CN102140558A - 一种定量检测乙型肝炎病毒（hbv）的方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种定量检测乙型肝炎病毒（HBV）的方法及其试剂盒，包括采用纳米磁珠法提取样品中乙肝病毒核酸作为标本模板，应用TaqMan荧光探针技术完成对该标本模板实时PCR检测过程，所述TaqMan荧光探针和竞争性内标分别标记下列其中一种不同颜色的荧光基团：FAM、Alexa546、JOE、HEX、TET；通过监测实时PCR反应体系中荧光信号的变化情况实现对样品中乙型肝炎病毒（HBV）的定量检测；试剂盒包括核酸提取试剂、核酸扩增试剂、对照品、标准品、内标。本发明从根本上解决现有荧光探针定量PCR技术存在的准确性差和灵敏性低的问题。适用于临床血液检测和诊断，监测和评价药物的疗效，也可用于中心血站血液筛查以及流行病学调查。

Description

一种定量检测乙型肝炎病毒(HBV)的方法及其试剂盒

技术领域

本发明属于生物医学临床诊断领域，具体指一种定量检测乙型肝炎病毒（HBV）核酸方法及试剂盒。

背景技术

在我国多种流行性传染病的病原微生物，如艾滋病，病毒性肝炎，结核，梅毒等，对人类健康造成了巨大危害。临床上主要应用免疫学和微生物学等方法对各种病原微生物进行检测和诊断，由于其灵敏性低和周期长等限制，仍不能完全杜绝阳性病原体的漏检和不能及时准确地诊断。近年来核酸分子检测技术在检验医学和临床研究中显示出强大的优势，相比较免疫诊断技术具有灵敏度好、特异性强和诊断快速等优点。但这项技术在进行确定病原体载量时仍存在操作复杂和灵敏性低等缺点，检测技术需要改进和提高。需要解决的技术关键是进一步提高检测的特异性和灵敏度，降低成本和方法的标准化。

核酸分子检测技术中的荧光定量PCR技术已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。这项技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，可以对人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒、梅毒螺旋菌、结核分枝杆菌、淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体等病原微生物进行定量测定。目前，常用的病原微生物实时荧光定量PCR技术包括探针类和染料类两种。

近年来，相比于传统的病毒核酸提取技术，市场上涌现了一些简单方便的核酸提取技术。主要涉及两种类型技术：离心柱法病毒核酸提取技术和磁珠法病毒核酸提取技术。前者由于提取技术中的离心柱配套使用的高通量自动化离心设备成本过高，难于普及推广。磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒（即磁珠-DNA 混合物），再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的DNA。磁珠法不需要加入多种试剂，操作简单，符合核酸自动化提取要求，是未来核酸纯化方法发展的一个重要方向。另外，磁珠提取核酸能够获得较高的回收产率。

在实际进行核酸检测的过程中运用PCR技术，为了排除假阴性结果和确定PCR的反应效率，需要在PCR反应体系中加入内标（内对照分子）。内标可以监控PCR反应，避免样本抑制物、DNA（RNA）提取过程的丢失、误操作等造成的假阴性结果；并对以上原因造成的定量误差进行修正。如中国专利申请CN1203366A采用珠蛋白基因等作为内标，CN1664098A采用beta-肌动蛋白作为内标，CN1687454A采用res-1基因作为内标，CN1940087A采用了RNA内标。然而，相对于PCR检测方法，人们对内标的研究工作却相对很少，特别是竞争

性内标，其设计有一定的技术难点。

正是由于PCR反应具有强大的扩增效率，也导致其易污染的缺点，极微量的污染可导致阳性结果，灵敏度过高可能会导致假阳性率增加。在导致PCR假阳性的因素中，产物污染是最严重、但又是可以避免的因素之一。为防止PCR产物污染，以避免假阳性和提高PCR诊断技术的稳定性已成为急待解决的问题。在PCR产物或引物中用dU代替dT。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。采用一种能识别核酸双链分子中的UTP并降解核酸的UNG酶，在下一次PCR之前对模板及其它反应物进行处理，可以防止因产物污染所致的假阳性。目前我国国家药政部门在接受PCR相关检测试剂盒申报时，已经把是否采用了UNG酶作为审批条件之一。但在目前仍然存在一些技术性问题，如UNG酶的活性保存非常重要。今后，UNG酶及其相应的系统将成为常规PCR检测试剂盒的组份。

检测乙型肝炎病毒（HBV）核酸的方法目前已有很多，且有很多商业化试剂盒生产。但大部分技术获试剂盒仍存在操作复杂和灵敏性低，准确性差等缺点，检测技术需要改进和提高。需要解决的技术关键是进一步提高检测的特异性和灵敏度，降低成本和方法的标准化。针对这些问题，本发明应用磁珠法获得高纯度核酸，采用竞争性内标和防污染系统降低假阳性和假阴性，大大提高了检测效率，灵敏度和准确性。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种可精确定量检测乙型肝炎病毒（HBV）核酸的方法及其试剂盒，从根本上解决现有乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量PCR技术存在的灵敏度低、准确性差等问题，其设计的TaqMan荧光探针具有灵敏度高，特异性强、稳定性好的优点。同时，核酸DNA提取方法简单，纯度好，采用竞争性内标和防污染体系提高检测精确度，容易操作，灵敏度度高，成本较低，特别适用于乙型肝炎病毒（HBV）精确的定量检测，灵敏度可达20 IU/ml，基本达到WHO对HBV病毒载量检测的要求。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种定量检测乙型肝炎病毒（HBV）的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

采用纳米磁珠法提取样品中乙肝病毒核酸作为模板，应用TaqMan 荧光探针技术完成对该标本模板实时PCR检测过程，并设计竞争性内标，通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性；其中：通过专用软件，根据分析比较乙型肝炎病毒目的基因序列，设计高保守性、特异性和高效性的TaqMan荧光探针和引物以及竞争性内标的探针和引物，所述TaqMan荧光探针和竞争性内标分别标记下列其中一种不同颜色的荧光基团：FAM、Alexa546、JOE、HEX、TET；所述实时PCR产物在60-120个碱基对范围；在实时PCR反应液中，加入一种前述TaqMan荧光探针和引物，通过监测实时PCR反应体系中荧光信号的变化情况实现对样品中乙型肝炎病毒（HBV）的定量检测。

所述纳米磁珠法提取样品中乙型肝炎病毒（HBV）核酸的步骤为：首先，取冻存的样品溶化，加入裂解液重悬样品沉淀，65℃ 水浴10min，裂解液与样品的体积比为1：2；然后，加入与样品等体积的结合液混匀，加入25μl磁珠，置于磁力架上吸附磁珠，吸掉上清；加入3倍样品体积的洗液于离心管中，置于磁力架上吸附磁珠，吸掉废液；在离心管中加入洗脱液，65℃水浴2min，吸附磁珠，吸取上清，即为目的总核酸，置于4℃或-20℃保存。

所述实时PCR反应体系为：包括5mM 的MgCl₂，0.6mg/ml的BSA，pH8.3的20mM Tris-HCl，75 mM 的KCl，2.5 mM 的dNTP，HotStar Taq酶，PCR增强剂，保护剂, 10-50 nM HBV荧光探针, 10-50 nM内标荧光探针, 10-50 nM HBV上下游引物。

所述样品包括人源或动物源的血液、精液、唾液。

一种定量检测乙型肝炎病毒（HBV）方法的试剂盒，包括核酸提取试剂、核酸扩增试剂、对照品、标准品、内标，其特征在于：所述核酸提取试剂中包括蛋白酶K、纳米磁珠、裂解液、结合液、洗液A、洗液B、洗脱液；其中裂解液组成为：其中裂解液组成为：pH8.0的50 mM Tris-HCl、pH8.0的10 mM EDTA、1%SDS、4 M异硫氰酸胍；结合液组成为：5M异硫氰酸胍、pH6.6的20 mM Tris-HCl、37.5%乙醇；洗液A、B组成为：20 mM NaCl、pH7.5的2 mM Tris-HCl、70%乙醇；洗脱液组成为：pH8.0的10 mM Tris-HCl、pH8.0的1 mM EDTA；所述核酸扩增试剂由HBV PCR 反应液、酶混合液-Taq酶& UDG酶、探针1、探针2组成，所述HBV PCR 反应液中包含针对乙型肝炎病毒（HBV）核酸而设计的引物；所述对照品中的阳性对照为非感染性乙型肝炎病毒DNA，阴性对照为无菌双蒸水，强阳性对照为非感染性病毒DNA；所述标准品为含有乙型肝炎病毒（HBV）DNA序列质粒的梯度稀释物；所述内标为竞争性内标，内标探针与HBV目标基因探针采用不同的荧光报告基团标记，通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。

所述核酸扩增试剂中针对乙肝病毒HBV和竞争性内标设计的TaqMan荧光探针和引物的序列如下：

HBV 探针：FAM-5’TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG’3-BHQ-1

上游引物：5’ ACACCTCCTTTCCATGGCTGC’3；

下游引物：5’ agcgccgacgggacgtagac’3；

内标探针：HEX-5’CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC’3-BHQ-1

所述试剂盒为检测乙型肝炎病毒（HBV）核酸的单一试剂盒。

本发明的优点及所产生的积极的技术效果是：

1、引物设计特异性强，具有广谱交叉反应：由于本定量检测病原微生物遗传物质的方法应用TaqMan-荧光探针技术完成对标本模板实时PCR检测过程，其通过专用软件，根据分析比较各种病原微生物的目的基因序列，设计高保守性、特异性和高效性的TaqMan探针和引物，所设计的TaqMan探针标记下列其中一种不同颜色的荧光基团：FAM，Alexa546，JOE，HEX，TET。所列举的应用本检测方法的试剂盒中针对乙肝病毒HBV设计的TaqMan探针和引物，具有高度保守性，可以覆盖其病原体不同的亚型或变种，有利于应用和推广。

2、检测技术灵敏性强，特异和精确：该检测技术使用自主开发的纳米磁珠法从样品中获得高纯度乙型肝炎病毒（HBV）核酸，减低提取物对PCR反应的干扰，加大检测样本量，提高检测灵敏度；采用竞争性内标和UDG酶系统完成对样品中提取的病原微生物核酸的实时PCR检测，降低了交叉污染的可能性；优化的PCR反应体系，使检测灵敏度达到20 IU/ml，达到7个数量级的动态范围。

3、竞争性内标设计：设计竞争性内标，能够高效的监控整个PCR扩增整个过程，避免出现假阴性结果。

4、技术易操作，应用范围广泛：本发明操作简便、快速、成本低廉，并且易于开发为自动化检测系统，以便对大量样品的进行高通量筛检。所检测的样品中包括人源或动物源的血液、精液、唾液。适合常规血液样品的检测，也适合自动化和高通量检测。可以判断传染病的病情、预后和传染性，预测抗病毒治疗的效果，监测和评价抗病毒药物的疗效，提高血液和血液制品的筛选质量和应用于流行病学调查领域，为临床病原体载量的监测和治疗方案以及药物的筛选提供了重要参考。

本项发明技术和试剂盒中高纯度核酸，竞争性内标，UDG酶和优化PCR反应体系的使用，可提供灵敏、特异和精确的实时PCR扩增和检测，提高了实时PCR 反应的效率、特异性和稳定性。

本试剂盒检测25份HBV的阳性样品，与目前市场主流核酸诊断试剂相比，我们的发明有更宽的线性范围，有更高的灵敏度。

附图说明：

图1是荧光实时PCR检测HBV病毒核酸的标准曲线；

图2是荧光实时PCR检测HBV病毒核酸的内标设计曲线；

具体实施方式：

该定量检测乙型肝炎病毒（HBV）核酸的方法，包括采用顺磁纳米磁珠法提取样品中病毒核酸作为标本模板，应用TaqMan荧光探针技术完成对该标本模板实时PCR检测过程，并设计竞争性内标，通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。在实时PCR反应液中，加入两种不同颜色的TaqMan探针（目的基因探针和内标探针），通过监测实时PCR反应体系中荧光信号的变化情况实现对样品中乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测，灵敏度可达20 IU/ml。通过专用软件，根据分析比较乙型肝炎病毒（HBV）目的基因序列，分别设计高保守性、特异性和高效性的TaqMan探针和引物以及竞争性内标的探针和引物；TaqMan探针和竞争性内标探针标记下列其中一种不同颜色的荧光基团：FAM、Alexa546、JOE、HEX、TET，TaqMan的PCR产物在60-120个碱基对范围。该检测方法可以检测的样品包括人源或动物源的血液、精液、唾液。

1、本发明实施例中所涉及的主要材料，仪器设备和样品来源如下：

（1）试剂： HotStarTaq酶，Proteinase K，dUTP，UDG等购自大连宝生物工程有限公司；TaqMan荧光探针，普通PCR引物等由上海生工生物工程有限公司合成。Tris，MgCl₂，BSA，盐酸胍，异硫氰酸胍，NaOH，HAC，SDS，EDTA等购自宝泰克生物科技公司；纳米磁珠购自上海奥润微纳新材料科技有限公司。

（2）主要仪器：荧光定量PCR仪(BIO-RAD)；超纯水系统(MILLIPORE)；生物超净台（江苏医疗设备厂）；单道移液器(EPPENDOF)；恒温水浴（江苏太仓），恒温振荡器（江苏太仓）等。样品：含有乙肝病毒，以及正常血液样品各5份。

（3）TaqMan荧光探针和引物设计：通过专用软件，根据GENBANK的乙肝病毒的核酸信息，分析比较乙肝病毒不同亚型的目的基因序列，设计高保守性、特异性和高效性的TaqMan探针和引物以及竞争性内标的探针，目的基因探针和内标探针分别标记下列其中一种不同颜色的荧光基团：FAM、Alexa546、JOE、HEX、TET，TaqMan的PCR产物在60-120个碱基对范围。

探针和引物由上海生工生物工程有限公司合成并进行荧光标记。本发明所列举的TaqMan荧光探针及引物的序列如下：

HBV-Probe：FAM-5’TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG’3-BHQ-1

HBV primer-1：5’ ACACCTCCTTTCCATGGCTGC’3；

HBV primer-2：5’ agcgccgacgggacgtagac’3；

内标-Probe：HEX-5’CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC’3-BHQ-1。

2、HBV国家病毒标准品的检测：

所述实时荧光定量PCR反应体系为50 μl，成分见表1，PCR反应程序见表2。

以中国食品药品检定研究院提供的乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量标准品标定的4种浓度的HBV阳性病毒血清为待测样本，浓度分别为1×10⁸IU/ml，1×10⁷IU/ml，1×10⁶IU/ml，和1×10⁵IU/ml，采用本发明方法进行检测，每一个浓度重复实验3次，结果如图1所示。CT值的变异系数分别为：0.52%，0.23%，0.35%和0.39%。变异系数非常小，这表明我们的试剂检测血清样本的重复性很好。

表1  PCR反应液组分

表2  PCR反应程序

灵敏度检测：以中国食品药品检定研究院提供的乙型肝炎病毒核酸定量标准品标定的HBV阳性血清为初始样本，稀释到50 IU/ml，30 IU/ml，20 IU/ml，每一个浓度的样本重复5次。50 IU/ml，30 IU/ml的样本均100%的扩增，20 IU/ml的样本有一个没有扩增出曲线，因此我们的试剂的灵敏度可达到20 IU/ml。

3、本试剂用于HBV阳性样本的检测

（1）待测核酸样本为已知浓度的HBV DNA阳性的血清（10⁴ IU/ml, 5×10³ IU/ml，1000 IU/ml，500 IU/ml，100 IU/ml），病毒核酸提取过程如下：

首先，取冻存的样品200μl溶化，加入1/2样品体积的裂解液，重悬样品沉淀，65℃水浴10min，然后，加入等样品体积的结合液混匀，加入25μl磁珠，置于磁力架上吸附磁珠，吸掉上清；接下来，加入3倍样品体积的洗液（洗液/样品，体积比）于离心管中，置于磁力架上吸附磁珠，吸掉废液；在离心管中加入洗脱液，65℃水浴2min，吸附磁珠，吸取上清，即为目的总核酸，置于4℃或-20℃保存。

（2）PCR 反应液配制和上机检测：

按照表1混合好PCR反应液后，以每管30μl分装于0.2 ml的PCR反应管中。分装好的反应管分别加入20μl已提取好的样本，于Bio-Rad IQ5进行荧光定量PCR扩增，PCR反应程序同表2。

（3）采用国内主流厂家试剂盒进行比较分析：

该试剂盒的方法为煮沸法提取HBV DNA。具体过程为：用带滤芯吸嘴取100μl待测样本[阳性对照，阴性对照，已知浓度的HBV DNA阳性的血清（1000 IU/ml，500 IU/ml）]加入到离心管中，然后加入100μl样品处理液A，振荡混匀。12000rpm转速离心10分钟，然后弃掉上清液，在沉淀中加入25μl样品处理液B，用移液器吸打8-10次。将离心管放入100℃沸水中煮10分钟，然后取出离心管进行12000 rpm转速离心10分钟，最后取2μl上清液进行PCR扩增。

（4）结果分析：

本实验选择中低浓度的5份HBV DNA阳性血清进行检测，在本发明的试剂测试中，荧光信号较高的一组为内标扩增曲线，荧光值较低的曲线为待测样本扩增曲线，内标在这几个浓度的检测中都有信号检出，并且内标没有对低浓度的样本检测带来影响。对于500 IU/ml以上病毒载量的样本，本发明的试剂和国内主流厂家试剂的结果符合度很好。但是，对于100 IU/ml病毒载量的样本，本发明的试剂能够检出，而对照试剂完全没有检测出。这表明本发明的试剂灵敏度要高于对照试剂。

荧光实时PCR检测HBV病毒核酸的标准曲线及内标设计曲线如图1、2所示；

表 3  5份HBV阳性血清检测结果

。

序列表：

SEQ.ID.NO.1： FAM-5’TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG’3-BHQ-1 HBV-Probe

SEQ.ID.NO.2： 5’ ACACCTCCTTTCCATGGCTGC’3； HBV primer-1

SEQ.ID.NO.3： 5’ agcgccgacgggacgtagac’3； HBV primer-2

SEQ.ID.NO.4： HEX-5’CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC’3-BHQ-1  内标-Probe。

SEQ.ID.NO.1： FAM-5’TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG’3-BHQ-1 HBV-Probe

SEQ.ID.NO.2： 5’ ACACCTCCTTTCCATGGCTGC’3； HBV primer-1

SEQ.ID.NO.3： 5’ agcgccgacgggacgtagac’3； HBV primer-2

SEQ.ID.NO.4： HEX-5’CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC’3-BHQ-1  内标-Probe

Claims (7)

1.一种定量检测乙型肝炎病毒（HBV）的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

采用纳米磁珠法提取样品中乙肝病毒核酸作为模板，应用TaqMan 荧光探针技术完成对该标本模板实时PCR检测过程，并设计竞争性内标，通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性；其中：通过专用软件，根据分析比较乙型肝炎病毒目的基因序列，设计高保守性、特异性和高效性的TaqMan荧光探针和引物以及竞争性内标的探针和引物，所述TaqMan荧光探针和竞争性内标分别标记下列其中一种不同颜色的荧光基团：FAM、Alexa546、JOE、HEX、TET；所述实时PCR产物在60-120个碱基对范围；在实时PCR反应液中，加入一种前述TaqMan荧光探针和引物，通过监测实时PCR反应体系中荧光信号的变化情况实现对样品中乙型肝炎病毒（HBV）的定量检测。

2.根据权利要求1所述一种定量检测乙型肝炎病毒（HBV）的方法，其特征在于：所述纳米磁珠法提取样品中乙型肝炎病毒（HBV）核酸的步骤为：首先，取冻存的样品溶化，加入裂解液重悬样品沉淀，65℃ 水浴10min，裂解液与样品的体积比为1：2；然后，加入与样品等体积的结合液混匀，加入25μl磁珠，置于磁力架上吸附磁珠，吸掉上清；加入3倍样品体积的洗液于离心管中，置于磁力架上吸附磁珠，吸掉废液；在离心管中加入洗脱液，65℃水浴2min，吸附磁珠，吸取上清，即为目的总核酸，置于4℃或-20℃保存。

3.根据权利要求1或2所述一种定量检测乙型肝炎病毒（HBV）的方法，其特征在于：

所述实时PCR反应体系为：包括5mM 的MgCl₂，0.6mg/ml的BSA，pH8.3的20mM Tris-HCl，75 mM 的KCl，2.5 mM 的dNTP，HotStar Taq酶，PCR增强剂，保护剂, 10-50 nM HBV荧光探针, 10-50 nM内标荧光探针, 10-50 nM HBV上下游引物。

4.根据权利要求3所述一种定量检测乙型肝炎病毒（HBV）的方法，其特征在于：所述样品包括人源或动物源的血液、精液、唾液。

5.一种如权利要求1所述定量检测乙型肝炎病毒（HBV）方法的试剂盒，包括核酸提取试剂、核酸扩增试剂、对照品、标准品、内标，其特征在于：所述核酸提取试剂中包括蛋白酶K、纳米磁珠、裂解液、结合液、洗液A、洗液B、洗脱液；其中裂解液组成为：其中裂解液组成为：pH8.0的50 mM Tris-HCl、pH8.0的10 mM EDTA、1%SDS、4 M异硫氰酸胍；结合液组成为：5M异硫氰酸胍、pH6.6的20 mM Tris-HCl、37.5%乙醇；洗液A、B组成为：20 mM NaCl、pH7.5的2 mM Tris-HCl、70%乙醇；洗脱液组成为：pH8.0的10 mM Tris-HCl、pH8.0的1 mM EDTA；所述核酸扩增试剂由HBV PCR 反应液、酶混合液-Taq酶& UDG酶、探针1、探针2组成，所述HBV PCR 反应液中包含针对乙型肝炎病毒（HBV）核酸而设计的引物；所述对照品中的阳性对照为非感染性乙型肝炎病毒DNA，阴性对照为无菌双蒸水，强阳性对照为非感染性病毒DNA；所述标准品为含有乙型肝炎病毒（HBV）DNA序列质粒的梯度稀释物；所述内标为竞争性内标，内标探针与HBV目标基因探针采用不同的荧光报告基团标记，通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。

6.根据权利要求5所述的定量检测乙型肝炎病毒（HBV）方法的试剂盒，其特征在于：所述核酸扩增试剂中针对乙肝病毒HBV和竞争性内标设计的TaqMan荧光探针和引物的序列如下：    

HBV 探针：FAM-5’TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCG’3-BHQ-1

上游引物：5’ ACACCTCCTTTCCATGGCTGC’3；

下游引物：5’ agcgccgacgggacgtagac’3；

内标探针：HEX-5’CGAGCATCCTGCAGCTGCTCGCCTC’3-BHQ-1。

7.根据权利要求5所述定量检测乙型肝炎病毒（HBV）方法的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为检测乙型肝炎病毒（HBV）核酸的单一试剂盒。

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