JP3337575B2 - 抗ストレプトリジンｏ抗体の決定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ａ群溶血性連鎖球菌感
染症の診断のための被検液中の抗ストレプトリジンＯ抗
体の決定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】抗ストレプトリジンＯ抗体は、例えばラ
ンスフィールド（Lancefield) の血清学的分類（Lancef
ield, R. C. 、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，第５７巻、第５
７１〜５９５頁、１９３３年）によるＡ群溶血性連鎖球
菌（group A hemolytic streptococci) の産生する毒素
の一つであるストレプトリジンＯ、一般に還元条件、例
えばメルカプトエタノールの存在下赤血球の溶血を生じ
せしめる分子量５０，０００〜７０，０００の範囲に含
まれるタンパク質として知られているもの、に対する抗
体であり、Ａ群溶血性連鎖球菌に感染した患者の血清で
は抗ストレプトリジンＯ抗体価が上昇することが知られ
ている。

【０００３】Ａ群溶血性連鎖球菌は、扁桃炎、咽頭炎、
皮膚化膿症、猩紅熱や続発症としてリウマチ熱、糸球体
腎炎をはじめとする多くの疾患群を惹起する病原菌であ
る。これらの疾患の多くは特異的臨床所見に欠けるた
め、Ａ群溶血性連鎖球菌感染症の診断のために抗ストレ
プトリジンＯ抗体の確認およびその抗体価の測定が広く
用いられている（長田富香、臨床検査、第２３巻、臨時
増刊、１１７２頁〜１１７５頁、１９７９年）。

【０００４】抗ストレプトリジンＯ抗体価を測定する方
法としては、ウサギ赤血球、ヒツジ赤血球またはヒトＯ
型赤血球を用いるランツ・ランダール法（Rantz, L. A.
ら、Proc. Soc. Exp. Biol. Med.、第５９巻、２２頁〜
２５頁、１９４５年）およびその変法であるマイクロタ
イター法（Edwards, E. A.、J. Bacteriol. 、第８７
巻、１２５４頁〜１２５５頁、１９６４年）が従来から
日常検査に広く用いられてきた。これらの測定法はいず
れもストレプトリジンＯが有する溶血活性を被検液中の
抗ストレプトリジンＯ抗体が中和することを原理とする
測定法である。

【０００５】生体に感染したＡ群溶血性連鎖球菌はスト
レプトリジンＯを含む多様な抗原、例えば、発赤毒素、
ストレプトキナーゼ、ストレプトドルナーゼ、ヒアルロ
ン酸分解酵素、リボ核酸分解酵素、ノイラミン酸分解酵
素等を産生しており、これに対応して血中に出現する抗
体も多様である（レンサ球菌感染症〔中〕−その基礎と
臨床−、塩川優一・吉岡守正・浜田茂幸編集、３１７頁
〜３５９頁、廣川書店（株）、１９９２年６月２５日発
行）が、ストレプトリジンＯに特徴的な生物活性である
溶血活性を利用したこれらの測定法では、測定用試薬と
して必ずしも精製されたストレプトリジンＯを用いる必
要はなく、多数の抗原物質の中でストレプトリジンＯに
対する抗体すなわち抗ストレプトリジンＯ抗体のみを特
異的に測定できる（藤本秀江ら、臨床病理、第４０巻、
２１頁〜２７頁、１９９２年）。

【０００６】しかしながら、これらの測定法では必然的
に新鮮な赤血球を必要とするため、用いる赤血球の安定
性、ロット差等により測定値のバラツキが生じやすく、
また、操作法も煩雑であり、自動化は極めて困難であっ
た（特開平６−１８６２３３号公報）。

【０００７】近年、ストレプトリジンＯを固相化させた
ラテックス粒子等の担体を用いた免疫凝集反応を原理と
する被検液の抗ストレプトリジンＯ抗体価の測定法が用
いられるようになり（三浦利彦ら、衛生検査、第３６
巻、３６頁〜４０頁、１９８７年）、前述のストレプト
リジンＯの溶血活性を利用した測定法に比し、不安定な
赤血球を必要としない点や自動化分析が可能になった点
等が改善された。

【０００８】しかし、一方では、固相化させるストレプ
トリジンＯがＡ群溶血性連鎖球菌の培養液から調製さ
れ、ストレプトリジンＯの精製の困難さから高純度のス
トレプトリジンＯを得ることが極めて難かしく、通常、
ストレプトリジンＯとともにＡ群溶血性連鎖球菌の産生
する多様な抗原物質が同時に担体上に固相化される問題
がある。従ってまた、測定される抗体価は、ストレプト
リジンＯの他に固相化されたすべての抗原物質に対する
被検液中の抗体を総合的に測定したものであり、ストレ
プトリジンＯの溶血活性を利用した測定法に比し、抗ス
トレプトリジンＯ抗体に対する反応特異性という点で問
題があった（藤本秀江ら、臨床病理、第４０巻、２１頁
〜２７頁、１９９２年）。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】これらの抗ストレプト
リジンＯ抗体価測定法が抱える問題点を解決すべく、ス
トレプトリジンＯを含有する溶液からストレプトリジン
Ｏを特異的に担体上に固相化せしめ、これを用いること
によって抗ストレプトリジンＯ抗体を反応特異的かつ簡
便に決定でき、また、用手法に限らず自動化分析にも対
応できる決定方法を提供することである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、下記一般式（１）

【００１１】

【化２】 （ただし式中、Ｒ１は置換されたあるいは非置換の、不
飽和のあるいは飽和された、コレステロール側鎖基また
はコール酸側鎖基、Ｒ２は水素原子または水酸基、破線
部位は飽和または二重結合部位を示す。）で表されるス
テロイド化合物を物理的もしくは化学的に固定化させた
担体とＡ群溶血性連鎖球菌由来のストレプトリジンＯ含
有溶液とを反応させ、これによって、ストレプトリジン
Ｏ含有溶液中のストレプトリジンＯのみを特異的に担体
上に固相化せしめることができ、かつ、このようにして
得られたストレプトリジンＯ固相化担体が抗ストレプト
リジンＯ抗体との反応性を保持していること、およびこ
の性質を利用すれば被検液中の抗ストレプトリジンＯ抗
体を決定することができることを見出し、本発明を完成
するに至った。

【００１２】本発明は、上記の知見に基づいて完成され
たもので、被検液中の抗ストレプトリジンＯ抗体の免疫
学的決定において、下記一般式（１）

【００１３】

【化３】 （ただし式中、Ｒ１は置換されたあるいは非置換の、不
飽和のあるいは飽和された、コレステロール側鎖基また
はコール酸側鎖基、Ｒ２は水素原子または水酸基、破線
部位は飽和または二重結合部位を示す。）で表されるス
テロイド化合物の一種以上を固定化させた担体とストレ
プトリジンＯ含有溶液との接触によって形成したストレ
プトリジンＯ固相化担体を使用することを特徴とする抗
ストレプトリジンＯ抗体の決定方法である。

【００１４】本発明に係わるステロイド化合物として
は、上記一般式（１）で表されるもので、その式中、Ｒ
１は置換されたあるいは非置換の、不飽和のあるいは飽
和された、コレステロール側鎖基またはコール酸側鎖基
を示し、Ｒ２は水素原子または水酸基を示し、破線部位
は飽和または二重結合部位である。また、基Ｒ１の具体
的説明としては、例えば、水酸基、低級アルキル基また
は低級アシル基で置換あるいは非置換の、１または２個
の二重結合をもつ不飽和のあるいは飽和された、コレス
テロール側鎖基またはコール酸側鎖基である。また、コ
レステロール側鎖基としては、下記一般式（２）

【００１５】

【化４】 （ただし式中、Ｒ３は水素原子、水酸基、低級アルキル
基または低級アシル基を示し、Ｒ４は水素原子、水酸
基、低級アルキル基または低級アシル基を示し、Ｒ５は
水素原子、水酸基、低級アルキル基または低級アシル基
を示し、破線部位は飽和または二重結合部位を示す。）
または、下記一般式（３）

【００１６】

【化５】 （ただし式中、破線部位は飽和または二重結合部位を示
す。）で表されるコレステロール側鎖基が挙げられ、好
ましくは、上記一般式（２）において、Ｒ３およびＲ４
が水素原子であり、Ｒ５が水素原子、水酸基、メチル基
もしくはエチル基であることを特徴とするコレステロー
ル側鎖基が挙げられ、具体的には、例えば、コレステロ
ール側鎖基、β−シトステロール側鎖基、スチグマステ
ロール側鎖基、カンペステロール側鎖基、エルゴステロ
ール側鎖基、セレブロステロール側鎖基、デスモステロ
ール側鎖基等が挙げられる。

【００１７】上記一般式（１）で表されるステロイド化
合物の具体的化合物としては、例えば、コレステロール
(cholesterol)、７−デヒドロコレステロール ( 7-deh
ydrocholesterol)、コレスタノール（cholestanol)、コ
プロスタノール（coprostanol)、Δ⁷ −コレステノール
（Δ⁷ -cholestenol) 、Δ⁷ −コプロステノール（Δ ⁷
-coprostenol）、β−シトステロール（β-sitostero
l)、７−デヒドロ−β−シトステロール（７-dehydro-
β-sitosterol)、スチグマステロール（stigmastero
l）、７−デヒドロスチグマステロール（7-dehydrostig
masterol)、カンペステロール（campesterol)、７−デ
ヒドロカンペステロール（７-dehydrocampesterol)、ス
チグマスタノール（stigmastanol）、Δ⁷ −スチグマス
テノール（Δ⁷-stigmastenol)、１１α−ヒドロキシコ
レステロール（１１α-hydroxycholesterol)、Δ²²−ス
チグマステノール（Δ²²-stigmastenol)、α−スピナス
テロール（α-spinasterol）、カンペスタノール（camp
estanol)、Δ⁷ −カンペステノール（Δ⁷ -campesteno
l）、２０α−ヒドロキシコレステロール（２０α-hydr
oxycholesterol)、ブラシカステロール（brassicastero
l）、エルゴステロール（ergosterol）、セレブロステ
ロール（cerebrosterol)、７−デヒドロセレブロステロ
ール（７-dehydrocerebrosterol)、セレブロスタノール
（cerebrostanol)、Δ ⁷ −セレブロステノール（Δ⁷ -c
erebrostenol）、デスモステロール（desmosterol)、７
−デヒドロデスモステロール（７-dehydrodesmostero
l)、３β−ヒドロキシコラン酸（３β-hydroxycholanic
acid)または３β−ヒドロキシ−Δ⁵ −コレン酸（３β
-hydroxy−Δ⁵ -cholenic acid）等が挙げられる。

【００１８】好ましくは、コレステロール、７−デヒド
ロコレステロール、コレスタノール、コプロスタノー
ル、Δ⁷ −コレステノール、Δ⁷ −コプロステノール、
β−シトステロール、７−デヒドロ−β−シトステロー
ル、スチグマステロール、７−デヒドロスチグマステロ
ール、カンペステロールまたは７−デヒドロカンペステ
ロール等が挙げられる。

【００１９】より好ましくは、コレステロール、７−デ
ヒドロコレステロール、コレスタノール、コプロスタノ
ール、Δ⁷ −コレステノールまたはΔ⁷ −コプロステノ
ール等が挙げられる。これらのステロイド化合物におい
て、１種または２種以上を含有するものが挙げられる。

【００２０】本発明における一般式（１）で表されるス
テロイド化合物（以下、単に本ステロイド化合物とい
う）は、好ましくは当業者によく知られた方法で担体上
に固定化することができ、これは、好適には担体表面上
に本ステロイド化合物を物理的に吸着させることによっ
て、あるいは、本ステロイド化合物の反応性誘導体をこ
れと反応可能な官能基を有する表面または活性化された
表面へ化学的に結合させることによって行われる。

【００２１】本発明の実施において、本ステロイド化合
物を固定化させた担体の有利な態様としては、本ステロ
イド化合物が担体単位面積（ｃｍ² ）あたりに通常２５
０ｎｍｏｌ〜０．０２５ｎｍｏｌ、好ましくは、２５ｎ
ｍｏｌ〜０．２５ｎｍｏｌの範囲で結合している担体を
挙げることができる。

【００２２】本発明に係わる担体としては、本発明を実
施可能なものであれば、その材質、形状および大きさ等
については何ら制限されなく、例えば、ポリスチレン、
ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリロニトリルブタ
ジエンスチレン共重合体、ブタジエンスチレン共重合
体、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニ
リデン、ポリアミド、ポリメチルメタアクリレート、ポ
リメチルペンテン、ポリアセタール、ポリビニルアセテ
ート、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラール、
ポリイソブチレン、塩化ビニル酢酸ビニル共重合体、フ
ッ素樹脂（ポリテトラフルオロエチレン、テトラフルオ
ロエチレンエチレン共重合体、パーフルオロアルコキシ
共重合体等）、ポリアクリロニトリル、ポリスチレンア
クリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレ
ンテレフタレート、ポリウレタン、ユリア樹脂、エポキ
シ樹脂、メラミン樹脂、フェノール樹脂、不飽和ポリエ
ステル樹脂、シリコン、ニトロセルロース、セルロース
アセテート、セルロースアセテートブチレート、セルロ
ースアセテートプロピオネート、セルロースプロピオネ
ート、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース
またはポリビニリデンジフルオリド等の成形されたポリ
マー、また、ポリマーにカルボキシル基、ニトリル基、
一級アミノ基または二級アミノ基等の官応基をもたせる
ことを目的として、上記のポリマー合成時にこれらの官
能基を有する物質がさらに共重合されてなる成形された
ポリマー、あるいは、上記のポリマー形成後に表面処理
によってこれらの官応基が導入されてなる成形されたポ
リマー、また、成形されたガラスまたは金属等が使用で
きる。

【００２３】また、本発明において、当業者によく知ら
れた免疫学的決定法において通常使用される材質、形状
および大きさ等を有する、例えば、ラテックス粒子、ビ
ーズ、ボール、マイクロタイタープレート、テストチュ
ーブまたはメンブレン等を担体として使用すると特に有
利である。

【００２４】本発明におけるステロイド化合物を担体に
物理的に吸着させることによって本ステロイド化合物を
担体に固定化する具体的方法の例としては、例えば、ラ
テックス粒子を担体とする場合には、本ステロイド化合
物とラテックス粒子とをラテックス粒子の構造等を損な
わず、かつ、本ステロイド化合物を溶解、分散または懸
濁せしめることができる、親水性あるいは親油性の溶
剤、最適には、エタノールまたはメタノール溶液中にて
接触させ、通常４℃〜６０℃、好ましくは、４℃〜３０
℃の温度範囲で、通常３０分間〜２４時間、好ましく
は、１時間〜１０時間の時間範囲で撹拌、振とうあるい
は静置して反応させた後、必要に応じてラテックス粒子
を水または適当な緩衝液で洗浄することによって本ステ
ロイド化合物を固定化する方法を挙げることができる。

【００２５】このとき、反応液中のラテックス粒子の濃
度として表される固形物濃度が、通常０．０１％〜１０
％、好ましくは、０．０５％〜５％の濃度範囲であり、
また、本ステロイド化合物の濃度が、通常０．１μｇ／
ｍ1 〜１０ｍｇ／ｍ1 、好ましくは、１μｇ／ｍ1 〜１
ｍｇ／ｍ1 の濃度範囲であることが望ましい。また、反
応液は、水を含んでいてもよく、また、ラテックス粒子
の構造を損なわず、かつ、反応に大きな影響を与えない
濃度範囲のクロロホルム、アセトン、ヘキサン、ジクロ
ロエタン、プロパノール、イソプロパノール、キシレ
ン、トルエン、ベンゼン、エーテル、石油エーテル、酢
酸メチル、酢酸エチルまたはその他の溶剤等を含んでい
てもよい。

【００２６】また、例えば、ビーズまたはボール等を担
体とする場合には、担体となるビーズまたはボール等の
材質の構造を損なわない条件下において、ビーズまたは
ボール等の表面積、体積、個数およびその他の要因を考
慮して、ラテックス粒子の方法に準じて行えばよい。

【００２７】さらに、例えば、マイクロタイタープレー
トを担体とする場合には、本ステロイド化合物を、マイ
クロタイタープレートの構造等を損なわず、かつ、本ス
テロイド化合物を溶解、分散または懸濁せしめることが
できる、親水性あるいは親油性の溶剤、最適には、エタ
ノールまたはメタノール溶液に通常１μｇ／ｍ1 〜１０
ｍｇ／ｍ1 、好ましくは、１０μｇ／ｍ1 〜１ｍｇ／ｍ
1 の濃度範囲で溶解、分散あるいは懸濁させ、マイクロ
タイタープレートのウエルにウエルあたり通常２５μl
〜２００μl 、好ましくは、５０μ1 〜１００μ1 添加
し、通常４℃〜６０℃、好ましくは、４℃〜３０℃の温
度範囲で、通常３０分間〜２４時間、好ましくは、１時
間〜６時間の時間範囲で静置して反応させた後、ウエル
を水または適当な緩衝液で洗浄することによって本ステ
ロイド化合物を固定化する方法を例として挙げることが
できる。

【００２８】このとき、反応液は、水を含んでいてもよ
く、また、マイクロタイタープレートの構造を損なわ
ず、かつ、反応に大きな影響を与えない濃度範囲のクロ
ロホルム、アセトン、ヘキサン、ジクロロエタン、プロ
パノール、イソプロパノール、キシレン、トルエン、ベ
ンゼン、エーテル、石油エーテル、酢酸メチル、酢酸エ
チルまたはその他の溶剤等を含んでいてもよい。

【００２９】あるいは、本ステロイド化合物を通常１０
０ｎｇ／ｍ1 〜１ｍｇ／ｍ1 、好ましくは、１μｇ／ｍ
1 〜１００μｇ／ｍ1 の濃度範囲で、マイクロタイター
プレートの構造等を損なわず、かつ、本ステロイド化合
物を溶解、分散または懸濁せしめることができる、親水
性あるいは親油性の溶剤、最適には、エタノールまたは
メタノール溶液に溶解、分散または懸濁せしめた液をマ
イクロタイタープレートのウエルにウエルあたり通常２
５μ1 〜２００μ1 、好ましくは、５０μ1 〜１００μ
l 添加し、通常２０℃〜９０℃、好ましくは、４０℃〜
７０℃の温度範囲で静置して溶媒を蒸発留去させた後、
ウエルを水または適当な緩衝液で洗浄することによって
本ステロイド化合物を固定化する方法も便利でよい。

【００３０】さらに、例えば、テストチューブ等を担体
とする場合には、担体となるテストチューブ等の構造等
を損なわない条件下において、テストチューブ等の内容
積およびその他の要因を考慮して、マイクロタイタープ
レートの方法に準じて行えばよい。

【００３１】さらに、例えば、メンブレン等を担体とす
る場合には、担体となるメンブレン等の構造等を損なわ
ず、かつ、本ステロイド化合物を溶解、分散または懸濁
せしめることができる、親水性あるいは親油性の溶剤、
最適には、エタノールまたはメタノール溶液に溶解、分
散または懸濁させた本ステロイド化合物をメンブレン単
位面積（ｃｍ² ）あたり通常２５０ｎｍｏｌ〜０．０２
５ｎｍｏｌ、好ましくは、２５ｎｍｏｌ〜０．２５ｎｍ
ｏｌの量範囲で、好ましくは、当業者によく知られた方
法、例えば、ドットスポット等によりメンブレン等と接
触させ、本ステロイド化合物を固定化する方法を挙げる
ことができる。

【００３２】このとき、スポットの大きさ等は任意であ
り、また、本ステロイド化合物を溶解、分散または懸濁
した溶液は、水を含んでいてもよく、また、メンブレン
等の構造を損なわず、かつ、反応に大きな影響を与えな
い濃度範囲のクロロホルム、アセトン、ヘキサン、ジク
ロロエタン、プロパノール、イソプロパノール、キシレ
ン、トルエン、ベンゼン、エーテル、石油エーテル、酢
酸メチル、酢酸エチルまたはその他の溶剤等を含んでい
てもよい。

【００３３】本発明におけるステロイド化合物を担体に
化学的に結合させる方法は、本ステロイド化合物に官能
基、例えば、カルボキシル基、水酸基、チオール基、１
級アミノ基、２級アミノ基、アミド基、ニトロ基または
アルデヒド基等が導入された本ステロイド化合物の反応
性誘導体と本ステロイド化合物に導入された官応基と反
応することができる官能基を有する担体または活性化さ
れた担体とを、自体よく知られた方法、例えば、「実験
と応用 アフィニティクロマトグラフィー、千畑一郎・
土佐哲也・松尾雄志著、３０頁〜１０９頁、講談社
（株）、１９７６年９月１０日発行」あるいは「酵素免
疫測定法、石川榮治・河合 忠・室井 潔編集、第３
版、７５頁〜１５１頁、医学書院（株）、１９８７年５
月１５日発行」等に記載された方法に準じて、化学的に
結合させることによって行うことができる。

【００３４】本発明におけるステロイド化合物を担体に
化学的に結合させる方法の例としては、例えば、下記一
般式（４）

【００３５】

【化６】 （ただし式中、Ｒ６は置換されたあるいは非置換の、飽
和されたコレステロール側鎖基またはコール酸側鎖基、
Ｒ７は水素原子または水酸基、破線部位は飽和または二
重結合部位を示す。）で表されるステロイド化合物にお
いて、Ｒ６が置換されたあるいは非置換の、飽和された
コレステロール側鎖基またはコール酸側鎖基であり、Ｒ
７が水素原子または水酸基であり、破線部位のいずれか
一箇所が二重結合であるステロイド化合物を反応出発物
質とする。

【００３６】次いで、これに、「細田 宏ら、Chem. Ph
arm. Bull.、第２８巻、１２９４頁〜１２９９頁、１９
８０年」等に記載の方法に準じて、５，６−エポキシ
体、７，８−エポキシ体あるいは１４，１５−エポキシ
体の環開裂反応を経て、６位、７位あるいは１５位にチ
オエーテル結合により架橋されたカルボキシル基、１級
アミノ基、２級アミノ基、アミド基、ニトロ基またはア
ルデヒド基等を導入することによって、本ステロイド化
合物の反応性誘導体を形成せしめ、これと反応可能な官
能基をもつ担体表面に結合させる方法等を挙げることが
できる。

【００３７】より具体的には、上記一般式（４）で表さ
れるステロイド化合物のうち、例えば、Δ⁷ −コレステ
ノール、Δ⁷ −コプロステノール、Δ⁷ −スチグマステ
ノール、Δ⁷ −カンペステノールあるいはΔ⁷ −セレブ
ロステノール等の７−８位に二重結合をもつステロイド
化合物を反応出発物質として、この反応出発物質の７位
にカルボキシル基を導入することによって本ステロイド
化合物の反応性誘導体を形成せしめる例を用いて示すと
次のとおりである。

【００３８】まず、反応出発物質としての上記ステロイ
ド化合物を、溶解、分散または懸濁せしめることができ
る親水性有機溶剤（好ましくは、メタノールまたはエタ
ノール等）中で、過酸（好ましくは、過酸化水素等）お
よびアルカリ試薬（好ましくは、水酸化ナトリウムまた
は水酸化カリウム等）と接触させ、通常０℃〜４０℃、
好ましくは、０℃〜１０℃の温度範囲で、通常３０分間
〜１２時間、好ましくは、１時間〜６時間の時間範囲で
撹拌、振とうまたは静置した後、反応液を中和すること
によって反応出発物質のエポキシ誘導体を形成せしめ
る。

【００３９】このとき、反応液中の反応出発物質として
のステロイド化合物の濃度は、通常０．０１ｍｍｏｌ／
ｍ1 〜１ｍｍｏｌ／ｍl 、好ましくは、０．０５ｍｍｏ
ｌ／ｍl 〜０．５ｍｍｏｌ／ｍl の濃度範囲にあり、過
酸の濃度は、通常０．１％〜１０％、０．５％〜５％の
濃度範囲にあり、アルカリ試薬の濃度は、通常０．５％
〜１０％、好ましくは、１％〜５％の濃度範囲にあり、
かつ、反応液中の水分含量が、好ましくは、２０％以下
の範囲にあることが望ましい。

【００４０】形成されたエポキシ誘導体の分離法は、例
えば、「生化学研究法Ｉ、第７版、安藤鋭郎・寺山宏・
西沢一俊・山川民夫編集、４９頁〜９６頁、朝倉書店
（株）、１９７３年３月２０日発行」等に記載の方法に
準じて行えばよい。

【００４１】次いで、得られたエポキシ誘導体を、溶
解、分散または懸濁せしめることができる親水性有機溶
剤、最適には、メタノールまたはエタノール中で、メル
カプトモノカルボン酸（好ましくは、２−メルカプト酢
酸または３−メルカプトプロピオン酸等）およびアルカ
リ試薬（好ましくは、水酸化ナトリウムまたは水酸化カ
リウム等）と接触させ、通常０℃〜６０℃、好ましく
は、１０℃〜４０℃の温度範囲で、通常３０分間〜１２
時間、好ましくは、１時間〜６時間の時間範囲で撹拌、
振とうまたは静置した後、反応液のｐＨを酸性に変える
ことによって、反応出発物質としてのステロイド化合物
の７位にチオエーテル結合により架橋されたカルボキシ
ル基を導入せしめることができる。

【００４２】このとき、反応液中のエポキシ誘導体の濃
度は、通常０．０１ｍｍｏｌ／ｍl〜１ｍｍｏｌ／ｍl
、好ましくは、０．０５ｍｍｏｌ／ｍl 〜０．５ｍｍ
ｏｌ／ｍl の濃度範囲にあり、メルカプトモノカルボン
酸の濃度は、通常０．０５ｍｍｏｌ／ｍl 〜５ｍｍｏｌ
／ｍl 、好ましくは、０．１ｍｍｏｌ／ｍl 〜１ｍｍｏ
ｌ／ｍl の濃度範囲にあり、アルカリ試薬の濃度は、通
常０．５％〜１０％、好ましくは、１％〜５％の濃度範
囲にあり、かつ、反応液中の水分含量が、好ましくは、
２０％以下の範囲であることが望ましい。

【００４３】また、反応液は、ジオキサン等を含んでい
てもよい。形成された誘導体の分離法は、前述のエポキ
シ誘導体の分離法に準ずれば足りる。上記の方法によ
り、上記一般式（４）で表されるステロイド化合物のう
ち、例えば、Δ⁷ −コレステノール、Δ⁷ −コプロステ
ノール、Δ⁷ −スチグマステノール、Δ⁷ −カンペステ
ノールあるいはΔ⁷ −セレブロステノール等の７−８位
に二重結合をもつステロイド化合物を反応出発物質とし
て、それぞれコレスタノール、コプロスタノール、スチ
グマスタノール、カンペスタノールあるいはセレブロス
タノール等の７位にチオエーテル結合により架橋された
カルボキシル基が導入された反応性誘導体を形成せしめ
ることができる。

【００４４】また、上記の方法により、例えば、５−６
位に二重結合をもつコレステロール、β−シトステロー
ル、カンペステロールまたはセレブロステロール等を反
応出発物質として、それぞれコレスタノール、スチグマ
スタノール、カンペスタノールまたはセレブロスタノー
ル等の６位にチオエーテル結合により架橋されたカルボ
キシル基が導入された反応性誘導体を形成せしめること
ができる。

【００４５】これらのカルボキシル基が導入された本ス
テロイド化合物の反応性誘導体は、自体よく知られた方
法、例えば、酸無水物法、カルボジイミド法またはＮ−
ヒドロキシサクシンイミド法等で表面にアミノ基をもつ
担体の表面アミノ基と反応させて固定化を行うことがで
きる。

【００４６】本ステロイド化合物を固定化した担体へス
トレプトリジンＯを固相化させる方法は、基本的に、本
ステロイド化合物を固定化した担体とストレプトリジン
Ｏとを水または適当な緩衝液中で反応させることによっ
て行われる。

【００４７】本発明の実施において、ストレプトリジン
Ｏ固相化担体の有利な態様としては、ストレプトリジン
Ｏが本ステロイド化合物を介して担体単位面積（ｃ
ｍ² ）あたりに通常１ｎｍｏｌ〜０．００１ｐｍｏｌ、
好ましくは、１００ｐｍｏｌ〜０．０１ｐｍｏｌの範囲
で結合している担体を挙げることができる。

【００４８】本発明において使用されるストレプトリジ
ンＯは、本発明におけるステロイド化合物との結合能を
保持し、かつ、抗ストレプトリジンＯ抗体と反応するも
のであれば何れでもよく、例えば、Ａ群、Ｃ群またはＧ
群に属する溶血性連鎖球菌によって生産された、あるい
は、遺伝子組み換え技術を用いることによって大腸菌、
酵母、その他の宿主によって生産された、ストレプトリ
ジンＯあるいはその誘導体または変異体等を使用するこ
とができる。

【００４９】また、当然のことながら、本発明における
ステロイド化合物との結合能を保持し、かつ、抗ストレ
プトリジンＯ抗体と反応するストレプトリジンＯ様のも
の、例えば溶血活性部位の一部または全部を欠損せしめ
たストレプトリジンＯである合成タンパク質または合成
ペプチド等も使用できる。これらに由来するストレプト
リジンＯは必ずしも高純度に精製されたものを使用する
必要はないが、本発明におけるステロイド化合物との結
合反応を阻害する物質が共存する場合には、適宜精製し
て使用することが望ましい。

【００５０】また、簡便には、市販のストレプトリジン
Ｏを使用することができ、例えば、栄研化学（株）製、
日水製薬（株）製、日本凍結乾燥研究所（株）製、Ｄｉ
ｆｃｏ社製、シグマ社製等のストレプトリジンＯ市販品
を使用することができる。

【００５１】本発明に使用される緩衝液は、通常用いら
れる緩衝液であれば特に限定されないが、通常ｐＨ５〜
９、好ましくは、ｐＨ６〜８の範囲である緩衝液を用い
ることが望ましく、例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝
液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、ベロナール緩衝液、グ
ッド（Ｇｏｏｄ’ｓ）緩衝液（例えば、ヘペス（ＨＥＰ
ＥＳ）緩衝液、ピペス（ＰＩＰＥＳ）緩衝液、メス（Ｍ
ＥＳ）緩衝液等）等を用いることができる。

【００５２】また、ストレプトリジンＯの安定化あるい
は担体へのタンパク質等の非特異的吸着を防止する目的
で、添加剤として、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、ゼラチン、スキムミルクまたはミルク由来のタン
パク質等のタンパク質や糖、グリセロール、エチレング
リコール、キレート剤、還元剤等を水または緩衝液中に
適宜添加することは任意である。

【００５３】その濃度範囲等は、例えば自体公知の抗原
抗体反応を利用した抗ストレプトリジンＯ抗体の免疫学
的決定方法において通常用いられる濃度範囲等から適宜
選択すれば足りる。ただし、ストレプトリジンＯは、水
溶液中では比較的不安定であるので、安定化の目的のた
め、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、
スキムミルクまたはミルク由来のタンパク質等のタンパ
ク質を通常０．０１％〜１０％、好ましくは、０．１％
〜１％の濃度範囲で水または緩衝液中に添加しておくこ
とが望ましい。

【００５４】また、担体へのタンパク質等の非特異的吸
着を防止する目的で、本ステロイド化合物を固定化した
担体を、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチ
ン、スキムミルクまたはミルク由来タンパク質等のタン
パク質等を水または前述の緩衝液に溶解させた溶液で予
め処理しておくことは任意である。その濃度範囲等は、
例えば自体公知の抗原抗体反応を利用した抗体の免疫学
的決定方法において通常用いられる濃度範囲等から適宜
選択されればよいが、通常０．０５％〜１０％、好まし
くは、０．５％〜５％の濃度範囲から選択されれば足り
る。

【００５５】本発明において、本ステロイド化合物を固
定化した担体にストレプトリジンＯを固相化させる方法
は、用いるストレプトリジンＯ含有溶液のストレプトリ
ジンＯの濃度、純度、ステロイド化合物を固定化した担
体の種類あるいは本発明における被検液中の抗ストレプ
トリジンＯ抗体の決定法の原理等の違いにより自ずから
異なるが、これらの要因を勘案して下記に示す例に準じ
て行えばよい。

【００５６】例えば、本ステロイド化合物を固定化した
ラテックス粒子に、例えば、ストレプトリジンＯの純度
として５％〜１０％含み、タンパク質含量として０．５
ｍｇ／ｍl 〜１ｍｇ／ｍl であるストレプトリジンＯ含
有溶液を使用してストレプトリジンＯを固相化させる場
合には、ストレプトリジンＯ含有溶液を水または前述の
緩衝液で通常１倍〜１０，０００倍、好ましくは、１０
倍〜１，０００倍希釈した液に固形物濃度として表され
るラテックス粒子の濃度が、通常０．０１％〜１０％、
好ましくは、０．０５％〜５％の範囲になるよう本ステ
ロイド化合物を固定化したラテックス粒子を懸濁させ、
通常０℃〜４０℃、好ましくは、４℃〜３０℃の温度範
囲で、通常１０分間〜２４時間、好ましくは、３０分間
〜１２時間の時間範囲で静置、撹拌あるいは振とうした
後、必要に応じてラテックス粒子を水または前述の緩衝
液等で洗浄してストレプトリジンＯを固相化させること
ができる。

【００５７】このようにして得られたストレプトリジン
Ｏ固相化ラテックス粒子は、例えば、免疫凝集反応を原
理とする抗ストレプトリジンＯ抗体の決定法に用いるこ
とができる。

【００５８】また、例えば、本ステロイド化合物を固定
化したビーズまたはボール等を担体とする場合には、ビ
ーズまたはボール等の表面積、体積、個数およびその他
の要因を考慮して、本ステロイド化合物を固定化したラ
テックス粒子にストレプトリジンＯを固相化させる方法
に準じて行えばよい。これによって得られたストレプト
リジンＯ固相化ビーズまたはボール等は、例えば、エン
ザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍
光法等による抗ストレプトリジンＯ抗体の決定法に用い
ることができる。

【００５９】さらに、例えば、本ステロイド化合物を固
定化したマイクロタイタープレートに、例えば、ストレ
プトリジンＯの純度として５％〜１０％含み、タンパク
質含量として０．５ｍｇ／ｍl 〜１ｍｇ／ｍl であるス
トレプトリジンＯ含有溶液を使用してストレプトリジン
Ｏを固相化させる場合には、ストレプトリジンＯ含有溶
液を水または前述の緩衝液で通常１０倍〜１０，０００
倍、好ましくは、１００倍〜１，０００倍希釈した液を
本ステロイド化合物を固定化したマイクロタイタープレ
ートの反応ウエルにウエルあたり通常２５μl 〜２００
μl 、好ましくは、５０μl 〜１００μl 添加し、通常
４℃〜４０℃、好ましくは、４℃〜３０℃の温度範囲
で、通常１０分間〜２４時間、好ましくは、３０分間〜
１０時間の時間範囲で静置した後、ウエルを水または前
述の緩衝液で洗浄してストレプトリジンＯを固相化させ
ることができる。

【００６０】このようにして得られたストレプトリジン
Ｏ固相化マイクロタイタープレートは、例えば、エンザ
イムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光
法等による抗ストレプトリジンＯ抗体の決定法に用いる
ことができる。

【００６１】さらに、例えば、本ステロイド化合物を固
定化したテストチューブ等を担体とし、これにストレプ
トリジンＯを固相化させる場合には、テストチューブ等
の内容積およびその他の要因を考慮して、本ステロイド
化合物を固定化したマイクロタイタープレートを用いる
場合の方法に準じて行えばよい。

【００６２】これによって得られたストレプトリジンＯ
固相化テストチューブ等は、例えば、エンザイムイムノ
アッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光法等による
抗ストレプトリジンＯ抗体の決定法に用いることができ
る。

【００６３】さらに、例えば、本ステロイド化合物を固
定化したメンブレン等に、例えば、ストレプトリジンＯ
の純度として５％〜１０％含み、タンパク質含量として
０．５ｍｇ／ｍl 〜１ｍｇ／ｍl であるストレプトリジ
ンＯ含有溶液を使用してストレプトリジンＯを固相化さ
せる場合には、ストレプトリジンＯ含有溶液を水または
前述の緩衝液で通常１０倍〜１０，０００倍、好ましく
は、１００倍〜１，０００倍希釈した液を、例えば、適
当な反応容器中で本ステロイド化合物を固定化したメン
ブレン等と接触させ、あるいは、本ステロイド化合物の
スポット上に滴下して接触させ、通常４℃〜４０℃、好
ましくは、４℃〜３０℃の温度範囲で、通常５分間〜２
４時間、好ましくは、１０分間〜１０時間の時間範囲で
静置または振とうした後、メンブレン等を水または前述
の緩衝液で洗浄してストレプトリジンＯを固相化させる
ことができる。

【００６４】このようにして得られたストレプトリジン
Ｏ固相化メンブレン等は、例えば、免疫染色（ｉｍｍｕ
ｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）法等による抗ストレプトリジン
Ｏ抗体の決定法に用いることができる。

【００６５】本発明において、ストレプトリジンＯ固相
化担体を使用して被検液中の抗ストレプトリジンＯ抗体
を免疫学的に決定する方法は、抗原抗体複合体を形成せ
しめる条件下で、本発明によるストレプトリジンＯ固相
化担体と被検液とを反応させ、形成された抗原抗体反応
の生成物を確認または定量することにより特徴づけられ
る。

【００６６】本発明に係わる被検液とは、血清、血漿、
唾液、尿等の生体体液、組織抽出液または組織培養上清
等が挙げられ、これらの被検液は、本発明において用い
られる抗ストレプトリジンＯ抗体の決定法の原理、検出
感度、測定レンジあるいは他の要因を考慮して、被検液
原液で、あるいは、被検液原液を前述の緩衝液等により
適宜希釈して本発明に用いられる。

【００６７】本発明において、ストレプトリジンＯ固相
化担体を使用して抗ストレプトリジンＯ抗体を決定する
ための反応条件としては、抗原抗体反応を阻害せず、か
つ、用いられる試薬類の性質（例えば、標識物質が用い
られる場合においては、標識物質の有する検出可能な性
質等）等を失活させない条件であれば特に限定されず、
それぞれの決定法の原理、あるいは他の要因を考慮し
て、最適と思われる条件をそれぞれの決定法に通常用い
られる公知の反応条件から選択すればよい。

【００６８】本発明において、ストレプトリジンＯ固相
化担体を使用して被検液の抗ストレプトリジンＯ抗体を
免疫学的に決定する方法の例としては、例えば、ストレ
プトリジンＯ固相化ラテックス粒子を用いた場合には、
好ましくは当業者によく知られた方法で、例えば、ラテ
ックススライド凝集法（柴田里美ら、機器・試薬、第１
１巻、３３８頁〜３４２頁、１９８８年）に準じて、ス
トレプトリジンＯ固相化ラテックス粒子と被検液とを判
定板上で混合し、抗原抗体反応によるラテックス粒子の
凝集の有無を目視で確認する方法が挙げられる。

【００６９】さらに、免疫比ろう測定（ｎｅｐｈｅｌｏ
ｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＮＩＡ）法
（山岸安子、臨床検査、第２３巻、臨時増刊、１２８６
頁〜１２８９頁、１９７９年）に準じて、ストレプトリ
ジンＯ固相化ラテックス粒子と被検液とを混合すること
により生じた抗原抗体複合体に光（レーザー光）を照射
し、その散乱光の強度の変化量を測定し、抗ストレプト
リジンＯ抗体標準液で求めた検量線より抗ストレプトリ
ジンＯ抗体を決定する方法が挙げられる。

【００７０】さらに又、ラテックス凝集免疫測定（ｌａ
ｔｅｘ ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙ；ＬＰＩＡ）法（櫻林郁之介ら、日本臨床、第４８
巻、増刊号（下巻）、１３５６頁〜１３６１頁、１９９
０年）に準じて、ストレプトリジンＯ固相化担体と被検
液とを混合し、抗原抗体反応の結果生じる濁りを光学的
に測定し、抗ストレプトリジンＯ抗体標準液で求めた検
量線より抗ストレプトリジンＯ抗体を決定する方法が挙
げられる。

【００７１】また、カウンティングイムノアッセイ法
（橋本好一ら、検査と技術、第２２巻、第５号、第６７
〜６８頁、増刊号、１９９４年）に準じて、ストレプト
リジンＯ固相化担体と被検液とを混合し、抗原抗体反応
の結果生じる凝集物の大きさおよび数を測定し、抗スト
レプトリジンＯ抗体標準液で求めた検量線より抗ストレ
プトリジンＯ抗体を決定する方法等を挙げることができ
る。

【００７２】また、例えば、ストレプトリジンＯ固相化
マイクロタイタープレート、ストレプトリジンＯ固相化
ビーズ、ストレプトリジンＯ固相化ボールまたはストレ
プトリジンＯ固相化テストチューブ等を用いた場合に
は、例えば、当業者によく知られたエンザイムイムノア
ッセイ法に準じて、ストレプトリジンＯ固相化担体と被
検液とを反応させ、次いで、標識剤で標識された標識抗
体を反応させ、次いで、抗原抗体複合体を介して担体に
結合した標識剤の活性を測定し、抗ストレプトリジンＯ
抗体標準液で求めた検量線より抗ストレプトリジンＯ抗
体を決定する方法等を挙げることができる。

【００７３】さらに、ビタミンＢ群の一種であるビオチ
ンが、卵白の塩基性糖タンパク質アビジンと選択的に結
合する性質を利用し、上記の測定方法において、ビオチ
ンを結合させた抗体を酵素標識抗体の代わりに使用し、
次いで、標識剤で標識されたアビジンもしくストレプト
アビジンを反応させ、次いで、抗原抗体複合体を介して
担体に結合した標識剤の活性を測定し、抗ストレプトリ
ジンＯ抗体標準液で求めた検量線より抗ストレプトリジ
ンＯ抗体を決定する方法等を挙げることができる。

【００７４】これらのエンザイムイムノアッセイ法を利
用した測定方法において使用される標識抗体またはビオ
チン結合抗体は、測定対象である被検液中の抗ストレプ
トリジンＯ抗体と結合するものであれば特に制限はな
く、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはこ
れらの酵素分解フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ')₂ 、
Ｆ（ａｂ)₂、Ｆａｂ' 、Ｆａｂ等）にかかわらず使用す
ることができる。また、抗体タンパクがいかなる動物種
に由来するものであってもよく、また、遺伝子組み換え
技術によって大腸菌、酵母、その他の宿主等によって生
産されたものであってもよい。

【００７５】標識剤としては、エンザイムイムノアッセ
イ法において通常使用されるすべての酵素から、好まし
くはペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β
−ガラクトシダーゼまたはグルコースオキシダーゼから
適宜選択すればよい。また、酵素活性の検出は、「酵素
免疫測定法、蛋白質核酸酵素別冊 No.３１、北川常廣・
南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、５１頁〜６３頁、共
立出版（株）、１９８７年９月１０日発行」等に記載の
方法に準じて行えばよい。

【００７６】さらに、本発明において、例えば、ストレ
プトリジンＯ固相化マイクロタイタープレート、ストレ
プトリジンＯ固相化ビーズ、ストレプトリジンＯ固相化
ボールまたはストレプトリジンＯ固相化テストチューブ
等を用いた場合には、「酵素免疫測定法、石川榮治・河
合 忠・室井 潔編集、第３版、３１頁〜５４頁、医学
書院（株）、１９８７年５月１５日発行」等に記載され
た抗体測定法のうち競合法を原理として、自体よく知ら
れたエンザイムイムノアッセイ法に準じて抗ストレプト
リジンＯ抗体を決定することができる。

【００７７】このとき、使用される酵素標識抗ストレプ
トリジンＯ抗体は、「酵素免疫測定法、蛋白質核酸酵素
別冊 No.３１、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治
編集、３７頁〜４５頁、共立出版（株）、１９８７年９
月１０日発行」等に記載の方法に準じて、例えば、Ａ群
溶血性連鎖球菌感染患者血清由来の抗体、動物にストレ
プトリジンＯを含む免疫源で免疫して得られる抗血清由
来の抗体、あるいは、「免疫研究法ハンドブック、藤原
大美・淀井淳司編著、６１頁〜７５頁、中外医学社
（株）、１９９２年９月２０日発行」等に記載の方法に
準じてストレプトリジンＯに対して作製されたモノクロ
ーナル抗体等に対して標識を行ったものを使用すればよ
い。標識酵素および酵素活性の検出法は前述の方法に準
ずればよい。

【００７８】さらに、上記のエンザイムイムノアッセイ
法に限らず、当業者によく知られたその他の方法、例え
ば、ラジオイムノアッセイ法、免疫蛍光法等によって行
ってもよい。ラジオイムノアッセイ法、免疫蛍光法は、
前述のエンザイムイムノアッセイ法において標識剤とし
ての酵素の代わりにそれぞれ放射性物質、蛍光物質を用
いて行えばよい。

【００７９】さらに、例えば、ストレプトリジンＯ固相
化メンブレン等を用いた場合には、例えば、当業者によ
く知られた免疫染色（ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）
法に準じて、ストレプトリジンＯ固相化担体と被検液と
を反応させ、次いで、標識剤で標識された標識抗体を反
応させ、次いで、抗原抗体複合体を介して担体に結合し
た標識剤の活性を検出し、これを目視で確認、あるい
は、デンシトメーター等で定量することによって抗スト
レプトリジンＯ抗体を決定する方法等を挙げることがで
きる。

【００８０】本発明における抗原抗体反応の生成物を確
認または定量する方法は、用手法に限らず、自動分析装
置を利用した方法であってもよい。本発明において、例
えば、ラテックス凝集免疫測定（ｌａｔｅｘ ａｇｇｌ
ｕｔｉｎａｔｉｏｎ ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓａｙ；ＬＰＩＡ）法により、ストレプトリ
ジンＯ固相化ラテックス粒子を用いて被検液中の抗スト
レプトリジンＯ抗体を決定する場合においては、例え
ば、被検液分注、試薬分注、吸光度測定、データ処理等
を自動システム化した装置である日立７０５、７０５
０、７１５０、７３６、７０７０等の自動分析機が利用
でき、詳しくはストレプトリジンＯ固相化ラテックス粒
子と被検液とを反応セル中で混合し、公知の測定条件か
ら選択された任意の波長、好適には４００ｎｍ〜９５０
ｎｍの適宜な波長にて、ブランク補正を行い、一定時間
後の吸光度変化量を測定し、この結果と抗ストレプトリ
ジンＯ抗体標準液で求めた検量線とを比較することによ
って被検液中の抗ストレプトリジンＯ抗体を決定でき
る。

【００８１】また、例えば、エンザイムイムノアッセイ
法により、ストレプトリジンＯ固相化マイクロタイター
プレートまたはストレプトリジンＯ固相化テストチュー
ブ等を用いて被検液中の抗ストレプトリジンＯ抗体を決
定する場合においては、例えば、被検液分注、試薬分
注、洗浄操作、吸光度測定、データ処理等を自動システ
ム化した装置であるＢＥＣＫＭＡＮ Ｂｉｏｍｅｋ １
０００ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ベックマン社製）、ＣＥＬＬ
ＡＳＳＡＹ−２０００ ＲＯＢＯＴＩＣ ＡＳＳＡＹ
ＳＹＳＴＥＭ（モリテックス（株）製）等が利用でき
る。

【００８２】更に詳しくは、ストレプトリジンＯ固相化
マイクロタイタープレートまたはストレプトリジンＯ固
相化テストチューブに被検液、酵素標識抗体および基質
液を洗浄操作を挿んで順次反応させ、必要に応じて酵素
反応停止液を反応させた後、標識酵素と用いた基質との
関係による酵素反応での発色を公知の測定条件から選択
された任意の波長にて測定し、この結果と抗ストレプト
リジンＯ抗体標準液で求めた検量線とを比較することに
よって被検液中の抗ストレプトリジンＯ抗体を決定でき
る。

【００８３】さらに、例えば、エンザイムイムノアッセ
イ法により、ストレプトリジンＯ固相化ビーズ等を用い
て被検液中の抗ストレプトリジンＯ抗体を決定する場合
においては、例えば、被検液分注、試薬分注、洗浄操
作、吸光度測定、データ処理等を自動システム化した装
置であるアロカＡＥＣ−２０００ ＰＯＳＥＩＤＯＮII
（アロカ社製）等が利用できる。

【００８４】更に詳しくは、ストレプトリジンＯ固相化
ビーズに被検液、酵素標識抗体および基質液を洗浄操作
を挿んで順次反応させ、必要に応じて酵素反応停止液を
反応させた後、標識酵素と用いた基質との関係による酵
素反応での発色を公知の測定条件から選択された任意の
波長にて測定し、この結果と抗ストレプトリジンＯ抗体
標準液で求めた検量線とを比較することによって被検液
中の抗ストレプトリジンＯ抗体を決定できる。

【００８５】本発明の方法は、本発明の実施に必要な試
薬類をキットにしておくと、操作がさらに容易となる。
また、自動化分析装置を使って本発明を実施する場合に
おいても有利である。

【００８６】本発明で用いられる試薬キットは、（Ａ）
本発明において用いられるステロイド化合物固定化担体
および（Ｂ）ストレプトリジンＯ含有試薬を組み合わせ
てなるキットを挙げることができるが、より好ましく
は、これらの試薬を予め反応させて作製した（Ｃ）スト
レプトリジンＯ固相化担体がキット構成試薬の一つとな
っていると特に有利である。また、本発明で用いられる
試薬キットには、当然のことながら、上記（Ａ）、
（Ｂ）、（Ｃ）の他に本発明の実施に必要なその他の試
薬類例えば、緩衝剤、標準物質、標識抗体、基質、基質
溶解剤、反応停止剤等がキットの構成試薬として適宜含
まれていてもよい。

【００８７】

【実施例】以下に実施例によりさらに詳しく説明する
が、本発明は、これらによって限定されるものではな
い。 実施例１ 固定化ステロイド化合物とストレプトリジンＯとの反応
性の検討 （１）ストレプトリジンＯの調製 トッド−ヘウイト培地（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ Ｂｒ
ｏｔｈ：Ｄｉｆｃｏ社製）２リットルにてＡ群溶血性連
鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅ
ｓ）３型菌Ｄ５８Ｘ株（ＡＴＣＣ１２３８３）を３７℃
で１２時間培養した後、遠心分離およびろ過にて除菌培
養液を回収した。この除菌培養液に飽和硫安を添加して
４０％飽和とし、生じた沈澱を１００ｍl の精製水に溶
解した。

【００８８】この液を精製水およびＰＢＳに対して透析
を行って硫安を除去した後、ＰＢＳで平衡化したセファ
デックスＧ−１００（ゲル量１リットル）にてゲルろ過
を行い、溶血活性を指標にしてストレプトリジンＯ分画
を回収した。濃縮により、２８０ｎｍにて測定される吸
光度が０．８００を示し、溶血活性が８，１９２溶血単
位（ＨＵ）／ｍ1 を示すストレプトリジンＯ含有サンプ
ル１１ｍ1 を得た。

【００８９】溶血活性の測定は、新鮮なウサギ脱繊維赤
血球（日本バイオテスト研究所（株）製）をＰＢＳにて
５回遠心洗浄した後、１％赤血球懸濁液になるようＰＢ
Ｓにて調製した液２ｍl とストレプトリジンＯ含有サン
プルをＰＢＳにて等比希釈した液１ｍ1 とをガラス試験
管中で混合し、３７℃で３０分間インキュベートした
後、１００％溶血を示すストレプトリジンＯ含有サンプ
ルの最高希釈倍数を確認し、それをストレプトリジンＯ
含有サンプル１ｍ1 あたりのＨＵ値とした。

【００９０】（２）コレステロール固定化担体の作製 マイクロタイタープレート（住友ベークライト（株）
製）に１ｍｇ／ｍ1 濃度のコレステロール（半井化学薬
品（株）製）エタノール溶液をウエルあたり１００μl
添加し、６０℃で２時間静置し、溶媒を留去させること
によってコレステロール固定化マイクロタイタープレー
トを作製した。また、対照としてコレステロールを含ま
ないエタノール溶液を用いて同様に処理したコレステロ
ール非固定化マイクロタイタープレートを作製した。

【００９１】（３）コレステロール固定化担体とストレ
プトリジンＯ含有溶液との反応 （１）により調製されたストレプトリジンＯ含有サンプ
ルをＰＢＳにて２０培希釈し、（２）により作製された
コレステロール固定化マイクロタイタープレートおよび
コレステロール非固定化マイクロタイタープレートのウ
エルにウエルあたり５０μ1 添加し、室温で２時間反応
させた。反応液をウエルから回収し、回収液についてＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）分析および溶血活性の測定（実施例１（１）に記
載の方法）を行い、反応前と比較した。

【００９２】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
は、１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用い、ラエン
ムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．、Ｎａｔｕｒｅ、第２
２７巻、６８０頁〜６８５頁、１９７０年）の方法に準
じて行った。同一のゲルにおいて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分
子量スタンダードローレンジ（ホスフォリラーゼＢ：９
２，５００、牛血清アルブミン：６６，２００、オボア
ルブミン：４５，０００、カルボニックアンヒドラー
ゼ：３１，０００、ソイビーントリプシンインヒビタ
ー：２１，５００、リゾチーム：１４，４００；バイオ
ラッド社製）を泳動し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により分離された回収液の各タンパクバンド
の分子量を確認するための目安とした（図１中、レーン
１）。泳動後のゲルは、銀染色キットワコー（和光純薬
工業（株）製）にて銀染色を施した。

【００９３】（４）結果 （３）の結果、図１に示すＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを
得た。図１中、レーン２はコレステロール固定化マイク
ロタイタープレートまたはコレステロール非固定化マイ
クロタイタープレートに反応させる前の液、すなわち
（１）により調製されたストレプトリジンＯ含有サンプ
ルをＰＢＳにて２０培希釈した液に含まれるタンパク質
の分離パターンを意味する。

【００９４】また、図１中、レーン３はコレステロール
固定化マイクロタイタープレートから回収された回収液
に含まれるタンパク質の分離パターンを意味し、さら
に、図１中、レーン４は、コレステロール非固定化マイ
クロタイタープレートから回収された回収液に含まれる
タンパク質の分離パターンを意味する。

【００９５】以上のことから、分子量６６，０００〜６
９，０００および５５，０００〜５８，０００を示すス
トレプトリジンＯのバンドが、コレステロール固定化担
体と反応させることによって選択的に結合して消失した
ことが確認された。また、コレステロール固定化マイク
ロタイタープレートからの回収液残査の溶血活性は、反
応前の活性の０．８％が回収されたにすぎなかった。こ
れらの結果より、ストレプトリジンＯ含有溶液中の生物
活性を有するストレプトリジンＯが特異的にコレステロ
ール固定化担体に結合することが判明した。

【００９６】実施例２ 固相化ストレプトリジンＯと抗ストレプトリジンＯ抗体
との反応性の検討 （１）コレステロール固定化担体の作製 マイクロタイタープレート（住友ベークライト（株）
製）に２０μｇ／ｍ1 濃度のコレステロールエタノール
溶液をウエルあたり５０μl ずつ添加し、６０℃で２時
間静置して溶媒を留去させ、次いで、２０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．６、０．１４Ｍ塩化ナトリウム含
有）に５％濃度となるようスキムミルク（雪印乳業
（株）製）を溶解した液（以下、ブロッキング液と称
す）をウエルあたり１００μ1 添加し、室温で２時間反
応させた。２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６、
０．１４Ｍ塩化ナトリウム含有）（以下、洗浄液と称
す）にてウエルを２回洗浄してコレステロール固定化担
体を作製した。

【００９７】（２）ストレプトリジンＯのコレステロー
ル固定化担体への感作 実施例１（１）に記載のストレプトリジンＯ含有サンプ
ルを０．５％濃度のスキムミルクを含む２０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６、０．１４Ｍ塩化ナトリウム
含有）（以下、希釈液と称す）にて１００倍、４００
倍、１，６００倍に希釈した液および対照ブランクとし
ての希釈液をウエルあたり５０μ1 添加し、室温で２時
間反応させた。洗浄液にてウエルを７回洗浄してストレ
プトリジンＯをマイクロタイタープレートに感作させ
た。

【００９８】（３）ストレプトリジンＯ−抗ストレプト
リジンＯ抗体免疫複合体の検出 （２）により処理されたマイクロタイタープレートに対
し、抗ストレプトリジンＯ抗体標準液（１３１ＩＵ／ｍ
1 ）を希釈液にて５００培希釈した液をウエルあたり５
０μ1 添加し、室温で１時間反応させた。洗浄液にてウ
エルを７回洗浄した後、酵素標識第２抗体としてアルカ
リホスファターゼ標識ヤギＦ（ａｂ’） ₂ 抗ヒトＩｇＧ
（タゴ社製）を希釈液にて１，０００倍希釈した液をウ
エルあたり５０μ1 添加し、室温で１時間反応させた。

【００９９】次いで、洗浄液でウエルを７回洗浄した
後、基質液としてｐ−ニトロフェニルリン酸（和光純薬
工業（株）製）を０．５ｍｇ／ｍ1 濃度となるようにジ
エタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．５）にて溶解した液
をウエルあたり１００μ1 添加し、室温で１５分間反応
させた。次いで、０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液をウ
エルあたり１００μ1 添加して酵素反応を停止させ、４
０５ｎｍの吸光度（ΔＥ）を測定した。

【０１００】（４）結果 ストレプトリジンＯ−抗ストレプトリジンＯ抗体免疫複
合体の検出結果は、図２に示した。図２の結果から、コ
レステロールを介して担体に固相化されたストレプトリ
ジンＯは抗ストレプトリジンＯ抗体との反応性を保持す
ることが判明した。

【０１０１】実施例３ 抗ストレプトリジンＯ抗体価の測定−１ （１）ストレプトリジンＯ固相化担体の作製 粒径０．１２μｍのポリスチレンラテックス（積水化学
工業（株）製）を１０％エタノール水溶液にて２％ポリ
スチレンラテックス懸濁液となるよう調製し、この懸濁
液１容量部にコレステロール（半井化学薬品（株）製）
を２００μｇ／ｍl の濃度で含む１０％エタノール水溶
液１容量部を加え、室温で２時間接触させた。

【０１０２】次いで、この反応液１容量部に対し、２％
濃度のＢＳＡを含むＰＢＳを９容量部添加し、室温で２
時間反応した。反応後、１２，０００回転で２０分間遠
心してラテックス粒子を回収し、０．２％ラテックス懸
濁液となるようＰＢＳに再懸濁した。次いで、このラテ
ックス懸濁液１容量部に対し、実施例１（１）に記載の
ストレプトリジンＯ含有サンプルを０．４％濃度のＢＳ
Ａを含むＰＢＳにて５０倍希釈した液１容量部を添加
し、室温で２時間反応させた。反応後、１２，０００回
転で２０分間遠心してラテックス粒子を回収し、０．１
％ラテックス懸濁液となるようＰＢＳに再懸濁してスト
レプトリジンＯ固相化ラテックス粒子を得た。

【０１０３】（２）抗ストレプトリジンＯ抗体価の測定 （１）により作製されたストレプトリジンＯ固相化ラテ
ックス粒子懸濁液２００μ1 に対し、ＰＢＳ６００μ1
および血清被検液２００μ1 を添加し、３７℃で５分間
反応させた後、５９０ｎｍにおける吸光度（ΔＥ）を測
定した。抗ストレプトリジンＯ抗体価は、あらかじめ抗
ストレプトリジンＯ抗体標準液を用いて本発明の測定法
により作製された検量線から求めた。

【０１０４】（３）結果 本法での抗ストレプトリジンＯ抗体価の検量線を図３に
示した。図３の結果から、本発明の方法により良好な検
量線が得られることが判明した。また、本発明の方法と
従来法であるランツ・ランダール法との相関を図４に示
した。図４の結果から、本発明の方法は、ランツ・ラン
ダール法と良好な相関関係を示したことが判明した。

【０１０５】実施例４ 抗ストレプトリジンＯ抗体価の測定−２ （１）ストレプトリジンＯ固相化担体の作製 １０％エタノール水溶液にコレステロール（半井化学薬
品（株）製）を１００μｇ／ｍ1 の濃度になるよう懸濁
させた液を、マイクロタイタープレート（住友ベークラ
イト（株）製）のウエルにウエルあたり５０μ1 添加
し、室温で２時間静置した後、ウエルを精製水で２回洗
浄した。次いで、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．６、０．１４Ｍ塩化ナトリウム含有）に５％濃度と
なるようスキムミルク（雪印乳業（株）製）を溶解した
液（以下、ブロッキング液と称す）をウエルあたり１０
０μ1 添加し、室温で２時間反応させた。

【０１０６】２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
６、０．１４Ｍ塩化ナトリウム含有）（以下、洗浄液と
称す）にてウエルを２回洗浄後、実施例１（１）に記載
のストレプトリジンＯ含有サンプルを０．５％濃度のス
キムミルクを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．６、０．１４Ｍ塩化ナトリウム含有）（以下、希釈
液と称す）にて１，０００倍に希釈した液をウエルあた
り５０μ1 添加し、室温で２時間反応させた。洗浄液に
てウエルを７回洗浄してストレプトリジンＯ固相化マイ
クロタイタープレートを作製した。

【０１０７】（２）抗ストレプトリジンＯ抗体価の測定 ＢＥＣＫＭＡＮ Ｂｉｏｍｅｋ １０００ Ａｕｔｏｍ
ａｔｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉ
ｏｎを使用して抗ストレプトリジンＯ抗体価の測定を行
った。（１）により作製されたストレプトリジンＯ固相
化マイクロタイタープレートに対し、まず血清被検液を
希釈液にて１００培希釈した液をウエルあたり５０μl
添加し、室温で１時間反応させた後、洗浄液にてウエル
を７回洗浄させた。次いで、第１試液（酵素標識第２抗
体としてアルカリホスファターゼ標識ヤギＦ（ａｂ’）
₂ 抗ヒトＩｇＧ（タゴ社製）を希釈液にて１，０００倍
希釈した液）をウエルあたり５０μ1 添加し、室温で１
時間反応させた後、洗浄液でウエルを７回洗浄させた。

【０１０８】次いで、第２試液（基質液としてｐ−ニト
ロフェニルリン酸（和光純薬工業（株）製）を０．５ｍ
ｇ／ｍ1 濃度となるようにジエタノールアミン緩衝液
（ｐＨ９．５）にて溶解した液）をウエルあたり１００
μ1 添加し、室温で１５分間反応させた。さらに、０．
５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液をウエルあたり１００μ1
添加して酵素反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度（Δ
Ｅ）を測定した。抗ストレプトリジンＯ抗体価は、あら
かじめ抗ストレプトリジンＯ抗体標準液を用いて本法に
より作製された検量線から求めた。

【０１０９】（３）結果 本発明の測定法での抗ストレプトリジンＯ抗体価の検量
線を図５に示した。図５の結果から、本発明の測定法に
より良好な検量線が得られることが判明した。また、本
発明の測定法と従来法であるランツ・ランダール法との
相関を図６に示した。図６の結果から、本発明の方法
は、ランツ・ランダール法と良好な相関関係を示したこ
とが判明した。

【０１１０】

【発明の効果】本発明によれば、ストレプトリジンＯが
結合することができるステロイドを固定化した担体を用
いることにより、これまで純品を得ることが困難であっ
たストレプトリジンＯを必ずしも高純度に精製する必要
はなく、ストレプトリジンＯ含有溶液からストレプトリ
ジンＯを特異的に担体上に固相化せしめることができ、
さらに、このストレプトリジンＯ固相化担体を用いるこ
とによってＡ群溶血性連鎖球菌感染により体液中に出現
する多様な抗体群の中から抗ストレプトリジンＯ抗体を
反応特異的かつ簡便に測定できる。しかも不安定な赤血
球を必要とせず、かつ、自動化が可能な測定法を提供で
きる。本発明は、以上の点において従来法に比し顕著な
効果を奏するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例１におけるコレステロール固相
化担体とストレプトリジンＯ含有溶液とを接触させた後
の回収液の電気泳動のパターンを示す。

【図２】図２は、実施例２における固相化ストレプトリ
ジンＯ−抗ストレプトリジンＯ抗体免疫複合体の検出結
果を示す。

【図３】図３は、実施例３におけるストレプトリジンＯ
固相化ラテックス粒子を用いた本発明の測定法の検量線
を示す。

【図４】図４は、実施例３におけるストレプトリジンＯ
固相化ラテックス粒子を用いた本発明の測定法と従来法
（ランツ・ランダール法）との相関を示す。

【図５】図５は、実施例４におけるストレプトリジンＯ
固相化マイクロタイタープレートを用いた本発明の測定
法の検量線を示す。

【図６】図６は、実施例４におけるストレプトリジンＯ
固相化マイクロタイタープレートを用いた本発明の測定
法と従来法（ランツ・ランダール法）との相関を示す。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭64−79660（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−172552（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−117159（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−148193（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−186233（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/53 - 33/579

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被検液中の抗ストレプトリジンＯ抗体の
   免疫学的決定において、下記一般式（１） 【化１】 （ただし式中、Ｒ１は置換されたあるいは非置換の、不
   飽和のあるいは飽和された、コレステロール側鎖基また
   はコール酸側鎖基、Ｒ２は水素原子または水酸基、破線
   部位は飽和または二重結合部位を示す。）で表されるス
   テロイド化合物の一種以上を固定化させた担体とストレ
   プトリジンＯ含有溶液との接触によって形成したストレ
   プトリジンＯ固相化担体を使用することを特徴とする抗
   ストレプトリジンＯ抗体の決定方法。
2. 【請求項２】 ステロイド化合物が、２５０ｎｍｏｌ／
   ｃｍ² 〜０．０２５ｎｍｏｌ／ｃｍ² の担体単位面積あ
   たりの結合量である請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 ステロイド化合物が、２５ｎｍｏｌ／ｃ
   ｍ² 〜０．２５ｎｍｏｌ／ｃｍ² の担体単位面積あたり
   の結合量である請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 ストレプトリジンＯが、１ｎｍｏｌ／ｃ
   ｍ² 〜０．００１ｐｍｏｌ／ｃｍ² の担体単位面積あた
   りの結合量である請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 ストレプトリジンＯが、１００ｐｍｏｌ
   ／ｃｍ² 〜０．０１ｐｍｏｌ／ｃｍ² の担体単位面積あ
   たりの結合量である請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 上記一般式（１）におけるステロイド化
   合物が、コレステロール、７−デヒドロコレステロー
   ル、コレスタノール、コプロスタノール、Δ⁷−コレス
   テノール、Δ⁷ −コプロステノール、β−シトステロー
   ル、７−デヒドロ−β−シトステロール、スチグマステ
   ロール、７−デヒドロスチグマステロール、カンペステ
   ロール、７−デヒドロカンペステロール、スチグマスタ
   ノール、Δ⁷ −スチグマステノール、１１α−ヒドロキ
   シコレステロール、Δ²²−スチグマステノール、α−ス
   ピナステロール、カンペスタノール、Δ⁷ −カンペステ
   ノール、２０α−ヒドロキシコレステロール、ブラシカ
   ステロール、エルゴステロール、セレブロステロール、
   ７−デヒドロセレブロステロール、セレブロスタノー
   ル、Δ⁷ −セレブロステノール、デスモステロール、７
   −デヒドロデスモステロール、３β−ヒドロキシコラン
   酸または３β−ヒドロキシ−Δ⁵ −コレン酸である請求
   項１〜請求項５のいずれか１項に記載の方法。
7. 【請求項７】 担体が、ラテックス粒子、ビーズ、ボー
   ル、マイクロタイタープレート、テストチューブまたは
   メンブレンである請求項１に記載の方法。