CN104846122A - 肠道病毒71型和柯萨奇病毒a16型核酸检测试剂盒(荧光pcr法) - Google Patents
肠道病毒71型和柯萨奇病毒a16型核酸检测试剂盒(荧光pcr法) Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒（荧光PCR法），同时对样本中的肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型进行定性检测。本试剂盒由核酸提取试剂盒及扩增试剂盒组成。核酸提取试剂盒包含磁珠、核酸助沉剂及RNA提取液；扩增试剂盒包含蛋白酶K、EV71/CA16 PCR反应液、质控品及内标，其中EV71/CA16 PCR反应液含EV71型引物及荧光探针、CA16型引物及荧光探针、内标引物及荧光探针。本发明试剂盒通过一步法三色荧光PCR检测技术同时进行EV71型和CA16型的检测分型，比单个检测试剂盒，节约了生产检测成本，提高了检测效率；本发明选择磁珠法提取RNA，可以获得高纯度和高得率的核酸，最低检测限可达1×103copies/ml；本发明采用内标质控体系，监测反应体系可能存在的抑制因素。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测试剂盒（荧光PCR法），具体涉及一种一步法三色荧光PCR检测技术对患者咽拭子、粪便样本中肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）分型检测，利用内标质控体系监测反应体系可能存在的抑制因素的新方法。
背景技术
手足口病（Hand, foot and mouth disease, HFMD）是由肠道病毒引起的急性传染病，病毒以肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒A16型（CA16）多见，多发生于学龄前儿童，尤以3岁以下年龄组发病率最高。感染手足口病初期，患者急性起病，发热、口痛、厌食、口腔黏膜出现散在疱疹或溃疡，手、足、臀部、臂部、腿部出现斑丘疹，后转为疱疹；重症病例则可能出现脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎、肺水肿、循环障碍等，极少数病例可致死亡。
对于肠道病毒引起的手足口病、病毒型脑炎等疾病实验室仍缺乏快速、敏感、特异的诊断方法。目前对于肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型引起的手足口病的实验室诊断方法主要有以下几个方面：1.病毒感染常规检查包括细胞和生化检查。2.病毒分离是肠道病毒实验室诊断的“金标准”。3.血清学检查比较患者急性期与恢复期血清中和抗体滴度，可作为EV71和CA16感染的血清学诊断方法。血清学检查不适用于早期诊断，可以作为回顾性诊断，如恢复期抗体水平比早期有≥4倍上升，则有极大的诊断意义。肠道病毒（EV71和CA16）特异性核酸检测需要进行RT-PCR试验，并需要测序证实。虽然灵敏度较上述方法有所提高，但该方法是基于一对核酸引物进行扩增，容易产生非特异性扩增，出现假阳性。普通PCR技术的结果判读还需要对扩增产物进行凝胶电泳分析，操作繁琐、费时。
一步法三色荧光PCR检测技术原理是在单色荧光定量PCR技术的基础上，在同一个荧光定量PCR扩增实验中同时扩增三个目的基因，探针为多种荧光标记比如FAM、VIC、HEX、CY5、JOE等，每种荧光标记的探针在PCR扩增过程中所产生的荧光信号不同。利用该原理发明的试剂盒在同一个标本的检测中，可以同时检测出肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型，并采用内标质控体系，用于监测反应体系可能存在的抑制因素，实现对一个标本同时检测两种肠道病毒，并对病毒进行分型，应用极为方便。由于该方法引入了特异性扩增引物和荧光探针，很大程度上增强了检测的灵敏度和特异性，避免了其它检测方法因特异性不高而易漏检的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒（荧光PCR法），应用该试剂盒，可以对人体咽拭子、粪便样本中的肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型核酸RNA进行快速、准确测定，临床上主要用于肠道病毒感染的辅助诊断。
本发明提供一种肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒（荧光PCR法），本试剂盒由核酸提取试剂盒及扩增试剂盒组成。核酸提取试剂盒包含磁珠、核酸助沉剂及RNA提取液；扩增试剂盒包含蛋白酶K、EV71/CA16 PCR反应液、EV71/CA16质控品、EV71/CA16内标，其中EV71/CA16 PCR反应液含有反转录酶、UNG酶、Taq酶、dNTP、MgCl2、EV71型引物、EV71型荧光探针、CA16型引物、CA16型荧光探针、内标引物、内标荧光探针。
检测用各引物、探针、质控品序列
1) 检测用各分型上游引物和下游引物序列
EV71型上游引物序列：5′-tgccgaaattggagcatcatcaaatg-3′
EV71型下游引物序列：5′-actgggacatagatataacagg-3′
CA16型上游引物序列：5′-gttgttcacgtatatgcgcttt-3′
CA16型下游引物序列：5′-gattcattcgcttggcaaac-3′
内标上游引物序列：5′-aattggtcaacatgtgaaagc-3′
内标下游引物序列：5′-gaatgtggccaaggttccgtcatttgg-3′
2) 检测用各分型荧光探针序列和各自的荧光素标记物
EV71型荧光探针序列：5′FAM-ccactcttgatagtttctttagtaggg-3′BHQ-1
CA16型荧光探针序列：5′HEX-atggtgagctagtcccccaattac-3′BHQ-1
内标荧光探针序列：5′CY5-aatcttctaattactgtatatggaag-3′BHQ-2
3) 质控品序列
EV71质控品序列：
tcatcggctg gatacaggca aggttccagc actccaagct gccgaaattg gagcatcatc aaatgctagt gacgagagca
tgattgagac acgctgtgtc cttaactcgc acagtacagc tgagaccact cttgatagtt tctttagtag ggcgggatta
gttggagaga tagatctccc tcttgagggc acaactaacc caaatggtta tgccaactgg gacatagata taacaggtta
cgcgcaaatg cgta
CA16质控品序列：
tgctcaatta cggcgcaaat gcgagttgtt cacgtatatg cgctttgatg ctgaattcac atttgtcgta gccaagccca
atggtgagct agtcccccaa ttactgcagt acatgtatgt cccaccaggg gctccgaaac ccacatccag agattcattc
gcttggcaaa ctgctaccaa cccatctgtg tttgtgaaaa tgacg
内标质粒序列：
aaaatctttt cttacaaggg aagtccccaa ttggtcaaca tgtgaaagca cgtgtcatgt tcttactttt gtttgggtaa
tcttctaatt actgtatatg gaagatgtga atgaagtttt ggtcctgaat gtggccaagg ttccgtcatt tggagatacg
aaatcaaatc tcctttaaga ttttgttttt ataatgtgtt cttccatcc
EV71/CA16阴性质控品为无菌实验室三级水。
根据本发明的一个优选实施方案，其中检测肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型和内标的荧光标记分别为FAM、HEX(VIC)、CY5，所以称为一步法三色荧光PCR检测技术。
根据本发明的一个优选实施方案，所述试剂盒中包括如下组分，
1) RNA提取液1：由Tris-HCl、SDS和GuSCN配制而成；
2) RNA提取液2：由EDTA和NaCl配制而成；
3) RNA提取液3：由Tris-HCl和乙醇配制而成；
4) RNA提取液4：由Tris-HCl分装而成；
5) RNA提取液5：由Tris-HCl、EDTA配制而成；
6) 磁珠：为磁珠直接分装而成；
7) 核酸助沉剂：为核酸助沉剂直接分装而成；
8) 蛋白酶K：由蛋白酶K和灭菌的实验室三级水配制而成；
9) EV71/CA16 PCR反应液：由RNA-mix、EV71上下游引物、EV71探针、CA16上下游引物、CA16探针、内标上下游引物、探针配制而成；
10) EV71/CA16阳性质控品：将一定量高浓度的EV71阳性质粒和CA16阳性质粒按照1:1的比例混合均匀，再用pH8.0的TE缓冲液稀释此混合质粒，至终浓度均为1.00~9.99×106copies/mL；
11) EV71/CA16弱阳性质控品：由一定量高浓度的EV71和CA16阳性混合质粒，pH8.0的TE缓冲液配制而成，使其终浓度均为1.00~9.99×104copies/mL；
12) EV71/CA16阴性质控品：为实验室三级水，经灭菌制成；
13) EV71/CA16内标：由一定量高浓度的内标质粒，pH8.0的TE缓冲液配制而成，使其终浓度为1.00~9.99×105copies/mL。
在优选的情况下，本发明使用磁珠法提取样本核酸，采用一步法三色荧光PCR检测技术，分别选取肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型基因组中相对保守的区域，设计特异性引物及探针，在样本核酸提取之后采用荧光PCR对病毒进行快速检测，同时采用内标质控体系，用于监测反应体系可能存在的抑制因素。内标模板与靶基因无同源性，内标探针选择的是与靶基因探针没有冲突的另一检测通道。
具体的，在一个优选实施方案中，本发明所述方法包括如下步骤，①在生物样本中加入RNA提取液1、磁珠、蛋白酶K、核酸助沉剂、RNA提取液2，使样本裂解释放出RNA，RNA与纳米磁珠结合，在磁场作用下，磁珠聚集，磁珠-核酸复合物和液体分离；②向磁珠-核酸复合物加入RNA提取液3，洗去复合物表面蛋白质、脂类以及盐离子等杂质，在磁场作用下，得到洗涤后的磁珠-核酸复合物；③向磁珠-核酸复合物加入RNA提取液4，洗去复合物表面蛋白质、脂类以及盐离子等杂质，在磁场作用下，得到洗涤后的磁珠-核酸复合物；④向洗涤后的磁珠-核酸复合物加入RNA提取液5，改变磁珠和核酸结合情况，将核酸在磁珠上面洗脱下来，在磁场作用下，磁珠和核酸RNA溶液分离，得到纯化的核酸RNA；⑤将纯化的待测样本核酸RNA、EV71/CA16阳性质控品、EV71/CA16弱阳性质控品、EV71/CA16阴性质控品均加入到分装好的EV71/CA16 PCR反应液中，在荧光定量PCR扩增仪上进行PCR反应，并分析结果。
根据本发明的一个优选实施方案，反应结束后，根据PCR仪说明书及荧光曲线进行手动或自动调整基线和阈值。阳性样本参考值为Ct值≤37.0；阴性样本参考值为Ct值＞40.0；37＜Ct值≤40.0且扩增曲线正常为灰区，需进行重复试验，重复试验后，Ct值＜40，判断为阳性，否则判断为阴性。
根据本发明的一个优选实施方案，本试剂盒的最低检测限及灵敏度可达1×103copies/ml。
根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒的检测特异性测定方法如下：
本试剂盒在3家临床试验机构共完成了520例咽拭子的检测，后经参比试剂鉴定证实，EV-71型阴性符合率为99.70%，阳性符合率为99.48%，总符合率为99.62%；CA-16型阴性符合率为100%，阳性符合率为99.51%，总符合率为99.81%。检测200例粪便样本，经参比试剂鉴定证实，EV-71型和CA-16型阴性符合率均为100%，阳性符合率均为100%，总符合率均为100%。
本发明的试剂盒经过多次不同的重复实验验证证实，具有良好的重复性和稳定性。本发明中核酸提取试剂盒在2~8℃保存；扩增试剂盒在-20±5℃避光保存，产品有效期可达8个月。
针对肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒（荧光PCR法）所设计的引物和三色荧光探针扩增特异性基因片段，可同时检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型，并达到分型的目的，同时利用内标质控体系，用于监测反应体系可能存在的抑制因素，应用十分方便。由于该方法引入了三组特异性扩增引物和荧光探针，使得检测具有更好的灵敏度和特异性，从而避免了其它检测方法特异性不高的问题。同时本发明引入了EV71/CA16阳性质控品、EV71/CA16弱阳性质控品和EV71/CA16阴性质控品，作为实验的对照，对感染的肠道病毒RNA进行快速检测。本发明使用一步法三色荧光PCR检测技术，简化了试验过程，提高了检测效率。与传统方法相比，本发明具有操作简单、快速方便的优点。因此本发明的试剂盒可以对人体咽拭子、粪便样本中的肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型核酸RNA进行快速、准确测定，临床上主要用于肠道病毒感染的辅助诊断。
附图说明
图1显示了本发明提供的一个EV71/CA16阳性质控品、一个EV71/CA16弱阳性质控品和一个EV71/CA16阴性质控品的扩增曲线图。
图2显示了一个加在EV71/CA16阳性质控品、一个加在EV71/CA16弱阳性质控品和一个加在EV71/CA16阴性质控品中的内标扩增曲线图。
图3显示了本发明提供的六个EV71阳性样本，六个CA16阳性样本的扩增曲线图。
图4显示了本发明提供的七个EV71和CA16近似病原体（分别为：单纯疱疹病毒Ⅱ型，柯萨奇病毒A4型，流感病毒，肺炎衣原体，副流感病毒，金黄色葡萄球菌、合胞体病毒）的扩增曲线图（含内标）。
图5显示了本发明提供的最低检出限样本重复检测10次的扩增曲线图。
具体实施方式
以下仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可很容易进行的改变或变化都涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。
实施例1：本实施例提供一种肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒（荧光PCR法），本试剂盒由核酸提取试剂盒及扩增试剂盒组成。核酸提取试剂盒包含磁珠、核酸助沉剂及RNA提取液；扩增试剂盒包含蛋白酶K、EV71/CA16 PCR反应液、EV71/CA16质控品、EV71/CA16内标，其中EV71/CA16 PCR反应液含有反转录酶、UNG酶、Taq酶、dNTP、MgCl2、EV71型引物、EV71型荧光探针、CA16型引物、CA16型荧光探针、内标引物、内标荧光探针。
从附图1、2可以看出，EV71/CA16阳性质控品以及EV71/CA16弱阳性质控品本身有明显扩增曲线，可判为阳性；而EV71/CA16阴性质控品本身无明显扩增曲线，与阈值线无交点，没有Ct值，可判为阴性。加入EV71/CA16阳性质控品、EV71/CA16弱阳性质控品和EV71/CA16阴性质控品中的内标均为明显的扩增曲线，可判为阳性。说明本试剂盒EV71/CA16阳性质控品、EV71/CA16弱阳性质控品、EV71/CA16阴性质控品和EV71/CA16内标可以检测反应体系，避免假阴性结果。
实施例2：本实施例提供一种肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒（荧光PCR法）检测咽拭子和粪便样本中的EV71和CA16 RNA的操作。
一、临床样本核酸RNA提取检测
1)实验开始前取出试剂盒所需组分，轻微振荡，使其充分混匀，如试剂中有沉淀，请溶解后使用。核酸提取操作时，如发现管壁和管盖有液体，请短暂离心使液体甩入管底，再置于磁力架上；
2)PCR反应液准备：检测反应设置阳性质控、弱阳性质控和阴性质控，每孔均设有内标。反应数N=待检样本数(n)+质控品数(3)+1。计算加到反应混合物中的各个试剂的量，取1.5mL无菌离心管配制反应体系（EV71/CA16 PCR反应液40μl/人份+EV71/CA16内标1μl/人份），试剂全部加入后震荡混匀，离心数秒。然后将上述混合液41μl/管分装至PCR反应管中；
3)样本核酸提取：取N个1.5ml灭菌离心管（N为所需提取临床样本的数量），分别加入300μl提取液1、40μl蛋白酶K、4μl核酸助沉剂、20μl磁珠（使用前充分振荡混匀），200μl待处理样本，100 μl提取液2，室温颠倒混匀15分钟，使磁珠和核酸充分结合。将离心管放在磁力架上静置2分钟，磁珠吸附完全，溶液澄清后弃去上清液。吸附在离心管盖上的磁珠可通过反复颠倒磁力架冲洗下来。加入550μl提取液3，漩涡振荡使磁珠重新悬浮，然后置于磁力架上，2分钟磁分离后去上清。重复提取液3操作。将离心管放置在磁力架上，缓慢加入600μl提取液4，吹吸3次，静置2分钟磁分离后弃去上清液，取下离心管。加入50μl提取液5，用移液器缓慢吹打混匀，55℃温浴10分钟，期间轻轻晃动溶液两次。将离心管放在磁力架上静置2分钟，磁分离后将上清液转移至新的灭菌离心管中；
4)加样：将EV71/CA16阴性质控品、EV71/CA16阳性质控品、EV71/CA16弱阳性质控品、临床样本RNA 9μl分别加入PCR反应管中，盖紧管盖（避免气泡产生）短暂离心将管壁上的液体全部甩至管底，然后立即进行PCR反应。
二、PCR扩增程序设置以及结果分析条件设定
1) PCR扩增程序
50℃ 30分钟，1个循环；95℃ 5分钟，1个循环；95℃ 15秒→60℃ 45秒，40个循环；25℃ 10秒，1个循环
2) 结果分析条件设定
反应结束后，也可根据荧光曲线进行手动或自动调整基线和阈值。基线的起始点一般设定在5～8之间，终止点一般设定在12～15之间，阈值线通常设定在1000～5000之间（视具体情况而定）。设定之后，重新分析，记录样本Ct值和结果。
三、质量控制
1) 内标：内标通道应出现S型扩增曲线，且Ct值≤35.0；
2) 阴性质控品：靶基因FAM和HEX通道均无S型扩增曲线；内标通道有S型扩增曲线，且Ct值≤35.0；
3) 阳性质控品：靶基因FAM和HEX通道均有S型扩增曲线，且Ct值≤30.0；内标通道有S型扩增曲线，且Ct值≤35.0；
4) 弱阳性质控品：靶基因FAM、HEX通道、内标通道均有S型扩增曲线，且Ct值≤35.0；
以上条件必须在同一次实验中全部满足，否则本次实验结果无效。
四、实验结果
从附图3、4可以看出，六个EV71阳性样本在FAM通道有明显扩增曲线，六个CA16阳性样本在HEX通道有明显扩增曲线，可判为阳性；而七个EV71和CA16近似病原体（分别为：单纯疱疹病毒Ⅱ型，柯萨奇病毒A4型，流感病毒，肺炎衣原体，副流感病毒，金黄色葡萄球菌、合胞体病毒）的扩增曲线在FAM和HEX通道都无明显扩增曲线，与阈值线无交点，没有Ct值，均可判为EV71和CA16阴性。本试剂盒可以分别在不同荧光通道检测出EV71型和CA16型样本，而EV71和CA16近似病原体样本均检测为阴性，说明本试剂盒的特异性佳。
实施例3：本实施例提供一种肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒（荧光PCR法）最低检测限的测定。
第一步对已定值的EV71/CA16阳性混合样本进行梯度稀释，每个稀释梯度进行重复检测，利用经检测合格的本发明所述试剂盒进行检测，初步判定该试剂盒的分析灵敏度（最低检出限）为1×103copies/ml；第二步：将确定的最低检出限样本重复检测10次，确定本发明所述试剂盒的最低检出限的重复性。
从附图5可以看出，本发明所述试剂盒对最低检出限样本重复检测10次，FAM和HEX通道均有明显扩增曲线，内标扩增正常，可判断为阳性。说明本试剂盒的最低检测限及灵敏度可达1×103copies/ml。
实施例4：本实施例提供一种肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒（荧光PCR法）的临床应用。
使用本发明的试剂盒在3家临床试验机构共完成了520例咽拭子的检测，检出EV71阳性样本192例，阴性样本328例；CA16阳性样本203例，阴性样本317例。后经参比试剂（已获批的同类试剂盒）鉴定证实，EV-71型阴性符合率为99.70%，阳性符合率为99.48%，总符合率为99.62%，Kappa值为0.9917；CA-16型阴性符合率为100%，阳性符合率为99.51%，总符合率为99.81%，Kappa值为0.9960。检测200例粪便样本，检出EV-71阳性样本82例，阴性样本118例；CA-16阳性样本72例，阴性样本128例。后经参比试剂（已获批的同类试剂盒）鉴定证实，EV-71型和CA-16型阴性符合率均为100%，阳性符合率均为100%，总符合率均为100%，Kappa值均为1。本发明提供一种肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒（荧光PCR法）与对照试剂检测结果一致性较好，为病人的诊断提供临床辅助证明。如果样本中检测出EV71或CA16基因型肠道病毒的存在，建议立即采取必要措施。
<110> 宝瑞源生物技术（北京）有限公司
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ttttgttttt ataatgtgtt cttccatcc 209
Claims (5)
1.一种肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型核酸检测试剂盒（荧光PCR法），本试剂盒由核酸提取提取盒及扩增试剂盒组成，核酸提取试剂盒包含磁珠、核酸助沉剂及RNA提取液；扩增试剂盒包含蛋白酶K、EV71/CA16 PCR反应液、EV71/CA16质控品、EV71/CA16内标，其中EV71/CA16 PCR反应液含有反转录酶、UNG酶、Taq酶、dNTP、MgCl2、EV71型引物、EV71型荧光探针、CA16型引物、CA16型荧光探针、内标引物、内标荧光探针，各序列如下：
EV71型上游引物序列：5′-tgccgaaattggagcatcatcaaatg-3′
EV71型下游引物序列：5′-actgggacatagatataacagg-3′
CA16型上游引物序列：5′-gttgttcacgtatatgcgcttt-3′
CA16型下游引物序列：5′-gattcattcgcttggcaaac-3′
内标上游引物序列：5′-aattggtcaacatgtgaaagc-3′
内标下游引物序列：5′-gaatgtggccaaggttccgtcatttgg-3′
EV71型荧光探针序列：5′FAM-ccactcttgatagtttctttagtaggg-3′BHQ-1
CA16型荧光探针序列：5′HEX-atggtgagctagtcccccaattac-3′BHQ-1
内标荧光探针序列：5′CY5-aatcttctaattactgtatatggaag-3′BHQ-2
EV71质控品序列：
tcatcggctg gatacaggca aggttccagc actccaagct gccgaaattg gagcatcatc aaatgctagt gacgagagca
tgattgagac acgctgtgtc cttaactcgc acagtacagc tgagaccact cttgatagtt tctttagtag ggcgggatta
gttggagaga tagatctccc tcttgagggc acaactaacc caaatggtta tgccaactgg gacatagata taacaggtta
cgcgcaaatg cgta
CA16质控品序列：
tgctcaatta cggcgcaaat gcgagttgtt cacgtatatg cgctttgatg ctgaattcac atttgtcgta gccaagccca
atggtgagct agtcccccaa ttactgcagt acatgtatgt cccaccaggg gctccgaaac ccacatccag agattcattc
gcttggcaaa ctgctaccaa cccatctgtg tttgtgaaaa tgacg
内标质粒序列：
aaaatctttt cttacaaggg aagtccccaa ttggtcaaca tgtgaaagca cgtgtcatgt tcttactttt gtttgggtaa
tcttctaatt actgtatatg gaagatgtga atgaagtttt ggtcctgaat gtggccaagg ttccgtcatt tggagatacg
aaatcaaatc tcctttaaga ttttgttttt ataatgtgtt cttccatcc
EV71/CA16阴性质控品为无菌实验室三级水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中包括如下组分：
RNA提取液1：由Tris-HCl、SDS和GuSCN配制而成；
RNA提取液2：由EDTA和NaCl配制而成；
RNA提取液3：由Tris-HCl和乙醇配制而成；
RNA提取液4：由Tris-HCl分装而成；
RNA提取液5：由Tris-HCl、EDTA配制而成；
磁珠：为磁珠直接分装而成；
核酸助沉剂：为核酸助沉剂直接分装而成；
蛋白酶K：由蛋白酶K和灭菌的实验室三级水配制而成；
EV71/CA16 PCR反应液：由RNA-mix、EV71上下游引物、EV71探针、CA16上下游引物、CA16探针、内标上下游引物、探针配制而成；
EV71/CA16阳性质控品：将一定量高浓度的EV71阳性质粒和CA16阳性质粒按照1:1的比例混合均匀，再用pH8.0的TE缓冲液稀释此混合质粒，至终浓度均为1.00~9.99×106copies/mL；
EV71/CA16弱阳性质控品：由一定量高浓度的EV71和CA16阳性混合质粒，pH8.0的TE缓冲液配制而成，使其终浓度均为1.00~9.99×104copies/mL；
EV71/CA16阴性质控品：为实验室三级水，经灭菌制成；
EV71/CA16内标：由一定量高浓度的内标质粒，pH8.0的TE缓冲液配制而成，使其终浓度为1.00~9.99×105copies/mL。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，检测EV71型、CA16型、内标的探针5′标记分别为FAM、HEX(VIC)、CY5，但不限于此三种荧光标记，所以称为一步法三色荧光PCR检测技术，探针3′标记为BHQ。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，使用磁珠法提取纯化RNA；采用一步法三色荧光PCR检测技术同时对EV71型和CA16型进行检测分型；采用内标质控体系，监测反应体系可能存在的抑制因素。
5.根据权利要求4所述的的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：
在生物样本中加入RNA提取液1、磁珠、蛋白酶K、核酸助沉剂、RNA提取液2，使样本裂解释放出RNA，RNA与纳米磁珠结合，在磁场作用下，磁珠聚集，磁珠-核酸复合物和液体分离；向磁珠-核酸复合物加入RNA提取液3，洗去复合物表面蛋白质、脂类以及盐离子等杂质，在磁场作用下，得到洗涤后的磁珠-核酸复合物；向磁珠-核酸复合物加入RNA提取液4，洗去复合物表面蛋白质、脂类以及盐离子等杂质，在磁场作用下，得到洗涤后的磁珠-核酸复合物；向洗涤后的磁珠-核酸复合物加入RNA提取液5，改变磁珠和核酸结合情况，将核酸在磁珠上面洗脱下来，在磁场作用下，磁珠和核酸RNA溶液分离，得到纯化的核酸RNA；将纯化的待测样本核酸RNA、EV71/CA16阳性质控品、EV71/CA16弱阳性质控品、EV71/CA16阴性质控品均加入到分装好的EV71/CA16 PCR反应液中，在荧光定量PCR扩增仪上进行PCR反应，并分析结果。
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