JP2015230293A - 生体分子検出用試験キット、及びこれを用いた生体分子の検出方法、並びにこれらに用いられる生体分子検出用試験片及び生体分子検出用標識試薬 - Google Patents
生体分子検出用試験キット、及びこれを用いた生体分子の検出方法、並びにこれらに用いられる生体分子検出用試験片及び生体分子検出用標識試薬 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】より高い感度及び精度での生体分子の検出に用いることができる、生体分子検出用の試験片と、蛍光シリカナノ粒子を有する生体分子検出用試験キットを提供する。
【解決手段】生体分子検出用の試験片と、蛍光シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬を有する生体分子検出用試験キットであって、前記試験片は生体分子を捕捉する試験領域を有し、生体分子に対する結合性を有する第１の捕捉物質が第１の連結物質を介して前記試験領域に導入され、生体分子に対する結合性を有する第２の捕捉物質が第２の連結物質を介して前記蛍光シリカナノ粒子の表面に導入され、前記第１の連結物質と前記第２の連結物質は溶液中で互いに吸着しない物質からなる、生体分子検出用試験キット。
【選択図】なし
【解決手段】生体分子検出用の試験片と、蛍光シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬を有する生体分子検出用試験キットであって、前記試験片は生体分子を捕捉する試験領域を有し、生体分子に対する結合性を有する第１の捕捉物質が第１の連結物質を介して前記試験領域に導入され、生体分子に対する結合性を有する第２の捕捉物質が第２の連結物質を介して前記蛍光シリカナノ粒子の表面に導入され、前記第１の連結物質と前記第２の連結物質は溶液中で互いに吸着しない物質からなる、生体分子検出用試験キット。
【選択図】なし
Description
本発明は、生体分子検出用試験キット、及びこれを用いた生体分子の検出方法、並びにこれらに用いられる生体分子検出用試験片及び生体分子検出用標識試薬に関する。
生体中の核酸や抗原などの生体分子を検出する手法として、生体分子を捕捉する捕捉物質を担体に固定化させた多孔質の試験片と、生体分子を捕捉する標識試薬を用いた検出法がある。この方法では、検体液に含まれる生体分子を標識粒子に捕捉させ、多孔質支持体を毛細管現象により移動させる。そして、多孔質支持体に例えばライン状に固定された捕捉物質と生体分子とを接触させることによって、前記生体分子を濃縮し、捕捉物質が固定されたラインを標識試薬により発色させる。この発色によって生体分子の有無を判定することができる。
かかる生体分子の検出法の特徴として下記の３点が挙げられる。
（１）判定までに要する時間が短く迅速な検査が可能である。
（２）検体を滴下するだけで測定でき操作が簡便である。
（３）特別な検出装置を必要とせず判定が容易である。
これらの特徴を利用して、前記の検出法は妊娠検査薬やインフルエンザ検査薬に用いられており、新たなＰＯＣＴ（Point Of Care Testing）の手法として利用されている。また、食品検査においても、例えば食物アレルゲンの検査試薬等として広く利用され益々注目を集めている。
かかる生体分子の検出法の特徴として下記の３点が挙げられる。
（１）判定までに要する時間が短く迅速な検査が可能である。
（２）検体を滴下するだけで測定でき操作が簡便である。
（３）特別な検出装置を必要とせず判定が容易である。
これらの特徴を利用して、前記の検出法は妊娠検査薬やインフルエンザ検査薬に用いられており、新たなＰＯＣＴ（Point Of Care Testing）の手法として利用されている。また、食品検査においても、例えば食物アレルゲンの検査試薬等として広く利用され益々注目を集めている。
これまでに、各種生体分子検出用試験キットが提案されている。
例えば、生体分子検出用試験キットに用いられる標識試薬としては、ラテックス粒子からなる標識試薬や、金コロイド粒子からなる標識試薬が提案されている（例えば、特許文献１〜３参照）。
また、核酸検出用試験キットの試験片として、生体分子に対する結合性を有するオリゴヌクレオチドが試験片の試験領域に固定化されている試験片が提案されている（例えば、特許文献１及び２参照）。
例えば、生体分子検出用試験キットに用いられる標識試薬としては、ラテックス粒子からなる標識試薬や、金コロイド粒子からなる標識試薬が提案されている（例えば、特許文献１〜３参照）。
また、核酸検出用試験キットの試験片として、生体分子に対する結合性を有するオリゴヌクレオチドが試験片の試験領域に固定化されている試験片が提案されている（例えば、特許文献１及び２参照）。
特許文献１〜３に記載されている生体分子検出用試験キットに用いられている標識試薬は、ラテックス粒子や金コロイド粒子からなる。これらの粒子を用いた生体分子の検出感度は低く、十分なものとは言えなかった。そこで、高感度な生体分子の検出には、ラテックス粒子や金コロイド粒子などの着色粒子に代えて、蛍光粒子が用いられている。
そこで、本発明は、より高い感度及び精度での生体分子の検出に用いることができる、生体分子検出用の試験片と、蛍光シリカナノ粒子を有する生体分子検出用試験キットを提供することを課題とする。
また、本発明は、より高い感度及び精度で生体分子を検出することができる、生体分子検出用試験キットを用いた生体分子の検出方法を提供することを課題とする。
さらに、本発明は、より高い感度及び精度での生体分子の検出に用いることができる、生体分子検出用試験片、及び蛍光シリカナノ粒子からなる生体分子検出用標識試薬を提供することを課題とする。
また、本発明は、より高い感度及び精度で生体分子を検出することができる、生体分子検出用試験キットを用いた生体分子の検出方法を提供することを課題とする。
さらに、本発明は、より高い感度及び精度での生体分子の検出に用いることができる、生体分子検出用試験片、及び蛍光シリカナノ粒子からなる生体分子検出用標識試薬を提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討を行った。その結果、生体分子に結合性を有する物質（以下、「第２の捕捉物質」ともいう）を特定の連結物質を介して蛍光シリカナノ粒子の表面に導入することで、蛍光シリカナノ粒子に対する捕捉物質の固定化の効率が向上することを見い出した。
また、生体分子検出用試験片において、生体分子に結合性を有する物質（以下、「第１の捕捉物質」ともいう）を、特定の連結物質を介して試験片の試験領域に導入することで、捕捉物質の試験領域への固定化の効率が向上することを見い出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
また、生体分子検出用試験片において、生体分子に結合性を有する物質（以下、「第１の捕捉物質」ともいう）を、特定の連結物質を介して試験片の試験領域に導入することで、捕捉物質の試験領域への固定化の効率が向上することを見い出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
本発明の上記課題は、下記の手段により解決された。
（１）生体分子検出用の試験片と、蛍光シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬を有する生体分子検出用試験キットであって、
前記試験片は生体分子を捕捉する試験領域を有し、
生体分子に対する結合性を有する第１の捕捉物質が、第１の連結物質を介して前記試験領域に導入され、
生体分子に対する結合性を有する第２の捕捉物質が、第２の連結物質を介して前記蛍光シリカナノ粒子の表面に導入され、
前記第１の連結物質と前記第２の連結物質は、溶液中で互いに吸着しない物質からなる、
生体分子検出用試験キット。
（２）前記第１の連結物質及び前記第２の連結物質のそれぞれが、ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」ともいう）、スカシガイヘモシアニン（以下、「ＫＬＨ」ともいう）、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンからなる群より選ばれる少なくとも１種の連結物質である、前記（１）項に記載の試験キット。
（３）前記第１の連結物質と前記第２の連結物質が同種の連結物質である、前記（１）又は（２）項に記載の試験キット。
（４）前記第１の捕捉物質及び前記第２の捕捉物質のそれぞれがオリゴヌクレオチドである、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の試験キット。
（５）前記蛍光シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の試験キット。
（１）生体分子検出用の試験片と、蛍光シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬を有する生体分子検出用試験キットであって、
前記試験片は生体分子を捕捉する試験領域を有し、
生体分子に対する結合性を有する第１の捕捉物質が、第１の連結物質を介して前記試験領域に導入され、
生体分子に対する結合性を有する第２の捕捉物質が、第２の連結物質を介して前記蛍光シリカナノ粒子の表面に導入され、
前記第１の連結物質と前記第２の連結物質は、溶液中で互いに吸着しない物質からなる、
生体分子検出用試験キット。
（２）前記第１の連結物質及び前記第２の連結物質のそれぞれが、ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」ともいう）、スカシガイヘモシアニン（以下、「ＫＬＨ」ともいう）、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンからなる群より選ばれる少なくとも１種の連結物質である、前記（１）項に記載の試験キット。
（３）前記第１の連結物質と前記第２の連結物質が同種の連結物質である、前記（１）又は（２）項に記載の試験キット。
（４）前記第１の捕捉物質及び前記第２の捕捉物質のそれぞれがオリゴヌクレオチドである、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の試験キット。
（５）前記蛍光シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の試験キット。
（６）生体分子検出用試験キットを用いた生体分子の検出方法であって、
前記生体分子検出用試験キットは、生体分子検出用の試験片と、蛍光シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬を有し、
前記試験片は生体分子を捕捉する試験領域を有し、
生体分子に対する結合性を有する第１の捕捉物質が、第１の連結物質を介して前記試験領域に導入され、
生体分子に対する結合性を有する第２の捕捉物質が、第２の連結物質を介して前記蛍光シリカナノ粒子の表面に導入され、
前記第１の連結物質と前記第２の連結物質は、溶液中で互いに吸着しない物質からなり、
前記蛍光シリカナノ粒子の第２の捕捉物質に結合した生体分子と、前記試験領域の第１の捕捉物質との結合により生じる、前記蛍光シリカナノ粒子の発光を検出することで、生体分子を検出する、
生体分子の検出方法。
（７）前記第１の連結物質及び前記第２の連結物質のそれぞれが、ＢＳＡ、ＫＬＨ、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンからなる群より選ばれる少なくとも１種の連結物質である、前記（６）項に記載の生体分子の検出方法。
（８）前記第１の連結物質と前記第２の連結物質が同種の捕捉物質である、前記（６）又は（７）項に記載の生体分子の検出方法。
（９）前記第１の捕捉物質及び前記第２の捕捉物質のそれぞれがオリゴヌクレオチドである、前記（６）〜（８）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
（１０）前記蛍光シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、前記（６）〜（９）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
（１１）前記試験キットが核酸検出用試験キットであり、
第１及び第２の捕捉物質がそれぞれオリゴヌクレオチドであり、
前記の各オリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列のオリゴヌクレオチドを生体分子に予め導入する、
前記（６）〜（１０）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
前記生体分子検出用試験キットは、生体分子検出用の試験片と、蛍光シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬を有し、
前記試験片は生体分子を捕捉する試験領域を有し、
生体分子に対する結合性を有する第１の捕捉物質が、第１の連結物質を介して前記試験領域に導入され、
生体分子に対する結合性を有する第２の捕捉物質が、第２の連結物質を介して前記蛍光シリカナノ粒子の表面に導入され、
前記第１の連結物質と前記第２の連結物質は、溶液中で互いに吸着しない物質からなり、
前記蛍光シリカナノ粒子の第２の捕捉物質に結合した生体分子と、前記試験領域の第１の捕捉物質との結合により生じる、前記蛍光シリカナノ粒子の発光を検出することで、生体分子を検出する、
生体分子の検出方法。
（７）前記第１の連結物質及び前記第２の連結物質のそれぞれが、ＢＳＡ、ＫＬＨ、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンからなる群より選ばれる少なくとも１種の連結物質である、前記（６）項に記載の生体分子の検出方法。
（８）前記第１の連結物質と前記第２の連結物質が同種の捕捉物質である、前記（６）又は（７）項に記載の生体分子の検出方法。
（９）前記第１の捕捉物質及び前記第２の捕捉物質のそれぞれがオリゴヌクレオチドである、前記（６）〜（８）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
（１０）前記蛍光シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、前記（６）〜（９）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
（１１）前記試験キットが核酸検出用試験キットであり、
第１及び第２の捕捉物質がそれぞれオリゴヌクレオチドであり、
前記の各オリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列のオリゴヌクレオチドを生体分子に予め導入する、
前記（６）〜（１０）のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
（１２）生体分子を捕捉する試験領域を有する生体分子検出用試験片であって、生体分子に対する結合性を有する捕捉物質が、ＢＳＡ、ＫＬＨ、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンからなる群より選ばれる少なくとも１種の連結物質を介して前記試験領域に導入されている、生体分子検出用試験片。
（１３）前記捕捉物質がオリゴヌクレオチドである、前記（１２）項に記載の生体分子検出用試験片。
（１３）前記捕捉物質がオリゴヌクレオチドである、前記（１２）項に記載の生体分子検出用試験片。
（１４）蛍光シリカナノ粒子からなる生体分子検出用標識試薬であって、生体分子に対する結合性を有する捕捉物質が、ＢＳＡ、ＫＬＨ、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンからなる群より選ばれる少なくとも１種の連結物質を介して前記蛍光シリカナノ粒子の表面に導入されている、生体分子検出用標識試薬。
（１５）前記蛍光シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、前記（１４）項に記載の生体分子検出用標識試薬。
（１６）前記捕捉物質がオリゴヌクレオチドである、前記（１４）又は（１５）項に記載の生体分子検出用標識試薬。
（１５）前記蛍光シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、前記（１４）項に記載の生体分子検出用標識試薬。
（１６）前記捕捉物質がオリゴヌクレオチドである、前記（１４）又は（１５）項に記載の生体分子検出用標識試薬。
本発明の生体分子検出用試験キットは、より高い感度及び精度での生体分子の検出に用いることができる。
また、本発明の生体分子の検出方法は、より高い感度及び精度で生体分子を検出することができる。
さらに、本発明の生体分子検出用試験片及び、及び蛍光シリカナノ粒子からなる生体分子検出用標識試薬は、より高い感度及び精度での生体分子の検出に用いることができる。
また、本発明の生体分子の検出方法は、より高い感度及び精度で生体分子を検出することができる。
さらに、本発明の生体分子検出用試験片及び、及び蛍光シリカナノ粒子からなる生体分子検出用標識試薬は、より高い感度及び精度での生体分子の検出に用いることができる。
本明細書において「物質」とは、化合物又は化学合成された分子の他、生体分子（タンパク質、ペプチド、核酸等）を包含する。これらは人工起源のものであっても、天然起源のものであってもよい。
また、本明細書において「結合」又は「連結」とは、複数のものが分離した状態から連続して一体となることを全般的に指し、共有結合やイオン結合、水素結合といった化学的な結合のほか、化学吸着や物理吸着、そのほか嵌合、螺合、咬合した物理的な連結状態等も含む意味である。ここで、「結合」又は「連結」とは、直接複数のものが結合しても、別のものを介して間接的に結合してもよい意味である。
さらに、本明細書において「検出」とは、定性的な検出や定量的な検出のみならず、その他の各種の測定や同定、分析、評価等を含む概念である。
また、本明細書において「結合」又は「連結」とは、複数のものが分離した状態から連続して一体となることを全般的に指し、共有結合やイオン結合、水素結合といった化学的な結合のほか、化学吸着や物理吸着、そのほか嵌合、螺合、咬合した物理的な連結状態等も含む意味である。ここで、「結合」又は「連結」とは、直接複数のものが結合しても、別のものを介して間接的に結合してもよい意味である。
さらに、本明細書において「検出」とは、定性的な検出や定量的な検出のみならず、その他の各種の測定や同定、分析、評価等を含む概念である。
本発明の生体分子検出用試験キットは、生体分子検出用の試験片と、蛍光シリカナノ粒子を有する。そして、本発明の生体分子の検出方法は、当該生体分子検出用試験キットを用いて、生体分子の検出を行う。
以下、本発明の構成についてその好ましい実施形態を中心に詳述する。
以下、本発明の構成についてその好ましい実施形態を中心に詳述する。
［生体分子］
本発明において、検出対象（標的物質）としての生体分子に特に制限はなく、抗原、抗体、核酸、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、その他生体活性を有する化学物質等が挙げられる。これらのうち、本発明は核酸の検出に好適に用いることができる。
また、生体分子は、後述する第１の捕捉物質に対する結合性を有する部位と、後述する第２の捕捉物質に対する結合性を有する部位それぞれを有していることが好ましい。
本発明において、検出対象（標的物質）としての生体分子に特に制限はなく、抗原、抗体、核酸、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、その他生体活性を有する化学物質等が挙げられる。これらのうち、本発明は核酸の検出に好適に用いることができる。
また、生体分子は、後述する第１の捕捉物質に対する結合性を有する部位と、後述する第２の捕捉物質に対する結合性を有する部位それぞれを有していることが好ましい。
本発明において、生体分子を含有する試料としては特に制限はないが、臨床検体（例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、膵液、胃液、喀痰、鼻や咽等の粘膜から採取したぬぐい液等の体液や便等）、食品検体（例えば、液体飲料、半固形食品、固形食品等）、環境サンプリング検体（例えば、土壌、河川、海水等の自然界のサンプル、工場内の生産ラインやクリーンルームに設置されたエアーサンプラーによるサンプリング検体、ふき取り検体等）等が挙げられる。
また、試料は液体であればそのまま用いることもできる。試料が半固形又は固形物等の場合には、希釈や抽出等の処理を施した後に用いることもできる。
また、試料は液体であればそのまま用いることもできる。試料が半固形又は固形物等の場合には、希釈や抽出等の処理を施した後に用いることもできる。
［生体分子検出用の試験片］
本発明の生体分子検出用試験キットに用いる試験片（以下、「テストストリップ」ともいう）の形状に特に制限はないが、平面状の試験片であることが好ましく、ラテラルフロー用の試験片であることがより好ましい。
また、試験片の構造に特に制限はないが、試料添加用部材（サンプルパッド）と、生体分子を捕捉する試験領域を有するメンブレンと、吸収パッドとが、この順でそれぞれ相互に毛細管現象が生じるように直列に連結している構造であることが好ましい。そして、各構成部材は粘着剤付きバッキングシートにより裏打ちされていることが好ましい。
以下、上記形状及び構造を有する試験片について、本発明の好ましい実施形態を図１及び２を参照しながら説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
本発明の生体分子検出用試験キットに用いる試験片（以下、「テストストリップ」ともいう）の形状に特に制限はないが、平面状の試験片であることが好ましく、ラテラルフロー用の試験片であることがより好ましい。
また、試験片の構造に特に制限はないが、試料添加用部材（サンプルパッド）と、生体分子を捕捉する試験領域を有するメンブレンと、吸収パッドとが、この順でそれぞれ相互に毛細管現象が生じるように直列に連結している構造であることが好ましい。そして、各構成部材は粘着剤付きバッキングシートにより裏打ちされていることが好ましい。
以下、上記形状及び構造を有する試験片について、本発明の好ましい実施形態を図１及び２を参照しながら説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
（サンプルパッド）
サンプルパッド２は生体分子、標識試薬、これらの複合体を含む試料を滴下する構成部材である。サンプルパッドの材料や寸法等は特に限定されず、この種の製品に適用される一般的なものを利用することができる。
サンプルパッド２は生体分子、標識試薬、これらの複合体を含む試料を滴下する構成部材である。サンプルパッドの材料や寸法等は特に限定されず、この種の製品に適用される一般的なものを利用することができる。
（メンブレン）
メンブレン３は、サンプルパッド２から毛細管現象により移動してきた生体分子を捕捉するための構成部材である。
図１に示すように、メンブレン３は、生体分子を捕捉する試験領域１０を少なくとも１つ有する。そして、生体分子に対する特異的な結合性を有し生体分子と複合体を形成しうる第１の捕捉物質が、第１の連結物質を介して試験領域１０に導入されている。第１の連結物質を介することで第１の捕捉物質の試験領域１０への固定化の効率が向上し、生体分子の検出感度を向上させることができる。
この試験領域１０で第１の捕捉物質−生体分子−標識試薬からなる複合体が形成され、標識試薬が濃縮される。そして、標識試薬が有する蛍光色素の量の程度により生体分子を定性的又は定量的に検出することができる。
複数の生体分子を検出する場合は、メンブレン３に複数の試験領域を設けてもよい。例えば図２に示すように、異なる２種の生体分子を検出するために、メンブレン３に第１の試験領域２０と第２の試験領域２１とをそれぞれ平行となるように設けてもよい。
前記試験領域の形状としては、局所的に第１の捕捉物質が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられる。本発明において試験領域はライン状であることが好ましく、幅０．５〜１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。
メンブレン３は、サンプルパッド２から毛細管現象により移動してきた生体分子を捕捉するための構成部材である。
図１に示すように、メンブレン３は、生体分子を捕捉する試験領域１０を少なくとも１つ有する。そして、生体分子に対する特異的な結合性を有し生体分子と複合体を形成しうる第１の捕捉物質が、第１の連結物質を介して試験領域１０に導入されている。第１の連結物質を介することで第１の捕捉物質の試験領域１０への固定化の効率が向上し、生体分子の検出感度を向上させることができる。
この試験領域１０で第１の捕捉物質−生体分子−標識試薬からなる複合体が形成され、標識試薬が濃縮される。そして、標識試薬が有する蛍光色素の量の程度により生体分子を定性的又は定量的に検出することができる。
複数の生体分子を検出する場合は、メンブレン３に複数の試験領域を設けてもよい。例えば図２に示すように、異なる２種の生体分子を検出するために、メンブレン３に第１の試験領域２０と第２の試験領域２１とをそれぞれ平行となるように設けてもよい。
前記試験領域の形状としては、局所的に第１の捕捉物質が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられる。本発明において試験領域はライン状であることが好ましく、幅０．５〜１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。
＜第１の連結物質＞
本発明で用いる第１の連結物質に特に制限はなく、適宜選択することができる。本発明で用いる第１の連結物質としては、第１の捕捉物質を連結するために、アミノ基、カルボキシル基、チオール基などの官能基を有し、メンブレンに物理的な吸着が可能な物質が好ましい。
また、第１の連結物質と、後述する第２の連結物質は、溶液中で互いに吸着しない物質からなる。ここで「溶液中で互いに吸着しない」とは、各連結物質が、使用される環境の濃度、温度で、凝集や会合を生じず、単分散した状態のことを指す。これらの連結物質が互いに吸着する物質からなると、生体分子がなくても後述する標識粒子が前記試験領域に捕捉されてしまう非特異吸着を起こし、偽陽性の原因になるからである。
第１の連結物質の具体例としては、ＢＳＡ、ＫＬＨ、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンが挙げられる。このうち、ＢＳＡ及びＫＬＨが好ましく、ＢＳＡがより好ましい。
本発明で用いる第１の連結物質に特に制限はなく、適宜選択することができる。本発明で用いる第１の連結物質としては、第１の捕捉物質を連結するために、アミノ基、カルボキシル基、チオール基などの官能基を有し、メンブレンに物理的な吸着が可能な物質が好ましい。
また、第１の連結物質と、後述する第２の連結物質は、溶液中で互いに吸着しない物質からなる。ここで「溶液中で互いに吸着しない」とは、各連結物質が、使用される環境の濃度、温度で、凝集や会合を生じず、単分散した状態のことを指す。これらの連結物質が互いに吸着する物質からなると、生体分子がなくても後述する標識粒子が前記試験領域に捕捉されてしまう非特異吸着を起こし、偽陽性の原因になるからである。
第１の連結物質の具体例としては、ＢＳＡ、ＫＬＨ、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンが挙げられる。このうち、ＢＳＡ及びＫＬＨが好ましく、ＢＳＡがより好ましい。
＜第１の捕捉物質＞
本発明で用いる第１の捕捉物質は、生体分子に対する特異的な結合性を有し、試験領域で第１の捕捉物質−生体分子−標識試薬からなる複合体を形成しうるものであれば特に制限はない。
第１の捕捉物質と生体分子の組み合わせの例としては、抗体とその抗原の組み合わせ、抗原とその抗体の組み合わせ、核酸（ＤＮＡやＲＮＡ等）とストリンジェントな条件で該核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの組み合わせ、受容体とそのリガンドの組み合わせ、リガンドとその受容体の組み合わせ、レクチンと糖鎖の組み合わせ、アプタマーと該アプタマーに特異的に結合する分子の組み合わせが挙げられる。
なお、本明細書において、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W．Russell.，Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
前述のように、本発明は核酸の検出に好適に用いることができる。したがって、第１の捕捉物質はオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
第１の捕捉物質と、後述する第２の捕捉物質としてそれぞれオリゴヌクレオチドを用い、２種以上のオリゴヌクレオチドを生体分子として検出する場合、図２に示すようにメンブレン上の異なる位置にヌクレオチドの種類に合わせて複数の試験領域を設け、各試験領域に固定した第１の捕捉物質と相補的な配列と、後述する第２の捕捉物質に相補的な配列の両方を検出対象となるヌクレオチドに予め導入することで、２種以上のヌクレオチドを検出できる。ここで２種以上のオリゴヌクレオチドを検出する場合、各オリゴヌクレオチドそれぞれに対して異なる第１の捕捉物質を選択すれば、第２の捕捉物質はヌクレオチドの種類が異なっても同じ塩基配列でよい。これにより、１種類の第２の捕捉物質を結合した標識試薬を用いて、２種類以上のオリゴヌクレオチドの検出が可能となる。なお、２種類以上のオリゴヌクレオチドを検出対象とする場合、検出対象となるオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」ともいう）により増幅しておくことが好ましい。
本発明で用いる第１の捕捉物質は、生体分子に対する特異的な結合性を有し、試験領域で第１の捕捉物質−生体分子−標識試薬からなる複合体を形成しうるものであれば特に制限はない。
第１の捕捉物質と生体分子の組み合わせの例としては、抗体とその抗原の組み合わせ、抗原とその抗体の組み合わせ、核酸（ＤＮＡやＲＮＡ等）とストリンジェントな条件で該核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの組み合わせ、受容体とそのリガンドの組み合わせ、リガンドとその受容体の組み合わせ、レクチンと糖鎖の組み合わせ、アプタマーと該アプタマーに特異的に結合する分子の組み合わせが挙げられる。
なお、本明細書において、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W．Russell.，Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
前述のように、本発明は核酸の検出に好適に用いることができる。したがって、第１の捕捉物質はオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
第１の捕捉物質と、後述する第２の捕捉物質としてそれぞれオリゴヌクレオチドを用い、２種以上のオリゴヌクレオチドを生体分子として検出する場合、図２に示すようにメンブレン上の異なる位置にヌクレオチドの種類に合わせて複数の試験領域を設け、各試験領域に固定した第１の捕捉物質と相補的な配列と、後述する第２の捕捉物質に相補的な配列の両方を検出対象となるヌクレオチドに予め導入することで、２種以上のヌクレオチドを検出できる。ここで２種以上のオリゴヌクレオチドを検出する場合、各オリゴヌクレオチドそれぞれに対して異なる第１の捕捉物質を選択すれば、第２の捕捉物質はヌクレオチドの種類が異なっても同じ塩基配列でよい。これにより、１種類の第２の捕捉物質を結合した標識試薬を用いて、２種類以上のオリゴヌクレオチドの検出が可能となる。なお、２種類以上のオリゴヌクレオチドを検出対象とする場合、検出対象となるオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」ともいう）により増幅しておくことが好ましい。
第１の捕捉物質としてオリゴヌクレオチドを用いる場合、生体分子との結合性を考慮して適宜選択することができる。
第１の捕捉物質がオリゴヌクレオチドの場合、第１の捕捉物質としてのオリゴヌクレオチドの塩基配列は、２０塩基長以上、５０塩基長以下（好ましくは４０塩基長以下、より好ましくは３５塩基長以下）であることが好ましい。この範囲であると、第１の捕捉物質の生体分子に対する特異性を確保しつつ、好ましいハイブリダイゼーション効率を確保することができる。
また複数の配列を使用する場合、正規直交化配列を用いることが好ましい。正規直交化配列とは、核酸の塩基配列であって、その融解温度が均一であるもの、即ち融解温度が一定範囲内に揃うように設計された配列であって、核酸自身が分子内（intramolecular）で構造化して、相補的な配列とのハイブリッド形成を阻害することのない配列であり、尚且つこれに相補的な塩基配列以外とは安定したハイブリッドを形成しない塩基配列を意味する。１つの正規直交化配列群に含まれる配列は、所望の組み合わせ以外の配列間及び自己配列内において反応が生じ難いか、又は反応が生じない。また、正規直交化配列は、ＰＣＲにより増幅させると、たとえば上述のクロスハイブリダイズのような問題に影響されずに、当該正規直交化配列を有する核酸の初期量に応じた量の核酸が定量的に増幅される性質を有している。正規直交化配列については、H．Yoshida and A．Suyama，DIMACS，Vol．54，p．9-20（2000）及び国際公開第２００４／０９２３７６号パンフレットに詳細が記載されている。これらの文献に記載の方法を参照して正規直交化配列を設計することができる。
第１の捕捉物質がオリゴヌクレオチドの場合、第１の捕捉物質としてのオリゴヌクレオチドの塩基配列は、２０塩基長以上、５０塩基長以下（好ましくは４０塩基長以下、より好ましくは３５塩基長以下）であることが好ましい。この範囲であると、第１の捕捉物質の生体分子に対する特異性を確保しつつ、好ましいハイブリダイゼーション効率を確保することができる。
また複数の配列を使用する場合、正規直交化配列を用いることが好ましい。正規直交化配列とは、核酸の塩基配列であって、その融解温度が均一であるもの、即ち融解温度が一定範囲内に揃うように設計された配列であって、核酸自身が分子内（intramolecular）で構造化して、相補的な配列とのハイブリッド形成を阻害することのない配列であり、尚且つこれに相補的な塩基配列以外とは安定したハイブリッドを形成しない塩基配列を意味する。１つの正規直交化配列群に含まれる配列は、所望の組み合わせ以外の配列間及び自己配列内において反応が生じ難いか、又は反応が生じない。また、正規直交化配列は、ＰＣＲにより増幅させると、たとえば上述のクロスハイブリダイズのような問題に影響されずに、当該正規直交化配列を有する核酸の初期量に応じた量の核酸が定量的に増幅される性質を有している。正規直交化配列については、H．Yoshida and A．Suyama，DIMACS，Vol．54，p．9-20（2000）及び国際公開第２００４／０９２３７６号パンフレットに詳細が記載されている。これらの文献に記載の方法を参照して正規直交化配列を設計することができる。
第１の連結物質を介して試験領域に第１の捕捉物質を導入する方法としては特に制限はなく、常法に従って導入することができる。例えば、静電的引力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等によって第１の連結物質と第１の捕捉物質との複合体を形成し、複合体を試験領域に塗布、滴下又は噴霧後、乾燥することにより、第１の連結物質を介して第１の捕捉物質を試験領域に導入することができる。あるいは、架橋剤や縮合剤の化学結合により第１の連結物質と第１の捕捉物質との複合体を形成し、複合体を試験領域に塗布、滴下又は噴霧後、乾燥することにより、第１の連結物質を介して第１の捕捉物質を試験領域に導入することができる。なお、第１の連結物質と第１の捕捉物質とが直接結合して複合体を形成してもよいし、他の物質を介して間接的に第１の連結物質と第１の捕捉物質とが結合して複合体を形成していてもよい。第１の連結物質と第１の捕捉物質との複合体の形成方法については、Nucleic Acids Research，vol．15，p．5275（1987）；Nucleic Acids Research，vol．16，p．3671（1988）などを参考にすることができる。
本発明において、第１の連結物質としてＢＳＡを用い、第１の捕捉物質としてオリゴヌクレオチドを用いる場合、オリゴヌクレオチドの末端にアミノ基、カルボキシル基、チオール基などの官能基を導入し、導入した官能基とＢＳＡの官能基とを縮合反応で結合させることにより、ＢＳＡとオリゴヌクレオチドとの複合体を形成することができる。そして、複合体を試験領域に塗布し乾燥させると、メンブレンに存在する疎水部分にＢＳＡに存在する疎水部分が物理的に吸着することにより、ＢＳＡを介してオリゴヌクレオチドが試験領域に導入される。なお、メンブレンに対するオリゴヌクレオチドの物理的吸着力がＢＳＡに比べて非常に弱いため、ＢＳＡが優先的にメンブレンに固定される。
本発明において、第１の連結物質としてＢＳＡを用い、第１の捕捉物質としてオリゴヌクレオチドを用いる場合、オリゴヌクレオチドの末端にアミノ基、カルボキシル基、チオール基などの官能基を導入し、導入した官能基とＢＳＡの官能基とを縮合反応で結合させることにより、ＢＳＡとオリゴヌクレオチドとの複合体を形成することができる。そして、複合体を試験領域に塗布し乾燥させると、メンブレンに存在する疎水部分にＢＳＡに存在する疎水部分が物理的に吸着することにより、ＢＳＡを介してオリゴヌクレオチドが試験領域に導入される。なお、メンブレンに対するオリゴヌクレオチドの物理的吸着力がＢＳＡに比べて非常に弱いため、ＢＳＡが優先的にメンブレンに固定される。
試験領域における第１の連結物質の結合量に特に制限はなく、適宜設定することができる。例えば、試験領域１ｃｍ2当たりの第１の連結物質の結合量は、０．１μｇ以上１００μｇ以下が好ましく、１μｇ以上２０μｇ以下がより好ましい。
また、試験領域における第１の捕捉物質の導入量に特に制限なく、適宜設定することができる。例えば、第１の連結物質がオリゴヌクレオチドである場合、試験領域１ｃｍ2当たりのオリゴヌクレオチドの導入量は、０．０１μｇ以上１００μｇ以下が好ましく、０．１μｇ以上１０μｇ以下がより好ましい。なお、第１の連結物質の結合量は、第１の連結物質と第１の捕捉物質の複合体のうち第１の連結物質の重量割合から算出することができる。また、第１の捕捉物質の結合量は、第１の連結物質と第１の捕捉物質の複合体のうち第１の捕捉物質の重量割合から算出することができる。
また、試験領域における第１の捕捉物質の導入量に特に制限なく、適宜設定することができる。例えば、第１の連結物質がオリゴヌクレオチドである場合、試験領域１ｃｍ2当たりのオリゴヌクレオチドの導入量は、０．０１μｇ以上１００μｇ以下が好ましく、０．１μｇ以上１０μｇ以下がより好ましい。なお、第１の連結物質の結合量は、第１の連結物質と第１の捕捉物質の複合体のうち第１の連結物質の重量割合から算出することができる。また、第１の捕捉物質の結合量は、第１の連結物質と第１の捕捉物質の複合体のうち第１の捕捉物質の重量割合から算出することができる。
（吸収パッド）
吸収パッド４は、毛細管現象でメンブレン３を移動してきた溶液を吸収し、一定の流れを生じさせるための構成部材である。
吸収パッド４は、毛細管現象でメンブレン３を移動してきた溶液を吸収し、一定の流れを生じさせるための構成部材である。
これら各構成部材の材料としては特に制限は無く、生体分子検出用の試験片に通常用いられる部材が使用できる。例えば、サンプルパッド２としてはGlass Fiber Conjugate Pad（商品名、MILLIPORE社製）等のガラスファイバーのパッドを好ましく用いることができる。メンブレン３としてはHi-Flow Plus180メンブレン（商品名、MILLIPORE社製）等のニトロセルロースメンブレンを好ましく用いることができる。吸収パッド４としてはCellulose Fiber Sample Pad（商品名、MILLIPORE社製）等のセルロースメンブレンを好ましく用いることができる。
前記粘着剤付きバッキングシート５としては、ＡＲ９０２０（商品名、Adhesives Research社製）等が挙げられる。
前記粘着剤付きバッキングシート５としては、ＡＲ９０２０（商品名、Adhesives Research社製）等が挙げられる。
試験片の作製法としては、サンプルパッド２、メンブレン３、吸収パッド４の並び順に、各部材間で毛管現象を生じさせ易くするために、それら各部材の両端と隣接する部材と１〜５ｍｍ程度重ね合わせて（好ましくはバッキングシート５上に）貼付することで、テストストリップ１を作製することができる。
［標識試薬］
本発明の生体分子検出用試験キットに含まれる標識試薬は、蛍光シリカナノ粒子からなる。蛍光シリカナノ粒子を用いることで、着色粒子よりも高感度で生体分子を検出することができる。
本発明の生体分子検出用試験キットに含まれる標識試薬は、蛍光シリカナノ粒子からなる。蛍光シリカナノ粒子を用いることで、着色粒子よりも高感度で生体分子を検出することができる。
本発明で用いる蛍光シリカナノ粒子の調製方法に特に制限はなく、任意のいかなる調製方法によって蛍光シリカナノ粒子を得ることができる。例えば、Journal of Colloid and Interface Science，159，p．150-157（1993）に記載のゾル−ゲル法や、国際公開第２００７／０７４７２２号パンフレットに記載されたコロイドシリカ粒子の調製方法を参照することができる。
具体的に、蛍光材料としての蛍光色素を用いた蛍光シリカナノ粒子の調製例について説明する。
蛍光色素を含有するシリカ粒子は、蛍光色素とシランカップリング剤とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合若しくは吸着させて得られた生成物に１種又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。これによりオルガノシロキサン成分とシロキサン成分とがシロキサン結合してなるシリカ粒子が得られる。１例としては、N-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する又は付加した蛍光色素と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。
蛍光色素を含有するシリカ粒子は、蛍光色素とシランカップリング剤とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合若しくは吸着させて得られた生成物に１種又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。これによりオルガノシロキサン成分とシロキサン成分とがシロキサン結合してなるシリカ粒子が得られる。１例としては、N-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する又は付加した蛍光色素と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。
前記シランカップリング剤としてアミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、シラン化合物としてテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）を用いた場合を下記に例示する。
前記活性基を有する又は付加した前記蛍光色素の具体例として、5-（及び-6）-カルボキシテトラメチルローダミン-NHSエステル（商品名、emp Biotech GmbH社製）や、下記式でそれぞれ表されるDY550-NHSエステル又はDY630-NHSエステル（いずれも商品名、Dyomics GmbH社製）等のＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物を挙げることができる。
前記置換基を有するシランカップリング剤の具体例として、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシラン、N-2（アミノエチル）3-アミノプロピルメチルジメトキシシラン、3-アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。
縮重合させる前記シラン化合物としては特に制限はないが、ＴＥＯＳ、γ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、ＡＰＳ、3-チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、3-イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシランを挙げることができる。中でも、前記シリカ粒子内部のシロキサン成分を形成する観点からはＴＥＯＳが好ましく、前記シリカ粒子内部のオルガノシロキサン成分を形成する観点からはＭＰＳ又はＡＰＳが好ましい。
上述のように調製すると、球状、又は球状に近いシリカ粒子を調製することができる。ここで、「球状に近いシリカ粒子」とは、具体的には長軸と短軸の比が２以下の形状である。
本発明で用いる蛍光シリカナノ粒子の平均粒径に特に制限はないが、２０ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であることが好ましく、２０ｎｍ以上６００ｎｍ以下であることがより好ましく、６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。粒径が小さすぎると、検出感度が低下し、粒径が大きすぎると、生体分子検出用の試験片に用いられる多孔質支持体（メンブレン）の目詰まりの原因となる。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した１００個の標識試薬シリカ粒子の合計の投影面積から蛍光シリカナノ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した蛍光シリカナノ粒子の個数（１００個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
なお、前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子を含む概念の後述する「動的光散乱法による粒度」とは異なり、一次粒子のみからなる粒子の平均粒径である。
所望の平均粒径の蛍光シリカナノ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、または適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清または沈殿のみを回収することで可能である。
本発明で用いる蛍光シリカナノ粒子は粒状物質として単分散であることが好ましい。蛍光シリカナノ粒子の粒度分布の変動係数、いわゆるＣＶ値に特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した１００個の標識試薬シリカ粒子の合計の投影面積から蛍光シリカナノ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した蛍光シリカナノ粒子の個数（１００個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
なお、前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子を含む概念の後述する「動的光散乱法による粒度」とは異なり、一次粒子のみからなる粒子の平均粒径である。
所望の平均粒径の蛍光シリカナノ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、または適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清または沈殿のみを回収することで可能である。
本発明で用いる蛍光シリカナノ粒子は粒状物質として単分散であることが好ましい。蛍光シリカナノ粒子の粒度分布の変動係数、いわゆるＣＶ値に特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
本明細書において、前記「動的光散乱法による粒度」とは、動的光散乱法により測定され、前記の平均粒径とは異なり、一次粒子だけでなく、一次粒子が凝集してなる二次粒子をも含めた概念であり、前記複合粒子の分散安定性を評価する指標となる。
動的光散乱法による粒度の測定装置としては、ゼータサイザーナノ（商品名；マルバーン社製）が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
動的光散乱法による粒度の測定装置としては、ゼータサイザーナノ（商品名；マルバーン社製）が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
本発明で用いる蛍光シリカナノ粒子の表面には、第２の連結物質を介して、生体分子に対する結合性を有する第２の捕捉物質が導入されている。第２の連結物質を介して第２の捕捉物質を導入することで、第２の捕捉物質の蛍光シリカナノ粒子への固定化の効率が向上し、生体分子の検出感度を向上させることができる。
＜第２の連結物質＞
本発明で用いる第２の連結物質に特に制限はなく、適宜選択することができる。本発明で用いる第２の連結物質としては、蛍光シリカナノ粒子と第２の捕捉物質とを連結するために、アミノ基、カルボキシル基、チオール基などの官能基を分子内に２個以上有する物質が好ましい。また前述したように、第１の連結物質と第２の連結物質は、溶液中で互いに吸着しない物質からなる。
第２の連結物質の具体例としては、ＢＳＡ、ＫＬＨ、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンが挙げられる。このうち、ＢＳＡ及びＫＬＨが好ましく、ＢＳＡがより好ましい。
また、前記第１の連結物質と第２の連結物質は同種の物質であることが好ましい。第１の連結物質と第２の連結物質として同種の連結物質を選択することで、これらの連結物質は溶液中で凝集せず好ましい分散状態が維持される。そのため、蛍光シリカナノ粒子に結合した第２の連結物質が試験領域に結合した第１の連結物質と非特異的に吸着して測定誤差を生じることを抑制することができる。その結果、蛍光強度のＳ／Ｎ比が向上し、より高感度かつ高精度の生体分子の検出が可能となる。
本発明で用いる第２の連結物質に特に制限はなく、適宜選択することができる。本発明で用いる第２の連結物質としては、蛍光シリカナノ粒子と第２の捕捉物質とを連結するために、アミノ基、カルボキシル基、チオール基などの官能基を分子内に２個以上有する物質が好ましい。また前述したように、第１の連結物質と第２の連結物質は、溶液中で互いに吸着しない物質からなる。
第２の連結物質の具体例としては、ＢＳＡ、ＫＬＨ、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンが挙げられる。このうち、ＢＳＡ及びＫＬＨが好ましく、ＢＳＡがより好ましい。
また、前記第１の連結物質と第２の連結物質は同種の物質であることが好ましい。第１の連結物質と第２の連結物質として同種の連結物質を選択することで、これらの連結物質は溶液中で凝集せず好ましい分散状態が維持される。そのため、蛍光シリカナノ粒子に結合した第２の連結物質が試験領域に結合した第１の連結物質と非特異的に吸着して測定誤差を生じることを抑制することができる。その結果、蛍光強度のＳ／Ｎ比が向上し、より高感度かつ高精度の生体分子の検出が可能となる。
＜第２の捕捉物質＞
本発明で用いる第２の捕捉物質は、生体分子に対する特異的な結合性を有し、前記試験領域で第１の捕捉物質−生体分子−標識試薬からなる複合体を形成しうるものであれば特に制限はない。
第２の捕捉物質と生体分子の組み合わせの例としては、抗体とその抗原の組み合わせ、抗原とその抗体の組み合わせ、核酸（ＤＮＡやＲＮＡ等）とストリンジェントな条件で該核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの組み合わせ、受容体とそのリガンドの組み合わせ、リガンドとその受容体の組み合わせ、レクチンと糖鎖の組み合わせ、アプタマーと該アプタマーに特異的に結合する分子の組み合わせが挙げられる。
前述のように、本発明は核酸の検出に好適に用いることができる。したがって、第２の捕捉物質はオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
本発明で用いる第２の捕捉物質は、生体分子に対する特異的な結合性を有し、前記試験領域で第１の捕捉物質−生体分子−標識試薬からなる複合体を形成しうるものであれば特に制限はない。
第２の捕捉物質と生体分子の組み合わせの例としては、抗体とその抗原の組み合わせ、抗原とその抗体の組み合わせ、核酸（ＤＮＡやＲＮＡ等）とストリンジェントな条件で該核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの組み合わせ、受容体とそのリガンドの組み合わせ、リガンドとその受容体の組み合わせ、レクチンと糖鎖の組み合わせ、アプタマーと該アプタマーに特異的に結合する分子の組み合わせが挙げられる。
前述のように、本発明は核酸の検出に好適に用いることができる。したがって、第２の捕捉物質はオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
第２の捕捉物質としてオリゴヌクレオチドを用いる場合、生体分子との結合性を考慮して適宜選択することができる。
第２の捕捉物質がオリゴヌクレオチドの場合、第２の捕捉物質としてのオリゴヌクレオチドの塩基配列は、２０塩基長以上、５０塩基長以下（好ましくは４０塩基長以下、より好ましくは３０塩基長以下）であることが好ましい。この範囲であると、第２の捕捉物質の生体分子に対する特異性を確保しつつ、好ましいハイブリダイゼーション効率を確保することができる。
また複数の配列を使用する場合、前述の正規直交化配列を用いることが好ましい。
第２の捕捉物質がオリゴヌクレオチドの場合、第２の捕捉物質としてのオリゴヌクレオチドの塩基配列は、２０塩基長以上、５０塩基長以下（好ましくは４０塩基長以下、より好ましくは３０塩基長以下）であることが好ましい。この範囲であると、第２の捕捉物質の生体分子に対する特異性を確保しつつ、好ましいハイブリダイゼーション効率を確保することができる。
また複数の配列を使用する場合、前述の正規直交化配列を用いることが好ましい。
第２の連結物質を介して蛍光シリカナノ粒子の表面に第２の捕捉物質を導入する方法としては特に制限はなく、常法に従って導入することができる。例えば、静電的引力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等によって第２の連結物質を介して蛍光シリカナノ粒子の表面に第２の捕捉物質を導入させてもよい。あるいは、架橋剤や縮合剤の化学結合によって、第２の連結物質を介して蛍光シリカナノ粒子の表面に第２の捕捉物質を導入させてもよい。また、蛍光シリカナノ粒子の表面に導入する第２の捕捉物質を導入したときに蛍光シリカナノ粒子同士が凝集する場合は、予め交互吸着法によって蛍光シリカナノ粒子の表面に表面処理を施しておいてもよい。
以下、第２の捕捉物質としてオリゴヌクレオチドを用い、第２の連結物質としてＢＳＡを用いて本発明で用いる蛍光シリカナノ粒子を調製する方法について説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
まず、反応性官能基を有するシランカップリング剤を加水分解し、加水分解されたシランカップリング剤と蛍光シリカナノ粒子の表面に存在するヒドロキシル基とを縮重合させ、反応性官能基を蛍光シリカナノ粒子の表面に導入する。
反応性官能基を有するシランカップリング剤の具体例としては、3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン、ＭＰＳ、ＡＰＳ、3-チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、3-イソチオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリエトキシシラン、（-クロロプロピルトリメトキシシラン、ビニルメトキシシラン、3-メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、3-アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、N-フェニル-3-アミノプロピルトリメトキシシラン、3-ウレイドプロピルトリエトキシシラン、ビス（トリエトキシシリルプロピル）テトラスルフィドが挙げられる。
反応性官能基を有するシランカップリング剤の具体例としては、3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン、ＭＰＳ、ＡＰＳ、3-チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、3-イソチオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリエトキシシラン、（-クロロプロピルトリメトキシシラン、ビニルメトキシシラン、3-メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、3-アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、N-フェニル-3-アミノプロピルトリメトキシシラン、3-ウレイドプロピルトリエトキシシラン、ビス（トリエトキシシリルプロピル）テトラスルフィドが挙げられる。
反応性官能基としてはチオール基、アミノ基、カルボキシル基、ハロゲン基、ビニル基、エポキシ基及びイソシアネート基から選ばれる少なくとも１種の反応性官能基が好ましく、チオール基がより好ましい。
反応性官能基がチオール基である場合は、蛍光シリカナノ粒子表面におけるチオール基の密度は０．００２〜０．２個／ｎｍ2が好ましく、０．００２〜０．１個／ｎｍ2がより好ましい。当該含色素シリカ粒子の表面に存在するチオール基の量Ｂは、ＤＮＴＢ（5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)）を試薬として用いて測定することができる。ＤＮＴＢを用いたチオール基の定量法としては、例えば、Archives of Biochemistry and Biophysics, 82, 70(1959)の方法で行うことができる。具体的な方法の一例としては、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した１０ｍＭのＤＮＴＢの溶液２０μＬと、２００ｍｇ／ｍＬに調製したシリカ粒子コロイド２．５ｍＬとを混合し、１時間後に４１２ｎｍの吸光度を測定し、標準物質としてγ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）を用いて作成した検量線から粒子表面に存在するチオール基量を定量することができる。
反応性官能基がチオール基である場合は、蛍光シリカナノ粒子表面におけるチオール基の密度は０．００２〜０．２個／ｎｍ2が好ましく、０．００２〜０．１個／ｎｍ2がより好ましい。当該含色素シリカ粒子の表面に存在するチオール基の量Ｂは、ＤＮＴＢ（5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)）を試薬として用いて測定することができる。ＤＮＴＢを用いたチオール基の定量法としては、例えば、Archives of Biochemistry and Biophysics, 82, 70(1959)の方法で行うことができる。具体的な方法の一例としては、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した１０ｍＭのＤＮＴＢの溶液２０μＬと、２００ｍｇ／ｍＬに調製したシリカ粒子コロイド２．５ｍＬとを混合し、１時間後に４１２ｎｍの吸光度を測定し、標準物質としてγ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）を用いて作成した検量線から粒子表面に存在するチオール基量を定量することができる。
蛍光シリカナノ粒子の表面に導入した反応性官能基と、これと化学結合を形成するリンカー分子とを反応させる。そして、リンカー分子とＢＳＡとを結合させ、蛍光シリカナノ粒子とＢＳＡとの複合体を形成する。
反応性官能基がチオール基である場合は、チオール基が導入された蛍光シリカナノ粒子と、マレイミド基及びカルボキシル基を有するリンカー分子とを非プロトン性溶媒中に共存させる。これにより、チオール基とマレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した粒子を作製する。続いて、リンカー分子が結合した粒子と、カルボジイミドと、アミノ基を有するＢＳＡとを水系溶媒中に共存させる。これにより、カルボジイミドにより活性エステル化されたリンカー分子のカルボキシル基と、ＢＳＡが有するアミノ基との間でアミド結合を形成させ、蛍光シリカナノ粒子とＢＳＡとの複合体を形成する。
反応性官能基がアミノ基、カルボキシル基、ビニル基、エポキシ基、イソシアネート基である場合も、常法によりＢＳＡと蛍光シリカナノ粒子との複合体を形成することができる。これらの方法は、例えば、特開２００９−２７４９２３号公報、特開２００９−１６２５３７号公報、特開２０１０−１００５４２号公報等の記載を参照することができる。
反応性官能基がチオール基である場合は、チオール基が導入された蛍光シリカナノ粒子と、マレイミド基及びカルボキシル基を有するリンカー分子とを非プロトン性溶媒中に共存させる。これにより、チオール基とマレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した粒子を作製する。続いて、リンカー分子が結合した粒子と、カルボジイミドと、アミノ基を有するＢＳＡとを水系溶媒中に共存させる。これにより、カルボジイミドにより活性エステル化されたリンカー分子のカルボキシル基と、ＢＳＡが有するアミノ基との間でアミド結合を形成させ、蛍光シリカナノ粒子とＢＳＡとの複合体を形成する。
反応性官能基がアミノ基、カルボキシル基、ビニル基、エポキシ基、イソシアネート基である場合も、常法によりＢＳＡと蛍光シリカナノ粒子との複合体を形成することができる。これらの方法は、例えば、特開２００９−２７４９２３号公報、特開２００９−１６２５３７号公報、特開２０１０−１００５４２号公報等の記載を参照することができる。
そして、蛍光シリカナノ粒子に結合するＢＳＡと、第２の捕捉物質としてのオリゴヌクレオチドとを常法に従って結合させる。例えば、静電的引力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等によってＢＳＡとオリゴヌクレオチドとを結合させることができる。あるいは、架橋剤や縮合剤の化学結合によりＢＳＡとオリゴヌクレオチドとを結合させることができる。なお、ＢＳＡとオリゴヌクレオチドとが直接結合して複合体を形成してもよいし、他の物質を介して間接的にＢＳＡとオリゴヌクレオチドとが結合して複合体を形成していてもよい。ＢＳＡとオリゴヌクレオチドとの結合方法については、Nucleic Acids Research，vol．15，p．5275（1987）；Nucleic Acids Research，vol．16，p．3671（1988）などを参考にすることができる。
蛍光シリカナノ粒子における第２の連結物質の結合量に特に制限なく、適宜設定することができる。例えば、蛍光シリカナノ粒子１ｇ当たりの第２の連結物質の結合量は、１ｍｇ以上２００ｍｇ以下が好ましく、１０ｍｇ以上５０ｍｇ以下が好ましい。なお、蛍光シリカナノ粒子における第２の連結物質の結合量は、通常のタンパク定量法により確認することができる。
また、蛍光シリカナノ粒子の表面における第２の捕捉物質の導入量に特に制限なく、適宜設定することができる。例えば、第２の連結物質がオリゴヌクレオチドである場合、蛍光シリカナノ粒子の表面１ｎｍ2当たりのオリゴヌクレオチドの導入量は、０．０００１個以上０．１個以下が好ましく、０．００１個以上０．０５個以下が好ましい。なお、蛍光シリカナノ粒子の表面におけるオリゴヌクレオチドの導入量は、蛍光シリカナノ粒子に結合した第２の連結物質の量と、第２の連結物質とオリゴヌクレオチドとの複合体のうちオリゴヌクレオチドの重量割合から算出することができる。
また、蛍光シリカナノ粒子の表面における第２の捕捉物質の導入量に特に制限なく、適宜設定することができる。例えば、第２の連結物質がオリゴヌクレオチドである場合、蛍光シリカナノ粒子の表面１ｎｍ2当たりのオリゴヌクレオチドの導入量は、０．０００１個以上０．１個以下が好ましく、０．００１個以上０．０５個以下が好ましい。なお、蛍光シリカナノ粒子の表面におけるオリゴヌクレオチドの導入量は、蛍光シリカナノ粒子に結合した第２の連結物質の量と、第２の連結物質とオリゴヌクレオチドとの複合体のうちオリゴヌクレオチドの重量割合から算出することができる。
［生体分子の検出方法］
次に、上記構成の生体分子検出用の試験片と蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬を有する生体分子検出用試験キットを用いた生体分子の検出方法について、好ましい実施態様に基づいて説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
次に、上記構成の生体分子検出用の試験片と蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬を有する生体分子検出用試験キットを用いた生体分子の検出方法について、好ましい実施態様に基づいて説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
まず、第１の捕捉物質に対する結合性を有する物質と、第２の捕捉物質に対する結合性を有する物質それぞれを、生体分子に予め付与する。生体分子が核酸であり、第１及び第２の捕捉物質がそれぞれオリゴヌクレオチドである場合、各オリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、本明細書において「タグ配列」ともいう）を生体分子である核酸に付与することが好ましい。生体分子にタグ配列を付与する方法については特に制限はなく、特開２０１３−５９３１９号公報、特開２０１３−５９３２０号公報、特開２０１３−５９３２１号公報などを参考とすることができる。
つぎに、タグ配列が付与された生体分子を含有しうる液体試料と本発明の標識試薬との混合物を、本発明の試験片１のサンプルパッド２に滴下する。サンプルパッド２に滴下する液体試料の量は、試験片の構成に合わせて適宜調節することができる。
そして、毛細管現象によりサンプルパッド２からメンブレン３に移動してきた生体分子と蛍光シリカナノ粒子との複合体が、試験片１の試験領域（テストライン）上に導入された第１の捕捉物質との結合により濃縮される。この濃縮された複合体の蛍光シリカナノ粒子に含まれる色素の蛍光を検出することで、生体分子を検出することができる。
色素の蛍光の検出方法に特に制限はなく、目視で検出してもよいし、汎用の蛍光検出器を用いて検出してもよい。
汎用の蛍光検出器は、励起光源及びフィルタからなる。前記励起光源としては水銀ランプ、ハロゲンランプ、キセノンランプ、レーザダイオード、発光ダイオードなどが挙げられる。前記フィルタは、励起光源から特定の波長の光のみを透過するフィルタであり、前記蛍光微粒子の蛍光波長、蛍光波長から適宜選択する。前記蛍光検出器は、蛍光を受光する光電子倍増管又はＣＣＤ検出器を備えていてもよい。これにより目視では確認できない強度ないしは波長の蛍光も検出でき、さらにはその蛍光強度を測定できる。
照射する励起光の波長は特に限定されないが、３００ｎｍ以上が好ましく、４００ｎｍ以上がより好ましく、５００ｎｍ以上が特に好ましい。また、７００ｎｍ以下が好ましく、６００ｎｍ以下がより好ましく、５５０ｎｍ以下が特に好ましい。
蛍光の波長は３５０ｎｍ以上が好ましく、４５０ｎｍ以上がより好ましく、５３０ｎｍ以上が特に好ましい。また、８００ｎｍ以下が好ましく、７５０ｎｍ以下がより好ましく、５８０ｎｍ以下が特に好ましい。
汎用の蛍光検出器は、励起光源及びフィルタからなる。前記励起光源としては水銀ランプ、ハロゲンランプ、キセノンランプ、レーザダイオード、発光ダイオードなどが挙げられる。前記フィルタは、励起光源から特定の波長の光のみを透過するフィルタであり、前記蛍光微粒子の蛍光波長、蛍光波長から適宜選択する。前記蛍光検出器は、蛍光を受光する光電子倍増管又はＣＣＤ検出器を備えていてもよい。これにより目視では確認できない強度ないしは波長の蛍光も検出でき、さらにはその蛍光強度を測定できる。
照射する励起光の波長は特に限定されないが、３００ｎｍ以上が好ましく、４００ｎｍ以上がより好ましく、５００ｎｍ以上が特に好ましい。また、７００ｎｍ以下が好ましく、６００ｎｍ以下がより好ましく、５５０ｎｍ以下が特に好ましい。
蛍光の波長は３５０ｎｍ以上が好ましく、４５０ｎｍ以上がより好ましく、５３０ｎｍ以上が特に好ましい。また、８００ｎｍ以下が好ましく、７５０ｎｍ以下がより好ましく、５８０ｎｍ以下が特に好ましい。
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
（調製例１）第２の連結物質を介して第２の捕捉物質が導入された蛍光シリカナノ粒子の調製
（１）蛍光シリカナノ粒子の調製
蛍光分子であるカルボキシローダミン６Ｇを含有する蛍光シリカナノ粒子を以下の方法で調製した。
5-（及び-6）-カルボキシローダミン６Ｇ・スクシンイミジルエステル（商品名、emp Biotech GmbＨ社製）３１ｍｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬに溶解した。これにＡＰＳ（信越シリコーン社製）１２μＬを加え室温（２３℃）で１時間反応を行い、5-（及び-6）-カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ複合体（５ｍＭ）を得た。
（１）蛍光シリカナノ粒子の調製
蛍光分子であるカルボキシローダミン６Ｇを含有する蛍光シリカナノ粒子を以下の方法で調製した。
5-（及び-6）-カルボキシローダミン６Ｇ・スクシンイミジルエステル（商品名、emp Biotech GmbＨ社製）３１ｍｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍＬに溶解した。これにＡＰＳ（信越シリコーン社製）１２μＬを加え室温（２３℃）で１時間反応を行い、5-（及び-6）-カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ複合体（５ｍＭ）を得た。
得られた5-（及び-6）-カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ複合体の溶液６００μＬと、エタノール１４０ｍＬ、ＴＥＯＳ（信越シリコーン社製）６．５ｍＬ、蒸留水２０ｍＬ及び２８質量％アンモニア水１５ｍＬを混合し、室温で２４時間反応を行った。
反応終了後１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿した粒子に蒸留水４ｍＬを加え粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去した。その結果、平均粒径２７１ｎｍの蛍光分子を含有する蛍光シリカナノ粒子１．６５ｇを得た（収率約９４％）。
反応終了後１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿した粒子に蒸留水４ｍＬを加え粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去した。その結果、平均粒径２７１ｎｍの蛍光分子を含有する蛍光シリカナノ粒子１．６５ｇを得た（収率約９４％）。
（２）蛍光分子を含有する蛍光シリカナノ粒子へのチオール基の導入
上記で得た蛍光分子を含有する蛍光シリカナノ粒子１ｇを水／エタノール＝１／４の混合液１５０ｍＬに分散させた。これにＭＰＳ（和光純薬社製）１．５ｍＬを加えた。続いて２８％アンモニア水２０ｍＬを加え、室温で４時間混合した。
上記で得た蛍光分子を含有する蛍光シリカナノ粒子１ｇを水／エタノール＝１／４の混合液１５０ｍＬに分散させた。これにＭＰＳ（和光純薬社製）１．５ｍＬを加えた。続いて２８％アンモニア水２０ｍＬを加え、室温で４時間混合した。
反応終了後１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿した蛍光シリカナノ粒子に蒸留水１０ｍＬを加え蛍光シリカナノ粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、分散液に含まれる未反応のＭＰＳやアンモニア等を除去した。その結果、チオール基が導入された蛍光シリカナノ粒子（以下、「チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ」と呼ぶ。）を得た。
得られたチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ ５００ｍｇについて、ＤＮＴＢを用いて導入されたチオール基の定量分析を行った。その結果、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａの粒子表面のチオール基の密度は、０．０４６個／ｎｍ２であった。
得られたチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ ５００ｍｇについて、ＤＮＴＢを用いて導入されたチオール基の定量分析を行った。その結果、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａの粒子表面のチオール基の密度は、０．０４６個／ｎｍ２であった。
（３）チオール基を介した蛍光シリカナノ粒子とＢＳＡとの結合
以下の方法により、チオール基を介して、前記チオール基導入蛍光シリカナノ粒子ＡとＢＳＡとを結合させた。
チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａの分散液（濃度２５ｍｇ／ｍＬ、分散媒：蒸留水）８０μＬにＤＭＦ４２０μＬを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μＬ加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦ５００μＬを加えチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを分散させた。これにリンカー分子として3-マレイミド安息香酸１ｍｇを加え３０分混合した。このようにして、前記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａのチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
以下の方法により、チオール基を介して、前記チオール基導入蛍光シリカナノ粒子ＡとＢＳＡとを結合させた。
チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａの分散液（濃度２５ｍｇ／ｍＬ、分散媒：蒸留水）８０μＬにＤＭＦ４２０μＬを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μＬ加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦ５００μＬを加えチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを分散させた。これにリンカー分子として3-マレイミド安息香酸１ｍｇを加え３０分混合した。このようにして、前記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａのチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
この反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去後、蒸留水８８．６μＬを加え粒子を分散させた。続いて、０．５Ｍ ＭＥＳ（2-モルホリノエタンスルホン酸)（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ（N-ヒドロキシスクシンイミド）２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）７５μＬを加え混合した。これにＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ、Sigma Aldrich社製）を６．０μＬ加え、６０分間混合した。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。これに１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。これに１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
得られたコロイド２００μＬをサンプルとして、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａに結合したＢＳＡの定量を行った。ＢＳＡの定量には、PierceBCA Protein Assay Kit（商品名、Thermo Fisher Scientific社製）を用いた。
その結果、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ１ｇあたりのＢＳＡの結合量は、１４．６ｍｇであった。
その結果、チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ１ｇあたりのＢＳＡの結合量は、１４．６ｍｇであった。
（４）ＢＳＡを介した蛍光シリカナノ粒子とオリゴヌクレオチドとの結合
ＢＳＡ定量後に残ったコロイド２００μＬを１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。これに１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）５００μＬを加え、粒子を分散させた。分散液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。続いて蒸留水を７４．６μＬ加え粒子を分散させた。さらに０．５Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ７５μＬを加え、よく混合した。
これに合成時に3’末端にアミノ基を導入したアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ（配列（Ａ）、5'-CCGTGTCCACTCTAGAAAAACCT-3'、配列番号１、１ｍｇ／ｍＬ）２０μＬを加え、６０分間混合した。このようにして、BSAの有するカルボキシル基とオリゴヌクレオチドの末端に導入したアミノ基との間で、縮合剤（ＥＤＣ）によりアミド結合を形成した。
ＢＳＡ定量後に残ったコロイド２００μＬを１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。これに１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）５００μＬを加え、粒子を分散させた。分散液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。続いて蒸留水を７４．６μＬ加え粒子を分散させた。さらに０．５Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ７５μＬを加え、よく混合した。
これに合成時に3’末端にアミノ基を導入したアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ（配列（Ａ）、5'-CCGTGTCCACTCTAGAAAAACCT-3'、配列番号１、１ｍｇ／ｍＬ）２０μＬを加え、６０分間混合した。このようにして、BSAの有するカルボキシル基とオリゴヌクレオチドの末端に導入したアミノ基との間で、縮合剤（ＥＤＣ）によりアミド結合を形成した。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を回収した。
回収した上清液を用いてアガロース電気泳動を行い、バンドの蛍光強度からオリゴヌクレオチドの密度を測定した。その結果、初期濃度からの減少分である２．８μｇがシリカ粒子に結合したことが分かった。これをチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ１ｎｍ2当たりで計算すると、蛍光シリカナノ粒子の表面１ｎｍ2当たりのオリゴヌクレオチドの結合量は、０．０２１個であった。
上清を回収した後の粒子の沈降物に１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。続いてHEPES（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethane sulfonic acid）（同仁化学研究所社製）緩衝液４００μＬを加え粒子を分散させて、ＢＳＡを介してオリゴヌクレオチドが結合した蛍光シリカナノ粒子のコロイドを得た。
回収した上清液を用いてアガロース電気泳動を行い、バンドの蛍光強度からオリゴヌクレオチドの密度を測定した。その結果、初期濃度からの減少分である２．８μｇがシリカ粒子に結合したことが分かった。これをチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａ１ｎｍ2当たりで計算すると、蛍光シリカナノ粒子の表面１ｎｍ2当たりのオリゴヌクレオチドの結合量は、０．０２１個であった。
上清を回収した後の粒子の沈降物に１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。続いてHEPES（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethane sulfonic acid）（同仁化学研究所社製）緩衝液４００μＬを加え粒子を分散させて、ＢＳＡを介してオリゴヌクレオチドが結合した蛍光シリカナノ粒子のコロイドを得た。
（調製例２）オリゴヌクレオチドが結合する金ナノ粒子の調製
金コロイド（平均粒径：４０ｎｍ、田中貴金属社製）９００μＬに１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液１００μＬを加え、金ナノ粒子にＢＳＡを吸着させた。なお、金コロイド粒子１ｇあたりのＢＳＡの結合量は、７３ｍｇであった。
続いて上記コロイドを１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。これに、１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）を５００μＬ加え、粒子を分散させた。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。続いて蒸留水７４．６μＬを加え粒子を分散させた。さらに０．５Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ ７５μＬを加えよく混合した。
これに合成時に3’末端にアミノ基を導入したアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ（配列（Ａ）、5'-CCGTGTCCACTCTAGAAAAACCT-3'、配列番号１、１ｍｇ／ｍＬ）２０μＬを加え、６０分間混合した。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。これに１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。続いてHEPES（同仁化学研究所社製）緩衝液４００μＬを加え粒子を分散させて、オリゴヌクレオチドが結合した金ナノ粒子のコロイドを得た。なお、オリゴヌクレオチドの導入量は、金コロイド粒子の表面１ｎｍ2当たり０．０２４個であった。
金コロイド（平均粒径：４０ｎｍ、田中貴金属社製）９００μＬに１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液１００μＬを加え、金ナノ粒子にＢＳＡを吸着させた。なお、金コロイド粒子１ｇあたりのＢＳＡの結合量は、７３ｍｇであった。
続いて上記コロイドを１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。これに、１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）を５００μＬ加え、粒子を分散させた。１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。続いて蒸留水７４．６μＬを加え粒子を分散させた。さらに０．５Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ ７５μＬを加えよく混合した。
これに合成時に3’末端にアミノ基を導入したアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ（配列（Ａ）、5'-CCGTGTCCACTCTAGAAAAACCT-3'、配列番号１、１ｍｇ／ｍＬ）２０μＬを加え、６０分間混合した。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。これに１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。続いてHEPES（同仁化学研究所社製）緩衝液４００μＬを加え粒子を分散させて、オリゴヌクレオチドが結合した金ナノ粒子のコロイドを得た。なお、オリゴヌクレオチドの導入量は、金コロイド粒子の表面１ｎｍ2当たり０．０２４個であった。
（調製例３）オリゴヌクレオチドが連結物質を介さずに結合する蛍光シリカナノ粒子の調製
下記の方法により、調製例１で用いたチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａにオリゴヌクレオチドを直接結合させた。
チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａの分散液（濃度２５ｍｇ／ｍＬ、分散媒：蒸留水）４０μＬにＤＭＦ４６０μＬを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μＬ加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦを５００μＬ加えチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを分散させた。これにリンカー分子として3-マレイミド安息香酸を１ｍｇ加え３０分混合した。このようにして、前記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａのチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
この反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去後、１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）５００μＬを加え粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し上清を除去した。続いて蒸留水７４．６μＬを加え粒子を分散させた。さらに０．５Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ７５μＬを加えよく混合した。
これに合成時に3’末端にアミノ基を導入したアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ（配列（Ａ）、5'-CCGTGTCCACTCTAGAAAAACCT-3'、配列番号１、１ｍｇ／ｍＬ）２０μＬを加え、６０分間混合した。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。続いてHEPES（同仁化学研究所社製）緩衝液４００μＬを加え粒子を分散させて、オリゴヌクレオチドが直接結合した蛍光シリカナノ粒子のコロイドを得た。なお、オリゴヌクレオチドの導入量は、蛍光シリカナノ粒子の表面１ｎｍ2当たり０．０１３個であった。
下記の方法により、調製例１で用いたチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａにオリゴヌクレオチドを直接結合させた。
チオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａの分散液（濃度２５ｍｇ／ｍＬ、分散媒：蒸留水）４０μＬにＤＭＦ４６０μＬを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦを５００μＬ加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦを５００μＬ加えチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａを分散させた。これにリンカー分子として3-マレイミド安息香酸を１ｍｇ加え３０分混合した。このようにして、前記リンカー分子のマレイミド基とチオール基導入蛍光シリカナノ粒子Ａのチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
この反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去後、１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）５００μＬを加え粒子を分散させ、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し上清を除去した。続いて蒸留水７４．６μＬを加え粒子を分散させた。さらに０．５Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ７５μＬを加えよく混合した。
これに合成時に3’末端にアミノ基を導入したアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ（配列（Ａ）、5'-CCGTGTCCACTCTAGAAAAACCT-3'、配列番号１、１ｍｇ／ｍＬ）２０μＬを加え、６０分間混合した。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。続いてHEPES（同仁化学研究所社製）緩衝液４００μＬを加え粒子を分散させて、オリゴヌクレオチドが直接結合した蛍光シリカナノ粒子のコロイドを得た。なお、オリゴヌクレオチドの導入量は、蛍光シリカナノ粒子の表面１ｎｍ2当たり０．０１３個であった。
（調製例４）第１の連結物質を介して第１の捕捉物質を導入した生体分子検出用メンブレンの作製
（１）オリゴヌクレオチドとＢＳＡとの結合
ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ、Sigma Aldrich社製）２００μＬに、蒸留水２９４．６μＬ、合成時に3’末端にアミノ基を導入したアミノ基含有オリゴヌクレオチド（配列（Ｂ）、5'-TGTTCTCTGACCAATGAATCTGC-3'、配列番号２、１ｍｇ／ｍＬ、）５０μＬ、０．５Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ ７５μＬを加え６０分間混合した。オリゴヌクレオチドとＢＳＡとの前記混合液についてアガロース電気泳動を行い、バンドの蛍光強度からＢＳＡに未結合のオリゴヌクレオチドの濃度を測定し、初期濃度との差からＢＳＡに結合したオリゴヌクレオチドの量を算出した。そして、混合液を限外濾過し、未反応のオリゴヌクレオチド、ＮＨＳ、ＥＤＣ等を除去した。このようにして、オリゴヌクレオチドが結合したＢＳＡの溶液（１ｍｇ／ｍＬ、溶媒：５０ｍＭリン酸バッファー（ｐH７．０））を調製した。
同様に、合成時に3’末端にアミノ基を導入したアミノ基含有オリゴヌクレオチド（配列（Ｃ）、5'-TGGAACTGGGAACGCTTTAGATG-3'、配列番号３）が結合したＢＳＡの溶液（１ｍｇ／ｍＬ、溶媒：５０ｍＭリン酸バッファー（ｐH７．０））を調製した。
（１）オリゴヌクレオチドとＢＳＡとの結合
ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ、Sigma Aldrich社製）２００μＬに、蒸留水２９４．６μＬ、合成時に3’末端にアミノ基を導入したアミノ基含有オリゴヌクレオチド（配列（Ｂ）、5'-TGTTCTCTGACCAATGAATCTGC-3'、配列番号２、１ｍｇ／ｍＬ、）５０μＬ、０．５Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＮＨＳ ２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ ７５μＬを加え６０分間混合した。オリゴヌクレオチドとＢＳＡとの前記混合液についてアガロース電気泳動を行い、バンドの蛍光強度からＢＳＡに未結合のオリゴヌクレオチドの濃度を測定し、初期濃度との差からＢＳＡに結合したオリゴヌクレオチドの量を算出した。そして、混合液を限外濾過し、未反応のオリゴヌクレオチド、ＮＨＳ、ＥＤＣ等を除去した。このようにして、オリゴヌクレオチドが結合したＢＳＡの溶液（１ｍｇ／ｍＬ、溶媒：５０ｍＭリン酸バッファー（ｐH７．０））を調製した。
同様に、合成時に3’末端にアミノ基を導入したアミノ基含有オリゴヌクレオチド（配列（Ｃ）、5'-TGGAACTGGGAACGCTTTAGATG-3'、配列番号３）が結合したＢＳＡの溶液（１ｍｇ／ｍＬ、溶媒：５０ｍＭリン酸バッファー（ｐH７．０））を調製した。
（２）オリゴヌクレオチドが結合したＢＳＡのメンブレンへの固定化
メンブレン（丈２５ｍｍ、商品名：Hi-Flow Plus180 メンブレン、MILLIPORE社製）３の端から約６ｍｍの位置に、幅約１ｍｍの第１の試験領域（テストライン）２０として、配列２のオリゴヌクレオチドが結合したＢＳＡを１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０）＋２％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。また、メンブレン３の端から約１０ｍｍの位置に、幅約１ｍｍの第２の試験領域（テストライン）２１として、配列３のオリゴヌクレオチドが結合したＢＳＡを１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０）＋２％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。このようにして、メンブレン３の試験領域２０及び２１上にＢＳＡを介して２種のオリゴヌクレオチドを固定化させた。
なお、試験領域１ｃｍ2当たりのＢＳＡの結合量は、１０．５μｇであった。また、試験領域１ｃｍ2当たりのオリゴヌクレオチドの導入量は、それぞれ２．１μｇであった。また、ＢＳＡとオリゴヌクレオチドの複合体は、ほぼ全て前記試験領域２０及び２１に固定させた。
メンブレン（丈２５ｍｍ、商品名：Hi-Flow Plus180 メンブレン、MILLIPORE社製）３の端から約６ｍｍの位置に、幅約１ｍｍの第１の試験領域（テストライン）２０として、配列２のオリゴヌクレオチドが結合したＢＳＡを１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０）＋２％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。また、メンブレン３の端から約１０ｍｍの位置に、幅約１ｍｍの第２の試験領域（テストライン）２１として、配列３のオリゴヌクレオチドが結合したＢＳＡを１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０）＋２％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。このようにして、メンブレン３の試験領域２０及び２１上にＢＳＡを介して２種のオリゴヌクレオチドを固定化させた。
なお、試験領域１ｃｍ2当たりのＢＳＡの結合量は、１０．５μｇであった。また、試験領域１ｃｍ2当たりのオリゴヌクレオチドの導入量は、それぞれ２．１μｇであった。また、ＢＳＡとオリゴヌクレオチドの複合体は、ほぼ全て前記試験領域２０及び２１に固定させた。
（調製例５）オリゴヌクレオチドを直接固定化した生体分子検出用メンブレンの作製
メンブレン３（丈２５ｍｍ、商品名：Hi-Flow Plus180 メンブレン、MILLIPORE社製）の端から約６ｍｍの位置に、幅約１ｍｍの第１の試験領域（テストライン）２０として、合成時に3’末端にアミノ基を導入したアミノ基含有オリゴヌクレオチド（配列（Ｂ）、5'-TGTTCTCTGACCAATGAATCTGC-3'、配列番号２）を１ｍｇ／ｍＬで含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０）＋２％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。同様に端から約１０ｍｍの位置に、幅約１ｍｍの第２の試験領域（テストライン）２１として、合成時に3’末端にアミノ基を導入したアミノ基含有オリゴヌクレオチド（配列（Ｃ）、5'-TGGAACTGGGAACGCTTTAGATG-3'、配列番号３）を１ｍｇ／ｍＬで含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０）＋２％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。その後UV照射装置で約400mJ／cm2の紫外線光を照射し、メンブレン３の試験領域２０及び２１上に２種のオリゴヌクレオチドを直接固定化させた。
なお、試験領域１ｃｍ2当たりのオリゴヌクレオチドの導入量は、それぞれ１０．１μｇであった。
メンブレン３（丈２５ｍｍ、商品名：Hi-Flow Plus180 メンブレン、MILLIPORE社製）の端から約６ｍｍの位置に、幅約１ｍｍの第１の試験領域（テストライン）２０として、合成時に3’末端にアミノ基を導入したアミノ基含有オリゴヌクレオチド（配列（Ｂ）、5'-TGTTCTCTGACCAATGAATCTGC-3'、配列番号２）を１ｍｇ／ｍＬで含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０）＋２％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。同様に端から約１０ｍｍの位置に、幅約１ｍｍの第２の試験領域（テストライン）２１として、合成時に3’末端にアミノ基を導入したアミノ基含有オリゴヌクレオチド（配列（Ｃ）、5'-TGGAACTGGGAACGCTTTAGATG-3'、配列番号３）を１ｍｇ／ｍＬで含有する溶液（（５０ｍＭＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０）＋２％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。その後UV照射装置で約400mJ／cm2の紫外線光を照射し、メンブレン３の試験領域２０及び２１上に２種のオリゴヌクレオチドを直接固定化させた。
なお、試験領域１ｃｍ2当たりのオリゴヌクレオチドの導入量は、それぞれ１０．１μｇであった。
（調製例６）調製例４で作成した生体分子検出用メンブレンを用いた生体分子検出用テストストリップの作製
サンプルパッド（商品名：Glass Fiber Conjugate Pad（ＧＦＣＰ）、MILLIPORE社製）２、調製例４で作成した生体分子検出用メンブレン３、及び吸収パッド（商品名：Cellulose Fiber Sample Pad（ＣＦＳＰ）、MILLIPORE社製）４の順で、バッキングシート（商品名：AR9020、Adhesives Research社製）５上で組み立てた。続いて、５ｍｍ幅、長さ６０ｍｍのストリップ状に切断し、生体分子検出用テストストリップ１を作製した。
サンプルパッド（商品名：Glass Fiber Conjugate Pad（ＧＦＣＰ）、MILLIPORE社製）２、調製例４で作成した生体分子検出用メンブレン３、及び吸収パッド（商品名：Cellulose Fiber Sample Pad（ＣＦＳＰ）、MILLIPORE社製）４の順で、バッキングシート（商品名：AR9020、Adhesives Research社製）５上で組み立てた。続いて、５ｍｍ幅、長さ６０ｍｍのストリップ状に切断し、生体分子検出用テストストリップ１を作製した。
（調製例７）調製例５で作成した生体分子検出用メンブレンを用いた生体分子検出用テストストリップの作製
調製例４で作成した生体分子検出用メンブレンを調製例５で作成した生体分子検出用メンブレンに代えた以外は、調製例６と同様にして生体分子検出用テストストリップ１を作製した。
調製例４で作成した生体分子検出用メンブレンを調製例５で作成した生体分子検出用メンブレンに代えた以外は、調製例６と同様にして生体分子検出用テストストリップ１を作製した。
（試験例）ＤＮＡの検出
ヒト由来のゲノムＤＮＡを用い、下記プライマー（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
ここでプライマー（Ｄ）及び（Ｅ）の構造は、前記シリカ粒子又は金粒子を標識したオリゴヌクレオチド（配列（Ａ））と相補的な配列を有する部分と、プロピレン鎖からなる下記に示すスペーサーＸと、ヒトゲノムの標的ＤＮＡの一部と相補的な配列を有する部分から構成される。
また、プライマー（Ｆ）の構造は、メンブレン３に第１の試験領域２０として固定したオリゴヌクレオチド（配列（Ｂ））と相補的な配列を有する部分と、プロピレン鎖からなる下記に示すスペーサーＸと、ヒトゲノムの標的ＤＮＡの一部と相補的な配列を有する部分から構成される。
また、プライマー（Ｇ）の構造は、メンブレン３に第２の試験領域２１として固定したオリゴヌクレオチド（配列（Ｃ））と相補的な配列を有する部分と、プロピレン鎖からなる下記に示すスペーサーＸと、ヒトゲノムの標的ＤＮＡの一部と相補的な配列を有する部分から構成される。
これらのプライマーは、通常のオリゴヌクレオチド合成法により作成した。なお、プロピレン鎖からなるスペーサー部分は、下記に示すスペーサーＸを試薬として用いて、通常のオリゴヌクレオチド合成法により導入した。
ヒト由来のゲノムＤＮＡを用い、下記プライマー（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
ここでプライマー（Ｄ）及び（Ｅ）の構造は、前記シリカ粒子又は金粒子を標識したオリゴヌクレオチド（配列（Ａ））と相補的な配列を有する部分と、プロピレン鎖からなる下記に示すスペーサーＸと、ヒトゲノムの標的ＤＮＡの一部と相補的な配列を有する部分から構成される。
また、プライマー（Ｆ）の構造は、メンブレン３に第１の試験領域２０として固定したオリゴヌクレオチド（配列（Ｂ））と相補的な配列を有する部分と、プロピレン鎖からなる下記に示すスペーサーＸと、ヒトゲノムの標的ＤＮＡの一部と相補的な配列を有する部分から構成される。
また、プライマー（Ｇ）の構造は、メンブレン３に第２の試験領域２１として固定したオリゴヌクレオチド（配列（Ｃ））と相補的な配列を有する部分と、プロピレン鎖からなる下記に示すスペーサーＸと、ヒトゲノムの標的ＤＮＡの一部と相補的な配列を有する部分から構成される。
これらのプライマーは、通常のオリゴヌクレオチド合成法により作成した。なお、プロピレン鎖からなるスペーサー部分は、下記に示すスペーサーＸを試薬として用いて、通常のオリゴヌクレオチド合成法により導入した。
ＰＣＲは、下記の方法により行った。
サンプル増幅用試薬として、ＱＩＡＧＥＮ社のmultiplex PCR master mixを使用した。サーマルサイクラーとして、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR System9700を使用した。まず、蒸留水４．０μＬ、２×multiplex PCR master mix ５．０μＬ、プライマー混合物（各５００ｎＭ）０．５μＬ、ゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ／μＬ）０．５μＬを混合し、１０．０μＬのサンプル液を調製した。次に、サンプル液をサーマルサイクルプレートに移し、サーマルサイクル反応（９５℃で１５分後；９５℃で３０秒、８０℃で１秒、６４℃で６分を４０サイクル、その後１０℃に下げる）を行った。そして、増幅したサンプルをＱＩＡＧＥＮ社のMinElute PCR Purification Kitを用いて精製し、アガロース電気泳動により意図した長さで増幅していることを確認した。また、蛍光強度から増幅量を算出した。
サンプル増幅用試薬として、ＱＩＡＧＥＮ社のmultiplex PCR master mixを使用した。サーマルサイクラーとして、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR System9700を使用した。まず、蒸留水４．０μＬ、２×multiplex PCR master mix ５．０μＬ、プライマー混合物（各５００ｎＭ）０．５μＬ、ゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ／μＬ）０．５μＬを混合し、１０．０μＬのサンプル液を調製した。次に、サンプル液をサーマルサイクルプレートに移し、サーマルサイクル反応（９５℃で１５分後；９５℃で３０秒、８０℃で１秒、６４℃で６分を４０サイクル、その後１０℃に下げる）を行った。そして、増幅したサンプルをＱＩＡＧＥＮ社のMinElute PCR Purification Kitを用いて精製し、アガロース電気泳動により意図した長さで増幅していることを確認した。また、蛍光強度から増幅量を算出した。
ＰＣＲで得られた反応液を展開液（エーエムアール社製）で希釈し、目的の増幅産物の総量の濃度を１００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬに調整した。
続いて希釈液及び増幅産物を含まない展開液それぞれ１００μＬに、調製例１〜３で調製した粒子液（２．５ｍｇ／ｍＬ）１μＬを加え混合した。
続いて希釈液及び増幅産物を含まない展開液それぞれ１００μＬに、調製例１〜３で調製した粒子液（２．５ｍｇ／ｍＬ）１μＬを加え混合した。
そして、表１に示すように粒子とテストストリップとを用いて試験１〜４を行い、ＤＮＡの検出を行った（各試験５回ずつ）。
調製例６又は７で作製したテストストリップのサンプルパッド部分に、前記標識試薬粒子を滴下した。１５分後、試験１〜３については下記検出装置を用いて、第１の試験領域の発光強度及び第２の試験領域の蛍光強度を数値化した。試験４については、目視で試験領域の発光の有無を判定した。
その結果を表１に示す。
調製例６又は７で作製したテストストリップのサンプルパッド部分に、前記標識試薬粒子を滴下した。１５分後、試験１〜３については下記検出装置を用いて、第１の試験領域の発光強度及び第２の試験領域の蛍光強度を数値化した。試験４については、目視で試験領域の発光の有無を判定した。
その結果を表１に示す。
＜検出装置＞
光源と光学フィルタと光電子倍増管（ＰＭＴ）からなる検出ユニットを有し、該検出ユニットが、モーターによって一定速度で直線移動する機構を備え、ＰＭＴの受光強度を５０μ秒ごとに記録する記録機構を備えた検出装置を作製した。なお、検出ユニットは、光源が５３２ｎｍのレーザダイオードであり、レーザダイオードをサンプルに照射し、反射光を５５０ｎｍ以上の波長の光のみを透過する光学フィルタを透過させた後にＰＭＴで受光する機構を有する。
光源と光学フィルタと光電子倍増管（ＰＭＴ）からなる検出ユニットを有し、該検出ユニットが、モーターによって一定速度で直線移動する機構を備え、ＰＭＴの受光強度を５０μ秒ごとに記録する記録機構を備えた検出装置を作製した。なお、検出ユニットは、光源が５３２ｎｍのレーザダイオードであり、レーザダイオードをサンプルに照射し、反射光を５５０ｎｍ以上の波長の光のみを透過する光学フィルタを透過させた後にＰＭＴで受光する機構を有する。
表１の結果から、第１の試験領域２０、第２の試験領域２１いずれについても、試験１では検体濃度が１μｇ／ｍＬの場合、試験領域の発光強度が、展開液だけを滴下した場合（濃度：０μｇ／ｍＬ）の試験領域の発光強度よりも、有意に高かった。すなわち、本発明によれば、生体分子濃度が１μｇ／ｍＬという低濃度であっても生体分子を検出でき、生体分子の検出感度が向上したことがわかる。
また、試験１では、第１の試験領域２０、第２の試験領域２１いずれについても、展開液のみを滴下した場合の試験領域の発光強度が、試験２及び３に比べて低かった。これは、第１及び第２の連結物質として同種の物質を選択し、連結物質を介して各捕捉物質を固定することにより、生体分子が結合していない蛍光シリカナノ粒子が試験領域に非特異的に吸着することを抑制することを示す。
さらに、検体濃度が０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬの間で、それぞれ発光強度に有意差があった。したがって、検体濃度を定量分析することが可能であることがわかる。
また、試験１では、第１の試験領域２０、第２の試験領域２１いずれについても、展開液のみを滴下した場合の試験領域の発光強度が、試験２及び３に比べて低かった。これは、第１及び第２の連結物質として同種の物質を選択し、連結物質を介して各捕捉物質を固定することにより、生体分子が結合していない蛍光シリカナノ粒子が試験領域に非特異的に吸着することを抑制することを示す。
さらに、検体濃度が０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬの間で、それぞれ発光強度に有意差があった。したがって、検体濃度を定量分析することが可能であることがわかる。
試験２では、第１の試験領域２０、第２の試験領域２１いずれについても、検体濃度が１０μｇ／ｍＬ以上であれば、展開液だけを滴下した場合との発光強度との明確な有意差が得られた。また、検体濃度が１０μｇ／ｍＬと１００μｇ／ｍＬとの間では、発光強度に明確な有意差が得られた。すなわち、試験２では検体濃度が１０μｇ／ｍＬ以上であれば、検体を検出することが可能であり、濃度差も知ることができる。検体濃度が１μｇ／ｍＬの場合は、展開液だけを滴下した場合の試験領域の発光強度に対して有意差がなかった。これは、連結物質を介さずに、オリゴヌクレオチドを直接試験領域に固定化したメンブレンを用いたためである。
試験３では、第１の試験領域２０、第２の試験領域２１いずれについても、検体濃度が１０μｇ／ｍＬ以上であれば、展開液だけを滴下した場合との発光強度との明確な有意差が得られた。また、検体濃度が１μｇ／ｍＬと１０μｇ／ｍＬの間、及び１０μｇ／ｍＬと１００μｇ／ｍＬの間では、それぞれ発光強度に明確な有意差が得られた。すなわち、試験３では検体濃度が１０μｇ／ｍＬ以上であれば、検体を検出し、定量分析することも可能である。さらに試験３では、検体濃度が１μｇ／ｍＬ程度しか存在しない場合と、１０μｇ／ｍＬ以上存在する場合とを区別して、検体を検出し、定量分析することも可能である。一方、検体濃度が１μｇ／ｍＬの場合の試験領域の発光強度は、展開液だけを滴下した場合の試験領域の発光強度に対して有意差がなかった。これは、連結物質を介さずにオリゴヌクレオチドが結合する蛍光シリカナノ粒子を用いたためである。
試験４では、第１の試験領域２０、第２の試験領域２１いずれについても、検体濃度が１００μｇ／ｍＬの場合でないと検体を検出できなかった。この結果から、本発明で規定する蛍光シリカ粒子からなる標識試薬又は試験片を用いて生体分子を検出する手法は、金粒子にオリゴヌクレオチドが結合した標識試薬を用いて、かつオリゴヌクレオチドが直接固定されたメンブレンを用いる手法よりも生体分子の検出感度が高く効果的であるといえる。
１ テストストリップ
２ サンプルパッド
３ メンブレン
４ 吸収パッド
５ バッキングシート
１０ 試験領域
２０ 第１の試験領域
２１ 第２の試験領域
２ サンプルパッド
３ メンブレン
４ 吸収パッド
５ バッキングシート
１０ 試験領域
２０ 第１の試験領域
２１ 第２の試験領域
Claims (16)
- 生体分子検出用の試験片と、蛍光シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬を有する生体分子検出用試験キットであって、
前記試験片は生体分子を捕捉する試験領域を有し、
生体分子に対する結合性を有する第１の捕捉物質が、第１の連結物質を介して前記試験領域に導入され、
生体分子に対する結合性を有する第２の捕捉物質が、第２の連結物質を介して前記蛍光シリカナノ粒子の表面に導入され、
前記第１の連結物質と前記第２の連結物質は、溶液中で互いに吸着しない物質からなる、
生体分子検出用試験キット。 - 前記第１の連結物質及び前記第２の連結物質のそれぞれが、ウシ血清アルブミン、スカシガイヘモシアニン、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンからなる群より選ばれる少なくとも１種の連結物質である、請求項１に記載の試験キット。
- 前記第１の連結物質と前記第２の連結物質が同種の連結物質である、請求項１又は２に記載の試験キット。
- 前記第１の捕捉物質及び前記第２の捕捉物質のそれぞれがオリゴヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の試験キット。
- 前記蛍光シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の試験キット。
- 生体分子検出用試験キットを用いた生体分子の検出方法であって、
前記生体分子検出用試験キットは、生体分子検出用の試験片と、蛍光シリカナノ粒子からなる生体分子検出用の標識試薬を有し、
前記試験片は生体分子を捕捉する試験領域を有し、
生体分子に対する結合性を有する第１の捕捉物質が、第１の連結物質を介して前記試験領域に導入され、
生体分子に対する結合性を有する第２の捕捉物質が、第２の連結物質を介して前記蛍光シリカナノ粒子の表面に導入され、
前記第１の連結物質と前記第２の連結物質は、溶液中で互いに吸着しない物質からなり、
前記蛍光シリカナノ粒子の第２の捕捉物質に結合した生体分子と、前記試験領域の第１の捕捉物質との結合により生じる、前記蛍光シリカナノ粒子の発光を検出することで、生体分子を検出する、
生体分子の検出方法。 - 前記第１の連結物質及び前記第２の連結物質のそれぞれが、ウシ血清アルブミン、スカシガイヘモシアニン、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンからなる群より選ばれる少なくとも１種の連結物質である、請求項６に記載の生体分子の検出方法。
- 前記第１の連結物質と前記第２の連結物質が同種の連結物質である、請求項６又は７に記載の生体分子の検出方法。
- 前記第１の捕捉物質及び前記第２の捕捉物質のそれぞれがオリゴヌクレオチドである、請求項６〜８のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
- 前記蛍光シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、請求項６〜９のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。
- 前記試験キットが核酸検出用試験キットであり、
第１及び第２の捕捉物質がそれぞれオリゴヌクレオチドであり、
前記の各オリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列のオリゴヌクレオチドを生体分子に予め導入する、
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の生体分子の検出方法。 - 生体分子を捕捉する試験領域を有する生体分子検出用試験片であって、生体分子に対する結合性を有する捕捉物質が、ウシ血清アルブミン、スカシガイヘモシアニン、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンからなる群より選ばれる少なくとも１種の連結物質を介して前記試験領域に導入されている、生体分子検出用試験片。
- 前記捕捉物質がオリゴヌクレオチドである、請求項１２に記載の生体分子検出用試験片。
- 蛍光シリカナノ粒子からなる生体分子検出用標識試薬であって、生体分子に対する結合性を有する捕捉物質が、ウシ血清アルブミン、スカシガイヘモシアニン、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン、グロブリン、アビジン、及びストレプトアビジンからなる群より選ばれる少なくとも１種の連結物質を介して前記蛍光シリカナノ粒子の表面に導入されている、生体分子検出用標識試薬。
- 前記蛍光シリカナノ粒子の平均粒径が６０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である、請求項１４に記載の生体分子検出用標識試薬。
- 前記捕捉物質がオリゴヌクレオチドである、請求項１４又は１５に記載の生体分子検出用標識試薬。
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