CN101434993B - 角膜常见致病真菌菌种检测的液相芯片系统及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种角膜常见致病真菌菌种检测的液相芯片系统及其检测方法。该液相芯片系统由3、5、7、20、35、47、79号的羧基化微球、待测的角膜常见致病真菌的种特异性探针和2条质控探针组成。该系统的微球偶联体特异性的识别相应真菌菌种基因组DNA通用引物的PCR产物，然后再与链霉亲和素-藻红蛋白报告分子结合并通过液相芯片检测仪，经由红绿双色激光的同时检测确定待测真菌菌种的种类和数量。本发明能够同时检测5种真菌菌种，且有快速、所需样本量少、高特异性、高灵敏度、高重复性的优点，因而对角膜常见致病真菌菌种的快速鉴定和早期诊断方面具有重要的应用价值，有望为真菌性角膜炎乃至全身性真菌感染的早期快速诊断和针对性治疗做出贡献。

Description

角膜常见致病真菌菌种检测的液相芯片系统及其检测方法

技术领域

本发明属于分子生物检测真菌领域，具体涉及一种角膜常见致病真菌菌种检测的液相芯片系统及其检测方法。

背景技术

真菌性角膜炎是一种世界范围内常见的致盲性眼病，多见于以农业人口为主的发展中国家，如中国、印度、加纳等。其发病者多为青壮年人群，给社会和家庭造成了沉重的经济、精神负担。近年来随着广谱抗生素、皮质激素、免疫抑制剂和抗肿瘤药物的广泛应用，致病性真菌感染的机率大大增加，相关统计数据显示真菌性角膜炎在我国感染性角膜病中所占比例高达34.8％～61.9％(Lixin Xie，et al.Ophthalmology，2006，113:1943-1948.翟华蕾等.中华医学杂志，2007，87(33):2372-2374.)。所以，真菌性角膜炎的早期诊断对防盲、治盲意义重大，只有早期及时确诊，才能避免不合理用药，并根据感染的菌种不同而选择合适的手术时机及手术方式。

临床上常用的真菌诊断方法包括角膜刮片镜检、真菌培养、共焦显微镜检查、组织病理检查等，虽然种类不少，但除了真菌培养外，各种诊断方法都不能将真菌鉴定至种的水平，无助于临床上根据感染真菌种属选择相应的敏感药物，或根据不同种属在角膜中水平和垂直的不同生长方式选择合适的手术方式。而唯一能鉴定真菌种属的真菌培养方法又耗时过长(通常需5～7天)，不能用于临床早期诊断；基于聚合酶链反应(polymerasechain reaction，PCR)的一些分子生物学诊断方法因其操作复杂，假阳性率高，使其临床应用存在一定的难度；而作为固相芯片的基因芯片技术则由于重复性差，技术障碍尚难以克服。因此，早期快速诊断真菌性角膜炎并鉴定种属是非常必要的。

现代液相芯片技术(Multi-Analyte Suspension Array，MASA)是一种新型的基因芯片技术。该技术的核心是把荧光编码的乳胶微球分别与特异性的检测探针偶联，然后在悬液中加入微量标本与特异性检测微球进行结合，结合的结果经激光判读后由电脑以数据形式记录下来。该技术具有高特异性、高灵敏度、反应迅速、所需样本量少的特点。目前基于液相芯片技术的基因分型、组织分型及病毒和细菌感染性疾病等方面已经有相应的检验方法，迄今没有检测角膜致病性真菌菌种的液相核酸芯片系统及其检测方法，因此无法实现早期快速诊断真菌性角膜炎并鉴定种属。

发明内容

本发明的目的是提供一种角膜常见致病真菌菌种检测液相芯片系统，以早期快速检测角膜常见致病真菌菌种，克服已有技术的不足。

本发明的另一个目的是快速而有效的实现同时检测多种真菌菌种。

本发明所采用的技术路线是：本发明专门筛选出5种致真菌性角膜炎的80％左右的致病真菌菌种：茄病镰刀菌(Fusarium solani)、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)和黄曲霉菌(Aspergillus flavus)。运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，对在核酸序列库中能够检索到的上述主要角膜致病真菌的rRNA基因序列进行同源性分析，找出保守区和可变区(ITS区)，设计出针对上述菌种的5条种特异性探针和2条质控探针。各条探针通过与不同荧光编码的微球进行偶联制成5种特异性微球偶联体，即液相芯片。最后，偶联有不同探针的不同荧光编码的微球偶联体能够特异性的识别相应真菌菌种基因组DNA的通用引物(生物素标记)的PCR扩增产物，PCR扩增产物再与链霉亲和素-藻红蛋白报告分子结合，微球偶联体-PCR产物-报告分子混合物通过液相芯片检测仪(Luminex100)，以红色激光激发上述微球上的红色分类荧光，依据微球的色彩不同确定真菌的种属类型，以绿色激光激发藻红蛋白，测定微球上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定微球上结合的PCR产物的含量；因此，通过红绿双色激光的同时检测，可以确定真菌菌种的种类和数量。

本发明的具体技术方案如下：

本发明所涉及的角膜常见致病真菌菌种检测液相芯片系统由微球、种特异性探针和质控探针组成，其特征是，所述商品化微球是3、5、7、20、35、47、79号的羧基化微球；所设计并合成的种特异性探针及质控探针序列如下：

茄病镰刀菌检测探针           5’-GCACACGCCGTCCCTCAAATAC-3’

串珠镰刀菌检测探针           5’-TCGTTACTGGTAATCGTCGCGG-3’

尖孢镰刀菌检测探针           5’-CTCAAGCCCTCGGGTTTGGTGT-3’

烟曲霉菌检测探针             5’-CGCCAGCCGACACCCAACTTTA-3’

黄曲霉菌检测探针             5’-TGCCGAACGCAAATCAATCT-3’

阳性质控探针                 5’-GCATATCAATAAGCGGAGGA-3’

阴性质控探针                 5’-TTTCAGATGATTCTCGGTTACTTGTGTC-3’

其中，所述茄病镰刀菌检测探针与47号微球形成微球偶联体，串珠镰刀菌检测探针与7号微球形成微球偶联体，尖孢镰刀菌检测探针与20号微球形成微球偶联体，烟曲霉菌检测探针与3号微球形成微球偶联体，黄曲霉菌检测探针与79号微球形成微球偶联体，阳性质控探针与35号微球形成微球偶联体，阴性质控探针与5号微球形成微球偶联体。

上述微球偶联体的制备方法是：分别选取3、5、7、20、35、47、79号的羧基化微球，洗涤；活化羧基化微球，并对应3、5、7、20、35、47、79号的羧基化微球顺序分别加入5’端12C氨基修饰的烟曲霉菌检测探针、阴性质控探针、串珠镰刀菌检测探针、尖孢镰刀菌检测探针、阳性质控探针、茄病镰刀菌检测探针和黄曲霉菌检测探针，形成各检测探针和相应荧光编码微球的混合物并混匀；在室温避光孵育30分钟；再以0.02％TWEEN20和0.1％SDS溶液洗涤，并溶于pH8.0的TE缓冲液，即获得各检测探针与相应荧光编码微球的微球偶联体，并分别于4℃条件下避光保存；使用时，依据需要检测的菌种选择相应的微球偶联体混合，即构成相应的液相芯片系统。

采用液相芯片系统对角膜常见致病真菌标准菌株或临床分离菌株进行检测的方法：首先提取待测的真菌菌株基因组DNA，并以5’生物素标记的真菌通用引物进行PCR扩增形成生物素化PCR产物；再将羧基化微球与检测探针的微球偶联体和生物素化PCR产物混合，在95℃变性后于杂交温度50℃孵育1小时，使探针与相应生物素化的PCR产物特异性杂交；杂交后加入浓度为2-4μg/mL的75μL链霉亲和素-藻红蛋白，混匀，于杂交温度50℃孵育；将上述孵育后的混合物上样到Luminex100检测仪，通过红绿双通道激光系统即可确定真菌菌种的种类和数量。

本发明对于角膜常见致病真菌的菌种的检测具有快速、所需样本量少、高特异性、高灵敏度、高重复性的特点。单次检测阳性率达到95.2％；最低检测浓度低至0.94ng PCR产物；四次重复检测的变异系数在1.8％～13.7％之间，符合临床检测试剂的重复性标准。另外，本发明的方法具有较好的灵活性，可以在同一反应体系中对1-5种真菌菌种进行检测而应用于混合真菌感染的诊断。因此，该方法对角膜常见致病真菌菌种的快速鉴定和早期诊断具有重要的应用价值，有望为真菌性角膜炎乃至全身性真菌感染的早期快速诊断和菌种针对性治疗做出贡献。

附图说明

图1、本发明的5种菌种平行检测与单一菌种检测的荧光强度比较示意图。所建立的液相芯片检测系统可以准确的将5种目的真菌标准菌株鉴定至种的水平，无论是只检测单一菌种还是在同一个反应体系中平行检测5种目的菌种，都可获得稳定的阳性MFI。

图2本发明的不同浓度PCR产物的液相芯片检测结果。结果可见，188ng～0.94ngPCR产物均可检测出阳性结果，MFI随待测PCR产物浓度的降低而降低，两者呈正相关(rs＝0.74，P<0.05)。

图3本发明的不同浓度PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图中：1：DNAmarker，2：188ng，3：94ng，4：37.5ng，5：18.8ng，6：9.4ng，7：1.88ng，8：0.94ng，9：0.188ng。结果可见，188ng～37.5ng PCR产物可见片段大小为550bp左右的电泳条带，清晰度依次降低，18.8ng以下未见可辨认的电泳条带。

具体实施方式

实施例1：本发明的真菌种特异性探针与质控探针的设计合成

将上述5种角膜常见致病真菌的标准菌株和临床分离菌株复苏培养后，以离心柱法提取基因组DNA，再利用真菌通用引物对基因组DNA进行PCR扩增。PCR的反应体系为50μL，其中包括2×Taq PCR，MasterMix25μL，一对浓度为10μM的真菌通用引物各2μL，模板DNA5ng，加灭菌去离子水补至50μL。扩增条件：94℃5min；94℃30s，53℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。所用扩增引物采用Leinberger DM和HsiaoCR报道的真菌通用引物(P1-5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，P2-5’-TCCTCCGCTTATTGATATG-3’)，反向引物P2的5’端以生物素标记。扩增后以离心柱式PCR产物纯化试剂盒对5种标准菌株的PCR产物进行纯化并送交测序。

从NCBI的GenBank数据库中获取5种角膜常见致病真菌的全基因组序列，将所查序列与上述PCR产物测序所得序列进行生物信息学比对，分析并找出保守区和可变区；利用分子生物学软件Oligo6.65，根据可变区(ITS区)序列设计种特异性探针，根据保守区序列设计阳性质控探针，阴性质控探针为与真菌序列无同源性的无关序列；通过BLAST比对对所设计的探针进行筛选。所设计探针在合成过程中5’端以氨基C12修饰，这样就形成了种特异性探针、阳性质控探针和阴性质控探针，以备微球偶联体的制备。

实施例2：本发明的微球偶联体的详细制备方法

1)把-20℃保存的新鲜干燥的EDC粉末置于室温。

2)用双蒸水溶解氨基修饰的寡核苷酸探针至浓度为0.1mM。

3)用漩涡振荡器重悬微球约20s，取1×10⁶个(80μL)微球至微量离心管中，≥8000×g离心2min以沉淀微球。

4)小心吸弃上清，向上述沉淀中加入50μL0.1M的MES(PH4.5)，漩涡震荡约20s重悬微球，形成微球混悬液。

5)取1μL溶解好的0.1mM探针加入上述微球混悬液中，震荡混匀。

6)准备新鲜的10mg/mL的EDC水溶液，取3μL加入微球混悬液中，震荡混匀，室温避光孵育30min。

7)再次准备新鲜的10mg/mL的EDC水溶液，取3μL加入微球混悬液中，震荡混匀，室温避光孵育30min。

8)加1mL0.02％Tween20溶液到微球混悬液中，震荡混匀，≥8000×g离心2min以沉淀微球。

9)小心吸弃上清，加1mL0.1％SDS溶液震荡重悬微球，≥8000×g离心2min以沉淀微球。

10)小心吸弃上清，将沉淀溶于100μLTE PH8.0缓冲液，震荡混匀约20s。

11)用血细胞计数板计数交联好的微球：将交联好的微球用双蒸水做1：100稀释，漩涡振荡混匀，取10μL灌血细胞计数板，计数4个大方格中的微球数，微球数/μL＝4个大方格的微球数之和×2.5×100(稀释因子)。

12)2-8℃避光保存交联好的微球。使用时，依据需要检测菌种选择混合。

实施例3本发明的检测方法和结果

先将角膜常见致病真菌的标准菌株或临床分离菌株复苏培养，提取基因组DNA，以生物素标记的真菌通用引物进行PCR扩增，PCR产物用于同偶联有特异性探针的微球偶连体进行杂交，具体检测步骤如下：

1)将交联有各种检测探针的相应荧光编码微球分别以漩涡振荡器或超声混匀约20s，取所需荧光编码的微球等比混合，混匀。

2)用1.5×TMAC溶液将微球稀释至150微球/μL的微球工作液(每个反应需33μL微球工作液)，漩涡震荡混匀约20s。

3)每个反应孔加33μL微球工作液。

4)每个样本孔加入扩增好的生物素化的PCR产物和TE(Tris-EDTA，PH8.0)缓冲液至总体积17μL；每个背景孔加入与待测PCR产物同体积的空白对照液(以双蒸水代替DNA模板)和TE，PH8.0缓冲液至总体积17μL。用移液器轻轻吹打混匀。

5)封闭反应板以防止蒸发，并在95℃孵育5min，使PCR产物的双链DNA变性。

6)于杂交温度(50℃)孵育反应板1小时后将板在5000×g离心3min。离心期间准备新鲜的下述报告分子混合液：将链霉亲和素-藻红蛋白以1×TMAC溶液稀释至2-4μg/mL(每个反应孔需75μL)。

7)离心后，小心吸弃上清，将杂交板重置于杂交温度，每个反应孔加入上述75μL报告分子混合液，轻轻吹打混匀，并于杂交温度(50℃)孵育反应板5分钟形成杂交液。

8)取50μL杂交液在杂交温度下按照系统操作手册用Luminex100分析仪通过红绿双通道激光系统即可检测确定真菌菌种的种类和数量。

真菌标准菌株或临床分离菌株的检测结果如下：

特异性检测结果：本发明可以准确鉴定出5种角膜常见致病真菌的菌种，未发生非特异性杂交，检测阳性率达到95.2％，如图1。

灵敏度检测结果：本发明对真菌PCR产物的检测低限为0.94ng，中位荧光强度值随待测PCR产物浓度的降低而降低，两者呈正相关(r_s＝0.74，P<0.05)，如图2。

重复性检测结果：本发明有良好的重复性，4次重复检测的变异系数(CV)在1.8％～13.7％之间，符合国家对临床检测试剂的重复性要求。

多菌种混合检测结果：本发明可以在同一反应体系中准确的将5种角膜常见致病真菌鉴定至种的水平，其荧光强度值与各菌种单独检测的荧光强度值无统计学差异(t＝0.82，P>0.05)。

因此，本发明可以在同一反应体系内快速将1至5种角膜常见致病真菌鉴定至种的水平，而且具有敏感、快速、特异性高、重复性好、所需样本量少的特点。

<110>山东省眼科研究所

<120>角膜常见致病真菌菌种检测的液相芯片系统及其检测方法

<160>7

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>茄病镰刀菌(Fusarium solani)

<400>1

gcacacgccgtccctcaaatac

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)

<400>2

tcgttactggtaatcgtcgcgc

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)

<400>3

ctcaagccctcgggtttggtgt

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)

<400>4

cgccagccgacacccaacttta

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>黄曲霉菌(Aspergillus flavus)

<400>5

tgccgaacgcaaatcaatct

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>阳性质控探针，用于鉴定芯片系统的稳定性

<400>6

gcatatcaataagcggagga

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>阴性质控探针，用于排除背景和污染

<400>7

tttcagatgattctcggttacttgtgtc

Claims (3)

1.一种角膜常见致病真菌菌种检测的液相芯片，该液相芯片由微球、种特异性探针和质控探针组成，其特征是，所述的微球是3、5、7、20、35、47、79号的羧基化微球；其种特异性探针及质控探针序列如下：

茄病镰刀菌检测探针    5’-GCACACGCCGTCCCTCAAATAC-3’

串珠镰刀菌检测探针    5’-TCGTTACTGGTAATCGTCGCGG-3’

尖孢镰刀菌检测探针    5’-CTCAAGCCCTCGGGTTTGGTGT-3’

烟曲霉菌检测探针      5’-CGCCAGCCGACACCCAACTTTA-3’

黄曲霉菌检测探针      5’-TGCCGAACGCAAATCAATCT-3’

阳性质控探针          5’-GCATATCAATAAGCGGAGGA-3’

阴性质控探针          5’-TTTCAGATGATTCTCGGTTACTTGTGTC-3’

其中，所述茄病镰刀菌检测探针与47号微球形成偶联体，串珠镰刀菌检测探针与7号微球形成偶联体，尖孢镰刀菌检测探针与20号微球形成偶联体，烟曲霉菌检测探针与3号微球形成偶联体，黄曲霉菌检测探针与79号微球形成偶联体，阳性质控探针与35号微球形成偶联体，阴性质控探针与5号微球形成偶联体。

2.如权利要求1所述的液相芯片，其特征在于上述微球偶联体的制备方法是：分别选取3、5、7、20、35、47、79号的羧基化微球，洗涤，活化羧基化微球，并对应3、5、7、20、35、47、79号的羧基化微球顺序分别加入5’端12C氨基修饰的烟曲霉菌检测探针、阴性质控探针、串珠镰刀菌检测探针、尖孢镰刀菌检测探针、阳性质控探针、茄病镰刀菌检测探针和黄曲霉菌检测探针，形成各检测探针和相应微球的混合物并混匀；室温避光孵育30分钟；再以0.02％TWEEN20和0.1％SDS溶液洗涤，最后溶于pH8.0的TE缓冲液，即获得各检测探针与相应微球的偶联体，并分别于2-8℃条件下避光保存。

3.利用权利要求1所述的液相芯片进行检测的方法：其特征在于首先提取待测的真菌菌株基因组DNA，并以5’生物素标记的真菌的通用引物进行扩增；再将检测探针与羧基化微球的偶联体和生物素化的PCR产物混合，在95℃变性后于杂交温度50℃孵育1小时，使探针与相应的生物素化的PCR产物特异性杂交；杂交后加入浓度为2-4μg/mL的75μL链霉亲和素-藻红蛋白，混匀，再于杂交温度50℃孵育；将上述孵育后的混合物上样到Luminex100检测仪通过红绿双通道激光系统即可检测确定真菌菌种的种类和数量。 

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