JPH09178752A - 微生物の検出方法及び検出用検査セット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 細胞の膜構造を破壊する酵素で検体を前処理
することを特徴とする免疫反応を利用した微生物の検出
方法 【効果】 本発明によれば、測定対象の微生物の検出感
度を著しく高めることが可能となり、免疫反応を利用し
た診断において、診断の正確さを大きく向上させること
ができる。本発明の方法は検体の前処理により検出感度
を向上させるため、酵素抗体法、ラテックス凝集法、金
コロイド法、ラジオイムノアッセイ法等の各種免疫学的
検出方法において、その測定原理にかかわらず広く応用
可能な感度改善手段となりうる。さらに、本発明の検査
セットによれば、上記本発明の検出方法にしたがって検
体中の微生物の検査を確実かつ簡便に実施することがで
き、本発明の検出用検査セットを自動分析装置に用いる
と、人手を介さずに大量の検体を迅速に処理することが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、検体中の微生物の存
否、多寡を高感度に検出するための方法および検出用検
査セットに関する。

【０００２】

【従来の技術】免疫反応を利用し、病原体、細胞表面マ
ーカー、血液型、ホルモン、薬物等の測定項目を、高感
度かつ迅速に試験する方法が広く臨床検査法として応用
され、感染症の診断と治療、臓器移植や輸血適合性、妊
娠検査等、広く医学全般に大きな貢献をしている。特に
感染症の場合、以前は病原体の特定は分離培養法を用い
ていたため、検査結果が得られるまでに長い時間を要し
ていたが、免疫学的診断法の開発により、短時間に診断
を下すことが可能となり、患者の享受する利益の大きさ
には計り知れないものがある。

【０００３】免疫反応を利用し、検体中の抗原あるいは
抗体を検出するためのマーカーとしては、以前から赤血
球、菌体、ラテックス等が凝集反応を指標とする測定方
法のに用いられていたが、検出感度が低いという欠点が
あった。この欠点を解決するため、放射性元素や酵素を
標識とするラジオイムノアッセイ法（Ｒａｄｉｏｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）や酵素抗体法（Ｅｎｚｙｍ
ｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＥＩＡ）が開発され、高
感度な検出方法として臨床検査の分野で広く利用されて
いる。

【０００４】感染症の診断においては検出感度の改善に
より正診率が高くなるため、少しでも感度を向上させる
ための技術開発が行われている。特に酵素抗体法におい
ては、ラジオアイソトープを使用することなく高感度の
測定が可能であることから、本法を対象とした技術開発
が盛んである。中でも本法における感度の改善は新しい
基質の開発が大きく寄与し、発色から蛍光、さらには発
光物質が開発されるに及んで、ラジオイムノアッセイ法
以上の検出感度を得るに至っている。この分野の技術情
報については、臨床検査，３８巻，第２号（１９９４）
等に総説が掲載されている。 しかし、蛍光あるいは発
光の検出には蛍光分光計やフォトン検出器のような特別
の機器を必要とするので、その利用が制限されるという
問題がある。現在、当分野では、特別の機器を必要とし
ない検出感度の改善法の開発が待望されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記事情に鑑
みなされたものであり、現在行われている免疫反応を利
用した微生物の検出方法において、簡便な手段により、
検体中の微生物の検出感度を上げることが可能となる検
出方法を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため検討を重ねた結果、微生物の膜構造を破壊
する酵素、あるいは該酵素及び界面活性剤で検体を処理
することにより、検体中の微生物の検出感度を大幅に上
げ、正確な診断をより早く下すことが可能であることを
見い出し、本発明をなすに至ったものである。

【０００７】以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明において微生物とは、細菌、リケッチア族（Ｒｉ
ｃｋｅｔｔｓｉａｅ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄ
ｉａ）、ウイルス（ｖｉｒｕｓ）、および真核生物の原
生生物を指す。

【０００８】免疫反応とは、抗原と抗体の間に生ずる分
子間の結合反応であり、高い特異性を持っている。免疫
反応を利用して微生物の存否、多寡を判定する測定方法
としては、具体的にはラテックス凝集反応、ＥＩＡ、Ｒ
ＩＡ、蛍光免疫測定法等、免疫学的研究分野で通常利用
される各種測定法が含まれる。この中でも、ラテックス
凝集反応とＥＩＡは、特別な装置を必要とせず、簡便に
実施できる臨床検査法として検出用キットが多数市販さ
れている。

【０００９】本発明によると、検体中の抗原である微生
物を、該細胞の膜構造を破壊する酵素単独、あるいは界
面活性剤との併用下で処理することにより、微生物表面
に存在する抗原が可溶化され、その結果、１）免疫反応
が進行しやすくなる、２）エピトープの露出等の理由に
より検出感度が向上する。したがって、本発明は免疫反
応を利用するどの測定方法においても、検出感度の向上
が期待できる。さらに、抗原の可溶化により、不溶性抗
原では適用が困難なイムノクロマトグラフィー法、オク
テロニー法等も利用できるようになるという利点もあ
る。

【００１０】本発明において細胞の膜構造とは、莢膜構
造、細胞壁、細胞膜、エンベロープ等、微生物と外界と
の境界構造を指す。細胞の膜構造を破壊する酵素とは、
前述した微生物の各種膜構造に作用し、測定対象となる
エピトープの構造を破壊することなく、膜構造を分解す
る作用を有する酵素あるいは複合酵素を指す。酵素活性
としては、グリコシダーゼやホスホグリコシダーゼとし
て知られる糖鎖を切断する酵素、アミダーゼとして知ら
れる糖−アミノ酸間結合を切断する酵素、エンドペプチ
ダーゼ、エキソペプチダーゼ、プロテアーゼ等のペプチ
ド結合切断酵素、リパーゼ、ホスホリパーゼ等の脂質分
解酵素等が含まれる。さらに、上記の各酵素活性を適切
な組み合わせを選択して併用することにより、単独の場
合よりも高い溶菌活性が期待できることが知られてい
る。複合酵素は安定な状態で複数の酵素活性を発揮でき
るので特に有利である。例えば、ストレプトマイセス
グロビスポルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｌｏｂ
ｉｓｐｏｒｕｓ）ＡＴＣＣ＃２１５５３から得られるム
タノリジンは、Ｎ−アセチルムラミダーゼ活性の他にプ
ロテアーゼ活性も有しており、Ｎ−アセチルムラミダー
ゼ単独よりも高い溶菌活性を示す。その他にもカルボヒ
ドラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼからなる複合酵素系
なども知られている。なお、細胞壁を分解する酵素に関
しては、山崎真狩，「生化学データブックＩＩ」，８５
８頁〜８６６頁，社団法人 日本生化学会編集，東京化
学同人発行（１９８０年）や「溶菌酵素」，船津勝、鶴
大典編集，講談社発行（１９７７年）等に詳細が記載さ
れている。

【００１１】本発明において界面活性剤とは、表面張力
を減ずる作用を有し、可溶化、分散、浸透、乳化等の作
用により、酵素による細胞の膜構造の破壊を促進する物
質を指す。本発明者は、適切な界面活性剤処理を併用す
ることにより、酵素単独使用の場合よりも検出感度が向
上することを明らかにした。ここで使用する界面活性剤
はその構造から、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界
面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤に分
類される。陰イオン性界面活性剤としては脂肪酸誘導
体、硫酸エステル型、スルホン酸型、リン酸エステル型
等が知られている。陽イオン性界面活性剤としては４級
アンモニウム塩、アミド結合アンモニウム塩、エステル
結合アミンやエーテル結合を有する４級アンモニウム
塩、複素環アミン、アミン誘導体等が知られている。両
性界面活性剤としてはアミノ酸誘導体、イミダゾリン有
機酸誘導体、アミノスルホン酸誘導体が知られている。
非イオン性界面活性剤としてはポリオキシエチレン系、
多価アルコール系、アルキロールアミド系、糖誘導体等
が知られており、広く利用できる。

【００１２】この中で、非イオン性界面活性剤は酵素に
よる細胞の膜構造の破壊を妨害しにくく、利用しやす
い。さらに、検体の処理後に行う免疫反応に対しても、
陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界
面活性剤が共存すると免疫反応を妨害する例が多く、界
面活性剤による処理の後に、透析あるいはゲルろ過等の
適当な方法で界面活性剤を除去する必要があった。例え
ば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は膜構造の破壊
作用は強力であるが、免疫反応の阻害作用も大きく、Ｓ
ＤＳ存在下での検出は不可能であった。これに対し、非
イオン性界面活性剤は免疫反応の妨害の程度が小さく、
良好な成績が得られる例が多かった。

【００１３】界面活性剤処理を併用する場合は、酵素処
理と界面活性剤による処理の順序について、１）界面活
性剤で処理してから酵素処理を行う、２）酵素処理をし
てから界面活性剤で処理する、３）酵素処理と界面活性
剤処理を同時に行う、の三通りの組み合わせが可能であ
る。なかでも同時処理は測定時間の短縮に寄与するので
好ましく、酵素活性を妨害しない界面活性剤の種類及び
その濃度等の使用条件を設定してから実施することが望
ましい。

【００１４】免疫反応の実施条件は、各種免疫学的測定
方法について、一般に当分野で通常行われている実験条
件を採用することができる。

【００１５】次に、本発明の検出用検査セットは、検体
採取用器具、検体保存用器具、検体保存用溶液、細胞の
膜構造の破壊処理を行うための反応容器、ピペットやビ
ーカー等の計量用器具、細胞の膜構造を破壊する酵素、
又は、細胞の膜構造を破壊する酵素および界面活性剤
と、該試薬類を溶解又は懸濁するための緩衝液、及び免
疫反応を行うための試薬及び器具からなる。ここで、免
疫反応を行うための試薬及び器具は、測定原理によって
そのセットの内容が異なる。例えば、ラテックス凝集法
により測定する場合は、抗体で感作したラテックスの懸
濁液、背景が黒色の判定用ボード、混合用のヘラが必要
である。酵素抗体法の場合は、余剰の試薬を除去するた
めの洗浄液、ブロッキング剤、酵素の基質とその溶解
液、反応停止薬とその溶解液、発色用の色見本等が必要
となる。

【００１６】このような検出用検査セットによれば、操
作に熟練しない場合でも安定した試験成績を修めること
が可能となる。なお、セット化にあたっては、凍結乾燥
等のドライ化で試薬の長期保存が可能となるが、ドライ
化が困難の場合には、試薬の性状に合わせて、保存剤、
防腐剤等を適宜使用することにより保存期間を長くする
ことができる。

【００１７】本発明の検出用検査セットは、特に臨床検
査分野において、感染症の早期診断に広く応用できるも
のであり、研究用試薬や理科教材等としても広く利用可
能である。また、本発明の検出用検査セットを公知の免
疫学的測定用の自動分析装置に応用することで、大量の
検体を迅速に、人手を介さずに検出することもできる。

【００１８】

【発明の効果】本発明によれば、測定対象の微生物の検
出感度を著しく高めることが可能となり、免疫反応を利
用した診断において正診率が高くなり、診断の正確さを
著しく向上させることができる。本発明の方法は検体の
前処理により検出感度を向上するため、酵素抗体法、ラ
テックス凝集法、金コロイド法、ラジオイムノアッセイ
法等の各種免疫学的検出方法において、その測定原理に
かかわらず広く応用可能な感度改善の手段となり得る。
更に、本発明の検出用検査セットによれば、上記本発明
の検出方法にしたがって検体中の微生物の検査を確実か
つ簡便に実施することができ、本発明の検出用検査セッ
トを自動分析装置に用いると、人手を介さずに大量の検
体を迅速に処理することができる。

【００１９】

【実施例】以下、実施例と比較例を示し本発明を具体的
に説明するが、特に記述のない操作は室温で行った。蛋
白質の濃度は２８０ｎｍにおける吸光度から算出した。
なお、本発明は下記の実施例に制限されるものではな
い。

【００２０】［実施例１］ １．特異抗体の調製 １）特開昭６０−７３４６３号に記載したバクテロイデ
ス・ジンジバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｉｎｇ
ｉｖａｌｉｓ）３８１株−現在の分類にしたがうと、ポ
ルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏ
ｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、以下、Ｐ．ｇｉｎｇｉ
ｖａｌｉｓと記す）３８１株−に対するモノクローン抗
体Ｎｏ．１を産生するハイブリドーマ株を使用した。 ２）同ハイブリドーマ株をマウス腹腔内に投与して得た
腹水の５０％硫安沈殿画分から、プロテインＧカラムを
常法に従って操作し、免疫グロブリンＧ画分を得た。１
０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４、以下、Ｐ
ＢＳと記す）に対して４℃で一晩透析し、セントリカッ
ト Ｕ−５０（倉敷紡績株式会社）で濃縮し、同緩衝液
を用いて抗体溶液（抗体として１０ｍｇ／ｍｌ）を調製
した。

【００２１】２．ラテックスの感作 １）ラテックス粒子懸濁液（日本合成ゴム株式会社、Ｉ
ｍｍｕｔｅｘ Ｇ２８０１）１０μｌおよび２μｇ／μ
ｌとなるように１００ｍＭグリシン緩衝化生理食塩水
（ｐＨ８．２、以下、ＧＢＳと記す）に溶解した特異抗
体溶液１０μｌとＧＢＳをチューブに加え、全容量５０
０μｌとした。ローテーターを用いて回転（約５ｒｐ
ｍ）させながら、３７℃で２時間処理した。 ２）遠心分離により未吸着の特異抗体を除き、感作ラテ
ックスをＰＢＳで３回洗浄した後、５００μｌの１ｗ／
ｖ％ウシ血清アルブミン添加ＰＢＳ（以下、ブロッキン
グ溶液と記す）中に再懸濁し、同様にして室温で３０分
間処理し、ブロッキングを行なった。 ３）遠心分離によりラテックス粒子を回収し、ブロッキ
ング溶液で洗浄後、０．０５ｗ／ｖ％アジ化ナトリウム
と０．１ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミンを添加したＰＢＳ
を用いて、ラテックス濃度が０．５ｗ／ｖ％となるよう
なラテックス懸濁液を調製し、使用時まで４℃で保存し
た。なお、ラテックス濃度は５５０ｎｍにおける吸光度
（Ａ_５５０）から換算して求めた。

【００２２】３．検体の調製 １）Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ３８１株を用い、トリプ
チケースソイの透析外液にヘミン５μｇ／ｍｌ、メナジ
オン０．５μｇ／ｍｌを添加した培地で、３７℃で３日
間嫌気培養した。遠心分離により菌体を回収し、ＰＢＳ
で４回洗浄した後、Ａ_５５０が１．０となるように２０
ｍＭトリス塩酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ８．０）中に懸
濁し、菌懸濁液を調製した。この懸濁液を同緩衝液で段
階的に希釈した。血液平板で生菌数をチェックした結
果、Ａ_５５０＝１．０の菌懸濁液は約１Ｘ１０^９ｃｆｕ
／ｍｌに相当した。 ２）同緩衝液を用いて、リゾチーム（生化学工業株式会
社、１００９４０）、エチレンジアミン四酢酸の最終濃
度がそれぞれ４０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍＭとなるような
酵素液を調製した。 ３）１）で調製した菌懸濁液４ｍｌに対して酵素液を
０．２ｍｌを添加した。酵素液を添加しないものを比較
例とし、緩衝液を同量添加した。 ４）３７℃の恒温水槽中に３０分間静置した後、直ちに
検出操作を実施した。

【００２３】４．検出 黒色厚紙上に、ラテックス懸濁液２０μｌと検体２０μ
ｌをとって良く撹拌した後、時々振盪しながら放置し、
１０分後に凝集の有無を肉眼で判定した。判定基準は、
１）凝集塊が認められ、ラテックスの白濁が消失した場
合を＋＋（強陽性）、２）白濁しているが、凝集塊が認
められる場合を＋（陽性）、３）凝集塊が認められない
場合を−（陰性）とした。結果を表１に示した。表１の
結果から、本発明の処理法を用いた結果検出感度が高く
なり、より低濃度での菌の検出が可能となることを確認
した。

【００２４】

【表１】

【００２５】［実施例２］ １．特異抗体の調製 実施例１で調製したものを使用した。 ２．ラテックスの感作 実施例１で調製したものを使用した。 ３．検体の調製 １）実施例１で調製したＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ３８
１株の懸濁液を使用し、実施例１と同様にしてエチレン
ジアミン四酢酸存在下のリゾチーム処理を１５分間実施
した。酵素液を添加しないものを比較例とした。 ２）さらにノニデット Ｐ−４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ
−４０、以下、ＮＰ−４０と記す）を最終濃度０．０１
ｗ／ｖ％となるように添加した検体も試験した。 ３）超音波発生装置（Ｎｉｓｓｅｉ、ＵＳ−１５０）を
用いて、直径３ｍｍチップ）で１０秒間全検体を超音波
処理した後、直ちに検出操作を行った。 ４．検出 実施例１と同様に行った。結果を表２に示した。

【００２６】

【表２】 表２の結果から、本発明の処理法を用いた結果検出感度
が高くなり、より低濃度での菌の検出が可能となること
を確認した。

【００２７】［実施例３］ １．特異抗体の調製 １）エドワード ディー ザンダースらの方法（Ｅｄｗ
ａｒｄ Ｄ． Ｚａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８
１），１２２，２１７−２２５）に準じ、ストレプトコ
ッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｍｕｔａｎｓ、以下、Ｓ．ｍｕｔａｎｓと記す）ＮＣＴ
Ｃ１０４４９株（血清型ｃ、以下、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ
１０４４９と記す）の培養液上清より、硫酸アンモニウ
ム沈殿、ＤＥＡＥ−セルロースカラム、セファロース−
６Ｂカラムの操作により蛋白質抗原ｃを得た。 ２）常法に従いアジュバントとともに蛋白質抗原ｃをウ
マとヒツジに投与し、抗体価の上昇を確認後に採血し、
抗血清を分離した。この抗血清に対して３３％飽和とな
るよう硫酸アンモニウムを添加し、４℃で２回塩析し、
ＰＢＳに溶解した後、ＰＢＳに対して４℃で一晩透析し
た。 ３）蛋白質抗原ｃとＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂを
用い、常法に従って蛋白質抗原ｃ結合アフィニティーカ
ラムを調製した。硫酸アンモニウム沈殿画分を該アフィ
ニティーカラムを通し、結合画分を０．２Ｍグリシン−
塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）で溶出後、直ちに同容量の１
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加えた。 ４）その一部をＰＢＳに対して４℃で一晩透析、セント
リカット Ｕ−５０で濃縮を行ない、ＰＢＳでアフィニ
ティー精製特異抗体溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を調製し
た。

【００２８】２．検態（菌懸濁液）の調製 １）Ｓ．ｍｕｔａｎｓ １０４４９とＳ．ｍｕｔａｎｓ
ＯＭＺ１７５株（血清型ｆ）以下、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ
ＯＭＺ１７５と記す）を、それぞれブレイン・ハート
・インヒュージョン培地（以下、ＢＨＩ培地と記す）を
用いて３７℃の嫌気性条件下で一晩培養した後、遠心分
離により菌体を回収し、１０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩
水（ｐＨ６．５、以下、ＰＢＳ（ｐＨ６．５）と記す）
で４回洗浄した後、Ａ_５５０が０．６となるように同緩
衝液中に懸濁し、菌懸濁液を調製した。この懸濁液を段
階的に希釈した。対照としてはＰＢＳ（ｐＨ６．５）を
用いた。なお、ミティス・サリバリウス寒天培地で生菌
数をチェックした結果、Λ_５５０＝０．６の菌懸濁液は
両菌株ともに約２Ｘ１０^９ｃｆｕ／ｍｌに相当した。 ２）ＰＢＳ（ｐＨ６．５）を用いて、１，０００単位／
ｍｌのムタノリジン（Ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ、Ｓｉｇ
ｍａ Ｃｈｅｍｉａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍ ９９０
１）、１００ｍＭ塩化マグネシウム、５ｗ／ｖ％ポリオ
キシエチレン（以下ＰＯＥと略す）ソルビタン モノラ
ウレート、５ｗ／ｖ％ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピ
ラノシド、５ｗ／ｖ％ＰＯＥ（１０）オクチルフェニル
エーテル）、ＰＯＥ（２０）セチルエーテルの各溶液を
調製した。 ３）上記で調製した検体及び試薬を用いて、反応時に１
ｍＭ塩化マグネシウムを含有し、同じく菌体濃度は１×
１０^９、５×１０^８、１×１０^８、５×１０^７、１×１
０^７、５×１０^６、１×１０^６ｃｆｕ／ｍｌとなるよう
な条件で溶菌処理を行った。なお、反応時のムタノリジ
ン及び界面活性剤の濃度と処理条件は表３のように設定
した。ムタノリジンを添加しないものを比較例とし、所
定の処理時間が経過後、直ちに検出操作を行った。

【００２９】３．検出 １）ＥＩＡ用９６穴マルチウェルプレート（Ｃｏｓｔａ
ｒ、３５９０）に抗蛋白質抗原ｃウマ抗体溶液（１０μ
ｇ／ｍｌＰＢＳ）を１００μｌ添加し、飽和水蒸気下、
４゜Ｃで一晩静置した。 ２）抗体溶液を除いて常法通りに洗浄後、ウェルをブロ
ッキング溶液で満たし、４時間静置した。 ３）ブロッキング溶液を除いて洗浄後、処理直後の検体
を１００μｌ添加し、３０分間静置した。 ４）検体を除いて洗浄後、０．１ｗ／ｖ％ウシ血清アル
ブミン添加ＰＢＳを用いて調製した抗蛋白質抗原ｃヒツ
ジ抗体溶液（１μｇ／ｍｌ）を１００μｌ添加し、３０
分間静置した。 ５）抗体溶液を除いて洗浄後、０．１ｗ／ｖ％ウシ血清
アルブミン添加ＰＢＳを用いて２，０００倍に希釈した
「ぺルオキシダーゼ標識化抗ヒツジＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ウ
サギ抗体」（ザイメッド ラボラトリーズ Ｉｎｃ．：
ＺＹＭＥＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、６
１−８６２０）を１００μｌ添加し、３０分間静置し
た。 ６）標識化抗体溶液を除いて洗浄後、ペルオキシダーゼ
用発色キットＡ（株式会社タウンズ、ＭＬ−ＩＩＩ０
Ａ）の発色液１００μｌを添加して１５分間静置し、続
いて同停止液１００μｌを添加した。肉眼で発色の有無
を観察し、発色ウェルを陽性とした。Ｓ．ｍｕｔａｎｓ
ＯＭＺ１７５、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ １０４４９の検出
限界（ｃｆｕ／ｍｌ）をそれぞれ表３・表４、表５・表
６に示した。表３乃至表６の結果から、本発明の処理法
を用いた場合検出感度が高くなり、より低濃度での菌の
検出が可能となることを確認した。

【００３０】

【表３】

【００３１】

【表４】

【００３２】

【表５】

【００３３】

【表６】

【００３４】［実施例１２］ １．特異抗体の調製 １）エドワード ディー ザンダースらの方法（Ｅｄｗ
ａｒｄ Ｄ． Ｚａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（ｌ９８
１），１２２，２１７−２２５）に準じ、ストレプトコ
ッカス・ソブリヌス（Ｓｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏ
ｂｒｉｎｕｓ）６７１５株（血清型ｇ、以下、Ｓ．ｓｏ
ｂｒｉｎｕｓ６７１５と記す）の培養液上清より、硫酸
アンモニウム沈殿、ＤＥＡＥ−セルロースカラム、セフ
ァロース−６Ｂカラムの操作により蛋白質抗原ｇを得
た。 ２）実施例３〜７記載の方法と同様にして、蛋白質抗原
ｇでウサギを免疫し、抗血清を分離した。続いて硫酸ア
ンモニウムによる塩析、ＰＢＳに対する透析を同様に行
った。 ３）蛋白質抗原ｇとＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂを
用い、常法に従って蛋白質抗原ｇ結合アフィニティーカ
ラムを調製した。硫酸アンモニウム沈殿画分を該アフィ
ニティーカラムを通し、結合画分を０．２Ｍグリシン−
塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）で溶出後、直ちに同容量の１
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加えた。 ４）１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４゜
Ｃで一晩透析、セントリカット Ｕ−５０で濃縮を行な
い、同緩衝液でアフィニティー精製特異抗体溶液（１０
ｍｇ／ｍｌ）を調製した。

【００３５】２．標識抗体の調製 １）１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製した西
洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（和光純薬工業株式会
社， １６２−１２８８３）溶液（５ｍｇ／ｍｌ）２ｍ
ｌに１００μｌの１００Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液
を添加し、３０分間反応させた後、５ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ４．５）に対して４℃で一晩透析した。 ２）透析膜内液にＩＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）を添加
してｐＨを９．５に調整した。 ３）１．で調製した特異抗体溶液２ｍｌにＩＭ炭酸緩衝
液（ｐＨ９．５）１００μｌを加え、直ちに酵素溶液中
に添加して２時間反応させた。 ４）１ｗ／ｖ％水素化ホウ素ナトリウム水溶液１００μ
ｌを加えて氷水浴中で２時間反応させた後、ＰＢＳに対
して４℃で一晩透析した。 ５）１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した
セファデックスＧ−２００でゲルろ過して、酵素標識抗
体画分を回収した。同画分をセントリカットＵ−５０で
濃縮した後、１ｍｇ／ｍｌの特異抗体溶液と同等の抗原
結合活性を有するように同緩衝液で濃度を調整した。

【００３６】３．検体の調製 １）Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ６７１５をＢＨＩ培地を用い
て３７℃の嫌気性条件下で一晩培養した後、遠心分離に
より菌体を回収した。１０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水
（ｐＨ６．５、以下、ＰＢＳ（ｐＨ６．５）と記す）で
４回洗浄した後、Ａ_５５０が０．３となるように同緩衝
液中に懸濁し、菌懸濁液を調製した。この懸濁液を実施
例３〜７と同様に段階的に希釈し、１Ｘ１０^９〜１Ｘ１
０^４ｃｆｕ／ｍｌ相当の菌懸濁液を調製した。対照とし
てはＰＢＳ（ｐＨ６．５）を用いた。なお、ミティス・
サリバリウス寒天培地で生菌数をチェックした結果よ
り、Ａ_５５０＝０．３の菌懸濁液は約１Ｘ１０^９ｃｆｕ
／ｍｌに相当した。 ２）菌懸濁液１０ｍｌをポリプロピレン製チューブに取
り、３，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を除去
した。 ３）ＰＢＳ（ｐＨ６．５）を用いて、Ｎ−アセチルムラ
ミデイス ＳＧ（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓ
ｅ ＳＧ、生化学工業株式会社、１０００９５）、塩化
マグネシウム、界面活性剤の最終濃度が、それぞれ１０
０単位／ｍｌ、１ｍＭ）、０．１ｗ／ｖ％となるような
酵素液を調製した。この組成から酵素だけを除いた溶液
で処理したものを比較例とした。界面活性剤としては、
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ｎ−オ
クチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ポリオキシエチレ
ン（１０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチ
レン（２０）セチルエーテルを用いた。 ４）酵素液２ｍｌを添加し、良く懸濁してから室温で３
０分間静置した。検体を二分し、その一部を０．４５μ
ｍミリポアフィルターでろ過してろ過液を得た。反応液
及びそのろ過液を用いて直ちに検出操作を行った。

【００３７】４．検出 １）内径約８ｍｍのガラスチューブに、抗蛋白質抗原ｇ
ウサギ抗体溶液（１０μｇ／ｍｌＰＢＳ）を５００μｌ
添加し、４゜Ｃで一晩静置した。 ２）抗体溶液を除いて常法通りに洗浄後、試験管を０．
１ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミン添加ＰＢＳで満たし、４
℃で一晩、ブロッキング処理した。 ３）ブロッキング用溶液を除いて洗浄後、処理直後の検
体を５００μｌ添加し、３０分間静置した。 ４）検体を除いて洗浄後、ＰＢＳで２０００倍に希釈し
た酵素標識抗体溶液（２．で調製したもの）５００μｌ
を添加して３０分間静置した。 ５）標識化抗休溶液を除いて洗浄後、ペルオキシダーゼ
用発色キットＡ（株式会社タウンズ、ＭＬ−１１１０
Ａ）の発色液５００μｌを添加して１５分間静置し、続
いて同停止液５００μｌを添加した。肉眼で発色の有無
を観察し、発色チューブを陽性とした。検出限界（ｃｆ
ｕ／ｍｌ）を表５に示した。表５の結果から、本発明の
処理法を用いた結果検出感度が高くなり、より低濃度で
の菌の検出が可能となることを確認した。

【００３８】

【表７】

【００３９】［実施例１４］下記内容からなるストレプ
トコッカス・ミュータンスの検出キットを作成した。 １．パラフィン・ペレット ２．プラスチック・カップ ３．プラスチック・スポイト ４．酵素反応用チューブ ５．免疫反応用チューブ 抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体をコーティン
グしたチューブＰＢＳを用いて、実施例３で調製した抗
蛋白質抗原ｃウマ抗体溶液（抗体濃度：２０μｇ／ｍ
ｌ）を調製し、ポリスチレン製チューブの表面に抗体を
吸着させた後、ウシ血清アルブミンでブロッキング処理
し、０．１ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミン添加ＰＢＳで満
たしたもの。 ６．界面活性剤水溶液 ２０％ポリオキシエチレン ソルビタン モノラウレー
ト水溶液 ７．酵素 ムタノリジン（５００単位）の凍結乾燥品 ８．酵素溶解液 １００ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ６．５） ９．抗体Ｉ 実施例３で調製した抗蛋白質抗原ｃヒツジ抗体（１０ｐ
ｇ）とウシ血清アルブミン（１ｍｇ）の凍結乾燥品 １０．抗体ＩＩ アルカリ性ホスファターゼ結合抗ヒツジ免疫グロブリン
Ｇ抗体（抗体として５μｇ）とウシ血清アルブミン（１
ｍｇ）の凍結乾燥品 １１．抗体溶解液 ５０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４） １２．基質 ｐ−ニトロフェニルリン酸ニナトリウム六水和物５６ｍ
ｇ １３．基質溶解液 １ｍＭ塩化マグネシウムを含む１Ｍジエタノールアミン
緩衝液（ｐＨ９．８） １４．陽性対照 所定のｃｆｕに相当するＳ．ｍｕｔａｎｓ懸濁液を、ム
タノリジンで完全に溶菌させた得た溶菌液のミリポアフ
ィルターろ過液 １×１０^４ｃｆｕ／ｍｌ、１×１０^６ｃｆｕ／ｍｌ、１
×１０^８ｃｆｕ／ｍｌ １５．洗浄液 ＰＢＳで調製した０．０５ｗ／ｖ％ポリオキシエチレン
ソルビタンモノラウレート溶液 １６．反応停止液 ２Ｎ水酸化ナトリウム １７．タイマー

【００４０】１８．取扱説明書（唾液が検体の場合） １）測定に先立って、下記の試薬を調製する。 ・凍結乾燥酵素に酵素溶解液１ｍｌを添加、溶解させ、
酵素溶液とする。 ・抗体Ｉ、抗体ＩＩにそれぞれ抗体溶解液１ｍｌを添
加、溶解させ、それぞれ抗体溶液Ｉ、ＩＩとする。 ・基質に基質溶解液１０ｍｌを添加、溶解させ、基質溶
液とする。 ２）パラフィン・ペレットを５分間噛んだ後、唾液をプ
ラスチック・カップに取る。 ３）プラスチック・スポイトで唾液を０．５ｍｌ取り、
酵素反応用チューブの底の部分加え、界面活性剤水溶液
１滴を加え、良く混ぜてから１分放置する。続いて、酵
素溶液２滴を加え、良く混ぜてから２０分間放置する。 ４）プラスティック・スポイトで酵素処理した唾液を取
り、免疫反応用チューブの底の部分に５滴落とし、１５
分間放置する。 ５）洗浄液で免疫反応用チューブを３回洗浄する。 ６）抗体溶液Ｉを５滴加え１５分間放置した後、５）と
同様に洗浄する。 ７）抗体溶液ＩＩを５滴加え１５分間放置した後、５）
と同様に洗浄する。 ８）基質溶液を１０滴を加え良く混ぜてから加え、その
まま放置し、発色の程度を観察する。 ９）陽性対照に発色を認めたら反応停止液を１滴加え
る。 １０）陽性対照および検体の発色の程度を比較し、検体
中のＳ．ｍｕｔａｎｓ濃度を判定する。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】免疫反応を利用した微生物の検出におい
   て、細胞の膜構造を破壊する酵素で検体を前処理するこ
   とを特徴とする微生物の検出方法
2. 【請求項２】細胞の膜構造を破壊するにあたり、酵素に
   界面活性剤を併用して検体を前処理することを特徴とす
   る請求項１記載の微生物の検出方法
3. 【請求項３】請求項１又は２記載の検体の前処理剤、免
   疫反応を行うための試薬及び器具とを具備してなる、免
   疫反応を利用した微生物を検出するための検出用検査セ
   ット。