CN102851394B

CN102851394B - 一种检测肠道病毒71型rna的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN102851394B
Application number: CN201210315436.0A
Authority: CN
Inventors: 戴立忠; 邓中平; 付亚成
Original assignee: Sansure Biotech Inc
Current assignee: Sansure Biotech Inc
Priority date: 2012-08-30
Filing date: 2012-08-30
Publication date: 2014-01-15
Anticipated expiration: 2032-08-30
Also published as: CN102851394A

Abstract

本发明提供一种提取纯化和检测EV71 RNA（肠道病毒71型RNA）的方法，并提供一种相应的检测EV71 RNA的试剂盒。本发明提供的试剂盒中包括含磁珠的RNA提取溶液、和含用于靶多核苷酸扩增的上游引物EV71-F1、下游引物EV71-R1和用于靶多核苷酸检测的探针EV71-P1的PCR反应液。本发明提供的试剂盒可检测出EV71阳性样本，但不能检测出非EV71病原体，说明本发明试剂盒具有很好的特异性；另外，本发明选择了吸附效果好、易于纯化的磁珠法提取RNA，可以获得高纯度和高得率的核酸，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳定性，其检测下限即灵敏度可达200copies/ml，检测范围（试剂盒的定量线性范围）为2.00E+02~2.00E+08copies/ml。

Description

一种检测肠道病毒71型RNA的方法及试剂盒

技术领域

本发明提供一种提取纯化和检测肠道病毒71型（Human enterovirus 71，EV71）RNA的方法，并提供一种相应的检测EV71 RNA的试剂盒。

背景技术

EV71是引起婴幼儿手足口病常见的病毒，学龄前儿童对EV71普遍易感，且发病急、进展快。成人亦有感染，一般表现为隐性带毒，可传染给婴幼儿而引起发病。

与其他肠道病毒相似，对EV71感染进行诊断与分类的方法在现阶段一般是通过采集适当的临床标本后进行病毒分离和病毒鉴定；如果没有采到合适的临床标本，或无法进行病毒分离，也可以通过血清学检测（如中和实验）来检测血清中的中和抗体，或直接从临床标本中检测病毒的核酸来诊断。

由于病毒分离培养较困难，加之感染后IgG抗体存在时间长，再感染时IgM和补体结合抗体又常为阴性，故有时血清学实验较难区分初次感染和再次感染，而特异性核酸的检测不失为快速、明确的诊断手段。

实时荧光PCR技术（FQ-PCR）把PCR、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行。实时荧光PCR技术与其它检测技术相比具有以下优势：（1）与免疫学检测比较，其具有更高的灵敏度，从理论上讲只要有一个基因拷贝就可以检测出来。（2）根据各种病原体独特的保守基因序列设计引物，能够保证PCR反应的高度特异性，避免交叉反应。（3）能对病毒进行定量检测，可反映出患者体内病原体拷贝数的高低和复制情况。定量检测有助于判断病原体感染与疾病发生和发展的关系，探讨药物对病原体的作用，了解感染疾病病人用药后病情的变化情况。这对理解发病机制和预测抗病毒治疗的有效性十分关键。（4）可扩大检测人群的范围，适用于大规模的流行病调查。对如手足口病这类自然感染率极高的病原微生物尤其适用。（5）将PCR敏感性与探针特异性相结合，在很大程度上改变了传统PCR的缺陷，缩短了反应时间，简化了操作步骤（6）全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阴性和环境污染（7）实时检测技术可连续不断的检测PCR过程中荣耀信号的变化，避免了传统PCR的“平台期效应”，并且模板的定量不通过终产物，而由Ct值算出，准确性和灵敏性都有提高。

目前，国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术定量检测EV71-RNA的试剂盒应用于临床检测中，这些试剂盒所提供的EV71-RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。该类试剂盒存在很多不足之处：1）检测灵敏度低，约在1000copies/ml左右；检测范围窄，一般在1.00E+03copies/ml~1.00E+07copies/ml之间，对于临床高值（大于5.00E+07copies/ml）和低值（小于1.00E+03copies/ml）的样本无法检测；2）无法有效检测肠道病毒71型A、B、C的各亚型样本，经常有漏检情况的发生；3）酚-氯仿法是最经典的RNA提取方法，但是操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低，且所用试剂具有一定的毒性；柱提取方法无需高速离心，但是需频繁更换离心管，用时长，特异性较差；4）无法有效去除样本中的PCR抑制物（如全血、痰液等），体系中一般没有阳性内对照（即内标），无法预防假阴性；5）国外性能优异的同类试剂是Biomerieux,inc.的NucliSENS EasyqEnterovirus System试剂。该试剂成本和耗材成本太高，很难在临床广泛开展。

磁珠（免疫磁珠）法是近年发展迅速且被广泛应用的一种核酸提取方法，其优于传统方法的特点可以总结为以下几点：其系列试剂不含氯仿、苯酚等毒性大的有机溶剂；提取纯化的核酸质量好、产量高；提取步骤更简单，不需要离心，易于实现自动化；这些优点使其有替代其它核酸提取和纯化方法的发展趋势。但在现有技术中，并未见有磁珠法用于提取纯化和检测EV71 RNA的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于解决现有肠道病毒71型核酸检测试剂盒的缺陷，提供一种RNA提取得率高、检测灵敏度高的肠道病毒71型核酸检测试剂盒，应用该试剂盒，可以对咽拭子、粪便等未知样本中的EV71-RNA浓度进行快速、准确测定，为早期诊断肠道病毒71型感染提供可靠的实验依据。

本发明用磁珠法提取样本核酸，采用实时荧光定量PCR技术，以EV71基因组的高度保守区域为扩增靶目标，设计特异性引物及TaqMan探针，在实时荧光PCR仪上通过PCR扩增对EV71 RNA进行定性检测。

本发明提供一种检测EV71 RNA的方法，其中使用磁珠法提取和纯化EV71 RNA。

在本发明中，所述磁珠是生物科学和纳米材料科学二者结合的产品。它运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠；该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。它利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在Chaotropic盐（盐酸胍、异硫氰酸胍等）和外加磁场的作用下，能将血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中的DNA和RNA分离出来，可应用于临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。在本发明中，所述磁珠可经商购获取。

在优选的情况下，本发明结合使用磁珠法和实时荧光PCR技术提取纯化和检测EV71RNA。

具体的，在一个实施方式中，本发明所述方法包括如下步骤，步骤A，裂解病毒：每支离心管加入含磁珠的RNA提取溶液和待测样本，混匀后离心；EV71阴性对照和EV71阳性对照参照与待测样本相同的方法作RNA提取和纯化处理；步骤B，磁珠吸附核酸：每管加入含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠的RNA提取溶液Ⅱ，混匀后静置；步骤C，去除杂质：经离心后将离心管置于磁珠分离器上进行磁珠分离，再缓慢将溶液吸出；步骤D，洗涤：每管加入含曲拉通和氯化钠的RNA提取溶液Ⅲ和含矿物油的RNA提取溶液Ⅳ，混匀后离心，将离心管置于磁珠分离器上进行磁珠分离，静置分层后将液体吸出丢弃；步骤E，RNA洗脱：加入含Tris-HCl和EDTA的RNA洗脱液将离心管壁上的磁珠洗脱到管底，混匀并静置后将离心管再次置于磁珠分离器上，然后将从磁珠上洗脱下来的RNA吸至新的灭菌离心管中；步骤F，荧光PCR分析：将洗脱磁珠后的待测样本RNA、EV71阴性对照、EV71阳性对照中均加入含PCR反应缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、引物、探针的PCR反应液和含mMLV酶和H-Taq DNA聚合酶的EV71酶混合液，在荧光定量PCR扩增仪上进行PCR反应，并分析结果。

本发明还提供一种检测EV71 RNA的试剂盒，包括含磁珠的RNA提取溶液Ⅰ、和含用于靶多核苷酸扩增的上游引物EV71-F1、下游引物EV71-R1和用于靶多核苷酸检测的探针EV71-P1的PCR反应液；其中，上游引物EV71-F1的碱基序列为5’-TCTGTTTCCCCGGACTGAGTAT-3’；下游引物EV71-R1的碱基序列为5’-TGGTGTTACTAGGTTTTCCGAAGTAG-3’；探针EV71-P1的碱基序列为5’FAM-AAAACGTTCGTTATCCGGCT-BHQ13’；

在本发明的试剂盒中，发明人寻找出EV71 RNA的保守序列而设计出用于靶多核苷酸扩增和检测的引物和探针序列，为EV71 RNA的实时荧光PCR检测检测提供了保障。

在本发明所述试剂盒中，优选的是，所述试剂盒中还包括内标，所述内标即为阳性内对照，具体为一段长为78碱基对的人工合成DNA序列插入pUC18T载体的重组体，即质粒，浓度为1.00E+03 copies/ml~1.00E+06 copies/ml；78碱基对的序列如下所示：5’-AAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTC-3’。

在本发明一个具体实施方式中，所述试剂盒中包括如下组分，①RNA提取溶液Ⅰ：包含十二烷基硫酸钠、曲拉通、异硫氰酸胍和100~400μg/ml的磁珠；②RNA提取溶液Ⅱ：含4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠；③RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通和氯化钠；④RNA提取溶液Ⅳ：含矿物油；⑤RNA洗脱液：含Tris-HCl和EDTA；⑥内标：如上所述的可选择使用的内标；⑦PCR反应液：包括5×PCR反应缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸，用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物EV71-F1与EV71-R1，用于靶多核苷酸检测的探针EV71-P1，用于内标扩增和检测的上、下游引物dzu-F1与dzu-R1和探针dzu-P1；⑧EV71酶混合液：含mMLV酶和H-TaqDNA聚合酶；⑨EV71阳性对照：标定已知浓度的慢病毒，其浓度为1.00~5.00E+05copies/ml；和⑩EV71阴性对照：灭菌生理盐水。

在本发明的上述试剂盒中，用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物EV71-F1与EV71-R1和用于靶多核苷酸检测的探针EV71-P1的序列是本发明的核心；而用于内标扩增的上、下游引物dzu-F1与dzu-R1和用于内标检测的探针dzu-P1均可以据内标的碱基序列而任意选择。在本发明中，例如，上游引物dzu-F1为：5'-AAATCCTAAGGTTCCAGCT-3'；下游引物dzu-R1为：5'-GAGATTGCACCTCCAGAAG-3'；探针dzu-P1为：5’HEX-CAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAG-Dabcyl 3’。

在上述试剂盒中，更为优选的是，①RNA提取溶液Ⅰ：由十二烷基硫酸钠0.2~1.0%（质量/体积）、曲拉通1.0~4.0%（体积/体积），异硫氰酸胍0.2~1.0mol/L和100~400μg/ml的磁珠组成。②RNA提取溶液Ⅱ：包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸100~300mmol/L、氯化钠100~300mmol/L，溶液Ⅱ的pH值为6.5±0.2；③RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通0.1~1.0%（体积/体积）和氯化钠100~300mmol/L。⑤RNA洗脱液：含Tris-HCl 0.8~1.2mol/L和EDTA0.1~1.0mol/L；⑦PCR反应液：包括5×PCR反应缓冲液10μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2~0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物EV71-F1与EV71-R1，0.2~0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针EV71-P1，0.1~0.2μmol/L的用于内标扩增的上、下游引物dzu-F1与dzu-R1，0.05~0.2μmol/L的用于内标检测的探针dzu-P1；⑧EV71酶混合液：包括mMLV酶10~150U/μl和1~10U/μl的H-Taq DNA聚合酶。

本发明在对EV71的序列进行比对的基础上，在EV71的最保守区域5’UTR共设计了两对引物和探针，经定量PCR优化，筛选出了扩增效果最好的一对引物和探针，可检测出EV71阳性样本，但不能检测出非EV71病原体，说明本发明试剂盒具有很好的特异性，并且该试剂所用的引物和探针检测的序列区域在肠道病毒71型A、B1~B4和C1~C4各亚型的保守位置，能有效检测各类亚型的样本，避免了其他同类试剂存在的亚型漏检的风险，避免假阴性结果的产生。另外，本发明对EV71-RNA的提取方法进行了比较和优化，选择了吸附效果好、易于纯化的磁珠法提取RNA，可以获得高纯度和高得率的核酸，大大提高了检测灵敏度、准确度和稳定性，检测灵敏度可达2.00E+02 copies/ml，线性检测范围为2.00E+02copies/ml～2.00E+08 copies/ml。

另外，在本发明的一种优选实施方式中，在样本提取过程中增加了内标，利用内标监控RNA提取和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止样本检测假阴性。

本发明中，在荧光定量PCR扩增结束后，经仪器自带软件自动分析样本的Ct值，可定性检测咽拭子、粪便等未知样本中的EV71-RNA，可为灵敏、早期诊断肠道病毒71型感染提供可靠的实验证据。

附图说明

图1为本发明方法检测EV71线性梯度样本，浓度为2.00E+02copies/ml～2.00E+08copies/ml；

图2为本发明方法检测EV71企业参考品的阳性参考品P1-P10；

图3为本发明方法检测EV71企业参考品的阴性参考品；

图4为本发明方法检测EV71企业参考品的精密度参考品，浓度为5.00E+02copies/ml；

图5为本发明方法检测EV71企业参考品的灵敏度参考品，浓度为2.00E+03copies/ml；

图6为本发明方法检测EV71企业参考品的灵敏度参考品，浓度为2.00E+02copies/ml；

图7为本发明方法检测EV71企业参考品的灵敏度参考品，浓度为1.00E+02copies/ml；

图8为本发明方法检测EV71相应内标；

图9为本发明方法检测科萨奇病毒A16型、腺病毒、流感病毒、EB病毒、巨细胞病毒、肺炎支原体、解脲脲原体、结核杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌样本；

图10为本发明方法检测测肠道病毒71型A、B1~B4和C1~C4各亚型的阳性病毒样本。

具体实施方式

以下仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可很容易进行的改变或变化都涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。

实施例1

本实施例提供一种肠道病毒71型核酸检测试剂盒（检测EV71 RNA的试剂盒），它包括如下组分：

①RNA提取溶液Ⅰ：由十二烷基硫酸钠0.6（质量/体积）%、曲拉通3.5（v/v）%，异硫氰酸胍0.8mol/L和300μg/ml的磁珠组成；

②RNA提取溶液Ⅱ：包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸100mmol/L、氯化钠200mmol/L，溶液Ⅱ的pH值为6.5±0.2；

③RNA提取溶液Ⅲ：曲拉通0.5（v/v）%、氯化钠300mmol/L；

④RNA提取溶液Ⅳ：矿物油；

⑤RNA洗脱液：Tris-HCl 1.2mol/L（pH8.0）、EDTA1.0mol/L（pH8.0）和纯化水组成；

⑥内标（阳性内对照）：一段长为78碱基对的人工合成DNA序列插入pUC18T载体的重组体，即质粒，浓度为1.00E+03copies/ml~1.00E+06copies/ml；78碱基对的序列如下所示：

5’-AAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTC-3’

⑦PCR反应液：PCR反应液由引物、探针、dNTPs、5×PCR反应缓冲液、灭菌纯化水等组成。每人份EV71PCR反应液为43μl，单人份用量配方如表1：

表1

物料名称	单人份用量
		引物EV71-F1(50pmol/μl)	0.2μl
引物EV71-R1(50pmol/μl)	0.2μl
		探针EV71-P1(50pmol/μl)	0.1μl
内标引物dzu-F1(40pmol/μl)	0.2μl
		内标引物dzu-R1(40pmol/μl)	0.2μl
内标探针dzu-P1(50pmol/μl)	0.06μl
		dNTPs	0.8μl
5×PCR buffer	10μl
		灭菌纯化水	31.24μl

所述用于靶多核苷酸扩增和检测的上下游引物及探针，其碱基序列分别为：

上游引物EV71-F1：5’-TCTGTTTCCCCGGACTGAGTAT-3’；

下游引物EV71-R1：5’-TGGTGTTACTAGGTTTTCCGAAGTAG-3’；

探针EV71-P1：5’FAM-AAAACGTTCGTTATCCGGCT-BHQ 13’；

针对100碱基的序列设计了非竞争性内标的引物及探针，其碱基序列分别为：

上游引物dzu-F1：5'-AAATCCTAAGGTTCCAGCT-3'；

下游引物dzu-R1：5'-GAGATTGCACCTCCAGAAG-3'；

探针dzu-P1：5’HEX-CAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAG-Dabcyl 3’；

⑧EV71酶混合液：mMLV酶10~150U/μl，1~10U/μl H-Taq DNA聚合酶；

⑨EV71阳性对照：根据定值后的EV71慢病毒的浓度，用TE缓冲溶液稀释到1.00~5.00E+05copies/ml作为EV71阳性对照；

⑩EV71阴性对照：灭菌生理盐水。

实施例2

本实施例提供上述实施例1所述试剂盒用于检测咽拭子、粪便等未知样本中EV71-RNA的操作步骤：

一、试剂准备

1）按比例取相应量的RNA提取溶液Ⅰ（200μl～1ml/人份）及内标（1μl/人份）充分混匀成RNA提取溶液1-mix，瞬时离心后备用。

2）根据待测样本、EV71阴性对照、EV71阳性对照的数量，按比例取相应量的PCR反应液（43μl/人份）及EV71酶混合液（2μl/人份），充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。

二、RNA提取操作

1）裂解病毒：每管加入200μl～1ml RNA提取溶液1-mix，然后加入100μl～1ml待测样本（如咽拭子），盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心EV71阴性对照和EV71阳性对照参照与待测样本相同方法作RNA提取和纯化处理；

2）磁珠吸附核酸：每管加入50~400μl RNA提取溶液Ⅱ，震荡混匀10秒钟后，室温静置10~30分钟；

3)去除杂质：瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上进行磁珠分离，2~5分钟后缓慢将溶液吸出；

4）洗涤：每管加入400μl～1ml RNA提取溶液Ⅲ和100~500μl RNA提取溶液Ⅳ，震荡混匀3~7秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于磁珠分离器上进行磁珠分离；

5）2~5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1~3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃；

6）加入10~100ul RNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀3~4次，室温静置5~30分钟后将离心管再次置于磁珠分离器上2~5分钟，然后将从磁珠上洗脱下来的RNA吸至新的1.5ml灭菌离心管中；

7）每个反应管加入45μl的PCR-mix，吸取已经洗脱磁珠后的待测样本RNA、EV71阴性对照、EV71阳性对照各5μl加入PCR-mix中，盖好管盖。

三、荧光PCR反应与结果分析（在荧光定量PCR扩增仪上进行）

1）将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称。

2）荧光检测通道选择：选择FAM通道（Reportere:FAM,Quencher:None）检测EV71；选择HEX或Vdzu通道（Reporter:Vdzu,Quencher:None）检测内标。

3）荧光定量PCR反应条件见表2：

表2

4）结果分析

反应结束后自动保存结果，对EV71的曲线和相应EV71内标的曲线分别进行分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3~15、End值可设在5~20，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线），点击Analyze进行分析，然后到Plate窗口下记录检测结果。对于测定Ct值≤36（Ct值＞0）的样本，报告为EV RNA阳性；对于测定显示无Ct值的样本，同时内标检测为阳性（Ct值≤36），报告为EV RNA阴性；对于测定Ct值>36的样本，同时内标检测为阳性（Ct值≤36），报告为低于检测下限。若内标Ct值>36或内标显示无Ct值，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。

按上述实施例中所述方法对EV71 RNA和其余多种病毒做出检测分析，EV71 RNA的特异性试验表明，本发明所述试剂盒能够检测EV71企业阳性参考品P1-P10，而对科萨奇病毒A16型、腺病毒、流感病毒、EB病毒、巨细胞病毒、肺炎支原体、解脲脲原体、结核杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等样本均保持良好的阴性结果。另外，本发明中试剂盒能够有效检测肠道病毒71型A、B1~B4和C1~C4各亚型的阳性病毒样本。

从附图4~7可见，本发明方法检测EV71浓度低至2.00E+02copies/ml的企业参考品时，多次检测均为阳性，而检测EV71浓度为1.00E+02copies/ml的企业参考品时，只有50%样本检测为阳性；说明本发明方法检测EV71 RNA的灵敏度为2.00E+02copies/ml。

Claims

1.一种检测EV71RNA的试剂盒，包括含磁珠的RNA提取溶液、和含用于靶多核苷酸扩增的上游引物EV71-F1、下游引物EV71-R1和用于靶多核苷酸检测的探针EV71-P1的PCR反应液；其中，上游引物EV71-F1的碱基序列为5’-TCTGTTTCCCCGGACTGAGTAT-3’；下游引物EV71-R1的碱基序列为5’-TGGTGTTACTAGGTTTTCCGAAGTAG-3’；探针EV71-P1的碱基序列为5’FAM-AAAACGTTCGTTATCCGGCT-BHQ13’。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括内标，其为一段长为78碱基对的人工合成DNA序列插入pUC18T载体的重组体，即质粒，且78碱基对的序列为：5’-AAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTC-3’。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中包括如下组分，

①RNA提取溶液Ⅰ：由十二烷基硫酸钠、曲拉通、异硫氰酸胍和100～400μg/ml的磁珠溶液组成；

②RNA提取溶液Ⅱ：由4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氯化钠溶液组成；

③RNA提取溶液Ⅲ：由曲拉通和氯化钠溶液组成；

④RNA提取溶液Ⅳ：矿物油；

⑤RNA洗脱液：由Tris-HCl和EDTA溶液组成；

⑥内标；

⑦PCR反应液：由5×PCR反应缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸，用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物EV71-F1与EV71-R1，用于靶多核苷酸检测的探针EV71-P1，用于内标扩增和检测的上、下游引物dzu-F1与dzu-R1和探针dzu-P1组成；

⑧EV71酶混合液：由mMLV酶和H-Taq DNA聚合酶溶液组成；

⑨EV71阳性对照：标定已知浓度的慢病毒，其浓度为1.00～5.00E+05copies/ml；

⑩EV71阴性对照：灭菌生理盐水。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，在试剂盒中，

①RNA提取溶液Ⅰ：由十二烷基硫酸钠0.2～1.0%（质量/体积）、曲拉通1.0～4.0%（体积/体积），异硫氰酸胍0.2～1.0mol/L和100～400μg/ml的磁珠组成。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，在试剂盒中，

②RNA提取溶液Ⅱ：由4-羟乙基哌嗪乙磺酸100～300mmol/L和氯化钠100～300mmol/L组成，溶液Ⅱ的pH值为6.5±0.2；

③RNA提取溶液Ⅲ：由曲拉通0.1～1.0%（体积/体积）和氯化钠100～300mmol/L组成。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，在试剂盒中，

⑤RNA洗脱液：由Tris-HCl0.8～1.2mol/L和EDTA0.1～1.0mol/L组成；

⑦PCR反应液：由5×PCR反应缓冲液10μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上、下游引物EV71-F1与EV71-R1，0.2～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针EV71-P1，0.1～0.2μmol/L的用于内标扩增的上、下游引物dzu-F1与dzu-R1和0.05～0.2μmol/L的用于内标检测的探针dzu-P1组成；

⑧EV71酶混合液：由mMLV酶10～150U/μl和1～10U/μl的H-Taq DNA聚合酶组成。