CN101560558B - 多重pcr产物的悬浮芯片的非诊断性检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种PCR产物的悬浮芯片的非诊断性检测方法，芯片主要由编码微球、生物素化的引物、捕获探针、链霉亲和素-藻红蛋白组成，所述方法包括：所述捕获探针分别与相应的各号微球偶联，以红色激光激发其球形基质上的分类荧光，依据其球形基质色彩不同确定类型；其中所述的生物素化引物表示进行PCR时的引物需生物素化标记；偶联上探针的微球可以特异性地和扩增的生物素标记的PCR产物结合；所述的链霉亲和素-藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，以绿色激光激发藻红蛋白，测定球形基质上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定球形基质上结合的PCR产物的含量。

Description

多重PCR产物的悬浮芯片的非诊断性检测方法

技术领域

本发明提供一种对多重PCR产物的悬浮芯片的非诊断性检测方法，本发明还涉及对悬浮芯片检测方法中条件的改进。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)简称PCR，是一种模拟天然DNA复制的体外扩增法。PCR技术的问世给分子诊断带来一场革命。PCR技术已经成为分子诊断的基础。目前PCR产物的检测方法为琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶仅约可区分相差100bp的DNA片段。片段长度相差不大或者相等的PCR产物，琼脂糖凝胶电泳将无能无力。另外，琼脂糖凝胶电泳通过紫外光激发荧光染料产生荧光来判断是否存在PCR产物，检测灵敏度相对较低。且琼脂糖凝胶电泳通过片段的大小对产物进行判断，特异性差，对非特异扩增的大小相似的片段不能区分。而且常用的染料如溴化乙锭等具有致癌性，常操作对身体健康不利。

悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片(liquid array，liquidchip)，是一种非常灵活的多功能技术平台，可以进行蛋白、核酸等生物大分子检测、受体和配体识别分析等研究。悬浮芯片主要通过可偶联探针的荧光编码微球与两束激光检测，对被测物的定性和定量分析，一个反应孔内可以完成100种不同的生物学反应。可实现对核酸的多重检测。

发明内容

本发明提供一种多重PCR产物的悬浮芯片的非诊断性检测方法，该方法利用悬浮芯片技术结合核酸探针技术对标记上生物素的PCR产物进行特异性的识别，检测灵敏度高，特异性好，尤其适用于多重PCR产物相似长度片段的区分，且理论上可对100种不同的PCR产物进行区分，实现100种不同因子的检测。

本发明提供的技术方案是一种多重PCR产物的悬浮芯片的非诊断性检测方法，该方法包括：首先PCR扩增引物标记生物素，再根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性捕获探针，并提交GENEBANK检测探针的特异性；所述捕获探针分别与相应的编码微球偶联；该捕获探针在一定的条件下特异的捕获生物素化的PCR产物；然后加入链霉亲和素-藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，利用悬浮芯片LUMINAX系统进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光和微球表面经特异性反应结合上的藻红蛋白，对待检测物进行定性和定量分析。

本发明还提供一种多重PCR产物的悬浮芯片的非诊断性检测方法，包括以下步骤：1、PCR引物标记生物素，2、根据待检测的PCR产物，选择设计位于扩增区域内的特异的捕获探针；3、相应的探针偶联微球；4.捕获探针捕获待检测的PCR产物并检测。

在本发明的方法中，首先据待检测的PCR产物，设计位于扩增区域内的特异的捕获探针，每条探针长20-30bp，在合成时连接C12或15-20个poly(T)作为加臂，氨基化修饰，以便与微球偶联。

在将相应的探针与微球偶联时，例如，包括以下步骤：

a)分别选取不同编号的编码微球，用漩涡振荡器振荡微球悬液，使微球混合均匀，转移至离心管，14000a离心，小心吸出上清；

b)加入2-(n-吗啉代)乙磺酸溶液，振荡超声，使微球重悬；

c)用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针稀释；将稀释的探针加于微球悬浮液中，振荡混匀；

d)加入新鲜配制的EDC溶液至微球与探针的混和液中，振荡混匀；

避光，漩涡振荡器上振荡，室温孵育30分钟；再次加入新鲜配制的EDC；再次在漩涡振荡器上振荡，室温避光孵育；

e)用0.02％PBST 1ml洗涤，14000g下离心；移弃上清，微球重悬于0.1％SDS中，洗涤，离心；

f)移弃上清，微球重悬于100ul pH8.0TE中，振荡悬起混匀，即得到偶联好的检测微球。

本发明优选的方法包括以下步骤：

g)分别选取不同编号的编码微球，用漩涡振荡器振荡微球悬液，使微球混合均匀。

h)分别取上述微球大约1.25x10⁶个，分别转移至离心管，14000g离心3-5min，小心吸出上清。

i)加入50ul 0.1mol/L的2-(n-吗啉代)乙磺酸溶液，振荡20-30S，超声20-30s，使微球重悬。

j)用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针稀释到0.1mmol/L。

k)将1ul稀释的探针加于微球悬浮液中，振荡混匀。

l)加入2.5ul新鲜配制的10mg/mL的EDC溶液至微球与探针混和液中，振荡混匀。

m)用铝箔包裹离心管避光，漩涡振荡器上400-600rpm振荡，室温孵育30分钟。

n)再次加入新鲜配制的10mg/mL EDC。

o)再次在漩涡振荡器上400-600rpm振荡，室温避光孵育30分钟。

p)用0.02％PBST 1ml洗涤1次，离心14000g 3-5min.

q)移弃上清，微球重悬于1ml 0.1％SDS中，洗涤，离心。

r)移弃上清，微球重悬于100ul pH8.0TE中，振荡悬起混匀，即得到偶联好的检测微球。

在本发明的用上述捕获探针捕获待检测的PCR产物的过程中，例如，包括：

1.取已经偶联好的检测探针每种各3500个于杂交液中，使其总量为33μl，根据微球计数结果计算相应加入量；

2.向各管中加5～17ul五种细菌混合模板的PCR产物使其终体积为50ul，吹打混匀。

3.95℃变性10分钟。

4.杂交温度下杂交一定时间。

5.转移至滤板抽滤去掉未结合的PCR产物。

6.再向各孔加75ul 4ng/ul SA-PE的1×TMAC液，室温避光孵育10min，抽滤去掉未结合的SA-PE。

7.再向各孔加入75ul 1×TMAC溶液，振荡使微球重悬。

8.反应结束后上机检测。Bio-PlexTM system进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光，对微球的编号进行识别；通过激发微球表面的藻红蛋白，对结合的PCR产物进行定量分析。

本发明与传统的PCR检测方法相比，优点在于：

1.通过仪器的信号放大系统和生物素亲和素的放大作用，本发明对PCR产物的检测灵敏度高于琼脂糖凝胶电泳。

2.通过特异性探针捕获PCR产物，检测特异性远好于用片段长度对PCR产物进行判断。

3.对片段长度大小相似或者一样的片段，同样可以进行区分识别，从而使多重PCR引物的设计趋于灵活。

附图说明

图1为DNA浓度——编码微球表面的荧光强度剂量反应曲线。编码微球表面荧光强度与加入的模板量在一定的范围内成正相关，其中横坐标为多重PCR时管中加入的模板DNA的量，纵坐标代表相应编码微球表面的荧光强度。可以通过拟合的标准曲线实现对核酸的半定量分析。

图2表示用本发明建立的方法对7株炭疽芽孢杆菌，4株鼠疫菌，3株布鲁菌，2株土拉弗朗西斯菌，2株类鼻疽伯克霍尔德菌进行检测的结果。其中，X轴表示检测样品，Y轴表示检测微球，Z轴表示检测荧光信号(MFI)与背景荧光信号(BFI)之比亦即信噪比。

17003～15，17003-11，17003-28，17003-32，17003-54，17003-10：五株炭疽芽孢杆菌强毒株；

Sterne：炭疽芽孢杆菌sterne株；yp12，yp16，yp17：三株鼠疫耶尔森菌自然分离株；Ev76：鼠疫耶尔森Ev76株；S2：布鲁氏菌疫苗株S2；S19：布鲁氏菌疫苗株S19；M5：布鲁氏菌疫苗株M5；FT-2，FT-5：两株土拉弗朗西丝菌；BP-2，BP-5：两株类鼻疽伯克霍尔德菌。

具体实施方式

实施例1：PCR产物的悬浮芯片的非诊断性检测方法用于五种生物恐怖因子炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌、类鼻疽伯克霍尔德菌的六重PCR产物的检测

1.确定上述五种细菌的诊断片段，炭疽的选择capB和染色体上的一段标识序列，鼠疫选择染色体上的一段标识序列，布鲁菌选择布鲁氏属特异性的片段BCSP31，通过NCBI的GeneBank获取候选基因序列，利用软件设计引物，并合成相关序列，下游引物5’端生物素标记，见表1，并将这些引物稀释成10μmol/L。

表1引物序列

2.使用以上引物的多重PCR反应扩增以上五种待检测细菌。

3.根据扩增区域内的核苷酸序列，设计的五种细菌特异性探针如下，探针序列如表2：

表2病原菌多重检测体系探针序列

上述探针连接C12，或15个T，或20个T，或18个T，效果一致。

上述五钟病原体的悬浮芯片检测结果见表3.其中：Type为样本类型，B代表阴性对照，C代表已知样本，X代表未知样本；BA-1为炭疽芽孢杆菌探针1，BA-2为炭疽芽孢杆菌探针2，BSA为阴性对照，Yp-2为鼠疫耶尔森菌探针，Bru-2为布鲁氏菌探针，Ft-2为土拉弗朗西斯菌探针，Bp-2为类鼻疽伯克霍尔德菌探针，Biotin(045)为生物素阳性对照；C1、C2、C4为炭疽芽孢杆菌样本，C6、C7、C8为鼠疫耶尔森菌样本，C9、C10为布鲁氏菌样本，C11为阴性样本；检测荧光值大于等于三倍本底荧光值判为阳性，因此已知样本全部正确识别，未知样本X1、X2均为炭疽芽孢杆菌强阳性，类鼻疽伯克霍尔德弱阳性。

表3检查五种病原体的悬浮芯片检测结果

实施例2：相应探针与微球的偶联

1)分别选取不同编号的编码微球，用漩涡振荡器振荡微球悬液，使微球混合均匀。

2)分别取上述微球大约1.25x10⁶个，分别转移至离心管，14000g离心3-5Min，小心吸出上清。

3)加入50ul 0.1mol/L的2-(n-吗啉代)乙磺酸溶液，振荡20-30S，超声20-30s，使微球重悬。

4)用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针稀释到0.1mmol/L。

5)将1ul稀释的探针加于微球悬浮液中，振荡混匀。

6)加入2.5ul新鲜配制的10mg/mL的EDC溶液至微球与探针混和液中，振荡混匀。

7)用铝箔包裹离心管避光，漩涡振荡器上400-600rpm振荡，室温孵育30分钟。

8)再次加入新鲜配制的10mg/mL EDC。

9)再次在漩涡振荡器上400-600rpm振荡，室温避光孵育30分钟。

10)用0.02％PBST 1ml洗涤1次，离心14000g 3-5min.

11)移弃上清，微球重悬于1ml 0.1％SDS中，洗涤，离心。

12)移弃上清，微球重悬于100ul pH8.0TE中，振荡悬起混匀，即得

到偶联好的检测微球。

实施例3：捕获探针对待检测的PCR产物的捕获和检测

i.取已经偶联好的检测探针每种各3500个于杂交液中，使其总量为33μl(根据微球计数结果计算相应加入量)

ii.向各管中加5～17ul五种细菌混合模板的PCR产物使其终体积为50ul，吹打混匀。

iii.95℃变性10分钟。

iv.杂交温度下杂交一定时间。

v.转移至滤板抽滤去掉未结合的PCR产物。

vi.再向各孔加75ul 4ng/ul SA-PE的1×TMAC液，室温避光孵育10min，抽滤去掉未结合的SA-PE。

vii.再向各孔加入75ul 1×TMAC溶液，振荡使微球重悬。

viii.反应结束后上机检测。Bio-PlexTM system进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光，对微球的编号进行识别；通过激发微球表面的藻红蛋白，对结合的PCR产物进行定量分析。

实施例4：定量检测

待检目标核酸系列稀释，一般设6个以上稀释度，同上面的PCR程序和反应条件进行PCR反应，同上面的反应进行PCR产物的检测，根据检测结果，运用Bio-Plex Version 4.0分析系统提供的方程拟合标准曲线，根据标准曲线，代入各个待测样品的MFI值，即可实现待检样品核酸的定量分析。

如鼠疫耶尔森菌EV76株基因组DNA10倍系列稀释，2.8fg～280ng，按确定的方法进行PCR扩增和检测，拟合曲线，曲线动态范围28fg～280pg，曲线方程：FI＝-25.2499+(663.894+25.2499)/((1+(Conc/20599.2)^-4.5687))^0.0999957，从标准曲线推算检出限为50fg/test，鼠疫基因组大小4826100bp，则相当于9cfu/test。当PCR模板浓度在280pg以上时，杂交达到饱和。

实施例5：定量检测

用建立的方法对7株炭疽芽孢杆菌，4株鼠疫菌，3株布鲁菌，2株土拉弗朗西斯菌，2株类鼻疽伯克霍尔德菌进行检测，结果如图2。

结果分析：

检测时，同时以PCR阴性对照进行杂交检测做为检测本底。对于每个检测体系和检测本底，仪器输出的数据是相应反应体系内一种编号微球群的荧光强度中位值(Median Fluorescence Intensity，MFI)，亦即读取的这种编号的微球群(100个或以上)的每个微球信号强度的统计平均值。通过Bio-Plex悬浮芯片系统读取各孔荧光值(MFI)以及本底荧光值(Background MFI，BFI)。

结果判断：

当待检测样本的MFI值为本次检测背景信号强度三倍以上时即判为阳性。

Claims (1)

1.一种多重PCR产物的悬浮芯片的非诊断性检测方法，其中该方法包括首先将PCR引物标记生物素，根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性捕获探针，并提交GENBANK检测探针的特异性；所述捕获探针在合成时连接C12或15-20个T作为加臂，再分别与相应的编码微球偶联；该捕获探针在一定的条件下特异的捕获生物素化的PCR产物，该一定的条件为：95℃变性5～10分钟，45～60℃杂交10～30分钟；然后加入链霉亲和素-藻红蛋白与微球上捕获的PCR产物上的生物素结合，利用LUMINAX系统进行检测，通过激发微球基质上的红色分类荧光和微球表面的藻红蛋白对待检测物进行定性和定量分析；其中，引物序列为：

探针序列为：

Images