CN105779644A

CN105779644A - 人巨细胞病毒的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

Info

Publication number: CN105779644A
Application number: CN201410801867.7A
Authority: CN
Inventors: 冯俊; 居金良
Original assignee: SHANGHAI RENDU BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Shanghai Rendu Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2014-12-22
Filing date: 2014-12-22
Publication date: 2016-07-20
Anticipated expiration: 2034-12-22
Also published as: CN105779644B

Abstract

本发明公开了一种人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，具体包括：捕获探针、HCMVT7引物和nT7引物、HCMV检测探针、M‑MLV反转录酶和T7RNA聚合酶等试剂。本发明方法能够高特异性、高灵敏度、低污染、快速地对含有人巨细胞病毒的尿液、乳汁和血液样品进行核酸扩增检测。利用该试剂盒及方法可准确、快速、方便地对人巨细胞病毒进行定性检测，对病毒活动性感染进行诊断，监视和预测巨细胞病毒流行性，以及对病毒感染的辅助诊断和药物疗效的观察。

Description

人巨细胞病毒的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒的生物检测技术领域，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的人巨细胞病毒（HCMV）的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus, HCMV）又称为涎病毒或人疱疹病毒5型(Human herpesvirus 5)，是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒。它和弓形体、风疹病毒、单纯疱疹病毒、梅毒螺旋体合称为人类五大生物致畸因子。这种病毒进入细胞内以后会导致细胞增大，所以叫做巨细胞病毒。在我国巨细胞病毒感染广泛流行，通常情况下，很多正常人身上都潜伏有巨细胞病毒，潜伏部位常在唾液腺、乳腺、肾脏、子宫颈、睾丸、白细胞以及其它腺体中，病毒可长期或间歇地自唾液、乳汁、尿液、精子及子宫颈分泌物中排出。但在大多数免疫正常个体呈无症状感染，而在免疫抑制个体、胎儿和婴幼儿如果感染则可出现明显病症。

HCMV是危害人严重危害人类生殖健康，常通过性交传播，引起泌尿生殖系统、中枢神经系统、肝脏、肺、血液循环系统等病变，并与恶性肿瘤的发生可能有关。孕妇感染可导致胎儿肝脾肿大、血小板减少性紫癫及溶血性贫血，少数是先天性畸形，如小头、智力低下、神经肌肉运动障碍、耳聋、脉络膜视网膜炎等，因此是围产医学和优生学中的重大研究课题。

免疫缺陷患者及免疫抑制治疗，肝、肾、心脏等器官移植，肿瘤及骨髓移植等可产生广泛的HCMV复发性感染，因此HCMV感染也是器官和骨髓移植中重要预防环节。鉴于HCMV在临床疾病中的重要作用，已经引起医学界的广泛重视。

目前，HCMV常用的检查有病毒分离培养法、血清学检查、抗原血症法和Real-Time PCR法等。HCMV感染宿主范围窄，只在人成纤维母细胞中增殖，通过细胞分离培养病毒虽然是诊断金标准，但是耗时较长，检测灵敏度低，在临床上已经很少使用；酶联免疫法法(ELISA)是最常用血清学诊断方法，但HCMV成人感染率极高，IgG大多数人均为阳性，检测意义不大，且ELISA法受影响因素较多，特异性不高；临床上最常用pp65抗原血症监测法, 是一种特异性高、敏感性好被人的方法,已成为HCMV活动性感染的国际公认“标准”方法，但是，该方法实验操作过程繁琐，不易被检验科医生接受；Real-Time PCR法，需要经历几十个温度变化的循环过程，扩增反应时间长，且产物为DNA，易污染，最为关键的是无法监测HCMV的活动性感染。因此，开发一种快速、灵敏、特异、不易污染且能检测HCMV活动性感染的试剂盒非常必要。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7 RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病毒的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病毒的特性进行专门设计。目前国内尚无针对人巨细胞病毒（HCMV）的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速，高灵敏度、高特异性，污染易控，能检测HCMV活动性感染的HCMV mRNA扩增检测试剂盒。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种人巨细胞病毒实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条序列表中序列1所示的HCMV的靶标核酸的捕获探针，一对用于靶标核酸扩增检测的上游引物T7和下游引物nT7，以及一条用于所述靶标核酸扩增产生的RNA拷贝特异结合的HCMV检测探针；所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示，所述T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示，所述HCMV检测探针如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

进一步，所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于一SAT酶液中，所述捕获探针存在于病毒核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和检测探针存在于扩增检测液中。

再进一步，所述试剂盒还包含有HCMV内标和内标检测探针；所述HCMV内标为人巨细胞病毒核苷酸序列的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用T7和nT7引物，由序列表中序列6所示的体外转录RNA；所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列7所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于扩增检测液中。

具体的，所述试剂盒包含裂解液、病毒核酸提取液、洗涤液、HCMV扩增检测液、SAT酶液、HCMV阳性对照、HCMV阴性对照、HCMV内标，其中：

裂解液：含硫酸铵(NH₄)₂SO₄和HEPES；

病毒核酸提取液：含捕获探针和磁珠；

洗涤液：含NaCl和SDS；

HCMV扩增检测液：含dNTP、NTP、T7引物、nT7引物、HCMV检测探针和内标检测探针；

SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7 RNA聚合酶；

HCMV阳性对照；含人巨细胞病毒PP67基因核酸的稀释物或人巨细胞病毒pp67基因的体外转录RNA稀释物；

HCMV阴性对照：不含有人巨细胞病毒靶标核酸序列或不含有人巨细胞病毒的溶液；

HCMV内标：HCMV IC RNA的稀释物。

更为具体的，所述试剂盒中一个反应单位中各种试剂组成如下：

（1）裂解液：25-250mM HEPES，5-50mM (NH4)2SO4；

（2）病毒核酸提取液：HEPES 250-800mM，LLS 4-10%，捕获探针1-50μΜ，磁珠50-500mg/L；

（3）洗涤液：HEPES 5-50mM，NaCl 50-500 mM，1% SDS，EDTA 1-10mM；

（4）HCMV扩增检测液：Tris 10-50mM，MgCl2 10-40mM，dNTP 0.1-10mM，NTP 1-20mM，PVP40 1-10%，KCl 5-40mM，HCMV引物和探针浓度在2.5-10pmol/反应；

（5）SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应、T7 RNA聚合酶200-2000U/反应、2-10mM HEPES pH7.5、10-100 mM N-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4 mM zinc acetate、10-100 mM trehalose、40-200 mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1% (v/v) Triton X-100和20-50% (v/v) glycerol；

（6）HCMV阳性对照：含10⁵-10⁸拷贝/mL人巨细胞病毒PP67基因核酸的稀释物；

（7）HCMV阴性对照：不含有人巨细胞病毒靶标核酸序列或不含有人巨细胞病毒的溶液；

（8）HCMV内标：含10⁴-10⁸拷贝/mL HCMV IC RNA的稀释物。

更具体的，所述试剂盒中HCMV扩增检测液的T7引物浓度为5pmol/反应，nT7引物浓度为5pmol/反应，HCMV检测探针浓度为5pmol/反应，内标检测探针浓度为5pmol/反应；其他组分不变。

本发明与现有检测方法相比有以下优点：

（1）本发明试剂盒针对HCMV的PP67基因进行靶标筛选和引物设计，PP67是晚期信使核糖核酸编码的CMV基质表层蛋白，它不仅与病毒基因的复制有关，而且是具有完整病毒循环的标志，所以PP67是CMV活动性感染最可靠的指标。监测PP67的可以准确地反映出体内HCMV的活动状况。

（2）本发明试剂盒中加入内标，可进一步有效监控假阴性的存在，提供更准确的检测结果。

（3）本发明将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，整个过程没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，同时降低了对所用PCR仪的设计和生产成本。

（4）本发明扩增产物为RNA，RNA在自然界中极易降解，相对PCR扩增DNA而言，污染易控，交叉影响小。

（5）设备简单，成本低：与实时荧光定量PCR相比，本发明所用的仪器无需升降温循环，因而设计和生产成本大幅降低。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1比对组的引物对和探针序列的荧光检测结果；

图2本发明组的引物对和探针序列的荧光检测结果；

图3为特异性样本的靶标荧光检测结果；

图4为特异性样本的内标荧光检测结果；

图5为临床样本检测的靶标荧光检测结果；

图6为临床样本检测的内标荧光检测结果。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

以下实施例中所使用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。

实施例 1 用于实时荧光核酸恒温扩增检测人巨细胞病毒 (HCMV) 的专用引物和探针的设计

本发明选择HCMV PP67基因中高度保守且特异性强的区段作为扩增靶序列区域，根据引物探针设计原理，使用DNAStar、DNAMAN软件和人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测人巨细胞病毒(HCMV)的专用引物和探针序列，得到如下具体序列：

(1)一条可与人巨细胞病毒(HCMV)的靶标核酸(HCMV RNA)序列特异结合的捕获探针(TCO，Target Capture Oligo)，所述捕获探针的核苷酸序列为: 5’ ACGTCACGCGATGCCTACTCCGATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3’；

(2)一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生HCMV靶标核酸(HCMV RNA)的DNA拷贝的HCMV扩增引物，所述HCMV扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列为5’ AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGAGCGTACCGCCGAGAGAAC3’，nT7引物序列为5’ TCTACGAACATCTCGACGCC 3’；

(3)一条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述HCMV靶标核酸(HCMV RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的HCMV检测探针，所述HCMV检测探针的核苷酸序列为5’ CGCCUGCAAGACGUCCCGGAGAGGCG 3’，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。

HCMV检测探针为分子信标，是一类高特异性、高敏感性的分子探针，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎，分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。本发明的一种优选的检测探针具有如序列5所示的核苷酸序列。

在引物、探针设计过程中，产生了诸多对引物和探针序列，如选自HCMV的UL123基因保守区域进行引物、探针序列筛选获得：T7引物序列：5’ AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACTCATACATGCTCTGCATAGTTAGTTATTG 3’，nT7引物序列：5’ AGAATGCCTTAGATATCTTAG 3’，检测探针序列为5’CCGAGCCUUUCGAGGACAUCUCGG3’，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。将上述各序列用专利200810111479.0中所述的反应体系进行扩增，比对5个梯度的灵敏度检测并选取较优者。

结果如图1，图2(图1为比对组，图2为本发明组)，从结果可看出，比对组的灵敏度仅在10⁴copies/反应时得出检测结果，而本发明组的灵敏度至少提高了二个数量级，可达10copies/反应或更低。从曲线形状可明显看出，本发明组优于比对组。

通过筛选、比对各设计引物对、探针序列，可挑选出检测灵敏度高的最佳引物、探针序列作为本发明相应序列。

实施例 2 ：用于实时荧光核酸恒温扩增检测人巨细胞病毒 (HCMV) 的参照物设计

由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出错误的结论，因此，在本发明的试剂盒中还可以设置对照物，以排除检测结果失真的情况。

本发明中可以设置的参照物包括：HCMV阳性对照、HCMV阴性对照和HCMV内标中的一个或多个对照物。

HCMV阳性对照可以是为体外转录的RNA，也可以是人巨细胞病毒双链DNA。通过检测阳性对照，可证明试剂盒检测方法及材料无误，保证检测的准确性，同时可以监测每次检测的重复性和稳定性及试剂盒批次间的差异。

HCMV内标可以是体外转录的RNA，不具有生物学活性。HCMV内标作为HCMV RNA的竞争性内标，可以作为参照物，用于防止假阴性结果的发生，通过检测加入有内标的样本，可了解整个扩增反应体系是否受抑制，更好的提示假阴性。

阴性对照可排除假阳性，在正确使用试剂盒检测方法和材料情况下，可保证检测的特异性。

本发明HCMV阳性对照为体外转录的HCMV RNA通过以下述方法制备：

(1)用化学合成法合成HCMV PP67基因片段(如序列8所示)；

(2)将HCMV PP67基因片段插入到pGEM®-T载体中，构建HCMV阳性对照质粒；

(3) HCMV阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为pGEM®-T- HCMV菌株，贮存于-70℃；

(4)从pGEM®-T- HCMV菌株中提取pGEM®-T-HCMV质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。

所述HCMV内标中的体外转录的HCMV IC RNA以下述方法制备：

(1)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同HCMV靶标序列区域(HCMV内标片断，其核苷酸序列如序列表中序列9所示)；

(2)将片段克隆到pGEM®-T载体中，构建HCMV内标质粒；

(3) HCMV内标质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为pGEM®-T-HCMV IC菌株，贮存于-70℃；

(4)从pGEM®-T- HCMV IC菌株中提取pGEM®-T-HCMV IC质粒，将质粒进行转录RNA纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。

(5)为便于进行结果分析，还配合试剂盒中增加的HCMV内标，设计了内标检测探针，HCMV内标与HCMV靶标核苷酸拥有相同的引物结合区，两引物之间的核酸序列或排列不同，使其不能与检测探针结合，但能与内标探针结合，所述内标检测探针为与HCMV检测探针序列、荧光标记不同的探针，所述的内标检测探针的核苷酸序列为5’CGACUCUGGCCUGGACGCAGUCG3’(序列7)，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

实施例 3 制备人巨细胞病毒 (HCMV) 的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

利用实施例1所提供的专用引物和探针，得到本发明人巨细胞病毒(HCMV)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。该试剂盒包含有捕获探针(TCO，Target Capture Oligo)、T7引物、nT7引物、HCMV检测探针、M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶等组分，其中：

捕获探针核苷酸序列为序列2、T7引物序列序列3、nT7引物序列为序列4、检测探针核苷酸序列为序列5、内标探针核苷酸序列为序列7。

所述的捕获探针存在于病毒核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和HCMV检测探针存在于HCMV扩增检测液中，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中。具体地将，所述试剂盒包含以下组分：裂解液、病毒核酸提取液、洗涤液、HCMV扩增检测液、SAT酶液、HCMV阳性对照、HCMV阴性对照和HCMV内标，具体为：

（1）裂解液：25-250mM HEPES，5-50mM (NH₄)₂SO₄；

（3）洗涤液：HEPES 5-50mM，NaCl 50-500 mM，1% SDS，EDTA 1-10mM；

（4）HCMV扩增检测液：Tris 10-50mM，MgCl2 10-40mM，dNTP 0.1-10mM，NTP 1-20mM，PVP40 1-10%，KCl 5-40mM，T7引物浓度为5pmol/反应，nT7引物浓度为5pmol/反应，HCMV检测探针浓度为5pmol/反应，HCMV内标检测探针浓度为5pmol/反应；

（6）HCMV阳性对照：含10⁵-10⁸拷贝/mL人巨细胞病毒 PP67基因核酸的稀释物或者人巨细胞病毒体外转录RNA的稀释物；

（8）HCMV内标：含10⁴-10⁸拷贝/mL HCMV IC RNA的稀释物。

实施例 4 试剂盒的特异性检测

用本发明制成的试剂盒检测与人巨细胞病毒(HCMV)分类近似、症状类似、易发生交叉反应的微生物进行特异性检测，具体1-9号样本为水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒（EBV）、单纯疱疹病毒1型（HSV-1）、猿猴B病毒（simian herpes B virus）、单纯疱疹病毒2型（HSV-2）、人乳头瘤病毒（HPV）、沙眼衣原体（CT）、淋病奈瑟菌（NG）、解脲脲原体（UU）。试剂盒组成及具体方法如下：

1、对照品准备

1.1 内标：取400 μL稀释液，加入10 μL HCMV内标（10⁵HCMV IC RNA稀释物），混匀备用。

1.2 阳性对照：取250 μL阴性对照，加入10 μL阳性对照品（10⁶拷贝/mL人巨细胞病毒体外转录RNA的稀释物），混匀备用。

1.3 阴性对照：取250 μL阴性对照（生理盐水）备用。

2、核酸提取

2.1 取11个1.5mL离心管，编号1^#~11^#，在样本处理管中加入200μl裂解液(HEPES 50mM，(NH₄)₂SO₄ 35mM)和200μl待测样本(不足以生理盐水补足，其中1^#~9^#为样本，10^#为阳性对照，11^#为阴性对照)。

2.2 在离心管中加入100μl病毒核酸提取液(HEPES 200mM，EDTA 100mM，LiCl 800mM，捕获探针15μΜ，磁珠 150mg/L)和10μl内标溶液，混匀，60℃保温5分钟，室温放置10分钟。

2.3将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5-10分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入1mL洗涤液(HEPES 25mM，NaCl 150 mM，1%SDS，EDTA 2.5mM；)振荡均匀后静置5-10分钟，弃液体，保留磁珠，反复2次。

2.4将离心管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用(此步应清晰可见磁珠)。

3、SAT核酸扩增检测

3.1向离心管中加入40μl扩增检测液洗涤磁珠。HCMV扩增反应液具体包含Tris 15mM，MgCl₂ 15mM，dNTP 2.5mM，NTP 3mM，PVP40 1%，KCl 10mM；HCMV检测液中T7引物浓度为5pmol/反应，nT7引物浓度为5pmol/反应，HCMV检测探针浓度为5pmol/反应，内标检测探针浓度为5pmol/反应。

3.2取振荡混匀的上述反应检测液30μl加至洁净微量反应管，用恒温仪60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；向微量反应管中加入10μl已预热至42℃的SAT酶液，1200rpm振荡15秒钟混匀。SAT酶液中含有M-MLV反转录酶1500U/反应、T7 RNA聚合酶1000U/反应、10mM HEPES pH7.5、15 mM N-acetyl-L-cysteine(N-乙酰-L-半胱氨酸)、0.15mM zinc acetate(乙酸锌)、20 mM trehalose(海藻糖)、100mM Tris-HCl pH 8.0、80mM KCl、0.25mM EDTA、0.5% (v/v) Triton X-100和30% (v/v) glycerol(丙三醇)。

3.3将微量反应管快速转至恒温荧光检测仪器(ABI7500荧光定量仪)，42℃反应50分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测50次；荧光素通道选择FAM通道(靶标信号检测，F1)和VIC通道(HEX和VIC波长相近，内标信号检测，F2)。

4、结果判定

根据SAT扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取dt值，判定结果。

阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)。

① 阳性结果判定：

F1通道：dt≤45的样本为阳性。

② 阴性结果判定：F1通道dt无数值或为50，同时F2通道：dt≤45，则为阴性。

从图3、图4检测结果可见，除阳性对照外，1-9号、阴性对照的扩增曲线（F1荧光通道）皆为阴性，并且相应内标（F2荧光通道）都出现扩增信号，表明检测样本不受反应体系抑制，结果可靠，HCMV可明确与水痘-带状疱疹病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒1型、猿猴B病毒、单纯疱疹病毒2型、人乳头瘤病毒、沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲脲原体区分，本发明试剂盒特异性良好。

实施例 6 临床样本的实时荧光核酸恒温扩增检测

用实施例3中所用试剂盒检测6个临床样本中的HCMV，同步比对抗原血症法，样本包括2个尿液样本（样本1^#、2^#）、2个男性血清样本（3^#、4^#）、2个女性血清样本（5^#、6^#）。SAT检测的具体方法包括以下步骤：

1、样本采集、运输及保存

1.1 样本采集

（1）尿液标本

取清晨首次尿，或长时间（至少1小时）不排尿后的首段尿0.5 mL，与0.5 mL尿样保存液混合，该样品即为待测样品。

（2）血清标本

用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血0.5 mL，取出0.2 mL，与0.2 mL尿样保存液混合，该样品即为待测样品。

1.3 标本运输和保存

所采集的标本可立即用于测试或长期保存于-70℃，-20℃保存期为6个月，标本应避免反复冻融。标本运送采用0℃冰壶。

2. 核酸提取、SAT扩增检测及结果判断同实施例4。

根据图5(F1荧光通道)和图6(F2荧光通道)检测结果确定，样本1、2、4、6为阳性，样本3、5为阴性，与抗原血症法结果一致，表明本发明试剂盒可用于人巨细胞病毒活动性感染的检测，且产品准确性高，上机扩增检测时间仅需50分钟，具有周期短、高灵敏度、高特异性、低污染和反应稳定的特点。

根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的人巨细胞病毒(HCMV)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不足构成对本发明限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生物上结构功能相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明相关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海仁度生物科技有限公司

<120> 人巨细胞病毒的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 568

<212> RNA

<213> unknown

<220>

<223> 靶标RNA序列

<400> 1

gcucgagacc gacgacguuc caucugacca gaaaaaaaaa ggcaccccuc gguggcgacc 60

ucucaccauc guuugcccgu ucgcccgucc ucgagccauc aucaccaccu caggcucuau 120

cgguaccauc guugucaucc gaaaaaaaaa cugccucacc caccugcgua aaacaccauc 180

uuuccggagg ugcgguaaga cgggcaaaua cggucgugcc gaggacaaaa aaacgcacca 240

gucgacacca cacccucaug agcaccaccu gucgguguug gucguccucc aucguucucu 300

acgaacaucu cgacgcccgg gugucggacg ucggcaagac gucccggaga agacgguguu 360

cucucggcgg uacgcucucu ggaucuauaa uaucuauagu agcuaaacga gacugugacu 420

acgacgaacc acaucaucuu uuuuuuaugu ugcuucuuua uaaaagacuu augucgacga 480

cacucggcau cagccaucuc gugaaacacg cucgcuuuuc gucucuccaa ggcacacugg 540

guucgcugaa agggaccgug uaccgacc 568

<210> 2

<211> 54

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 捕获探针序列

<400> 2

acgtcacgcg atgcctactc cgataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 54

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> T7引物序列

<400> 3

aatttaatac gactcactat agggagagag cgtaccgccg agagaac 47

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> nT7引物序列

<400> 4

tctacgaaca tctcgacgcc 20

<210> 5

<211> 26

<212> RNA

<213> unknown

<220>

<223> 检测探针序列

<400> 5

cgccugcaag acgucccgga gaggcg 26

<210> 6

<211> 565

<212> RNA

<213> unknown

<220>

<223> 内标RNA序列

<400> 6

gcucgagacc gacgacguuc caucugacca gaaaaaaaaa ggcaccccuc gguggcgacc 60

ucucaccauc guuugcccgu ucgcccgucc ucgagccauc aucaccaccu caggcucuau 120

cgguaccauc guugucaucc gaaaaaaaaa cugccucacc caccugcgua aaacaccauc 180

uuuccggagg ugcgguaaga cgggcaaaua cggucgugcc gaggacaaaa aaacgcacca 240

gucgacacca cacccucaug agcaccaccu gucgguguug gucguccucc aucguucucu 300

acgaacaucu cgacgcccgg gugucggacg ucgcuggccu ggacgcaaga cgguguucuc 360

ucggcgguac gcucucugga ucuauaauau cuauaguagc uaaacgagac ugugacuacg 420

acgaaccaca ucaucuuuuu uuuauguugc uucuuuauaa aagacuuaug ucgacgacac 480

ucggcaucag ccaucucgug aaacacgcuc gcuuuucguc ucuccaaggc acacuggguu 540

cgcugaaagg gaccguguac cgacc 565

<210> 7

<211> 23

<212> RNA

<213> unknown

<220>

<223> 内标检测探针序列

<400> 7

cgacucuggc cuggacgcag ucg 23

<210> 8

<211> 568

<212> DNA

<213> Human cytomegalovirus

<400> 8

gctcgagacc gacgacgttc catctgacca gaaaaaaaaa ggcacccctc ggtggcgacc 60

tctcaccatc gtttgcccgt tcgcccgtcc tcgagccatc atcaccacct caggctctat 120

cggtaccatc gttgtcatcc gaaaaaaaaa ctgcctcacc cacctgcgta aaacaccatc 180

tttccggagg tgcggtaaga cgggcaaata cggtcgtgcc gaggacaaaa aaacgcacca 240

gtcgacacca caccctcatg agcaccacct gtcggtgttg gtcgtcctcc atcgttctct 300

acgaacatct cgacgcccgg gtgtcggacg tcggcaagac gtcccggaga agacggtgtt 360

ctctcggcgg tacgctctct ggatctataa tatctatagt agctaaacga gactgtgact 420

acgacgaacc acatcatctt ttttttatgt tgcttcttta taaaagactt atgtcgacga 480

cactcggcat cagccatctc gtgaaacacg ctcgcttttc gtctctccaa ggcacactgg 540

gttcgctgaa agggaccgtg taccgacc 568

<210> 9

<211> 565

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 内标DNA序列

<400> 9

gctcgagacc gacgacgttc catctgacca gaaaaaaaaa ggcacccctc ggtggcgacc 60

tctcaccatc gtttgcccgt tcgcccgtcc tcgagccatc atcaccacct caggctctat 120

cggtaccatc gttgtcatcc gaaaaaaaaa ctgcctcacc cacctgcgta aaacaccatc 180

tttccggagg tgcggtaaga cgggcaaata cggtcgtgcc gaggacaaaa aaacgcacca 240

gtcgacacca caccctcatg agcaccacct gtcggtgttg gtcgtcctcc atcgttctct 300

acgaacatct cgacgcccgg gtgtcggacg tcgctggcct ggacgcaaga cggtgttctc 360

tcggcggtac gctctctgga tctataatat ctatagtagc taaacgagac tgtgactacg 420

acgaaccaca tcatcttttt tttatgttgc ttctttataa aagacttatg tcgacgacac 480

tcggcatcag ccatctcgtg aaacacgctc gcttttcgtc tctccaaggc acactgggtt 540

cgctgaaagg gaccgtgtac cgacc 565

Claims

1. 一种人巨细胞病毒的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条序列表中序列1所示的HCMV的靶标核酸的捕获探针，一对用于靶标核酸扩增检测的上游引物T7和下游引物nT7，以及一条用于所述靶标核酸扩增产生的RNA拷贝特异结合的HCMV检测探针；所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示，所述T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示，所述HCMV检测探针如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于一SAT酶液中，所述捕获探针存在于病毒核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和检测探针存在于扩增检测液中。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含有HCMV内标和内标检测探针；所述HCMV内标为人巨细胞病毒核苷酸序列的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用T7和nT7引物，由序列表中序列6所示的体外转录RNA；所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列7所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于扩增检测液中。

4.根据权利要求1至3任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含裂解液、病毒核酸提取液、洗涤液、HCMV扩增检测液、SAT酶液、HCMV阳性对照、HCMV阴性对照、HCMV内标，其中：

裂解液：含硫酸铵(NH₄)₂SO₄和HEPES；

病毒核酸提取液：含捕获探针和磁珠；

洗涤液：含NaCl和SDS；

SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7 RNA聚合酶；

HCMV内标：HCMV IC RNA的稀释物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中一个反应单位中各种试剂组成如下：

（1）裂解液：25-250mM HEPES，5-50mM (NH₄)₂SO₄；

（3）洗涤液：HEPES 5-50mM，NaCl 50-500 mM，1% SDS，EDTA 1-10mM；

（4）HCMV扩增检测液：Tris 10-50mM，MgCl₂10-40mM，dNTP 0.1-10mM，NTP 1-20mM，PVP40 1-10%，KCl 5-40mM，HCMV引物和探针浓度在2.5-10pmol/反应；

（8）HCMV内标：含10⁴-10⁸拷贝/mL HCMV IC RNA的稀释物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述HCMV扩增检测液中T7引物浓度为5pmol/反应，nT7引物浓度为5pmol/反应，HCMV检测探针浓度为5pmol/反应，内标检测探针浓度为5pmol/反应；其他组分不变。