DE2206103B2 - Verfahren zum Nachweisen und Bestimmen einer Komponente der Reaktion zwischen spezifisch bindenden Proteinen und den Substanzen, die von diesen Proteinen spezifisch gebunden werden - Google Patents

Description

Hochmolekulare Substanzen, wie einfache und kon- adrenocorticotrop^; Hormon (ACTH) nidioinnmuno jugicrte Proteine und Kohlehydrate sind in der Lage, 65 logisch nachzuweisen, es sei denn, daß ein sehr seltene die Bildung von Antikörpern zu verursachen, wenn Antiserum zur Verfügung steht, welches Antisub sie Tieren unter den richtigen Versuchsbedingungen stanzen mit einer außerordentlich hohen Bindung; injiziert werden. Zwischen diesen Antikörpern und der affinität für ACTH er.thäll (vgl. J. Clin. luvest. Vol. 47

1968, S. 2725). Auch die Bestimmung kleinerer Peptidhormone wie Oxytocin in nicht extrahiertem Serum verursacht große Schwierigkeiten, weil die erforderliche Empfindlichkeit nicht erreicht werden kann.

Obwohl im Prinzip die immunologische Kreuzreaktion zwischen Choriongonadotropin (HCG) und luteinisierendem Hormon (LH) es ermöglicht, beide Hormone mit einem Testsystem zu bestimmen, können die meisten Methoden für die Bestimmung von HCG mit Hilfe eines Kupplungsproduktes für HCG und einem Enzym nicht für den Nachweis und die Bestimmung von LH verwendet werden, und zwar deshalb, weil LH in wesentlich geringerer Konzentration im Blut und Urin vorkommt als hCG wahrend der Schwangerschaft, so daß die Empfindlichkeit der Testsysteme unzureichend ist. Dieser Mangel an Empfindlichkeit kann verringert werden, indem die zu bestimmende Substanz aus dem Medium, in welchem sie vorkommt, extrahiert wird oder indem das Medium eingeengt wird. Diese Methoden sind jedoch mit viel Arbeit verbunden und die Ergebnisse häufig unbefriedigend.

Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zum Nachweisen und Bestimmen einer Komponente der Reaktion zwischen spezifisch bindenden Proteinen und den Substanzen, die von diesen Proteinen spezifisch gebunden werden können unter Ausnutzung der bekannten Bindungsaffinität dieser Komponenten füreinander, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die zu bestimmende Komponente mit ihrem Bindungspartner, welcher unlöslich gemacht wurde oder wird, zur Umsetzung bringt, die feste Phase des Reaktionsgemisches von der flüssigen Phase abtrennt und mit einem Kupplungsprodukt zur Umsetzung bringt, welches durch Verbinden eines Enzyms mit einer spezifisch mit einer der Reaktionskomponenten reagierenden Substanz erhalten worden ist und schließlich die Enzymaktivität der flüssigen oder festen Phase in dem erhaltenen Reaktionsgemisch als Maß für die Menge der zu bestimmenden Substanz bestimmt.

Der für die Bestimmung der in unbekannter Menge vorhandenen Komponente benötigte Bindungspartnc-r wird in unlöslicher Form angewendet. Die Bestimmung kann erfolgen, indem der Bindungspartner in unlöslicher Form zu dem Reaktionsgemisch gegeben 4; und das Gemisch in einem heterogenen Medium umgesetzt wird; gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung kann man aber auch die zu bestimmende Komponente mit ihrem Bindungspartner in gelöster Form umsetzen und den Bindungspartner seinerseits mit unlöslich gemachten Antisubstanzen gegen diesen Bindungspartner zur Umsetzung bringen.

Die Substanz, welche spezifisch mit einer der Reaktionskomponenten reagieren kann und die gekuppelt mit einem Enzym verwendet wird, kann die andere Reaktionskomponente, aber auch eine dritte Substanz sein, die dann eine spezifische Affinität für eine der Komponenten der Reaktion besitzen muß.

Das Verfahren ist auf die verschiedenen oben beschriebenen Reaktionssystemc anwendbar, d. h. Antigen/Antikörper, Hapten/Antikörper und niedrigmolekulare Substanz/spezifisches Bindungsprotein. Als dritte Substanz kann ein zweiter Antikörper auftreten, d. h. ein Antikörper gegen die Gammaglobulinfraktion der Tierart, in welcher die ersten Antikörper erzeugt worden sind. Diese Situation kann sich ergeben bei dem System Antigen (erster) Antikörper und Hanten/(erster) Antikörper. Als dritte Substanz kann auch ein Antikörper gegen ein spezifisches Bindungsprotein in Frage kommen.

Das neue Nachweis- und Bestimmungsverfahren wird in zwei Stufen durchgeführt, zwischen dtnen eine Trennung der flüssigen und der festen Phase des Reaktionsgemisches stattfindet. Die zweite Stufe wird mit der festen Phase durchgeführt. Nur in dieser Stufe wird das Enzymkupplungsprodukt verwendet und die Enzymaktivität bestimmt. Hierdurch ergeben sich folgende Vorteile:

1. Die erste Stufe kann mit einem größeren Volumen, als es für die zweite Stufe wünschenswert oder möglich wäre, durchgeführt werden. Dies ist von außerordentlicher Bedeutung, wenn die nachzuweisende Substanz in zu geringer Konzentration vorkommt, um mit Hilfe bekannter Verfahren nachgewiesen werden zu können.

2. In der zu untersuchenden Flüssigkeit können Substanzen vorhanden sein, die die Reaktionen der zweiten Stufe ungünstig beeinflussen. Vor allem das im Kupplungsprodukt vorhandene Enzym und die enzymatisch katalysierende Reaktion kennen gegenüber störenden Substanzen in der Testflüssigkeit empfindlich sein.

Das neu entwickelte Verfahren kann besonders zur Bestimmung von in Körperflüssigkeiten \orhandenen Substanzen wie Hormonen, ihren Antikörpern unci spezifischen Bindungsproteinen sowie Enzymen angewandt werden. Auch Faktoren der Blutgerinnung. Fibrinolyse und Komplcmentsysteme, pathologische Proteine in Körperflüssigkeiten sowie Antikörper gegen pathogene Mikroorganismen und lso-Antikörper lassen sich in dieser Weise bestimmen.

Das Medium, in welchem die erste Stufe der Bestimmung stattfindet, besteht häufig zu einem großen Teil aus Testflüssigkeit wie Urin oder Serum. Wenn notwendig, kann es auf den für immunochemische Reaktionen benötigten pH-Wert eingestellt werden, d. h. auf einen pH-Wert von 5 bis 9 durch Zugabe eines trockenen Puffersalzes oder eines kleinen Volumens einer konzentrierten Pufferlösung. Das Medium der zweiten Stufe ist gleichfalls ein Puffer mit einem für immunochemische Reaktionen benötigten pH-Wen. Zu diesem Zwecke eignen sich Phosphalpuffer, Citratpuffer, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan und Imidazolpuffer. Es kann notwendig sein, für die einsprechende Enzymreaklion einen Puffer anderer Zusammensetzung und anderen pH-Wertes zu verwenden, die von dem verwendeten Enzym abhängen.

Die Herstellung der unlöslich gemachten Reaktionskomponente kann auf verschiedene Weise erfolgen, die unter anderem abhängen von den Eigenschaften dieser Reaktionskomponente. So können Antikörper, spezifische Bindungsproteine und proteinartige Antigene unlöslich gemacht werden durch Vernetzen von ■/.. B. Glutaraldehyd und Chlorameisensäureäthylestcr, durch physikalische Adsorption oder chemisches Kuppeln mit einem unlöslichen Träger wie Cclluloseverbindungen, Agarosc, vernetztes Dextran. Polystyrol und anderes mehr oder durch Kuppeln mit Annkörpern gegen das betreffende Protein gekuppelt n:ii einem unlöslichen Träger. Niedrigmolekuhire Substanzen können mittels Verfahren gebunden werden, die von der Struktur der niedermolekularen Substanz und dem Trügermaterial abhängen. Einige der niedrigmolekularen Substanzen können schon Gruppen be-

sitzen, weiche mit den reaktionsfähigen Stellen auf dem Trägermaterial reagieren können; in anderen Fällen müssen solche Gruppen durch organochemische Reaktionen eingeführt werden.

Die Herstellung der Enzymkupplungsprodukte wird ebenfalls mit Hilfe von Verfahren durchgeführt, die von den Eigenschaften der in das Kupplungsprodukt eingeführten Moleküle abhängen. Eine kovalente Bindung von Proteinen an Enzyme kann mit Reagenzien wie Carbodiimide, Diisocyanate, Glutaraldehyd und Bis-diazobenzidin bewirkt werden. Das Kuppeln der niedrigmolekularen Substanzen kann in vielfältiger Weise erfolgen. Manche dieser Substanzen besitzen. bereits Gruppen, die mit den reaktionsfähigen Gruppen des Enzyms vernetzt werden können; in anderen Fällen müssen solche Gruppen durch organochemische Reaktionen eingeführt werden. Es ist selbstverständlich, daß bei der Herstellung dieser Kupplungsprodukte die ursprünglichen Eigenschaften der an das Enzym gebundenen Substanzen sich nicht sehr ändern sollen und daß auch die Enzymaktivität nicht beträchtlich verringert werden soll.

Die Wahl des Enzyms_y das einen Teil des Kupplungsproduktes bilden soll, wird bestimmt durch Eigenschaften, wie spezifische Bindungsaktivität (eine hohe Umwandlungsgeschwindigkeit erhöht die Empfindlichkeit des Testsystems) und die Einfachheit der Bestimmung des Enzyms. Die Bestimmung eines Enzyms, welches eine Umwandlung katalysiert, an der gefärbte Reaktionskomponenten teilnehmen, ist einfach. Solche colorimetrischen Bestimmungen können in einfacher Weise automatisiert werden.

Gemäß der Erfindung ist es auch möglich, Enzyme zu verwenden, die solche Umwandlungen katalysieren, an denen Reaktionskomponenten beteiligt sind, die spektrophotometrisch oder fluorimetrisch bestimmt werden können. Diese Bestimmungen können gleichfalls automatisiert werden. Bei der Herstellung der Kupplungsprodukte werden Enzyme wie Katalase, Peroxidase, /3-Glucuronidase, /3-B-Glucosidasc, /9-D-Galactosidase, Urease, Glucose-oxidase und Galactoseoxidase bevorzugt, insbesondere die Gruppe der Oxido-Reduktasen.

Zur weiteren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im folgenden ein allgemeines Ausführungsbeispiel beschrieben:

Ein bestimmtes Volumen einer Testfiüssigkeit, beispielsweise 10 cm³, enthaltend in sehr niedriger Konzentration die zu bestimmende Komponente, wird mit einer bestimmten Menge eines unlöslich gemachten Reaktionspartners der zu bestimmenden Substanz vermischt. Die Testfiüssigkeit kann Urin »ein, in der die zu bestimmende Komponente in sehr niedriger Konzentration vorhanden ist oder Serum, das verdünnt worden ist, um den Einfluß von störenden Faktoren zu verringern. Damit die durchzuführende Reaktion in dem heterogenen System stattfinden kann, wird das Gemisch in Bewegung gehalten. Die erhaltene feste Phase wird von der Testflüssigkeit abgetrennt, beispielsweise durch Zentrifugieren, und wenn notwendig, gewaschen. Der erste Teil der Bestimmung kann auch in der Weise durchgeführt werden, daß die Testflüssigkeit mit einer bestimmten Menge des Reaktionspartners der zu bestimmenden Substanz in gelöster Form inkubiert wird, worauf eine Menge eines unlöslich gemachten Antikörpers gegen den Reaktionspartner zugegeben, das Gemisch in Bewegung gehalten und schließlich zentrifugiert wird. Die Abtrennung durch Filtrieren und Absitzenlassen ist gleichfalls möglich.

Bei der Durchführung des zweiten Teils der Bestimmung wird die unlösliche Substanz, welche die feste Phase bildet, wieder suspendiert, und zwar vorzugsweise in einem Puffer und mit einer bestimmten Menge eines Kupplungsproduktes der zu bestimmenden Substanz mit einem Enzym, beispielsweise mit Peroxydase zur Umsetzung gebracht. Nach einer bestimmten Zeit wird die feste Phase erneut abgetrennt, beispielsweise durch Zentrifugieren und darauf die Enzymaktivität in der flüssigen Phase bestimmt. Diese Enzymaktivität ist ein Maß für die Menge der in der Testflüssigkeit zu bestimmenden Substanz. Der zweite Teil des Bestimmungsverfahrens kann auch durchgeführt werden, indem die unlösliche Substanz aus dem ersten Teil des Bestimmungsverfahrens mit einem Kupplungsprodukt umgesetzt wird, welches durch Verbinden einer dritten Substanz, die spezifisch mit der zu bestimmenden Reaktionskomponente reagieren kann, mit einem Enzym erhalten worden ist. Dies wird dann der Fall sein, wenn ein Antikörper bestimmt wird durch das unlöslich gemachte entsprechende Antigen im ersten Teil der Bestimmung und im zweiten Teil dei Bestimmung ein zweiter Antikörper gegen den ersten, der mit einem Enzym gekoppelt ist, verwendet wird.

Die Enzymaktivität einer Phase des Reaktionsgemisches wird nachgewiesen oder gemessen durch Inkubieren dieser Phase mit einem Substrat und anderen Substanzen, die für die entsprechende Enzymreaktion benötigt werden.

Dabei wird z. B. von einer Reaktion Gebrauch gemacht, bei welcher eine gefärbte Verbindung gebildet oder entfernt wird, deren Adsorption leicht quantitativ bestimmt werden kann.

Die Reagenzien können in vielfältiger Form eingesetzt werden. Die Komponente des Reaktionssysttms. gekuppelt mit einem Enzym, kann in einem Puffer gelöst oder gefriergetrocknet sein. Es kann auch ein fester Träger verwendet werden, beispielsweise ein Streifen Papier imprägniert mit dem Enzymkupplungsprodukt.

Die unlösliche Komponente kann in Form von Teilchen unterschiedlicher Größe wie Körner, Platten und Stäbe oder in Form eines Streifens eines beliebigen Trägermaterials zur Anwendung kommen.

Für die Durchführung des Bestimmungsverfahrens wird üblicherweise eine Testpackung verwendet, die hauptsächlich besteht aus

a) einer bestimmten Menge des Enzymkupplungsproduktes,

b) einer entsprechenden Menge einer der Komponenten des Reaktionssystems in unlöslicher Form,

c) einem Substrat für die Bestimmung der Menge des verwendeten Enzyms.

Die Testpackung kann gegebenenfalls auch die erforderlichen Hilfsmittel enthalten, um eine Verdünnungsrcihe der zu prüfenden Probe für quantitative Bestimmung herzustellen, beispielsweise Teströhrchen, Pipetten und Flaschen, enthaltend ein Verdünnungsmittel. Für die Bestimmung von Antigenen oder Haptenen oder ihren Antikörpern enthält die Testpackung zumindest

a) eine bestimmte Menge des Kupplungsproduktes des Antigens oder Haptens oder einen Antikörper gegen es sowie ein En^ym;

b) eine entsprechende Menge einer unlöslich gemachten Komponente des Reaktionssystems Antigen/Antikörper oder Hapten/Antikörper und

c) ein Substrat für die Bestimmung der Enzymaktivilät.

Die folgenden speziellen Beispiele erläutern die Erfindung noch näher.

Beispiel 1
Bestimmung von Choriongonadotropin (HCG) im

Serum,
a) Herstellung von HCG-HRP

5 mg HCG und 20 mg Meerrettisch-Peroxidase (HRP) wurden in 2 cm³ eines 0,05molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 6,2 gelöst. Nach der Zugabe von 40 μΐ einer 25%igen Glutaraldehydlösung wurde das Gemisch bei Raumtemperatur 2 Stunden geschüttelt. Darauf wurde das Gemisch 5 Minuten bei 250 g zentrifugiert und darauf über ein stark vernetztes Dextran in einem 0,05molaren Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,2 fraktioniert. Die Fraktionen, deren höchster Prozentsatz Enzymaktivität durch Antikörper gegen HCG gebunden war, wurden im Testsystem verwendet.

b) Herstellung von Antikörpern gegen HCG

Antikörper gegen HCG wurden in Kaninchen erzeugt, wie von S c h u u r s et. al. in Acta Endocr. (Kbh.), 59 (1968), beschrieben.

c) Herstellung des Immuno-Adsorbens,
Anti-HCG-Cellulose

Die Gammaglobulin-Fraktion des unter b) beschriebenen Anti-HCG-Serums wurde durch Ausfällen mit 18% (Gewicht pro Volumen) festem Na₂SO₁ hergestellt. Der Niederschlag wurde gewaschen und dann in so viel 0,05molarem Boratpuffer vom pH-Wert 8,6 aufgenommen, daß die Protein-Endkonzentration 10 mg/cm³ betrug.

m-Aminobenzyloxymethyl-cellulose (350 mg), hergestellt nach Gurvichs Methode, beschrieben in Biokihimiya, 26,934 (1961), wurde in 50 cm³ destilliertem Wasser suspendiert und durch Zugabe von 10 cm³ 36%iger Salzsäure und tropfenweiser Zugabe von 10cm^a 10%iger Natriumnitritlösung diazotiert. Die Suspension wurde zentrifugiert, der Niederschlag gewaschen und wieder in 43 cm⁸ einer 0,05molaren Natriumboratlösung vom pH 8,6 suspendiert. Dieser Suspension wurden 7 cm³ der hergestellten Gammaglobulin-Lösung zugegeben. Das Gemisch wurde 26 Stunden bei 4° C gerührt, zentrifugiert und schließlich mit 11 eines 0,02molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 6,0 gewaschen.

d) Bestimmung von HCG im Serum

Eine Verdünnungsreihe von HCG (8-4-2-1-0,5-0,25-0 ΙΕ/cm³) wurde mit einer Verdünnungsflüssigkeit hergestellt, die aus einem Teil menschlichem Serum und zwei Teilen eines 0,05molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 6,2 bestand. Von jeder derart hergestellten HCG-Verdünnung wurden 0,5 cm* 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 0,5 cm^s der Immuno-Adsorbens-Suspension (4mg/cm») hergestellt gemäße), rotiert und dann zentrifugiert. Der Niederschlag wurde zweimal gewaschen, jedes Mal mit 2 cm³ 0,05mo!arem Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,2. Der Niederschlag wurde dann mit 0,1 cm⁸ HCG-HRP-Lösung in einer geeigneten Verdünnung sowie in 0,05molarem Phosphatpuffer vom pH-V/ert 6,2 vermischt und wiederum bei Raumtemperatur 2 Stunden lang rotiert.

Nach dem Zentrifugieren wurde die Enzymaktivität in der überstehenden Flüssigkeit bestimmt durch Zugabe von 0,5 cm³ dieser überstehenden Flüssigkeit zu 1,5 cm³ einer Substratlösung, bestehend aus 10 μΐ 30%igem HjO₂ und 20 mg 5-Aminosalicylsäure in 150 cm³ eines 0,02molaren Phosphatpuffers vom

ίο pH-Wert 6,0. Nach 30 Minuten wurde die Extinktion gemessen bei 460 nm.

In dem beschriebenen Testsystem verursachte eine HCG-Konzentration von 0,25 I.E./cm³ eine meßbare Zunahme der Enzymaktivität in der überstehenden Flüssigkeit, während einer Konzentration von einer I.E./cm³ die maximale Zunahme verursachte. In diesem Test erwies sich, daß die Zentrifugierstufe von entscheidender Bedeutung war, weil bei Auslassen dieser Stufe falsche Meßergebnisse für die Enzymaktivität erhalten wurden, die unter anderem auf der Trübung des Serums und seiner peroxidase-artigen Aktivität beruhten.

Der HCG-Gehalt im Serum von schwangeren Frauen ließ sich nach dieser Versuchsanordnung bestimmen, vorausgesetzt, daß die Serumprobe im Verhältnis von mindestens 1: 3 verdünnt wurde.

Beispiel 2

Bestimmung von HCG in niederer Konzentration mit Hilfe eines Enzym-Antigen-Kupplungsproduktes.

a) Herstellung von Antisubstanzen gegen Kaninchen-Gammaglobulin

Kaninchen-Gamrnaglobulin wurde aus normalem Kaninchenserum isoliert durch Ausfällen mit 18% (Gew./Volumen) festem Na₂SO₄. Antikörper gegen dieses Gammaglobulin wurden in Schafen erzeugt.

Das Injektionsschema lautete:

40 Tag	Menge	Freunds	Injektionsart
		Adjuvans
0	0,5 mg	+	intramuskulär
14	0,5 mg	+	intramuskulär
45 28	1 mg	+	intramuskulär
42	1 mg	—	intravenös
56	lmg	—	intravenös

Am 70. Tage wurde dem Schaf das Blut abgenommen.

b) Herstellung von [Schaf-AntHKaninchen-Gammaglobulin^-Cellulose

Die Gammaglobulin-Fraktion des unter a) beschrie benen Schafsserums wurde hergestellt durch Ausfälle! mit 16% (Gewicht je Volumen) festem Natriumsulfat Diese Gammaglobulin-Fraktion wurde, wie in Bei spiel 1 c) beschrieben, an m-Aminobenzyloxymethyl cellulose gebunden.

c) Bestimmung von Choriongonadotropin beim Menschen (HCG)

Eine Verdünnungsreihe von HCG wurde in einer 0,01 molaren Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0 herge stellt, der gleichfalls 2% (Volumen/Volumen) normale Schafsserum enthielt. Die Verdünnungsreihe lag ir Bereich von 10 bis 32OI.E./1, der Verdünnungsfaktc betrug 2.

10

5 cm³ einer HCG-Lösung wurden mit 0,1 cm³ Kaninchen-(Anti-HCG-)Serum gemäß Beispiel 1 b), verdünnt mit demselben Puffer bis zur gewünschten Stärke, versetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen; darauf wurden 1,5 mg [Schaf - anti - (Kaninchen - Gammaglobulin)] - Cellulose zugegeben und das Gemisch 2 Stunden lang rotiert.

Die Cellulose wurde 10 Minuten bei 3000 UpM telt. Schließlich wurde das Gemisch auf einer Dextran-Kolonne in einem 0,05molaren Phosphatäuffer vom pH-Wert 6,5 fraktioniert. Die Fraktionen, deren höchster Prozentsatz Enzymaktivität an HCG-CeIIulose gebunden war, wurden im Testsystem verwendet.

ti) Bestimmung von HCG und LH 10 cm³ einer HCG-Verdünnungsreihe von HCG und

zentrifugiert und in lern³ einer Lösung des HCG- 10 cnr einer HCG-Verdünnungsreihe von LH wurden HRP-Kupplungsproduktes gemäß Beispiel la) suspen- io mit 5 mg Anti-HCG-Cellulose, hergestellt gemäß Beidiert, verdünnt zu der gewünschten Stärke mit 0,01 mo- spiel Ic) und suspendiert in 1 cm³ 0,15molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0, vermischt und die Gemische bei Raumtemperatur 2 Stunden lang rotiert.

larem Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0 mit 2 % normalem Schafsserum.

Das Gemisch wurde wiederum 2 Stunden lang gerührt. Nach dem Zentrifugieren wurde die Enzymakti- vität in der überstehenden Flüssigkeit bestimmt durch Zugabe von 0,5 cm³ dieser Flüssigkeit zu 1,5 cm⁵ Enzymsubstrat, bestehend aus 10 μΐ 30%igem Wasserstoffsuperoxid und 20 mg 5-Aminosalicylsäure in 150 cm³ eines 0,01molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 6,0. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 25°C stehengelassen; darauf wurde die Extinktion bei 460 nm bestimmt. In der überstehenden Flüssigkeit wurde 100% Enzymaktivität gemessen, vorausgesetzt, daß kein Anti-HCG-Serum zugegeben worden war.

Eine Verdünnungsreihe von HCG, hergestellt mit Kinderurin als Verdünnungsflüssigkeit, ergab ein identisches Schema, so daß auch Messungen in Urinproben durchgeführt werden können. Das immuno-Adsorbens wurde zentrifugiert und mit 5 cm³ des 0,05molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 6,0 gewaschen.

Das Immuno-Adsorbens wurde mit 1 cm³ des(Anti-HCG-)HRP-Kupplungsproduktes in der gewünschten Verdünnung versetzt und das Gemisch dann wiederum 2 Stunden lang rotiert. Schließlich wurde nach dem Zentrifugieren die Enzymaktivität der überstehenden Flüssigkeit bestimmt, wie in den vorausgegangenen Beispielen beschrieben.

Mit diesem Verfahren ließ sich eine HCG-Konzentration von 5 bis 10 I.E./l und eine LH-Konzer.;ration von 10 bis 20 I.E./l bestimmen. Wurde die Zentrif ugierstufe übergangen, so betrug die optimale Probengröße 0,5 cm³, und die Empfindlichkeit lag bei etwa 100 I.E./l HCG oder etwa 200 I.E./l LH; dies bedeutet,

Die Zentrifugierstufe bewirkt eine um lOfach höhere 30 daß das Verfahren nach der Erfindung eine 10- bis Empfindlichkeit, als sie in einem System ohne Zentri- 2Ofache Steigerung der Empfindlichkeit bewirkt.

fugieren erreicht wird.

Beispiel 3

Bestimmung von HCG und LH in niederen Konzcntrationen mit Hilfe eines Enzym-Antikörper-Kupplungsproduktes.

a) Herstellung des Immuno-Adsorbens HCG Cellulose

Dieses Immuno-Adsorbens wurde gemäß der in Beispiel 1 c) beschriebenen Arbeitsweise hergestellt, jedoch an Stelle von Kaninchen-Gammaglobulin 100 mg HCG mit 500 mg m-Aminobenzyloxymethylcellulose gekuppelt.

b) Reinigung von Antikörpern gegen HCG

10 cm³ Kaninchen-Anti-HCG-Serum, hergestellt gemäß Beispiel 1 b), wurden mit 90 cm³ 0,05 molarem Citrat vom pH-Wert 5,0 verdünnt und langsam über das Immuno-Adsorbens laufengelassen, das vermischt mit 10 Teilen stark vernetzten! Dextran in eine Säule gefüllt worden war. Das Immuno-Adsorbens wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen, bis kein Protein mehr eluiert wurde. Die Antisubstanzen wurden mit 0,G5molarem Citrat-Puffer vom pH-Wert 2,0 eluiert. Die Fraktionen wurden in einem halben Volumen 0,25molarer NaHCO₃-Lösung gesammelt, ihr Gehalt an Antikörpern und Protein getestet und die geeigneten Fraktionen eingefroren.

Beispiel 4 Bestimmung von HCG und Anti-HCG

c) Herstellung des Kupplungsproduktes (Anti-HCG)-HRP

20 mg Meerrettich-Peroxidase (HRP) wurden in 2 cm³ einer Antikörperlösung mit einem Proteingehalt von 2 mg/cm³ gelöst. Diese Lösung wurde mit 8 μΐ einer 25%igen Glutaraldehydlösung versetzt und das Gemisch 2 Stunden bei Raumtemperatur geschüt-

a) Kaninrhenserum wurde über DEAE-Ceüulose (DiäthvJarninäihyläther der Cellulose) eemäß H. A. Sober et al. in J. Am. Chem. Soc, 78, 756 (1956), fraktioniert. Ein Teil der isolierten Gammaglobulin-

Fraktion, die immunoelektrophoretisch rein war, wurde zur Erzeugung von Antikörpern im Schaf, entsprechend dem in Beispiel 2 a) gegebenen Schema, verwendet: weitere 100mg Kaninchen-Gammaglobulin wurden mit 500 mg m-Aminobenzyloxymethyl-

Cellulose in der in Beispiel Ic) beschriebenen Weise gekuppelt.

Aus dem hergestellten Schafsserum mit Anti-Kaninchen-Gammaglobulin wurden die spezifischen Antikörper gemäß Beispie! 3 b) mit dem hergestellten

Immuno-Adsorbers isoliert.

b) Das Kupplungsprodukt [Anti - (Kaninchen-Gammaglobulin)]-HR.P wurde analoa dem Kupplungsprodukt (Anti-HCG)-HRP. wie In Beispiel 3c) beschrieben, hergestellt.

c) Bestimmung von Anti-HCG: Eine Verdünnungsreihe vom Kaninchen-(Anti-HCG-)Serum wurde mil einem 0,05 molaren Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,Ci hergestellt.
0,5 cm³ Kaninchen-(Anti-HCG-)Serum wurde mit

0,25 mg HCG-Cellulcse 2 Stunden rotiert (s. Beispiel 3a). Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert und der Niederschlag 4mal mit Phosphatpuffer ausgeh waschen, jedesmal mit 3 cm³; darauf wurde der Nieder·] schlag in 1 cm³ einer Lösung des Kupplungsproduk

tes b) wieder suspendier!. Das erhaltene Gemisd wurde erneut 2 Stunden lang rotiert. Nach dem Zentri fugieren wurde die Enzymaktivität der überstehender Flüssigkeit bestimmt, wie in Beispiel Id) beschrieben

11 12

d) Bestimmung von HCG: Mit den hergestellten lin-)Serum wurden 1,6 mg Natriumsulfat gegeben. Das

Reagenzien wurde HCG bestimmt durch Inkubieren Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur ge-

seiner Lösungen mit 0,5 cm³ KLaninchen-(Anti-HCG-) rührt; der Miederschlag wurde abzentrifugiert, zwei-

Serum in einer Verdünnung, die in dem unter c) be- mal mit 20 cm³ einer 16%igen (Gewicht/Volumen) Na-

schriebenen System gerade eine fast maximale Re- 5 triumsulfatlösung gewaschen und schließlich in 10 cm³

duktion der Enzymaktivität in der überstehenden O.lmolarer Natriumdicarbonatlösung aufgenommen.

Flüssigkeit bewirkt; mit dem erhaltenen Gemisch Die aktivierte Cellulose wurde 40cm³ einer 0,lmo-

wurde das unter c) beschriebene Verfahren durchge- laren Natriumbicarbonatlösung und den 10 cm³

führt. Globulinlösung vermischt. Diese Suspension wurde

Wurden 5 cm³ HCG-Lösung verwendet, so konnten io 40 Stunden bei 4°C rotiert und gewaschen: zweimal Konzentrationen von etwa 10 I.E./l HCG nachge- mit 5 cm³ 0,5molarer Natriumbicarbonatlösung, zweiwiesen werden. mal mit 500 cm³ 0,05molarer Citratlösung mit pH-Wert _R · · ι ί 1,1 und zweimal mit 500 cm³ 0,05molarer Phosphat^p lösung mit pH-Wert 6,2.

Bestimmung von Insulin i m Serum 15 _x _ ,. . _

e) Bestimmung von Insulin im Serum

a) Herstellung von Insulin-(Glucose-Oxidase) _4cm, _einer i_nsui_in.Verdünnungsreihe im Bereich 5 mg Schweineinsulin und 25 cm³ Glucose-Oxidase von 0 bis 100 ng/cm³ wurden bei Raumtemperatur

wurden in 2 cm³ 0,05molarem Phosphatpuffer vom 4 Stunden lang mit 1,0 cm³ Antiinsulinserum (mit

pH-Wert 6,5 gelöst. Diese Lösung wurde mit 5 μΐ einer 20 0,15molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0 ver-

25%igen Glutaraldehydlösung versetzt und das Ge- dünnt auf die gewünschte Stärke) inkubiert. Darauf

misch dann bei Raumtemperatur 90 Minuten ge- wurden 5 mg des gemäß d) hergestellten Immuno-

schüttelt. Das Gemisch wurde über vernetzten! Adsorbens, suspendiert in 1 cm³ 0,15molarem Phos-

Dextran in 0,05molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert phatpuffer vom pH-Wert 6,0 zugegeben und das er-

6,5 fraktioniert. Die Fraktionen, deren höchster 25 haltene Gemisch über Nacht bei 4°C rotiert. Das

Prozentsatz an Enzymaktivität von Antikörpern gegen Immuno-Adsorbens wurde zentrifugiert und dreimal

Insulin gebunden werden konnte, wurden im Test- mit jeweils 5 cm³ 0,05molarem Phosphatpuffer vom

system verwendet. pH-Wert 6.0 gewaschen, dem 2% Schafsserum zugegeben worden waren. Dann wurden 1,0 cm³ Insulin-

b) Herstellung von Antikörpern gegen Insulin _{3o Glucoseoxidase} verdünnt auf die gewünschte Stärke

10 Meerschweinchen wurden einmal wöchentlich mit dem Waschpuffer, zu dem Immuno-Adsorbens während einer Zeitspanne von 4 bis 8 Wochen 1 mg gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde erneut über Schweineinsulin in vollständigem Freunds Adjuvans Nacht rotiert und dann zentrifugiert; darauf wurde in intramuskulär injiziert. Die Tiere wurden 2 Wochen der überstehenden Flüssigkeit die Enzymaktivität gelang sich selbst überlassen; darauf wurde intravenös 35 messen; hierzu wurden 0,5 cm³ Flüssigkeit mit 2,5 cm³ ein weiteres mg insulin ohne Adjuvans injiziert. einer Substratlösung inkubiert und die Extinktion bei 2 Wochen später wurde den Tieren Blut abgenommen. 460 nm gemessen. Die Substratlösung enthielt 50 mg Gelegentlich auftretende Hypoglykaemie wurde durch Glucose. 10 μ-g Peroxidase und 1 mg 5-Aminosalicylintraperitoneale Administration von Glucose bekämpft. säure je 2,5 cm³ des 0,05molaren Phosphatpuffers vom

40 pH-Wert 6,0.

c) Herstellung von Antisubstanzen _Die Zentrifugierstufe. die in diesem Falle sowohl

gegen Meerschweinchen-Gammaglobulm _{dazu djentei das e}i_nzusetzende Maximalvolumen der

Zur Herstellung von Meerschweinchen-Gamma- Testflüssigkeit zu erhöhen als auch die Reaktion

globulin wurde 1 Volumen einer gesättigten Ammo- störende Serumfaktoren zu entfernen, bewirkte eine

niumsulfatlösung zu 2 Volumina Meerschweinchen- 45 1Ofache Steigerung der Empfindlichkeit, so daß eine

serum gegeben. Der erhaltene Niederschlag wurde Konzentration von wenigen ng/cm³ Insulin nachge·

zweimal mit 33%iger gesättigter Ammoniumsuifat- wiesen werden konnten,
lösung gewaschen und dann in einer physiologischen

Salzlösung aufgenommen. Ein Schaf wurde mit zu- B e i s ρ i e 1 6

nehmenden Dosen des hergestellten Gammaelobulins, 50 _ . /->.·,

nämlich mit 0,5,1 und 2 mi immunisiert. Die Injektio- Best.mmung von Oestrad.ol

nen wurden alle 2 Wochen verabfolgt und das Immuno- _{a) Bestimmung von} Ocstradiol-17-succinyl-HRP gen mit vollständigem Freunds Adjuvans vermischt.

Zwei Wochen nach der letzten Injektion wurden 50 mg Oestradiol-17-bernsteinsäurehalbester um

weitere 2 mg Gammaglobulin in einer physiologischen 55 0,08 cm³ Tri-n-buty'lamin wurden in 2,5 cm³ Dioxai

Kochsalzlösung gegeben. 1 Wochen später wurde dem gelöst. Zu der kalten Lösung (2° C) wurden 15 μΐ Iso

Tier Blut abgenommen. butylchlorcarbonat gegeben. Nach 30 Minuten wurd

_, , „ ... ... ... .. diese Lösung mit 100 mg Meerrettich-Peroxidase (HRP

d) Herstellung von unlöslichen Antikörpern _in ^_{5 cm}, _{ejnes 2}. ₃__{Gemisches aus Dioxan un},

gegen Meerschweinchen-Gammaglobuhn _{6o Was5er das mft Natron}i_{auge auf pH}-Wert 9,5 einge

10 mg mikrokristalline Cellulose wurden aktiviert, stellt worden war, vermischt. Die Lösung wurd

indem sie unter Rühren zu 400 cm³ einer 2,5%igen 4 Stunden bei 2° C gerührt und darauf 18 Stunden lan

(Gewicht/Volumen) CNBr-Lösung gegeben wurden; dialysiert. Der Niederschlag, der erhalten wurde nac

darauf wurde der pH-Wert mit 1 η-Natronlauge auf Einstellen des pH-Wertes des Dialysates auf 4,6, wurd

10,5 eingestellt und 2 Minuten bei diesem pH-Wert ge- 65 abzentrifugiert, gewaschen und in 5 cm³ destillierter

halten. Die Cellulose wurde mit Eiswasser und mit Wasser, eingestellt auf pH-Wert 8, aufgenommen. Da

O.lmolarer Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Zu Material wurde weiter gereinigt durch zweimalige

10 cm³ Schaf-Anti-iMeerschweinchen-Gammaglobu- Ausfällen mit 10 cm³ Aceton. Das Endprodukt wurd

in 10 cm⁸ eines 0,05molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,8 aufgenommen.

b) Herstellung von Oestradiol-H-succinyl-BSA

Die Herstellung erfolgte gemäß der unter a) be schriebenen Mischanhydrid-Methode. Das Ausgangsmaterial waren 100 mg Oestradiol-17-bernsteinsäurehalbester und 150 mg Rinderserumalbumin (BSA).

c) Herstellung von Antisubstanzen gegen Oestradiol

Einem Schaf wurden alle 4 Wochen 4 mg Oestradiol-17-succinyl-BSA in vollständigem Freunds Adjuvans injiziert. In regelmäßigen Intervallen wurde dem Schaf Blut entnommen. Das Serum wurde mit BSA adsorbiert.

d) Herstellung von Antisubstanzen gegen Schaf-Gammaglobulin

Schaf-Gammaglobulin wurde, wie in Beispiel 2b) beschrieben, hergestellt, dieses Mal jedoch mit 16% Gewicht/Volumen Natriumsulfat. Kaninchen wurden mit diesem Schaf-Gammaglobulin nach folgendem Schema immunisiert:

intramuskulär intramuskulär intramuskulär intravenös

2 Wochen nach der letzten Injektion wurde den Tieren Blut abgenommen.

e) Herstellung des Immuno-Adsorbens [Kaninchen-Anti-iSchafsgammaglobuliniJ-Cellulose

Die Gammaglobulin-Fraktion der unter b) beschriebenen Antisera wurde durch Ausfällen mit 18% Gew./Vol. Na₂SO₄ hergestellt. Das erhaltene Produkt wurde mit Cellulose nach Gurvichs Methode, beschrieben in Beispiel 1 c), gekuppelt.

f) Bestimmung von Oestradiol

Eine Verdünnungsreihe von Oestradiol (0-0,5-1-2-4-8-16 ng/cm³) wurde in Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0 hergestellt. Jeweils eine 5-cm³-Probe wurde mit 0,5 cm³ des Schafs-Anti-Oestradiol-Serums in der gewünschten Verdünnung vermischt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und darauf lern³Immuno-Adsorbenssuspension[gemäße)] von 60 mg/cm³ zugegeben; darauf wurde das Gemisch 4 Stunden lang bei Raumtemperatur rotiert. Die Cellulose wurde abzentrifugiert und mit 5 cm³ des 0,05molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 6,0, enthaltend 2% BSA, gewaschen. Darauf wurden 1 cm³ Oestradiol-17-succinyl-HRP, verdünnt auf die gewünschte Stärke mit dem Puffer, mit welchem das Gemisch gewaschen worden war, zu der Cellulose gegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden rotiert; darauf wurde erneut zentrifugiert. Die Enzymaktivtät in der überstehenden Flüssigkeit, wie in Beispiel 1 beschrieben, gemessen.

- 5 Mit Hilfe dieser beschriebenen Verfahrensweise ließen sich Konzentrationen von 1 ng/cm³ Oestradiol nachweisen; dies bedeutet eine Zunahme der Empfindlichkeit um den Faktor 10, verglichen mit dem entsprechenden Test ohne Zentrifugierstufe.

Beispiel 7

Bestimmung von Cortisol

a) Herstellung von Cortisol-21-galactose-oxidase

50 mg Cortisol-21-Bernsteinsäurehalbester und 100 mg Galactose-oxidase wurden gemäß Beispiel 6 a) gekuppelt.

b) Herstellung von unlöslichem Transcortin

100 mg Transcortin, gereinigt durch Chromatographie auf DEAE-Cellulose und anschließend auf Hydroxylapatit, wurden mit 3 mg Sepharose 4 B nach der CNBr-Methode gekuppelt: Eine Sepharose-4B-Suspension (3 g) wurde aktiviert durch Vermischen

25 niit 4 cm³ 2,5°/_oiger (Gewicht/Volumen) CNBr-Lösung

Tag Menge Freunds Injektionsart in destilliertem Wasser; darauf wurde der pH-Wert

Adjuvans mit 1 η-Natronlauge auf 10 bis 11 eingestellt und

6 Minuten bei diesem Wert gehalten. Anschließend wurde die Sepharose mit Eiswasser und mit OJmolarer Natriumbicarbonatlösung gewaschen; dann wurden 100 mg Transcortin in 20 cm³ 0,lmolarer Natriumbicarbonatlösung zugegeben und die Suspension bei 4°C 24 Stunden lang geschüttelt. Es wurde nacheinander mit 0,5molarer Natriumbicarbonatlösung, 0,05-molarem Citratpuffer vom pH-Wert 1,1 und 0,05molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0 gewaschen und die Sepharose im letzten Puffer gehalten, dem 0,1 % Methiolat zugesetzt worden war.

c) Bestimmung von Cortisol

Eine Cortisolverdünnungsreihe im Bereich von 0,25 bis 16 ng/cm³ wurde in 0,05molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0 hergestellt. 5 cm³ jeder Cortisollösung (im 0,05molaren Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,0) wurde über Nacht mit 5 mg Transcortin-Sepharose bei 4° C rotieii. Nach dem Zentrifugieren wurden 1 cm³ Cortisol-21-galactoseoxidase-Lösung, verdünnt auf geeignete Konzentration mit dem oben genannten Puffer, zugegeben und dieses Gemisch 2 Stunden bei 4°C rotiert. Nach erneutem Zentrifugieren wurde die Enzymaktivität in der überstehenden Flüssigkeit bestimmt durch Zugabe von 0,5 cm⁸ der Flüssigkeit zu 1,5 cm³ Substrat, bestehend aus 100 mg D-Galactose. 20 mg 5-Aminosalicylsäure und 10 μg Peroxidase in 150 cm³ eines 0,02molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 6,0. Schließlich, nach 30 Minuten, wurde die Extinktion bei 460 nm gemessen.

Mit Hilfe dieses Verfahrens ließen sich etwa 1 ng/cm^s Cortisol nachweisen, was eine Steigerung der

Empfindlichkeit um den Faktor 10 bedeutet.

O	200 μβ
14	400 μg
28	800 μg
42	800 μg

Claims (3)

1 2 injizierten hochmolekularen Substanz, dem Antigen Patentansprüche- spielt wiederum die spezifische Bindungsaffinität ein. Rolle.

1. Verfahren zum Nachweisen und Bestimmen Bestimmungsmethoden unter Ausnutzung dies-, einer Komponente der Reaktion zwischen spezi- 5 bestimmten Bindungsaffinitaten beruhen oft auf de: fisch bindenden Proteinen und den Substanzen, die Konkurrenz zwischen der zu bestimmenden bubstan; von diesen Proteinen spezifisch gebunden werden in der Probe und der bekannten Menge der gleichen können unter Ausnutzung der bekannten Bindungs- radioaktiv markierten Substanz fur eine begrenzt! affinität dieser Komponenten füreinander, da- Menge ihres Bindungspartners. Die Menge der 5:1 durch gekennzeichnet, daß man die zu 10 bestimmenden Substanz bestimmt, welcher feil dei bestimmende Komponente mit ihrem Bindungs- radioaktiv markierten Substanz durch ihren Bnndungs partner, welcher unlöslich gemacht wurde oder partner gebunden werden kann. Es ist auch möglich wird, zur Umsetzung bringt, die feste Phase des eine unbekannte Menge von spezifisch bindenden Reaktionsgemisches von der flüssigen Phase ab- Protein durch Umsetzen einer Probe dieses Protein: trennt und mit einem Kupplungsprodukt zur Um- 15 mit einer bestimmten Menge radioaktiv markierter Setzung bringt, welches durch Verbinden eines spezifisch bindender Substanz nachzuweisen (v<_;] Enzyms mit einer spezifisch mit einer der Reak- Radioisotopes in Medicine. In vitro studies, Heraus tionskomponenten reagierenden Substanz erhalten geber Hayes, Goswitz, Murphy, USAEC, Oak Ridge worden ist und schließlich die Enzymaktivität der 1968, S. 7). Die Benennungen, mit welchen diese flüssigen oder festen Phase in dem erhaltenen ao Methoden in der Literatur bezeichnet werden, hänger Reaktionsgemisch als Maß für die Menge der zu von der Art des spezifisch bindenden Proteins ab. Sc bestimmenden Substanz bestimmt. ist die Rede von »Versuchen mit konkurrierendcT

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- bindendem Protein«, wenn Rezeptor- oder Transport zeichnet, daß man die zu bestimmende Kompo- Proteine verwendet werden und von »radioimmuno nente mit ihrem Bindungspartner in gelöster Form *5 logischen Bestimmungen«, wenn Antikörper als sp-? umsetzt und den Bindungspartner seinerseits mit zifisch bindendes Protein verwendet werden,
unlöslich gemachten Antisubstanzen gegen diesen Anstatt eine der Komponenten der oben beschri*; Bindungspartner zur Umsetzung bringt. benen Reaktionen mit einem radioaktiven Isotop η

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch markieren, kann auch ein Enzym als markierende gekennzeichnet, daß man als Enzym eine Oxido- 30 Substanz verwendet werden (vgl. Bull. Soc. Chem Reduktase verwendet. Biol., Vo!. 50, 1968, S. 1169 bis 1178). Dort, wo Ge

brauch gemacht wird von der Bindungsaffiniiät zwischen einer niedrigmolekularen Substanz und ihren

spezifischen bindenden Protein, kann die niedrig

35 molekulare Substanz mit einem Enzym gekuppel werden (vgl. älteren Vorschlag gemäßDT-OS 21 55 658)

Für den Nachweis und die Bestimmung von Sub- Das Kupplungsprodukt — niedrigmoleku'are Sub stanzen, weiche eine wichtige Rolle in biochemischen stanz/Enzym — kann dann für experimentelle An Prozessen spielen, d. h. niedrigmolekulare Substanzen Ordnungen, wie oben beschrieben, verwendet werden. wie Vitamine und Steroide oder hochmolekulare Ver- 40 Wird Gebrauch gemacht von der Bindungsaffinitä bindungen wie Proteine und Kohlehydrate lassen sich zwischen einem Antigen und seinem Antikörper, η häufig Reaktionen dieser Substanzen mit Proteinen kann das Antigen beispielsweise mit einem Enzyn ausnutzen, welche eine spezifische Bindungsaffinität gekuppelt werden, anstatt, wie bei radioimmuno für diese Substanzen besitzen. So kann man die Kon- logischen Verfahren gebräuchlich, mit einem radio zentration eines Steroids bestimmen, indem man ein 45 aktiven Isotop markiert zu werden.
Protein verwendet, das dieses Steroid spezifisch binden Für alle Verfahren, bei denen solch eine markier«

kann. Als Beispiel für derartige Kombinationen seien Reaktionskomponente verwendet wird, ist eine gegenannt Cortisol und Transcortin (auch CBG = Cor- eignete Methode zum Abtrennen der freien markierten ticosteroid-bindende? Globulin), 17/9-Oestradiol und an ihrem Bindungspartner hängenden Verbindur; das Oestradiol bindende Rezeptor-Protein des Uterus 50 wesentlich. Je nach Art der an der Reaktion teil (vgl. J. Clin. Endocrinol. Metabol., Vol. 27, 1967, nehmenden Substanzen können verschiedene Trenn S. 973, und Vol. 28, 1968, S. 127). methoden angewandt werden, beispielsweise Elektro

Es ist auch möglich, eine niedrigmolekulare Sub- phorese, Gelfiltration, selektive Adsorption, Anwen stanz chemisch mit einem Protein zu verbinden und den einer der R.eaktionskomponenten in unlöslicl dieses Konjugat einem Versuchstier zu injizieren, wel- 55 gemachter Form und Anwenden von Antikörpen ches dann durch Bildung von Antikörpern gegen gegen eine der Reaktionskomponenten, gleichfalls ii unter anderem die niedrigmolekulare Substanz rea- unlöslich gemachter Form.

giert. Die niedrigmolekulare Substanz wird in diesem Trotz der hohen Empfindlichkeit, die mit diesen

Falle als sogenanntes Hapten angesehen. Die Anti- Verfahren erzielt werden kann, ist es nicht immer möj> körper gegen das Hapten können als besonderer Fall ⁶° lieh, Substanzen nachzuweisen oder zu bestimmen von spezifisch bindenden Proleinen angesehen werden welche in extrem niederen Konzentrationen beispiels (vgl. Methods of Immunology and lmmunochemistry. weise im Serum oder Urin, vorkommen. So ist e·: Band I). außerordentlich schwierig und häufig unmöglich, du