGAACA3’(Seq ID No:2)；
Rv1768-R:5’CGCTCCGAACAACGCGGCTAT3’(Seq ID No:3)；
Rv1768-P:5’-FAM-TTAGTGCAGCCAACGCGGCCGCG-BQ1-3’(Seq ID No:4)；
还包含2×ddPCRTM SuperMix for Probes，微滴发生油，阴性对照和阳性对照。
20μL微滴数字PCR反应体系为：Rv1768-F和Rv1768-R各,2μL，引物的原始浓度为10μM，Rv1768-P 1μL，探针原始浓度为350nmol/L，2×ddPCRTM SuperMix for Probes 10μL，灭菌超纯水3μL；
所述阳性对照为重组质粒pET-28a(+)-RV1768，阴性对照为灭菌超纯水；
加入30ng/μL样本全血DNA2μL。
本发明的试剂盒的工作程序为：
(1)配制20μL ddPCR反应体系；
(2)制备微滴，然后将微滴转入PCR板，于PCR仪中进行扩增；
(3)将完成PCR扩增的PCR板放入微滴分析仪中，检测微滴，分析数据，显示检测结果。
在本发明的一个实施例中，制备微滴的方法是采用Bio-Rad公司的QX100TM微滴式数字PCR仪的微滴生成器，按照说明书操作进行微滴制备即可。
其中步骤(2)中PCR的扩增程序为95℃，10min预变性；94℃变性30s，60℃退火60s，共45个循环，扩增结束后进行98℃、10min的热变性。
本发明提供的试剂盒在结核分枝杆菌检测和预防中的应用也属于本发明的保护范围。
为实现上述目的，本发明通过如下方案实现：
通过分子克隆技术将Rv1768基因构建至pET28a的原核表达载体中，采用实时荧光定量PCR技术和ddPCR技术分别对pET28a-Rv1768重组质粒作出标准曲线，以确定ddPCR技术的灵敏度，通过查阅文献和引物BLAST确定其特异性。
分别收集6例活动性肺结核病人与以及6例健康人，分别采用实时荧光定量PCR技术和ddPCR技术对上述样本全血DNA进行检测，并探讨ddPCR技术的检测效果是否具有统计学意义。
本发明首次通过对毒性结核分枝杆菌特有的,而其他细菌和人体不具有的目的基因Rv1768进行克隆构建，制备出pET-28a-Rv1768的重组表达质粒，并以此确定针对Rv1768基因进行微滴数字PCR的灵敏度(RV1768重组质粒浓度稀释达到1.2copies/μL时仍保持着正相关性)和特异性，通过平行比较检测样品，发现ddPCR技术相对于qPCR技术具有更高的灵敏度与特异度，对复杂背景的DNA样本能有较好的分辨率。ddPCR技术能准确测量结核病人全血中结核分枝杆菌特异基因Rv1768基因的拷贝数，对结核病的辅助诊断提供极大的帮助。
附图说明
图1为分别设置了56℃、60℃、64℃、68℃、72℃这5个温度进行梯度PCR反应的反应产物示意图；
图1A显示的是反应产物的琼脂糖凝胶电泳图；图1B显示的是电泳图的灰度烧描强度柱状图；
图2为不同终末浓度的荧光探针进行荧光定量PCR反应的荧光强度变化趋势图；
图3为比较实时荧光定量PCR与ddPCR技术的灵敏度；
图4为实时荧光定量PCR法和ddPCR法分别检测活动性肺结核病人血液样本中结核特异基因Rv1768的含量；
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施例1】最佳退火温度的确定
针对结核分枝杆菌Rv1768基因长1857bp片段，其序列如Seq ID No:1所示，制备出pET-28a-Rv1768的重组表达质粒，利用软件设计引物，得到最优化的引物，产物长度为131bp(从Rv1768基因41bp至171bp)，引物由上海英骏公司合成，F：5'–CGGCAACAGATTTGGCGAACA-3'；R：5'-CGCTCCGAACAACGCGGCTAT-3'。以上引物分别以重组质粒pET-28a(+)-RV1768为模板，进行退火温度的梯度PCR。反应体系和反应条件如下：
在Taq DNA聚合酶的作用下，95℃预变性5min；再95℃变性20s，55～72℃退火20s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸5min。
分别设置了56℃、60℃、64℃、68℃、72℃这5个温度进行梯度PCR反应。结果显示在退火温度为60℃时，引物的扩增效率最高。
【实施例2】Taqman探针最佳反应浓度的优化
探针由上海英骏公司合成，探针：5’-FAM-TTAGTGCAGCCAACGCGGCCGCG-BQ1-3’
反应体系和反应条件如下：
设置探针浓度每管分别为100、150、200、250、300、350、400和450nmol/L，加入10μL2×Gene Expression Master Mix，pET-28a(+)-RV1768模板2μL，用超纯水补足至20μL，然后进行qPCR扩增。扩增条件确定为:95℃，5min预变性；95℃，15s；60℃，30s，40个循环，在退火步骤中采集荧光信号。结果显示当探针浓度达到350nmol/L时，荧光强度不再随浓度的升高而升高。如图2所示。
【实施例3】绘制重组质粒的标准曲线
将重组质粒pET-28a(+)-RV1768进行梯度倍比稀释：109、108、107、106、105、104、103、102、10和1copies/μL，各取以上倍比稀释的重组质粒DNA 1μL分别用于qPCR和ddPCR，并将结果绘制出标准曲线。
qPCR标准曲线的绘制：
反应体系和反应条件如下：
qPCR反应总体系为20μL，反应探针终浓度为300nmol/L。qPCR使用2步扩增法，程序如下：94℃，5min预变性；94℃变性15s，60℃退火60s，共40个循环，在退火步骤中采集荧光信号。每个模板重复3个平行扩增，重复3轮实验。扩增结束后使用Step One Plus自带软件进行分析实验数据，并通过计算获得qPCR标准曲线，R2值以及扩增效率。
ddPCR标准曲线的绘制：
反应体系和反应条件如下：
ddPCR反应总体系为20μL，反应探针终浓度为300nmol/L。将配制好的20μL PCR反应液，转移至微滴发生卡(DG8cartridge)孔中，再加入70μL微滴发生油(dropletgeneration oil)至oil孔中，利用QX100TM微滴式数字PCR仪的微滴生成器制备反应微滴。将每个样品的微滴分别转移至96孔PCR反应板中对应的反应孔中，用铝膜热封(180℃，5sec)后，于普通PCR仪上进行扩增，本实验的PCR扩增是在Bio-Rad S1000PCR仪上完成的。ddPCR扩增使用3步法，设置程序如下：95℃，10min预变性；94℃变性30s，60℃退火60s，共45个循环，扩增结束后进行98℃、10min的热变性。将PCR扩增后的96孔板放入QX100TM微滴式数字PCR仪的微滴分析器中，检测FAM的荧光信号，96个样品检测用时约3h，仪器会自动分析样品的各微滴荧光信号，然后由QuantaSoft 1.7.4完成对数据的自动处理。
图3圆点标注曲线为使用实时荧光定量PCR技术绘制的标准曲线，方形点标注曲线为使用ddPCR技术绘制的标准曲线。结果显示：使用实时荧光定量PCR法检测时，当重组质粒浓度达到102copies/μL以下时已偏离标准曲线，说明实时荧光定量PCR最低检测浓度是102copies/μL。使用ddPCR法检测时，当RV1768重组质粒浓度稀释达到1.2copies/μL时仍保持着正相关性，说明ddPCR最低检测浓度是1.2copies/μL以下因而其灵敏度远高于qPCR的最低检测浓度(102copies/μL)。
【实施例4】对临床样本的检测
收集6例肺结核病人以及6例健康人，分别采用实时荧光定量PCR技术和ddPCR技术对上述样本全血DNA进行检测，并探讨ddPCR技术的检测效果是否具有统计学意义。
1、全血样本的总DNA的提取
全血样本DNA采用AXYGEN公司全血DNA提取试剂盒提取，具体步骤如下所述：
1)吸取30μL蛋白酶K溶液于高压灭菌的EP管中。
2)加入200μL的全血。
3)加入200μL的Buffer BL于涡旋震荡上震荡30s。
4)70℃干浴锅中干浴20min，中途需拿出涡旋震荡3次以上。
5)加入200μL无水乙醇涡旋震荡15s。
6)将上述溶液放入吸附柱中，10000rpm离心2min。
7)加入Buffer W1B溶液400μL洗两次。
8)加入Buffer W2溶液600μL洗两次。
9)空转一次后，待酒精挥发完毕加入80～110μL无菌水洗脱。
10)每份样本采用紫外分光光度计测量其浓度，最后使用无菌双蒸水调节其浓度一致，备用。
2、qPCR法对样本的检测
应用全血DNA提取试剂盒提取待测样本的全血DNA，经由紫外分光光度计测量OD260/OD280和琼脂糖凝胶进行质量鉴定。
反应体系和反应条件如下：
qPCR反应总体系为20μL，反应探针终浓度为350nmol/L。qPCR使用2步扩增法，程序如下：94℃，5min预变性；94℃变性15s，60℃退火60s，共40个循环，在退火步骤中采集荧光信号。每个模板重复3个平行扩增，重复3轮实验。扩增结束后使用Step One Plus自带软件获得实验数据。
3、ddPCR法对样本的检测
应用全血DNA提取试剂盒提取待测样本的全血DNA，经由紫外分光光度计测量OD260/OD280和琼脂糖凝胶进行质量鉴定。
反应体系和反应条件如下：
ddPCR反应总体系为20μL，反应探针终浓度为350nmol/L。将配制好的20μL PCR反应液，转移至微滴发生卡(DG8cartridge)孔中，再加入70μL微滴发生油(dropletgeneration oil)至oil孔中，利用QX100TM微滴式数字PCR仪的微滴生成器制备反应微滴。将每个样品的微滴分别转移至96孔PCR反应板中对应的反应孔中，用铝膜热封(180℃，5sec)后，于Bio-Rad S1000PCR仪上完成扩增。ddPCR扩增使用3步法，设置程序如下：95℃，10min预变性；94℃变性30s，60℃退火60s，共45个循环，扩增结束后进行98℃、10min的热变性。将PCR扩增后的96孔板放入QX100TM微滴式数字PCR仪的微滴分析器中，检测FAM的荧光信号，96个样品检测用时约3h，仪器会自动分析样品的各微滴荧光信号，然后由QuantaSoft1.7.4完成对数据的自动处理。
结果如图4A所示，实时荧光定量PCR检测Rv1768基因在活动性肺结核病人血液样本的含量，结果显示差异无统计学意义(p＞0.05)；ddPCR检测Rv1768基因在活动性肺结核病人血液样本的含量，如图4B结果显示差异有显著的统计学意义(p＜0.0001)。

Claims (5)

1.一种用于检测结核分枝杆菌Rv1768的特异性引物和探针组合，其特征在于，核苷酸序列分别为：
Rv1768-F:5’CGGCAACAGATTTGGCGAACA3’(Seq ID No:2)；
Rv1768-R:5’CGCTCCGAACAACGCGGCTAT3’(Seq ID No:3)；
Rv1768-P:5’-FAM-TTAGTGCAGCCAACGCGGCCGCG-BQ1-3’(Seq ID No:4)。
2.一种含有权利要求1所述的特异性引物和探针组合的结核分枝杆菌检测试剂盒。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其为微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，包含一对特异性引物和1条探针，其核苷酸序列分别为：
Rv1768-F:5’CGGCAACAGATTTGGCGAACA3’(Seq ID No:2)；
Rv1768-R:5’CGCTCCGAACAACGCGGCTAT3’(Seq ID No:3)；
Rv1768-P:5’-FAM-TTAGTGCAGCCAACGCGGCCGCG-BQ1-3’(Seq ID No:4)；
还包含2×ddPCRTM SuperMix for Probes，微滴发生油，阴性对照和阳性对照；
20μL微滴数字PCR反应体系为：Rv1768-F和Rv1768-R各,2μL，引物的原始浓度为10μM，Rv1768-P 1μL，探针原始浓度为350nmol/L，2×ddPCRTMSuperMix for Probes 10μL，灭菌超纯水3μL；
所述阳性对照为重组质粒pET-28a(+)-RV1768，阴性对照为灭菌超纯水；
加入30ng/μL样本全血DNA 2μL。
5.权利要求1-4任一所述的试剂盒在在结核分枝杆菌检测和预防中的应用。
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