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Die vorliegende Erfindung betrifft
neue Formen von Glykolipiden sowie neue Verfahren für das Bestimmen
von Anti-Glykolipid-Antikörpern
im Assay. Das bevorzugte Glykolipid ist Sulfatid. Die neuen Assayverfahren
eignen sich insbesondere für
die Diagnose jeglicher Krankheit, bei der ein erhöhter Anti-Glykolipid-Autoantikörperspiegel
einen Marker darstellt. Bei dieser Krankheit kann es sich zum Beispiel
um Neuropathie und um Insulinabhängige
Diabetes (IDDM, Typ-1-Diabetes) handeln, darunter auch Diagnosen
zum Ausschliessen von Typ-2-Diabetes,
hiermit assoziierten Spätfolgen
sowie die Verfolgung der Behandlung von IDDM. Die neuen Sulfatidformen
können
möglicherweise
als Arzneimittel zur Behandlung von IDDM verwendet werden.
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Bei Sulfatid, dem wichtigsten Antigen
der vorliegenden Erfindung, handelt es sich um ein Glykosphingolipid
mit der folgenden Struktur:
(= Galactosylceramid-3-sulfat).
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Die Entwicklung von manifestem IDDM
beinhaltet einen Autoimmunvorgang, bei dem die Insulin-produzierenden
Zellen in den Langerhan'schen Zellen der Bauchspeicheldrüse langsam
zerstört
werden. Zum Diagnosezeitpunkt sind 70–80% der Zellen zerstört worden,
und die verbleibenden Zellen werden im allgemeinen innerhalb von
5 Jahren verschwinden. Prädiabetiker
sind Menschen, bei denen die Insulin-produzierenden Zellen ständig zerstört werden,
die jedoch noch keine klinischen Symptome aufweisen. Ein ganz bestimmter Typ
von Prädiabetikern
sind die nicht-IDDM-Patienten, deren Krankheit zu IDDM werden wird.
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Im Zusammenhang mit der vorliegenden
Erfindung bedeutet der Ausdruck IDDM, falls nicht anders erwähnt, manifester
IDDM sowie dessen prädiabetische
Formen.
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Stand der Technik
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Bei den wichtigsten bei IDDM auftretenden
Marker-Autoantikörpern
handelt es sich um Inselzellenantikörper (ICA), Anti-Glutaminsäuredecarboxylase-Antikörper (Anti-GAD),
Anti-Insulin-Antikörper
(IAA), Antikörper
gegen das 37-kD-Protein (vermutlich Tyrosinphosphatase) sowie Anti-Sulfatid-Antikörper. Die
wesentlichsten Nachteile dieser Marker sind die folgenden:
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ICAs werden auf konventionell-immunhistochemischem
Weg bestimmt und sind dadurch nicht für Screenings im großen Maßstab geeignet.
Obwohl sie normalerweise als gut für die Vorhersage von IDDM geeignet
gelten, stellen relativ hohe Variationen zwischen und innerhalb
der Assays einen Schwachpunkt dar.
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Die Anti-GAD-Antikörper sind
leicht zu bestimmen, auch bei Screenings in großem Maßstab, weisen jedoch möglicherweise
keinen starken Prognosewert auf .
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Die IAAs sind relativ leicht zu bestimmen,
fehlen jedoch bei über
40–50%
der neu diagnostizierten Kinder mit Typ-1-Diabetes und treten bei
erwachsenen Patienten noch weniger häufig auf.
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Die Anti-37kD-Protein-Antikörper kommen
mit wesentlich niedrigerer Häufigkeit
(ungefähr
50%) als die ICA- und Anti-GAD-Antikörper vor.
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Sowohl ICAs als auch Anti-GAD-Antikörper wurden
für die
Diagnose bei Prädiabetikern
verwendet.
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Anti-Sulfatid-Antikörper sind
als gute Marker für
manifesten IDDM bekannt (Buschard et al., Lancet 342 (1993) Seite
840–;
und Buschard et al., APMIS 101 (1993) 963–970). Ergebnisse, die für einen
diagnostischen Zusammenhang zwischen dieser Art von Antikörpern und
prädiabetischen
Formen des IDDM sprechen, sind bis jetzt noch nicht veröffentlicht
worden. Bei Neuropathie-Patienten wurden erhöhte Anti-Sulfatid-Antikörpertiter
gefunden; diese konnten für
die Identifikation von Patienten, bei denen eventuell Neuropathie
auftreten kann, verwendet. Bei Patienten mit Typ-2-Diabetes tritt
teilweise ebenfalls Neuropathie auf. In einer Vorstudie wurde von
einem Erfinder der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass Patienten
mit Typ-2-Diabetes ohne Neuropathie keine Reaktivität mit Anti-Sulfatid-Antikörper aufwiesen
und daher eine Möglichkeit besteht,
dass Patienten, bei denen Neuropathie auftritt, positiv sein werden
und dass sich daher ein Anti-Sulfatid-Antikörper als Mittel für die Prognose
eignen könnte;
siehe Fredman et al., J. Neurolog. 238 (1991) 75–79.
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Die Serumspiegel von Antikörpern gegen
Glykosphingolipide wurden im Assay häufig durch eine Kombination
von Dünnschichtchromatographie
(Thin-Layer Chromatography,
TLC) der Antigene und ELISA-Technik
(ELISA = Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay) bestimmt, wobei man
das Chromatographiematerial als Antigen für das Bestimmen des Auftretens
von Serumantikörpern
im Assay verwendete (TLC-ELISA) (Fredman et al., J. Neurol. 238
(1991) 75–79;
und Fredman et al., J. Neurol. 240 (1993) 381–387).
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Bei Anti-Glykolipid-Antikörpern waren
die Assay- methoden problematisch, insbesondere die bei Anti-Sulfatid-Antikörpern verwendeten
Methoden.
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Sulfatierte Glykolipide, insbesondere
Sulfatid, Lactosylceramid-3-sulfat und Seminolipid und die entsprechenden
Antikörper
wurden als diagnostische Marker sowie Therapeutika bei Diabetes
vorgeschlagen (Buschard K, WO-A-9219633).
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Die wichtigsten Probleme,
die durch die Erfindung gelöst
werden sollen.
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Es wurde von den Erfindern versucht,
die Bindung von Sulfatid an Plastiknäpfchen zu variieren, und es
wurde deutlich, dass die direkte Adsorption zu einem hohen Variationskoeffizienten
und häufig
zu unspezifischen Reaktionen führt,
die keinerlei Korrelation mit früheren
TLC-ELISA-Ergebnissen aufweisen. Wie kritisch es ist, dass sowohl
der Lipidteil als auch der Kohlenhydratteil von Glykolipiden mit
kurzen Kohlenhydratketten richtig exponiert wird, wurde mit monoklonalen
Anti-Sulfatid-Antikörpern gezeigt.
So ist der von Fredman et al. (Biochem. J. 251 (1988) 17–22) beschriebene
monoklonale Anti-Sulfatid-Antikörper
gegen Veränderungen
im Lipidteil empfindlich. Ein weiterer Aspekt besteht darin dass
mit Sulfat substituierte Galactose einen weit verbreiteten Epitop
an verschiedenen Glykoproteinen und Glykolipiden darstellt und dass
bis jetzt keine Ergebnisse existieren, die dafür sprechen, dass eine allgemeine
Reaktionsfähigkeit
gegenüber
diesem Epitop für
die Entwicklung von IDDM und seinen Spätfolgen relevant ist. Das Hauptproblem,
das die Erfindung lösen
soll, betrifft daher die Präsentation
von Glykolipidepitopen.
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Ein weiteres Problem, das die Erfindung
lösen soll,
betrifft die Diagnose von prädiabetischen
Formen von IDDM.
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Ziele der Erfindung.
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Ein erstes Ziel der Erfindung besteht
darin, dass die Präsentation
von Glykolipidantigenen/-haptenen bei Immunassays und möglicherweise
auch bei der Therapie verbessert wird. Die Antigene/-haptene, die hauptsächlich davon
betroffen sind, weisen kurze Kohlenhydratketten auf.
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Ein zweites Ziel besteht darin, verbesserte
Immunassays für
die Bestimmung von Anti-Glykolipid-Antikörpern oder Glykolipidantigenen/-haptenen,
insbesondere Autoantikörpern
gegen Glykosphingolipidantigene, die gegebenenfalls sulfatierte
Mono- und/oder Disaccharideinheiten aufweisen, bereitzustellen.
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Ein drittes Ziel besteht darin, verbesserte
Diagnoseverfahren bereitzustellen, bei denen Autoantikörper, die
an ein oder mehrere der genannten Glykolipidantigene/-haptene binden,
als Marker für
die Diagnose von IDDM sowie seinen prädiabetischen Formen, verwendet
werden.
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Ein viertes Ziel besteht darin, Diagnoseverfahren
für prädiabetische
IDDM-Formen bereitzustellen.
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Darstellung der Erfindung.
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Diese Ziele lassen sich dadurch erreichen,
dass man einen Komplex zwischen den wie oben definierten Glykolipidantigenen/-haptenen
und einem polymeren hydrophilen Träger mit hydrophoben Regionen
bildet. Geeignete Trägermoleküle sind
zum Beispiel entlipidisierte Formen hydrophiler Proteine wie Albumin,
die fähig
sind, mit Lipidverbindungen wie Fettsäuren und deren Derivaten Assoziationen
einzugehen.
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Ein erster Aspekt der Erfindung ist
daher ein Komplex zwischen einem wasserlöslichen Trägerpolymer und einem Glykolipidantigen,
vorzugsweise einem Glykosphingolipidantigen, mit einer in 3-Stellung
seiner endständigen
Kohlenhydrateinheit gegebenenfalls sulfatierten Mono- oder Disaccharideinheit.
Bei dem wasserlöslichen
Polymer handelt es sich vorzugsweise um eine entlipidisierte Form
eines Proteins mit hydrophoben Regionen, die an Lipide, wie Fettsäuren, zu
binden vermögen.
Zum Prioritätszeitpunkt
handelte es sich bei dem am stärksten
bevorzugten wasserlöslichen
Polymer um entlipidisiertes Albumin. Das wasserlösliche Polymer kann durch kovalente
Bindung oder physikalische Adsorption an eine beliebige bei Immunassays oder
in der Chroma- tographie verwendete Festphase immobilisiert werden.
Es kann entweder vor oder nach der Komplexbildung mit dem entsprechenden
Glykolipidantigen/-hapten immobilisiert werden. Bei diesem Aspekt
der Erfindung stellt Sulfatid als Glykolipidantigen/-hapten die
beste Ausbildung dar. Es wird angenommen, dass es sich bei den Kräften, aufgrund
derer das Glykolipidantigen/-hapten komplexiert bleibt, hauptsächlich um
hydrophobe Kräfte
handelt, d. h., dass zum Prioritätszeitpunkt
ein nichtkovalent assoziierter Komplex zwischen dem Trägerpolymer
und dem Glykolipid als bevorzugte Variante des erfindungsgemäßen Komplexes betrachtet
wird.
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Ein zweiter Aspekt der Erfindung
ist ein Immunassay für
Anti-Glykolipid-Antikörper
oder Glykolipidantigen/ hapten, bei dem der oben genannte Glykolipidkomplex
als Antigen verwendet wird. Bei diesem Assaytyp wird zwischen dem
erfindungsgemäßen Typ
des Glykolipid-Trägerpolymer-Komplexes
und dem entsprechenden Anti-Glykolipid-Antikörper (dem Analyten) einer Probe
ein Immunkomplex in einer Menge gebildet, die entweder qualitativ
oder quantitativ mit der Menge des Anti-Glykolipid- Antikörpers in
der Probe in Zusammenhang steht. Bei einer anderen Ausführungsform
stellt das Glykolipidantigen/-hapten den Analyten dar, den man mit
dem wie oben definierten Glykolipid-Trägerpolymer-Komplex um die Bindung
an eine im Unterschuss vorliegende Menge von zugesetztem Anti-Glykolipid-Antikörper konkurrieren
lässt.
Um die Bestimmung zu erleichtern, können noch weitere Reagentien,
die in den Immunkomplex eingebaut werden können, zum Beispiel markierte
Reagentien (markierte Antikörper
oder markierte Antigene) oder unlös- liche Reagentien oder Reagentien,
die immobilisiert werden können,
mitverwendet werden. Als Markierung können zum Beispiel Enzyme, Enzymsubstrate,
Cofaktoren, Coenzyme, Fluorophore, Farbstoffe, Teilchen wie Latexteilchen,
Kohlenstoffteilchen, Metallteilchen, radioaktive Isotope usw. verwendet
werden. Das markierte Reagens wird in solch einer Menge verwendet;
dass die in den (Glykolipid)---(Anti-Glykolipid-Antikörper)-Komplex
eingebaute bzw. nicht eingebaute Menge als Maß für die Menge des Analyten in
der Probe dient. Verändert
sich das Signal von der Markierung bei Einbau in den Immunkomplex,
so braucht vor dem Messen des Signals von der Markierung keine physikalische
Trennung der im Komplex gebundenen Form von der nicht im Komplex
gebundenen Form der Markierung vorgenommen zu werden. Falls die
Komplexbildung zu keiner Veränderung
des Signals führt, ist
es unbedingt erforderlich, eine physikalische Trennung der im Komplex
gebundenen Form von der nicht im Komplex gebundenen Form der Markierung
vorzunehmen. wenn eine Trennung vorgenommen wird, so spricht man
von heterogenen Assays; ist dies nicht der Fall, werden die Assays
als homogen bezeichnet. Die physikalische Trennung der nicht in
den Immunkomplex eingebauten Markierung von der in den Immunkomplex
eingebauten Markierung wird üblicherweise
dadurch durchgeführt,
dass man ein Reagens, das im Assaymedium unlöslich ist oder immobilisiert
werden kann, verwendet.
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Immunassays können auch in kompetitive und
nichtkompetitive Assays (Sandwich-Assays) eingeteilt werden. Weitere
Typen sind Agglutinationsassays, turbidometrische Assays sowie gegebenenfalls
homogene/heterogene und/oder kompetitive/nichtkompetitive Fällungsassays.
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Für
die Immunassays werden die üblichen
Bedingungen verwendet, was bedeutet, dass der pH-Wert während der
Immunreaktionen normalerweise im Bereich von 4–11 liegt, die Temperatur zwischen
0–35°C liegt usw.
Bei heterogenen Assays wird im Anschluss an jeden der verschiedenen
entsprechenden Antigen-Antikörperreaktionen
normalerweise Zwischentrennungs- und -Waschschritte durchgeführt, um
unspezifisch gebundene Immunreagentien und andere störende Substanzen
zu entfernen. Bei dem Reaktionsmedium handelt es sich normalerweise
um auf dem entsprechenden pH-Wert gepuffertes Wasser (wässriges
Medium).
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Die verwendete Probe stammt von einer
Körperflüssigkeit;
es kann sich um eine Blutprobe wie Vollblut, Serum oder Plasma,
oder um eine beliebige andere Art einer Probe, die den entsprechenden
Anti-Glykolipid-Antikörper bzw.
das entsprechende Glykolipidantigen/hapten enthält, handeln (Harn, Liquor,
Tränenflüssigkeit,
Speichel).
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Die Immunassays gemäß diesem
Aspekt der Erfindung können
entweder für
Diagnosezwecke oder für
das Screening bzw. die Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern, die
auf Glykolipidantigene des obengenannten Typs gerichtet sind, verwendet
werden.
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Zum Prioritätszeitpunkt wird die bevorzugteste
Ausbildung des zweiten Aspekts der Erfindung im Versuchsteil beschrieben;
bei ihr wird entlipidisiertes Albumin als festphasengebundenes Trägerpolymer
und Sulfatid als Glykolipid verwendet. Das Assayprotokoll umfasst
einen Dreifach-Sandwich-Assay, wobei die Probe mit dem Trägerpolymer
inkubiert wird, welches anschließend mit dem markierten Anti-Human-Antikörper inkubiert
wird, um den immobilisierten ternären Immunkomplex: Glykolipid
----Anti-Glykolipid-Antikörper ---
markierter-Antiantikörper
zu bilden.
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Beim dritten Aspekt der Erfindung
handelt es sich um ein Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen, die
mit einem erhöhten
Spiegel eines wie oben definierten Anti-Glykolipidantigen/-hapten-Antikörpers in
Zusammenhang stehen, bei dem ein Immunassay des obengenannten Typs
verwendet wird. In bezug auf Anti-Sulfatid-Antikörper kann das Verfahren in
Zusammenhang mit der Diagnose von Neuropathie oder IDDM, darunter
auch seinen prädiabetischen
Formen, und zur Verfolgung der Behandlungsschemata, wie zum Beispiel
prophylaktische Behandlung mit z. B. Insulin, angewandt werden.
Zu den Verwendungen zählen
auch die Differenzialdiagnose von IDDM/nicht-IDDM und/oder die Diagnose/Prognose
von Diabetes-Spätfolgen
(Neuropathie, Retinopathie sowie Neuropathie) und/oder die Verfolgung
von Behandlungsschemata im all-gemeinen.
Bei einer wichtigen diagnostischen Verwendung, die ebenfalls dazu
zählt,
handelt es sich um die Bestimmung von prädiabetischen IDDM-Formen bei
nicht-IDDM-Patienten.
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Ein vierter Aspekt der Erfindung
betrifft insbesondere die Diagnose von prädiabetischen IDDM-Formen, wobei
erhöhte
Mengen an Anti-Sulfatid-Antikörper
in einer Probe als Marker für
einen prädiabetischen Status
eines Patienten, von dem die Probe stammt, verwendet wird. Bei diesem
Aspekt kann jeder beliebige Assay, insbesondere ein Immunassay,
verwendet werden, die besten Ergebnisse werden jedoch gemäß derzeitigem
Wissen dann erzielt, wenn der Assay gemäß dem genannten dritten Aspekt
mit Anti-Sulfatid-Antikörper
als Analyten durchgeführt
wird.
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Während
der Entwicklung der vorliegenden Erfindung wurde erkannt, dass die
diagnostische Verwendung des erfindungsgemäßen Immunassayverfahrens für Anti-Sulfatid-Antikörper in
erhöhten
Mengen dann weiter verbessert werden kann, wenn auch die erhöhten Mengen
an anderen, als Markierung dienenen Autoantikörpern, die in Zusammenhang
mit IDDM wie oben beschrieben gefunden werden, in Betracht gezogen werden,
zum Beispiel Inselzellenantikörper
(ICAs), Anti-Glutaminsäuredecarboxylase-Antikörper (Anti-GAD), Anti-Insulin-Antikörper (IAA),
Antikörper
gegen 37-kD-Protein (vermutlich Tyrosinphosphatase). Es wird angenommen,
dass insbesondere das gleichzeitige Auffinden erhöhter Mengen
an Anti-Sulfatid-Antikörper und
Anti-GAD den diagnostischen Wert dadurch erhöht, dass die Spezifität erhöht wird.
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Ein wichtiger fünfter Aspekt der Erfindung
besteht in der Verwendung des in Zusammenhang mit dem ersten Aspekt
der Erfindung definierten Komplexes als wirkstoff/Arzneistoff in
pharmazeutischen Zusammensetzun gen. Bei der bevorzugten Ausbildung
werden die oben genannten neuen Sulfatidkomplexe zur Verhinderung
und/oder Verzögerung
der Entwicklung von Diabetes (IDDM) und für die Behandlung von Krankheiten, die
mit Spätfolgen
des Diabetes (IDDM) in Zusammenhang stehen, eingesetzt. Die entsprechenden
Komplexe können
zum Beispiel mit dem immunologischen Liganden und/oder mit immunaktiven
Zellen, die an der Pathogenese beteiligt sind, interagieren und
so ihre Bindung an Glykolipid/Sulfatid in Zielzellen, wie α- und β-Zellen der
Bauchspeicheldrüse,
hemmen. Die Glykolipidkomplexe gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung
können
möglicherweise
auch bei intrazellulären
Vorgängen,
die am Fortschreiten der Krankheit beteiligt sind und von Sulfatid
und/oder seinen Stoffwechselprodukten verursacht werden, pharmakologisch
interagieren. Insbesondere können
wie oben definierte Sulfatidkomplexe als Impfstoffe zur Verhinderung,
Verzögerung
oder Modifikation von IDDM bzw. seinen Spätfolgen verwendet werden.
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Während
des Prioritätsjahres
wurde erkannt, dass Diagnosen in Zusammenhang mit IDDM durch einen
Assay auf Anti-Sulfatid-Antikörper
weiter verbessert werden können,
wenn man auch erhöhte
Mengen an Anti-GAD-Antikörper
in Betracht zieht. Die Verbesserung betrifft hauptsächlich eine
erhöhte
Spezifität.
Diese Art der Diagnose ist auf kein bestimmtes Assayverfahren für Anti-Sulfatid-
oder Anti-GAD-Antikörper
beschränkt,
obwohl es zum Einreichungszeitpunkt bevorzugt war, die neuen Formen
der beschriebenen Glykolipide für
Assays auf Anti-Sulfatid-Antikörper
zu verwenden. Die Verwendung erhöhter
Mengen sowohl an Anti-Sulfatid-Antikörper als auch an Anti-GAD-Antikörper in
Kombination als Markierung in Zusammenhang mit IDDM wie oben beschrieben
stellt eine eigene Erfindung dar.
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VERSUCHSTEIL
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Herstellung von entlipidisiertem
Albumin: Albumin wurde mit Hexan, das 5% Eisessig enthielt, bei +4°C entlipidisiert.
Nach gründlichem
Waschen mit Hexan wurde das Albumin gegen Milli Q-Wasser dialysiert und
dann lyophilisiert.
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Biotinmarkiertes entlipidisiertes
Albumin: Fettsäurefreies
Albumin wie oben beschrieben wurde in 0,1 M NaHCO3 auf
eine Konzentration von 10 g/l gelöst. Man versetzte mit Biotin-N-hydroxysuccinimid,
0,1 M in Dimethylformamid, auf eine Endkonzentration von 0,02 M.
Die zum Schluss erhaltene Mischung wurde 60 Minuten lang bei 20°C stehen
gelassen und dann mit einem gleichen Volumen phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
(PBS) versetzt. Das Reaktionsprodukt wurde 24 Stunden lang bei +4°C 5mal gegen
PBS dialysiert.
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Herstellung von Sulfatid: Rinderhirn
wurde mit einem gleichen Volumen Wasser homogenisiert. Dann versetzte
man mit Methanol und Chloroform auf ein Endverhältnis von 4 : 8 : 3 (in bezug
auf das Volumen, Chloroform/Methanol/Wasser). Der erhaltene Lipidextrakt
wurde durch Zentrifugation von Material befreit. Bestandteile mit
niedrigem Molekulargewicht wurden durch Verteilen nach Zugabe von
Chloroform und Methanol im Verhältnis
4 : 2 : 1 (auf das Volumen bezogen, Chloroform/Methanol/Wasser)
entfernt. Der Rohlipidextrakt wurde an Silikagel chromatographiert.
Die isolierte Sulfatidfraktion wurde verseift und nochmals auf Silikagel chromatographiert.
Nach erneutem Verteilen wurde die Sulfatidfraktion weiter durch
Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Schließlich wurde die gereinigte
Fraktion in Methanol gelöst
und durch Zugabe von Aceton gefällt.
Die isolierte Sulfatidfraktion wurde massenspektrometrisch charakterisiert
(FAB-MS). Man erhielt ungefähr
1,5 g Sulfatid pro kg Rinderhirn.
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Adsorption von Sulfatid an Albumin:
Sulfatid (100 nmol in einer Chloroform/Methanol/Wasser-Mischung)
wurde zur Trockne eingedampft, der Rückstand wurde in 500 μl Natriumacetat
(0,05 M, pH 4,5) gelöst, und
der Ansatz wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Ultraschall
behandelt. 0,5 ml entlipidisiertes Albumin, das im gleichen Puffer
gelöst
worden war (2 mg/ml), wurde zu dieser Lösung gegeben. Es wurde über Nach
bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Mischen inkubiert. Danach
wurde das Albumin mit dem adsorbierten Sulfatid durch Zugabe von
50 μl 10%iger
Trichloressigsäure
(Trichloroacetic Acid, TCA) in Wasser bei +4°C gefällt. Nach 30 Minute bei +4°C wurde 3
Minuten lang bei 23000 × g
(bei +4°C)
zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 ml PBS suspendiert und bei
+4°C aufbewahrt.
Das Verfahren ließe
sich auch auf biotinmarkiertes Albumin anwenden.
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Bindung von Sulfatid-Albumin an eine
Festphase: Das Sulfatid-Albumin wurde in 50 mM Carbonatpuffer, pH
9,6, in einer Konzentration von 2,5 mmol/ml suspendiert, und 100 μl dieser
Lösung
wurden in die Näpfchen
einer Mikrotiterplatte (Nunc Storwell Maxisorp Immunomoduler, Dänemark)
gegeben. Die Platte wurden über
2 Stunden lang bei 37°C
inkubiert, anschließend
mit Parafilm verschlossen und bis zur Verwendung bei +4°C aufbewahrt.
Unmittelbar vor dem Assay wurden die Beschichtungslösung von
Hand herausgeschleudert und die Näpfchen wurden eine Stunde lang
mit PBS mit 1% (w/v) Trockenmilchpulver inkubiert, um die unspezifischen
Bindungen an der Oberfläche
abzusättigen.
Das Verfahren ließe
sich auch auf an biotinmarkiertes Albumin gebundenes Sulfatid anwenden.
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ASSAYPROTOKOLL
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Serumproben, 50 μl Serum 1 : 400 mit PBS mit
1% Milchpulver verdünnt,
wurden in die wie oben beschrieben behandelten Näpfchen einer Mikrotiterplatte
gegeben. Bei Seren mit hohem Sulfatidtiter wurden die Proben weiter
verdünnt.
Die Platten wurden dann bei +4°C über Nacht
inkubiert. Als Referenzmaterial wurde gepooltes Serum von Blutspendern
verwendet (50 Serumproben, die einzeln bei einer Analyse mit TLC-ELISA auf
Anti-Sulfatid-Reaktivität negativ
waren). Als innerer Standard wurde ein positives Serum verwendet.
Für jede
Probe wurde ein Dreifachbestimmung durchgeführt. Nach der Inkubation wurden
die Proben von Hand herausgeschleudert und die Näpfchen wurden 6mal im NUNC-Immunowasher
mit 0,1% Albumin gelöst
in PBS gewaschen. Danach wurden 50 μl Anti-Human-IgG-Phospatase-Konjugat
(Zymed, BioZac, Schweden), das im Verhältnis 1 : 500 mit 1% Albumin
in PBS verdünnt
worden war, zugegeben und die Platte wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur
inkubiert. Ungebundene Bestandteile wurden dann durch 5maliges Waschen
mit albuminhaltigem (1%) PBS entfernt. Danach wurde bei +37°C mit 100 μl p-Nitrophenylphosphat
(1 mg/ml) (Phosphatasesubstrattabletten 104, Sigma, USA) gelöst in 1,0
M Diethanolaminpuffer pH 9,8 inkubiert. Die Enzymreaktion wurde
durch Zugabe von 50 μl
3 M NaOH gestoppt. Die Extinktion wurde bei 405 nm bestimmt.
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Die Ergebnisse anhand klinischer
Proben zeigten eine sicherere Diagnose bei IDDM und zeigten auch erstmals,
dass Anti-Sulfatid-Antikörper
in erhöhten
Mengen als Marker für
prädiabetische
Formen von IDDM dient. Aus den Ergebnissen geht nicht nur hervor,
dass sich Anti-Sulfatid-Antikörper als
Marker für
die Kontrolle von Behandlungsschemata eignet, sondern auch, dass
mit diesem Antikörper
als Marker Spätfolgen
von Diabetes diagnostiziert/prognostiziert werden können.
