JP6605802B2 - 免疫アッセイによる微生物の検出方法、免疫アッセイに付す検体の処理方法、免疫アッセイ用検体前処理液、及びイムノクロマトグラフィー用試験キット - Google Patents
免疫アッセイによる微生物の検出方法、免疫アッセイに付す検体の処理方法、免疫アッセイ用検体前処理液、及びイムノクロマトグラフィー用試験キット Download PDFInfo
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本発明は、免疫アッセイによる微生物の検出方法、免疫アッセイに付す検体の処理方法、免疫アッセイ用検体前処理液、及びイムノクロマトグラフィー用試験キットに関する。
生体中の抗原などの生体分子を標的物質として検出する手法として、生体分子を捕捉する捕捉物質（抗体など）を担体に固定化させた多孔質の試験片と、標識試薬粒子を用いた検出法がある。この方法では、検体に含まれる生体分子を標識試薬粒子に捕捉し、毛細管現象により試験片の多孔質支持体を移動させる。そして、多孔質支持体に例えばライン状に固定された捕捉物質と生体分子とを接触させることによって標識試薬粒子を濃縮し、捕捉物質が固定されたラインを標識試薬粒子により発色させる。この発色によって生体分子の有無を判定することができる。
かかる生体分子の検出法の特徴として下記の３点が挙げられる。
（１）判定までに要する時間が短く迅速な検査が可能である。
（２）検体を滴下するだけで測定でき操作が簡便である。
（３）特別な検出装置を必要とせず判定が容易である。
これらの特徴を利用して、前記の検出法はインフルエンザ検査薬、口腔内常在菌の検査薬などに用いられており、新たなＰＯＣＴ（Point Of Care Testing）の手法として利用されている。また、食品検査においても、例えば食物アレルゲンの検査試薬等として広く利用され益々注目を集めている。
かかる生体分子の検出法の特徴として下記の３点が挙げられる。
（１）判定までに要する時間が短く迅速な検査が可能である。
（２）検体を滴下するだけで測定でき操作が簡便である。
（３）特別な検出装置を必要とせず判定が容易である。
これらの特徴を利用して、前記の検出法はインフルエンザ検査薬、口腔内常在菌の検査薬などに用いられており、新たなＰＯＣＴ（Point Of Care Testing）の手法として利用されている。また、食品検査においても、例えば食物アレルゲンの検査試薬等として広く利用され益々注目を集めている。
ヒトの口腔内常在菌と、歯周病や齲蝕の発生との間には密接な関係性があることが知られている。例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）など、病原性を有する口腔内常在菌が、歯周病や齲蝕などの口腔内疾患の原因となる。
そこで、前記の検出法を口腔内常在菌の検査薬などに適用する場合、検体液が試験片の多孔質支持体を移動できるよう、菌体破砕などの検体の前処理を行う必要がある。例えば特許文献１〜５には、検体と、各種界面活性剤を含む検体前処理液とを混合し、免疫アッセイに付す検体を処理する方法が記載されている。
そこで、前記の検出法を口腔内常在菌の検査薬などに適用する場合、検体液が試験片の多孔質支持体を移動できるよう、菌体破砕などの検体の前処理を行う必要がある。例えば特許文献１〜５には、検体と、各種界面活性剤を含む検体前処理液とを混合し、免疫アッセイに付す検体を処理する方法が記載されている。
微生物を含む検体を対象とする免疫アッセイでは、微生物の細胞膜に含まれる膜タンパク質や、細胞膜に結合した糖鎖など、微生物が有する固有の構成成分を抗原として、抗原抗体反応により抗原を捕捉する。
そこで、特許文献１〜５に記載されているように、イムノクロマトグラフィー用試験片を用いる免疫アッセイに付して微生物を含む検体を検出する場合、検体が試験片の多孔質支持体を移動し、微生物が有する固有の構成成分と抗体との結合反応（抗原抗体反応）を効率的に生じさせることが重要である。そのためには、界面活性剤を含む前処理液で検体を処理して菌体を十分に破砕し、抗体が認識可能な程度まで微生物をなるべく小さく分解する必要がある。この場合、前処理液に含まれる界面活性剤の濃度を上げれば、菌体を十分に破砕することができる。
しかし、前処理液中の界面活性剤の濃度を上げると、処理した検体を免疫アッセイに付しても抗原抗体反応が阻害され、微生物の検出感度が低下してしまうという問題が生じる。
そこで、特許文献１〜５に記載されているように、イムノクロマトグラフィー用試験片を用いる免疫アッセイに付して微生物を含む検体を検出する場合、検体が試験片の多孔質支持体を移動し、微生物が有する固有の構成成分と抗体との結合反応（抗原抗体反応）を効率的に生じさせることが重要である。そのためには、界面活性剤を含む前処理液で検体を処理して菌体を十分に破砕し、抗体が認識可能な程度まで微生物をなるべく小さく分解する必要がある。この場合、前処理液に含まれる界面活性剤の濃度を上げれば、菌体を十分に破砕することができる。
しかし、前処理液中の界面活性剤の濃度を上げると、処理した検体を免疫アッセイに付しても抗原抗体反応が阻害され、微生物の検出感度が低下してしまうという問題が生じる。
そこで本発明は、免疫アッセイに付す検体に含まれる微生物を十分に破砕するとともに、抗原抗体反応を阻害することなく微生物の検出感度を向上させる、微生物の検出方法を提供することを課題とする。
また本発明は、抗原抗体反応を阻害することなく微生物の検出感度を向上させる、免疫アッセイに付す検体の処理方法を提供することを課題とする。
さらに本発明は、検体に含まれる微生物を十分に破砕するとともに、免疫アッセイに付した際に抗原抗体反応を阻害することなく微生物の検出感度を向上させる、免疫アッセイ用検体前処理液及びイムノクロマトグラフィー用試験キットを提供することを課題とする。
また本発明は、抗原抗体反応を阻害することなく微生物の検出感度を向上させる、免疫アッセイに付す検体の処理方法を提供することを課題とする。
さらに本発明は、検体に含まれる微生物を十分に破砕するとともに、免疫アッセイに付した際に抗原抗体反応を阻害することなく微生物の検出感度を向上させる、免疫アッセイ用検体前処理液及びイムノクロマトグラフィー用試験キットを提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討を行った。その結果、アミラーゼなどの酵素を含む検体前処理液を用いて検体の処理を行うことで、抗原抗体反応の反応性が向上し、検出対象物質の検出感度が向上することを見出した。
本発明はこの知見に基づき完成されるに至ったものである。
本発明はこの知見に基づき完成されるに至ったものである。
本発明の上記課題は、下記の手段により解決された。
（１）イムノクロマトグラフィー用の試験片と、イムノクロマトグラフィー用の標識試薬粒子とを有するイムノクロマトグラフィー用キットを用いて、抗原抗体反応により抗原を検出する、免疫アッセイによる唾液に含まれる微生物の検出方法であって、検体として唾液を含む液と、アミラーゼの濃度が１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下の検体前処理液とを混合した混合液を、前記イムノクロマトグラフィー用の試験片に滴下して混合液に含まれる微生物の破砕物である抗原を抗原抗体反応により検出し、微生物の検出を行う、免疫アッセイによる微生物の検出方法。
（２）イムノクロマトグラフィー用の試験片と、イムノクロマトグラフィー用の標識試薬粒子とを有するイムノクロマトグラフィー用キットを用いて、抗原抗体反応により抗原を検出する、免疫アッセイによる唾液に含まれる微生物の検出方法であって、アミラーゼを含む検体前処理液を含浸し、アミラーゼの含有量を、前記試験片に滴下する検体として唾液を含む液０．０７ｍＬ当たり０．０２ｍｇ以上０．２ｍｇ以下とした部材を前記イムノクロマトグラフィー用の前記試験片に設け、検体として唾液を含む液を前記試験片に滴下し、前記部材に移動した検体として唾液を含む液と前記アミラーゼとを前記部材中で混合し、混合液に含まれる微生物の破砕物である抗原を抗原抗体反応により検出し、微生物の検出を行う、免疫アッセイによる微生物の検出方法。
（３）前記検体前処理液がさらにキレート剤を含有する、前記（１）又は（２）項に記載の方法。
（４）前記標識試薬粒子が、前記抗原に対する抗体が粒子表面に導入された蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子である、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（１）イムノクロマトグラフィー用の試験片と、イムノクロマトグラフィー用の標識試薬粒子とを有するイムノクロマトグラフィー用キットを用いて、抗原抗体反応により抗原を検出する、免疫アッセイによる唾液に含まれる微生物の検出方法であって、検体として唾液を含む液と、アミラーゼの濃度が１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下の検体前処理液とを混合した混合液を、前記イムノクロマトグラフィー用の試験片に滴下して混合液に含まれる微生物の破砕物である抗原を抗原抗体反応により検出し、微生物の検出を行う、免疫アッセイによる微生物の検出方法。
（２）イムノクロマトグラフィー用の試験片と、イムノクロマトグラフィー用の標識試薬粒子とを有するイムノクロマトグラフィー用キットを用いて、抗原抗体反応により抗原を検出する、免疫アッセイによる唾液に含まれる微生物の検出方法であって、アミラーゼを含む検体前処理液を含浸し、アミラーゼの含有量を、前記試験片に滴下する検体として唾液を含む液０．０７ｍＬ当たり０．０２ｍｇ以上０．２ｍｇ以下とした部材を前記イムノクロマトグラフィー用の前記試験片に設け、検体として唾液を含む液を前記試験片に滴下し、前記部材に移動した検体として唾液を含む液と前記アミラーゼとを前記部材中で混合し、混合液に含まれる微生物の破砕物である抗原を抗原抗体反応により検出し、微生物の検出を行う、免疫アッセイによる微生物の検出方法。
（３）前記検体前処理液がさらにキレート剤を含有する、前記（１）又は（２）項に記載の方法。
（４）前記標識試薬粒子が、前記抗原に対する抗体が粒子表面に導入された蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子である、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）イムノクロマトグラフィー用の試験片と、イムノクロマトグラフィー用の標識試薬粒子とを有するイムノクロマトグラフィー用キットを用いて、抗原抗体反応により唾液に含まれる微生物の破砕物である抗原を検出する免疫アッセイに付す検体の処理方法であって、抗原抗体反応に付して抗原を検出する前に、検体として唾液を含む液と、アミラーゼの濃度が１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下の検体前処理液とを混合して、前記検体として唾液を含む液とアミラーゼとを混合する、検体の処理方法。
（６）前記検体前処理液がさらにキレート剤を含有する、前記（５）項に記載の検体の処理方法。
（６）前記検体前処理液がさらにキレート剤を含有する、前記（５）項に記載の検体の処理方法。
（７）イムノクロマトグラフィー用の試験片と、イムノクロマトグラフィー用の標識試薬粒子とを有するイムノクロマトグラフィー用キットを用いて、抗原抗体反応により唾液に含まれる微生物の破砕物である抗原を検出する免疫アッセイに付す検体として唾液を含む液と混合して検体を処理する免疫アッセイ用検体前処理液であって、少なくともアミラーゼを１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で含有し、イムノクロマトグラフィー用の試験片を用いて前記検体を免疫アッセイに付す前に、検体として唾液を含む液と混合して用いられる、免疫アッセイ用検体前処理液。
（８）キレート剤をさらに含有する、前記（７）項に記載の検体前処理液。
（８）キレート剤をさらに含有する、前記（７）項に記載の検体前処理液。
（９）少なくともアミラーゼを１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で含有する、検体として唾液を含む液と混合して検体を処理する検体前処理液、イムノクロマトグラフィー用の試験片、及びイムノクロマトグラフィー用の標識試薬粒子を有する、イムノクロマトグラフィー用試験キット。
（１０）前記検体前処理液がさらにキレート剤を含有する、前記（９）項に記載の試験キット。
（１１）前記標識試薬粒子が、抗体が粒子表面に導入された蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子である、前記（９）又は（１０）に記載の試験キット。
（１０）前記検体前処理液がさらにキレート剤を含有する、前記（９）項に記載の試験キット。
（１１）前記標識試薬粒子が、抗体が粒子表面に導入された蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子である、前記（９）又は（１０）に記載の試験キット。
（１２）少なくともアミラーゼを含む検体前処理液を含浸して得られた部材を設けたイムノクロマトグラフィー用の試験片、及びイムノクロマトグラフィー用の標識試薬粒子を有する、イムノクロマトグラフィー用試験キットであって、前記部材中の前記アミラーゼの含有量が、前記試験片に滴下する検体として唾液を含む液０．０７ｍＬ当たり０．０２ｍｇ以上０．２ｍｇ以下である、イムノクロマトグラフィー用試験キット。
（１３）前記検体前処理液がさらにキレート剤を含有する、前記（１２）項に記載の試験キット。
（１４）前記標識試薬粒子が、抗体が粒子表面に導入された蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子である、前記（１２）又は（１３）に記載の試験キット。
（１３）前記検体前処理液がさらにキレート剤を含有する、前記（１２）項に記載の試験キット。
（１４）前記標識試薬粒子が、抗体が粒子表面に導入された蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子である、前記（１２）又は（１３）に記載の試験キット。
本発明の微生物の検出方法は、免疫アッセイに付す検体に含まれる微生物を十分に破砕するとともに、抗原抗体反応を阻害することなく微生物の検出感度を向上させることができる。
また本発明の免疫アッセイに付す検体の処理方法は、抗原抗体反応を阻害することなく微生物の検出感度を向上させることができる。
さらに本発明の免疫アッセイ用検体前処理液及びイムノクロマトグラフィー用試験キットは、検体に含まれる微生物を十分に破砕するとともに、イムノクロマトグラフィーに付した際に抗原抗体反応を阻害することなく微生物の検出感度を向上させることができる。
また本発明の免疫アッセイに付す検体の処理方法は、抗原抗体反応を阻害することなく微生物の検出感度を向上させることができる。
さらに本発明の免疫アッセイ用検体前処理液及びイムノクロマトグラフィー用試験キットは、検体に含まれる微生物を十分に破砕するとともに、イムノクロマトグラフィーに付した際に抗原抗体反応を阻害することなく微生物の検出感度を向上させることができる。
本明細書において「物質」とは、化合物又は化学合成された分子の他、生体分子（タンパク質、ペプチド、核酸等）を包含する。これらは人工起源のものであっても、天然起源のものであってもよい。
また、本明細書において「結合」又は「連結」とは、複数のものが分離した状態から連続して一体となることを全般的に指し、共有結合やイオン結合、水素結合といった化学的な結合のほか、化学吸着や物理吸着、そのほか嵌合、螺合、咬合した物理的な連結状態等も含む意味である。ここで、「結合」又は「連結」とは、直接複数のものが結合しても、別のものを介して間接的に結合してもよい意味である。
さらに、本明細書において「検出」とは、定性的な検出や定量的な検出のみならず、その他の各種の測定や同定、分析、評価等を含む概念である。
また、本明細書において「結合」又は「連結」とは、複数のものが分離した状態から連続して一体となることを全般的に指し、共有結合やイオン結合、水素結合といった化学的な結合のほか、化学吸着や物理吸着、そのほか嵌合、螺合、咬合した物理的な連結状態等も含む意味である。ここで、「結合」又は「連結」とは、直接複数のものが結合しても、別のものを介して間接的に結合してもよい意味である。
さらに、本明細書において「検出」とは、定性的な検出や定量的な検出のみならず、その他の各種の測定や同定、分析、評価等を含む概念である。
本発明は免疫アッセイによる微生物の検出方法であり、検体を含む液と酵素を混合し、混合液に含まれる抗原を抗原抗体反応に付して検出し、微生物の検出を行う。本発明の微生物の検出方法において、イムノクロマトグラフィー用の試験片と、イムノクロマトグラフィー用の標識試薬粒子とを有するイムノクロマトグラフィー用キットを用いて、抗原抗体反応により抗原を検出することが好ましい。本発明の好ましい実施態様（以下、「第１の実施態様」ともいう）としては、検体を含む液と酵素を含む検体前処理液（以下、単に「前処理液」ともいう）とを混合して、前記検体を含む液と前記酵素とを混合する方法が挙げられる。本発明の別の好ましい実施態様（以下、「第２の実施態様」ともいう）としては、前処理液を含浸して得られた部材を前記イムノクロマトグラフィー用の試験片に設け、検体を含む液を前記試験片に滴下し前記部材に移動した検体を含む液と前記酵素とを前記部材中で混合する方法が挙げられる。
以下、本発明の構成についてこれらの好ましい実施形態を中心に詳述する。
以下、本発明の構成についてこれらの好ましい実施形態を中心に詳述する。
［検体］
本発明において、検体としては特に制限はない。具体例としては、臨床検体（例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、膵液、胃液、体液、喀痰、鼻や咽等の粘膜から採取したぬぐい液等の体液や便等）、食品検体（例えば、液体飲料、半固形食品、固形食品等）、環境サンプリング検体（例えば、土壌、河川、海水等の自然界のサンプル、微生物の培養液、浴槽の水などの生活環境に存在するサンプル、工場内の生産ラインやクリーンルームに設置されたエアーサンプラー、配管内から採取したサンプリング検体、ふき取り検体等）等が挙げられる。
また、試料は液体であればそのまま用いることもできる。試料が半固形又は固形物等の場合には、希釈、抽出、機械的粉砕等の処理を施した後に用いることもできる。
本発明において、検体としては特に制限はない。具体例としては、臨床検体（例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、膵液、胃液、体液、喀痰、鼻や咽等の粘膜から採取したぬぐい液等の体液や便等）、食品検体（例えば、液体飲料、半固形食品、固形食品等）、環境サンプリング検体（例えば、土壌、河川、海水等の自然界のサンプル、微生物の培養液、浴槽の水などの生活環境に存在するサンプル、工場内の生産ラインやクリーンルームに設置されたエアーサンプラー、配管内から採取したサンプリング検体、ふき取り検体等）等が挙げられる。
また、試料は液体であればそのまま用いることもできる。試料が半固形又は固形物等の場合には、希釈、抽出、機械的粉砕等の処理を施した後に用いることもできる。
［前処理液］
本発明で用いることができる前処理液は、少なくとも酵素を含有する。ここで、本明細書における「酵素」とは、触媒として機能するタンパク質などの分子であり、生物由来のタンパク質や、人工的に合成されたポリペプチド、ポリヌクレオチドなどを意味する。
前述のように、界面活性剤を含む前処理液で微生物を含む検体を処理し、免疫アッセイを行うと、抗原抗体反応が阻害され、微生物の検出感度が低下する場合がある。これに対し、検体を含む液と酵素とを混合して検体を処理することで、検体を免疫アッセイに付した際に、抗原抗体反応を阻害することなく、微生物の検出感度を向上させることができる。
本発明で用いることができる前処理液は、少なくとも酵素を含有する。ここで、本明細書における「酵素」とは、触媒として機能するタンパク質などの分子であり、生物由来のタンパク質や、人工的に合成されたポリペプチド、ポリヌクレオチドなどを意味する。
前述のように、界面活性剤を含む前処理液で微生物を含む検体を処理し、免疫アッセイを行うと、抗原抗体反応が阻害され、微生物の検出感度が低下する場合がある。これに対し、検体を含む液と酵素とを混合して検体を処理することで、検体を免疫アッセイに付した際に、抗原抗体反応を阻害することなく、微生物の検出感度を向上させることができる。
本発明で用いる酵素は、免疫アッセイに付す検体に含まれる微生物を十分に破砕するとともに、抗原抗体反応を阻害するものであれば、特に制限はない。本発明で用いる酵素の具体例としては、アミラーゼ、サッカラーゼ、マルターゼ、ラクターゼなどの炭水化物分解酵素；ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼなどのタンパク質分解酵素；リパーゼ、ホスホリパーゼなどの脂肪分解酵素；デヒドロゲナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、トランスヒドロゲナーゼ、カタラーゼなどの酸化還元酵素が挙げられる。これらのうち、炭水化物分解酵素が好ましく、アミラーゼがより好ましい。
本発明で用いることができる前処理液中の酵素の濃度に特に制限はなく、適宜設定することができる。
例えば、本発明の第１の実施態様における前処理液中の酵素の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上が好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ以上がより好ましい。上限については特に制限はないが、抗原抗体反応を阻害せず、沈降物を生じないという観点から、１００ｍｇ／ｍＬ以下が好ましい。
例えば、本発明の第１の実施態様における前処理液中の酵素の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上が好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ以上がより好ましい。上限については特に制限はないが、抗原抗体反応を阻害せず、沈降物を生じないという観点から、１００ｍｇ／ｍＬ以下が好ましい。
本発明で用いることができる前処理液は、キレート剤をさらに含有することが好ましい。検体を含む液に生体由来のナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオンなどの無機イオンが過剰に含まれる場合、これらの無機イオンが後述する標識試薬粒子やイムノクロマトグラフィー用試験片のメンブレンに吸着し、抗原抗体反応の効率を低下させて、微生物の検出感度が低下する。さらには、検体を含む液にこれらの無機イオンが過剰に含まれると、標識試薬粒子の非特異的な吸着を生じさせ、偽陽性の原因になる。これに対して、前記前処理液がキレート剤をさらに含有することで、過剰な無機イオンをキレート剤と結合させて無機イオンがメンブレンや標識粒子へ吸着することを防止し、微生物の検出感度を向上させるとともに、偽陽性を防止できる。
本発明で好ましく用いることができるキレート剤としては、含窒素炭化水素化合物、含酸素炭化水素化合物、含硫黄炭化水素化合物、クラウンエーテル、アプタマーなどが挙げられる。このうち、含窒素炭化水素化合物が好ましい。
前記含窒素炭化水素化合物としては、分子内にアミノ基（ＮＲN 2）（ＲNは水素原子、炭素数１〜１２のアルキル基、炭素数２〜１２のアルケニル基、又は炭素数６〜１４のアリール基を表す。）又はイミノ基（ＮＲN）を有する化合物が好ましい。含窒素炭化水素化合物は、分子内にエーテル基を有していてもよい。ＲNで表されるアルキル基、アルケニル基及びアリール基はさらに置換基を有していてもよく、当該置換基の例としてはヒドロキシ基及びカルボキシル基が挙げられる。
前記含窒素炭化水素化合物は、アミノ基又はイミノ基と、カルボキシル基とを有するアミノカルボン酸化合物がより好ましく、＞Ｎ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ（ｎは１〜４の整数を表す）の構造又は−Ｎ−（（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ）2の構造を分子内に有するアミノカルボン酸化合物がさらに好ましい。このようなアミノカルボン酸化合物の具体例としては、エチレンジアミン四酢酸（以下、「EDTA」ともいう）、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、エチレンジアミン-N,N'-ジコハク酸、3-ヒドロキシ-2,2'-イミノジコハク酸4ナトリウムなどが挙げられる。これらのうち、本発明で用いることができるキレート剤は、EDTAが特に好ましい。
前記含窒素炭化水素化合物としては、分子内にアミノ基（ＮＲN 2）（ＲNは水素原子、炭素数１〜１２のアルキル基、炭素数２〜１２のアルケニル基、又は炭素数６〜１４のアリール基を表す。）又はイミノ基（ＮＲN）を有する化合物が好ましい。含窒素炭化水素化合物は、分子内にエーテル基を有していてもよい。ＲNで表されるアルキル基、アルケニル基及びアリール基はさらに置換基を有していてもよく、当該置換基の例としてはヒドロキシ基及びカルボキシル基が挙げられる。
前記含窒素炭化水素化合物は、アミノ基又はイミノ基と、カルボキシル基とを有するアミノカルボン酸化合物がより好ましく、＞Ｎ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ（ｎは１〜４の整数を表す）の構造又は−Ｎ−（（ＣＨ2）n−ＣＯＯＨ）2の構造を分子内に有するアミノカルボン酸化合物がさらに好ましい。このようなアミノカルボン酸化合物の具体例としては、エチレンジアミン四酢酸（以下、「EDTA」ともいう）、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、エチレンジアミン-N,N'-ジコハク酸、3-ヒドロキシ-2,2'-イミノジコハク酸4ナトリウムなどが挙げられる。これらのうち、本発明で用いることができるキレート剤は、EDTAが特に好ましい。
本発明の前処理液中のキレート剤の濃度に特に制限はなく、適宜設定することができる。
例えば、本発明の第１の実施態様における前処理液中のキレート剤の濃度は、１ｍＭ以上が好ましく、２ｍＭ以上がより好ましい。上限については特に制限はないが、抗原抗体反応を阻害せず、不溶物を生じないという観点から、１００ｍＭ以下が好ましい。
例えば、本発明の第１の実施態様における前処理液中のキレート剤の濃度は、１ｍＭ以上が好ましく、２ｍＭ以上がより好ましい。上限については特に制限はないが、抗原抗体反応を阻害せず、不溶物を生じないという観点から、１００ｍＭ以下が好ましい。
前記前処理液は、界面活性剤を含んでいてもよい。ただし前述のように、界面活性剤の濃度が高すぎると、検体を免疫アッセイに付した際に抗原抗体反応が阻害され、微生物の検出感度が低下する。したがって前記前処理液が界面活性剤を含む場合、本発明の効果を損なわない範囲で界面活性剤を含有させる必要がある。また前述のように、本発明では検体を含む液と酵素を混合する。そのため本発明の前処理液は、抗原抗体反応を阻害する、この種の前処理液に通常含まれる界面活性剤の量が少なくて済む。
本発明に用いることができる界面活性剤は、本発明の効果を損なわない範囲で、適宜選択することができる。例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、ポリエチレングリコール、p-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)-フェニルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどの非イオン性界面活性剤；アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩などの陽イオン性界面活性剤；脂肪酸ナトリウム、モノアルキル硫酸塩、アルキルポリオキシエチレン硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、モノアルキルリン酸塩などの陰イオン性界面活性剤；アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタインなどの両性界面活性剤、特開２０１１−２５２８１９号公報に記載のホスホリルコリン基を含むコポリマーが挙げられる。
前記前処理液中の界面活性剤の濃度に特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲で適宜設定することができる。
本発明に用いることができる界面活性剤は、本発明の効果を損なわない範囲で、適宜選択することができる。例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、ポリエチレングリコール、p-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)-フェニルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどの非イオン性界面活性剤；アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩などの陽イオン性界面活性剤；脂肪酸ナトリウム、モノアルキル硫酸塩、アルキルポリオキシエチレン硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、モノアルキルリン酸塩などの陰イオン性界面活性剤；アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタインなどの両性界面活性剤、特開２０１１−２５２８１９号公報に記載のホスホリルコリン基を含むコポリマーが挙げられる。
前記前処理液中の界面活性剤の濃度に特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲で適宜設定することができる。
前記前処理液は、前記以外の成分を含有していてもよい。このような成分としては、ｐＨの緩衝のためのリン酸、クエン酸、ほう酸、酢酸、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、HEPES（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid））などのｐＨ緩衝剤や、抗原抗体反応が適正に起こる範囲内の塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩、また粒子とメンブレン間の非特異吸着の抑制剤としてのウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」ともいう）、カゼインなどのタンパク質、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、アミノ酸などの物質が挙げられる。
本発明で用いることができる前処理液のｐＨに特に制限はないが、３以上が好ましく、５以上がより好ましく、１１以下が好ましく、９以下がより好ましい。
本発明において、酵素としてアミラーゼを含み、さらにEDTAを含む前処理液で処理することで検出感度が向上する微生物の菌種としては、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）、ストレプトコッカス・ミチス（Streptococcus mitis）、ストレプトコッカス・サングイニス（Streptococcus sanguinis）、ストレプトコッカス・ミティオア（Streptococcus mitior）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、バクテリオネマ・マツルショッティイ（Bacterionema matruchotii）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionbacterium acnes）などの口腔内細菌などが挙げられる。
本発明の微生物の検出方法は、各種免疫アッセイに適用することができる。
例えば、一般的な免疫学的検査法である、イムノクロマトグラフィー、ELISA法、EIA（エンザイムイムノアッセイ）、FIA（蛍光イムノアッセイ）、RIA（ラジオイムノアッセイ）等に適用することができる。あるいは、抗体又は抗原が結合した粒子と検体を混合し、検体に含まれる抗原又は抗体との抗原抗体反応によって粒子を凝集させる免疫凝集法、抗体又は抗原が結合した粒子と検体を混合し、検体に含まれる抗原又は抗体との抗原抗体反応によって生じる抗原−抗体複合物の沈降物を形成させ、その凝集塊に光を照射して、散乱による照射光の減衰を分光光度計で計測して検体に含まれる抗原量を測定する免疫比濁法、抗体又は抗原が結合した粒子と検体を混合し、検体に含まれる抗原又は抗体との抗原抗体反応によって生じる抗原−抗体複合物を形成させ、その複合物の分散液に光をあて散乱した光を測定することで、検体に含まれる抗原又は抗体を定量する免疫比ろう法、抗体または抗原を結合した粒子及び酵素標識抗体を測定物質と反応させ、粒子-測定物質-酵素標識抗体の複合体を形成し、未反応物を除去後、発光試薬を添加し、その発光量を測定して検出対象物を定量する化学発光酵素免疫測定法などに適用することができる。その他にも、フローサイトメトリーにおける標識粒子や、バイオチップ等にも適用することができる。
例えば、一般的な免疫学的検査法である、イムノクロマトグラフィー、ELISA法、EIA（エンザイムイムノアッセイ）、FIA（蛍光イムノアッセイ）、RIA（ラジオイムノアッセイ）等に適用することができる。あるいは、抗体又は抗原が結合した粒子と検体を混合し、検体に含まれる抗原又は抗体との抗原抗体反応によって粒子を凝集させる免疫凝集法、抗体又は抗原が結合した粒子と検体を混合し、検体に含まれる抗原又は抗体との抗原抗体反応によって生じる抗原−抗体複合物の沈降物を形成させ、その凝集塊に光を照射して、散乱による照射光の減衰を分光光度計で計測して検体に含まれる抗原量を測定する免疫比濁法、抗体又は抗原が結合した粒子と検体を混合し、検体に含まれる抗原又は抗体との抗原抗体反応によって生じる抗原−抗体複合物を形成させ、その複合物の分散液に光をあて散乱した光を測定することで、検体に含まれる抗原又は抗体を定量する免疫比ろう法、抗体または抗原を結合した粒子及び酵素標識抗体を測定物質と反応させ、粒子-測定物質-酵素標識抗体の複合体を形成し、未反応物を除去後、発光試薬を添加し、その発光量を測定して検出対象物を定量する化学発光酵素免疫測定法などに適用することができる。その他にも、フローサイトメトリーにおける標識粒子や、バイオチップ等にも適用することができる。
以下、本発明の微生物の検出方法の好ましい実施態様として、イムノクロマトグラフィーによる微生物の検出方法について説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
［イムノクロマトグラフィー用試験キット］
本発明において、前記前処理液と、イムノクロマトグラフィー用試験片（以下、「試験片」、又は「テストストリップ」ともいう）と、イムノクロマトグラフィー用の標識試薬粒子（以下単に、「標識試薬粒子」ともいう）とを有するイムノクロマトグラフィー用試験キット（以下、単に「試験キット」ともいう）を用いて、抗原抗体反応により検出対象物質を検出することが好ましい。
以下、本発明で好ましく用いることができる試験キットについて説明する。
本発明において、前記前処理液と、イムノクロマトグラフィー用試験片（以下、「試験片」、又は「テストストリップ」ともいう）と、イムノクロマトグラフィー用の標識試薬粒子（以下単に、「標識試薬粒子」ともいう）とを有するイムノクロマトグラフィー用試験キット（以下、単に「試験キット」ともいう）を用いて、抗原抗体反応により検出対象物質を検出することが好ましい。
以下、本発明で好ましく用いることができる試験キットについて説明する。
［本発明の第１の実施態様で好ましく用いることができるイムノクロマトグラフィー用の試験片］
本発明の第１の実施態様で好ましく用いることができる試験キットに含まれる試験片の形状に特に制限はないが、平面状の試験片であることが好ましく、ラテラルフロー用の試験片であることがより好ましい。
また、試験片の構造に特に制限はないが、試料添加用部材（サンプルパッド）と、検出対象物質（以下、「抗原」ともいう）を捕捉する試験領域を有するメンブレンと、吸収パッドとが、この順でそれぞれ相互に毛細管現象が生じるように直列に連結している構造であることが好ましい。そして、各構成部材は粘着剤付きバッキングシートにより裏打ちされていることが好ましい。
以下、上記形状及び構造を有する試験片について、図１及び２を参照しながら説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
本発明の第１の実施態様で好ましく用いることができる試験キットに含まれる試験片の形状に特に制限はないが、平面状の試験片であることが好ましく、ラテラルフロー用の試験片であることがより好ましい。
また、試験片の構造に特に制限はないが、試料添加用部材（サンプルパッド）と、検出対象物質（以下、「抗原」ともいう）を捕捉する試験領域を有するメンブレンと、吸収パッドとが、この順でそれぞれ相互に毛細管現象が生じるように直列に連結している構造であることが好ましい。そして、各構成部材は粘着剤付きバッキングシートにより裏打ちされていることが好ましい。
以下、上記形状及び構造を有する試験片について、図１及び２を参照しながら説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
（サンプルパッド）
サンプルパッド２は、前記検体や標識試薬粒子を滴下する構成部材である。サンプルパッド２の材料や寸法等は特に限定されず、この種の製品に適用される一般的なものを利用することができる。
サンプルパッド２は、前記検体や標識試薬粒子を滴下する構成部材である。サンプルパッド２の材料や寸法等は特に限定されず、この種の製品に適用される一般的なものを利用することができる。
（メンブレン）
メンブレン３は、サンプルパッド２から毛細管現象により移動してきた抗原を捕捉するための構成部材である。
図１に示すように、メンブレン３には、少なくとも１つの試験領域１０が設けられている。そして、抗原に対する特異的な結合性を有し抗原と複合体を形成しうる捕捉物質（以下、「第１の抗体」ともいう）が、試験領域１０に導入されている。これにより、検出対象物質と結合した標識試薬粒子が試験領域１０へ捕捉される。
この試験領域１０で第１の抗体−抗原−標識試薬粒子からなる複合体が形成され、標識試薬粒子が濃縮される。そして、標識試薬粒子が有する標識量の程度により生体分子を定性的又は定量的に検出することができる。
メンブレン３は、サンプルパッド２から毛細管現象により移動してきた抗原を捕捉するための構成部材である。
図１に示すように、メンブレン３には、少なくとも１つの試験領域１０が設けられている。そして、抗原に対する特異的な結合性を有し抗原と複合体を形成しうる捕捉物質（以下、「第１の抗体」ともいう）が、試験領域１０に導入されている。これにより、検出対象物質と結合した標識試薬粒子が試験領域１０へ捕捉される。
この試験領域１０で第１の抗体−抗原−標識試薬粒子からなる複合体が形成され、標識試薬粒子が濃縮される。そして、標識試薬粒子が有する標識量の程度により生体分子を定性的又は定量的に検出することができる。
図２に示すように、メンブレン３には、抗原と結合した標識試薬粒子を捕捉するための試験領域２０を設け、試験領域２０の下流に、試験領域２０に結合しなかった標識試薬粒子を捕捉する参照領域２１をさらに設けてもよい。このような参照領域２１を設けることにより、サンプルパッド２に滴下した試料が毛細管現象によりメンブレン３に移動し、さらに試験領域２０を超えて移動しているかを確認することができる。参照領域２１は設けなくてもよい。
前記試験領域及び参照領域の形状としては、局所的に捕捉物質が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられる。本発明において試験領域及び参照領域はそれぞれライン状であることが好ましく、幅０．５〜１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。
前記第１の抗体は、抗原抗体反応により抗原を捕捉し、前記試験領域で第１の抗体−抗原−標識試薬粒子からなる複合体を形成しうるものであれば特に制限はない。
前記参照領域に用いる、標識試薬粒子を捕捉する捕捉物質としては、標識試薬粒子に対して結合性を有するものから適宜選択することができる。具体的には、抗体、抗原、核酸、受容体、リガンド、糖鎖、アプタマーなどから適宜選択することができる。
前記参照領域に用いる、標識試薬粒子を捕捉する捕捉物質としては、標識試薬粒子に対して結合性を有するものから適宜選択することができる。具体的には、抗体、抗原、核酸、受容体、リガンド、糖鎖、アプタマーなどから適宜選択することができる。
前記試験領域における第１の抗体の導入量に特に制限なく、適宜設定することができる。例えば、試験領域の形状がライン状の場合、単位長さ（ｃｍ）当たりの第１の抗体の固定化量は０．００１μｇ以上が好ましく、０．０１μｇ以上がより好ましく、１０μｇ以下が好ましく、２μｇ以下がより好ましい。
第１の抗体の固定化方法としては、第１の抗体の溶液をメンブレン３の所定の領域に塗布、滴下又は噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。また、非特異的吸着による測定への影響を防止するため、捕捉物質の固定化後にメンブレン３全体をいわゆるブロッキング処理を施してもよい。
第１の抗体の固定化方法としては、第１の抗体の溶液をメンブレン３の所定の領域に塗布、滴下又は噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。また、非特異的吸着による測定への影響を防止するため、捕捉物質の固定化後にメンブレン３全体をいわゆるブロッキング処理を施してもよい。
（吸収パッド）
吸収パッド４は、毛細管現象でメンブレン３を移動してきた溶液を吸収し、一定の流れを生じさせるための構成部材である。
吸収パッド４は、毛細管現象でメンブレン３を移動してきた溶液を吸収し、一定の流れを生じさせるための構成部材である。
これら各構成部材の材料としては特に制限は無く、この種の試験片に通常用いられる部材が使用できる。例えば、サンプルパッド２としてはGlass Fiber Conjugate Pad（商品名、MILLIPORE社製）等のガラスファイバーのパッドを好ましく用いることができる。メンブレン３としてはHi-Flow Plus180メンブレン（商品名、MILLIPORE社製）等のニトロセルロースメンブレンを好ましく用いることができる。吸収パッド４としてはCellulose Fiber Sample Pad（商品名、MILLIPORE社製）等のセルロースメンブレンを好ましく用いることができる。
前記粘着剤付きバッキングシート６としては、AR9020（商品名、Adhesives Research社製）等が挙げられる。
前記粘着剤付きバッキングシート６としては、AR9020（商品名、Adhesives Research社製）等が挙げられる。
試験片の作製法としては、サンプルパッド２、メンブレン３、吸収パッド４の並び順に、各部材間で毛管現象を生じさせ易くするために、それら各部材の両端と隣接する部材と１〜５ｍｍ程度重ね合わせて（好ましくはバッキングシート６上に）貼付することで、テストストリップ１を作製することができる。
［本発明の第２の実施態様で好ましく用いることができるイムノクロマトグラフィー用の試験片］
本発明の第２の実施態様で好ましく用いることができる試験キットに含まれる試験片の形状に特に制限はないが、平面状の試験片であることが好ましく、ラテラルフロー用の試験片であることがより好ましい。
また、試験片の構造に特に制限はないが、サンプルパッドと、前処理液を含浸して得られた部材（以下、「コンジュゲートパッド」ともいう）と、抗原を捕捉する試験領域を有するメンブレンと、吸収パッドとが、この順でそれぞれ相互に毛細管現象が生じるように直列に連結している構造であることが好ましい。そして、各構成部材は粘着剤付きバッキングシートにより裏打ちされていることが好ましい。
以下、上記形状及び構造を有する試験片について、図３を参照しながら説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
本発明の第２の実施態様で好ましく用いることができる試験キットに含まれる試験片の形状に特に制限はないが、平面状の試験片であることが好ましく、ラテラルフロー用の試験片であることがより好ましい。
また、試験片の構造に特に制限はないが、サンプルパッドと、前処理液を含浸して得られた部材（以下、「コンジュゲートパッド」ともいう）と、抗原を捕捉する試験領域を有するメンブレンと、吸収パッドとが、この順でそれぞれ相互に毛細管現象が生じるように直列に連結している構造であることが好ましい。そして、各構成部材は粘着剤付きバッキングシートにより裏打ちされていることが好ましい。
以下、上記形状及び構造を有する試験片について、図３を参照しながら説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
（サンプルパッド）
サンプルパッド２は、前記検体や標識試薬粒子を滴下する構成部材である。サンプルパッド２の材料や寸法等は特に限定されず、この種の製品に適用される一般的なものを利用することができる。
サンプルパッド２は、前記検体や標識試薬粒子を滴下する構成部材である。サンプルパッド２の材料や寸法等は特に限定されず、この種の製品に適用される一般的なものを利用することができる。
（コンジュゲートパッド）
コンジュゲートパッド５は、前処理液を含浸して得られた構成部材である。そして、サンプルパッド２から毛細管現象により移動した検体を含む液と前処理液に含まれる酵素とを混合する部分である。
コンジュゲートパッド５は、前処理液を含浸して得られた構成部材である。そして、サンプルパッド２から毛細管現象により移動した検体を含む液と前処理液に含まれる酵素とを混合する部分である。
コンジュゲートパッド５に含ませる前記酵素の量に特に制限はなく、適宜設定することができる。例えば、コンジュゲートパッド５中の酵素の含有量は、前記試験片に滴下する検体を含む液０．１ｍＬ当たり０．００１ｍｇ以上が好ましく、０．０１ｍｇ以上がより好ましい。上限については特に制限はないが、抗原抗体反応を阻害しないという観点から、前記試験片に滴下する検体を含む液０．１ｍＬ当たり１００ｍｇ以下が好ましい。
また、コンジュゲートパッド５に含ませる前記キレート剤の量に特に制限はなく、適宜設定することができる。例えば、コンジュゲートパッド５中のキレート剤の含有量は、前記試験片に滴下する検体を含む液０．１ｍＬ当たり０．１μｍｏｌ以上が好ましく、０．２μｍｏｌ以上がより好ましい。上限については特に制限はないが、抗原抗体反応を阻害せず、不溶物を生じないという観点から、前記試験片に滴下する検体を含む液０．１ｍＬ当たり１０μｍｏｌ以下が好ましい。
また、コンジュゲートパッド５に含ませる前記キレート剤の量に特に制限はなく、適宜設定することができる。例えば、コンジュゲートパッド５中のキレート剤の含有量は、前記試験片に滴下する検体を含む液０．１ｍＬ当たり０．１μｍｏｌ以上が好ましく、０．２μｍｏｌ以上がより好ましい。上限については特に制限はないが、抗原抗体反応を阻害せず、不溶物を生じないという観点から、前記試験片に滴下する検体を含む液０．１ｍＬ当たり１０μｍｏｌ以下が好ましい。
（メンブレン）
図３に示すように、メンブレン３には、少なくとも１つの試験領域２０が設けられている。そして、抗原に対する特異的な結合性を有し抗原と複合体を形成しうる捕捉物質（以下、「第１の抗体」ともいう）が、試験領域２０に導入されている。これにより、検出対象物質と結合した標識試薬粒子が試験領域２０へ捕捉される。
この試験領域２０で第１の抗体−抗原−標識試薬粒子からなる複合体が形成され、標識試薬粒子が濃縮される。そして、標識試薬粒子が有する標識量の程度により生体分子を定性的又は定量的に検出することができる。
さらに図３に示すように、メンブレン３には、試験領域２０の下流に、試験領域２０に結合しなかった標識試薬粒子を捕捉する参照領域２１をさらに設けてもよい。このような参照領域２１を設けることにより、サンプルパッド２に滴下した試料が毛細管現象によりメンブレン３に移動し、さらに試験領域２０を超えて移動しているかを確認することができる。参照領域２１は設けなくてもよい。
図３に示すように、メンブレン３には、少なくとも１つの試験領域２０が設けられている。そして、抗原に対する特異的な結合性を有し抗原と複合体を形成しうる捕捉物質（以下、「第１の抗体」ともいう）が、試験領域２０に導入されている。これにより、検出対象物質と結合した標識試薬粒子が試験領域２０へ捕捉される。
この試験領域２０で第１の抗体−抗原−標識試薬粒子からなる複合体が形成され、標識試薬粒子が濃縮される。そして、標識試薬粒子が有する標識量の程度により生体分子を定性的又は定量的に検出することができる。
さらに図３に示すように、メンブレン３には、試験領域２０の下流に、試験領域２０に結合しなかった標識試薬粒子を捕捉する参照領域２１をさらに設けてもよい。このような参照領域２１を設けることにより、サンプルパッド２に滴下した試料が毛細管現象によりメンブレン３に移動し、さらに試験領域２０を超えて移動しているかを確認することができる。参照領域２１は設けなくてもよい。
前記試験領域及び参照領域の形状としては、局所的に捕捉物質が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられる。本発明において試験領域及び参照領域はそれぞれライン状であることが好ましく、幅０．５〜１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。
前記第１の抗体は、抗原抗体反応により抗原を捕捉し、前記試験領域で第１の抗体−抗原−標識試薬粒子からなる複合体を形成しうるものであれば特に制限はない。
前記参照領域に用いる、標識試薬粒子を捕捉する捕捉物質としては、標識試薬粒子に対して結合性を有するものから適宜選択することができる。具体的には、抗体、抗原、核酸、受容体、リガンド、糖鎖、アプタマーなどから適宜選択することができる。
前記参照領域に用いる、標識試薬粒子を捕捉する捕捉物質としては、標識試薬粒子に対して結合性を有するものから適宜選択することができる。具体的には、抗体、抗原、核酸、受容体、リガンド、糖鎖、アプタマーなどから適宜選択することができる。
前記試験領域における第１の抗体の導入量に特に制限なく、適宜設定することができる。例えば、試験領域の形状がライン状の場合、単位長さ（ｃｍ）当たりの第１の抗体の固定化量は０．００１μｇ以上が好ましく、０．０１μｇ以上がより好ましく、１０μｇ以下が好ましく、２μｇ以下がより好ましい。
第１の抗体の固定化方法としては、第１の抗体の溶液をメンブレン３の所定の領域に塗布、滴下又は噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。また、非特異的吸着による測定への影響を防止するため、捕捉物質の固定化後にメンブレン３全体をいわゆるブロッキング処理を施してもよい。
第１の抗体の固定化方法としては、第１の抗体の溶液をメンブレン３の所定の領域に塗布、滴下又は噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。また、非特異的吸着による測定への影響を防止するため、捕捉物質の固定化後にメンブレン３全体をいわゆるブロッキング処理を施してもよい。
（吸収パッド）
吸収パッド４は、毛細管現象でメンブレン３を移動してきた溶液を吸収し、一定の流れを生じさせるための構成部材である。
吸収パッド４は、毛細管現象でメンブレン３を移動してきた溶液を吸収し、一定の流れを生じさせるための構成部材である。
これら各構成部材の材料としては特に制限は無く、この種の試験片に通常用いられる部材が使用できる。例えば、サンプルパッド２及びコンジュゲートパッド５としてはGlass Fiber Conjugate Pad（商品名、MILLIPORE社製）等のガラスファイバーのパッドを好ましく用いることができる。メンブレン３としてはHi-Flow Plus180メンブレン（商品名、MILLIPORE社製）等のニトロセルロースメンブレンを好ましく用いることができる。吸収パッド４としてはCellulose Fiber Sample Pad（商品名、MILLIPORE社製）等のセルロースメンブレンを好ましく用いることができる。
前記粘着剤付きバッキングシート６としては、AR9020（商品名、Adhesives Research社製）等が挙げられる。
前記粘着剤付きバッキングシート６としては、AR9020（商品名、Adhesives Research社製）等が挙げられる。
試験片の作製法としては、サンプルパッド２、コンジュゲートパッド５、メンブレン３、吸収パッド４の並び順に、各部材間で毛管現象を生じさせ易くするために、それら各部材の両端と隣接する部材と１〜５ｍｍ程度重ね合わせて（好ましくはバッキングシート６上に）貼付することで、テストストリップ１を作製することができる。
［標識試薬粒子］
本発明で好ましく用いることができる標識試薬粒子としては、この種の試験キットに通常適用されるものを適宜使用することができる。例えば、蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子、吸光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子、蛍光ラテックスナノ粒子からなる標識試薬粒子、吸光ラテックスナノ粒子からなる標識試薬粒子、半導体微粒子からなる標識試薬粒子、金コロイド粒子からなる標識試薬粒子、放射性物質で標識した粒子が挙げられる。
本発明で好ましく用いることができる標識試薬粒子は、蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子が好ましい。蛍光シリカナノ粒子を用いた場合、蛍光検出装置により蛍光強度を容易に数値化でき、高感度及び高精度で生体分子を検出することができる。さらに、蛍光シリカナノ粒子の表面に様々な官能基を導入することができ、試験領域の発光が高輝度である。そのため、蛍光シリカナノ粒子を用いた場合、広い定量レンジで生体分子の検出を実現することができる。
以下、蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子について説明する。しかし、本発明はこれに限定するものではない。
本発明で好ましく用いることができる標識試薬粒子としては、この種の試験キットに通常適用されるものを適宜使用することができる。例えば、蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子、吸光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子、蛍光ラテックスナノ粒子からなる標識試薬粒子、吸光ラテックスナノ粒子からなる標識試薬粒子、半導体微粒子からなる標識試薬粒子、金コロイド粒子からなる標識試薬粒子、放射性物質で標識した粒子が挙げられる。
本発明で好ましく用いることができる標識試薬粒子は、蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子が好ましい。蛍光シリカナノ粒子を用いた場合、蛍光検出装置により蛍光強度を容易に数値化でき、高感度及び高精度で生体分子を検出することができる。さらに、蛍光シリカナノ粒子の表面に様々な官能基を導入することができ、試験領域の発光が高輝度である。そのため、蛍光シリカナノ粒子を用いた場合、広い定量レンジで生体分子の検出を実現することができる。
以下、蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子について説明する。しかし、本発明はこれに限定するものではない。
蛍光シリカナノ粒子の調製方法に特に制限はなく、任意のいかなる調製方法によって蛍光シリカナノ粒子を得ることができる。例えば、Journal of Colloid and Interface Science，159，p．150-157（1993）に記載のゾル−ゲル法や、国際公開第２００７／０７４７２２号に記載されたコロイドシリカ粒子の調製方法を参照することができる。
蛍光材料としての蛍光色素を用いた蛍光シリカナノ粒子の調製例について、具体的に説明する。
蛍光色素を含有するシリカ粒子は、蛍光色素とシランカップリング剤とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合若しくは吸着させて得られた生成物に１種又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。これによりオルガノシロキサン成分とシロキサン成分とがシロキサン結合してなるシリカ粒子が得られる。１例としては、N-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する又は付加した蛍光色素と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。
蛍光色素を含有するシリカ粒子は、蛍光色素とシランカップリング剤とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合若しくは吸着させて得られた生成物に１種又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。これによりオルガノシロキサン成分とシロキサン成分とがシロキサン結合してなるシリカ粒子が得られる。１例としては、N-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する又は付加した蛍光色素と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより調製することができる。
前記シランカップリング剤としてアミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、シラン化合物としてテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）を用いた場合を下記に例示する。
前記活性基を有する又は付加した前記蛍光色素の具体例として、5-（及び-6）-カルボキシテトラメチルローダミン-NHSエステル（商品名、emp Biotech GmbH社製）や、下記式でそれぞれ表されるDY550-NHSエステル又はDY630-NHSエステル（いずれも商品名、Dyomics GmbH社製）等のＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物を挙げることができる。
前記置換基を有するシランカップリング剤の具体例として、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシラン、N-2（アミノエチル）3-アミノプロピルメチルジメトキシシラン、3-アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。
縮重合させる前記シラン化合物としては特に制限はないが、ＴＥＯＳ、γ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、ＡＰＳ、3-チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、3-イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシランを挙げることができる。中でも、前記シリカ粒子内部のシロキサン成分を形成する観点からはＴＥＯＳが好ましく、前記シリカ粒子内部のオルガノシロキサン成分を形成する観点からはＭＰＳ又はＡＰＳが好ましい。
上述のように調製すると、球状、又は球状に近いシリカ粒子を調製することができる。ここで、「球状に近いシリカ粒子」とは、具体的には長軸と短軸の比が２以下の形状である。
蛍光シリカナノ粒子の平均粒径に特に制限はないが、２０ｎｍ以上が好ましく、３０ｎｍ以上がより好ましく、６０ｎｍ以上がさらに好ましく、１０００ｎｍ未満が好ましく、６００ｎｍ以下がより好ましく、５００ｎｍ以下がさらに好ましく、３００ｎｍ以下が特に好ましい。粒径が小さすぎると、検出感度が低下し、粒径が大きすぎると、試験片に用いられる多孔質支持体（メンブレン）の目詰まりの原因となる。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した１００個の標識試薬シリカ粒子の合計の投影面積から蛍光シリカナノ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した蛍光シリカナノ粒子の個数（１００個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
なお、前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子を含む概念の後述する「動的光散乱法による粒度」とは異なり、一次粒子のみからなる粒子の平均粒径である。
所望の平均粒径の蛍光シリカナノ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、または適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清又は沈殿のみを回収することで可能である。
蛍光シリカナノ粒子は粒状物質として単分散であることが好ましい。蛍光シリカナノ粒子の粒度分布の変動係数、いわゆるＣＶ値に特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した１００個の標識試薬シリカ粒子の合計の投影面積から蛍光シリカナノ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択した蛍光シリカナノ粒子の個数（１００個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
なお、前記平均粒径は、一次粒子が凝集してなる二次粒子を含む概念の後述する「動的光散乱法による粒度」とは異なり、一次粒子のみからなる粒子の平均粒径である。
所望の平均粒径の蛍光シリカナノ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、または適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清又は沈殿のみを回収することで可能である。
蛍光シリカナノ粒子は粒状物質として単分散であることが好ましい。蛍光シリカナノ粒子の粒度分布の変動係数、いわゆるＣＶ値に特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
本明細書において、前記「動的光散乱法による粒度」とは、動的光散乱法により測定され、前記の平均粒径とは異なり、一次粒子だけでなく、一次粒子が凝集してなる二次粒子をも含めた概念であり、前記複合粒子の分散安定性を評価する指標となる。
動的光散乱法による粒度の測定装置としては、ゼータサイザーナノ（商品名；マルバーン社製）が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
動的光散乱法による粒度の測定装置としては、ゼータサイザーナノ（商品名；マルバーン社製）が挙げられる。この手法は、微粒子などの光散乱体による光散乱強度の時間変動を測定し、その自己相関関数から光散乱体のブラウン運動速度を計算し、その結果から光散乱体の粒度分布を導出するというものである。
蛍光シリカナノ粒子の表面には、抗原に対する結合性を有する捕捉物質（以下、「第２の抗体」ともいう）が導入されている。
蛍光シリカナノ粒子の表面に導入する第２の抗体は、抗原に対する特異的な結合性を有し、前記試験領域で第１の抗体−抗原−標識試薬粒子からなる複合体を形成しうるものであれば特に制限はない。
蛍光シリカナノ粒子の表面に導入する第２の抗体は、抗原に対する特異的な結合性を有し、前記試験領域で第１の抗体−抗原−標識試薬粒子からなる複合体を形成しうるものであれば特に制限はない。
蛍光シリカナノ粒子の表面に第２の抗体を導入する方法としては特に制限はなく、常法に従って導入することができる。例えば、静電的引力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等によって蛍光シリカナノ粒子の表面に第２の抗体を導入してもよい。あるいは、架橋剤や縮合剤の化学結合によって、蛍光シリカナノ粒子の表面に第２の抗体を導入してもよい。また、蛍光シリカナノ粒子の表面に導入する第２の抗体を導入したときに蛍光シリカナノ粒子同士が凝集する場合は、予め交互吸着法によって蛍光シリカナノ粒子の表面に表面処理を施しておいてもよい。
以下、蛍光シリカナノ粒子を調製する方法について説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
まず、反応性官能基を有するシランカップリング剤を加水分解し、加水分解されたシランカップリング剤と蛍光シリカナノ粒子の表面に存在するヒドロキシル基とを縮重合させ、反応性官能基を蛍光シリカナノ粒子の表面に導入する。
反応性官能基を有するシランカップリング剤の具体例としては、3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン、ＭＰＳ、ＡＰＳ、3-チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、3-イソチオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリエトキシシラン、（-クロロプロピルトリメトキシシラン、ビニルメトキシシラン、3-メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、3-アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、N-フェニル-3-アミノプロピルトリメトキシシラン、3-ウレイドプロピルトリエトキシシラン、ビス（トリエトキシシリルプロピル）テトラスルフィドが挙げられる。
反応性官能基を有するシランカップリング剤の具体例としては、3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン、ＭＰＳ、ＡＰＳ、3-チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、3-イソチオシアナトプロピルトリエトキシシラン、3-［2-（2-アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピルトリエトキシシラン、（-クロロプロピルトリメトキシシラン、ビニルメトキシシラン、3-メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、3-アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、N-フェニル-3-アミノプロピルトリメトキシシラン、3-ウレイドプロピルトリエトキシシラン、ビス（トリエトキシシリルプロピル）テトラスルフィドが挙げられる。
反応性官能基としてはチオール基、アミノ基、カルボキシル基、ハロゲン基、ビニル基、エポキシ基及びイソシアネート基から選ばれる少なくとも１種の反応性官能基が好ましく、チオール基がより好ましい。
反応性官能基がチオール基である場合は、蛍光シリカナノ粒子表面におけるチオール基の密度は０．００２〜０．２個／ｎｍ2が好ましく、０．００２〜０．１個／ｎｍ2がより好ましい。当該含色素シリカ粒子の表面に存在するチオール基の量Ｂは、ＤＮＴＢ（5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)）を試薬として用いて測定することができる。ＤＮＴＢを用いたチオール基の定量法としては、例えば、Archives of Biochemistry and Biophysics, 82, 70(1959)の方法で行うことができる。具体的な方法の一例としては、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した１０ｍＭのＤＮＴＢの溶液２０μＬと、２００ｍｇ／ｍＬに調製したシリカ粒子コロイド２．５ｍＬとを混合し、１時間後に４１２ｎｍの吸光度を測定し、標準物質としてγ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）を用いて作成した検量線から粒子表面に存在するチオール基量を定量することができる。
反応性官能基がチオール基である場合は、蛍光シリカナノ粒子表面におけるチオール基の密度は０．００２〜０．２個／ｎｍ2が好ましく、０．００２〜０．１個／ｎｍ2がより好ましい。当該含色素シリカ粒子の表面に存在するチオール基の量Ｂは、ＤＮＴＢ（5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)）を試薬として用いて測定することができる。ＤＮＴＢを用いたチオール基の定量法としては、例えば、Archives of Biochemistry and Biophysics, 82, 70(1959)の方法で行うことができる。具体的な方法の一例としては、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した１０ｍＭのＤＮＴＢの溶液２０μＬと、２００ｍｇ／ｍＬに調製したシリカ粒子コロイド２．５ｍＬとを混合し、１時間後に４１２ｎｍの吸光度を測定し、標準物質としてγ−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）を用いて作成した検量線から粒子表面に存在するチオール基量を定量することができる。
蛍光シリカナノ粒子の表面に導入した反応性官能基と、これと化学結合を形成するリンカー分子とを反応させる。そして、リンカー分子とウシ血清アルブミンとを結合させ、蛍光シリカナノ粒子とＢＳＡとの複合体を形成する。
反応性官能基がチオール基である場合は、チオール基が導入された蛍光シリカナノ粒子と、マレイミド基及びカルボキシル基を有するリンカー分子とを非プロトン性溶媒中に共存させる。これにより、チオール基とマレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した粒子を作製する。続いて、リンカー分子が結合した粒子と、カルボジイミドと、アミノ基を有するＢＳＡとを水系溶媒中に共存させる。これにより、カルボジイミドにより活性エステル化されたリンカー分子のカルボキシル基と、ＢＳＡが有するアミノ基との間でアミド結合を形成させ、蛍光シリカナノ粒子とＢＳＡとの複合体を形成する。
反応性官能基がアミノ基、カルボキシル基、ビニル基、エポキシ基、イソシアネート基である場合も、常法によりＢＳＡと蛍光シリカナノ粒子との複合体を形成することができる。これらの方法は、例えば、特開２００９−２７４９２３号公報、特開２００９−１６２５３７号公報、特開２０１０−１００５４２号公報等の記載を参照することができる。
反応性官能基がチオール基である場合は、チオール基が導入された蛍光シリカナノ粒子と、マレイミド基及びカルボキシル基を有するリンカー分子とを非プロトン性溶媒中に共存させる。これにより、チオール基とマレイミド基との間でチオエーテル結合を形成させて、リンカー分子が結合した粒子を作製する。続いて、リンカー分子が結合した粒子と、カルボジイミドと、アミノ基を有するＢＳＡとを水系溶媒中に共存させる。これにより、カルボジイミドにより活性エステル化されたリンカー分子のカルボキシル基と、ＢＳＡが有するアミノ基との間でアミド結合を形成させ、蛍光シリカナノ粒子とＢＳＡとの複合体を形成する。
反応性官能基がアミノ基、カルボキシル基、ビニル基、エポキシ基、イソシアネート基である場合も、常法によりＢＳＡと蛍光シリカナノ粒子との複合体を形成することができる。これらの方法は、例えば、特開２００９−２７４９２３号公報、特開２００９−１６２５３７号公報、特開２０１０−１００５４２号公報等の記載を参照することができる。
そして、蛍光シリカナノ粒子に結合するＢＳＡと、第２の抗体とを常法に従って結合させる。例えば、静電的引力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等によって、ＢＳＡと第２の抗体とを結合させることができる。あるいは、架橋剤や縮合剤の化学結合により、ＢＳＡと第２の抗体とを結合させることができる。なお、ＢＳＡと第２の抗体とが直接結合して複合体を形成してもよいし、他の物質を介して間接的にＢＳＡと第２の抗体とが結合して複合体を形成していてもよい。
蛍光シリカナノ粒子の表面における第２の抗体の導入量に特に制限なく、適宜設定することができる。例えば、蛍光シリカナノ粒子の表面１ｎｍ2当たりの第２の抗体の導入量は、０．０００１ｍｏｌ以上０．１ｍｏｌ以下が好ましく、０．００１ｍｏｌ以上０．０５ｍｏｌ以下が好ましい。
［微生物の検出方法］
次に、上記構成の試験片と蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬を有する試験キットを用いた、イムノクロマトグラフィーによる微生物の検出方法について、好ましい実施態様に基づいて説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
次に、上記構成の試験片と蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬を有する試験キットを用いた、イムノクロマトグラフィーによる微生物の検出方法について、好ましい実施態様に基づいて説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
まず本発明の第１の実施態様では、前記前処理液と、唾液などの検体とを混合し、検体の処理を行う。処理条件に特に制限はなく、検体をイムノクロマトグラフィーに付すことができ、抗原抗体反応により、微生物が有する固有の構成成分を検出可能な状態まで菌体を破砕できればよい。例えば、前処理液と検体との混合液を通常の混合手段を用いて、転倒混和、振盪又は撹拌により混合すればよい。
前処理液を用いた検体の処理時間に特に制限はなく、１秒〜２４時間の間で適宜選択することができる。また、処理を行う温度についても特に制限はなく、前処理液に含まれる酵素の至適温度等に応じて適宜選択することができる。
前処理液を用いた検体の処理時間に特に制限はなく、１秒〜２４時間の間で適宜選択することができる。また、処理を行う温度についても特に制限はなく、前処理液に含まれる酵素の至適温度等に応じて適宜選択することができる。
つぎに、前処理液で処理した検体と、前記標識試薬粒子を、試験片１のサンプルパッド２に滴下する。サンプルパッド２に滴下する液体試料の量は、試験片１の構成に合わせて適宜調節することができる。
そして、毛細管現象によりサンプルパッド２からメンブレン３に移動してきた抗原と標識試薬粒子との複合体が、試験片１の試験領域上に導入された第１の抗体との結合により濃縮される。そして、試験領域１０に光を照射し、濃縮された標識試薬粒子の標識（蛍光シリカナノ粒子に含まれる色素の発光強度）を検出する。検出した標識の有無又は標識の程度により、微生物の検出を行うことができる。
本発明の第２の実施態様では、前記前処理液を免疫アッセイに用いる部材に乾燥された状態で含ませておき、抗原抗体反応により抗原を検出する前に、前記部材中で検体を含む液と前記酵素とを混合させる。例えば、イムノクロマト法により微生物を検出する場合、前記前処理液をサンプルパッド２やメンブレン３に含ませておき、検体を含む液がこれらの部材を通過する際に、検体を含む液と前記酵素とを混合してもよい。あるいは、前記前処理液を含ませたコンジュゲートパッド５をメンブレン３よりも上流に設け、検体を含む液がこの部材を通過する際に、検体を含む液と前記酵素とを混合してもよい。これらの場合、検体が前記部材を通過した後に抗原抗体反応が行われる。
蛍光シリカナノ粒子に含まれる色素の発光強度の検出方法に特に制限はなく、目視で検出してもよいし、汎用の蛍光検出器を用いて検出してもよい。
汎用の蛍光検出器は、励起光源及びフィルタからなる。前記励起光源としては水銀ランプ、ハロゲンランプ、キセノンランプ、レーザダイオード、発光ダイオードなどが挙げられる。前記フィルタは、励起光源から特定の波長の光のみを透過するフィルタであり、前記蛍光微粒子の蛍光波長、蛍光波長から適宜選択する。前記蛍光検出器は、蛍光を受光する光電子倍増管又はＣＣＤ検出器を備えていてもよい。これにより目視では確認できない強度ないしは波長の蛍光も検出でき、さらにはその蛍光強度を測定できる。
照射する励起光の波長は特に限定されないが、３００ｎｍ以上が好ましく、４００ｎｍ以上がより好ましく、５００ｎｍ以上が特に好ましい。また、７００ｎｍ以下が好ましく、６００ｎｍ以下がより好ましく、５５０ｎｍ以下が特に好ましい。
蛍光の波長は３５０ｎｍ以上が好ましく、４５０ｎｍ以上がより好ましく、５３０ｎｍ以上が特に好ましい。また、８００ｎｍ以下が好ましく、７５０ｎｍ以下がより好ましく、５８０ｎｍ以下が特に好ましい。
汎用の蛍光検出器は、励起光源及びフィルタからなる。前記励起光源としては水銀ランプ、ハロゲンランプ、キセノンランプ、レーザダイオード、発光ダイオードなどが挙げられる。前記フィルタは、励起光源から特定の波長の光のみを透過するフィルタであり、前記蛍光微粒子の蛍光波長、蛍光波長から適宜選択する。前記蛍光検出器は、蛍光を受光する光電子倍増管又はＣＣＤ検出器を備えていてもよい。これにより目視では確認できない強度ないしは波長の蛍光も検出でき、さらにはその蛍光強度を測定できる。
照射する励起光の波長は特に限定されないが、３００ｎｍ以上が好ましく、４００ｎｍ以上がより好ましく、５００ｎｍ以上が特に好ましい。また、７００ｎｍ以下が好ましく、６００ｎｍ以下がより好ましく、５５０ｎｍ以下が特に好ましい。
蛍光の波長は３５０ｎｍ以上が好ましく、４５０ｎｍ以上がより好ましく、５３０ｎｍ以上が特に好ましい。また、８００ｎｍ以下が好ましく、７５０ｎｍ以下がより好ましく、５８０ｎｍ以下が特に好ましい。
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
（調製例１）蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子の調製
（１）蛍光シリカナノ粒子の調製
蛍光分子であるカルボキシローダミン６Ｇを含有する蛍光シリカナノ粒子を以下の方法で調製した。
5-（及び-6）-カルボキシローダミン６Ｇ・スクシンイミジルエステル（商品名、emp Biotech GmbＨ社製）３．１ｍｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１ｍＬに溶解した。ここにＡＰＳ（信越シリコーン社製）１．２μＬを加え、室温（２３℃）で１時間反応を行い、5-（及び-6）-カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ複合体（５ｍＭ）を得た。
（１）蛍光シリカナノ粒子の調製
蛍光分子であるカルボキシローダミン６Ｇを含有する蛍光シリカナノ粒子を以下の方法で調製した。
5-（及び-6）-カルボキシローダミン６Ｇ・スクシンイミジルエステル（商品名、emp Biotech GmbＨ社製）３．１ｍｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１ｍＬに溶解した。ここにＡＰＳ（信越シリコーン社製）１．２μＬを加え、室温（２３℃）で１時間反応を行い、5-（及び-6）-カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ複合体（５ｍＭ）を得た。
得られた5-（及び-6）-カルボキシローダミン６Ｇ−ＡＰＳ複合体の溶液６００μＬと、エタノール１４０ｍＬ、ＴＥＯＳ（信越シリコーン社製）６．５ｍＬ、蒸留水２０ｍＬ及び２８質量％アンモニア水１５ｍＬを混合し、室温で２４時間反応を行った。
反応終了後、反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿した粒子に蒸留水４ｍＬを加え粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去した。
その結果、平均粒径約２７０ｎｍの蛍光分子を含有する蛍光シリカナノ粒子１．６５ｇを得た（収率約９４％）。
反応終了後、反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿した粒子に蒸留水４ｍＬを加え粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去した。
その結果、平均粒径約２７０ｎｍの蛍光分子を含有する蛍光シリカナノ粒子１．６５ｇを得た（収率約９４％）。
（２）蛍光シリカナノ粒子へのチオール基の導入
上記で得た蛍光シリカナノ粒子２０ｍｇを水／エタノール＝１／４の混合液１ｍＬに分散させた。これにＭＰＳ（和光純薬社製）２０μＬを加えた。続いて２８％アンモニア水５０μＬを加え、室温で４時間混合した。
上記で得た蛍光シリカナノ粒子２０ｍｇを水／エタノール＝１／４の混合液１ｍＬに分散させた。これにＭＰＳ（和光純薬社製）２０μＬを加えた。続いて２８％アンモニア水５０μＬを加え、室温で４時間混合した。
反応終了後反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿した蛍光シリカナノ粒子に蒸留水１ｍＬを加え蛍光シリカナノ粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、分散液に含まれる未反応のＭＰＳやアンモニア等を除去した。その結果、チオール基が導入された蛍光シリカナノ粒子を得た。
（３）チオール基を介した蛍光シリカナノ粒子と抗体との結合
以下の方法により、チオール基を介して、チオール基が導入された蛍光シリカナノ粒子とマウス由来抗ストレプトコッカス・ミュータンスポリクローナル抗体（以下、単に「抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体」ともいう）とを結合させた。
チオール基が導入された蛍光シリカナノ粒子の分散液（濃度２５ｍｇ／ｍＬ、分散媒：蒸留水）４０μＬにＤＭＦ４６０μＬを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦ５００μＬを加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦ５００μＬを加え蛍光シリカナノ粒子を分散させた。これにリンカー分子としてN-(4-アミノフェニル)マレイミド１ｍｇを加え３０分混合した。このようにして、上記リンカー分子のマレイミド基と蛍光シリカナノ粒子のチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
以下の方法により、チオール基を介して、チオール基が導入された蛍光シリカナノ粒子とマウス由来抗ストレプトコッカス・ミュータンスポリクローナル抗体（以下、単に「抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体」ともいう）とを結合させた。
チオール基が導入された蛍光シリカナノ粒子の分散液（濃度２５ｍｇ／ｍＬ、分散媒：蒸留水）４０μＬにＤＭＦ４６０μＬを加え、１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去し、ＤＭＦ５００μＬを加え遠心分離し、上清を除去した。再度ＤＭＦ５００μＬを加え蛍光シリカナノ粒子を分散させた。これにリンカー分子としてN-(4-アミノフェニル)マレイミド１ｍｇを加え３０分混合した。このようにして、上記リンカー分子のマレイミド基と蛍光シリカナノ粒子のチオール基との間でチオエーテル結合を形成させた。
この反応液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離した。上清を除去後、蒸留水７４．６μＬを加え粒子を分散させた。続いて、０．５Ｍ ＭＥＳ（2-モルホリノエタンスルホン酸)（ｐＨ６．０）１００μＬ、５０ｍｇ／ｍｌ ＮＨＳ（N-ヒドロキシスクシンイミド）２３０．４μＬ、１９．２ｍｇ／ｍｌ ＥＤＣ（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）７５μＬを加え混合した。これに抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体（１．０ｍｇ／ｍＬ）２０．０μＬを加え、室温で１時間混合した。なお、抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体は、ストレプトコッカス・ミュータンス（ATCC25175）の破砕物を免疫原として、常法に従い作製した。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。これに１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。同様の操作をさらに２回洗浄を行った後、１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。これに１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させた。続いて１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。同様の操作をさらに２回洗浄を行った後、１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え、粒子を分散させてコロイドを得た。
得られたコロイドをサンプルとして、蛍光シリカナノ粒子に結合した抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体の定量を行った。抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体の定量には、PierceBCA Protein Assay Kit（商品名、Thermo Fisher Scientific社製）を用いた。
その結果、蛍光シリカナノ粒子１ｇあたりの抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体の結合量は、１０．７ｍｇであった。
その結果、蛍光シリカナノ粒子１ｇあたりの抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体の結合量は、１０．７ｍｇであった。
続いて、上記コロイドに１０％ＢＳＡを１０μＬ加え１０分間混合した。そして混合液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）５００μＬを加え粒子を分散させた。分散液を１５０００×ｇの重力加速度で１０分遠心分離し、上清を除去した。再度１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ７．５）４００μＬを加え粒子を分散させた。このようにして、抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体が結合した蛍光シリカナノ粒子を分散させたコロイドを得た。
（調製例２）イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
イムノクロマトグラフィー用テストストリップを以下の方法で作製した。
イムノクロマトグラフィー用抗体固定化メンブレンを以下の方法で作製した。
メンブレン３（丈２５ｍｍ、商品名：Hi-Flow Plus180 メンブレン、MILLIPORE社製）の端から約８ｍｍの位置に、幅約１ｍｍの試験領域（テストライン）２０として、抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。
また、幅約１ｍｍの参照領域（コントロールライン）２１として、ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体（ポリクローナル抗体、Meridian社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。
その後、５０℃で３０分乾燥させ、メンブレン３を作製した。なお、テストライン２０とコントロールライン２１との間隔は５ｍｍとした。
イムノクロマトグラフィー用テストストリップを以下の方法で作製した。
イムノクロマトグラフィー用抗体固定化メンブレンを以下の方法で作製した。
メンブレン３（丈２５ｍｍ、商品名：Hi-Flow Plus180 メンブレン、MILLIPORE社製）の端から約８ｍｍの位置に、幅約１ｍｍの試験領域（テストライン）２０として、抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。
また、幅約１ｍｍの参照領域（コントロールライン）２１として、ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体（ポリクローナル抗体、Meridian社製）を１ｍｇ／ｍＬ含有する溶液（（５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。
その後、５０℃で３０分乾燥させ、メンブレン３を作製した。なお、テストライン２０とコントロールライン２１との間隔は５ｍｍとした。
図２に示すように、前記メンブレン３、サンプルパッド（Glass Fiber Conjugate Pad（ＧＦＣＰ）、MILLIPORE社製）２、及び吸収パッド（Cellulose Fiber Sample Pad（ＣＦＳＰ）、MILLIPORE社製）４の順で、バッキングシート（商品名：AR9020、Adhesives Research社製）６上で組み立てた。なおメンブレン３は、テストライン２０がサンプルパッド２側、コントロールライン２１が吸収パッド４側に位置するように配置した。
続いて、５ｍｍ幅、長さ６０ｍｍのストリップ状に切断し、テストストリップ１を作製した。
続いて、５ｍｍ幅、長さ６０ｍｍのストリップ状に切断し、テストストリップ１を作製した。
（試験例１）ストレプトコッカス・ミュータンスの検出
（１）前処理液の調製
表１に示す組成の前処理液１〜１３（ｐＨ７）をそれぞれ調製した。なお前処理液１〜４は、アミラーゼを含まない前処理液である。一方前処理液５〜１２は、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度でアミラーゼを含む前処理液である。
（１）前処理液の調製
表１に示す組成の前処理液１〜１３（ｐＨ７）をそれぞれ調製した。なお前処理液１〜４は、アミラーゼを含まない前処理液である。一方前処理液５〜１２は、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度でアミラーゼを含む前処理液である。
（２）ストレプトコッカス・ミュータンスの検出
ストレプトコッカス・ミュータンスの菌体濃度が１×１０5ＣＦＵ／ｍＬである唾液検体（陽性唾液）５０μＬを１３本用意し、表１の前処理液１〜１３をそれぞれ２０μＬずつ加え、１０秒間ボルテックスで混合した。続いて調製例１で調製した抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体が結合した蛍光シリカナノ粒子を分散させたコロイド（２．５ｍｇ／ｍＬ）を０．６μＬ加え、ボルテックスで５秒混合した。その後、混合液全量を調製例２で作製したテストストリップ１のサンプルパッド２に滴下した。２０分後、下記検出装置を用いて、テストライン２０の発光強度（Ｘ）の測定をした。
これとは別に、ストレプトコッカス・ミュータンスを含まない唾液検体（陰性唾液）についても同様の操作を行い、テストライン２０の発光強度（Ｙ）の測定をした。
そして、発光強度（Ｘ）と発光強度（Ｙ）との発光強度差（Ｘ−Ｙ）を算出した。
その結果を表２に示す。なお、すべての試験において参照領域での発光を確認し、試験が正常に行われたことを確認できた。
ストレプトコッカス・ミュータンスの菌体濃度が１×１０5ＣＦＵ／ｍＬである唾液検体（陽性唾液）５０μＬを１３本用意し、表１の前処理液１〜１３をそれぞれ２０μＬずつ加え、１０秒間ボルテックスで混合した。続いて調製例１で調製した抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体が結合した蛍光シリカナノ粒子を分散させたコロイド（２．５ｍｇ／ｍＬ）を０．６μＬ加え、ボルテックスで５秒混合した。その後、混合液全量を調製例２で作製したテストストリップ１のサンプルパッド２に滴下した。２０分後、下記検出装置を用いて、テストライン２０の発光強度（Ｘ）の測定をした。
これとは別に、ストレプトコッカス・ミュータンスを含まない唾液検体（陰性唾液）についても同様の操作を行い、テストライン２０の発光強度（Ｙ）の測定をした。
そして、発光強度（Ｘ）と発光強度（Ｙ）との発光強度差（Ｘ−Ｙ）を算出した。
その結果を表２に示す。なお、すべての試験において参照領域での発光を確認し、試験が正常に行われたことを確認できた。
＜検出装置＞
光源と光学フィルタと光電子倍増管（ＰＭＴ）からなる検出ユニットを有し、該検出ユニットが、モーターによって一定速度で直線移動する機構を備え、ＰＭＴの受光強度を５０μ秒ごとに記録する記録機構を備えた検出装置を作製した。なお、検出ユニットは、光源が５３２ｎｍのレーザダイオードであり、レーザダイオードをサンプルに照射し、反射光を５５０ｎｍ以上の波長の光のみを透過する光学フィルタを透過させた後にＰＭＴで受光する機構を有する。
光源と光学フィルタと光電子倍増管（ＰＭＴ）からなる検出ユニットを有し、該検出ユニットが、モーターによって一定速度で直線移動する機構を備え、ＰＭＴの受光強度を５０μ秒ごとに記録する記録機構を備えた検出装置を作製した。なお、検出ユニットは、光源が５３２ｎｍのレーザダイオードであり、レーザダイオードをサンプルに照射し、反射光を５５０ｎｍ以上の波長の光のみを透過する光学フィルタを透過させた後にＰＭＴで受光する機構を有する。
表２に示すように、アミラーゼを含有する前処理液（前処理液６〜９、Tween２０を１質量％含み、ＥＤＴＡを含まない）を用いて唾液を処理して微生物の検出を行った場合（参考例２及び３、並びに実施例４及び５）、アミラーゼを含まない前処理液（前処理液２、Tween２０を１質量％含み、ＥＤＴＡを含まない）を用いて唾液を処理して微生物の検出を行った場合（比較例２）と比べて、陽性唾液と陰性唾液との間の蛍光強度差が大きくなっている。この蛍光強度差は、アミラーゼの濃度が１ｍｇ／ｍＬのとき（実施例４）に最大値を示した。そして実施例４の蛍光強度差は、比較例２の蛍光強度差の６倍以上であった。
以上のように本発明によれば、微生物の検出感度が顕著に向上することが分かる。
以上のように本発明によれば、微生物の検出感度が顕著に向上することが分かる。
さらに、表２に示すように、アミラーゼに加えてさらにＥＤＴＡを加えた前処理液（前処理液１０〜１３）を用いて唾液を処理して微生物の検出を行うことで（実施例６〜９）、さらに大きな蛍光強度差を示した。この蛍光強度差は、ＥＤＴＡの濃度が１０ｍＭのとき（実施例８）に最大値を示した。
さらに、アミラーゼを含有し、Tween２０を含まない前処理液（前処理液５）を用いて唾液を処理して微生物の検出を行った場合（実施例１）、アミラーゼを含有しない前処理液（前処理液１〜４）を用いて唾液を処理して微生物の検出を行った場合（比較例１〜４）に比べて蛍光強度差が大きかった。この結果から、前処理液に界面活性剤を加えなくても酵素を加えることで、微生物の検出感度が向上することが分かる。
さらに、アミラーゼを含まず界面活性剤の濃度を変えた前処理液（前処理液１〜４）を用いて唾液を処理して微生物の検出を行った場合（比較例１〜４）、界面活性剤の濃度が１質量％のとき蛍光強度差が最大値を示し、それ以上界面活性剤の量を増やすと、蛍光強度差は低下した。この結果から、界面活性剤の添加量を増加しても十分な検出感度が得られないことが分かる。
（調製例３）イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
（１）前処理液の調製
表３に示す組成の前処理液２１〜３３（ｐＨ７）をそれぞれ調製した。
（１）前処理液の調製
表３に示す組成の前処理液２１〜３３（ｐＨ７）をそれぞれ調製した。
（２）前処理液を含浸させたコンジュゲートパッドの作製
続いて、前記前処理液を含浸させたコンジュゲートパッド５を以下の方法で作製した。
Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）（８ｍｍ×１５０ｍｍ）１３枚に、前処理液２１〜３３それぞれ８００μＬをピペットで均一に塗布した。これらをデシケーター内で室温下、一夜減圧下で乾燥し、前処理液を含浸させたコンジュゲートパッド５を得た。
続いて、前記前処理液を含浸させたコンジュゲートパッド５を以下の方法で作製した。
Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）（８ｍｍ×１５０ｍｍ）１３枚に、前処理液２１〜３３それぞれ８００μＬをピペットで均一に塗布した。これらをデシケーター内で室温下、一夜減圧下で乾燥し、前処理液を含浸させたコンジュゲートパッド５を得た。
（３）イムノクロマトグラフィー用テストストリップの作製
図３に示すように、調製例２で作製したメンブレン３、前記コンジュゲートパッド５、サンプルパッド（Glass Fiber Conjugate Pad（ＧＦＣＰ）、MILLIPORE社製）２、及び吸収パッド（Cellulose Fiber Sample Pad（ＣＦＳＰ）、MILLIPORE社製）４の順で、バッキングシート（商品名：AR9020、Adhesives Research社製）６上で組み立てた。なおメンブレン３は、テストライン２０がコンジュゲートパッド５側、コントロールライン２１が吸収パッド４側に位置するように配置した。
続いて、５ｍｍ幅、長さ６０ｍｍのストリップ状に切断し、テストストリップ１を作製した。これにより、１個のテストストリップに用いられる処理用パッドは３０分割されて５ｍｍ幅×８ｍｍ長さになり、それぞれ前段で塗布した８００μＬの処理液の３０分の１の検体前処理剤を含有することになる。
このように作製した各テストストリップのコンジュゲートパッド５に含まれるＴｗｅｅｎ２０、アミラーゼ、及びＥＤＴＡの量を表４に示す。
図３に示すように、調製例２で作製したメンブレン３、前記コンジュゲートパッド５、サンプルパッド（Glass Fiber Conjugate Pad（ＧＦＣＰ）、MILLIPORE社製）２、及び吸収パッド（Cellulose Fiber Sample Pad（ＣＦＳＰ）、MILLIPORE社製）４の順で、バッキングシート（商品名：AR9020、Adhesives Research社製）６上で組み立てた。なおメンブレン３は、テストライン２０がコンジュゲートパッド５側、コントロールライン２１が吸収パッド４側に位置するように配置した。
続いて、５ｍｍ幅、長さ６０ｍｍのストリップ状に切断し、テストストリップ１を作製した。これにより、１個のテストストリップに用いられる処理用パッドは３０分割されて５ｍｍ幅×８ｍｍ長さになり、それぞれ前段で塗布した８００μＬの処理液の３０分の１の検体前処理剤を含有することになる。
このように作製した各テストストリップのコンジュゲートパッド５に含まれるＴｗｅｅｎ２０、アミラーゼ、及びＥＤＴＡの量を表４に示す。
（試験例２）ストレプトコッカス・ミュータンスの検出
ストレプトコッカス・ミュータンスの菌体濃度が１×１０5ＣＦＵ／ｍＬである唾液検体（陽性唾液）７０μＬを１３本用意し、調製例３で作製したテストストリップのサンプルパッド２に滴下した。２０分後、上記検出装置を用いて、テストライン２０の発光強度（Ｘ）の測定をした。
これとは別に、ストレプトコッカス・ミュータンスを含まない唾液検体（陰性唾液）についても同様の操作を行い、テストライン２０の発光強度（Ｙ）の測定をした。
そして、発光強度（Ｘ）と発光強度（Ｙ）との発光強度差（Ｘ−Ｙ）を算出した。
その結果を表５に示す。なお、すべての試験において参照領域での発光を確認し、試験が正常に行われたことを確認できた。
ストレプトコッカス・ミュータンスの菌体濃度が１×１０5ＣＦＵ／ｍＬである唾液検体（陽性唾液）７０μＬを１３本用意し、調製例３で作製したテストストリップのサンプルパッド２に滴下した。２０分後、上記検出装置を用いて、テストライン２０の発光強度（Ｘ）の測定をした。
これとは別に、ストレプトコッカス・ミュータンスを含まない唾液検体（陰性唾液）についても同様の操作を行い、テストライン２０の発光強度（Ｙ）の測定をした。
そして、発光強度（Ｘ）と発光強度（Ｙ）との発光強度差（Ｘ−Ｙ）を算出した。
その結果を表５に示す。なお、すべての試験において参照領域での発光を確認し、試験が正常に行われたことを確認できた。
表５に示すように、アミラーゼを含有する前処理液（前処理液２６〜２９、Tween２０を０．２ｍｇ含み、ＥＤＴＡを含まない）を含浸して得られたコンジュゲートパッドを設けたテストストリップ（テストストリップ２６〜２９）を用いて微生物の検出を行った場合（参考例１２及び１３、並びに実施例１４及び１５）、アミラーゼを含まない前処理液（前処理液２２）を含浸して得られたコンジュゲートパッドを設けたテストストリップ（テストストリップ２２、Tween２０を０．２ｍｇ含み、ＥＤＴＡを含まない）を用いて微生物の検出を行った場合（比較例１２）と比べて、陽性唾液と陰性唾液との間の蛍光強度差が大きくなっている。この蛍光強度差は、コンジュゲートパッドに含まれるアミラーゼの量が０．０２ｍｇのとき（実施例１４）に最大値を示した。そして実施例１４の蛍光強度差は、比較例１２の蛍光強度差の６倍以上であった。
以上のように本発明によれば、微生物の検出感度が顕著に向上することが分かる。
以上のように本発明によれば、微生物の検出感度が顕著に向上することが分かる。
さらに、表５に示すように、アミラーゼを含みさらにＥＤＴＡを含む前処理液（前処理液３０〜３３）を含浸して得られたコンジュゲートパッドを設けたテストストリップ（テストストリップ３０〜３３）を用いて微生物の検出を行うことで（実施例１６〜１９）、さらに大きな蛍光強度差を示した。この蛍光強度差は、コンジュゲートパッドに含まれるＥＤＴＡの含有量が０．２μｍｏｌのとき（実施例１８）に最大値を示した。
さらに、アミラーゼを含有し、Tween２０を含まない前処理液（前処理液２５）を含浸して得られたコンジュゲートパッドを設けたテストストリップ（テストストリップ２５）を用いて微生物の検出を行った場合（実施例１１）、アミラーゼを含有しない前処理液（前処理液２１〜２４）を含浸して得られたコンジュゲートパッドを設けたテストストリップ（テストストリップ２１〜２４）を用いて微生物の検出を行った場合（比較例１１〜１４）に比べて蛍光強度差が大きかった。この結果から、前処理液に界面活性剤を加えなくても酵素を加えることで、微生物の検出感度が向上することが分かる。
さらに、アミラーゼを含まず界面活性剤の含有量を変えたい前処理液（前処理液２１〜２４）を含浸して得られたコンジュゲートパッドを設けたテストストリップ（テストストリップ２１〜２４）を用いて唾液を処理して微生物の検出を行った場合（比較例１１〜１４）、コンジュゲートパッドに含まれる界面活性剤の含有量が０．２ｍｇのとき蛍光強度差が最大値を示し、それ以上界面活性剤の量を増やすと、蛍光強度差は低下した。この結果から、界面活性剤の添加量を増加しても十分な検出感度が得られないことが分かる。
１ テストストリップ
２ サンプルパッド
３ メンブレン
４ 吸収パッド
５ コンジュゲートパッド
６ バッキングシート
１０ 試験領域
２０ 試験領域
２１ 参照領域
２ サンプルパッド
３ メンブレン
４ 吸収パッド
５ コンジュゲートパッド
６ バッキングシート
１０ 試験領域
２０ 試験領域
２１ 参照領域
Claims (14)
- イムノクロマトグラフィー用の試験片と、イムノクロマトグラフィー用の標識試薬粒子とを有するイムノクロマトグラフィー用キットを用いて、抗原抗体反応により抗原を検出する、免疫アッセイによる唾液に含まれる微生物の検出方法であって、
検体として唾液を含む液と、アミラーゼの濃度が１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下の検体前処理液とを混合した混合液を、前記イムノクロマトグラフィー用の試験片に滴下して混合液に含まれる微生物の破砕物である抗原を抗原抗体反応により検出し、微生物の検出を行う、免疫アッセイによる微生物の検出方法。 - イムノクロマトグラフィー用の試験片と、イムノクロマトグラフィー用の標識試薬粒子とを有するイムノクロマトグラフィー用キットを用いて、抗原抗体反応により抗原を検出する、免疫アッセイによる唾液に含まれる微生物の検出方法であって、
アミラーゼを含む検体前処理液を含浸し、アミラーゼの含有量を、前記試験片に滴下する検体として唾液を含む液０．０７ｍＬ当たり０．０２ｍｇ以上０．２ｍｇ以下とした部材を前記イムノクロマトグラフィー用の前記試験片に設け、
検体として唾液を含む液を前記試験片に滴下し、前記部材に移動した検体として唾液を含む液と前記アミラーゼとを前記部材中で混合し、混合液に含まれる微生物の破砕物である抗原を抗原抗体反応により検出し、微生物の検出を行う、免疫アッセイによる微生物の検出方法。 - 前記検体前処理液がさらにキレート剤を含有する、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記標識試薬粒子が、前記抗原に対する抗体が粒子表面に導入された蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- イムノクロマトグラフィー用の試験片と、イムノクロマトグラフィー用の標識試薬粒子とを有するイムノクロマトグラフィー用キットを用いて、抗原抗体反応により唾液に含まれる微生物の破砕物である抗原を検出する免疫アッセイに付す検体の処理方法であって、
抗原抗体反応に付して抗原を検出する前に、検体として唾液を含む液と、アミラーゼの濃度が１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下の検体前処理液とを混合して、前記検体として唾液を含む液とアミラーゼとを混合する、検体の処理方法。 - 前記検体前処理液がさらにキレート剤を含有する、請求項５に記載の検体の処理方法。
- イムノクロマトグラフィー用の試験片と、イムノクロマトグラフィー用の標識試薬粒子とを有するイムノクロマトグラフィー用キットを用いて、抗原抗体反応により唾液に含まれる微生物の破砕物である抗原を検出する免疫アッセイに付す検体として唾液を含む液と混合して検体を処理する免疫アッセイ用検体前処理液であって、少なくともアミラーゼを１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で含有し、イムノクロマトグラフィー用の試験片を用いて前記検体を免疫アッセイに付す前に、検体として唾液を含む液と混合して用いられる、免疫アッセイ用検体前処理液。
- キレート剤をさらに含有する、請求項７に記載の検体前処理液。
- 少なくともアミラーゼを１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で含有する、検体として唾液を含む液と混合して検体を処理する検体前処理液、
イムノクロマトグラフィー用の試験片、及び
イムノクロマトグラフィー用の標識試薬粒子
を有する、イムノクロマトグラフィー用試験キット。 - 前記検体前処理液がさらにキレート剤を含有する、請求項９に記載の試験キット。
- 前記標識試薬粒子が、抗体が粒子表面に導入された蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子である、請求項９又は１０に記載の試験キット。
- 少なくともアミラーゼを含む検体前処理液を含浸して得られた部材を設けたイムノクロマトグラフィー用の試験片、及び
イムノクロマトグラフィー用の標識試薬粒子
を有する、イムノクロマトグラフィー用試験キットであって、
前記部材中の前記アミラーゼの含有量が、前記試験片に滴下する検体として唾液を含む液０．０７ｍＬ当たり０．０２ｍｇ以上０．２ｍｇ以下である、イムノクロマトグラフィー用試験キット。 - 前記検体前処理液がさらにキレート剤を含有する、請求項１２に記載の試験キット。
- 前記標識試薬粒子が、抗体が粒子表面に導入された蛍光シリカナノ粒子からなる標識試薬粒子である、請求項１２又は１３に記載の試験キット。
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