JPH0731199B2 - 低 ｐＩ蛋白質または炭水化物を含んでなる特異的バインディング組成物ならびに診断試験キットおよび使用方法 - Google Patents
低 ｐＩ蛋白質または炭水化物を含んでなる特異的バインディング組成物ならびに診断試験キットおよび使用方法Info
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- JPH0731199B2 JPH0731199B2 JP1146910A JP14691089A JPH0731199B2 JP H0731199 B2 JPH0731199 B2 JP H0731199B2 JP 1146910 A JP1146910 A JP 1146910A JP 14691089 A JP14691089 A JP 14691089A JP H0731199 B2 JPH0731199 B2 JP H0731199B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、標的リガンドの検出方法における特異的バイ
ンディング種を含んでなる特異的バインディング組成物
およびその使用に関する。また、その組成物を含む診断
試験キットにも関する。本発明は、診断方法において有
用である。
ンディング種を含んでなる特異的バインディング組成物
およびその使用に関する。また、その組成物を含む診断
試験キットにも関する。本発明は、診断方法において有
用である。
医業では、生物学的流体、細胞または組織中に存在する
生物学的および化学的物質の迅速かつ正確な検出または
定量についての調査および診断方法の必要性が依然とし
て存在する。例えば、生物学的検体における薬剤、ホル
モン、ステロイド、ポリペプチド、ヌクレオチド、プロ
スタグランジン、蛋白質、炭水化物または感染性生物体
（細菌、カビまたはウイルス）の存在は、適切な診断ま
たは処置のために正確かつ迅速な方法で測定されねばな
らない。
生物学的および化学的物質の迅速かつ正確な検出または
定量についての調査および診断方法の必要性が依然とし
て存在する。例えば、生物学的検体における薬剤、ホル
モン、ステロイド、ポリペプチド、ヌクレオチド、プロ
スタグランジン、蛋白質、炭水化物または感染性生物体
（細菌、カビまたはウイルス）の存在は、適切な診断ま
たは処置のために正確かつ迅速な方法で測定されねばな
らない。
例えば、特定のストレプトコッカス（Streptococcus）
属に属するようなグラム陽性細菌に分類される生物体
は、ヒトの病原体として知られている。グループＡの微
生物が、主にＢ型溶血性肺炎、猩紅熱、リウマチ熱、心
臓病続発症、糸球体腎炎、敗血性咽喉痛および産褥感染
症を引き起こす原因となる。ストレプトコッカスＡによ
り生ずる感染力の深刻な作用のため、その存在を早い段
階で診断することが重要であり、そうすることで適切な
処置方針をとることができる。換言すれば、感染因子を
低濃度で検出できるような高感度アッセイを入手するこ
とが望まれる。
属に属するようなグラム陽性細菌に分類される生物体
は、ヒトの病原体として知られている。グループＡの微
生物が、主にＢ型溶血性肺炎、猩紅熱、リウマチ熱、心
臓病続発症、糸球体腎炎、敗血性咽喉痛および産褥感染
症を引き起こす原因となる。ストレプトコッカスＡによ
り生ずる感染力の深刻な作用のため、その存在を早い段
階で診断することが重要であり、そうすることで適切な
処置方針をとることができる。換言すれば、感染因子を
低濃度で検出できるような高感度アッセイを入手するこ
とが望まれる。
診断上の測定方法を提供する目的で、測定される生物学
的または化学的物質（本明細書では「標的リガンド」ま
たは単に「リガンド」という）と受容体（前記物質と特
異的に反応またはバインディングする分子）との間の特
異的バインディング反応を利用する前記物質の単離同定
について多種多様な方法が案出されてきた。リガンドと
その対応する受容体との間の前記反応は、特異的バイン
ディング反応として既知である。そのリガンドと受容体
のいずれかが抗体であるとき、反応は免疫反応として既
知である。かかる反応には１種以上のリガンドまたは受
容体が関与し得る。
的または化学的物質（本明細書では「標的リガンド」ま
たは単に「リガンド」という）と受容体（前記物質と特
異的に反応またはバインディングする分子）との間の特
異的バインディング反応を利用する前記物質の単離同定
について多種多様な方法が案出されてきた。リガンドと
その対応する受容体との間の前記反応は、特異的バイン
ディング反応として既知である。そのリガンドと受容体
のいずれかが抗体であるとき、反応は免疫反応として既
知である。かかる反応には１種以上のリガンドまたは受
容体が関与し得る。
前記のような反応は、いろいろな方法で検出される。一
般に、特異的バインディング反応に関与する１以上のも
のが検出し得るように標識される。すなわち、それが本
来的に検出可能であるか、または検出可能な成分（例え
ば、酵素、放射性同位体、色原体または蛍光助剤）が何
等かの方法でそれらに組み込まれたものが選ばれる。最
近では、検出可能な成分として酵素を利用するアッセイ
（例えば、ELISA）が多数存在する。これは一定の場合
に、アッセイに必要な備品が最小限ですむ点で便利であ
り、ならびに感度が改善されているからである。
般に、特異的バインディング反応に関与する１以上のも
のが検出し得るように標識される。すなわち、それが本
来的に検出可能であるか、または検出可能な成分（例え
ば、酵素、放射性同位体、色原体または蛍光助剤）が何
等かの方法でそれらに組み込まれたものが選ばれる。最
近では、検出可能な成分として酵素を利用するアッセイ
（例えば、ELISA）が多数存在する。これは一定の場合
に、アッセイに必要な備品が最小限ですむ点で便利であ
り、ならびに感度が改善されているからである。
特異的バインディング反応を利用する多くの分析方法に
内在する重要な課題の一つは、非特異的バインディング
反応が起こることである。例えば、抗体または抗原のよ
うな特異的バインディング種は、それが特異的でない他
の蛋白質、炭水化物または化学的もしくは生物学的物質
と無差別に反応する可能性がある。それらは、また相互
に反応して共に凝集することにより、それらが特異的反
応性を有する分子との特異的バインディングを阻害する
可能性がある。さらに、アッセイがある種の固体支持体
（例えば、膜、ガラス・チューブ、プレート、ビーズま
たは繊維）を用いて実施される場合には、特異的バイン
ディング種がその表面上の化学基のためにこれらの材料
に非特異的バインディングする可能性もある。
内在する重要な課題の一つは、非特異的バインディング
反応が起こることである。例えば、抗体または抗原のよ
うな特異的バインディング種は、それが特異的でない他
の蛋白質、炭水化物または化学的もしくは生物学的物質
と無差別に反応する可能性がある。それらは、また相互
に反応して共に凝集することにより、それらが特異的反
応性を有する分子との特異的バインディングを阻害する
可能性がある。さらに、アッセイがある種の固体支持体
（例えば、膜、ガラス・チューブ、プレート、ビーズま
たは繊維）を用いて実施される場合には、特異的バイン
ディング種がその表面上の化学基のためにこれらの材料
に非特異的バインディングする可能性もある。
特に、ポリアミド膜は、特異的バインディング種（例え
ば、抗体）との非特異的相互作用に対して感受性であ
る。固体表面（例えば、ポリアミド）への非特異的バイ
ンディングは、カゼインまたはウシ血清アルブミンのよ
うな蛋白質でそれらを被覆するこにより極小化し得るこ
とが知られている。
ば、抗体）との非特異的相互作用に対して感受性であ
る。固体表面（例えば、ポリアミド）への非特異的バイ
ンディングは、カゼインまたはウシ血清アルブミンのよ
うな蛋白質でそれらを被覆するこにより極小化し得るこ
とが知られている。
これらの好ましくない非特異的反応の全てが、バックグ
ランド障害（すなわち、不要な検出可能なシグナル）を
生じてアッセイ感度を劣化させる（すなわち、低濃度検
出性が劣る）。ヨーロッパ特許公開第0280560号公報に
は、凝集アッセイにおける非特異的相互作用が、これら
のアッセイで使用される微多孔質膜を一定の低pI値の蛋
白質または炭水化物で被覆することにより極小化され得
ることが記載されている。
ランド障害（すなわち、不要な検出可能なシグナル）を
生じてアッセイ感度を劣化させる（すなわち、低濃度検
出性が劣る）。ヨーロッパ特許公開第0280560号公報に
は、凝集アッセイにおける非特異的相互作用が、これら
のアッセイで使用される微多孔質膜を一定の低pI値の蛋
白質または炭水化物で被覆することにより極小化され得
ることが記載されている。
凝集アッセイで一定の改良がなされているにもかかわら
ず、ELISAまたはサイドイッチアッセイのような非凝集
アッセイでは、同様に膜を被覆したものが低いバックグ
ランドおよび高いアッセイ感度を同時には示さないこと
がわかった。一般に、酵素標識を使用するアッセイの感
度は高いが、膜がたとえ被覆されるとしても好ましくな
いバックグランドが課題となるであろう。
ず、ELISAまたはサイドイッチアッセイのような非凝集
アッセイでは、同様に膜を被覆したものが低いバックグ
ランドおよび高いアッセイ感度を同時には示さないこと
がわかった。一般に、酵素標識を使用するアッセイの感
度は高いが、膜がたとえ被覆されるとしても好ましくな
いバックグランドが課題となるであろう。
低濃度のリガンドに対して高い感度を示し、しかも非特
異的相互作用に由来する不要なシグナルの極小を示すア
ッセイを入手することが強く望まれる。
異的相互作用に由来する不要なシグナルの極小を示すア
ッセイを入手することが強く望まれる。
前述の課題は、本発明によれば、Ａ）特異的バインディ
ング種と、Ｂ）１種類もしくはそれ以上の、５を越える
pI値を実質的に全く有さない水溶性蛋白質および／また
は炭水化物との水性混合物である特異的バインディング
組成物を使用するアッセイにより解決することができ
る。
ング種と、Ｂ）１種類もしくはそれ以上の、５を越える
pI値を実質的に全く有さない水溶性蛋白質および／また
は炭水化物との水性混合物である特異的バインディング
組成物を使用するアッセイにより解決することができ
る。
本発明の特異的バインディング組成物は、標的リガンド
検出用診断試験キット中に含めることができる。
検出用診断試験キット中に含めることができる。
本発明は、また、生物学的検体試料中の標準リガンドを
検出する方法であって、下記の工程： A.A）特異的バインディング種と、Ｂ）１種類もしくは
それ以上の、５を越えるpI値を実質的に全く有さない水
溶性蛋白質および／または炭水化物との水性混合物であ
る特異的バインディング組成物を、標的リガンドを含む
ことが予測される生物学的検体試料と接触させて特異的
バインディング複合体を形成する工程、そして B.前記検体試料中でリガンドの存在を示すものとしての
前記複合体の存在を検出する工程、 を含んでなることを特徴とする生物学的検体試料中の標
的リガンドの検出方法も提供する。
検出する方法であって、下記の工程： A.A）特異的バインディング種と、Ｂ）１種類もしくは
それ以上の、５を越えるpI値を実質的に全く有さない水
溶性蛋白質および／または炭水化物との水性混合物であ
る特異的バインディング組成物を、標的リガンドを含む
ことが予測される生物学的検体試料と接触させて特異的
バインディング複合体を形成する工程、そして B.前記検体試料中でリガンドの存在を示すものとしての
前記複合体の存在を検出する工程、 を含んでなることを特徴とする生物学的検体試料中の標
的リガンドの検出方法も提供する。
本発明は、ヒトまたは動物宿主に由来する生物学的検体
における標的リガンドの存在を迅速に検出するのに使用
することができる。前述したように、このリガンドは、
その場で特異的に反応して複合体を形成する対応する受
容体が存在するすべての化学的または生物学的な物質で
あり得る。限定されるものでないが、代表的なリガンド
としては、蛋白質（例えば、酵素、抗体および抗原蛋白
質ならびにそれらの断片）、ペプチド、ポリペプチド、
ヌクレオチド、炭水化物、植物レクチン、毒素、ハプテ
ン、薬剤、ウイルス、カビおよび細菌ならびにそれらの
構成要素、さらに当業者に既知の他の物質が挙げられ
る。本発明は、特に連鎖球菌性（Streptococcal）抗
原、例えば連鎖球菌性A,B,CまたがＧグループ生物体か
ら抽出される炭水化物の検出に有用である。最も好まし
くは、本発明によれば連鎖球菌（または、ストレプトコ
ッカス）性Ａ抗原が検出可能である。
における標的リガンドの存在を迅速に検出するのに使用
することができる。前述したように、このリガンドは、
その場で特異的に反応して複合体を形成する対応する受
容体が存在するすべての化学的または生物学的な物質で
あり得る。限定されるものでないが、代表的なリガンド
としては、蛋白質（例えば、酵素、抗体および抗原蛋白
質ならびにそれらの断片）、ペプチド、ポリペプチド、
ヌクレオチド、炭水化物、植物レクチン、毒素、ハプテ
ン、薬剤、ウイルス、カビおよび細菌ならびにそれらの
構成要素、さらに当業者に既知の他の物質が挙げられ
る。本発明は、特に連鎖球菌性（Streptococcal）抗
原、例えば連鎖球菌性A,B,CまたがＧグループ生物体か
ら抽出される炭水化物の検出に有用である。最も好まし
くは、本発明によれば連鎖球菌（または、ストレプトコ
ッカス）性Ａ抗原が検出可能である。
限定されるものでないが、これらをアッセイすることが
できる生物学的試料としては、全血またはその成分（血
清もしくは血漿）、咽喉または口に由来する唾液または
粘液、涙液、脊髄液、糞便、尿、膣分泌液、精液、ヒト
組織または器官の抽出物ならびにヒト乳汁が挙げられ
る。これらの検体は、適当な手段を使用して集めること
ができる。例えば、連鎖球菌性抗原の検出では、一般に
咽喉用綿棒がアッセイされる。
できる生物学的試料としては、全血またはその成分（血
清もしくは血漿）、咽喉または口に由来する唾液または
粘液、涙液、脊髄液、糞便、尿、膣分泌液、精液、ヒト
組織または器官の抽出物ならびにヒト乳汁が挙げられ
る。これらの検体は、適当な手段を使用して集めること
ができる。例えば、連鎖球菌性抗原の検出では、一般に
咽喉用綿棒がアッセイされる。
本発明の限定的な態様は、特異的バインディング種およ
び５を越えるpI値のものは実質的に全く有さない１以上
の水溶性蛋白質または炭水化物（以下に詳細に定義す
る）を含んでなる特異的バインディング組成物の使用で
ある。
び５を越えるpI値のものは実質的に全く有さない１以上
の水溶性蛋白質または炭水化物（以下に詳細に定義す
る）を含んでなる特異的バインディング組成物の使用で
ある。
本明細書の定義によれば、特異的バインディング種と
は、他の生物学的化合物に特異的バインディングし得る
いずれかの生物学的または化学的化合物をいう。前記種
が標的リガンドと特異的に反応する場合には、これらの
種はそのリガンドに対する受容体として知られている。
他方、これらの種はリガンドについての受容体である
（リガンド自体に対するものでない）化合物と特異的バ
インディングしてもよい。限定されるものではないが、
代表的な特異的バインディング種としては、抗体は、抗
原性物質（例えば、蛋白質および炭水化物）、ペプチ
ド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ハプテン、薬剤、ホ
ルモン、アビジシまたはその誘導体、ビチオンまたはそ
の誘導体、レクチンまたはその誘導体および当業者に既
知の他のものが挙げられる。どのような特異的バインデ
ィング種が特定の標的リガンドまたは受容体と共に利用
されるかについては当業者には容易にわかるであろう。
は、他の生物学的化合物に特異的バインディングし得る
いずれかの生物学的または化学的化合物をいう。前記種
が標的リガンドと特異的に反応する場合には、これらの
種はそのリガンドに対する受容体として知られている。
他方、これらの種はリガンドについての受容体である
（リガンド自体に対するものでない）化合物と特異的バ
インディングしてもよい。限定されるものではないが、
代表的な特異的バインディング種としては、抗体は、抗
原性物質（例えば、蛋白質および炭水化物）、ペプチ
ド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ハプテン、薬剤、ホ
ルモン、アビジシまたはその誘導体、ビチオンまたはそ
の誘導体、レクチンまたはその誘導体および当業者に既
知の他のものが挙げられる。どのような特異的バインデ
ィング種が特定の標的リガンドまたは受容体と共に利用
されるかについては当業者には容易にわかるであろう。
好ましくは、特異的バインディング種は、検出可能なシ
ナグルを提供するために適当に標識される。標識は、分
子の生来の部分かまたはそれらに特別に付着した成分で
あってもよい。標識は、直接検出し得る、例えば、放射
性同位体、化学発光成分、リン光化合物、蛍光成分また
は色原体成分であって、さらに化学反応を伴うことなく
視覚的または適当な装置を使用して検出可能なものも挙
げることができる。た、間接的に検出し得る、例えば、
１以上の反応に関与して検出可能な種を与える酵素、ビ
オチンまたはアビジンを伴う標識であってもよい。
ナグルを提供するために適当に標識される。標識は、分
子の生来の部分かまたはそれらに特別に付着した成分で
あってもよい。標識は、直接検出し得る、例えば、放射
性同位体、化学発光成分、リン光化合物、蛍光成分また
は色原体成分であって、さらに化学反応を伴うことなく
視覚的または適当な装置を使用して検出可能なものも挙
げることができる。た、間接的に検出し得る、例えば、
１以上の反応に関与して検出可能な種を与える酵素、ビ
オチンまたはアビジンを伴う標識であってもよい。
限定されるものでないが、より好ましくは、特異的バイ
ンディング種としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホ
スフォターゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼお
よびβ−グルコシダーゼが挙げられる。ペルオキシダー
ゼおよびアルカリホスファターゼが好ましい。
ンディング種としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホ
スフォターゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼお
よびβ−グルコシダーゼが挙げられる。ペルオキシダー
ゼおよびアルカリホスファターゼが好ましい。
標識化特異的バインディング種は、既知の方法を使用し
て調製することができる。殆んどは市販されている。市
販されていないものは、既知の方法〔例えば、「放射性
標識種の調製」についてのMethods in Enzymology，9
2、免疫化学技術（Immunochemical Techniques）、277
ページ、LangoneおよびVan Vunakis編、1983、「ビオチ
ニル化種」についてのヨーロッパ特許公開第201,079号
公報ならびに米国特許第4,276,206号明細書、参照〕を
使用して調製される。一般に、酵素標識類は、酸素の誘
導、酵素誘導体の精製、その誘導体と抗体の反応、次い
で得られる接合体の精製および特性決定により調製され
る。各種の方法が次の文献に記載されている。すなわ
ち、Yoshitake,Eur.J.Biochem.，101,395（1979）、Nak
aneら、J.Histochemistry and Cytochemistry，22,1084
（1974）およびAvrameas,Bull.Soc.Chim.Biol., 50,1169
（1968）である。
て調製することができる。殆んどは市販されている。市
販されていないものは、既知の方法〔例えば、「放射性
標識種の調製」についてのMethods in Enzymology，9
2、免疫化学技術（Immunochemical Techniques）、277
ページ、LangoneおよびVan Vunakis編、1983、「ビオチ
ニル化種」についてのヨーロッパ特許公開第201,079号
公報ならびに米国特許第4,276,206号明細書、参照〕を
使用して調製される。一般に、酵素標識類は、酸素の誘
導、酵素誘導体の精製、その誘導体と抗体の反応、次い
で得られる接合体の精製および特性決定により調製され
る。各種の方法が次の文献に記載されている。すなわ
ち、Yoshitake,Eur.J.Biochem.，101,395（1979）、Nak
aneら、J.Histochemistry and Cytochemistry，22,1084
（1974）およびAvrameas,Bull.Soc.Chim.Biol., 50,1169
（1968）である。
組成物中に存在する特異的バインディング種の量は、標
的リガンド、使用される色素形成性組成物（酵素標識が
使用される場合）、使用される個々の標識および個々の
アッセイにおける他のファクターに応じて変化し得る。
しかしながら、一般に少なくとも0.1μg/ml、好ましく
は１〜20μg/mlの量で存在する。特異的バインディング
組成物における第２の重要な成分は、pI値が５以下の水
溶性蛋白質または炭水化物あるいはそれらの混合物であ
る。pI（または等電点）の語は、分子が電荷として中和
であるような分子中の正電荷と負電荷の数が等しいpHと
して知られている。蛋白質または炭水化物のpI値は、既
知の材料および方法を使用して測定することができる。
例えば、LKB Ampholine PAG plate（LKB-Produkter AB,
Bromma,Sweden、より入手可能）、pH範囲3.5〜9.5およ
び標準検量器を使用する等電点電気泳動により測定する
ことができる。
的リガンド、使用される色素形成性組成物（酵素標識が
使用される場合）、使用される個々の標識および個々の
アッセイにおける他のファクターに応じて変化し得る。
しかしながら、一般に少なくとも0.1μg/ml、好ましく
は１〜20μg/mlの量で存在する。特異的バインディング
組成物における第２の重要な成分は、pI値が５以下の水
溶性蛋白質または炭水化物あるいはそれらの混合物であ
る。pI（または等電点）の語は、分子が電荷として中和
であるような分子中の正電荷と負電荷の数が等しいpHと
して知られている。蛋白質または炭水化物のpI値は、既
知の材料および方法を使用して測定することができる。
例えば、LKB Ampholine PAG plate（LKB-Produkter AB,
Bromma,Sweden、より入手可能）、pH範囲3.5〜9.5およ
び標準検量器を使用する等電点電気泳動により測定する
ことができる。
本発明は、pI値が５を越える１以上の蛋白質または炭水
化物を少量（例えば、総蛋白質および炭水化物重量当た
り25重量％未満）有する組成物も包含することを意図す
る。従って、本発明の組成物中の蛋白質または炭水化物
の全てが必ずしも低いpI値を有しなければならないもの
ではないが、高いpI値を有する物質が多く使用される場
合には、発明の利点が著しく損われることを覚悟しなけ
ればならない。特異的バインディング組成物では、pI値
が５を越える蛋白質または炭水化物は、全く使用しない
ことが好ましい。
化物を少量（例えば、総蛋白質および炭水化物重量当た
り25重量％未満）有する組成物も包含することを意図す
る。従って、本発明の組成物中の蛋白質または炭水化物
の全てが必ずしも低いpI値を有しなければならないもの
ではないが、高いpI値を有する物質が多く使用される場
合には、発明の利点が著しく損われることを覚悟しなけ
ればならない。特異的バインディング組成物では、pI値
が５を越える蛋白質または炭水化物は、全く使用しない
ことが好ましい。
有用な水溶性低pI値蛋白質としては、カゼイン誘導体あ
るいは負に荷電される他の誘導体（例えば、カゼインの
アシル化、アルキル化もしくはスルホン化により得られ
る誘導体）、例えば、スクシニル化カゼイン、グルタリ
ル化カゼイン、スクシニル化ウシ血清アルブミン、スク
シニル化コラーゲンならびに当業者に明らかな他のもの
が挙げられる。これらの材料は、適当な条件下で利用可
能なアミン基を有する蛋白質をアシル化、アルキル化ま
たはスルホン化することにより容易に調製される。利用
可能なアシル化剤としては、限定されるものでないが、
ジカルボン酸およびポリカルボン酸に由来する無水物、
アシルハロゲン化物およびエステルのような米国特許第
4,591,571号明細書に記載されるものが挙げられる。好
ましいアシル化剤は、コハク酸無水物、グルタル酸無水
物およびジメチルグルタル酸無水物を含む。コハク酸無
水物が、特に好ましいアシル化剤である。スクシニル化
カゼインの調製は、以下に記載される。限定されるもの
でないが、本発明で使用するための蛋白質変性において
有用なアルキル化剤およびスルホニル化剤としては、ブ
ロモ酢酸、クロロ酢酸、フルオロニトロベンゼン、ｍ−
（クロロスルホニル）安息香酸、ブロモマレイン酸、ブ
ロモプロピオン酸およびｐ−（クロロスルホニル）安息
香酸が挙げられる。
るいは負に荷電される他の誘導体（例えば、カゼインの
アシル化、アルキル化もしくはスルホン化により得られ
る誘導体）、例えば、スクシニル化カゼイン、グルタリ
ル化カゼイン、スクシニル化ウシ血清アルブミン、スク
シニル化コラーゲンならびに当業者に明らかな他のもの
が挙げられる。これらの材料は、適当な条件下で利用可
能なアミン基を有する蛋白質をアシル化、アルキル化ま
たはスルホン化することにより容易に調製される。利用
可能なアシル化剤としては、限定されるものでないが、
ジカルボン酸およびポリカルボン酸に由来する無水物、
アシルハロゲン化物およびエステルのような米国特許第
4,591,571号明細書に記載されるものが挙げられる。好
ましいアシル化剤は、コハク酸無水物、グルタル酸無水
物およびジメチルグルタル酸無水物を含む。コハク酸無
水物が、特に好ましいアシル化剤である。スクシニル化
カゼインの調製は、以下に記載される。限定されるもの
でないが、本発明で使用するための蛋白質変性において
有用なアルキル化剤およびスルホニル化剤としては、ブ
ロモ酢酸、クロロ酢酸、フルオロニトロベンゼン、ｍ−
（クロロスルホニル）安息香酸、ブロモマレイン酸、ブ
ロモプロピオン酸およびｐ−（クロロスルホニル）安息
香酸が挙げられる。
利用できる低pI値の炭水化物には、水溶性セルロース誘
導体が含まれる。代表的な化合物は、カルボキシメチル
セルロース、カルボキシエチルセルロースおよび当業者
に容易に明らかとなる他のものである。これらのセルロ
ース誘導体は、一般に市販されている。
導体が含まれる。代表的な化合物は、カルボキシメチル
セルロース、カルボキシエチルセルロースおよび当業者
に容易に明らかとなる他のものである。これらのセルロ
ース誘導体は、一般に市販されている。
特異的バインディング種と混合して使用される好ましい
材料は、スクシニル化カゼイン、グルタリル化カゼイ
ン、カルボキシメチルセルロース、スクシニル化ウシ血
清アルブミンおよびスクシニル化コラーゲンである。
材料は、スクシニル化カゼイン、グルタリル化カゼイ
ン、カルボキシメチルセルロース、スクシニル化ウシ血
清アルブミンおよびスクシニル化コラーゲンである。
前述の水溶性蛋白質または炭水化物は、特異的バインデ
ィング組成物中、総組成物当たり少なくとも0.05重量％
の量で存在するのが好ましい。より好ましくは、0.05〜
２重量％の量で存在する。
ィング組成物中、総組成物当たり少なくとも0.05重量％
の量で存在するのが好ましい。より好ましくは、0.05〜
２重量％の量で存在する。
本発明の組成物は、一般に特異的バインディング種と適
当な緩衝液（pH4〜９）中の低pI値蛋白質または炭水化
物の混合により調製される。任意の添加剤には、防腐
剤、４′−ヒドロキシアセトアニリドおよび当業者に既
知の他の物質のような電子移動剤が含まれる。本発明の
代表的組成物を例１に示す。
当な緩衝液（pH4〜９）中の低pI値蛋白質または炭水化
物の混合により調製される。任意の添加剤には、防腐
剤、４′−ヒドロキシアセトアニリドおよび当業者に既
知の他の物質のような電子移動剤が含まれる。本発明の
代表的組成物を例１に示す。
本発明の組成物は、一般に特異的バインディング種と適
当な緩衝液（pH4〜９）中の低pI値蛋白質または炭水化
物の混合により調製される。任意の添加剤には、防腐
剤、４′−ヒドロキシアセトアニリドおよび当業者に既
知の他の物質のような電子移動剤が含まれる。本発明の
代表的組成物を例１に示す。
当な緩衝液（pH4〜９）中の低pI値蛋白質または炭水化
物の混合により調製される。任意の添加剤には、防腐
剤、４′−ヒドロキシアセトアニリドおよび当業者に既
知の他の物質のような電子移動剤が含まれる。本発明の
代表的組成物を例１に示す。
本発明の特異的バインディング組成物は、特異的バイン
ディング種が特異的バインディングリガンドの有無また
は量は検出するために利用できるすべてのアッセイに使
用することができる。例えば、アッセイは免疫メトリッ
クアッセイ（また、「サンドイッチ」アッセイとして既
知）、競合的バインディング、直接もしくは間接付着性
アッセイ、または当業者に既知の他のアッセイであって
よい。組成物における特異的バインディング種は、目的
のリガンドに対する受容体であるか、またはかかる受容
体である他の分子と特異的な反応性を有し得る。どちら
の場合にも、前記種は標識化または未標識化され得、好
ましくは前述のように標識化される。各アッセイは、当
該技術分野で十分な例示があり、本明細書でこれ以上の
詳細な説明は不要であろう。有用なアッセイは、溶液あ
るいは診断試験装置、分析要素、試薬ストリップまたは
他の有用な製品中で実施することができる。
ディング種が特異的バインディングリガンドの有無また
は量は検出するために利用できるすべてのアッセイに使
用することができる。例えば、アッセイは免疫メトリッ
クアッセイ（また、「サンドイッチ」アッセイとして既
知）、競合的バインディング、直接もしくは間接付着性
アッセイ、または当業者に既知の他のアッセイであって
よい。組成物における特異的バインディング種は、目的
のリガンドに対する受容体であるか、またはかかる受容
体である他の分子と特異的な反応性を有し得る。どちら
の場合にも、前記種は標識化または未標識化され得、好
ましくは前述のように標識化される。各アッセイは、当
該技術分野で十分な例示があり、本明細書でこれ以上の
詳細な説明は不要であろう。有用なアッセイは、溶液あ
るいは診断試験装置、分析要素、試薬ストリップまたは
他の有用な製品中で実施することができる。
例示の目的で、残余の本説明は、捕集および濾過手段の
ような微多孔質膜を使用する連鎖球菌性抗原のようなリ
ガンドに対するアッセイに向けられる。一般に、かかる
膜はアッセイで用いられる全ての試薬および流体を受け
取り保持し得る診断試験装置に組み込まれる。しかしな
がら、本発明はこれらの特定のアッセイまたは態様に限
定されないことを理解しなければならない。
ような微多孔質膜を使用する連鎖球菌性抗原のようなリ
ガンドに対するアッセイに向けられる。一般に、かかる
膜はアッセイで用いられる全ての試薬および流体を受け
取り保持し得る診断試験装置に組み込まれる。しかしな
がら、本発明はこれらの特定のアッセイまたは態様に限
定されないことを理解しなければならない。
各種試験装置が、米国特許第3,825,410号、同3,888,629
号、同3,970,429号および同4,446,232号明細書に記載さ
れるものを含み当該技術分野で知られている。特に有用
な装置は、ヨーロッパ特許公開第0308231号公報に記載
されている。
号、同3,970,429号および同4,446,232号明細書に記載さ
れるものを含み当該技術分野で知られている。特に有用
な装置は、ヨーロッパ特許公開第0308231号公報に記載
されている。
より具体的には、試験装置は、生物学的検体試料および
適当な試薬をそれぞれに収容することができる１以上の
試験ウェルを有する水不溶性シェルを含んでなる。
適当な試薬をそれぞれに収容することができる１以上の
試験ウェルを有する水不溶性シェルを含んでなる。
シェルは、ガラス、高分子材、セラミック、繊維材、セ
ルロース材および当該技術分野で既知の他の材料のよう
ないずれかの有用な水不溶性材料から調製することがで
きる。
ルロース材および当該技術分野で既知の他の材料のよう
ないずれかの有用な水不溶性材料から調製することがで
きる。
好ましい態様では、試験装置が、検体試験の結果ならび
に正対照、および負対照の結果を与えるように設計され
る３種類の試験ウェルを有する。各試験ウェルは、それ
らの中に取り付けられる微多孔質製品を有する。他の試
験装置は、ヨーロッパ特許公開第0280558号公報に記載
されている。有用な試験装置の他の変形物は、当業者の
日常活動の範囲内に入るであろう。
に正対照、および負対照の結果を与えるように設計され
る３種類の試験ウェルを有する。各試験ウェルは、それ
らの中に取り付けられる微多孔質製品を有する。他の試
験装置は、ヨーロッパ特許公開第0280558号公報に記載
されている。有用な試験装置の他の変形物は、当業者の
日常活動の範囲内に入るであろう。
一般的に、本発明の方法は、標的リガンドと本発明の特
異的バインディング種との間で直接的または間接的に特
異的バインディング複合体を形成するように、本発明の
特異的バインディング組成物を標的リガンドを含むこと
が予測される生物学的検体試料と接触させることにより
実施される。前記リガンドおよび種は、その種がリガン
ドに対する受容体であるときには直接複合化し得る。ま
た、前記種は、リガンドおよび相互にバインディングす
る１以上の他の特異的バインディング分子を介して前記
リガンドと二次的に複合化されてもよい。例えば、リガ
ンドが受容体と直接複合化され、次いでこの特異的バイ
ンディング種が、また受容体と反応してもよい。
異的バインディング種との間で直接的または間接的に特
異的バインディング複合体を形成するように、本発明の
特異的バインディング組成物を標的リガンドを含むこと
が予測される生物学的検体試料と接触させることにより
実施される。前記リガンドおよび種は、その種がリガン
ドに対する受容体であるときには直接複合化し得る。ま
た、前記種は、リガンドおよび相互にバインディングす
る１以上の他の特異的バインディング分子を介して前記
リガンドと二次的に複合化されてもよい。例えば、リガ
ンドが受容体と直接複合化され、次いでこの特異的バイ
ンディング種が、また受容体と反応してもよい。
前記リガンドと種との間の接触は、いずれかの適当な方
法により達成できるが、好ましくは、検体が試験装置中
で前記種と混合される。
法により達成できるが、好ましくは、検体が試験装置中
で前記種と混合される。
この接触の前後または同時に、この反応が標的リガンド
と前記種の反応を妨害しない限り、標的リガンドまたは
特異的バインディング種を他の特異的バインディング化
合物と複合化することができる。このような状態は、一
つが標識されもう一つが標識されていない２種類の受容
体分子（同一または異なる）とリガンドが複合化する免
疫メトリックアッセイを含むことができる。この標識さ
れていない受容体は、不溶化することができるか、また
はアッセイの遅い時点で不溶化することが可能である。
また、リガンドを固体支持体に直接付着し、次いで標識
化受容体と反応させるか、または標識されていない受容
体と反応させた後、その最初の受容体に対する酵素標識
化受容体と標識されていない受容体を反応させる直接的
なバインディングアッセイであってもよい。
と前記種の反応を妨害しない限り、標的リガンドまたは
特異的バインディング種を他の特異的バインディング化
合物と複合化することができる。このような状態は、一
つが標識されもう一つが標識されていない２種類の受容
体分子（同一または異なる）とリガンドが複合化する免
疫メトリックアッセイを含むことができる。この標識さ
れていない受容体は、不溶化することができるか、また
はアッセイの遅い時点で不溶化することが可能である。
また、リガンドを固体支持体に直接付着し、次いで標識
化受容体と反応させるか、または標識されていない受容
体と反応させた後、その最初の受容体に対する酵素標識
化受容体と標識されていない受容体を反応させる直接的
なバインディングアッセイであってもよい。
アッセイにおいて形成される複合体が、次に適当な手段
により検出される。例えば、複合体は、それが流体およ
び複合化されていない物質から分離される場合、検出し
得る凝集物を形成するならば視覚的に検出され得るであ
ろう。好ましいくは、前記種が適当な手段で標識化さ
れ、そして適当な装置および試薬を使用して検出可能な
シグナルが生ずる。放射性同位体性標識は、複合化合物
における１分当たりのカウントを測定することにより検
出することができる。他の標識には、色素、化学発光ま
たは別のシグナルを発生する何等かの試薬および反応が
必要となろう。
により検出される。例えば、複合体は、それが流体およ
び複合化されていない物質から分離される場合、検出し
得る凝集物を形成するならば視覚的に検出され得るであ
ろう。好ましいくは、前記種が適当な手段で標識化さ
れ、そして適当な装置および試薬を使用して検出可能な
シグナルが生ずる。放射性同位体性標識は、複合化合物
における１分当たりのカウントを測定することにより検
出することができる。他の標識には、色素、化学発光ま
たは別のシグナルを発生する何等かの試薬および反応が
必要となろう。
より好ましくは、酵素標識およびその酵素と反応して色
素を与える適当な試薬を含む色素供給性組成物を使用し
て複合体が検出される。標識の種類は、色素を供給する
ために使用される試薬を決定し得るであろうし、当業者
は適当な色素供給性組成物をいかにデザインすべきかが
容易にわかるであろう。色素は、基質と酵素の単一反応
または一連の反応を通して供給することができる。
素を与える適当な試薬を含む色素供給性組成物を使用し
て複合体が検出される。標識の種類は、色素を供給する
ために使用される試薬を決定し得るであろうし、当業者
は適当な色素供給性組成物をいかにデザインすべきかが
容易にわかるであろう。色素は、基質と酵素の単一反応
または一連の反応を通して供給することができる。
得られる色素は、視覚的に観察するか、または適当な分
光光度計を使用して測定することができる。
光光度計を使用して測定することができる。
ペルオキシダーゼが好ましい酵素標識であり、基質また
は基質形成性反応ならびに色素形成性反応体を含む多数
の適当な色素形成性組成物が知られている。基質それ自
体が、ベンジジン、テトラメチルベンジジンもしくは他
のベンジジン誘導体、2,2′−アジノ−ジ−（３−エチ
ル−ベンズチアゾロン−６−スルホン酸）、フェノール
レッド、ｏ−フェニレンルジアミン、ピロガロール、４
−アミノアンチピリン、ブロモピロガロールレッドおよ
び当該技術分野で既知の他のもののごとき色素形成性化
合物であってもよい。また、水素供与体および電子受容
体を組み合わせ検出可能な種を供給することもできる
（例えば、米国特許4,260,679号明細書参照）。
は基質形成性反応ならびに色素形成性反応体を含む多数
の適当な色素形成性組成物が知られている。基質それ自
体が、ベンジジン、テトラメチルベンジジンもしくは他
のベンジジン誘導体、2,2′−アジノ−ジ−（３−エチ
ル−ベンズチアゾロン−６−スルホン酸）、フェノール
レッド、ｏ−フェニレンルジアミン、ピロガロール、４
−アミノアンチピリン、ブロモピロガロールレッドおよ
び当該技術分野で既知の他のもののごとき色素形成性化
合物であってもよい。また、水素供与体および電子受容
体を組み合わせ検出可能な種を供給することもできる
（例えば、米国特許4,260,679号明細書参照）。
好ましくは、色素形成性組成物は、過酸化水素およびペ
ルオキシダーゼの存在下で色素を供給するロイコ染料
〔例えば、米国特許第4,089,747号明細書に記載される
ようなトリアリールイミダゾールロイコ染料または同第
4,670,385号明細書に記載されるようなトリアリールメ
タンロイコ染料〕を含む。
ルオキシダーゼの存在下で色素を供給するロイコ染料
〔例えば、米国特許第4,089,747号明細書に記載される
ようなトリアリールイミダゾールロイコ染料または同第
4,670,385号明細書に記載されるようなトリアリールメ
タンロイコ染料〕を含む。
本発明の診断試験キットは、本発明の酵素標識化特異的
バインディング組成物ならびに適当な色素供給組成物を
含む。これらのキット要素は、適当な手段でパッケージ
され、液体または固体試薬のバイアルまたはボトルを区
分して入れることができるある種のキャリヤー中に入れ
ることができる。さらに、前記方法を実施する上で有用
な次の、試験装置、抽出試薬（アッセイに先立ってリガ
ンドを抽出しなければならない場合）、洗浄液、希釈
剤、さらなる受容体分子および当業者に既知の他の試
薬、の１種類以上を含んでもよい。試薬は、乾燥状態ま
たは適当な溶液として供給することができる。キットの
非反応性構成部品には、説明書、混合容器、撹拌器およ
びピペットなを含めてもよい。
バインディング組成物ならびに適当な色素供給組成物を
含む。これらのキット要素は、適当な手段でパッケージ
され、液体または固体試薬のバイアルまたはボトルを区
分して入れることができるある種のキャリヤー中に入れ
ることができる。さらに、前記方法を実施する上で有用
な次の、試験装置、抽出試薬（アッセイに先立ってリガ
ンドを抽出しなければならない場合）、洗浄液、希釈
剤、さらなる受容体分子および当業者に既知の他の試
薬、の１種類以上を含んでもよい。試薬は、乾燥状態ま
たは適当な溶液として供給することができる。キットの
非反応性構成部品には、説明書、混合容器、撹拌器およ
びピペットなを含めてもよい。
以下の例は、本発明の実施例の代表的なものであるが、
本発明を限定することを意図するものでない。
本発明を限定することを意図するものでない。
ロイコ染料は、２−（４−ヒドロキシ−3,5−ジメトキ
シフェニル）−4,5−ビス（４−メトキシフェニル）イ
ミダゾールを用いて次のように調製した； 固体ロイコ染料（0.1％の溶液を調製する目的で）を、
リン酸ナトリウム緩衝液（５ミリモル濃度）中20％のポ
リ（ビニルピロリドン）溶液中に溶解した。次に、この
溶液を過酸化水素（10ミリモル濃度）、４′−ヒドロキ
シアセトアニリド電子移動剤（0.7ミリモル濃度）およ
びジエチレンジアミンペンタ酢酸キレート剤（10マイク
ロモル濃度）を含むリン酸ナトリウム緩衝液に加え、最
終濃度１％のポリ（ビニルピロリドン）および0.005％
のロイコ染料とした。
シフェニル）−4,5−ビス（４−メトキシフェニル）イ
ミダゾールを用いて次のように調製した； 固体ロイコ染料（0.1％の溶液を調製する目的で）を、
リン酸ナトリウム緩衝液（５ミリモル濃度）中20％のポ
リ（ビニルピロリドン）溶液中に溶解した。次に、この
溶液を過酸化水素（10ミリモル濃度）、４′−ヒドロキ
シアセトアニリド電子移動剤（0.7ミリモル濃度）およ
びジエチレンジアミンペンタ酢酸キレート剤（10マイク
ロモル濃度）を含むリン酸ナトリウム緩衝液に加え、最
終濃度１％のポリ（ビニルピロリドン）および0.005％
のロイコ染料とした。
スクシニル化カゼインは、カゼインと等重量のコハク酸
無水物を25℃で４時間反応させ、次いで生成物を透析で
精製することにより調製した。
無水物を25℃で４時間反応させ、次いで生成物を透析で
精製することにより調製した。
ロプロディン（LoProdyne ）ナイロン製微多孔質膜
は、Pall Corpから入手し、使い捨て用試験装置の試験
ウェル中に取り付け、次いでFluoradFC135界面活性剤
（0.05g/m2）で前処理した。
は、Pall Corpから入手し、使い捨て用試験装置の試験
ウェル中に取り付け、次いでFluoradFC135界面活性剤
（0.05g/m2）で前処理した。
例1:特異的バインディング組成物 本例は、本発明により調製される好ましい特異的バイン
ディング組成物を例示する。この組成物は、市販先より
入手した免疫精製ラビットポリクロナル抗体およびYosh
itakeら、Eur.J.Biochem.101,395（1979）に記載される
方法によってMilesLaboratoriesから入手したワサビペ
ルオキシダーゼを使用して調製した抗−ストレプトコッ
カスＡ−ペルオキシダーゼ標識化接合体を含む。この接
合体をスクシニル化カゼイン（p14.5、0.5〜1.5重量
％）、0.1モル濃度の４−モルホリノプロパンスルホン
酸緩衝液（pH7.5）、10ミリモル濃度の４′−ヒドロキ
シアセトアニリドおよび0.01重量％の防腐剤と混合し
た。
ディング組成物を例示する。この組成物は、市販先より
入手した免疫精製ラビットポリクロナル抗体およびYosh
itakeら、Eur.J.Biochem.101,395（1979）に記載される
方法によってMilesLaboratoriesから入手したワサビペ
ルオキシダーゼを使用して調製した抗−ストレプトコッ
カスＡ−ペルオキシダーゼ標識化接合体を含む。この接
合体をスクシニル化カゼイン（p14.5、0.5〜1.5重量
％）、0.1モル濃度の４−モルホリノプロパンスルホン
酸緩衝液（pH7.5）、10ミリモル濃度の４′−ヒドロキ
シアセトアニリドおよび0.01重量％の防腐剤と混合し
た。
例2:ストレプトコッカスＡ抗原についてのアッセイ 本例は、生物学的検体中のストレプトコッカスＡ抗原を
検出するための本発明の方法における例１の組成物の使
用を例示する。
検出するための本発明の方法における例１の組成物の使
用を例示する。
ストレプトコッカスＡ抗原は、培養微生物を添加する前
に酸性共試薬に水性亜硝酸ナトリウムを混合する標準的
な亜硝酸抽出法を使用してグループＡストレップ（stre
p）培養物から得た。次に、抽出流体に過剰の緩衝液を
添加することにより中和した。グループＡの炭水化物抗
原は、酸性エタノールおよびアセトンを使用し、上澄を
廃棄しそして0.85％生理食塩水中にペレットを再懸濁し
て得られた。ラムノースの濃度は、DischeおよびShattl
es,J.Biol.Chem. 175595〜603（1948）の方法により測定
された。この濃厚物を、クエン酸（10μｌ、1.2モル濃
度）、亜硝酸ナトリウム（120μｌ、８モル濃度）およ
び４−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液（120μ
ｌ、１モル濃度、pH7.5）を含む中和抽出液中に再懸濁
した。
に酸性共試薬に水性亜硝酸ナトリウムを混合する標準的
な亜硝酸抽出法を使用してグループＡストレップ（stre
p）培養物から得た。次に、抽出流体に過剰の緩衝液を
添加することにより中和した。グループＡの炭水化物抗
原は、酸性エタノールおよびアセトンを使用し、上澄を
廃棄しそして0.85％生理食塩水中にペレットを再懸濁し
て得られた。ラムノースの濃度は、DischeおよびShattl
es,J.Biol.Chem. 175595〜603（1948）の方法により測定
された。この濃厚物を、クエン酸（10μｌ、1.2モル濃
度）、亜硝酸ナトリウム（120μｌ、８モル濃度）およ
び４−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液（120μ
ｌ、１モル濃度、pH7.5）を含む中和抽出液中に再懸濁
した。
前述したような微多孔質膜を、２つの使い捨て試験装置
の各３つの試験ウェル中に取付けた。コポリ〔スチレン
/mおよびｐ−（２−クロロエチルスホニルメチル）−ス
チレン〕ビーズ〔グリシン緩衝液〔0.1モル濃度、pH8.
5）中５重量％のポリ（アクリルアミド）および0.0005
重量％の蛍光増白剤を含む固体１％の懸濁液２μｌ）か
ら成る特異的バインディング試薬分散体を、検体試験ウ
ェルとして扱われる試験ウェルにおける膜の中心部に添
加した。そのビーズに、ストレプトコッカスＡ抗原に対
するラビッドポリクロナル抗体を共有結合させた。
の各３つの試験ウェル中に取付けた。コポリ〔スチレン
/mおよびｐ−（２−クロロエチルスホニルメチル）−ス
チレン〕ビーズ〔グリシン緩衝液〔0.1モル濃度、pH8.
5）中５重量％のポリ（アクリルアミド）および0.0005
重量％の蛍光増白剤を含む固体１％の懸濁液２μｌ）か
ら成る特異的バインディング試薬分散体を、検体試験ウ
ェルとして扱われる試験ウェルにおける膜の中心部に添
加した。そのビーズに、ストレプトコッカスＡ抗原に対
するラビッドポリクロナル抗体を共有結合させた。
第二の試験ウェル（負対照ウェルとされる）は、ポリ
（アクリルアミド）（グリシン緩衝液中５重量％）と蛍
光増白剤を混合したラビットガンマーグロブリン（１重
量％）を付着した同一のポリマービーズの乾燥分散体
（２μｌ）を含ませた。この分散体を膜の中心部に適用
した。
（アクリルアミド）（グリシン緩衝液中５重量％）と蛍
光増白剤を混合したラビットガンマーグロブリン（１重
量％）を付着した同一のポリマービーズの乾燥分散体
（２μｌ）を含ませた。この分散体を膜の中心部に適用
した。
第三の試験ウェル（正対照ウェルとされる）は、ポリ
（アクリルアミド）（グリシン緩衝液中５重量％）中の
前記乾式分散試薬（２μｌ）、蛍光増白剤およびストレ
プトコッカスＡ抗原20μg/mlを含ませた。この分散体を
膜の中心部に適用した。
（アクリルアミド）（グリシン緩衝液中５重量％）中の
前記乾式分散試薬（２μｌ）、蛍光増白剤およびストレ
プトコッカスＡ抗原20μg/mlを含ませた。この分散体を
膜の中心部に適用した。
抗原抽出液200mlを、検体試験ウェルだけに添加して貫
流した。
流した。
例１に記載したペルオキシダーゼ標識接合体を含有する
溶液（40μｌ）をすべてのウェルに添加して貫流した。
次に、この使い捨て装置を室温で１〜２分間インキュベ
ーションした。
溶液（40μｌ）をすべてのウェルに添加して貫流した。
次に、この使い捨て装置を室温で１〜２分間インキュベ
ーションした。
すべてのウェルにリン酸ナトリウム緩衝液（0.1モル濃
度、pH7.2）中デシル硫酸ナトリウム（70ミリモル濃
度）含む洗浄液適用して一杯にし、貫流した。
度、pH7.2）中デシル硫酸ナトリウム（70ミリモル濃
度）含む洗浄液適用して一杯にし、貫流した。
前述のロイコ染料（120ml）をすべてのウェルに添加
し、室温で２分インキュベーション後試験ウェル中に得
られる色素を測定した。抽出抗原が適用された検出ウェ
ルは、そのウェルの中心部い色素のないその周囲と明瞭
に区別できる赤色を示した。負対照ウェルは全く着色を
示さないにもかかわらず正対照ウェルは赤色を示した。
このことは、本アッセイにより抗原の検出に成功したこ
とを示す。
し、室温で２分インキュベーション後試験ウェル中に得
られる色素を測定した。抽出抗原が適用された検出ウェ
ルは、そのウェルの中心部い色素のないその周囲と明瞭
に区別できる赤色を示した。負対照ウェルは全く着色を
示さないにもかかわらず正対照ウェルは赤色を示した。
このことは、本アッセイにより抗原の検出に成功したこ
とを示す。
例3:標識化抗体を伴う各種蛋白質を使用する比較例 ストレプトコッカスＡ抗原は、例２に記載されるように
得た。
得た。
前述したように膜を含む使い捨て装置を、本アッセイで
使用した。試験ウェルの中心部にポリオール（アクリル
アミド）（0.1モル濃度のグリシン緩衝液中５重量％、p
H8.5）と混合した例２で使用するようなポリマービーズ
の懸濁液（２μｌ、１％の固形分）を添加した。続い
て、抽出抗原試料（200μｌ、2.9ng/ml）を試験ウェル
に添加した。
使用した。試験ウェルの中心部にポリオール（アクリル
アミド）（0.1モル濃度のグリシン緩衝液中５重量％、p
H8.5）と混合した例２で使用するようなポリマービーズ
の懸濁液（２μｌ、１％の固形分）を添加した。続い
て、抽出抗原試料（200μｌ、2.9ng/ml）を試験ウェル
に添加した。
この試料により４種の特異的バインディング種を試験し
た。
た。
（１）４−モルホリノプロパンスルホン酸（0.1モル濃
度）、４′−ヒドロキシアセトアニリド（10ミリモル濃
度）および0.1重量％のチメロサール防腐剤中、抗−ス
トレプトコッカスＡ抗体（９μg/ml）、0.5重量％スク
シニル化カゼイン（p14.5）。
度）、４′−ヒドロキシアセトアニリド（10ミリモル濃
度）および0.1重量％のチメロサール防腐剤中、抗−ス
トレプトコッカスＡ抗体（９μg/ml）、0.5重量％スク
シニル化カゼイン（p14.5）。
（２）スクシニル化カゼインに代えカゼイン（pI値は５
を越える）を使用する以外は組成物（１）に同じ。
を越える）を使用する以外は組成物（１）に同じ。
（３）スクシニル化カゼインに代えウシ血清アルブミン
（pI値は５を越える）を使用する以外は組成物（１）に
同じ。
（pI値は５を越える）を使用する以外は組成物（１）に
同じ。
（４）スクシニル化カゼインを含まない以外は組成物
（１）に同じ。
（１）に同じ。
各組成物（40μｌ）を、前記試験装置の試験ウェルに添
加し、室温で２分間インキュベーションした。次に、膜
をリン酸ナトリウム緩衝液（0.1モル濃度、pH7.2）中に
デシル硫酸ナトリウム（1.8重量％）を含む洗浄組成物
で洗浄した。
加し、室温で２分間インキュベーションした。次に、膜
をリン酸ナトリウム緩衝液（0.1モル濃度、pH7.2）中に
デシル硫酸ナトリウム（1.8重量％）を含む洗浄組成物
で洗浄した。
例２に記載したロイコ染料組成物（40μｌ）を添加し、
その使い捨て装置を室温で２分間インキュベーション
し、次いで分光光度計を使用して反射濃度を測定した。
反射濃度を透過濃度（Dr）に換算した結果を次の表に示
す。
その使い捨て装置を室温で２分間インキュベーション
し、次いで分光光度計を使用して反射濃度を測定した。
反射濃度を透過濃度（Dr）に換算した結果を次の表に示
す。
データは、スクシニル化カゼインを含む組成物（１）の
みが、最も低いバックグランドを伴う高感度（最高の染
料シグナル）を与えることを示す。
みが、最も低いバックグランドを伴う高感度（最高の染
料シグナル）を与えることを示す。
低pI値の蛋白質を塗布した膜を使用するアッセイとの比
較 試験アッセイは、アッセイに使用される膜が低pI値の蛋
白質で前処理されているヨーロッパ特許公開第0280560
号公報（前述）の説明に沿って、ストレプトコッカスＡ
抗原の検出についての例２と同様に実施した。
較 試験アッセイは、アッセイに使用される膜が低pI値の蛋
白質で前処理されているヨーロッパ特許公開第0280560
号公報（前述）の説明に沿って、ストレプトコッカスＡ
抗原の検出についての例２と同様に実施した。
膜は、Pall Corpからイムノジン（Immunodyne ）ナイ
ロン微多孔質膜として市販されている。それをスクシニ
ル化カゼインで塗布した。
ロン微多孔質膜として市販されている。それをスクシニ
ル化カゼインで塗布した。
アッセイの結果は、ＤT0.101を示したが、バックグラン
ドも同様に高かった（ＤT0.037）。このことは、低pI値
の蛋白質または炭水化物を膜上に設置することが、それ
を標識化特異的バインディング種組成物に添加するほど
好ましくはないことを示す。
ドも同様に高かった（ＤT0.037）。このことは、低pI値
の蛋白質または炭水化物を膜上に設置することが、それ
を標識化特異的バインディング種組成物に添加するほど
好ましくはないことを示す。
本発明は、特異的バインディング種（例えば、標識化抗
体）を使用して高感度を有する診断試験を可能にする組
成物を提供する。アッセイの改良された感度は、特異的
バインディング種を５を越えるpI値のものは実質的に全
く有さない１以上の水溶性蛋白質または炭水化物と混合
して使用することにより達成される。特に、これらの蛋
白質および炭水化物は、高いpI値を有する類似の蛋白質
および炭水化物（例えば、カゼインまたはウシ血清アル
ブミン）の使用に比べると、感度に悪影響を受けること
なくアッセイのバックグランドを効果的に低下する。特
異的バインディング種と前記蛋白質または炭水化物を混
合することは、アッセイで使用する膜または他の固体表
面上にそれを塗布するものに比べて、それら自体、固体
表面または目的のものでない他の蛋白質もしくは炭水化
物とその種との非特異的相互作用が減少する。
体）を使用して高感度を有する診断試験を可能にする組
成物を提供する。アッセイの改良された感度は、特異的
バインディング種を５を越えるpI値のものは実質的に全
く有さない１以上の水溶性蛋白質または炭水化物と混合
して使用することにより達成される。特に、これらの蛋
白質および炭水化物は、高いpI値を有する類似の蛋白質
および炭水化物（例えば、カゼインまたはウシ血清アル
ブミン）の使用に比べると、感度に悪影響を受けること
なくアッセイのバックグランドを効果的に低下する。特
異的バインディング種と前記蛋白質または炭水化物を混
合することは、アッセイで使用する膜または他の固体表
面上にそれを塗布するものに比べて、それら自体、固体
表面または目的のものでない他の蛋白質もしくは炭水化
物とその種との非特異的相互作用が減少する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−43987（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ, 111（２），Ｐ．157−166，（1988) Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ, 103（１），Ｐ．１−８，（1987) Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ．, 38（１−２），Ｐ．195−204，（1985) 福岡医誌，72（６），Ｐ．350−367, （1981)
Claims (3)
- 【請求項１】Ａ）特異的バインディング種と、Ｂ）１種
類もしくはそれ以上の、５を越えるpI値を実質的に全く
有さない水溶性蛋白質および／または炭水化物との水性
混合物であることを特徴とする特異的バインディング組
成物。 - 【請求項２】Ａ）リガンドまたはリガンドに対する受容
体との反応性を有している特異的バインディング種と、
Ｂ）１種類もしくはそれ以上の、５を越えるpI値を実質
的に全く有さない水溶性蛋白質および／または炭水化物
との水性混合物である特異的バインディング組成物を含
んでなることを特徴とする標的リガンド検出のための診
断試験キット。 - 【請求項３】生物学的検体試料中の標準リガンドを検出
する方法であって、下記の工程： A.A）リガンドまたはその受容体に対する特異的バイン
ディング種と、Ｂ）１種類もしくはそれ以上の、５を越
えるpI値を実質的に全く有さない水溶性蛋白質および／
または炭水化物との水性混合物である特異的バインディ
ング組成物を、標的リガンドを含むことが予測される生
物学的検体試料と接触させ、前記リガンドと前記種との
間に特異的バインディング複合体を形成する工程、そし
て B.前記検体試料中でリガンドの存在を示すものとしての
前記複合体の存在を検出する工程、 を含んでなることを特徴とする生物学的検体試料中の標
的リガンドの検出方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/206,257 US5051356A (en) | 1988-06-13 | 1988-06-13 | Specific binding composition comprising a low pI protein or carbohydrate and a diagnostic test kit and method of use |
| US206257 | 1988-06-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0232259A JPH0232259A (ja) | 1990-02-02 |
| JPH0731199B2 true JPH0731199B2 (ja) | 1995-04-10 |
Family
ID=22765606
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1146910A Expired - Lifetime JPH0731199B2 (ja) | 1988-06-13 | 1989-06-12 | 低 ｐＩ蛋白質または炭水化物を含んでなる特異的バインディング組成物ならびに診断試験キットおよび使用方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5051356A (ja) |
| EP (1) | EP0347138B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0731199B2 (ja) |
| DE (1) | DE68918166T2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6060237A (en) | 1985-02-26 | 2000-05-09 | Biostar, Inc. | Devices and methods for optical detection of nucleic acid hybridization |
| US5482830A (en) * | 1986-02-25 | 1996-01-09 | Biostar, Inc. | Devices and methods for detection of an analyte based upon light interference |
| US5468606A (en) * | 1989-09-18 | 1995-11-21 | Biostar, Inc. | Devices for detection of an analyte based upon light interference |
| US5866322A (en) * | 1988-01-29 | 1999-02-02 | Abbott Laboratories | Method for performing Rubella assay |
| US5459078A (en) * | 1988-01-29 | 1995-10-17 | Abbott Laboratories | Methods and reagents for performing ion-capture digoxin assays |
| US5459080A (en) * | 1988-01-29 | 1995-10-17 | Abbott Laboratories | Ion-capture assays using a specific binding member conjugated to carboxymethylamylose |
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| US5639671A (en) * | 1989-09-18 | 1997-06-17 | Biostar, Inc. | Methods for optimizing of an optical assay device |
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| US5550063A (en) * | 1991-02-11 | 1996-08-27 | Biostar, Inc. | Methods for production of an optical assay device |
| EP0586590B1 (en) * | 1991-05-30 | 1999-07-07 | Abbott Laboratories | Reagents containing a nonspecific binding blocker in ion-capture binding assays |
| JPH06508211A (ja) * | 1991-05-30 | 1994-09-14 | アボツト・ラボラトリーズ | ２ステップイオン捕獲結合アッセイを実施するための試薬及び方法 |
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| DE69127628T2 (de) * | 1991-10-01 | 1998-01-22 | Biostar Inc | Hochempfindlicher optischer Immunoassay durch Gebrauch von Enzymmarkierten Reagenz |
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| DE4343479A1 (de) * | 1993-12-21 | 1995-06-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Acylierte Proteinaggregate und deren Verwendung zur Entstörung von Immunoassays |
| DE4343480A1 (de) * | 1993-12-21 | 1995-07-06 | Boehringer Mannheim Gmbh | Acylierte Proteinaggregate und deren Verwendung zur Signalsteigerung in einem Immunoassay zum Nachweis von Antikörpern |
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| US6991907B1 (en) | 1995-04-18 | 2006-01-31 | Biosite, Inc. | Methods for the assay of troponin I and T and complexes of troponin I and T and selection of antibodies for use in immunoassays |
| US5795725A (en) * | 1995-04-18 | 1998-08-18 | Biosite Diagnostics Incorporated | Methods for the assay of troponin I and T and selection of antibodies for use in immunoassays |
| DE19637718A1 (de) | 1996-04-01 | 1997-10-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | Rekombinante inaktive Core-Streptavidin Mutanten |
| US6156521A (en) * | 1997-12-19 | 2000-12-05 | Biosite Diagnostics, Inc. | Methods for the recovery and measurement of troponin complexes |
| ES2185104T3 (es) * | 1997-12-11 | 2003-04-16 | Roche Diagnostics Gmbh | Eliminacionde las interferencias en procedimientos de diagnostico mediante peptidos de d-aminoacidos. |
| JP5647599B2 (ja) | 2009-03-02 | 2015-01-07 | 日本たばこ産業株式会社 | 生物学的試料中の物質を検出する方法 |
| JPWO2019130560A1 (ja) * | 2017-12-28 | 2020-12-17 | 株式会社ニチレイバイオサイエンス | ブロッキング試薬 |
| WO2022239457A1 (ja) | 2021-05-10 | 2022-11-17 | ソニーグループ株式会社 | 情報処理装置、情報処理方法及びプログラム |
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|---|---|---|---|---|
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| JPS6143987A (ja) * | 1984-08-07 | 1986-03-03 | Suntory Ltd | ペルオキシダ−ゼ及びその製造法 |
| US4670381A (en) * | 1985-07-19 | 1987-06-02 | Eastman Kodak Company | Heterogeneous immunoassay utilizing horizontal separation in an analytical element |
| US4818686A (en) * | 1986-09-15 | 1989-04-04 | Coulter Corporation | Chemical blocking agent against non-specific binding or staining of an antibody specific for terminal deoxynucleotidyl transferase in biological specimens during immunoassay |
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| US4828980A (en) * | 1987-09-18 | 1989-05-09 | Eastman Kodak Company | Membrane structure coated with low pI protein or carbohydrate and methods of making and use |
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1988
- 1988-06-13 US US07/206,257 patent/US5051356A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-06-12 EP EP89305894A patent/EP0347138B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-12 DE DE68918166T patent/DE68918166T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-06-12 JP JP1146910A patent/JPH0731199B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ．，３８（１−２），Ｐ．１９５−２０４，（１９８５） |
| Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０３（１），Ｐ．１−８，（１９８７） |
| Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１１（２），Ｐ．１５７−１６６，（１９８８） |
| 福岡医誌，７２（６），Ｐ．３５０−３６７，（１９８１） |
Also Published As
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|---|---|
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| EP0347138A3 (en) | 1990-09-05 |
| JPH0232259A (ja) | 1990-02-02 |
| EP0347138B1 (en) | 1994-09-14 |
| DE68918166D1 (de) | 1994-10-20 |
| EP0347138A2 (en) | 1989-12-20 |
| DE68918166T2 (de) | 1995-05-04 |
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