CN103852582B - 纳米荧光微粒用作多重pcr产物的液相蛋白芯片的用途 - Google Patents

纳米荧光微粒用作多重pcr产物的液相蛋白芯片的用途 Download PDF

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Abstract

本发明揭示了一种纳米荧光微粒用作多重PCR产物的液相蛋白芯片的用途，将纳米荧光微粒和靶向探针偶联用于蛋白液相芯片检测，所用纳米荧光微粒具有核壳结构，粒径为300～600nm，其内核为包含有不同梯度的荧光分子的聚合物微粒，外壳具有修饰在所述聚合物微粒外表面上的一种或多种官能团，聚合物微粒为聚甲基丙烯酸甲酯的微粒或甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚物的微粒或者它们的混合物。本发明纳米荧光微粒粒径稳定、光谱适用于可见发射光，根据其荧光不同表达，可以通过和特异性抗体结合，用于多重PCR产物的液相蛋白芯片检测技术，能够提高诊断效率和诊断准确性，且通量高，市场潜力大。

Description

纳米荧光微粒用作多重PCR产物的液相蛋白芯片的用途
技术领域
本发明涉及液相蛋白芯片领域，尤其是涉及一种纳米荧光微粒用作多重PCR产物的液相蛋白芯片的用途。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是无需使用活生物体而酶促复制DNA的分子生物学技术。PCR在医学和生物研究实验室中普遍用于多种任务，例如检测遗传疾病、鉴定基因指纹、诊断感染性疾病、克隆基因、亲子鉴定和DNA计算。由于其无与伦比的扩增和准确性能力，分子生物学家已将PCR作为核酸检测的首选方法。通常在PCR反应的终点或平台期进行DNA检测，这使得难于定量起始模板。实时PCR或动态PCR通过随着反应进程而记录扩增子浓度而提高了终点PCR分析的性能。扩增子浓度最常通过与被扩增靶标相关的荧光信号变化来记录。
液相芯片，也称为微粒体悬浮芯片(suspensionarray，liquidchip)，是基于xMAP(flexibleMultiAnalyteProfiling)技术的新型生物芯片技术平台，它是在不同荧光编码的微粒上进行抗原-抗体、酶-底物、配体-受体的结合反应及核酸杂交反应，通过红、绿两束激光分别检测微粒编码和报告荧光来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应，是一种新的高通量分子检测技术平台。但是由于现有编码微粒荧光易漂白的影响，使得编码微粒不稳定，影响检测结果。近年来，有学者采用量子点编码微粒，但由于量子点发射荧光范围有限，编码技术不成熟等问题，也一直没有得到广泛应用。
因此，现阶段，缺乏一种高效地、高通量的蛋白检测方法和相应的生物芯片，这大大限制了蛋白质组学的研究进展。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种纳米荧光微粒用作多重PCR产物的液相蛋白芯片的用途，采用本发明的纳米荧光微粒和靶向探针相结合，使之适用于多重PCR产物的液相蛋白芯片检测。
为实现上述目的，本发明提出如下技术方案：一种纳米荧光微粒用作多重PCR产物的液相蛋白芯片的用途，所述纳米荧光微粒具有包括内核与外壳的核壳结构，粒径为300～600nm，所述内核为包含有荧光分子的聚合物微粒，所述外壳具有修饰在所述聚合物微粒外表面上的一种或多种官能团，所述聚合物微粒为聚甲基丙烯酸甲酯的微粒或甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚物的微粒或两者的混合物，其中甲基丙烯酸甲酯的重量至少占所述纳米荧光微粒总重量的50％，所述的荧光分子的重量占所述纳米荧光微粒总重量的0.05％～5％，所述纳米荧光微粒用于多重PCR产物的液相蛋白芯片检测。
优选地，所述纳米荧光微粒与靶向探针偶联用于多重PCR产物的液相蛋白芯片检测。
更进一步地，所述甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚物中，甲基丙烯酸甲酯与所述其它单体的结构单元数均大于等于50。
所述其它单体为选自氟乙烯、氯乙烯、溴乙烯、乙烯碘化、苯乙烯以及丙烯酸中的一种或多种。
所述官能团为选自羧基，乙醇胺基，羟基，胺基，氨基，亚胺基，环氧基，异氰酸酯基，金属醇盐及聚乙二醇基中的一种。
所述荧光分子为罗丹明、荧光素及其衍生物、肾上腺素染料及氟硼莹中的一种或多种。
所述荧光分子的重量优选为所述纳米荧光微粒总重量的0.05％～5％，可表达不同强度的荧光，适用于编码荧光微粒。
优选地，所述纳米荧光微粒的粒径为350～400nm，所述纳米荧光微粒的粒径最优为370～390nm。
所述纳米荧光微粒还包含一种或者一种以上的通过所述官能团共价连接而覆盖在所述微粒表面的生物活性物种，该所述的生物活性物种选自抗体、抗原、核酸、配体、受体、人工多肽、蛋白质以及多糖中的一种，所述的生物活性物种能够参与特异性识别和结合反应。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明的每个纳米荧光微粒上都能够被连接上大量的荧光分子，是非常好的荧光信号放大的载体，应用于多重PCR的液相蛋白芯片检测中，可以大大提高检测灵敏度，且纳米荧光微粒非常稳定，受外界影响小，荧光稳定，这为通过荧光进行定量检测提供了良好的条件，因此，本发明纳米荧光微粒是荧光检测技术中高灵敏度分析检测和定量测试中的理想标记。
2、本发明纳米荧光微粒可用可见光光源激发以及通过简单的方法获得，降低液相蛋白芯片检测分析成本。
3、本发明纳米荧光微粒中，荧光分子均匀地分布在聚合物微粒中，微粒粒径均匀、稳定，根据荧光表达的不用梯度，可制备出一个光编码微粒，可用于多重PCR产物的液相蛋白芯片检测技术，适用于医疗诊断、生物检测、环境检测和食品安全监测以及不同物种的检测技术领域中。
附图说明
图1是本发明实施例1制备的纳米荧光微粒的激光光谱示意图；
图2是本发明实施例1制备的纳米荧光微粒的扫描电镜示意图；
图3～6是本发明核酸扩增检测在四种波长下的检测波形示意图；
图7是使用本发明的纳米荧光微粒与一般荧光物用于液相蛋白芯片检测的对比波形示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案作进一步说明，应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中所采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1表面官能团为羧基的纳米荧光微粒的制备，包括如下步骤：
(1)制备表面具有羧基的聚甲基丙烯酸甲酯微粒
取Polysciences公司产的聚甲基丙烯酸甲酯微粒(2.7％，0.324μm)5ml，清洗离心后在10ml超纯水中悬浮超声，加入含3mg甲基丙烯酸单体(用于在微粒表面形成羧基)的1ml水，混合2min，加入含15mg聚乙烯醇的0.5ml水，搅拌2min，然后加入含8mg十二烷基硫酸钠的0.5ml水，混合2min，然后加入5ml乙醇，搅拌5min，得到聚甲基丙烯酸甲酯微粒。
(2)制备纳米荧光微粒
通过注射器向步骤(1)所得聚甲基丙烯酸甲酯微粒中，缓慢加入含1mg罗丹明的750μl二氯甲烷，加入时间可以超过5min，继续搅拌5min。通过注射泵以0.5ml／min速度加入水25ml，然后空气气流去除一些溶剂定容到30ml。对微粒进行离心去除上清液，用90％乙醇清洗三遍，清洗后的微粒用30ml水悬浮，即得纳米荧光微粒。
实施例2纳米荧光微粒的表征
取实施例1制备的10μl纳米荧光微粒，悬浮在750μl水中进行检测，在610nm处收集微粒的激光光谱，发射光谱在580nm处采集，谱图参见图1。对微粒进行扫描电镜测试，粒径在370～390nm之间，粒径均匀，谱图参见图2所示。
实施例3多重PCR检测步骤
混合50μlPCR反应体系，PCR反应体系内含：各类引物均为15pmol，实施例4制备的不同的荧光检测探针各15pmol，检测DNA50—100ng，1倍PCR缓和液，TaqDNA聚合酶2μl，Mg++终浓度3pmol／L，混合后，PCR反应体系在PCR检测仪器上，96℃下预变性2min，然后94℃变性10s，53℃复性30s,60℃延伸40s，共40循环。
取16个样本(四个梯度，其中一个梯度为10个样本量，其他三个梯度各为两个样本量)，在四种波长下检测，如图3～6所示：
实施例4纳米荧光微粒和靶向探针偶联并用于蛋白液相芯片检测
选用不同荧光编码的实施例1制备的纳米荧光微粒，充分震荡纳米荧光微粒悬液，稀释纳米荧光微粒5×106个，离心速度14000g，离心10min，去除上清液。
向上述离心后的纳米荧光微粒中加入0.01M，pH4.8的硼酸盐缓冲液，终浓度2mMEDC和终浓度5mMNHS，室温反应15min，离心洗涤后，加入终浓度20mM2-巯基乙醇，离心去上清。
加入抗体，室温反应6h，加入终浓度50mMTris，离心去上清。用0.01M，pH7.2的PBS溶液(其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶沉淀至起始体积后，即为制备好的蛋白标记抗体的荧光微粒。
将制备好的蛋白标记抗体的荧光微粒和实施例3中的PCR产物混合，90℃变性10min，室温避光孵育30min，通过激发微粒荧光对PCR产物进行分析。
对十个HPV样本进行检测，与市面上的PCR膜杂交法比较见下表：
结果表明本发明与PCR膜杂交法检出结果中九例一致，只有一例不同，经过测序确定本发明液相杂交特异性更高，操作时间短，可具体分型，检出结果直观，成本低，污染小易于推广。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种纳米荧光微粒用作多重PCR产物的液相蛋白芯片的用途，所述纳米荧光微粒具有包括内核与外壳的核壳结构，粒径为300～600nm，所述内核为包含有荧光分子的聚合物微粒，所述外壳具有修饰在所述聚合物微粒外表面上的一种或多种官能团，所述聚合物微粒为聚甲基丙烯酸甲酯的微粒或甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚物的微粒或两者的混合物，其中甲基丙烯酸甲酯的重量至少占所述纳米荧光微粒总重量的50％，所述的荧光分子的重量占所述纳米荧光微粒总重量的0.05％～5％，其特征在于：所述纳米荧光微粒与靶向探针偶联用于多重PCR产物的液相蛋白芯片检测，其中，所述纳米荧光微粒和靶向探针偶联用于多重PCR产物的液相蛋白芯片检测的过程包括：
选用不同荧光编码的纳米荧光微粒，充分震荡纳米荧光微粒悬液，稀释纳米荧光微粒5×106个，离心速度14000g，离心10min，去除上清液；
向上述离心后的纳米荧光微粒中加入0.01M，pH4.8的硼酸盐缓冲液，终浓度2mMEDC和终浓度5mMNHS，室温反应15min，离心洗涤后，加入终浓度20mM2-巯基乙醇，离心去上清；
加入抗体，室温反应6h，加入终浓度50mMTris，离心去上清，用0.01M，pH7.2的PBS溶液复溶沉淀至起始体积后，即为制备好的蛋白标记抗体的荧光微粒；
将制备好的蛋白标记抗体的荧光微粒和PCR产物混合，90℃变性10min，室温避光孵育30min，通过激发微粒荧光对PCR产物进行分析。
2.根据权利要求1所述的纳米荧光微粒用作多重PCR产物的液相蛋白芯片的用途，其特征在于，所述甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚物中，甲基丙烯酸甲酯与所述其它单体的结构单元数均大于等于50。
3.根据权利要求1所述的纳米荧光微粒用作多重PCR产物的液相蛋白芯片的用途，其特征在于：所述其它单体为选自氟乙烯、氯乙烯、溴乙烯、乙烯碘化、苯乙烯以及丙烯酸中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的纳米荧光微粒用作多重PCR产物的液相蛋白芯片的用途，其特征在于：所述官能团为选自羧基，乙醇胺基，羟基，胺基，氨基，亚胺基，环氧基，异氰酸酯基，金属醇盐及聚乙二醇基中的一种。
5.根据权利要求1所述的纳米荧光微粒用作多重PCR产物的液相蛋白芯片的用途，其特征在于：所述荧光分子为罗丹明、荧光素及其衍生物、肾上腺素染料及氟硼莹中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的纳米荧光微粒用作多重PCR产物的液相蛋白芯片的用途，其特征在于：所述荧光分子的重量优选为所述纳米荧光微粒总重量的0.05％～5％，可表达不同强度的荧光，适用于编码荧光微粒。
7.根据权利要求1所述的纳米荧光微粒用作多重PCR产物的液相蛋白芯片的用途，其特征在于：所述纳米荧光微粒的粒径为350～400nm。
8.根据权利要求7所述的纳米荧光微粒用作多重PCR产物的液相蛋白芯片的用途，其特征在于：所述纳米荧光微粒的粒径为370～390nm。
9.根据权利要求1所述的纳米荧光微粒用作多重PCR产物的液相蛋白芯片的用途，其特征在于：所述纳米荧光微粒还包含一种或者一种以上的通过所述官能团共价连接而覆盖在所述微粒表面的生物活性物种，该所述的生物活性物种选自抗体、抗原、核酸、配体、受体、人工多肽、蛋白质以及多糖中的一种，所述的生物活性物种能够参与特异性识别和结合反应。
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