DK174032B1 - Sæt samt fremgangsmåde til immunometrisk dosering, der kan anvendes på hele celler - Google Patents

Description

i DK 174032 B1

Den foreliggende opfindelse angår et udstyr og en fremgangsmåde til immunometri sk bestemmelse under anvendelse af dette udstyr til bestemmelse af overfladeantigener, der er karakteristiske for cellepopulationer eller celleunderpopulat ioner.

5 Fremgangsmåden til immunometri sk bestemmelse og det tilsvarende udstyr er ligeledes beregnet til bestemmelse af cellerne selv ved mellemliggende bestemmelse af deres overfladeantigener. Disse bestemmelser er anvendelige i diagnostikken.

10 Kendskabet til antigener eller markører på celleoverf1aden har gjort store fremskridt med den praktiske anvende 1iggørelse af lymfocythybridisering og opdagelsen af monoklonale antistoffer af Koehler og Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497). De monoklonale antistoffer har især muliggjort anskueliggørelse 15 og analyse af overf 1ademarkører eller membrananti gener på celler af de mest forskelligartede oprindelser. Disse markører (eller antigener) kan være af forskellige karakter: proteiner, glycoproteiner eller giyco1ipider. De tilstræbte karakteriseringer gælder hovedsagelig vævsmarkører eller organmarkører, 20 markører af differentieringstilstande eller aktiveringstil-stande af normale celler og identifikation eller typebestemmelse af normale celler eller cancerceller. Et særligt vigtigt anvendelsesområde er undersøgelse af bloddannelsescellelinier (erythrocyt, megakaryocyt, granulocyt, monocyt, lymfocyt).

25

De monoklonale antistoffer har således f.eks. muliggjort at fastsætte de respektive overfladeegenskaber af lymfocytterne T og B. De tilsvarende markører alene eller i kombination identificerer differentieringsstadier og funktionelle specialise-30 ringer af lymfocytter. Ifølge international konvention er leu-kocytternes overflademarkører blevet klassificeret i grupper eller differentieringsklasser (CD) defineret af underkommi teen IUIS-OMS, 1984 og beskrevet i Verdenssundhedsorganisationens Bulletin 1984, 62 (5), 813-815.

35

Identifikationen af disse markører, der er muliggjort i kraft af monoklonale antistoffer, har gjort det muligt at nå frem til deres struktur og deres biologiske funktioner. Molekyler- DK 174032 B1 2 ne af markørerne CD4 og CD8 tager f.eks. del i 1 eukocytadhæsionsfunktioner og befinder sig på overfladen af T-lymfocytter og har henholdsvis en hjælpefunktion og induktionsfunktion (markør CD4) eller en cytotoksisk og undertrykkende funktion 5 (markør CD8).

Etableringen af denne viden har gjort det muligt at udnytte disse markører takket være de antistoffer, som de genkender, til at diagnosticere og følge forskellige patologier især ma-10 ligne hæmopatier (leukæmier, lymfomaer osv.) og tilstande af funktionsforstyrrelser af immunsystemet (auto immunsygdomme, medfødte eller erhvervede immunologiske mangler, såsom SIDA osv.) (BRET0N-G0RIUS et VAINCHENKER, Le Biologiste, 1987, XXI, nr. 167, 63-70, SHAW, Immunology today, 1987, 8 (1), 1-3).

15

Monoklonale antistoffer er i dag uerstattelige værktøjer for den anvendte kliniske biologi til analyse af celler.

Der findes fremgangsmåder til optælling af celler, som udnyt-20 ter mærkningen af deres overfladeantigener, men disse fremgangsmåder er ofte langvarige, komplicerede og vanskelige at udføre, og deres resultater er undertiden usikre.

De kendte fremgangsmåder, der anvendes til at måle den norma-25 ie eller modificerede ekspression af antigenerne på overfladen af cellen, kan opdeles i to grupper. I den første gruppe måles antigenerne ved hjælp af kompliceret og specialiseret laboratorieudstyr, der er baseret på strømn ingscytornetri (se især PONCELET med flere, J. Immunol. Methods, 1985, 85, 65-74) el-30 ler de kvantitative mi kroskopi teknikker (POULTER med flere, J. Immunol. Methods, 1987, 98, 227-234). Udførelsen af disse bedømmelsesmetoder for cellens antigener er baseret på måling af signaler, der bæres af anti celleantistoffer koblet direkte eller indirekte til en reaktionsdygtig markør med fluoresce-35 rende stoffer (eller f1uorochromer), såsom f1 uoresceini sothio-cyanat eller rhodamin, eller enzymer såsom peroxydase eller alkalisk phosphatase. Anvendelse af disse fluorescerende reagenser eller enzymatiske reagenser sammen med passende vaske- i 3 DK 174032 B1 trin fører så til fremkomst af fluorescenser eller farvninger, der er nøje begrænset til cel lemembranerne og ikke spredes i det omgivende miljø. Den nuværende anvendelse af disse laboratoriemetoder er begrænset af nødvendigheden af et kostbart og 5 specialiseret apparatur (fluorescensmikroskop eventuelt sammen med en bi 1 ledanalysator, cryostat og strømningscytometer). Analysen og fortolkningen af immunomarkeri ngerne af cellerne ved disse fremgangsmåder nødvendiggør desuden en cytologisk specialists kompetence.

10

En anden gruppe fremgangsmåder til måling af antigener er baseret på'den kvantitative bedømmelse af markører af den samlede cellepopulation. Disse fremgangsmåder muliggør måling af antigener med et mærke enten direkte eller indirekte, som så 15 udføres hyppigst i to, tre eller fire trin. I alle tilfældene bærer det anvendte reagens fra det sidste markeringstrin en sonde, som er enten af isotop karakter f.eks. jod 125 til en radioimmunbestemmelse (BROW med flere, J. Immunol. Methods, 1979, 31, 201 - STOCKER et HEUSSER, J. Immunol. Methods, 1979, 20 26, 87-95) eller et enzym til en bestemmelse af enzymometri sk type, som oftest peroxydase, alkalisk phosphatase eller β-ga-laktosidase (VAN LEUVEN med flere, J. Immunol. Methods, 1978, 23, 109-116 - MORRIS Transplantation, 1983, 36 (6), 719 - BAUMGARTEN, J. Immunol. Methods, 1986, 94, 91-98).

25

Fremgangsmåderne i denne sidstnævnte gruppe er temmelig upraktiske, besværlige og farlige at anvende på grund af nødvendigheden af talrige vaskninger og centrifugeringer af cellemateriale. Oet er undertiden nødvendigt at udtage det farvede me-30 dium, der fremkommer ved den enzymatiske reaktion med henblik på den endelige spektrofotometri ske måling. Endelig er den kemiske fiksering af cellerne, som oftest anvendes, årsag til irreversibel ødelæggelse af visse antigener, der er særligt følsomme for sædvanlige kemiske fikseringsmidler, såsom glu-35 taraldehyde eller methanol (DROVER med flere, J. Immunol. Methods, 1986, 90, 275-281).

Det er kendt fra litteraturen, at man kan bestemmes et antigen, der bærer flere antigene determinanter, dvs. flere epito- 4 DK 174032 B1 per ved at fiksere dette antigen med en af dets epitoper i kraft af et antistof immobi1 i seret på en fast bærer, og ved at binde til en anden epitop af antigenet et andet antistof, som bærer en enzymatisk markør eller radioisotopmarkør, som mulig-5 gør måling.

En sådan teknik, der ofte kaldes sandwichteknik, er især beskrevet i de franske patentansøgninger nr. 2.487.983, 2.500.

165 og EP 119.736. Ingen af disse dokumenter beskriver anven-10 delse af denne teknik til hele celler, selv om ordet "celle" undertiden er indbefattet i den liste over antigener, som processen kan anvendes til.

I de ovennævnte patenter er de forskellige antigener, der er 15 genstand for eksemplerne, alle udelukkende proteinmolekyler, der er opløselige i vand og fysiologiske væsker, såsom hormoner, enzymer eller cirkulerende tumormarkører. I modsætning hertil er det klart, at en celle ikke er et molekyle og adskiller sig i det mindste ved en betydeligt større størrelse 20 og ved at den ikke er opløselig i fysiologiske medier. Indtil i dag har sandwichteknikken derfor aldrig været anvendt på hele celler.

I øvrigt er immunoindfangning af celler på en fast bærer be-25 skrevet i patentansøgning WO 86/02091, hvor formålet er at fjerne uønskede celler i prøver af knoglemarv beregnet til transplantationer. Ifølge denne patentansøgning udføres indfangningen af cellerne på flydende mikrokugler og nødvendiggør, at det anvendte antistof er forbundet med den faste bæ-30 rer med en kompleks makromolekylær struktur kaldet netrelæ, som er i stand til at sikre en begunstiget orientering af antistoffet i forhold til det tilsvarende celleantigen. I denne ansøgning er der ikke vist nogen anvendelse af teknikken til kvantitativ bestemmelse af et antigen.

35

Immunoindfangning af celler er ligeledes beskrevet i ansøgning W0 84/03151 til en analytisk anvendelse. I denne ansøgning er formålet at identificere vævstyper, som de undersøgte celler 5 DK 174032 B1 tilhører (en operation, der i almindelighed kaldes typebestemmelse HLA). Indfangningen af cellerne sker i kraft af antistoffer, der befinder sig efter en særlig geometri på meget specialiserede bærere (mi kroskop 1ame11 er ) . Resultaterne fås 5 ved simpel visuel iagttagelse af bæreren og fører til svarene alt eller intet. De hidtil beskrevne systemer til immunoind-fangning af celler fører således ikke til analytiske anvendelser, der muliggør kvantitativ bestemmelse af et antigen udtrykt på membranen af bestemte celler. Endvidere kan alle dis-10 se systemer mangle specificitet, for de er baseret på genkendelse af celler af et enkelt antistof.

Bestemmelsesmetoden, som er genstand for den foreliggende opfindelse, har betydelige fordele sammenlignet med alle de tid-15 ligere kendte og anvendte teknikker, for den gør det muligt at måle på kvantitativ måde alt antigen i en cellepopulation i et enkelt analysetrin. Denne bestemmelse udføres på celler, som ikke underkastes noget kemisk eller fysisk indgreb, og som er i deres fuldstændige fysiologiske tilstand. Endvidere har be-20 stemmelsesmetoden ifølge opfindelsen ejendommelighederne ved meget høj specificitet, som er særegen for systemer med dobbelt immunologisk genkendelse, som udnytter 2 forskellige antistoffer, der er specifikke for 2 forskellige antigener båret af samme celle. Denne fremgangsmåde er enkel, hurtig og repro-25 ducerbar. Den er helt egnet til analyse af et stort antal prøver, hvilket muliggør dens udnyttelse til diagnostiske formål i kliniske, biologiske 1 abora tor i er med stort udbytte.

Den foreliggende opfindelse angår således et udstyr til immu-30 nometrisk bestemmelse af mindst ét overfladeantigen, som er karakteristisk for en population eller underpopulation af celler, og som omfatter som bestanddele*.

a) en fast bærer, hvorpå der ved covalent binding eller ved 35 fysisk adsorption er fikseret et eller flere monoklonale antistoffer rettet mod overfladeantigener af den undersøgte cellepopulation udover nævnte karakteristiske antigen og beregnet til på bæreren at i mmobilisere cellerne, hvoriblandt findes i 6 DK 174032 B1 celler af underpopulationen, som bærer antigenet, der skal bestemmes; b) mindst én opløsning omfattende et specifikt monoklonalt 5 antistof for det karakteristiske antigen i cellepopulationen eller celleunderpopulationen, som bærer antigenet der skal bestemmes, og som er mærket med en radioisotopsonde eller enzymatisk sonde; 10 c) hvor det drejer sig om monoklonale antistoffer mærket med en enzymatisk sonde, et enzymrøbestof, nemlig en eller flere opløsninger indeholdende enzymsubstratet og i givet tilfælde et eller flere reagenser, der er nødvendige til at afsløre enzymets aktivitet.

15

Udtrykket celle anvendt i den foreliggende beskrivelse og kravene indbefatter menneskeceller, dyreceller, protozoceller og mikroorganismeceller (bakterier eller svampe). Hvad angår blodcellerne indbefatter opfindelsen kerneholdige formede ele-20 menter, såsom leukocytter og formede elementer uden kerne, såsom røde blodlegemer eller blodplader.

Bestemmelsesmetoden ifølge opfindelsen er anvendelig til hele celler, dvs. ikke-lysede celler.

25

Cellerne har ikke undergået noget fysisk eller kemisk indgreb, og de anvendes i en tilstand af fuldstændig fysiologisk helhed. Denne sitution udgør den bedste garanti for integritet af de som bestemmelsesmål valgte membranmarkører.

30

Som fast bærer kan man anvende ethvert system, der er egnet til manipulation af cellesuspensioner og fortrinsvis reagensglas, partikel formede magnetiske bærere eller stive eller bløde mikrotitreringsplader af polyethylen, polystyren, poly-35 vinylchlorid eller nitrocellulose, som har mikrofordybninger.

De monoklonale antistoffer beregnet til immobilisering af cellerne kan være fikseret på de faste bærere enten ved covalent kemisk binding eller ved fysisk adsorption efter den klassiske 7 DK 174032 B1 velkendte teknik, såsom den der er beskrevet af STOCKER og HEUSSER, J. Immunol. Methods, 1979, bind 26, side 87-95. Med fordel kan bæreren forud være mættet ved hjælp af et protein.

5 Ifølge opfindelsen skal det eller de monoklonale antistoffer, som er fikseret på den faste bærer, muliggøre indfangning af cellepopulationen, i hvilken der findes den eller de cellepopulationer, som bærer antigenerne, der skal bestemmes. Når denne population udgøres af humane celler, er de foretrukne 10 monoklonale antistoffer til indfangningen antistofferne anti-HLA af klasse I, som er specifikke for den fælles del af antigenerne HLA A, B og C, som findes på 1 eukocytterne, og for talrige andre af organismens cellelinier. Blandt disse antistoffer foretrækkes især de, der kaldes S-klasse I, der for-15 handles af BIOSYS.

I andre tilfælde, hvor de undersøgte celler er humane celler, og i alle tilfælde, når cellerne ikke er humane, kan monoklonale antistoffer passende til den undersøgte celletype lige-20 ledes anvendes til immuno i ndfangni ng ifølge opfindelsen.

Udtrykket "et monoklonalt antistof mærket med en radioisotopsonde" betegner, at det monoklonale antistof bærer enten på et passende element i strukturen f.eks. de indgående tyrosinre-25 ster eller på et passende radikal, som er blevet fikseret derpå, en radioaktiv isotop, som gør det muligt at bestemme den ved tælling af den dermed forbundne radioaktivitet.

Udtrykket "et monoklonalt antistof mærket med en enzymatisk 30 sonde" betyder, at det monoklonale antistof er koblet med et enzym, som sammen med anvendelse af passende reagenser muliggør en kvantitativ måling af dette monoklonale antistof.

Substratet og reagenserne vælges således, at det endelige re-35 aktionsprodukt eller det endelige produkt fra rækkefølgen af reaktioner fremkaldt med enzymet, og som benytter disse stoffer, er: 8 DK 174032 B1 enten et farvet eller fluorescerende stof, som diffunderer i det flydende medium, som omgiver cellerne, og som er genstand for den endelige spektrofotometri ske eller f1uori metri ske måling, 5 eller et farvet stof, der er uopløseligt, og som aflejrer sig på cellerne og væggene, hvorpå de er fikseret, og som kan gøres til genstand for enten en fotometrisk:måling ved refleksion eller en visuel bedømmelse eventuelt i forhold til en 10 kalibreret farveskala.

Bestemmelsesudstyret kan som yderligere bestanddel indeholde en stcdpudeopløsning beregnet til vask af den faste bærer efter immobilisering og mærkning af cellerne med det eller de 15 antistoffer, som bærer den valgte sonde.

Bestemmelsesudstyret kan også indeholde som yderligere bestanddele de prøver, som er nødvendige til kalibrering af bestemmelsen og til kontrol af kvaliteten af bestemmelsen.

20

Opfindelsen angår ligeledes en fremgangsmåde til immunometri sk bestemmelse af overfladeantigener på en cellepopulation eller cel 1eunderpopu1 at i on, som er ejendommelig ved, at den omfatter: 25 et enkelt trin til specifik immobilisering eller immunoind-fangning af en cellepopulation på den faste bærer under anvendelse af et eller flere monoklonale antistoffer, der forud er fikseret ved covalent binding eller ved fysisk adsorption på 30 bæreren og i stand til at genkende et antigen, der findes på overfladen af cellerne, udover det antigen som skal bestemmes og samtidig direkte mærkning af overfladeantigenet, der skal bestemmes, og som hører til den immobi 1 i serede cellepopulation eller til en af dens underpopulationer, med et monoklonalt 35 antistof, der er specifikt for dette antigen, der skal bestemmes, hvilket monoklonale antistof bærer en radioisotopsonde eller alternativt enzymatisk sonde, 9 DK 174032 B1 en inkubationsperiode for at tillade immunoindfangning og samtidig mærkning, vask af den faste bærer for at fjerne uønskede celler eller 5 ikke-immobi 1 i serede celler og overskud af monoklonalt antistof, som bærer den radioisotope eller enzymatiske sonde, egentlig måling af antigenet, der skal bestemmes, i den mærkede cellepopulation eller celleunderpopulation ved tælling af 10 den fikserede radioaktivitet eller alternativt efter behandling af mediet med substratet for enzymet og eventuelt et eller flere passende hjælpereagenser, ved transmissionsfotometrisk eller refleksionsfotometrisk måling eller ved måling af fluorescensemissionen.

15

Bestemmelsesudstyret og den immunometri ske fremgangsmåde ifølge opfindelse anvendes fortrinsvis til bestemmelse af overfladeantigener af formede elementer af humant blod, især leuko-cytter, og specielt lymfocytter, T-lymfocytter, T4-lymfocyt-20 ter, T8-1ymfocytter, B-lymfocytter samt granulocytter, mono-cytter og blodplader.

En anden foretrukken anvendelse er bestemmelse af overfladeantigenerne på patogene mikroorganismer, f.eks. Candida albi-25 cans.

Desuden er bestemmelsesudstyret og den immunometri ske fremgangsmåde ifølge opfindelsen især anvendlig til bestemmelsen af overfladeantigener på tumorceller, især cancerceller fra 30 urinvejene og ondartede hæmopaticel1 er.

Bestemmelsesudstyret og den immunometri ske fremgangsmåde ifølge opfindelsen gør det muligt at måle signaler (radioaktivitet eller absorberet eller udsendt lys), som afhænger både af 35 antallet af celler, der findes i den undersøgte cellepopulation, og af den målte antigentæthed på overfladen af cellerne. Måling af disse signaler tillader en kvantitativ bedømmelse af det totale antal molekyler af dette antigen, som bæres af den 10 DK 174032 B1 undersøgte cellepopulation eller celleunderpopulation, hvori dette antigen har en strukturel eller funktionel rolle.

Hvor det drejer sig om leukocytmarkører, der er særlig betyd-5 ningsfulde i hæmatologien, ved man f.eks., at hos sunde individer i det fleste situationer varierer middelværdien af an-tigentætheden ikke særlig meget fra en prøve til en anden for samme cellepopulation. Der eksisterer så en god korrelation mellem den cytologiske tælling af cellerne, som bærer det på-10 gældende antigen, og det signal som måles ifølge opfindelsen, som er proportionalt med antallet af antigenmolekyler, der findes i den undersøgte prøve. I visse patologiske tilstande kan tætheden af overfladeantigener tværtimod variere for samme cellepopulation, uden at antallet eller mængden af positive 15 celler varierer særligt. Sådanne patologiske tilstande påvises mere effektivt ved anvendelse af den immunometriske fremgangsmåde ifølge opfindelsen eller ved anvendelse af udstyret ifølge opfindelsen end ved en sædvanlig fremgangsmåde til cytologisk tælling.

20

En anden anvendelse af opfindelsen fås ved som fast bærer at vælge en mikrotitrer ingsp1ade. Bestemmelsesudstyret og den immunometriske fremgangsmåde ifølge opfindelsen kan så med fordel udnyttes til bestemmelse på en enkelt plade af en række 25 overfladeantigener, der er karakteristiske for forskellige underpopulationer, som udgør den undersøgte cellepopulation. Til denne anvendelse kan man anvende på den ene side mikrotitre-ringsplader parat til anvendelse, hvorpå der er fikseret på forhånd et eller flere monokonale antistoffer, som er i stand 30 til at tilbageholde alle cellerne af den undersøgte population og på den anden side anbringe en række monoklonale antistoffer, koblet til en passende markør, og som hver er specifikke over for et antigen, der er karakteristisk for en af de under-populationer, der skal bedømmes. Ved en enkelt manipulation og 35 på samme bærer kan man således opnå kvantitativ bestemmelse af alle de antigener, der er nødvendige til karakterisering af de valgte underpopulat i oner.

11 DK 174032 B1

Denne anvendelse af den foreliggende opfindelse illustreres af karakteriseringen af den antigene udrustning af celler, der har interesse i klinisk biologi. Et første tilfælde repræsenteres af bestemmelsen af vævsgrupper, som karakteriserer et 5 givet individ, og som er kendt under den sædvanlige betegnelse typebestemmelse HLA.

Et andet tilfælde repræsenteres af typebestemmelsen af tumorceller, især for syge der når maligne hæmopatier såsom leu-10 kæmier og lymfomaer. Denne diagnostiske undersøgelse, der praktiseres systematisk, består i at karakterisere typen og oprindelsen af patientens tumorceller ved tilstedeværelsen eller fraværet på cellerne af en række overfladeantigener, der vælges passende.

15

Ved at anvendes udstyret ifølge opfindelsen, som omfatter en mikrotitreringsplade, hvorpå der på forhånd er fikseret et eller flere monoklonale antistoffer, som er i stand til at fiksere alle cellerne af den undersøgte population, og opløsnin-20 ger af forskellige monoklonale antistoffer mærket med en enzymatisk eller radioisotopsonde, der hver er specifik for et antigen, der findes på tumorcellerne, kan man identificere og kvantitativt bedømme de antigener, der er karakteristiske for patientens population af tumorceller, og derved henføre dem 25 til en af de store cancergrupper og især maligne hæmopatier, der karakteri seres klinisk. Anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen gør det således muligt på en enkelt bærer hurtigt at udføre en kvalitativ og kvantitativ undersøgelse af tumorcellernes antigene udrustning.

30

Til illustration af en anden anvende 1 se af opfindelsen kan nævnes tilfældet med humane T-lymfocytter, af hvilke der eksisterer især 2 underpopulationer af celler: lymfocytter, der er karakteristiske ved tilstedeværelsen af markøren CD4, som man 35 kalder positive T4-lymfocytter eller blot T4-lymfocytter, og lymfocytter der er karakteristiske ved tilstedeværelse af markøren CD8, og som man kalder positive T8-lymfocytter (eller T8-lymfocytter).

12 DK 174032 B1 Måling af det numeriske forhold T4/T8 har stor diagnostisk interesse i den kliniske biologi. Det er faktisk kendt, at ændringer i forholdet T4/T8 forekommer ved forskellige påvirkninger af immunsystemet, såsom immunforstyrrende sygdomme, 5 kroniske infektionssygdomme, virale infektioner og især HI V-sygdomme (SIDA-virus).

Bestemmelsesudstyret og den immunometri ske fremgangsmåde ifølge opfindelsen kan anvendes til bestemmelse af antigener, der 10 samlet er karakteristiske for populationen af T-lymfocytter og/eller antigener, der er karakteristiske for underpopulationer af T4- og T8-lymfocytter. I dette tilfælde udfører man specifik immob i lisering af T-lymfocytter fra den undersøgte prøve på en fast bærer, og samtidig udfører man direkte mærk-15 ning af overfladeantigener på T4-lymfocytterne med et mono-klonalt antistof anti-CD4 som bærer en radio i sotop eller enzymatisk sonde. På samme måde udfører man direkte mærkning af overf1adeant i gener på T8-lymfocytter med et monoklonalt antistof anti-CD8, som bærer en passende sonde.

20

Til bestemmelse af totale T-lymfocytter anvender man fortrinsvis et monoklonalt antistof anti-CD7 (ligeledes betegnet an-ti-T2), som bærer en passende sonde.

25 For at få specifik immobilisering af prøvens T-lymfocytter anvendes fortrinsvis et eller flere monoklonale antistoffer, der er i stand til alene eller i kombination at genkende alle prøvens T-celler, hvilket er tilfældet med de almindelige anti-leukocyt antistoffer (eller anti-CD45) eller antistoffer, som 30 genkender hele T-populat ionen (kaldet "pan T"), såsom antistofferne anti-CD2 (eller anti-Tll), anti-CD5 (eller anti-Tl), anti-CD7 (eller anti-T2) eller andre pan-T antistoffer, som endnu ikke er henført til en differentieringsklasse ifølge OMS-kriterierne.

Man kan med fordel anvende den immunometriske fremgangsmåde ifølge opfindelsen til bestemmelse af antigener, der er karakteristiske for populationen af T-lymfocytter og T4- og T8-lym- 35 13 DK 174032 B1 focytter på flere dele af samme faste bærer. Måling af signalerne ved tælling af radioaktivitet, fotometrisk måling i transmission eller refleksion eller fluorescensmåling gør det muligt let og direkte at beregne det numeriske forhold 5 CD4/CD8.

På samme måde kan man på samme faste bærer bestemme de underpopulationer, der kaldes T-1ymfocytter og B-1ymfocytter , og som udgør hele lymfocytrækken.

10

Man kan f.eks. ved adsorption fiksere et monoklonalt antistof eller en blanding af monokonale antistoffer, der er specifikke for alle overfladeantigenerne på T-celler, på væggene af mi krofordybn inger. Disse monoklonale antistoffer gør det mu-15 ligt senere at immobi1isere i mi krofordybni ngerne hele populationen af T-celler i den undersøgte prøve. Plader der er fremstillet på denne måde kan lyofiliseres og oplagres fortrinsvis ved 4eC. Dette trin kan udføres industrielt, og man kan således råde over plader, der er parate til anvendelse til 20 bestemmelsesudstyr, der er anvendeligt enten til totale T-lym-focytter eller til enhver underpopulation af T-lymfocytter,

Prøver indeholdende celler, der skal bestemmes, og som stammer fra blod eller en anden passende biologisk væske, hvad enten 25 den er normal eller patologisk, kan anvendes som de er eller efter tilberedning især ved vægtfyldegradientcentri fuger ing på kendte måder og især i medium af kraftig vægtfylde, som f.eks. FICOLL-PAQUE, der forhandles af Pharmacia. Til bestemmelse af blodlymfocytter kan man ligeledes behandle blodprøven, der 30 skal bestemmes, med en opløsning kalde lysestødpude, som lyser de røde blodlegemer.

Lige store dele af cellesuspensionen anbringes i kontakt med den faste bærer, f.eks. i mi krofordybninger i en mikrotiter-35 plade, der forud er tilberedt, samtidig med opløsningen som udgør en del af bestemmelsesudstyret, og som indeholder det monoklonale antistof, der er specifikt for den tilsigtede cellepopulation, og som bærer en passende sonde, dvs. et radio- 14 DK 174032 B1 isotop eller enzymatisk sporstof. Således kan en radioisotopsonde realiseres f.eks. ved mærkning af det monoklonale antistof med jod 125 eller jod 131, f.eks. i nærværelse af chlor-amin T på kendt måde (F.C. GREENWOOD, W.M. HUNTER med flere, 5 Biochem. J., 1963, 89, 114), eller en enzymatisk sonde kan realiseres ved at forbinde det monoklonale antistof med et enzym, såsom alkalisk phosphatase, peroxydase, Ø-ga1 akt os i dase eller acetylcholinesterase på i og for sig kendte måder (se f.eks. M. O'SULLIVAN, Methods in Enzymology, 1981, 73, 147) 10 eller efter en metode, som udledes heraf. For at undgå visse ubekvemmeligheder, der er forbundet med manipulation af radioaktive stoffer og med den begrænsede varighed af reagensernes gyldighed, anvendes i visse tilfælde enzymerne fremfor radioisotope sonder.

15

Inkubationsperioden, dvs. den tid, der er nødvendig til immobiliseringen og den samtidige markering af cellerne, er fortrinsvis mindre end eller lig med 1 time. I denne tid kan den faste bærer eventuelt centrifugeres for at forbedre immobili-20 seringen af cellerne. Den faste bærer, f.eks. mi krot i trer ings-pladen, bliver derefter vasket for samtidig at fjerne ikke-fikserede celler og overskud af monoklonalt antistof, som bærer en enzymatisk eller radioisotopsonde.

25 Når man anvender en radioisotopsonde f.eks. jod 125, bliver radioaktiviteten, der er forbundet med cellerne, talt i en gammatæller på enhver passende måde, og f.eks. efter opløse-liggørelse af cellerne med en alkalisk opløsning (f.eks. en natri umhydroxidopløs ni ng) og genvinding af opløsningen i nde-30 hoIdende radioaktiviteten ved hjælp af en absorberende stødpude .

Når man anvender en enzymatisk sonde til det monoklonale antistof, fås der fremkomst af et farvet eller fluorescerende pro-35 dukt ved til den faste bærer, hvorpå der er fikseret cellepopulationen, som bærer antigenet, der skal bestemmes, at sætte en opløsning indeholdende enzymsubstratet og et eller flere hjælpereagenser, som gør det muligt til slut som reaktions- 15 DK 174032 B1 produkt at få enten et farvet produkt, der er opløseligt i mediet, eller et farvet produkt, der er uopløseligt eller et opløseligt fluorescerende produkt, således som det er forklaret i det foregående. Man måler derefter lyssignalet, der stammer 5 fra de således behandlede prøver ved hjælp af apparaturer der passer til hvert tilfælde: henholdsvis transmissionfotometer eller refleksionsfotometer eller fluorimeter. Når den faste bærer er en mi kr ot i t rer i ngsp 1 ade, kan aflæsningen af de lysende signaler udføres i rækkefølge i alle fordybningerne i 10 samme plade ved anvendelse af automatiserede aflæsere af sædvanlig type i biologi laboratorier f.eks. pladeaflæseren Titer-tek eller pladeaflæseren Fluoroscan til henholdsvis spektro-fotometriske aflæsninger eller fluorometriske aflæsninger.

15 Ved anvendelse som enzymatisk sonde af alkalisk phosphatase bevirkes koblingen af dette enzym med det monoklonale antistof efter fremgangsmåden foreslået af Boehringer Mannheim - Bio-chemica. De foretrukne substrater for dette enzym er parani-tropheny1phosphat til en endelig spektrofotometri sk aflæsning 20 eller 4-methyl umbel 1 i fery 1phosphat til en f1uori metri sk aflæsning eller 5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat for at får et uopløseligt farvet reaktionsprodukt. Man kan ligeledes som enzymatisk sonde anvende β-ga1 aktos idase, hvis foretrukne substrater så er orthonitrophenyl-β-D-galaktopyranosid eller 4-me-25 thylumbel 1 i feryl-/3-D-galakto py ranosid.

Fortrinsvis kan man koble de monoklonale antistoffer til per-oxydasen. I dette tilfælde er koblingsprocessen afledt af den, der er beskrevet af M.B. WILSON og P.K. NAKANE i Immunofluo-30 rescence and Related Staining Techniques. W. Knapp, K. Kolu-bar, 6. Wicks udgivere Elsevier/North Holland, Amsterdam, 1978, side 215-224. Modifikationerne der er indført i forhold til den første fremst i 11 ingsprotokol for enzymatisk konjuge-ring har relation til følgende punkter: det molære forhold peroxydase/anti stof er lig med 3 til forskel fra 2 i protokollen, 35 16 DK 174032 B1 en mindre fremskreden oxidation af peroxydasens glueiddele ved en 33¾ formindskelse af den foreslåede koncentration af natriumper jodat .

5 Reagenserne, der anvendes til afsløre peroxydase konjugeret med monoklonalt antistof, omfatter oxygeneret vand, enzymsubstrat og en passende chromogen, f.eks. ortho-phenylendiamin eller 2,2'-azino-bis-(3-ethyl-6-benzothiazolinsulfonsyre) eller ABTS for at få et farvet s 1 utreakti onsprodukt, der er 10 opløseligt i mediet eller 3,3 '-diaminobenzidin eller l'-ami-no-3-ethyl-9-carbazol eller 4-chlor-a-naphthol for at få et endeligt uopløseligt reaktionsprodukt eller parahydroxypheny1 -propionsyre for at få et fluorescerende reaktionsprodukt, der er opløseligt i mediet.

15 I en foretrukken udførelsesform omfatter udstyret ifølge opfindelsen til bestemmelse af antigener karakteristiske for T-lymfocytter, T4-1ymfocytter og T8-lymfocytter: 20 a) en mikrotitreringsplade i hvis fordybninger, der er fikse-ret et eller flere monoklonale antistoffer, antilymfocytter T.

bl) En opløsning indeholdende mindst ét monoklonalt antistof anti 1ymfocytter T mærket med peroxydase.

25 b2) En opløsning indeholdende mindst ét monoklonalt antistof anti-antigen CD4 mærket med peroxydase, b3) En opløsning indehoIdende mindst ét monoklonalt antistof 30 anti-antigen CD8 mærket med peroxydase.

cl) En opløsning indeholdende oxygeneret vand, enzymsubstrat i en passende stødpude.

35 c2) En opløsning indeholdende chromogenet, der anvendes til at afsløre ekspressionen af enzymets aktivitet.

En anden fortrukken udførelsesform ifølge opfindelsen er anvendelse af monoklonale antistoffer koblet med acety1cho1 in- 17 DK 174032 B1 esterase.

Acetylcholinesterase kobles til antistoffet ved fortrinsvis at anvende en fremgangsmåde afledt af den, der er beskrevet i 5 fransk patent nr. 2.550.799, hvor man går frem skematisk som ved fremstilling af fragmenter af antistoffet ved en kendt teknik, modificering af enzymet ved reaktion med et passende heterobifunktionelt middel og til slut kobling af de således fremstillede produkter. Andre kendte fremgangsmåder til kon-10 struktion af immunoenzymati ske konjugater kan ligeledes anvendes i dette tilfalde.

Afsløringen af den enzymatiske aktivitet, der er specifikt bundet til celleantigenet, genkendt af konjugatet med acetyl-15 chlolinesterase, udføres fortrinsvis ved den velkendte teknik, der anvender acetylthiocholin som enzymsubstrat og Ellmans reagens eller 5,5 '-dithio-2-nitrobenzoesyre som chromogen efter enhver variant, der er egnet til det pågældende tilfælde, f.eks. den der er beskrevet Pradelles med flere, Anal. Chem., 20 57, (1985) 1170-1173.

De nævnte chromogener anvendes som de er eller i form af salte, der er opløselige i vand.

25 Bestemme1 ses resultaterne af antigener ifølge opfindelsen kan udtrykkes på enhver måde, der passer til den udførte undersøgelse. Specielt kan man udtrykke resultaterne enten i totalt antal molekyler af et givet antigen (f.eks. antigen CD4), der findes i et givet rumfang undersøgt prøve (f.eks. i mikroliter 30 blod), eller ved forholdet mellem antal molekyler af et antigen og antallet af molekyler af et andet antigen i den undersøgte prøve (f.eks. forholdet mellem antigenerne CD4 og antigenerne CD8 eller forholdet CD4/CD8 i den undersøgte blodprøve .

For at bestemme antallet af molekyler af et givet antigen i den undersøgte prøve anvendes med fortrinsvis en kalibreret skala, der udgøres af celler eller cel!epræparater, som bærer 35 18 DK 174032 B1 antigenet der skal bestemmes, og som er kalibreret forud ved en kendt referencemetode. Disse standarder udgøres fortrinsvis enten af celler, som er identiske med hensyn til oprindelse med de celler, som er genstand for bestemmelse eller af celler 5 fra etablerede cellelinier, som bærer det eftersøgte antigen eller af præparater f.eks. af membraner, som stammer fra cellerne.

Disse standarder behandles så nøjagtigt som prøverne, der skal 10 undersøges. Signalerne, der fremkommer, tjener til at konstruere en kalibreringsskala, hvormed sammenlignes de signaler, der måles med prøverne, der skal undersøges. De endelige beregninger er klassiske.

15 For at bestemme forholdet mellem antallet af molekyler af to antigener i prøven, der skal undersøges, kan man anvende det ovenfor beskrevne ka1 ibreringssystem og til slut beregne det eftersøgte forhold. Mere enkelt i talrige tilfælde kan man direkte beregne forholdet mellem specifikke signaler fremkommet 20 med hver af de eftersøgte antigener, i givet fald korrigere det med kendte faktorer, såsom forholdet mellem dimensionerne af de udtagne prøver, der er taget i brug, og man får direkte det søgte forhold.

25 Den immunometri ske bestemmelsesmetode ifølge opfindelsen er enkel, hurtig og reproducerbar. Anvendelsen af den er helt egnet til analyse af et stort antal prøver. For at forstå fordelene i sammenligning med andre beskrevne fremgangsmåder, er det hensigtsmæssigt at analysere de forskellige trin.

30

Immobiliseringen af cellerne på den faste bærer er den bestemmelsesfase, som traditionelt frembyder de fleste vanskeligheder, eller som er mest kritisk at udføre. Det middel, der ofte anvendes, er kemisk fiksering af cellerne med g 1utaraldehyd 35 eller methanol i skåle, der er behandlet eller ikke behandlet med poly-L-lysin (VAN LEUVEN med flere, J. Immunol. Methods, 1978, 23, 109). Alligevel kan de således udførte kemiske fikseringer formindske eller endog undertrykke den eftersøgte 19 DK 174032 B1 specifikke påvisning eller tværtimod inducere falske positive markeringer af celler, hvilket er en meget alvorlig ulempe (DROVER og MARSHALL, J. Immunol. Methods, 1986, 90, 275-281).

5 Udførelsen af fremgangsmåden ved kemisk fiksering nødvendiggør endvidere flere trin: centrifugering af cellerne, fremstilling af blandingen af fikseringsmiddel, fiksering og derefter vask af de fikserede celler.

10 Tørring af cellerne ved 37°C eventuelt efterfulgt af en fiksering med methanol i mikrofordybninger har ligeledes været foreslået (BAUMGARTEN, 0. Immunol. Methods, 1986, 94, 91-98).

Dehydrati ser i ngen af cellerne ved 37°C foruden at den kan ændre visse skrøbelige antigener, permeabi1iserer piasmamembra-15 nen omkring cellerne, hvilket letter immunomarkering af intra-cytoplasmiske antigener mere end mærkning af overfladeantigener og fører således til egenstøj, der er generende, eller falske positive resultater, når man ønsker en måling, der er begrænset til overfladeantigener.

20

Endvidere er reproducerbarheden af denne fremgangsmåde usikker. Dekanteringen af cellerne i mi krofordybni ngerne til bestemmelse og udtørring af cellerne kan variere fra et forsøg til et andet. Desuden er denne bestemmelse langvarig at udføre 25 for tørringstrinnet for cellerne kræver i sig selv en tid på mere end 2 timer.

Immobiliseringen af lymfocytpopulationer har ligeledes været opnået ved hjælp af anvendelse af polyklonale antistoffer ad-30 sorberet i mi krofordybni nger (STOCKER og HEUSSER, J. Immunol. Methods, 1979, 26, 87-95). Udover at tillade immobilisering af celler, der er fremmede for den eneste population, som man ønsker at analysere, frembyder de polyklonale antistoffer også den ulempe, at reagere med antigenerne der er bestemt til at 35 skulle måles med mærket antistof, hvilket lige så meget reducerer det endeligt målte signal.

Anvendelse af højt specifikke og beslægtede monoklonale antistoffer adsorberet eller fikseret på den faste bærer og især i 20 DK 174032 B1 bestemmelsesfordybninger muliggør eksklusiv indfangning af de efterstræbte celler, idet de andre ikke tilbageholdte cellepopulationer fjernes under vaskninger, der udføres for at mærke antigenerne som skal bestemmes. Desuden modificerer intet 5 kemisk eller fysisk middel de karakteristiske egenskaber ved antigenerne på dette trin, for de forskellige operationer, der er beregnet til kemisk eller fysisk at fiksere cellerne til bæreren, er afskaffet.

10 Ifølge den foreliggende opfindelse har det således vist sig, at immobiliseringen af cellerne med monoklonale antistoffer er en fremgangsmåde, som gør det muligt at forenkle immobiliseringstrinnet af cellerne som bærer antigenet, der skal bestemmes, samtidig med at resultaterne gøres mere pålidelige.

15

De immunometri ske bestemmelser anvendt på cellepopulationer udføres generelt ved mærkning af cellerne ved en indirekte metode i 2 eller 3 på hinanden følgende trin, idet sonden som bærer det specifikke signal fikseres på cellerne under det 20 sidste trin i mærkningsprocessen. Ved mærkningen af cellerne i to trin benytter de anvendte hovedreagenser antistof anti-im-munoglobuliner (anti-Ig) koblet til β-ga1 aktos i dase (C0BB0LD med flere, J. Immunol. Methods, 1971, 44, 125-133) eller al kalisk phosphatase (HESSIAN, J. Immunol. Methods, 1986, 91, 25 29-34) eller mærket med jod 125 (SAVION J. Immunol. Methods, 1987, 97, 49-56). Markeringsteknikken med reagenset peroxyda- se anti-peroxydase udføres i 3 trin (VAN LEUVEN 1978).

En anden fremgangsmåde ligeledes i 3 trin benytter et monoklo-30 nalt antistof specifikt for den antigene markør, der skal analyseres og derefter antistof anti-Ig fra mus som bærer biotin og til sidst et konjugat streptavidin-peroxydase (BAUMGARTEN 1986) eller streptavidi n-alkalisk phosphatase (IGIETSEME med flere, J, Immunol. Methods, 1987, 97, 123-131).

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter samtidig anvendelse i et enkelt trin af en i mmuno indfangningsproces af hele celler uden fysisk eller kemisk indgreb i cellerne og mærkning 35 21 DK 174032 B1 af alle eller en del af cellerne med et eller flere monoklona-le antistoffer, som direkte bærer en radioisotopsonde eller enzymatisk sonde, hvilket for første gang muliggør kvantitativ bestemmelse på cellerne selv af valgte membranantigener.

5

Ifølge opfindelsen muliggør den direkte mærkning af immunologisk immobi1 i serede celler: forenkling af bestemmelsesmetoden ved afskaffelse af mellem-10 liggende gentagne manipulationer mellem de på hinanden følgende trin i mærkningen, hvor det drejer sig om indirekte mærkning: centrifugeringer af cellerne, fjernelse af mærkningsreagenser, genoptagelse i suspension, 15 en økonomi med reagenser, en forbedret pålidelighed ved formindskning af antallet af trin og manipulationer, 20 en tidsgevinst, mulighed for samtidig at behandle et stort antal prøver udelukkende under anvendelse af sædvanlige materialer og apparater .

25

Inkubationsperioden til immobilisering af cellepopulationen og samtidig direkte mærkning af antigenerne i celleunderpopula-tionen, som skal bestemmes, er kort. Den er mindre end eller lig med 1 time, hvor det drejer sig om bestemmelse af T-lymfo-30 cytter og underpopulationer af T4- og T8-lymfocytter.

Efter vask af den faste bærer udføres den egentlige bestemmelse ved iagttagelse af et signal, der er nøjagtigt og enkelt at måle med sædvanligt apparatur: radioaktivitet, absorption 35 eller emission af lys.

Hele fremgangsmåden ifølge opfindelsen frembyder således talrige fordele: den er hurtig, pålidelig, økonomisk og enkel.

22 DK 174032 B1

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen gør det muligt at bestemme overfladeantigener i en cellepopulation inden for en stor række cellekoncentrationer.

5 Metodens følsomhed vis-å-vis antallet af celler afhænger af antigentætheden af den bestemte cellepopulation. For hvert antigen kan man, hvis det ønskes, definere den minimale molære koncentration af antigen, som kan måles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

10 Når f.eks. den valgte, faste bærer er en mi krot itreringsplade, og når de undersøgte celler er humane lymfocytter, har man således iagttaget, at man får signifikante målinger, når antallet af analyserede celler er mellem nogle hundrede og ca.

15 200.000 pr. mikrofordybning på 200 μΐ , idet den nedre grænse er bestemt af den målte tæthed af antigen på de undersøgte celler og følsomheden af den valgte påvisningsteknik, medens den øvre grænse i det væsentlige afhænger af dimensionen og geometrien af den faste bærer. Det er det samme, når den faste 20 bærer udgøres af reagensglas.

Man har bekræftet, at de registrerede signaler (tælling af radioaktivitet eller fotometriske målinger) gør det muligt, at få kalibreringskurver der er regelmæssige og tilfredsstillen-25 de som funktion af det antal celler, der er anvendt under de sædvanlige manipuleringsbetingelser.

I øvrigt kan man forbedre følsomheden af fremgangsmåden, hvis det er nødvendigt, ved samtidigt at fiksere på samme overfla-30 deantigen flere forskellige monoklonale antistoffer, der er specifikke for flere forskellige epitoper af samme antigen.

Dette er blevet bekræftet ved bestemmelse af C04-anti gener på celler af linien Ichikawa (human T-linie), hvortil man samtidig har anvendt antistofferne 0KT4 og ST4 mærket med jod 125.

35 Det målte signal er forøget ca. 50¾ i forhold til de signaler, der opnås med hver af antistofferne anti-CD4 anvendt alene.

I de følgende eksempler anvendes uden forskel følgende udtryk eller deres forkortelser.· 23 DK 174032 B1 BSA : okseseruma1 bum in PBS : salthodig phosphatstødpude med pH 7,4 POD : peroxydase

5 IgG : immunoglobulin G

IgM : immunoglobulin M

IgG anti-T eller anti-T : antistof anti-lymfocyt T

IgG anti-CD4 eller anti-CD4 : antistof anti-antigen CD4

IgG anti-CD8 eller anti-CD8 : antistof anti-antigen CD8 10 cpm : slag pr. minut dpm : desintegrationer pr. minut.

Eksempel 1 15 Immunoenzymometri sk bestemmelse af den molekylære koncentration af antigenerne CD4 og CD8 ud fra humane blodprøver omfattende en mærkning af antistoffer med peroxydase.

A) Fremstilling af bestemmelsesudstyret.

20 a) Fremstilling af pladen.

Man anvender en mikrotitrer ingsp1ade af plast forhandlet af NUNC (reference 64393) med 96 mikrofordybninger. Man anbringer 25 i hver mikrofordybning 200 μΐ af en opløsning indeholdende det rensede monoklonale antistof anti-CD2 (kaldet STll), der anvendes til at immobilisere totale T-lymfocytter, dvs. for at bevirke deres immunoindfangning. Dette antistof, der forhandles af BIOSYS, Compiégne, Frankrig under referencen STll an-30 vendes i en koncentration på 10 pg/ml i en saltholdig phosphatstødpude med pH værdi 7,4 (PBS). Adsorptionen af det monoklonale antistof sker ved 4eC i 12 timer. Man fjerner overskud af antistof ved omvending af pladen.

35 Man fremstiller en opløsning indeholdende 0,1% gelatine og 0,5% BSA i en saltholdig phosphatstødpude. Man indfører 250 μΐ af denne opløsning pr. mikrofordybning for at mætte overfladerne af fordybningerne med protein, hvilket opnås efter 1 24 DK 174032 B1 time ved 37eC. Man vasker pladerne 3 gange med saltholdig phosphatstødpude. De således fremstillede plader lyofiliseres og lagres ved 4°C i en forseglet plastpose.

5 b) Fremstilling af opløsningen af konjugat af monoklonalt antistof og peroxydase.

Man anvender peroxydase (POD) forhandlet af Boehringer Mannheim Biochemica (reference 814 393).

10

Koblingsprocessen mellem antistoffet og peroxydasen er den, der er beskrevet af M.B. WILSON og P.K. NAKANE i Immunofluorescence and Related Techniques (W. KNAPP, K. KOLUBAR, G. WICK udgivere 1978, Elsevier/North Holland, Amsterdam, side 215-15 224) med undtagelse af, at man til oxidationen af peroxydasen benytter 1,5 mg POD i 0,36 ml destilleret vand, og at man tilføjer 50 μΐ af en 0,2 M opløsning af natriumperjodat. Det således fremkomne produkt kobles med 2 mg IgG anti-CD4 indeholdt i 50 μΐ carbonatstødpude. Efter behandling med natriumborhy-20 drid og dialyse over for PBS steriliseres konjugatet IgG-POO ved filtrering på membran 0,22 pm og opbevares under sterile betingelser i en koncentration på 0,5 mg IgG pr. ml ved 4eC i reagensglas. Reagenset er stabilt i mindst 1 år.

25 på samme måde fremstilles konjugatet IgG-anti CD8-P0D. På samme måde kan man fremstille konjugatet IgM-POD.

c) Fremstilling af afsløringsreagenset.

3 0 Afsi ør i ngsreagenset fås på følgende måde: man fremstiller en 0,1 M citratstødpude ved at opløse c itronsyremonohydrat i en mængde af 2,1% i vand og indstille til en pH-værdi på 5 ved tilsætning af 7N natriumhydroxid. Man tilsætter så 30 mg orthopheny1 end iamindichlorhydrat til 20 ml citratstødpude og 35 derefter tilsættes i sidste øjeblik 40 μΐ 30% oxygeneret vand (enzymsubstrat) til 20 ml citratstødpude indeholdende ortho-phenylendi amin.

25 DK 174032 B1 B) Immunometri sk fremgangsmåde, a) Fraski11 el se af celler.

5 Man udtager 2 ml blodprøve, der skal bestemmes. Man blander dem med 2 ml saltholdig phosphatstødpude og anbringer denne blanding oven på 3 ml FICOLL-PAQUE (forhandlet af Pharmacia).

Ved centrifugering ved 400 x g i 30 minutter ved omgivelsernes temperatur dannes en ring af suspension indeholdende de 10 enkernede celler. Man genvinder hele denne suspension i et rumfang på 1 ml, og man fordeler 6 x 100 μΐ af den fremkomne suspension i 6 mi krofordybninger på den tidligere fremstillede plade.

15 b) Inkubation af cellerne.

Man fortynder til en hundrededel det tidligere fremstillede konjugat POD-antistof ved hjælp af PBS indeholdende 1% proteinstof, såsom BSA eller skummetmælkspulver, og man anbringer 20 100 μΐ af denne opløsning pr. mikrofordybning nemlig: 2 m i krofordybn i nger fyldes med hver 100 μΐ af opløsningen af konjugat POD-anti-CD4.

25 2 mi krof ordybni nger fyldes med hver 100 μΐ af opløsningen af konjugat POD-anti-CD8.

2 mi krofordybni nger til kontrol fyldes med hver 100 ml opløsning med 1% proteinstof (blindreaktion).

30

For at forbedre fikseringen af cellerne på bæreren centrifugerer man pladen i 3 minutter ved 150 x g efter at have ventet 1 time ved omgivelsernes temperatur.

35 c) Afsløring af fikseret enzym og måling.

Man tømmer mi krofordybningerne ved at omvende pladen. Man vasker mikrofordybn i ngerne 4 gange med 200 μΐ PBS. Man sætter 26 DK 174032 B1 til hver fordybning 200 μΐ afs 1 ør ingsreagens fremstillet umiddelbart til brug. Man lader inkubere i 20 minutter ved omgivelsernes temperatur i dæmpet lys. Man måler den optiske tæthed med spektrofotometer ved 492 nm (apparatet Titertek Multi-5 skan type 310 C - Flow Laboratories).

d) Kalibrering og udtryk af resultaterne.

For at udføre kalibrering af disse målinger anvendes et præ-10 parat af totale humane lymfocytter, der forud er kalibreret med hensyn til CD4 og CD8 antigener ved den cytof1uormetri ske teknik ifølge P0NCELET med flere (J. Immunol. Methods, 1985, 85, 65-74). Udtagning af lige store kendte portioner af dette sammenligningspræparat tjener til at udgøre de to kalibre-15 ringsskalaer for henholdsvis antigen CD4 og antigen CD8 i forhold til hvilke, der beregnes antallet af antigener svarende til hver prøve.

Som eksempel viser følgende tabel 1 for 20 humane blodprøver 20 stammende fra raske donorer værdierne af de opnåede optiske tætheder, antallet af molekyler antigen CD4 og CD8 og de heraf følgende forhold mellem antal af antigener (forholdet CD4/CD8).

25 30 35 27 DK 174032 B1

Tabel 1

Antigen CD4 ~~ Antigen CD8__ Mol-

Antal antigen- Antal antigen- for-

Donor Optisk molekyler (i Optisk molekyler (i hold 5 nr tæthed millioner) tæthed millioner) CD4/

___pr. μΐ blod _ pr. ul blod | C08 I

1 0,64 23 1,29 92I 0,25 2 0,71 27 0,75 37 0,73 3 0,82 32 1,10 81 0,39 4 0,49 17 0,55 23 0,74 5 0,74 29 0,89 52 0,56 6 0,88 38 0,92 55 0,69 1 7 0,74 29 0,72 36 0,80 8 0,75 29 0,69 33 0,88 9 ,0,48 16 0,80 41 0,39 10 1,00 50 1,08 80 0,62 11 0,61 22 0,69 33 0,67 12 0,73 28 0,85 46 0,61 13 0,51 18 0,66 30 0,60 15 14 0,65 24 1,06 76 0,31 15 0,92 42 0,87 48 0,87 16 0,77 31 0,98 63 0,49 17 0,68 25 1,01 67 0,37 18 0,85 36 0,96 61 0,59 19 0,91 41 0,90 52 0,79 20 1,00 .. ___50___ 1,02 69_[..0^72 20

Eksempel 2

Immunoenzymetri sk bestemmelse af den molekylære koncentration af antigenerne CD4 og CD8 i prøver af menneskeblod omfattende 25 en mærkning af antistof med alkalisk phospatase.

Denne bestemmelse udføres som den i eksempel 1. Fremstillingen af konjugatet af monoklonalt antistof og alkalisk phospatase udføres ved fremgangsmåden angivet af Boehringer Mann-30 heim - Biochemica (reference 567 744). Efter 1 times inkubation af cellerne, som skal bestemmes med dette konjugat, afslører man fikseret enzym ved tilsætning af en opløsning af par an itropheny1phosphat 1 mg/ml i en 1,2% diethanolaminstød-pude i destilleret vand indstillet til pH 9,8 med en fortyn-35 det opløsning af saltsyre. Efter 2 timer ved 37°C måles den optiske tæthed med spektrofotometer ved 405 nm.

Resultaterne beregnes og udtrykkes som i eksempel 1.

28 DK 174032 B1

Eksempel 3

Immunoradiometri sk bestemmelse af den molekylære koncentration af antigenerne CD4 og CD8 i prøver af menneskeblod omfattende 5 en mærkning af antistof med jod 125.

Fremstillingen af antistof mærket med jod 125 udføres ved teknikken beskrevet af F.C. GREENWOOD, V.M. HUNTER med flere, Biochem. J., 1963, 89, 114.

10

Man blander 50 pg monoklonalt antistof anti-CD4 eller anti-CD8 indeHoldt i 50 μΐ saltholdig phosphatstødpude med pH 7,2 med 37 MBq jod 125 i form af natriumjodid og 30 μΐ af en opløsning af chloramin T i en saltholdig phosphatstødpude inde-15 holdende 0,33 mg chloramin T pr. ml. Efter 1 time under omrøring standser man mærkningsreaktionen af det monoklonale antistof ved at tilsætte 100 μΐ af en opløsning af natriummetha-bisulfit med 2,5 mg/ml. Den således fremstillede opløsning føres på en PD 10 søjle (Pharmacia - Sephadex G25M), og man ud-20 vinder i afløbet den fraktion, der indeholder det radiomærkede antistof. Bestemmelsen udføres ved i 4 mi krofordybni nger at indføre et rumfang på 100 μΐ cellesuspension indeholdende de enkernede celler af menneskeblod fremstillet som i eksempel 1.

Man anbringer derefter 100 μΐ fortyndet opløsning af radioak-25 tivt antistof i en stødpude PBS i nde holdende 5% BSA, således at der indføres 150.000 cpm pr. fordybning. 2 mikrofordybnin-ger fyldes med hver 100 μΐ af opløsningen af konjugat anti-CD4-125-I, 2 mikrofordybni nger fyldes med hver 100 μΐ af op løsningen af konjugatet anti-CD8-125-I. Fikseringen af celler-30 ne forbedres ved centr ifuger ing af pladen i 3 minutter ved 150 x g efter 1 times inkubation ved omgivelsernes temperatur. Mikrofordybni ngerne tømmes ved at omvende pladen. Man vasker mikrofordybningerne 4 gange med 200 μΐ PBS pr. fordybning. Man indfører derpå 75 μΐ 1 M natriumhydroxidopløsning i hver for-3 5 dybn i ng. Efter 10 minutter genvindes indholdet af hver fordybning med en absorberende stødpude, før tælling af radioaktiviteten med en γ-tæller (multitæller LKB).

29 DK 174032 B1

Resultaterne beregnes og udtrykkes som i eksempel 1, idet værdierne for optisk tæthed erstattes med resultaterne af tælling i dpm.

5 Eksempel 4

Bekræftelse af gyldigheden af metoden.

På 20 udtagne prøver af menneskeblod måler man antigenerne 10 CD4 og CD8 på humane T-celler ved at følge den immunometri ske metode med peroxydase, der er beskrevet i eksempel 1. På samme blodprøver bestemmes desuden ved anvendelse af sædvanlig teknik {W.W. ERBER med flere, Lancet, 1984, (8385), 1042-1045) til cytologisk tælling forholdet mellem antallet af positive 15 T4-celler og antallet af positive T8-celler.

Korrelationskoefficienten mellem forholdet CD4/CD8 fremkommet ved immunoenzymometri sk bestemmelse og forholdet T4/T8 fremkommet ved cytologi sk tælling er r = 0,72.

20 På 7 andre udtagninger af menneskeblod sammenligner man ligeledes forholdet CD4/CD8 bestemt ved den immunoradiometri ske metode under anvendelse af mærkning med jod 125 ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse og forholdet mellem 25 cellerne T4/T8 bestemt ved tælling af cellerne. Korrelationskoefficienten er r=0,87.

I de 2 tilfælde viser de opnåede korrelationskoefficienter, at trods en samlet tilfredsstillende overensstemmelse mellem re-30 sultaterne af de 2 teknikker er informationen, som de 2 forhold giver, ikke ækvivalente, hvilket er klart, da bestemmelsen af antigenerne ifølge opfindelsen tager hensyn til ikke blot antallet af positive celler, som det er tilfældet ved den cytologiske metode, men også til tætheden af det pågældende 35 antigen på de positive celler af hver prøve. Den information, som gives ved teknikken beskrevet i den foreliggende opfindelse, er derfor mere fuldstændig end den, der gives ved den sædvanlige sammenligningsteknik (W.W. ERBER med flere. Lancet, 1984, (8385), 1042-1045).

30 DK 174032 B1

Eksempel 5

Immunoenzymometri sk bestemmelse af den molekylære koncentration af antigenerne CD4 og CD8 på T-lymfocytter i prøver af 5 menneskeblod omfattende en markering af antistof med peroxy-dase.

Dette eksempel er beregnet til at vise, at man kan formindske den nødvendige varighed af bestemmelsen i forhold til de i ek-10 sempel 1 beskrevne betingelser ved at modificere dels fremgangsmåden til fraski1lelse af cellerne og dels inkubationstiden, som er nødvendig i trinnet til immunoindfangning og mærkning af cel lerne, 15 A) Indflydelse af fremgangsmåde til adskillelse af celler fra totalblod.

a) Teknik ved kortvarig centrifugering: 20 Man udtager 0,5 ml blodprøve, som skal bestemmes, som man blander med 1,5 ml saltholdig phosphatstødpude. I et 5 ml hæ-molyseglas indføres 1,5 ml Fico11 -Paque, forhandlet af Pharmacia, og på overfladen af laget af Ficoll anbringes blodprøven fortyndet i PBS. Efter 5 minutters centrifugering ved 900 x g 25 ved omgivelsernes temperatur udtager man ringen af suspension indeholdende de enkernede celler i et rumfang på 0,5 ml. Denne prøve sættes til 1,5 ml PBS.

b) Teknik ved lyse af erythrocytter: 30

En anden hurtig metode til adskillelse af blodceller er anvendelse af en stødpude, som lyser de røde blodlegemer. Lysestødpuden, der anvendes som ikke-begrænsende eksempel, har følgende sammensætning: 35 ammoniumchlorid: 8,29 g surt kaliumcarbonat: 1 g dinatriumsalt af ethylendiamintetraeddikesyre: 0,0307 g til 1 1 destilleret vand, hvis pH er indstillet til 7,3.

31 DK 174032 B1

Man blander 5 ml lysestødpude og 0,250 ml blod. Efter 10 minutter under omrøring centrifugerer man ved 600 x g i 10 minutter. Det dannede bundfald af celler optages i 1 ml stødpude PBS.

5

Ved derefter at udføre bestemme Isen af antigenerne CD 4 og CD8 under betingelserne i eksempel 1 og ved sammenligning med referenceprotokollen beskrevet i eksempel 1 til isolering af en-kernede blodceller har man bekræftet, at den ene og den anden 10 af disse 2 varianter af fremgangsmåden til adskillelse af en-kernede celler fra totalt blod har muliggjort opsamling af alle lymfocytterne i de undersøgte blodprøver.

B) Indflydelse af inkubationstid på immunoindfangning og mærk-15 ning af cellerne.

For at bekræfte om den tid på 1 time, der anvendes i eksempel 1, ikke kan reduceres for at fremskynde forløbet af bestemmelsen, har man sammenlignet resultaterne opnåede for identiske 20 prøver indeholdende hver 20.000 enkernede celler pr. fordybning, når man lader tiden i trinnet til indfangning og mærkning af cellerne variere fra 10 minutter til 1 time. Arbejdsbetingelser er i øvrigt som i eksempel 1, og de fremkomne resultater er vist i tabel 2.

25

Tabel 2 I I _ Optisk tæthed_| 30 I Inkubations- i Antigen CD4_|_Antigen CD8_|

1 tid (min)._1 Prøve \ Blindprøve* | Prøve I Blindprøve* I

I 10 I 0,322 1 0,037 | 0,329 | 0,023 J

I 20 I 0,438 1 0,049 | 0,401 | 0,025 | I 30_1 0,620 1 0,055_1 0,498 1 0,027_\ 35 * Disse værdier for optisk tæthed svarer til blindforsøg udført i fravær af celler. Kontrolværdierne opnået i nærværelse af celler og under udeladelse af enten konjugatet eller substratet er ikke bedre end de viste værdier.

32 DK 174032 B1

Disse resultater viser at: det uspecifikke signal (blindprøve) bliver på værdier, der altid er lave, og som er lavere jo kortere tiden for tilstedevæ-5 relse af konjugat er.

Det specifikke signal opnår efter 10 minutters kontakt en værdi, der kan udnyttes analytisk med nøjagtighed og reproducerbarhed. Dette viser, at det er muligt i forhold til betingel-10 serne i eksempel 1 betydeligt at reducere varigheden af udførelsen af bestemmelsen uden betydeligt tab af nøjagtighed i resultaterne.

I praksis, og hvis man samler tidsgevinsten, som man kan opnå 15 ved fremstillingen af blodprøven og ved immunoindfangningen, er det muligt med udstyret og fremgangsmåden ifølge opfindelsen at bestemme antigenerne CD4 og CD8 (som ikke begrænsende eksempler) i prøver af totalt blod i en mængde af 10 eller 20 prøver pr. plade med 96 fordybninger på en samlet tid (efter 20 modtagelsen af prøverne i laboratoriet) som ikke overstiger 1 time. Dette produktivitetsniveau er bedre end af alle til dato kendte alternative teknikker.

Eksempel 6 25

Imrnunometrisk bestemmelse af den molekylære koncentration af antigenerne C05 på humane T-lymfocytter i prøver af menneskeblod omfattende mærkning af antistof med acetylcholinesterase.

30 A) Fremstilling af bestemmelsesudstyret.

a) Fast bærer.

Man anvender en mikroti treringsplade fremstillet på den måde, 35 der er beskrevet i eksempel 1.

b) Konjugat af monklonalt antistof og acetylcholinesterase.

33 DK 174032 B1

Man anvender acetylcholinesterase fra E1ectrophorus electricus fremstillet ved teknikken beskrevet i fransk patent nr. 2.550.

799.

5 Dette enzym kobles med antistoffet anti-CD5 kaldet STI og forhandlet af BIOSYS. Koblingen udføres ved fremgangsmåden beskrevet af YOSHITAKE med flere, Eru. J. Biochem., 101 (1979), 395-399 .

10 c) Afsløringsreagens.

Dette reagens omfatter både enzymsubstratet (acetylthiocholin) og Ellman’s reagens og har følgende sammensætning:

15 Acetylthiocholin 7,5 x 10"*M

5,5'-dithi o-2-nitro-benzoesyre (DTNB) 5 x 10“4M i en natriumphosphatstødpude 1M pH 7,4.

Denne opløsning fortyndes til l/100e i destilleret vand før 20 brugen.

B) Iromunometri sk fremgangsmåde.

a) De enkernede celler fraskilles ved anvendelse af metoden 25 beskrevet i eksempel 1.

b) Inkubationen af cellerne i immunoindfangnings- og markeringstrinnet varer 20 minutter som i eksempel 5.

30 c) Afsløring af fikseret enzym og måling.

Man sætter 100 μΐ afsløringsreagens til hver mi krofordybning. Absorbansen måles ved 412 nm efter 45 minutters inkubation.

35 De optiske tætheder, der er målt for prøver indeholdende kendte antal T-celler, er vist i tabel 3. Under disse forsøgsbetingelser er blindprøven særlig svag og svarer til en optisk tæthed på 0,002 til 0,003.

34 DK 174032 B1

Tabel 3 | | Antal T-lymfocytter indført pr. fordybning og | 5 I I antal molekyler antigen CD5 tilstede pr. for·* 1 I 1 dybn i nq j mill ioner_1 I I 540 j 1.080 I 2.160 j 4.320 | 8.640 | 17.280 j I_1 (323-1( 61L___Ll.l3„.( 260J_L (5,20) 1 ( 1.040 ) ] I Optisk I I I I I I j 10 I tæthed I 0,030 I 0,060 | 0,138 | 0,250 | 0,470 1 0,850 | I_1_I_____J___L______J___I____1

Disse resul tater belyser den store følsomhed af den således udarbejdede teknik. Den optiske tæthed på 0,030 fremkommet i 15 fordybninger indeholdende 540 T-lymfocytter (dvs. 32 millioner molekyler antigen CD5) som kan måles med nøjagt i ghed og er lig med 10 gange baggrundsstøjen svarer til ca. 5 x 10~17 mol antigen CD 5 pr. fordybning. En sådan føl southed er af samme størrelsesorden som de bedste kendte immunobestemmel ser, som be-20 nytter de mest følsomme radioaktive sporstoffer.

Eskempel 7

Bestemmelse af forskellige antigener udtrykt på aktiverede 25 humane T-lymfocytter.

Aktivering af T-lymfocytter er en fysiologisk proces, som griber for tidligt ind, hver gang immunsystemet stimuleres som f.eks. ved infektionspatologier, ved transplantation af orga-30 ner, og ved visse sygdomme med svigtende immunsystem. Denne naturlige proces bevirkes også almindeligt in vitro i laboratoriet i prøver, såsom især blandede 1ymfocytreakt i oner eller prøver af 1ymfoblast i sk omdannelse. I sidstnævnte tilfælde opnås den polyklonale aktivering ved anvendelse af midler såsom 35 phytohæmagl ut inin (PHA), concanavalin A eller andre lectiner. Aktiveringen af T-lymfocytter ledsages af en betydelig vækst i udtrykket af flere membranmarkører og især antigenet CD25 (receptor for interleukin 2) eller antigenet CD2. Disse antigener 35 DK 174032 B1 udgør derfor udmærkede markører for aktiveringstilstanden og bestemmelse af dem har stor interesse både i klinisk biologi og til de ovenfor nævnte 1aboratoriearbejder under undgåelse i alle tilfælde af anvendelse af radioaktive reagenser.

5

Disse antigener måles ved at anvende den metode, der er beskrevet i eksempel 1, med de specifikationer der er præciseret i tabel 4.

1° Tabel 4 Måling af overfladeantigen på aktiverede T-lvmfocvtter__] I Målt I Antistof anvendt til | Antistof mærket med | 15 I antigen 1 immunoindfangning [ peroxydase | 1_I forhandlet af_1 forhandlet af_| I CD2 j ST 1 BIOSYS | ST 11 BIOSYS |

1 CD2 5 I ST 11 BIOSYS 1 IOT 14 IMMUNTECH_J

20 Værdierne for optisk tæthed målt ved 450 nm for de anvendte 25 κ 103 enkernede celler er vist i nedenstående tabel 5 og sammenligner de samme celler uden stimulering med PHA og efter 3 dages stimulering.

25 Tabel 5 _1_Optiske tætheder__ ] I I Ikke-akti verede | Celler aktiveret | Blind- | 30 1 Antigen I celler_I i 3 daoe___[ Prove__| I CD25 I 0,064 I 0,529 | 0,044 |

I C02_1_0,129____J____0,768_j 0,027 I

Oisse resultater viser en betydelige vækst i de specifikke 35 signaler af de 2 undersøgte antigener, når der sker aktive ring.

Eksempel 8 36 DK 174032 B1

Bestemmelse af antigenerne CD22 og HLA-Dr (eller HLA af klasse II) der findes på B-1 ymfocytter .

5

Dette eksempel beskriver bestemmelsen af disse antigener på celler af linien RAJ I, som er en human B-lymfoid linie, beskrevet af PULVERTAFT i J. Clin. Pathol., 1965, 18, 261-274.

10 Til immunoindfangning af cellerne har man i bestemmelsesfordybninger adsorberet som vist i eksempel 1 enten antistof S-klasse II (BIOSYS) til bestemmelse af antigenerne CD22 eller antistof SB4 (BIOSYS) til bestemmelse af antigenerne HLA af klasse II (eller HLA-Dr).

15 a) Bestemmelse af antigen CD22:

Antistof SB22 (BIOSYS) er blevet mærket med jod 125 med metoden beskrevet i eksempel 3. Bestemmelsen af antigen CD22 udfø-20 res på den måde, der er vist i eksempel 3 for antigenerne CD4 og CD8 ved i mi krofordybningerne at indføre i rækkefølge: 5 x 10* celler af linien RAJI og derefter 105 cpm af mærket antistof SB22. Efter 1 time ved 4°C tømmes mikrofordybningerne ved omvend i ng af pladen, og vaskes derefter 4 gange med 200 μΐ PBS 25 pr. fordybning ved hver vask. Radioaktiviteten fikseret på cellerne genvindes og tælles som i eksempel 3. Man får derved en tælling på 760 dpm pr. fordybning indeholdende 5 x 10* celler RAJI med en blindprøve (uden celler) på 50 dpm.

30 b) Bestemmelse af antigen HLA-Dr s

Man indfører i rækkefølge i fordybningerne 105 celler og kon-jugatet antistof S-klasse II mærket med peroxydase på den måde, der er beskrevet i eksempie 1. Bestemmelsen udføres efter 35 samme protokol som i eksempel 1. Man får derved en optisk tæthed på 1,840 og en blindprøve uden celler på 0,105.

Eksempel 9 37 DK 174032 B1

Anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen til måling af antigener båret af T-1ymfocytter og B-lymfocytter fra menne-5 skeblod.

A) Fremstilling af plader:

Man anvender mikrotitreringsplader fremstillede som i eksempel 10 i med undtagelse af at i hver fordybning i mikropladen adsor-beres både monoklonale antistoffer, der er i stand til at fiksere mindst alle T-lymfocytter (S-klasse I fra BIOSYS) og B-lymfocytterne (S-klasse II fra BIOSYS), der hver anvendes i en koncentration på 5 pg/ml .

15 B) Immunometri sk bestemmelse:

De enkernede celler adskilles fra totalt blod ved hjælp af Fi-coll under betingelserne i eksempel 1 eller eksempel 5, og 20 derefter indfører man 80.000 enkernede celler pr. fordybn i ng i 75 μΐ stødpude PBS. T-1ymfocytterne måles i visse fordybninger med antistof ST11 (anti-CD2) fra BIOSYS. B-lymfocytterne måles i andre fordybninger med antistof SB3 (anti-CD37) fra BIOSYS, som genkender alle de perifere B-lymfocytter. Disse antistof-25 fer er på forhånd koblet med peroxydase efter protokollen beskrevet i eksempel 1. Den egentlige bestemmelse udføres som i eksempel 1.

C) Resultater.

30

Det absolutte antal T-lymfocytter og B-lymfocytter indeholdt i den undersøgte prøve bestemmes, idet der henholdes til kalibreringskurver, etableret ved at behandle identisk enkernede celler, hvori T- og B-lymfocytterne er blevet talt ved en sam-35 menligningsteknik.

Ved hjælp af passende standarder kan man alternativt også udtrykke resultaterne i molære koncentrationer af antigener CD2 og CD37 i den undersøgte prøve.

Eksempel 10.

38 DK 174032 B1

Bestemmelse af antigenerne GpIIb-IIIa og CD9 på humane blod-p 1 ader .

5

Bestemmelsen udføres ifølge eksempel 3 under anvendelse af mo-noklonale antistoffer radiomærket med jod 125.

Bl odpi aderne isoleres fra menneskeblod ved centrifugering i 10 nærværelse af perfus ionsvæske PLASMION (Laboratoire R. Bel-

Ion). Han blander i et reagensgals 5 ml blod + 5 ml saltholdig phosphatstødpude (PBS) og 10 ml PLASMION. Glasset centrifugeres så i 10 minutter ved 1500 o/m. Blodpladerne, der er samlet i den overliggende væske, udtages ved udsugning med 15 pipette. De vaskes en gang i PBS ved blanding af 1 rumfang bl odp 1 adesuspens ion med 10 ml PBS og centrifugeres så i 10 minutter ved 1000 x g. Til slut opsamler man blodpladebund-faldet, som bringes i suspension igen i PBS (2 ml). Blodpladerne tælles, og deres koncentration indstilles til 2,5 mil-20 1 ioner pr. ml PBS.

For at bestemme antigenet GpIIb-IIIa udfører man immunoind-fangning af blodpladerne med det monoklonale antistof I0B2 (Immunotech) og mærkning af antigenet GpII-IIIa med det mono-25 klonale antistof P2 (Immunotech).

For at bestemme antigenet CD9 bevirker man immunoindfangning med det monoklonale antistof P2 og mærkning med det monoklonale antistof I0B2. Man måler antallet af dpm pr. prøve om-30 fattende 200.000 blodplader.

Resultaterne er vist i tabel 6.

35 39 DK 174032 B1

Tabel 6 ] Målt antigen | Prøve målt | Kontrol uden celler \

5 1_]_____Ldpm]___I_(dpm)____J

CD9_1 1.927_I_ 113_I

I GpIIb-lIIa__] 2.S91_J_238_|

Eksempel 11 10

Bestemmelse af antigener CD15 båret af humane granulocytter.

*

Antigen C015 er en god specifik markør for humane granulocyt-ter (også kaldet flerkernede legemer). Bedømmelsen af disse 15 celler i kraft af dette antigen kan praktiseres i blod, som for enhver anden leukocytunderpopulation. Den anvendes ligeledes til at bedømme tilstedeværelsen af granulocytter i urin f.eks. i tilfælde af urinvejsinfektioner, såsom cyst i ti s eller pyelonephrites. I det foreliggende eksempel er bestemmel sen 20 udført på granu 1 ocytter, der stammer fra totalt blod og er fraskilt som vist nedenfor.

Granulocytterne bliver samtidig med visse enkernede celler skilt fra røde blodlegemer ved en fremgangsmåde analog med 25 den, der er beskrevet i eksempel 10 for blodplader, med undtagelse af, at man henstiller glasset indeholdende cellerne i 45 minutter ved omgivelsernes temperatur, og man genvinder suspension af 1eukocytterne i 500 μΐ udtaget ved overfladen af væsken.

30

Granulocytterne immobi1iseres i fordybninger med et monoklo-nalt antistof, der er spec i fikt for antigen CD45, som findes på cel lemembranen af alle 1eukocytterne: man anvender anti stoffet anti-LCA (BIOSYS) adsobreret i mi krofordybn i ngerne i 35 titreringspladen som vist i eksempel 1.

Til bestemmelsen anvender man det monoklonale antistof anti-CD15 SMY-15a (BIOSYS) mærket med peroxydase ved teknikken beskrevet i eksempel 1.

40 DK 174032 B1

Med 12.500 totale celler indført pr. fordybning er det specifikke signal af antigen CD15 fra granulocytterne således 0,616 efter korrektion af den ubearbejdede optiske tæthed for en blindprøve på 0,100 fremkommet i nærværelse af celler og i 5 fravær af enzymatisk konjugat og for granulocytterens endogene peroxydasevand.

Eksempel 12 10 Bedømmelse af en leukæmis phenotype ved den immunoenzymometri-ske fremgangsmåde.

-J

Phenotypebestemmelsen af tumorceller hos en 1eukæmi pat ient er en systematisk diagnostisk undersøgelse, der udføres for at 15 karakterisere typen og oprindelsen af patientens 1eukæmicel1 er (T, B, granulocytter, myeloblaster osv.). Denne undersøgelse udføres traditionelt ved i mmunoflurescensteknikken ved at anvende et batteri af monoklonale antistoffer og iagttage og tælle de positive celler i mikroskop. Man anvender ligeledes 20 strømningscytometri for at analyse mærkningen af cellerne.

Anvendelsen af monoklonale antistoffer ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen gør det muligt at identificere de store klinisk betydningsfulde grupper af akut eller kronisk leukæmi 25 ved desuden at anvende en kvantitativ oplysning om de relative tætheder af de forskellige undersøgte antigener.

I dette eksempel er fremstillet 6 monoklonale antistoffer koblet med peroxydase, der er specifikke for antigener, der fin-30 des på leukæmiceller: STI og ST11 (BIOSYS): anti-CD 5 og anti-CD2 SB3 (BIOSYS): anti-CD37 S-CALLA (SAN0FI): anti-CALLA (eller anti-CDlO) 35 S-klasse II (BIOSYS): anti-HLA-Dr (eller anti-HLA af klasse II) SMY15 (BIOSYS): anti-CD15.

41 DK 174032 B1

Mikrotitrer ingspladen fremstilles ved forudgående adsorption af en blanding af de monoklonale antistoffer anti-CD45 (S-LCA, BIOSYS) og anti-HLA af klasse I (S-klasse I, BIOSYS).

5 Ved anvendelse af de ovennævnte 6 udvalgte monoklonale antistoffer har man bedømt phenotypen af en kronisk lymfoid leukæmi B (LLC-B) som i øvrigt blev karakteriseret ved den sædvanli ge metode.

10 For i alt 80.000 enkernede celler indført pr. fordybning eller for kontrol fordybningerne uden celler er de optiske tætheder målt ved 492 nm anført i nedenstående tabel 7. For kontrol fordybningerne med celler, men uden antistof mærket med peroxy-dase er den optiske tæthed 0,110.

15

Tabel 7 I I Optisk tæthed |

20 I Monoklonalt antistof |____________J

I og tilsvarende | Prøve med | Kontrol uden | 1 antigen_1 celler__1.....celler____________| I ST11 (CD2) I 0,270 | 0,030 | I STI {CD5 ) I 1,350 I 0,014 | 25 I SB3 (CD3 7) | 0,850 | 0,005 | I S-klasse II (HLA-Dr) | 1,640 | 0,010 | I SMY15 (CD15) I 0,235 | 0,007 |

I CALLA (C010)_1 0,160_I 0,002_ I

30

De undersøgte 1eukæmice11 er bærer således rigeligt af antigenerne CD5, CD3 7 og HLA af klasse II, men de bærer ikke eller kun meget svagt antigenerne CD15, CALLA og CD2, hvilket er karakteristisk for en LLC-B.

35

Eskempel 13 42 DK 174032 B1

Bestemmelse af antigener, der står i forbindelse med cancer i uri nvejene.

5

Udstyret og fremgangsmåderne ifølge opfindelsen er især tilpasset til påvisning af tumorceller, især tumorer i urinvejene, og er velegnede til masseopsporing i højrisikogrupper f.eks. arbejdere i den kemiske industri eller andre meget ud-10 satte grupper.

Det foreliggende eksempel viser anvendelsen af opfindelsen til bestemmelse af et antigen, der står i forbindelse med blærekræft, på cellerne af linien RT4, der stammer fra en human 15 ur i nvejspapi 11 om (C.C. Rigby og L.M. Franks, Brit. 0. Cancer, 1970, 24, 746-754).

Pladerne beregnet til immunoindfangning af cellerne fremstilles som i eksempel 1 ved i fordybningerne at adsorbere det 20 monoklonale antistof S-klasse I (BIOSYS), som genkender et antigen HLA af klasse I, og er i stand til at fastholde alle epi telcel lerne.

Marker i ngskonjugaterne fås ved fremgangsmåderne i eksempel 1 25 (til enzymatisk markering) eller eksempel 3 (til radioisotop-markering) med det monoklonale antistof 12F6 (SAN0FI) som genkender et antigen, der står i forbindelse med blærekræft.

Til bestemmelsen fordeles i 4 mi krofordybni nger 75 μΐ af cel -30 lesuspensionen (dvs. 50 x 10^ celler pr. fordybning). I 2 for-dybni nger indføres konjugatet af monoklonalt antistof 12F6 (SAN0FI) koblet med peroxydase, i 2 andre fordybninger antistoffet 12F6 mærket med jod 125 (100.000 cpm/fordybning). Resultaterne, der blev opnået ved anvendelse af den immunoenzy-35 mometriske fremgangsmåde eller den rad ioimmunometri ske fremgangsmåde, er vist i tabel 8.

Tabel 8 43 DK 174032 B1 | Mærket mono- | I Forhold | 5 | klonalt anti- | Optisk tæthed (ved 492 nm) | patient sig- | I stof 1 eller com _1 nal/uspeci- | I I Prøve der skal 1 Kontrol | fikt signal |

1_I bestemmes___J___L—--J

I 12F6 peroxydase J 0,782 | 0,078 | 10,0 | 10 1 12F6 iod 125 I 1,612_1 350 1 *>6_1

Eksempel 14

Immunoenzymometri sk bestemmelse af et membranantigen på gæren 15 Candida albicans.

Cellerne af Candida albicans (serotype 17) stammer fra samlingen i Institut Pasteur, Paris. Gæren dyrkes i 18 timer på sædvanlig måde på et fast syntetisk medium. Cellerne tælles, og 20 man fremstiller en cellesuspension indeholdende ID5 celler pr. ml opløsning i stødpude PBS.

De anvendte monoklonale antistoffer anti-Candida albicans er fremstillet ved 1ymfocythybridi ser ing, som beskrevet i doktor-25 afhandlingen af T. Chardes, Faculté de Pharmacie, Universitet i Montpellier I, 1988.

Antistoffet CA4 anvendes til immunoindfangni ngen, medens antistoffet CA12 mærket med peroxydase anvendes til bestemmelse 30 under betingelserne i eksempel 1.

Oe ved 492 nm målte optiske tætheder for fordybningerne indeholdende de indførte celler og for kontrol prøven uden celler er henholdsvis 1,025 og 0,080.

35

Eksempel 15 44 DK 174032 B1

Immunoenzymometri sk bestemmelse udført på magnetiske kugler: bestemmelse af antigen CD5 på humane T-lymfocytter med et kon-5 jugat af antistof mærket med acetylcholinesterase og en partikelformet bærer dannet af magnetiske kugler.

Bæreren, der anvendes til indfangning af cellerne, udgøres af magnetiske kugler DYNABEADS. Kuglerne med betegnelsen 10 DYN-11101, der forhandles af BIOSYS, bærer på deres overflade et antistof anti-CD2, som er i stand til at fiksere alle T-1ymfocytterne i en undersøgt prøve. Disse kugler behandles endvidere med en opløsning af antistof anti-CD2 før brugen for at forbedre udførelsen af bestemmelsen.

15

Til dette formål blandes 10 μΐ af kuglesuspensionen med 1 ml opløsning af antistof med 25 pg/ml i stødpude PBS i 1 time under mild omrøring. Kuglerne bliver derefter vasket 4 gange med stødpude PBS og opbevares så i 4 ml stødpude PBS.

20

Til bestemmelsen indfører man i rækkefølge i et glas på 5 ml: 200 μΐ kuglesuspension, 80 μΐ suspension af enkernede celler udskilt af totalt blod ved hjælp af Ficoll-Paque (Pharmacia), og derefter tilsættes 280 μΐ konjugat af antistof STI mærket 25 med acetylcholinesterase identisk med det, der blev anvendt i eksempel 6.

Efter 1 time under mild omrøring fraskilles kuglerne ved hjælp af en magnet, og cellerne fikseret på kuglerne vaskes med en 30 stødpude PBS (5 vaskninger).

Acetylcholinesterasen fikseret på cellerne afsløres på samme måde som i eksempel 6. Det fremkomne signal for optisk tæthed er 0,168 i nærværelse af de mærkede celler, og blindprøven 35 uden celler viser 0,062.

Claims (40)

1. Udstyr til immunometri sk bestemmelse af et overfladean-5 tigen, der er karakteristisk for en population eller underpopulation af celler, kendetegnet ved, at det omfatter: a) en fast bærer, hvorpå der ved covalent binding eller ved 10 fysisk adsorption er fikseret et eller flere monoklonale antistoffer rettet mod overfladeantigenerne på cellepopulationen, som skal bestemmes, udover det nævnte karakteristiske antigen, b) en eller flere opløsninger, der hver indeholder et monoklo-15 nalt antistof, som er specifikt for det nævnte antigen, der er karakteristisk for den population eller underpopulation af celler, som skal bestemmes, og som er mærket med en radioaktiv sonde eller en enzymatisk sonde, 20 c) hvis det drejer sig om antistof mærket med en enzymatisk sonde en eller flere opløsninger, som indeholder de reagenser, der er nødvendige til at afsløre enzymets aktivitet, d) eventuelt en yderligere bestanddel, der udgøres af en 25 vaskeopløsning af stødpude og/eller prøver, der muliggør kalibrering og kontrol af kvaliteten af bestemmelsen.

2. Udstyr ifølge krav 1, kendetegnet ved, at bestanddelen (a) er en fast bærer, der udgøres af en mikrotitre- 30 ringsplade, i hvis fordybninger der er fikseret det eller de antistoffer, der er beregnet til at immobilisere cellerne, blandt hvilke der findes celler af den population eller underpopulation som bærer antigenet, der skal bestemmes.

3. Udstyr ifølge krav 1, kendetegnet ved, at be standdelen (a) er en parti kel formet magnetisk bærer.

4. Udstyr ifølge krav 1 til 3, kendetegnet ved, at bestanddelen (a) udgøres af en fast bærer, hvorpå der er fik- DK 174032 B1 seret et eller flere monoklonale antistoffer HLA af klasse I.

5. Udstyr ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det fikserede monoklonale antistof er antistoffer kaldet S-klasse

5 I .

6. Udstyr ifølge krav 1 til 3, kendetegnet ved, at de monoklonale antistoffer i bestanddel (b) er mærket med en radioisotopsonde af jod 125 eller jod 131. 10

7. Udstyr ifølge krav 1 til 3, kendetegnet ved, at de monoklonale antistoffer i bestanddel (b) er mærket med en enzymatisk sonde.

8. Udstyr ifølge krav 7, kendetegnet ved, at de mo noklonale antistoffer i bestanddel (b) er mærket med peroxyda-se, og at bestanddelen (c) omfatter i det væsentlige oxygene-ret vand og et chromogen valgt blandt orthophenylendiamin, 2,2'-azino-bis(3-ethyl-6-benzothiazoli nsul fonsyre), 3,3'-d i a- 20 minobenzidin, 3-amino-9-ethylcarbazol eller et af deres vand-opløselige salte.

9. Udstyr ifølge krav 7, kendetegnet ved, at de monoklonale antistoffer i bestanddel (b) er mærket med alkalisk 25 phosphatase og at bestanddel (c) udgøres af paran itropheny1 -phosphat, 4-methyl umbel 1 i fery 1phosphat eller 5-brom-4-chlor- 3-indolylphosphat.

10. Udstyr ifølge krav 7, kendetegnet ved, at de 30 monoklonale antistoffer i bestanddel (b) er mærket med β-ga- lactosidase, og at bestanddelen (c) udgøres af orthonitrophe-nyl-β-D-galactopyranosid eller 4-methylumbel1iferyl-β-D-ga-1actopyranosi d. 35 li. Udstyr ifølge krav 7, kendetegnet ved, at de monoklonale antistoffer i bestanddel (b) er mærket med acetylcholinesterase, og at bestanddel (c) omfatter i det væsentlige acetylthiocholin og 5,5'-dithio-2-nitrobenzoesyre eller et af deres vandopløselige salte. DK 174032 B1

12. Udstyr ifølge krav 1 til bestemmelse af et eller flere overfladeantigener på formede elementer i menneskeblod, såsom leukocytter, lymfocytter, T-1 ymfocytter, B-lymfocytter, granu-locytter og blodplader. 5

13. Udstyr ifølge krav 12 til bestemmelse af antigenet CD4 eller CD8 på humane T-lymfocytter, som bærer dette antigen kaldet T4-lymfocytter eller T8-lymfocytter.

14. Udstyr ifølge krav 1 til bestemmelse af et eller flere overfladeantigener på en patogen mikroorganisme.

15. Udstyr ifølge krav 14, kendetegnet ved, at den patogene mikroorganisme er Candida albicans. 15

16. Udstyr ifølge krav 1 til bestemmelse af et eller flere membranantigener på tumorceller.

17. Udstyr ifølge krav 16, kendetegnet ved, at tu-20 morcellerne er cancerceller i urinvejene eller en af cellerne i maligne hæmopatier.

18. Udstyr ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at bestanddelen {a) er en mi krotitreringsplade i hvis fordyb- 25 ninger der er fikseret et eller flere monoklonale antistoffer, der er specfikke for overfladeantigener på en cellepopulation, og bestanddelen (b} udgøres af flere opløsninger, der hver indeholder et monoklonalt antistof, der er specifikt for et overfladeantigen på en celleunderpopulat i on, som udgør en væ-30 sentlig del af den fikserede cellepopulation.

19. Udstyr ifølge krav 18 til bestemmelse af antigener, der er specifikke for lymfocytunderpopulationerne T, T4, T8 og B.

20. Udstyr ifølge krav 18 til karakterisering og bestemmelse af de forskellige antigener, der udgør den antigene udrustning på overfladen af tumorceller af maligne hæmopatier. DK 174032 B1

21. Fremgangsmåde til immunometrisk bestemmelse af overfladeantigener på en population eller underpopulation af celler, kendetegnet ved, at den består i: 5 a) at immobil i sere cellepopulationen som bærer antigenet, der skal bestemmes eller en cellepopulation omfattende den underpopulation, som bærer antigenet, der skal bestemmes på en fast bærer ved anvendelse af et eller flere monoklonale antistoffer, der forud er fikseret ved covalent binding eller ved fy-10 sisk adsorption på bæreren og i stand til at genkende et antigen, der findes på overfladen af cellerne udover antigenet som skal bestemmes, og i samme trin direkte at mærke populationen eller underpopu-15 lationen af celler, som skal bestemmes, ved hjælp af mindst et monoklonalt antistof, der er spec i fikt for antigenet, der skal bestemmes, hvilket antistof bærer en radioisotopsonde eller enzymatisk sonde, 20 b) overholde en inkubationsperiode, c) vaske bæreren for at fjerne de ikke immobi 1 i serede celler og overskud af antistof, 25 d) hvor det drejer sig om antistof, som bærer en enzymatisk sonde, at tilsætte det eller de nødvendige reagenser (sub strat og chromogen) til at afsløre enzymaktiviteten, e) aflæse resultaterne enten ved tælling af radioaktiviteten 30 eller ved måling af lyssignaler (farvning eller fluorescens), idet der eventuelt sammenlignes med en kalibreringsskala.

22. Fremgangsmåde ifølge krav 21, kendetegnet ved, at den faste bærer er som defineret i et af kravene 1 eller 2. 35

23. Fremgangsmåde ifølge krav 21 eller 22, k e n d e t e g -net ved, at de til markering bestemte monoklonale antistoffer bærer en enzymatisk sonde. DK 174032 B1

24. Fremgangsmåde ifølge krav 23, kendetegnet ved, at den enzymatiske sonde er peroxydase og at enzymets aktivitet afsløres med oxygeneret vand og et chromogen valgt blandt orthophenylendiamin, 2,2'-azino-bis(3-ethyl-6-benzothiazolin- 5 sulfonsyre), 3,3'-di am inobenzidin, 3-amino-9-ethylcarbazol eller et af deres vandop1 øse 1ige salte.

25. Fremgangsmåde ifølge krav 23, kendetegnet ved, at den enzymatiske sonde er alkalisk phosphatase, og at enzym- 10 aktiviteten afsløres med paranitrophenylphosphat, 4-methyl umbel 1 i ferylphosphat eller 5-brom-4-ch1 or-3 - i ndo 1y1phosphat.

26. Fremgangsmåde ifølge krav 23, kendetegnet ved, at den enzymatiske sonde er /3 - g a 1 ac tos i dase og at enzymakti- 15 viteten afsløres med orthonitrophenyl-β-D-galactopyranosid eller 4-methy1 umbel liferyΙ-β-D-galactopyranos id.

27. Fremgangsmåde ifølge krav 23, kendetegnet ved, at den enzymatiske sonde er acetylcholinesterase, og at enzym- 20 aktiviteten afsløres med acety1thiocholin og som chromogen 5,5"-dithio-2-nitro-benzoesyre eller et af deres vandopløselige salte.

28. Fremgangsmåde ifølge krav 21 eller 22, kendeteg- 25 net ved, at det til markering bestemte monoklonale antistof bærer en rad i o i sotopsonde af jod 125 eller jod 131.

29. Fremgangsmåde ifølge krav 21 eller 22, kendeteg net ved, at den samlede varighed af udførelsen af bestem- 30 melsen er lig med eller under 1 time.

30. Fremgangsmåde ifølge krav 21, kendetegnet ved, at de på den faste bærer fikserede monoklonale antistoffer er antistoffer HLA af klasse I. 35

31. Fremgangsmåde ifølge krav 30, kendetegnet ved, at det på den faste bærer fikserede monoklonale antistof er antistoffet kaldet S-klasse I. DK 174032 B1

32. Fremgangsmåde ifølge krav 21 til bestemmelse af et eller flere overfladeantigener på formede elementer i menneskeblod.

33. Fremgangsmåde ifølge krav 21, kendetegnet ved, 5 at de formede elementer i menneskeblod er leukocytter, lymfocytter, T-lymfocytter, T-lymfocytter, som bærer markøren CD4 kaldet T4-lymfocytter, T-lymfocytter, som bærer markøren C08 kaldet T8-lymfocytter, B-1ymfocytter, granulocytter, blodplader. 10

34. Fremgangsmåde ifølge krav 21 til bestemmelse af et eller flere overfladeantigener på en patogen mikroorganisme.

35. Fremgangsmåde ifølge krav 34, kendetegnet ved, 15 at den patogene mikroorganisme er Candida albicans.

36. Fremgangmsåde ifølge krav 21 til bestemmelse af et eller flere membranantigener på tumorceller.

37. Fremgangsmåde ifølge krav 26, kendetegnet ved, at tumorce11 erne er cancerceller i urinvejene, eller celler af maligne hæmopatier.

38. Fremgangsmåde ifølge krav 21 og 22 bestående i at immobi-25 lisere en cellepopulation på en mi krotitrer ingsp1ade med et eller flere monoklonale antistoffer, der er specifikke for overfladeantigener på denne population, og samtidig direkte at mærke cel 1eunderpopulat i oner, som er en væsentlig del af den fikserede population, ved hjælp af flere opløsninger, der hver 30 indeholder et monoklonalt antistof, der hvert er specifikt for et overfladeantigen på en de cel 1eunderpopu1 at i oner, som skal bestemmes.

39. Fremgangsmåde ifølge krav 38 til bestemmelse af antigener, 35 der er specifikke for 1ymofytunderpopulat i onerne T, T4, T8 og B.

40. Fremgangsmåde ifølge krav 38 til karakterisering og bestemmelse af forskellige antigener, der udgør den antigene ud- DK 174032 B1 rustning på overfladen af tumorceller af maligne hæmopatier. 5 10 15 20 25 30 35