DE19542549C2 - Verfahren zur Bestimmung des Antistreptolysin O Antikörpers - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Be­ stimmung von Antistreptolysin O Antikörper. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur immunolo­ gischen Bestimmung von Antistreptolysin O Antikörper, bei dem eine Testprobenlösung, die den Antistreptolysin O Antikörper enthält, mit einem Bindemittel zusammengebracht wird, das den Antistreptolysin O Antikörper spezifisch binden kann. Dabei wird der Antistreptolysin O Antikörper selektiv an das Bindemittel durch eine Antigen-Antikörper Reaktion gebunden und eine Menge des Antistreptolysin O Antikörpers, die an das Bindemittel gebunden ist, bestimmt. Das Bindemittel enthält ein auf einem Träger immobilisiertes Streptolysin O und wird erhalten, indem eine Lösung, die Streptolysin O enthält mit einem Träger zusammengebracht wird, auf dem wenigstens ein spezifisches Steroid immobilisiert ist. Das Bindemittel, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren benutzt wird, ist in der Lage, den Antistreptolysin O Antikörper spezifisch zu binden, so daß die Bestimmung des Antistreptolysin O Antikörpers schnell mit hoher Spezifität und Genauigkeit durchgeführt werden kann. Außerdem brauchen für das erfindungsgemäße Verfahren keine Erythrozyten verwendet zu werden, die unstabil sind und in Abhängigkeit von der jeweiligen Probe unter­ schiedliche Eigenschaften aufweisen. Wegen dieser vorstehend erwähnten Vorteile ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren die Automatisierung der spezifischen und genauen Bestimmung von Antistreptolysin O Antikörper und unterscheidet sich dadurch von konventionellen Bestimmungsverfahren, die nicht verwendet werden können, um eine spezifische und genaue Bestimmung des Antistreptolysin O Antikörpers zu automatisie­ ren. Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhaft für die Diagnose von Infektionen mit hämolytischen Streptokokken der Gruppe A benutzt werden.

Der Antistreptolysin O Antikörper ist ein Antikörper gegen Streptolysin O. Streptolysin O ist ein Toxin (das ein Mitglied der Gruppe der thiolaktivierten bakteriellen Zytolysine ist), das beispielsweise hergestellt wird von hämolytischen Streptokokken der Gruppe A, die gemäß der serologischen Klassifikation von Lancefield klassifiziert werden (siehe Lancefield, R. C., J. Exp. Med., Vol. 57, pp. 571-595, 1933), und ist allgemein als ein Protein mit einem Molekulargewicht im Bereich zwischen 50.000 und 70.000 bekannt. Es ist außerdem bekannt, [Watson K. C.; Kerr E. J.; LANCET (1975, Febr. 8) 1 (7902) 308-10] daß Streptolysin O mit Cholesterol und verwandten Sterolen reagiert (siehe Prigent, D. et al., BBA, Vol. 443, pp. 288-300, 1976), und zytolytische Effekte auf einen breiten Bereich von Säugetierzellen ausübt [Alouf I. E.; Geoffroy C.; Pattus F.; Verger R.; European Journal of Biochemistry, (1984, May 15) 141 (1) 205-10]. Streptolysin O lysiert Erythrozyten, üblicherweise unter reduktiven Bedingun­ gen, beispielsweise in Gegenwart von Merkaptoethanol durch eine Reaktion mit dem Cholesterol der Membran. Es ist bekannt, daß die Menge des Antistreptolysin O Antikörpers im Serum von Patienten erhöht ist, die mit hämolytischen Streptokokken der Gruppe A infiziert sind.

Hämolytische Streptokokken der Gruppe A sind pathogene Mikroorganismen, die verschiedene Krankheiten verursachen wie Tonsilitis, Pharyngitis, Hautvereiterung und Scharlachfieber, sowie Folgeerkrankungen wie rheumatisches Fieber, Glomerulo­ nephritis und ähnliche Erkrankungen. Die meisten dieser Erkrankungen zeigen keine spezifischen klinischen Symptome, durch die der pathogene Mikroorganismus, der diese Krankheiten verursacht, identifiziert werden kann. Deshalb ist zur klinischen Diagnose von Infektionen mit hämolytischen Streptokokken der Gruppe A der Nachweis der Anwesenheit des Antistreptolysin O Antikörpers und die Bestimmung des Antikörpertiters allgemein benutzt worden [siehe Tomika Nagata, "Rinshokensa (Laboratory Examinations)", Vol. 23, Supplementary Edition, pp. 1172-1175, 1979].

Als Verfahren zur Bestimmung des Antistreptolysin O Titers sind die Methode von Rantz-Randall, die Kaninchenerythrozyten, Schaferythrozyten oder menschliche Erythrozyten vom Typ O verwendet (siehe L. A. Rantz et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol. 59, pp. 22-25, 1945), und eine Modifikation des Rantz-Randall Verfahrens, nämlich das Mikrotiterverfahren (siehe Edwards, E. A.; J. Bacteriol., Vol. 87, pp. 1254-1255, 1964) üblicherweise in Routinenachweisverfahren in großem Umfang eingesetzt worden. Beide Bestimmungsverfahren basieren auf dem Prinzip, daß der Antistreptolysin O Antikörper in einer Testprobelösung die hämolytische Aktivität des Strepto­ lysins O neutralisiert.

Die hämolytischen Streptokokken der Gruppe A, die lebende Organismen infiziert haben, produzieren nicht nur Streptolysin O, sondern auch verschiedene andere Antigene wie das ery­ throgene Toxin, Streptokinase, Streptodornase, Hyaluronidase, Ribonuclease und Neuraminidase und zusätzlich treten im Blut verschiedene Antikörper gegen diese Antigene auf [siehe "Rensakyukin-kansensho II: Sono Kiso-to-Rinsho (Streptococci­ cosis, Volume II: the basic and clinical)"; herausgegeben von Yuichi Shiokawa, Morimasa Yoshioka and Shigeyuki Hamada; pp. 317-359, Hirokawa Shoten K. K., Japan, June 25 1992]. Da die vorstehend beschriebenen Bestimmungsmethoden die charakteri­ stische hämolytische Aktivität des Streptolysin O benutzen, braucht das Streptolysin O, das als Reagens für die be­ schriebenen Bestimmungsverfahren eingesetzt wird, nicht notwendigerweise gereinigt sein, sondern bei den vorstehend beschriebenen Bestimmungsverfahren kann nicht-gereinigtes Streptolysin O zur spezifischen Erkennung und Bestimmung allein des Antikörpers gegen Streptolysin O eingesetzt werden, selbst wenn dieser zusammen mit Antikörpern gegen eine Anzahl anderer Antigene vorliegt [Fujimoto et al., "Rinsho-byori (Clinical Pathology)", Vol. 40, pp. 21-27, 1992].

Diese Bestimmungsmethoden erfordern jedoch die Verwendung von frischen Erythrozyten. Erythrozyten sind unstabil und in verschiedenen Proben in ihrer Qualität unterschiedlich, so daß diese Bestimmungsverfahren, die Erythrozyten verwenden, in gleicher Weise unstabil sind. Außerdem umfassen diese Bestimmungsmethoden notwendigerweise auch komplizierte Maßnahmen. Deshalb ist es sehr schwierig, diese Bestimmungs­ methoden zu automatisieren (siehe europäische Patentanmeldung Nr. 0 475 786 A2 entsprechend der ungeprüften japanischen Patentanmeldung Laid-Open Specification No. Hei 6-186233).

Aus der europäischen Patentanmeldung Nr. 0.089.598 ist bereits ein Verfahren zur Herstellung eines Latex-Reagenzes bekannt, das es erlaubt, mittels einer Antigen-Antikörper-Reaktion, Antikörper gegen Streptolysin O zu bestimmen. In den letzten Jahren ist außerdem ein Bestimmungsverfahren für den Anti­ streptolysin O Antikörpertiter benutzt worden, das auf dem Prinzip der Immunagglutination beruht und einen Träger (z. B. kolloidale Latexpartikel) verwendet, der ein immobilisiertes Streptolysin O trägt [siehe T. Miura et al., "Eisei-kensa (Hygienic Examinations)", Vol. 36, pp. 36-40, 1987]. Diese konventionellen Bestimmungsverfahren, die ein auf einem Träger immobilisiertes Streptolysin O benutzen, sind dadurch verbessert worden, daß unstabile Erythrozyten nicht mehr eingesetzt werden müssen und das Verfahren automatisiert werden kann, wodurch es sich von den obengenannten konventio­ nellen Bestimmungsverfahren unterscheidet, die die hämolyti­ sche Aktivität des Streptolysin O als Erkennungsmerkmal benutzen.

Das konventionelle Bestimmungsverfahren, das ein auf einem Träger immobilisiertes Streptolysin O benutzt, hat die folgenden Nachteile: Streptolysin O wird im allgemeinen aus einer Kulturmischung von hämolytischen Streptokokken der Gruppe A hergestellt. Es ist sehr schwierig, aus einer derartigen Kultur ein hochgereinigtes Streptolysin O zu erhalten, weil das Streptolysin O, das aus einer solchen Kulturmischung von hämolytischen Streptokokken der Gruppe A erhalten wird, üblicherweise eine große Vielzahl von anderen Antigenen enthält, die von hämolytischen Streptokokken der Gruppe A gebildet werden. Wenn ein derartiges Streptolysin O auf einem Träger immobilisiert wird, werden deshalb auch andere Antigene, die von den hämolytischen Streptokokken der Gruppe A gebildet werden, auf dem Träger zusammen mit dem Streptolysin O immobilisiert. Deshalb ist der Antikörpertiter, der durch das konventionelle Bestimmungsverfahren unter Benutzung des oben erwähnten Trägers mit immobilisiertem Streptolysin O erhalten wird, ein Titer, der allen Antikörpern entspricht, die mit den verschiedenen Antigenen reagieren, die auf dem Träger immobilisiert sind. Dieses konventionelle Bestimmungsverfahren, das einen Träger mit immobilisiertem Streptolysin O benutzt, hat deshalb insoweit einen Nachteil, als es unbefriedigend im Hinblick auf seine Spezifität gegenüber dem Streptolysin O Antikörper ist [siehe Fujimoto et al., "Rinsho-byori (Clinical Pathology)", Vol. 40, pp. 21-27, 1992].

In dieser Situation war es erwünscht, ein Bestimmungsverfahren zu entwickeln, das die Probleme löst, die den konventionellen Verfahren zur Bestimmung von Antistreptolysin O Antikörper anhaften. Es war also erwünscht, ein Bestimmungsverfahren für den Antistreptolysin O Antikörper zu entwickeln, das zur genauen und einfachen Bestimmung von Antistreptolysin O Antikörpern mit hoher Spezifität eingesetzt werden kann und welches für ein automatisiertes Verfahren ebenso wie für ein manuelles Verfahren geeignet ist.

Die Erfinder haben umfangreiche und intensive Studien durchgeführt, um die vorstehenden Probleme des Standes der Technik zu lösen. Im Ergebnis haben sie gefunden, daß unerwarteterweise nur das in der Lösung enthaltene Streptoly­ sin O selektiv auf dem Träger immobilisiert werden kann, wenn eine das Streptolysin O enthaltende Lösung mit einem Träger zusammengebracht wird, der wenigstens ein Steroid der Formel (1):

physikalisch oder chemisch immobilisiert trägt, wobei R¹ aus der Gruppe bestehend aus einem Seitenkettenteil des Choleste­ rols und einem Seitenkettenteil der Cholsäure ausgewählt ist, wobei jedes der Seitenkettenteile unabhängig voneinander unsubstituiert oder substituiert und unabhängig voneinander gesättigt oder ungesättigt ist; wobei R² Wasserstoff oder Hydroxyl bedeutet; und wobei jede durchbrochene Linie unabhängig voneinander eine Einfachbindung oder keine Bindung bedeutet so daß jede durchbrochene Linie und jede danebenlie­ gende durchgezogene Linie zusammen unabhängig voneinander eine Doppelbindung oder eine Einfachbindung bedeuten,
wobei nur das Streptolysin O in der Lösung selektiv auf dem Träger immobilisiert werden kann, wodurch ein Träger mit einem immobilisierten Streptolysin O erhalten wird und das immobili­ sierte Streptolysin O noch die Fähigkeit zur Reaktion mit dem Antistreptolysin O Antikörper hat und in der Lage ist, spezifisch den Antistreptolysin O Antikörper zu binden. Sie haben auch gefunden, daß bei Verwendung des vorstehend genannten Trägers mit immobilisiertem Streptolysin O die spezifische Bestimmung des Antistreptolysin O Antikörpers genau und leicht durchgeführt werden kann. Die vorliegende Erfindung wurde, basierend auf den vorstehenden Erkenntnissen, vollendet.

Dementsprechend ist es ein ganz besonders wichtiges Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Antistreptolysin O Antikörper zur Verfügung zu stellen, das benutzt werden kann, um Antistreptolysin O Antikörper spezifisch, genau und leicht zu bestimmen und das nicht nur durch manuelle, sondern auch durch automatisierte Arbeitsschritte durchgeführt werden kann.

Dieses und andere Ziele, Merkmale und Vorteile der vorliegen­ den Erfindung wird der Fachmann aus der folgenden Beschreibung und den Ansprüchen in Verbindung mit den dazugehörigen Zeichnungen erkennen.

Es zeigen:

Fig. 1 zeigt Muster der Elektrophorese nach Beispiel 1 einschließlich eines Musters (Spur 3), das erhalten wurde durch SDS-Polyacrylamid Gel Elektrophorese einer Reaktionsmischung, die gewonnen wird, indem eine Lösung von Streptolysin O mit einem Träger in Kontakt gebracht wird, der immobilisiertes Chole­ sterol trägt;

Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse des Versuchs von Beispiel 2 zur Erkennung eines Immunkomplexes des immobilisierten Streptolysins O mit dem Antistreptolysin O Antikörper zeigt;

Fig. 3 zeigt die graphische Darstellung einer Kalibrier­ kurve, die in Beispiel 3 verwendet wird, und verdeutlicht die Beziehung zwischen dem Antistrep­ tolysin O Antikörpertiter und der Absorption bei 590 nm, wobei die Kalibrierkurve nach dem erfin­ dungsgemäßen Verfahren erhalten wurde unter Verwen­ dung einer Standardlösung, die den Antistreptolysin O Antikörper als eine Testprobenlösung enthält, und unter Verwendung von auf Latexpatikeln als Binde­ mittel immobilisiertem Streptolysin O;

Fig. 4 zeigt eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen dem Antistreptolysin O Antikörpertiter, bestimmt in Beispiel 3 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung von auf Latexpartikeln als Bindemittel immobilisierten Streptolysin O, und dem Antistreptolysin O Antikörpertiter, bestimmt nach dem Rantz-Randall Verfahren

Fig. 5 zeigt eine graphische Darstellung der Kalibrierkur­ ve von Beispiel 4 und stellt die Beziehung zwischen dem Antistreptolysin O Antikörpertiter und der Absorption bei 405 nm dar, wobei die Kalibrierkurve durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten wurde unter Benutzung einer Standardlösung, die Anti­ streptolysin O Antikörper als Testprobenlösung enthält, und unter Verwendung eines auf einer Mikrotiterplatte als Bindemittel immobilisierten Streptolysin O;

Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, die die Beziehung zwischen dem Antistreptolysin O Antikörpertiter zeigt, der in Beispiel 4 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt wurde unter Verwendung einer Mikrotiterplatte mit immobilisiertem Streptolysin O als Bindemittel und dem Antistreptolysin O Antikörpertiter bestimmt nach dem Verfahren von Rantz-Randall.

Im wesentlichen wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung des Antistreptolysin O Antikörpers zur Verfügung gestellt, das folgende Schritte umfaßt:

• a) eine Testprobenlösung, die den Antistreptolysin O Antikörper enthält, wird mit einem Bindemittel in Kontakt gebracht, das in der Lage ist, spezifisch den Antistreptolysin O Antikörper zu binden, wobei der Antistreptolysin O Antikör­ per mit dem Bindemittel selektiv durch eine Antigen-Antikörper Reaktion verbunden wird und
• b) Bestimmung der Menge des Antistreptolysin O Antikörpers, der durch das Bindemittel gebunden ist,
  wobei das Bindemittel einen Träger für das immobilisierte Streptolysin O umfaßt, der dadurch erhalten wird, daß man eine Lösung, die das Streptolysin O enthält, mit einem Träger in Kontakt bringt, auf dem wenigstens ein Steroid immobilisiert ist, das durch die Formel (1) dargestellt wird:
  wobei R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Seitenkettenteil des Cholesterols und einem Seitenkettenteil der Cholsäure, wobei jeder der Seitenkettenteile unsubstituiert oder substituiert und gesättigt oder ungesättigt ist;
  worin R² Wasserstoff oder Hydroxyl bedeutet; und wobei jede unterbrochene Linie eine Einfachbindung oder keine Bindung bedeutet, so daß jede unterbrochene Linie und eine da­ nebenliegende durchgezogene Linie zusammen entweder eine Doppelbindung oder eine Einfachbindung bedeuten.

In R¹ der Formel (1), das aus der Gruppe bestehend aus einem Seitengruppenteil des Cholesterols und einem Seitenkettenteil der Cholsäure ausgewählt ist, ist jedes der Seitenkettenteile unsubstituiert oder substituiert mit Hydroxyl, einem Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis 2 Kohlenstoffatomen oder einer Acylgruppe mit 2 bis 4 Kohlen­ stoffatomen, vorzugsweise 2 bis 3 Kohlenstoffatomen und gesättigt oder ungesättigt mit einer oder 2 Doppelbindungen. Ein spezielles Beispiel für eine solche Seitengruppeneinheit von Cholesterol ist eine Gruppe, wie sie in Formel (2) dargestellt wird

wobei R³ Wasserstoff, Hydroxyl, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 2 Kohlenstoffatomen, eine Acylgruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 3 Kohlenstoffatomen bedeutet; R⁴ Wasserstoff, Hydroxyl, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 2 Kohlenstoffatomen oder eine Acylgruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 3 Kohlenstoffatomen bedeutet; R⁵ Wasserstoff, Hydroxyl, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 2 Kohlenstoffatomen, oder eine Acylgruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, vorzugs­ weise 2 bis 3 Kohlenstoffatomen bedeutet; und jede unter­ brochene Linie eine einfache Bindung oder keine Bindung bedeutet, so daß jede unterbrochene Linie zusammen mit der danebenliegenden durchgezogenen Linie entweder eine Doppelbin­ dung oder eine Einfachbindung bedeutet.

In bevorzugten Beispielen einer solchen Gruppe der Formel (2) bedeuten R³ und R⁴ Wasserstoff und R⁵ Wasserstoff, Hydroxyl, Methyl oder Ethyl. Spezifische bevorzugte Beispiele von Gruppen der Formel (2) schließen entsprechende Seitenketten­ einheiten von Cholesterol, β-Sitosterol, Stigmasterol, Campesterol, Ergosterol, Cerebrosterol und Desmosterol ein.

Ein besonderes Beispiel eines solchen Seitenkettenteils der Cholsäure wird durch die Gruppe von Formel (3) dargestellt:

wobei die unterbrochene Linie eine Einfachbindung oder keine Bindung bedeutet, so daß die unterbrochene Linie zusammen mit der danebenliegenden durchgezogenen Linie eine Doppelbindung oder eine Einfachbindung bedeutet.

Spezifische Beispiele von Steroiden, die durch die Formel (1) dargestellt werden, umfassen Cholesterol, 7-Dehydrocholeste­ rol, Cholestanol, Coprostanol, Δ⁷-Cholestenol, Δ⁷-Coprosterol, β-Sitosterol, 7-Dehydro-β-Sitosterol, Stigmasterol, 7- Dehydrostigmasterol, Campesterol, 7-Dehydrocampesterol, Stigmastanol, Δ⁷-Stigmastenol, 11α-Hydroxycholesterol, Δ²²- Stigmasterol, α-Spinasterol, Campestanol, Δ⁷-Campestenol, 20α- Hydroxycholesterol, Brassicasterol, Ergosterol, Cerebrosterol, 7-Dehydrocerebrosterol, Cerebrostanol, Δ⁷-Cerebrostenol, Desmosterol, 7-Dehydrodesmosterol, 3β-Hydroxycholansäure und 3β-Hydroxy-Δ⁵-Cholensäure.

Bevorzugte Beispiele von Steroiden der Formel 1 umfassen Cholesterol, 7-Dehydrocholesterol, Cholestanol, Coprostanol, Δ⁷-Cholestenol, Δ⁷-Coprostenol, β-Sitosterol, 7-Dehydro-β- Sitosterol, Stigmasterol, 7-Dehydrostigmasterol, Campesterol und 7-Dehydrocampesterol. Unter diesen Steroiden sind besonders bevorzugt Cholesterol, 7-Dehydrocholesterol, Cholestanol, Coprostanol, Δ⁷-Cholestenol und Δ⁷-Coprostenol.

Diese Steroide können alleine oder in Kombination verwendet werden.

Die Steroide der Formel (1) können auf der Oberfläche des Bindemittels durch ein Verfahren immobilisiert werden, das ansich gut bekannt ist. Zum Beispiel kann die Immobilisierung des Steroids auf dem Träger durch physikalische Absorption des Steroids auf der Oberfläche des Trägers oder durch chemische Bindung eines reaktiven Derivats des Steroides mit der Oberfläche des Trägers erfolgen, der eine funktionelle Gruppe trägt, die mit dem Derivat reagieren kann oder aktiviert wird, um mit dem Derivat reagieren zu können.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sollte das immobilisierte Steroid vorzugsweise in einer Menge von 0,025 nmol/cm² bis 250 nmol/cm², ganz besonders bevorzugt zwischen 0,25 nmol/cm² bis 25 nmol/cm², bezogen auf die Oberfläche des Trägers, vorhanden sein.

Hinsichtlich des Materials, seiner Morphologie, seiner Größe und ähnlichen Eigenschaften des für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzten Trägers gibt es keine besondere Beschränkung, solange das erfindungsgemäße Verfahren be­ friedigend durchgeführt werden kann. Beispiele von Materialien für Träger schließen Polymere wie Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, ein Acrylnitril-Butadien-Styrol Copolymer, ein Butadien-Styrol Copolymeres, Polycarbonat, Polyvinylchlorid, Polyvinylidenchlorid, Polyamid, Polymethylmethacrylat, Polymethylpenten, Polyacetal, Polyvinylacetat, Polyvinylalko­ hol, Polyvinylbutyral, Polyisobutylen, ein Vinylchlorid- Vinylacetat Copolymer, einen Fluor enthaltenden Kunststoff (Polytetrafluorethylen, ein Tetrafluorethylen-Ethylen Copolymer, ein Perfluoralkoxy Copolymer oder ähnliche Polymere), Polyacrylnitiril, Polystyrolacrylat, Polyethylente­ rephthalat, Polybutylenterephthalat, Polyurethan, ein Harnstoffharz, ein Epoxyharz, ein Melaminharz, ein pheno­ lisches Harz, ein ungesättigtes Polyesterharz, ein Sili­ konharz, Nitrocellulose, Celluloseacetat, Celluloseacetat- Butyrat, Celluloseacetat-Propionat, Cellulosepropionat, Ethylcellulose, Carboxymethylcellulose und Polyvinylidendi­ fluorid ein. Geeignet sind auch Polymere, die funktionelle Gruppen enthalten, die z. B. bei einem Verfahren gewonnen werden, bei dem bei der Herstellung der vorstehend genannten Polymere eine Verbindung mit funktionellen Gruppen wie der Carboxyl-, Nitril-, primären oder sekundären Amino-Gruppe in das Polymer durch Copolymerisation eingeführt wird oder bei denen eine derartige funktionelle Gruppe durch eine Ober­ flächenbehandlung auf der Oberfläche der vorstehend genannten Polymere erzeugt wird. Weitere Beispiele für Trägermaterialien schließen Glas und Metall ein.

Bei der vorliegenden Erfindung können das Material, die Morphologie, die Größe und ähnliche Eigenschaften des Trägermaterials die gleichen sein wie die von üblicherweise verwendeten Trägern, die in konventionellen immunologischen Bestimmungsverfahren eingesetzt werden.

Vorzugsweise sollte der Träger, der erfindungsgemäß benutzt wird, ein kolloides Partikelchen sein, eine Perle, eine Kugel, eine Mikrotiterplatte, ein Teströhrchen oder eine Membran. Der Durchmesser des kolloidalen Partikelchens ist im allgemeinen zwischen etwa 0,01 µm bis ungefähr 10 µm. Der Durchmesser einer Perle beträgt im allgemeinen nicht mehr als etwa 7 mm. Der Durchmesser einer Kugel ist im allgemeinen nicht größer als etwa 10 mm.

Ein Beispiel für spezifische Methoden zur Immobilisierung von Steroiden der Formel (1) auf einem Träger durch physikalische Absorption ist im folgenden erklärt. Wenn beispielsweise ein kolloidales Latexpartikelchen als Träger benutzt wird, dann wird das Steroid mit dem kolloidalen Latexpartikelchen in einem hydrophilen oder lipophilen Lösungsmittel in Kontakt gebracht, wobei am besten Ethanol oder Methanol geeignet sind, die das Steroid auflösen, dispergieren oder suspendieren können, ohne die Struktur oder sonstige Eigenschaften des kolloidalen Latexmaterials ungünstig zu beeinflussen. Das Steroid und die kolloidalen Latexpartikelchen reagieren dann miteinander während des Rührens, Schüttelns oder des ruhigen Stehenlassens im allgemeinen zwischen 0 und 60°C, vorzugs­ weise zwischen 4°C und 30°C, im allgemeinen in 30 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise in 1 bis 10 Stunden. Falls gewünscht, werden anschließend die resultierenden La­ texpartikel mit dem immobilisierten Steroid darauf mit Wasser oder einem geeigneten Puffer gewaschen.

Bei der vorstehend genannten Reaktion beträgt die Konzen­ tration der Feststoffe, d. h. die Konzentration der Lat­ expartikel in der Reaktionsmischung im allgemeinen 0,01 (Gew./Vol.)% bis 10 (Gew./Vol.)%, vorzugsweise 0,05 (Gew./Vol.)% bis 5 (Gew./Vol.)%, und die Konzentration des Steroides in der Reaktionsmischung beträgt im allgemeinen 0,01 µg/ml bis 10 mg/ml, vorzugsweise 1 µg/ml bis 1 mg/ml. Die Reaktionsmischung kann Wasser oder kann auch jedes andere Lösungsmittel enthalten, solange die Struktur der kolloidalen Latexpartikel und die Umsetzungsreaktion nicht ungünstig beeinflußt werden. Beispiele für andere Lösungsmittel umfassen Chloroform, Aceton, Hexan, Dichlorethan, Propanol, Isopro­ panol, Xylol, Toluol, Benzol, Äther, Petroleumäther, Methyl­ acetat und Ethylacetat. Wenn eine Perle oder eine Kugel als Trägermaterial verwendet wird, dann kann die Immobilisierung des Steroids auf dem Träger nach ähnlichen Methoden durch­ geführt werden, wie sie oben beschrieben sind für die Immobilisierung des Steroids auf den kolloidalen Latexparti­ keln unter Anwendung von Reaktionsbedingungen, die die Struktur der Perle oder der Kugel nicht zerstören, wobei die Oberfläche, das Volumen und die Zahl der Perlen und Kugeln zu berücksichtigen sind.

Wenn eine Mikrotiterplatte als Träger benutz wird, dann kann die Immobilisierung des Steroides auf dem Träger beispiels­ weise nach folgendem Verfahren durchgeführt werden: Das Steroid wird in einem hydrophilen oder lipophilen Lösungs­ mittel gelöst, dispergiert oder suspendiert, wobei Ethanol und Methanol besonders geeignet sind, die das Steroid lösen, dispergieren oder suspendieren können, ohne die Struktur und die sonstigen Eigenschaften der Mikrotiterplatte ungünstig zu beeinflussen, wobei im allgemeinen eine Konzentration von 1 µg/ml bis 10 mg/ml, vorzugsweise von 10 µg/ml bis 1 mg/ml eingesetzt wird. Die erhaltene Lösung, Dispersion oder Suspension wird dann in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte eingetragen in einer Menge von im allgemeinen 25 µl bis 200 µl pro Vertiefung, vorzugsweise von 50 µl bis 100 µl pro Vertiefung und dann im allgemeinen bei 0°C bis 60°C, vorzugsweise bei 4°C bis 30°C, im allgemeinen 30 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 1 Stunde bis 6 Stunden stehengelas­ sen, wobei die Reaktion stattfindet. Danach werden die Vertiefungen mit Wasser oder einem geeigneten Puffer ge­ waschen.

Bei der vorstehend beschriebenen Reaktion kann die Reaktions­ mischung Wasser oder auch jedes andere Lösungsmittel enthal­ ten, solange die Struktur der Mikrotiterplatte und die Umsetzungsreaktion nicht ungünstig beeinflußt werden. Beispiele für solche anderen Lösungsmittel sind Chloroform, Aceton, Hexan, Dichlorethan, Propanol, Isopropanol, Xylol, Toluol, Benzol, Äther, Petroläther, Methylacetat und Ethyl­ acetat.

Ein anderes Beispiel für ein Verfahren zur Immobilisierung des Steroids auf einem Träger ist im folgenden erklärt: Das Steroid wird in einem hydrophilen oder lipophilen Lösungs­ mittel gelöst, dispergiert oder suspendiert, wobei Ethanol oder Methanol am besten geeignet sind, die das Steroid lösen, dispergieren oder suspendieren können, ohne die Struktur und andere Eigenschaften der Mikrotiterplatte ungünstig zu beeinflussen. Die Konzentration des Steroids beträgt dabei zwischen 100 ng/ml bis 1 mg/ml, vorzugsweise 1 µg/ml bis 100 µg/ml. Die erhaltene Lösung, Dispersion oder Suspension wird dann in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte in einer Menge von im allgemeinen zwischen 25 µl bis 200 µl pro Vertiefung, vorzugsweise zwischen 50 µl und 100 µl pro Vertiefung gegeben und bleibt dann bei 20°C bis 90°C ruhig stehen, vorzugsweise bei 40°C bis 70°C, wobei das Lösungsmittel verdunstet und entfernt wird. Danach werden die Vertiefungen mit Wasser oder einem geeigneten Puffer gewaschen.

Wenn beispielsweise ein Teströhrchen als Träger verwendet wird, dann kann die Immobilisierung des Steroids auf einem Träger in ähnlicher Weise durchgeführt werden, wie es vorstehend für die Immobilisierung des Steroids auf einer Mikrotiterplatte beschrieben ist, wobei Bedingungen gewählt werden, die die Struktur des Teströhrchens nicht beschädigen, wobei Faktoren wie das innere Volumen des Teströhrchens berücksichtigt werden müssen.

Wird beispielsweise eine Membran als Träger benutzt, dann kann die Immobilisierung des Steroids auf dem Träger nach dem folgenden Verfahren durchgeführt werden. Das Steroid wird in einem hydrophilen oder lipophilen Lösungsmittel gelöst, dispergiert oder suspendiert, wobei Ethanol und Methanol am besten geeignet sind, die das Steroid lösen, dispergieren oder suspendieren können, ohne die Struktur der Membran ungünstig zu beeinflussen. Die erhaltene Lösung, Dispersion oder Suspension wird dann mit der Membran nach einem üblichen Verfahren in Berührung gebracht, beispielsweise nach einem Verfahren, bei dem ein Punkt-Blotting verwendet wird, so daß das Steroid auf der Membran in einer Menge von im allgemeinen zwischen 0.025 nmol/cm² bis 250 nmol/cm², vorzugsweise zwischen 0,25 nmol/cm² bis 25 nmol/cm², bezogen auf die Oberfläche der Membran, immobilisiert wird. Bei dem vorstehend beschriebenen Immobilisierungsverfahren, das ein Punkt- Blotting verwendet, ist die Fleckgröße nicht besonders beschränkt und kann aus einem geeigneten Bereich ausgewählt werden und die Lösung, Dispersion oder Suspension des Steroides kann Wasser enthalten, kann aber auch irgendein anderes Lösungsmittel enthalten, solange die Struktur der Membran und die Reaktion nicht ungünstig beeinflußt werden. Beispiele für solche anderen Lösungsmittel umfassen Chloro­ form, Aceton, Hexan, Dichlorethan, Propanol, Isopropanol, Xylol, Toluol, Benzol, Äther, Petroläther, Methylacetat und Ethylacetat.

Die chemische Bindung des Steroids auf den Träger kann durch ein Verfahren durchgeführt werden, mit dem eine funktionelle Gruppe wie die Carboxyl-, Hydroxyl-, Thiol-, primäre Amino-, sekundäre Amino-, Amido-, Nitro- oder Aldehyd- Gruppe in das Steroid eingeführt wird, um ein reaktives Derivat des Steroids zu erhalten. Dabei wird dann das erhaltene reaktive Derivat des Steroids chemisch an der Oberfläche des Trägers gebunden, die eine funktionelle Gruppe trägt, die mit der funktionellen Gruppe des reaktiven Steroidderivats reagiert. Die Oberfläche des Trägers kann aber auch aktiviert werden, um mit dem Derivat nach einem an sich bekannten Verfahren reagieren zu können. Ein Verfahren ist zum Beispiel beschrieben in "Jikken- to-oyo-Affinity Chromatography (Experiments and Application: Affinity Chromatography)", Chibata, I., Tosa, T., Matsuo, Y.: pp. 30-109, Kodansha K. K., Japan, September 10, 1976, oder in "Koso Men-eki Sokuteiho (Enzyme Immunoassay)"; herausgegeben von Ishikawa, E., Kawai, T., Muroi, K., Third Edition, pp. 75- 151, Igaku Shoin K. KI., Japan, May 15, 1987.

Ein Beispiel für ein Verfahren zur chemischen Bindung des Steroids auf dem Träger ist im folgenden erklärt: Ein Steroid, dargestellt durch die Formel (4):

wird als Ausgangsmaterial benutzt, wobei R⁶ ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einem Seitenkettenteil des Cholesterols und einem Seitenkettenteil der Cholsäure, wobei jedes der Seitenkettenteile unsubstituiert oder substituiert und gesättigt sein kann, wobei R⁷ Wasserstoff oder Hydroxyl ist; und wobei jede durchbrochene Linie eine Einfachbindung oder keine Bindung darstellt, so daß jede durchbrochene Linie und jede danebenliegende durchgezogene Linie zusammen eine Doppelbindung oder eine Einfachbindung bilden, wobei jedoch wenigstens eine unterbrochene Linie eine Einfachbindung darstellt.

Eine funktionelle Gruppe wie die Carboxyl-, primäre Amino-, sekundäre Amino-, Amido-, Nitro- oder Aldehydgruppe wird in das Steroid der Formel (4) durch ein Verfahren eingeführt, bei dem zunächst ein 5,6-Epoxy, 7,8-Epoxy oder 14,15-Epoxy Derivat des Steroids hergestellt wird und dann eine funktionelle Gruppe eingeführt und an der 6-, 7- oder 15-Stellung des Steroids durch eine Thioetherbindung, erhalten durch eine Ringöffnungsreaktion des Epoxyderivats des Steroids, gebunden wird in Übereinstimmung mit einem Verfahren, das beschrieben ist von Hosoda, H., et al.; Chem. Phar. Bull., Vol. 28, pp. 1294-1299, 1980. Danach wird das entstandene Derivat des Steroids auf der Oberfläche des Trägers gebunden, wobei die Oberfläche des Trägers eine funktionelle Gruppe trägt, die mit dem Derivat reagieren kann.

Dieses Verfahren ist weiter unten durch ein Beispiel erklärt.

Beispielsweise wird ein Steroid, dargestellt durch die Formel (4), das eine Doppelbindung zwischen der 7. und 8. Stellung trägt, wie Δ⁷-Cholestenol, Δ⁷-Coprostenol, Δ⁷-Stigmastenol, Δ⁷- Campestenol oder Δ⁷-Cerebrostenol als Ausgangsmaterial verwendet und dann eine Carboxylgruppe in die 7-Stellung des Ausgangsmaterials eingeführt, um dadurch ein reaktives Derivat des Steroids zu erhalten.

Das obengenannte, als Ausgangsmaterial verwendete Steroid wird dann mit einem Peroxid (vorzugsweise Wasserstoffperoxid) und mit einem alkalischen Reagenz (vorzugsweise Natriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd) in einem hydrophilen organischen Lösungsmittel (vorzugsweise Methanol oder Ethanol) in Kontakt gebracht, das das Steroid lösen, dispergieren oder suspendie­ ren kann, wobei die resultierende Mischung dann einer Reaktion unter Rühren, Schütteln oder Stillstehen unterworfen wird. Dabei werden im allgemeinen Temperaturen von 0°C bis 40°C, vorzugsweise 0°C bis 10°C, im allgemeinen 30 Minuten bis 12 Stunden lang, vorzugsweise 1 bis 6 Stunden lang angewendet, um eine Reaktionsmischung zu erhalten, die ein Epoxyderivat des Ausgangsmaterials enthält. Danach wird die Reaktions­ mischung neutralisiert.

Die vorstehend genannte Reaktion wird unter solchen Bedingun­ gen durchgeführt, daß die Konzentration des Steroids als Ausgangsmaterial im allgemeinen zwischen 0,01 mmol/ml bis 1 mmol/ml, vorzugsweise zwischen 0,05 mmol/ml bis 0,5 mmol/ml liegt, während die Konzentration des Peroxids im allgemeinen zwischen 0,1 (Gew./Vol.)% bis 10 (Gew./Vol.)%, vorzugsweie zwischen 0,5 (Gew./Vol.)% bis 5 (Gew./Vol.)% liegt und die Konzentration des alkalischen Reagenzes im allgemeinen zwischen 0,5 (Gew./Vol.)% bis 10 (Gew./Vol.)%, vorzugsweise zwischen 1 (Gew./Vol)% bis 5 (Gew./Vol.)% liegt und der Wassergehalt vorzugsweise nicht höher als 20 (Vol./Vol.)% ist.

Die Isolierung des entstandenen Epoxyderivats kann in Übereinstimmung mit einer bekannten Methode durchgeführt werden, die z. B. beschrieben ist in "Sei-kagaku Kenkyu-ho I (Methods for Biochemical Research I)", Seventh Edition; herausgegeben von Ando E., Terayama, H., Nishizawa, K., and Yamakawa, T. und veröffentlicht von Asakura Shoten K. K., Japan, pp. 49-96 (March 20, 1973).

Danach wird das erhaltene Epoxyderivat mit einer Mercapto­ monocarbonsäure (vorzugsweise 2-Mercaptoessigsäure, 3- Mercaptopropionsäure oder ähnlichen Verbindungen) und einem alkalischen Reagenz (vorzugsweise Natriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd) in einem hydrophilen organischen Lösungs­ mittel, am besten Methanol oder Ethanol, das das Epoxyderivat lösen, dispergieren oder suspendieren kann, zusammengebracht. Die erhaltene Mischung wird dann unter Rühren, Schütteln oder Stillstehen einer Reaktion unterworfen, wobei im allgemeinen Temperaturen von 0°C bis 60°C, vorzugsweise 10°C bis 40°C, im allgemeinen 30 Minuten bis 12 Stunden, vorzugsweise 1 Stunde bis 6 Stunden angewendet werden, wobei anschließend der pH-Wert der Reaktionsmischung geändert und ein Wert im sauren Bereich eingestellt wird, wodurch ein Derivat des Steroids (welches als Ausgangsmaterial benutzt werden soll) erhalten wird, das eine Carboxylgruppe in der 7-Stellung gebunden durch eine Thioetherbindung, trägt.

Die vorstehend genannte Reaktion wird unter solchen Bedingun­ gen durchgeführt, daß im Reaktionssystem die Konzentration des Epoxyderivats im allgemeinen zwischen 0,01 mmol/ml bis 1 mmol/ml, vorzugsweise zwischen 0,05 mmol/ml bis 0,5 mmol/ml liegt, die Konzentration der Mercaptomonocarbonsäure im allgemeinen zwischen 0,05 mmol/ml bis 5 mmol/ml, vorzugsweise zwischen 0,1 mmol/ml bis 1 mmol/ml beträgt, die Konzentration des alkalischen Reagenzes im allgemeinen zwischen 0,5 (Gew./Vol.)% bis 10 (Gew./Vol.)%, vorzugsweise zwischen 1 (Gew./Vol.)% bis 5 (Gew./Vol.)% und der Wassergehalt vorzugsweise nicht höher als 20 (Vol./Vol.)% ist.

Die Reaktionsmischung kann Dioxan und ähnliche Verbindungen enthalten. Die Isolierung des hergestellten, eine funktionelle Gruppe tragenden Derivats kann in Übereinstimmung mit der gleichen Methode durchgeführt werden, die für die Isolierung des Epoxyderivats angewendet wird.

Bei dem vorstehenden Verfahren wird von den Steroiden, die durch die Formel (4) dargestellt sind, ein Steroid mit einer Doppelbindung zwischen der 7- und 8-Stellung wie Δ⁷-Choleste­ nol, Δ⁷-Coprostenol, Δ⁷-Stigmastenol, Δ⁷-Campestenol oder Δ⁷- Cerebrostenol als Ausgangsmaterial eingesetzt und dann die Carboxylgruppe in die 7-Stellung des Ausgangsmaterials eingeführt. Dadurch wird ein reaktives Derivat des Steroids erhalten, z. B. ein Cholestenolderivat, ein Coprostenolderivat, ein Stigmastenolderivat, ein Campestenolderivat oder ein Cerebrostenolderivat, das eine Carboxylgruppe trägt, die in 7-Stellung durch eine Thioethergruppe gebunden ist.

In Übereinstimmung mit dem vorstehenden Verfahren ist es möglich, daß ein Steroid, das durch die Formel (4) dargestellt wird, und eine Doppelbindung zwischen der 5- und 6-Stellung wie Cholesterol, β-Sitosterol, Campesterol oder Cerebrosterol trägt, als Ausgangsmaterial verwendet wird. Dann wird die Carboxylgruppe in die 6-Stellung des Ausgangsmaterials eingeführt wird, um dadurch ein reaktives Derivat des Steroids zu erhalten wie z. B. ein Cholestanolderivat, ein Stigmastanol­ derivat, ein Campestanolderivat oder ein Cerebrostanolderivat, das eine Carboxylgruppe trägt, die an der 6-Stellung durch eine Thioethergruppe gebunden ist.

Das eine Carboxylgruppe tragende reaktive Derivat des Steroids kann dann mit einer Aminogruppe, die sich auf der Oberfläche des Trägers befindet, nach einem bekannten Verfahren gebunden werden, beispielsweise nach der Säureanhydridmethode, der Carbodiimidmethode oder der N-Hydroxybernsteinsäureimid­ methode, um dadurch das Steroid auf der Oberfläche des Trägers zu immobilisieren. Die Immobilisierung des Streptolysin O auf der Oberfläche des Trägers, der bereits ein darauf immobili­ siertes Steroid trägt, kann beispielsweise dadurch durch­ geführt werden, daß man den Träger, der das immobilisierte Steroid trägt, mit Streptolysin O in Wasser oder einem geeigneten Puffer reagieren läßt.

Erfindungsgemäß wird bevorzugt, daß das immobilisierte Streptolysin O auf dem Träger in einer Menge von 0,001 pmol/cm² bis 1 nmol/cm², vorzugsweise von 0,01 pmol/cm² bis 100 pmol/cm², bezogen auf die Oberfläche des Trägers, anwesend ist.

Das Streptolysin O, das erfindungsgemäß verwendet wird, kann von beliebiger Art sein, solange es eine Bindungsaktivität gegenüber dem erfindungsgemäß verwendeten Steroid zeigt und für die Antigen-Antikörper Reaktion mit dem Antistreptolysin O Antikörper empfindlich ist. Streptolysin O, ein Derivat davon oder eine Variante kann eingesetzt werden. Diese Materialien sind solche, die beispielsweise von hämolytischen Streptokokken der Gruppen A, B oder C gebildet werden oder die durch gentechnologische Methoden von Wirtszellen, z. B. transformierten Mikroorganismen wie Echerichia Coli, Hefe oder ähnlichen Zellen gebildet werden.

Bei der vorliegenden Erfindung kann jede Streptolysin O- ähnliche Substanz, die Bindungsaktivität zu dem erfindungs­ gemäß verwendeten Steroid zeigt und gegenüber der Antigen- Antikörper Reaktion mit Antistreptolysin O Antikörper empfindlich ist, anstelle von Streptolysin O verwendet werden. Z. B. kann auch ein synthetisiertes Protein oder ein syn­ thetisiertes Peptid, das eine solche Aminosäurestruktur hat, daß dem Streptolysin O teilweise oder völlig die hämolytisch aktive Stelle fehlt, eingesetzt werden. Das erfindungsgemäß verwendete Streptolysin O braucht nicht notwendigerweise von hoher Reinheit zu sein. Wenn jedoch das Streptolysin O eine Hemmsubstanz enthält, welche die Bindungsreaktion des Streptolysin O mit dem Steroid der Formel (1) oder mit dem Streptolysin O Antikörpern verhindert, dann ist es wünschens­ wert, das Streptolysin O angemessen zu reinigen, um die Hemmsubstanz zu entfernen.

Es ist bequem, ein handelsübliches Streptolysin O zu verwen­ den. Beispiele für handelsübliche Streptolysin O-Produkte schließen die ein, die verkauft werden von Eiken Chemical Co., Ltd., Japan; Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Japan; Corpora­ tion Japan Lyophilization Laboratory, Japan; Difco Laborato­ ries, U.S.A.; and Sigma Chemical Company, U.S.A.

Hinsichtlich der Puffer, die erfindungsgemäß benutzt werden, gibt es keine besondere Beschränkung und alle üblichen Puffer können verwendet werden. Es ist wünschenswert, solche Puffer zu verwenden, die einen pH-Wert im Bereich zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 6 und 8 haben. Beispielsweise Phosphat­ puffer, Borsäurepuffer, Carbonsäurepuffer, Trispuffer, Veronalpuffer und Good's Puffer (z. B. HEPES Puffer, PIPES Puffer und MES Puffer) können benutzt werden.

Falls es zur Stabiliserung des Streptolysin O oder zur Verhinderung der unspezifischen Absorption von Proteinen auf dem Träger erwünscht ist, können solche Additive wie Rinderse­ rumalbumin (BSA), Gelatine, Magermilch, Proteine (z. B. aus der Milch gewonnene Proteine), Saccharide, Glycerin, Ethylen­ glykol, ein Gelat-Bildner oder ein Reduktionsmittel zu dem Wasser oder dem eingesetzten Puffer zugefügt werden. Diese Zusatzstoffe können in Mengen eingesetzt werden, die in üblichen immunologischen Bestimmungsverfahren für Antistrepto­ lysin O Antikörper benutzt werden, bei denen die Antigen- Antikörper Reaktion stattfindet. Streptolysin O ist relativ unstabil in einer wässrigen Lösung und es ist deshalb zur Stabilisierung wünschenswert, zum Wasser oder zum Puffer ein Additiv hinzuzusetzen wie Rinderserumalbumin (BSA), Gelatine, Magermilch oder ein Protein (z. B. ein aus der Milch gewonnenes Protein) in einer Menge von im allgemeinen 0,01 (Gew./Vol.) % bis 10 (Gew. /Vol.)%, vorzugsweise von 0,1 (Gew./Vol.)% bis 1 (Gew./Vol.)%.

Zur Verhinderung der unspezifischen Absorption von Proteinen auf dem Träger kann es wünschenswert sein, daß der Träger mit dem darauf immobilisierten Steroid mit einer Lösung behandelt wird, die durch Auflösung eines Additivs wie Rinderserumalbu­ min (BSA), Gelatine, Magermilch oder Proteinen (die aus Milch gewonnen werden) in Wasser oder einem Puffer erhalten wird. Die Konzentration des Zusatzstoffes in der Lösung kann in geeigneter Weise aus den Konzentrationsbereichen ausgewählt werden, die für solch eine Lösung üblicherweise verwendet werden, beispielsweise bei den konventionellen immunologischen Bestimmungsverfahren, die die Antigen-Antikörper Reaktion verwenden. Die Konzentration des Additivs in einer derartigen Lösung ist im allgemeinen zwischen 0,05 (Gew./Vol.)% bis 10 (Gew./Vol.)%, vorzugsweise 0,5 (Gew./Vol.)% bis 5 (Gew./Vol.)%.

Bei der vorliegenden Erfindung können die Bedingungen zur Immobilisierung von Streptolysin O auf einem Träger, der bereits ein immobilisiertes Steroid trägt, variiert werden in Abhängigkeit von Faktoren wie der Reinheit des Streptolysin O, der Streptolysin O-Konzentration in der eingesetzten Streptolysin O enthaltenden Lösung, der Art des Trägers und des Prinzips des entsprechenden Nachweisverfahrens, das für die Bestimmung des Streptolysin O Antikörpers verwendet wird, der an das Bindemittel gebunden wird. Unter Berücksichtigung der vorstehenden Faktoren kann beispielsweise die Immobilie­ rung von Streptolysin O auf einem Träger, der bereits ein immobilisiertes Steroid trägt, in Übereinstimmung mit dem folgenden Verfahren durchgeführt werden:

Wenn das Streptolysin O auf kolloidalen Latexpartikelchen immobilisiert werden soll, die bereits ein immobilisiertes Steroid tragen, dann kann die Immobilisierung von Streptolysin O beispielsweise nach dem folgenden Verfahren durchgeführt werden:

Eine wässrige Lösung mit einem Proteingehalt von 0,5 mg/ml bis 1 mg/ml, in der das Protein einen Streptolysin O-Gehalt von 5 bis 10 (Gew.)% hat, wird eingesetzt und die Streptolysin O-Lösung wird mit Wasser oder dem obengenannten Puffer auf das 1 bis 10.000-fache verdünnt, vorzugsweise auf das 10 bis 1.000-fache. In der resultierenden verdünnten Streptolysin O- Lösung werden die Latexpartikelchen, die das immobilisierte Steroid bereits tragen, in einer solchen Menge suspendiert, daß die Konzentration der Latexpartikelchen (d. h. die Feststoffkonzentration) im allgemeinen zwischen 0,01 (Gew./Vol.)% bis 10 (Gew./Vol.)%, vorzugsweise 0,05 (Gew./Vol.)% bis 5 (Gew./Vol.)% beträgt. Die entstehende Suspension wird dann zur Reaktion gebracht, indem man sie im allgemeinen bei 0°C bis 40°C, vorzugsweise bei 4°C bis 30 °C im allgemeinen 10 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten bis 12 Stunden ruhig stehenläßt, rührt oder schüttelt. Danach können die entstandenen Latexpartikelchen, die immobilisiertes Streptolysin O tragen, mit Wasser oder einem Puffer gewaschen werden.

Die Latexpartikelchen mit immobilisiertem Streptolysin O, die nach der vorstehend beschriebenen Methode erhalten wurden, können vorteilhaft eingesetzt werden, um den Antistreptolysin O Antikörper beispielsweise nach dem Prinzip des Immun- Agglutinierungs-Nachweises zu bestimmen.

Wenn als Träger eine mit immobilisiertem Steroid versehene Perle oder Kugel eingesetzt wird, kann die Immobilisierung des Streptolysin O auf dem das immobilisierte Steroid tragenden Träger durch ein ähnliches Verfahren durchgeführt werden, wie es vorstehend für die Immobilisierung von Streptolysin O auf den kolloidalen Latexpartikeln beschrieben ist, auf denen Steroid immobilisiert ist, wobei solche Faktoren wie die Oberfläche, das Volumen und die Zahl der Perlen und Kugeln beachtet werden müssen. Die das immobilisierte Streptolysin O tragende Perle oder Kugel, die nach dem vorstehenden Verfahren erhalten wurden, können vorteilhaft zur Bestimmung von Streptolysin O Antikörper benutzt werden, beispielsweise durch einen Enzym-Immunoassay oder einen Fluor-Immunoassay.

Wenn das Streptolysin O auf einer Mikrotiterplatte immobili­ siert werden soll, die bereits ein immobilisiertes Steroid trägt, dann kann die Immobilisierung des Streptolysin O beispielsweise nach dem folgenden Verfahren durchgeführt werden:

Eine wässrige Lösung mit einem Proteingehalt von 0,5 mg/ml bis 1 mg/ml, wobei das Protein einen Streptolysin O-Gehalt von 5 bis 10 (Gew.)% hat, wird eingesetzt und die Streptolysin O- Lösung mit Wasser oder dem obengenannten Puffer im allgemeinen auf das 10- bis 10.000-fache, vorzugsweise 100- bis 1.000- fache verdünnt. Die verdünnte Lösung wird dann in die Vertiefungen der das immobilisierte Steroid tragenden Mikrotiterplatte in einer Menge von im allgemeinen 25 µl bis 200 µl pro Vertiefung, vorzugsweise 50 µl bis 100 µl pro Vertiefung eingetragen und im allgemeinen bei 0°C bis 40°C, vorzugsweise bei 4°C bis 30°C, im allgemeinen 10 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten bis 20 Stunden stehenge­ lassen (wobei die Reaktion eintritt). Danach werden die Vertiefungen mit Wasser oder einem geeigneten Puffer ge­ waschen.

Die das immobilisierte Streptolysin O enthaltende Mikrotiter­ platte, die nach dem vorstehend genannten Verfahren erhalten wurde kann vorteilhaft zur Bestimmung von Antistreptolysin O Antikörper beispielsweise mit einem Enzym-Immunoassay, einem Radio-Immunoassay oder einem Fluor-Immunoassay verwendet werden.

Wenn beispielsweise ein Teströhrchen mit einem immobilisierten Steroid als Träger benutzt wird, dann kann die Immobilisierung des Streptolysin O auf dem das immobilisierte Steroid tragenden Träger nach einem ähnlichen Verfahren durchgeführt werden, wie es oben für die Immobilisierung von Streptolysin O auf einer das immobilisierte Steroid tragenden Mikrotiter­ platte beschrieben ist, wobei solche Faktoren wie das innere Volumen des Teströhrchens beachtet werden müssen.

Das das immobilisierte Streptolysin O enthaltende Teströhr­ chen, das nach dem vorstehend genannten Verfahren erhalten wurde, kann vorteilhaft benutzt werden zur Bestimmung des Antistreptolysin O Antikörpers beispielsweise mittels eines Enzym-Immunoassays, eines Radio-Immunoassays oder eines Fluor- Immunoassays.

Wenn das Streptolysin O auf einer Membran immobilisiert werden soll, die bereits ein immobilisiertes Steroid trägt, dann kann die Immobilisierung des Streptolysin O beispielsweise nach dem folgenden Verfahren durchgeführt werden:

Eine wässrige Lösung mit einem Proteingehalt von 0,5 mg/ml bis 1 mg/ml, wobei das Protein einen Streptolysin O-Gehalt von 5 bis 10 (Gew.)% hat, wird eingesetzt und die Streptolysin O- Lösung mit Wasser oder dem obengenannten Puffer im allgemeinen 10- bis 10.000-fach, vorzugsweise 100- bis 1.000-fach verdünnt. Die verdünnte Lösung wird dann mit der das immobili­ sierte Steroid tragenden Membran in Kontakt gebracht, beispielsweise in einem geeigneten Reaktionsgefäß oder dadurch, daß die Lösung auf Teile der das immobilisierte Steroid tragenden Membran aufgetropft wird. Dann läßt man die Membran ruhig stehen oder schüttelt sie im allgemeinen bei 0 °C bis 40°C, vorzugsweise bei 4°C bis 30°C, im allgemeinen 5 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 10 Minuten bis 10 Stunden. Danach wird die entstandene, das immobilisierte Streptolysin O tragende Membran mit Wasser oder dem oben­ genannten Puffer gewaschen. Die das immobilisierte Streptoly­ sin O enthaltende Membran, die nach dem vorstehend genannten Verfahren erhalten wurde, kann vorteilhaft zur Bestimmung von Streptolysin O Antikörper beispielsweise nach der Immunostai­ ning-Methode eingesetzt werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur immunologischen Bestimmung des Streptolysin O Antikörpers wird eine Test­ probenlösung, die den Antistreptolysin O Antikörper enthält, mit einem spezifischen Bindemittel in Berührung gebracht und umgesetzt, (d. h. mit dem oben beschriebenen spezifischen Träger, der immobilisiertes Streptolysin O enthält) unter Bedingungen, die für die Bildung des Antigen-Antikörper Kopmplexes geeignet sind, wobei der Antistreptolysin O Antikörper selektiv mit dem Bindemittel reagiert durch eine Antigen-Antikörper Reaktion und wobei dann die Menge des Antistreptolysin O Antikörpers bestimmt wird, die mit dem Bindemittel verbunden ist.

Beispiele von Testprobelösungen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren benutzt werden können, schließen Körperflüssigkeiten wie Serum, Plasma, Speichel und Harn, einen Gewebeextrakt und die überstehende Flüssigkeit einer Gewebekultur ein. Diese Testprobenlösungen können so benutzt werden wie sie sind oder nachdem sie in geeigneter Weise mit Wasser oder dem oben­ genannten Puffer verdünnt worden sind, wobei solche Faktoren wie das Prinzip des Bestimmungsverfahrens für den mit dem Bindemittel verbundenen Antistreptolysin O Antikörpers, die Empfindlichkeit des Nachweises und der Meßbereich berücksich­ tigt werden müssen.

Im Hinblick auf die Reaktionsbedingungen, unter denen das erfindungsgemäße Verfahren zur immunologischen Bestimmung des Antistreptolysin O Antikörper durchgeführt wird, gibt es keine besonderen Einschränkungen, solange die Antigen-Antikörper Reaktion nicht behindert und die Eigenschaften der benutzten Reagenzien nicht beeinträchtigt werden (z. B. wenn eine markierte Substanz benutzt wird sollten die zum Nachweis wichtigen Eigenschaften der markierten Substanz nicht beeinträchtigt sein). Unter Berücksichtigung von solchen Faktoren wie dem Prinzip des Bestimmungsverfahrens für den Antistreptolysin O Antikörper, der von dem Bindemittel gebunden ist, können die geeigneten Reaktionsbedingungen in angemessener Weise unter den Reaktionsbedingungen ausgewählt werden, die im allgemeinen für konventionelle Bestimmungs­ verfahren benutzt werden.

Wenn erfindungsgemäß beispielsweise kolloide Latexpartikelchen mit immobilisiertem Streptolysin O als Bindemittel benutzt werden, kann das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft für den Latex-Agglutinierungstest wie dem auf einem Glasplättchen durchgeführten Latex-Agglutinierungstest eingesetzt werden [siehe Satomi Shibata et al., "Kiki Shiyaku (Equipment and Reagents)", Vol. 11, pp. 338-342, 1988]. In diesem Fall werden die das immobilisierte Streptolysin O enthaltenden La­ texpartikelchen und eine Testprobenlösung miteinander auf einer Testplatte gemischt und das Auftreten oder Nicht- Auftreten einer Agglutination der Latexpartikel durch die Antigen-Antikörper Reaktion kann visuell geprüft werden.

Die mit immobilisiertem Streptolysin O versehenen kolloidalen Latexpartikelchen, die als Bindemittel benutzt werden, können erfindungsgemäß vorteilhaft auch für den photometrischen Latex-Immunoassay (LPIA) eingesetzt werden [siehe Ikunosuke Sakurabayashi et al., "Nippon Rinsho (Japanese Chemical)", Vol. 48, Supplementary Edition (Vol. II), pp. 1356-1361, 1990]. In diesem Fall werden die das immobilisierte Streptoly­ sin O tragenden Latexpartikelchen und die Testprobenlösung miteinander gemischt und eine Trübung, die durch die Antigen- Antikörper Reaktion entsteht, optisch gemessen. Der Antistrep­ tolysin O Antikörper wird durch Bezugnahme auf eine Kalibrie­ rungskurve bestimmt, die aus einer Standardlösung, die den Antistreptolysin O Antikörper enthält, gewonnen wurde.

Zusätzlich kann das erfindungsgemäße Verfahren, wenn immobili­ siertes Streptolysin O tragende Latexpartikelchen als Bindemittel eingesetzt werden, vorteilhaft für den nephelome­ trischen Immunoassay (NIA) eingesetzt werden [siehe Yasuko Yamagishi, "Rinsho-kensa (Laboratory Examinations)", Vol. 23, Supplementary Edition, pp. 1286-1289, 1979]. In diesem Fall werden die das immobilisierte Streptolysin O enthaltenden Latexpartikelchen und eine Testprobenlösung miteinander gemischt und das durch Antigen-Antikörper Reaktion gebildete Aggregat mit Licht bestrahlt (Laserstrahl), und die Intensität des gestreuten Lichtstrahles gemessen. Danach wird der Antistreptolysin O Antikörper unter Bezugnahme auf eine Kalibrierungskurve bestimmt, die aus einer Standardlösung mit dem Antistreptolysin O Antikörper erhalten wurde.

Weiterhin kann das erfindungsgemäße Verfahren, bei dem auf kolloidalen Latexpartikelchen immobilisiertes Streptolysin O als Bindemittel eingesetzt wird, vorteilhaft bei dem zählenden Immunoassay eingesetzt werden [siehe Kouichi Hashimoto et al., "Kensa-to-gijutsu (Examinations and Techniques)", Vol. 22. No. 5, pp. 67-68, Supplementary Edition, 1994]. In diesem Fall werden die das immobilisierte Streptolysin O tragenden Latexpartikelchen und eine Testprobenlösung miteinander gemischt und dann ein Aggregat durch eine Antigen-Antikörper Reaktion hergestellt, das bezüglich seiner Größe und Zahl gemessen wird. Der Antistreptolysin O Antikörper wird dann bestimmt durch Bezugnahme auf eine Kalibrierungskurve die aus einer Standardlösung erhalten wurde, die den Antistreptolysin O Antikörper enthält.

Wenn andererseits eine Mikrotiterplatte, eine Perle, eine Kugel oder ein Teströhrchen mit immobilisiertem Streptolysin O als Bindemittel verwendet wird, dann kann das erfindungs­ gemäße Verfahren vorteilhaft z. B. für den Enzym-Immunoassay eingesetzt werden. In diesem Fall reagieren der das immobili­ sierte Streptolysin O enthaltende Träger und eine Test­ probenlösung miteinander, um einen Antigen-Antikörper Komplex zu bilden, und dann reagiert der markierte Antikörper (gegen den Antistreptolysin O Antikörper) mit dem Komplex, worauf dann die Aktivität der markierten Verbindung die an den Träger durch den Komplex gebunden ist, gemessen wird. Der Antistrep­ tolysin O Antikörper wird dann bestimmt durch Bezugnahme auf eine Kalibrierungskurve, die mit einer Standardlösung von Antistreptolysin O Antikörper erhalten wurde.

Durch Benutzung der Eigenschaft des Biotins (das ein Typ des Vitamins B ist), das spezifisch an Avidin bindet, welches ein basisches Glucoprotein ist, das im Eiweiß vorkommt, kann die vorstehend beschriebene Bestimmungsmethode mittels eines Enzym-Immunoassays noch in folgender Weise modifiziert werden: Ein Antikörper (gegen den Antistreptolysin O Antikörper), der Biotin gebunden hat wird anstelle des markierten Antikörpers eingesetzt und Avidin oder Streptoavidin, das mit einer Markierungssubstanz markiert ist, reagiert mit dem Biotin, das an den Antikörper gebunden ist. Danach wird die Aktivität des Markierungsmittels, das mit dem Träger durch den Antigen- Antikörper Komplex gebunden ist, gemessen. Der Antistreptoly­ sin O Antikörper wird gemessen unter Bezugnahme auf eine Kalibrierungskurve, die aus einer Standardlösung erhalten wurde, die den Streptolysin O Antikörper enthält.

Bezüglich der Arten des markierten Antikörpers und des an Biotin gebundenen Antikörpers bei dem Enzym-Immunoassay- Bestimmungsverfahrens gibt es keine Beschränkung, solange diese an den Antistreptolysin O Antikörper binden können, der in der Testprobenlösung enthalten ist. Sowohl polyclonale Antikörper, monoclonale Antikörper und enzymolytische Bruchstücke davon [z. B. F(ab')₂, F(ab)₂, Fab' und Fab] können eingesetzt werden. Der Antikörper kann von jeder Tierart gewonnen werden und kann auch durch gentechnologische Methoden von Wirtszellen hergestellt werden, z. B. aus transformierten Mikroorganismen wie Escherichia Coli, Hefe und ähnlichen Wirtszellen.

Die Markierung kann unter denjenigen in geeigneter Weise ausgewählt werden, die im allgemeinen für Enzym-Immunoassays verwendet werden. Bevorzugte Beispiele für Markierungen schließen die Peroxydase, die alkalische Phosphatase, die β- Galaktosidase und die Glucoseoxidase ein.

Das Erkennen der Enzymaktivität kann nach dem Verfahren durchgeführt werden, das beispielsweise beschrieben ist in "Kouso Men-eki Sokutei-ho (Enzyme Immunoassay)", "Tanpakushit­ su-Kakusan-Kouso (Protein/Nucleic Acid/Enzym)" Supplement, No. 31; herausgegeben von Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nambara, Akio Tsuji und Eiji Ishikawa; veröffentlicht von Kyoritsu Shuppan K. K., Japan, pp. 51-63 (September 10, 1987).

Wenn eine Mikrotiterplatte, eine Perle, eine Kugel oder ein Teströhrchen mit immobilisiertem Streptolysin O als Binde­ mittel eingesetzt wird, kann das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft auf den Enzym-Immunoassay angewendet werden, der auf dem Prinzip des kompetitiven Bindungsnachweises beruht, der eine der Bestimmungsmethoden für Antikörper ist, die beschrieben ist in "Koso Men-eki Sokuteiho (Enzyme Immunoas­ say)"; herausgegeben von Ishikawa, E., Kawai, T. und Muroi, K., Third Edition, veröffentlicht von Igaku Shoin K. K., Japan, pp. 31-54 (May 15 1987).

In dem oben beschriebenen Enzym-Immunoassay, der auf dem Prinzip des kompetitiven Bindungsnachweises beruht, wird ein enzymmarkierter Antistreptolysin O Antikörper eingesetzt. Der enzymmarkierte Antistreptolysin O Antikörper wird durch die Markierung eines Antikörpers erhalten, der aus dem Serum eines Patienten gewonnen wird, der mit hämolytischen Streptokokken der Gruppe A infiziert ist oder durch Markieren eines Antikörpers, der aus einem Antiserum gewonnen wurde, welches durch Immunisierung eines Tieres mit einem Immunogen gewonnen wurde, welches Streptolysin O enthielt. Diese Methoden sind beschrieben in "Kouso-Men-eki Sokutei-ho (Enzyme Immunoas­ say)", "Tanpakishitsu-Kakusan-Kouso (Protein/Nucleic Acid/Enzym)" Supplement, No. 31; herausgegeben von Tsunehiro Kitagawa, Toshio Nambaram, Akio Tsuji und Eiji Ishikawa und veröffentlicht von Kyoritsu Shuppan K. K., Japan, pp. 37-45 (September 10, 1987). Der enzymmarkierte Antistreptolysin O Antikörper kann auch durch Markieren eines monoclonalen Antikörpers gewonnen werden, der gegen Streptolysin O in Übereinstimmung mit den Verfahren hergestellt worden ist, wie sie beschrieben sind in "Men-eki-kenkyu-ho Handbook (Handbook for Immunological Research)"; herausgegeben von Hiromi Fujiwara und Junji Yodoi und veröffentlicht von Chugai-Iyaku- Sha K. K., Japan, pp. 61-75 (September 20, 1992). Die Bestimmung des markierten Enzyms und das Erkennen der Enzymaktivität kann in Übereinstimmung mit den oben erwähnten Verfahren durch­ geführt werden.

Zusätzlich zu dem vorstehend erwähnten Enzym-Immunoassay kann auch eine andere bekannte Methode, beispielsweise der Radio- Immunoassay, der Fluoreszenz-Immunoassay und ähnliche Methoden eingesetzt werden. Beim Radio-Immunoassay und dem Fluoreszenz- Immunoassay wird eine radioaktive Substanz bzw. eine fluo­ reszierende Substanz anstelle des Enzyms als Markierungsmittel im Enzym-Immunoassay benutzt.

Wenn eine Membran mit darauf immobilisiertem Streptolysin O als Bindemittel eingesetzt wird, kann das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise vorteilhaft für das Immunostaining- Verfahren angewendet werden. In diesem Fall wird die das immobilisierte Streptolysin O enthaltende Membran mit einer Testprobenlösung zur Reaktion gebracht, um einen Antigen- Antikörper Komplex zu bilden und dann wird der Antikörper (gegen den Antistreptolysin O Antikörper) der mit einem Markierungsmittel versehen ist, mit dem Komplex zur Reaktion gebracht. Danach wird die Aktivität des an den Träger durch den Komplex gebundenen Markierungsmittels visuell geprüft und mit einem Densitometer gemessen.

Die Methode zur Feststellung und Bestimmung eines Produktes der Antigen-Antikörper Reaktion ist nicht besonders be­ schränkt. Nicht nur manuelle Methoden, sondern auch automati­ sierte Methoden, die automatisierte Analysengeräte einsetzen, können benutzt werden. Wird beispielsweise das erfindungs­ gemäße Verfahren auf den photometrischen Latex-Immunoassay (LPIA) angewendet, können automatische Analysengeräte wie Hitachi 705, 7050, 7150. 736 und 7070 (hergestellt und verkauft von Hitachi, Ltd., Japan) benutzt werden. Diese automatisierten Analysengeräte führen Operationen wie die Verteilung der Testprobelösung, die Verteilung eines Reagen­ zes, das Waschen, die Messung der Absorption und die Datenver­ arbeitung automatisch durch. Insbesondere führen diese automatischen Analysengeräte beispielsweise die folgenden Operationen durch: Die Latexpartikelchen mit dem darauf immobilisierten Streptolysin O und eine Testprobenlösung werden miteinander in einer Reaktionszelle gemischt. Nach einer vorbestimmten Zeitperiode wird die Absorption bei einer geeigneten Wellenlänge gemessen, die aus den bekannten Meßbedingungen ausgewählt wird, vorzugsweise bei einer Wellenlänge von 400 nm bis 950 nm, wobei eine Blindkorrektur durchgeführt wird. Dann werden die Ergebnisse der Absorptions­ messungen mit einer Kalibrierungskurve verglichen, die aus einer Standardlösung erhalten wurde, die Antistreptolysin O Antikörper enthält. Dadurch wird der Antistreptolysin O Antikörper in der Testprobenlösung bestimmt.

Wenn beispielsweise das erfindungsgemäße Verfahren auf einen Enzym-Immunoassay angewendet wird, wobei als Bindemittel eine Mikrotiterplatte oder ein Teströhrchen mit immobilisiertem Streptolysin O benutzt wird, kann ein automatisiertes Nachweissystem wie die BECKMAN Biomek 1000 Automated Laborato­ ry Workstation (hergestellt und verkauft bei Beckman In­ struments, Inc., U.S.A.) oder das CELL ASSAY-2000 ROBOTIC ASSAY SYSTEM (hergestell und verkauft von Moritex Corporation, Japan), eingesetzt werden. Diese automatisierten Nachweis­ systeme führen automatisch Operationen wie die Verteilung der Testprobenlösung, die Verteilung eines Reagenzes, das Waschen, das Messen der Absorption und die Datenverarbeitung durch. Insbesondere führen beispielsweise diese automatisierten Nachweissysteme die folgenden Operationen durch: Eine Mikrotiterplatte oder ein Teströhrchen, auf denen sich immobilisiertes Streptolysin O befindet, werden nacheinander mit der Testprobenlösung, dem enzymmarkierten Antikörper und einer Substratlösung zur Reaktion gebracht, wobei jeweils ein Waschvorgang zwischen die vorstehend genannten Reaktions­ schritte eingeschoben wird. Falls gewünscht, wird eine Lösung eines Enzymhemmers zu der entstandenen Reaktionsmischung gegeben, um die Reaktion zu beenden. Dann wird die Färbung, die durch die Enzymreaktion zwischen dem markierenden Enzym und dem Substrat entsteht bei einer geeigneten Wellenlänge gemessen, die aus den konventionellen Meßbedingungen ausge­ wählt wurde. Die Ergebnisse der Farbmessungen werden mit einer Kalibrierungskurve verglichen, die mit einer Standardlösung erhalten wurde, die den Antistreptolysin O Antikörper enthält, wodurch der Antistreptolysin O Antikörper in der Test­ probenlösung gemessen wird. Wird das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise auf einen Enzym-Immunoassay angewen­ det, der als Bindemittel eine Perle mit immobilisiertem Streptolysin O benutzt, dann kann ein automatisiertes Nachweissystem wie das Aloka AEC-2000 POSEIDON II (hergestellt und verkauft von Aloka Co., Ltd., Japan) verwendet werden. Dieses automatisierte Nachweissystem führt automatisch die Operationen der Verteilung einer Testprobenlösung, die Verteilung eines Reagenzes, das Waschen, das Messen der Absorption und die Datenverarbeitung durch. Speziell führt dieses automatisierte Nachweissystem beispielsweise die folgenden Operationen durch: Eine Perle mit immobilisiertem Streptolysin O wird nacheinander mit einer Testprobenlösung, einem enzymmarkierten Antikörper und einer Substratlösung zur Reaktion gebracht, wobei jeweils Waschvorgänge zwischen die vorstehend beschriebenen Reaktionen eingeschoben werden. Falls gewünscht, wird eine Enzymhemmerlösung zu der resultierenden Reaktionsmischung gegeben, um die Reaktion zu beenden. Dann wird die Färbung, die durch die Enzymreaktion zwischen dem markierenden Enzym und dem Substrat bei einer geeigneten Wellenlänge gemessen, die aus den bekannten Meßbedingungen ausgewählt wurde. Die Ergebnisse der Farbmessung werden mit einer Kalibrierungskurve verglichen, die aus einer Stan­ dardlösung erhalten wurde, die Antistreptolysin O Antikörper enthält. Dadurch wird der Antistreptolysin O Antikörper in der Testprobenlösung bestimmt.

Aus Gründen der Arbeitserleichterung können einige oder alle Reagenzien, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens notwendig sind, in Form eines Reagenziensatzes zur Verfügung gestellt werden. Solch ein Reagenziensatz ist auch vorteilhaft, wenn ein automatisches Analysiergerät zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt wird. Ein Beispiel für einen derartigen Reagenziensatz ist ein Satz der (A) einen Träger mit einem darauf immobilisierten Steroid für das erfindungsgemäße Verfahren und (B) eine Streptolysin O enthaltende Lösung enthält. Besonders bevorzugt ist, daß zusätzlich oder anstelle der vorstehend genannten Reagenzien (A) und (B) der Reangenziensatz (C) einen Träger mit immobili­ siertem Streptolysin O als Bindemittel enthält, welches durch die Reaktion der obengenannten Reagenzien (A) und (B) miteinander hergestellt worden ist. Der erfindungsgemäße Reagenziensatz kann auch noch andere geeignete Reagenzien enthalten, beispielsweise einen Puffer, eine Standardsubstanz, markierte Antikörper, ein Substrat, ein Lösungsmittel für ein Substrat und ein Mittel zur Beendigung der Reaktion.

Im folgenden wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele und Fig. 1 bis 6 erläutert, die jedoch nicht so ausgelegt werden sollten, als ob sie den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung begrenzen.

In den Fig. 3 und 5 ist der Ausdruck "IU" (d. h. Internationale Einheit) angegeben. In den Fig. 4 und 6 ist der Ausdruck "Todd Einheit" angegeben. Die internationale Einheit ist eine Einheit, die von der WHO definiert ist. Todd Einheit bedeutet eine Menge von Antistreptolysin O Antikörper, die das 2,5- fache der minimalen Streptolysin O-Menge neutralisieren kann (minimale hämolytische Dosis), bei der 0,5 ml von 5 (Vol./Vol.)% Kaninchenerythrozyten komplett lysiert werden können. Die internationale Einheit ist im wesentlichen der Todd-Einheit äquivalent.

Beispiel 1 Prüfung der Reaktivität von immobilisiertem Steroid mit Streptolysin O (1) Herstellung von Streptolysin O

Hämolytische Streptokokken der Gruppe A (Streptococcus pyogenes) Typ 3 Stamm D58X (ATCC 12383) wurden in 2 Liter von Todd-Hewitt Bouillon (Difco Laboratories, U.S.A.) geimpft und bei 37°C 12 Stunden lang inkubiert, danach zentrifugiert und filtriert, um ein steriles Filtrat zu gewinnen. Dann wurde eine gesättigte Ammoniumsulfatlösung zu dem Filtrat bis zu einer Konzentration von 40% Sättigung gegeben um ein Präzipitat zu bilden. Das Präzipitat wurde abgetrennt und in 100 ml reinem Wasser gelöst, um eine Lösung zu erhalten.

Die erhaltene Lösung wurde gegen gereinigtes Wasser und PBS (= phosphatgepufferte Salzlösung) dialysiert, um das Ammonium­ sulfat zu entfernen. Die erhaltene Lösung wurde einer Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-100 unterworfen, das mit PBS (welches einen Liter des Gels enthielt) ins Gleichgewicht gebracht worden war, und eine Streptolysin O- Fraktion gewonnen, indem man die hämolytische Aktivität als Entscheidungsmerkmal benutzte. Die Fraktion wurde kondensiert, um 11 ml einer Probelösung zu erhalten, die Streptolysin O enthielt und eine Absorption von 0,800 bei 280 nm und eine hämolytische Aktivität von 8,192 hämolytischen Einheiten (HU)/ml zeigte.

Der Nachweis der hämolytischen Aktivität wurde nach folgendem Verfahren durchgeführt. Frische defibrinierte Erythrozyten, aus einem Kaninchen (welche erhältlich sind von Nippon Bio- Test Laboratories K. K., Japan) wurden mit PBS fünfmal durch Zentrifugieren gewaschen und dann PBS hinzugefügt, um eine 1 (Vol./Vol.)% Suspension von Erythrozyten herzustellen.

Mit der oben erwähnten Probelösung, die Streptolysin O enthält, wurden fortlaufende zweifache Verdünnungen mit PBS durchgeführt. 1 ml jeder fortlaufenden Verdünnung wurde einzeln mit 2 ml der oben hergestellten 1 (Vol./Vol.)%-igen Erythrozytensuspension in einem Glasröhrchen gemischt, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für 30 Minuten. Danach wurde in jedem Röhrchen eine Messung der Hämolyse durchgeführt, um die Höchstzahl der Verdünnungen festzustellen, bei der sich noch eine 100%-ige Hämolyse zeigte. Die so erhaltene Zahl wurde definiert als der Wert der hämolytischen Einheit für 1 ml der Probelösung, die Streptolysin O enthielt.

(2) Herstellung eines Trägers mit immobilisiertem Cholesterol

100 µl einer Ethanollösung, die Cholesterol enthielt (erhält­ lich von Nakarai Chemical Ltd., Japan) in einer Menge von 1 mg/ml wurde in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte gegeben (erhältlich von Sumitomo Bakelite Co., Ltd., Japan) und dann blieb die Platte bei 60°C 2 Stunden stehen, um das Lösungs­ mittel zu verdunsten und zu entfernen, wodurch eine Mikroti­ terplatte mit immobilisiertem Cholesterol hergestellt wurde. Die gleiche Prozedur wurde wiederholt nur wurde diesmal eine cholesterolfreie Ethanollösung anstelle einer Cholesterol enthaltenden Ethanollösung eingesetzt, wodurch eine Mikroti­ terplatte hergestellt wurde, auf der sich kein immobilisiertes Cholesterol befand. Diese Platte wurde für Kontrollzwecke benutzt.

(3) Umsetzung des immobilisiertes Cholesterol enthaltenden Trägers mit einer Lösung von Streptolysin O

Die Probelösung von Streptolysin O, hergestellt nach dem vorstehend beschriebenen Verfahrensschritt (1) wurde 20-fach mit PBS verdünnt und 50 µl der resultierenden Verdünnungen wurden in jede Vertiefung von zwei Arten von Mikrotiterplatten gegeben, die hergestellt waren wie vorstehend unter (2) beschrieben ist, bei der die eine Mikrotiterplatte immobili­ siertes Cholesterol enthielt, während die andere Platte kein immobilisiertes Cholesterol enthielt. Dann ließ man jede Mikrotiterplatte zur Durchführung der Reaktion 2 Stunden stehen. Die entstandene Reaktionsmischung wurde aus jeder Vertiefung gewonnen und untersucht [d. h., SDS-Polyacrylelek­ trophorese (SDS-PAGE) und hämolytischer Aktivitätsnachweis wie er oben unter Punkt (1) beschrieben ist]. Die Ergebnisse der Untersuchungen jeder Reaktionsmischung wurden mit denen der Originalprobelösung vor der Reaktion verglichen.

Die oben genannte SDS-PAGE wurde durchgeführt mit einem 12,5 (Gew./Vol)% Polyacrylamidgel, im wesentlichen in Überein­ stimmung mit der Methode von Laemmli, U.K. (Nature, 227; Seite 680-685, 1970).

Andererseits wurde mit Substanzen mit bekanntem Standardmole­ kulargewicht (Phosphorylase B mit einem Molekulargewicht von 92.500, Rinderserumalbumin mit 66.200, Ovalbumin mit 45.000, Karbonsäureanhydrase mit 31.000, Sojatripsininhibitor mit 21.500 und Lysozym mit einem Molekulargewicht von 14.400; alle verfügbar von den Bio-Rad Laboratories, U.S.A.) die gleiche SDS-PAGE wie oben erwähnt durchgeführt, um dadurch Molekular­ gewichtsmarker (Spur 1 in Fig. 1) zur Abschätzung der entsprechenden Molekulargewichte der Proteine zu erhalten, die in den oben genannten Mischungen und der Originalprobenlösung enthalten sind, wobei die Proteine in dem gleichen Gel getrennt wurden. Bezüglich des Gels wurde eine Silberfärbung mit dem Wakosilberfärbungsreagenziensatz durchgeführt (erhältlich von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan), um hierdurch die Proteine in dem Gel sichtbar zu machen.

(4) Ergebnisse

Ein Muster des SDS-PAGE, erhalten gemäß dem vorstehenden Punkt (3), wird in Fig. 1 gezeigt. Die Spur 2 in Fig. 1 zeigt ein Trennmuster von Proteinen, die in der Originalprobelösung, die Streptolysin O enthielt, vorhanden waren, wobei die Probelö­ sung, hergestellt wie unter Punkt (1) oben beschrieben, 20- fach mit PBS verdünnt wurde.

Die Spur 3 in Fig. 1 zeigt ein Trennmuster von Proteinen, die in der Lösung enthalten waren, die aus der Mikrotiterplatte mit immobilisierten Cholesterol gewonnen wurde. Die Spur 4 in Fig. 1 zeigt ein Trennmuster der Proteine, die in der Lösung enthalten waren, die aus der Mikrotiterplatte zurückgewonnen wurde, in der kein immobilisiertes Cholesterol vorhanden war.

Durch Fig. 1 wurde bestätigt, daß die Banden der Molekularge­ wichte von 66.000 bis 69.000 und von 55.000 bis 58.000, die für Streptolysin O charakteristisch sind, in Spur 3 ver­ schwanden. Die hämolytische Aktivität der Lösung, die aus der mit immobilisierten Cholesterol versehenen Mikrotiterplatte gewonnen wurde, war nur 0,8%, verglichen mit der hämolytischen Aktivität, die die Probelösung zeigte.

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen deutlich, daß unter den Proteinen, die in der Probelösung enthalten sind und her­ gestellt wurden nach Verfahrensschritt (1) nur Streptolysin O eine biologische Aktivität aufweist, die spezifisch an den Träger gebunden wird, der immobilisiertes Cholesterol enthält.

Beispiel 2 Prüfung der Reaktivität von immobilisiertem Streptolysin O mit Antistreptolysin O Antikörper. (1) Herstellung eines mit immobilisiertem Cholesterol versehenen Trägers.

50 µl einer Ethanollösung, die Cholesterol in einer Konzen­ tration von 20 µg/ml enthält, wurde in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte gegeben (erhältlich von Sumitomo Bakelite Co., Ltd., Japan). Dann ließ man die Platte bei 60°C 2 Stunden stehen zur Verdunstung und Entfernung des Lösungsmittels, so daß hierdurch eine mit immobilisiertem Cholesterol versehene Mikrotiterplatte entstand. Magermilch (erhältlich von Snow Brand Milk Products Co., Ltd., Japan) wurde in 20 mM Tris- Hydrochloridpuffer (pH 7,6, der 0,14 M Natriumchlorid enthält) gelöst, so daß eine 5 (Gew./Vol.)% Lösung (im folgenden häufig als "Blockierungslösung" bezeichnet) hergestellt wurde. Danach wurden 100 µl der Blockierungslösung in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte gegeben. Dann ließ man die Reaktion bei Raumtemperatur 2 Stunden laufen. Die Vertiefungen wurden zweimal mit 20 mM Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,6, enthaltend 0,14 M Natriumchlorid) (im folgenden häufig "Waschlösung" bezeichnet) gewaschen, um dadurch einen Träger mit immobili­ siertem Cholesterol herzustellen.

(2) Empfindlichkeit von Streptolysin gegenüber einem mit Cholesterol immobilisierten Träger.

Die gleichen Probelösungen, die Streptolysin enthalten, hergestellt nach Beispiel 1, Ziffer (1), wurden 100-fach, 400- fach und 1.600-fach mit 20 mM Tris-Hydrochloridpuffer verdünnt (pH 7,6, enthaltend 0,14 M Natriumchlorid), der 0,5 (Gew./Vol.)% Magermilch enthielt (im folgenden häufig als "Verdünnungslösung" bezeichnet). 50 µl von jeder der oben genannten Verdünnungen und die oben genannte Verdünnungslösung (als Blindprobe) wurden einzeln in jede Vertiefung jeder Mikrotiterplatte gegeben und dann für die Reaktion bei Raumtemperatur 2 Stunden Zeit gegeben. Danach wurden die Vertiefungen von jeder Mikrotiterplatte 7-mal mit der Waschlösung gewaschen, um dadurch Mikrotiterplatten zu erhalten, die Streptolysin O gegenüber in vorbestimmten Mengen empfindlich waren sowie eine Mikrotiterplatte ohne Choleste­ rol für Kontrollzwecke.

(3) Erkennung eines Immunkomplexes von Streptolysin O mit einem Antistreptolysin O Antikörper

Eine Standard Lösung, die Antistreptolysin O Antikörper enthält (131 IU/ml) (im folgenden häufig als "Antistreptolysin O Antikörper Standard Lösung" bezeichnet), die vom Japanese National Institute of Health erhalten worden war, wurde 500- fach mit der oben genannten Verdünnungslösung verdünnt und 50 µl der resultierenden Verdünnung in jede Vertiefung jeder Mikrotiterplatte, hergestellt nach dem vorstehenden Verfah­ rensschritt 2, gegeben und dann bei Raumtemperatur eine Stunde lang stehen gelassen. Danach wurden die Vertiefungen jeder Mikrotiterplatte 7-mal mit der oben genannten Waschlösung gewaschen. Alkalisches, phosphatase-markiertes Ziegen-F(ab')₂ anti-Human-Immunglobulin G, erhältlich von Bio Source International Inc. -Tago Products, U.S.A. (enzym-markierter sekundärer Antikörper) wurde 1.000-fach mit der Verdünnungs­ lösung verdünnt und 50 ml der erhaltenen Verdünnung wurden dann in jede Vertiefung von jeder Mikrotiterplatte gegeben. Dann ließ man die Reaktion bei Raumtemperatur eine Stunde lang ablaufen.

Danach wurden die Vertiefungen jeder Mikrotiterplatte 7-mal mit Waschlösung gewaschen. 100 µl einer 0,5 mg/ml Lösung (Substrate) von p-Nitrophenylphospat (erhältlich von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan), in einem Diethanolaminpuf­ fer (pH 9,5) wurde in jede Vertiefung gegeben. Dann ließ man die Reaktion bei Raumtemperatur 15 Minuten ablaufen, gefolgt von der Zugabe von 100 µl einer 0,5 N wässrigen Natriumhydrox­ ydlösung in jede Vertiefung, um hierdurch die Enzym-Reaktion zu beenden. In jeder Lösung, die aus den Vertiefungen herausgenommen wurde, wurde die Absorbtion (ΔE) bei 405 nm gemessen.

(4) Ergebnisse

Die Ergebnisse des Nachweises eines Immunkomplexes von Streptolysin O mit Antistreptolysin O Antikörper werden in Fig. 2 gezeigt. Fig. 2 zeigt deutlich, daß Streptolysin O, das auf einem Träger durch Cholesterol immobilisiert wird, eine Reaktivität gegenüber Antistreptolysin O Antikörper behielt.

Beispiel 3 Bestimmung des Antistreptolysin O Antikörpertiters. (1) Herstellung eines Trägers mit immobilisiertem Streptoly­ sin O

Ein Polystryrollatex mit einem Partikeldurchmesser von 0,12 µm (erhältlich von Sekisui Chemical Co., Ltd., Japan) wurde in 10 (Vol./Vol.)% wässrigem Ethanol suspendiert, so daß eine 2 (Gew./Vol.)% Polystyrollatexsuspension hergestellt wurde. 1 Volumenteil einer 10 (Vol./Vol.)%-igen wässrigen Ethanollösung, die Cholesterol (erhältlich von Nakarai Chemical Ltd., Japan) in einer Menge von 200 µg/ml enthielt, wurde zu 1 Volumenteil der vorstehend hergestellten Lat­ exsuspension gegeben und bei Raumtemperatur 2 Stunden in Kontakt gelassen.

Zu 1 Volumenteil der entstandenen Mischung wurden 9 Volumen­ teile PBS gegeben, das 2 (Gew./Vol.)% BSA enthielt. Dann ließ man die Reaktion bei Raumtemperatur 2 Stunden ablaufen. Die entstandene Mischung wurde dann 20 Minuten lang bei 12.000 r. p. m. zentrifugiert, um dadurch die Latexpartikelchen wieder zu gewinnen. Die wiedergewonnenen Latexpartikelchen wurden erneut in PBS suspendiert, so daß eine 0,2 (Gew./Vol.)% Latexsuspension hergestellt wurde. Die Probelösung, die Streptolysin enthielt, hergestellt nach Beispiel 1, Ziffer (1) wurde 50-fach mit PBS verdünnt, welches 0,4 (Gew./Vol.)% BSA (Rinderserumalbumin) enthielt und 1 Volumenteil der ent­ standenen Verdünnung zu 1 Volumenteil der Latexsuspension gegeben. Man ließ dann die Reaktion bei Raumtemperatur 2 Stunden ablaufen. Danach wurde die entstandene Mischung 20 Minuten lang bei 12.000 r. p. m. zentrifugiert und hierdurch die Latexteilchen zurückgewonnen. Die zurückgewonnenen Latexteil­ chen wurden wieder in PBS suspendiert, so daß eine 0,1 (Gew./Vol.)% Latexsuspension hergestellt wurde. So wurden Latexpartikel mit immobilisiertem Streptolysin O in Form einer Suspension erhalten.

(2) Bestimmung des Antistreptolysin O Antikörpertiters

600 µl von PBS und 200 µl des Testserums wurden zu 200 µl der mit immobilisierten Streptolysin O versehenen Latexpartikel­ suspension gegeben, die hergestellt war wie oben unter Punkt (1) angegeben. Dann ließ man die Reaktion bei 37°C 5 Minuten ablaufen und anschließend wurde die Absorption (ΔE) der erhaltenen Reaktionsmischung bei 590 nm gemessen. Ein Antistreptolysin O Antikörpertiter wurde bestimmt durch Bezugnahme auf eine Kalibrierungskurve, die vorher nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten worden war, wobei eine Standardlösung verwendet wurde, die den Antistreptolysin O Antikörper enthielt.

(3) Ergebnisse

Die Kalibrierungskurve in Fig. 3, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, verdeutlicht die Beziehung zwischen dem Antistreptolysin O Antikörpertiter und der Absorption bei 590 nm. Aus Fig. 3 kann ersehen werden, daß eine verläßliche Kalibrierungskurve durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden kann. Das Verhältnis zwischen dem Streptolysin O Antikörpertiter, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt wurde und dem Antistreptolysin O Antikör­ per, der bestimmt wurde nach der bekannten Rantz-Randall- Methode wird in Fig. 4 gezeigt. Fig. 4 zeigt deutlich, daß die Ergebnisse, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurden in guter Übereinstimmung stehen mit denen, die nach dem Rantz-Randall-Verfahren zur Bestimmung des Antistreptolysin O Antikörpers erhalten wurden.

Beispiel 4 Bestimmung von Antistreptolysin O Antikörpertiter. (1) Herstellung eines Trägers mit immobilisierten Streptoly­ sin O

50 µl einer 10 (Vol./Vol.)% wässrigen Ethanollösung, die Cholesterol (erhältlich von Nakarai Chemical Ltd., Japan) in einer Konzentration von 100 µg/ml enthielt, wurde in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte gegeben (erhältlich von Sumitomo Bakelite Co., Ltd., Japan). Dann ließ man die Platte bei Raumtemperatur 2 Stunden stehen, gefolgt vom zweimaligen Waschen der Vertiefungen mit gereinigtem Wasser. Magermilch (verfügbar von Snow Brand Milk Products Co.; Ltd., Japan) wurde in 20 mM Tris-Hydrochloridpuffer (pH 7,6, enthaltend 0,14 M Natriumchlorid) gelöst, so daß eine 5 (Gew./Vol.)%-ige Lösung (Blockierungslösung) hergestellt wurde. Danach wurden 100 µl der Blockierungslösung in jede der Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben. Dann ließ man die Reaktion bei Raumtemperatur 2 Stunden lang ablaufen.

Die oben genannten Vertiefungen wurden zweimal mit 20 mM Tris- Hydrochloridpuffer ((pH 7,6, enthaltend 0,14 M Natrium­ chlorid) (Waschlösung) gewaschen. Die Probelösung, die Streptolysin O enthielt, hergestellt wie in Beispiel 1 Ziffer (1) wurde 1.000-fach mit 20 mM Tris-Hydrochloridpuffer verdünnt (pH 7,6, 0,14 M Natriumchlorid), der 0,5 (Gew./Vol.) % Magermilch (Verdünnungslösung) enthielt. 50 µl der vor­ stehend hergestellten Verdünnung wurden in jede Vertiefung gegeben und dann die Reaktion bei Raumtemperatur 2 Stunden lang laufen gelassen. Danach wurden die Vertiefungen 7-mal mit der Waschlösung gewaschen, um hierbei eine Mikrotiterplatte mit immobilisiertem Streptolysin O herzustellen.

(2) Bestimmung eines Antistreptolysin O Antikörpertiters

Ein Antistreptolysin O Antikörpertiter wurde durch Benutzung einer BECKMAN Biomek 1000 Automated Laboratory Workstation bestimmt (erhältlich von Beckman Instruments, Inc., U.S.A.). 50 µl des 100-fach verdünnten Testserums mit der oben genannten Verdünnungslösung wurden in jede Vertiefung der Mikrotiter­ platte gegeben, erhalten gemäß der vorstehenden Ziffer (1). Dann ließ man die Reaktion bei Raumtemperatur 1 Stunde lang laufen. Danach wurden die Vertiefungen 7-mal mit der oben genannten Waschlösung gewaschen. 50 µl eines primären Testreagenzes [alkalisches, phosphatase-markiertes Ziegen- F(ab')₂ anti-Human-Immunglobulin G (erhältlich von Biosource International, Inc.-Tago Products, U.S.A.)(enzym-markierter sekundärer Antikörper) 100-fach verdünnt mit der Verdünnungs­ lösung] wurde in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte gegeben. Dann ließ man die Reaktion bei Raumtemperatur 1 Stunde ablaufen. Danach wurden die Vertiefungen 7-mal mit der Waschlösung gewaschen.

100 µl eines sekundären Testreagenzes [eine 0,5 mg/ml Lösung (Substrat) von p-Nitrophenylphosphat (erhältlich von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan) in Diethanolaminpuffer (pH 9,5)] wurde in jede Vertiefung gegeben. Dann ließ man die Reaktion bei Raumtemperatur 15 Minuten ablaufen. 100 µl einer 0,5 N wässrigen Natriumhydroxydlösung wurden in jede Vertie­ fung gegeben, um damit die Enzymreaktion zu beenden. Für jede Reaktionmischung, die aus den Vertiefungen genommen wurde, wurden die Absorptionen (ΔE) bei 405 nm gemessen. Ein Antistreptolysin O Antikörpertiter wurde unter Bezugnahme auf eine Kalibrierungskurve bestimmt, die nach dem erfindungs­ gemäßen Verfahren unter Benutzung einer Standardlösung, die Antistreptolysin O Antikörper enthielt, erhalten wurde.

(3) Ergebnisse

Die Kalibrierungskurve von Fig. 5, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, verdeutlicht die Beziehung zwischen dem Antistreptolysin O Antikörpertiter und der Absorption bei 405 nm. Aus Fig. 5 wird verständlich, daß eine verläßliche Kalibrierungskurve durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden kann. Das Verhältnis zwischen dem Antistreptolysin O Antikörpertiter, der nach dem erfindungs­ gemäßen Verfahren bestimmt wurde und dem Antistreptolysin O Antikörpertiter, der nach der bekannten Rantz-Randall-Methode bestimmt wurde, wird in Fig. 6 gezeigt. Fig. 6 zeigt deutlich, daß die Ergebnisse, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten wurden, in guter Übereinstimmung stehen mit denen, die nach der Rantz-Randall-Methode zur Bestimmung des Antistreptolysin O Antikörpers erhalten wurden.

Claims (7)

1. Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Antistrepto­ lysin O Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß

• a) eine Testprobenlösung, die den Antistreptolysin O Antikörper enthält, mit einem Bindemittel in Kontakt gebracht wird, das in der Lage ist, den genannten Antistreptolysin O Antikörper spezifisch zu binden, wobei die selektive Bindung des genannten Antistreptoly­ sin O Antikörpers an das Bindemittel durch eine Antigen- Antikörperreaktion erfolgt und
• b) die Menge des an das Bindemittel gebundenen Anti­ streptolysin O Antikörpers gemessen wird wobei das genannte Bindemittel einen Träger mit immobili­ siertem Streptolysin O enthält, der hergestellt wird, indem man eine Lösung, die Streptolysin O enthält mit einem Träger zusammen bringt, auf dem sich wenigstens ein immobilisiertes Steroid befindet, welches dar­ gestellt wird durch die Formel (1):
  wobei R¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Seitenkettenteil des Cholesterols und einem Seitenkettenteil der Cholsäure, wobei jedes der genann­ ten Seitenkettenteile unabhängig voneinander unsub­ stituiert oder substituiert und unabhängig voneinander gesättigt oder ungesättigt ist, wobei R² Wasserstoff oder Hydroxyl bedeutet; und jede unterbrochene Linie un­ abhängig voneinander eine Einfachbindung oder keine Bindung darstellt, so daß jede unterbrochene Linie und jede daneben liegende durchgezogene Linie zusammen unabhängig entweder eine Doppelbindung oder eine Ein­ fachbindung bilden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das immobilisierte Steroid in einer Menge von 0,025 nmol/cm² bis 250 nmol/cm² bezogen auf die Oberfläche des Träger vorhanden ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das immobilisierte Steroid in einer Menge von 0,25 nmol/cm² bis 25 nmol/cm² bezogen auf die Oberfläche des Träger vorhan­ den ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das immobilisierte Streptolysin O in einer Menge von 0,001 pmol/cm² bis 1 nmol/cm² bezogen auf die Oberfläche des Trägers vorhanden ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das immobilisierte Streptolysin O in einer Menge von 0,01 pmol/cm² bis 100 µmol/cm² bezogen auf die Oberfläche des Trägers vorhanden ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das immobilisierte Steroid, das durch die Formel (1) dargestellt wird, Cholesterol, 7-Dehydrocholeste­ rol, Cholestanol, Coprostanol, Δ⁷-Cholestenol, Δ7-Coprostenol, β-Sitosterol, 7-Dehydro-β-sitosterol, Stigmasterol, 7- Dehydrostigmasterol, Campesterol, 7-Dehydrocampesterol, Stigmastanol, Δ7-Stigmastenol, 11α-Hydroxycholesterol, Δ²²- Stigmastenol, α-Spinasterol, Campestanol, Δ⁷-Campestenol, 20α- Hydroxycholesterol, Brassicasterol, Ergosterol, Cerebrosterol, 7-Dehydrocerebrosterol, Cerebrostanol, Δ7-Cerebrostenol, Desmosterol, 7-Dehydrodesmosterol, 3β-Hydroxycholansäure oder 3β-Hydroxy-Δ⁵-cholensäure ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein kolloides Partikelchen, eine Perle, eine Kugel, eine Mikrotiterplatte, ein Teströhrchen oder eine Membran ist.