JP5922147B2 - 多能性幹細胞に由来するインスリン産生細胞 - Google Patents

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Description

本発明は、そのいくつかの実施形態において、多能性幹細胞に由来するインスリン産生細胞、及びそれを作製する方法に関する。
Ｉ型糖尿病において、ランゲルハンス島（Ｉｓｌｅｔｓ ｏｆ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ）におけるインスリン産生細胞又はβ細胞は破壊されている。ランゲルハンス島は、インスリンを産生するβ細胞（ヒトにおいて膵内分泌部の約５５％）、グルカゴンを産生するα細胞（ヒトにおいて約３５％）、ソマトスタチンを産生するδ細胞（３〜１０％）、膵臓ポリペプチドを産生するＰＰ細胞（３〜５％）、及びグレリン（ｇｒｅｈｌｉｎ）を産生するε細胞（１％未満）を含む膵内分泌部を構成する特定化された細胞凝集物である。インスリン及びグルカゴンは、血中グルコースレベルの主要な制御因子である。高いグルコースレベルに応答して、インスリンは、体細胞、特に脂肪細胞、肝細胞、及び筋肉細胞によるグルコースの取り込みを刺激し、それらの細胞において、グルコースがエネルギーに変換され、又は脂肪及びグリコーゲンへと貯蔵され、したがって、血中グルコースレベルを低下させる。グルカゴンは、逆に、低血糖状況において脂肪及びグリコーゲン貯蔵からのグルコースの放出を刺激する。
Ｉ型糖尿病患者は、その血中グルコースレベルを低下させるためのインスリンの注射に依存している。しかしながら、何年にもわたると、血中グルコースレベルとインスリンレベルとの間の協調不全が患者の健康状態の深刻な悪化をもたらすことが多い。そのような患者の血糖の生理的制御及び一般的な健康状態は、死体由来のヒト島の移植術によって非常に向上させることができる。しかしながら、そのような移植の必要性は、死体ドナー由来の島細胞の入手可能性よりはるかに大きい。実際、そのような処置から恩恵を受けることができる１５００万人という潜在的数の患者について、世界中で毎年、たった数千の移植術を行うことができるにすぎない。それゆえに、膵島細胞のさらなる供給源の必要性がある。
幹細胞は、１つのそのようなさらなる供給源として提案されている。
例えば、膵管の上皮は、成体において島新生の能力がある細胞の供給源としての役割を果たし、膵幹細胞を構成する可能性があり、その幹細胞から島の正常な再生が一生を通じて起こる。しかしながら、インスリン産生細胞の作製のための供給源としてのこれらの細胞の使用は、組織培養におけるそれらの低い増殖能力及びインスリン産生細胞への遅い分化速度によって制限される。
最近の研究により、組織幹細胞が、発生事象のカスケードを活性化する優性遺伝子を用いて再プログラムする能力があることが示されている。このように、マウス［Ｆｅｒｂｅｒ Ｓ．ら、（２０００）．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：５６８〜５７２］及びアフリカツメガエル［Ｈｏｒｂ ＭＥ．ら、（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１３：１０５〜１１５］の肝細胞、加えてラットの腸細胞［Ｋｏｊｉｍａ Ｈら、（２００２）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５１：１３９８〜１４０８］は、膵臓十二指腸ホメオボックス１（Ｐｄｘ１）（膵臓発生及び成熟β細胞における遺伝子発現に重要な役割を果たすホメオボックス因子［Ｊｏｎｓｓｏｎ Ｊ．ら、（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７１：６０６〜６０９］）の発現後にβ細胞遺伝子発現を活性化することが示された。
さらに、Ｐｄｘ１遺伝子の発現によって改変された培養ヒト胎児肝細胞は、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）糖尿病性非肥満糖尿病性重症複合免疫不全（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ）マウスにおいて、有意な量で成熟インスリンを産生し、貯蔵し、生理的グルコースレベルに応答してそれを放出し、β細胞機能に取って代わることが示された［Ｚａｌｚｍａｎ Ｍ．ら、（２００３）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００：７２５３〜７２５８］。これらの細胞は、複数のβ細胞遺伝子、加えて、他の島細胞及び膵外分泌部の遺伝子を発現したが、いくつかの肝臓遺伝子を発現し続けた。
多能性ヒト胚盤胞内部細胞塊から永久細胞系として確立されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）は、インビトロでほとんど無限増殖の能力がある。インビトロで、これらの細胞は、全ての膵臓系統を含む胚発生の初期段階に移行することができる。それらは、組織再生に必要とされる大量の移植可能なドナー細胞の可能性のある供給源である。ｈＥＳＣをβ細胞へ分化させる能力は、β細胞代替物への有望なストラテジーを浮かび上がらせる［Ｂｅｒｎａｒｄｏら、２００９、Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（Ｄａｙｔｏｎ、Ｏｈｉｏ）２７、３４１〜３５１；Ｄ’Ａｍｏｕｒら、２００６、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１；Ｅｓｈｐｅｔｅｒら、２００８、Ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ４１、８４３〜８５８；Ｊｉａｎｇら、２００７、Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（Ｄａｙｔｏｎ、Ｏｈｉｏ）２５、１９４０〜１９５３；Ｋｒｏｏｎら、２００８、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６、４４３〜４５２；Ｚｈａｎｇら、２００９、Ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ １９、４２９〜４３８、Ｓｕｌｚｂａｃｈｅｒら、２００９、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ、５：１５９〜１７３］。
米国特許出願第２０１００２５５５８０号は、多能性幹細胞を膵臓系統へ分化させる方法を教示する。しかしながら、現在まで、胚性幹細胞の定方向分化は、β細胞と比較して、少量のインスリンを産生するのみである細胞を生じている。それゆえに、多能性幹細胞に由来するインスリン産生細胞を作製する方法を確立するための条件を開発する重要な必要性が依然として残っている。
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、多能性幹細胞から島細胞を作製する方法であって、
（ａ）多能性幹細胞を内胚葉細胞へ分化させるために分化培地において多能性幹細胞を培養するステップと、
（ｂ）さらに分化した細胞を生じさせるために、少なくとも１つの成長因子、ｃＡＭＰ誘導剤、及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む培地において内胚葉細胞を培養するステップであって、前記少なくとも１つの成長因子がＦＧＦ１０、ｂＦＧＦ、及びＦＧＦ７からなる群から選択される上記ステップと、
（ｃ）ニコチンアミド、ＧＬＰ−１、及びエキセンディン４からなる群から選択される成熟因子を含む培地において前記さらに分化した細胞を培養し、それにより、多能性幹細胞から島細胞を作製するステップと
を含む上記方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、多能性幹細胞から島細胞を作製する方法であって、
（ａ）多能性幹細胞を内胚葉細胞へ分化させるためにアクチビンＡを含む分化培地において多能性幹細胞を培養するステップと、
（ｂ）内胚葉細胞にｐｄｘ−１ ｍＲＮＡをトランスフェクトして、さらに分化した細胞を生じさせるステップと、
（ｃ）ニコチンアミド、エキセンディン４、及びＧＬＰ−１からなる群から選択される成熟因子を含む培地において前記さらに分化した細胞を培養し、それにより、多能性幹細胞から島細胞を作製するステップと
を含む上記方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、多能性幹細胞から島前駆細胞を作製する方法であって、
（ａ）多能性幹細胞を内胚葉細胞へ分化させるために分化培地において多能性幹細胞を培養するステップと、
（ｂ）島前駆細胞を作製するために、少なくとも１つの成長因子、ｃＡＭＰ誘導剤、及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む培地において内胚葉細胞を培養するステップであって、前記少なくとも１つの成長因子がＦＧＦ１０、ｂＦＧＦ、及びＦＧＦ７からなる群から選択される上記ステップと
を含む上記方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、本明細書に記載された方法に従って作製される島細胞の集団が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、本明細書に記載された方法に従って作製される島前駆細胞の集団が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、活性成分としての本明細書に記載された細胞の集団及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、治療的有効量の本明細書に記載された細胞の集団を対象に移植し、それにより糖尿病を処置するステップを含む、その必要がある対象において糖尿病を処置する方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、分化培地はアクチビンＡを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、分化培地は血清を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、分化培地は血清を欠く。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ステップ（ｂ）の培地はノギンをさらに含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、分化培地は血清代替代用物を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、分化培地はＷｎｔ３をさらに含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、分化培地は血清を欠く。
本発明のいくつかの実施形態によれば、多能性幹細胞を培養するステップは、多能性幹細胞のコラゲナーゼ脱離クラスターをゼラチンコーティング表面上で培養することにより実施される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、多能性幹細胞はヒト誘導多能性（ｉＰＰ）細胞を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、その方法は、ステップ（ａ）からステップ（ｂ）の間に、少なくとも１つの成長因子及びｃＡＭＰ誘導剤を含む培地において内胚葉細胞を培養するステップをさらに含み、前記培地はＲＡを欠く。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ｃＡＭＰ誘導剤はフォルスコリンを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、その方法は、
（ｄ）ステップ（ｃ）の後に、ＥｐＣＡＭに結合する作用物質と島細胞を接触させるステップと、
（ｅ）前記作用物質に結合する細胞を選択するステップと
をさらに含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、その方法は、ステップ（ｃ）から接触させるステップの間に、島細胞を分散させて、分散した島細胞を生じさせるステップをさらに含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、その方法は、選択するステップの後に、前記分散した島細胞を再凝集させるステップをさらに含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、再凝集させるステップは、カルシウムをキレート化する作用物質の存在下で実施される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、カルシウムをキレート化する作用物質は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、シトレート、及びホスフェートからなる群から選択される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、その方法は、接触させるステップの後に、分散した島細胞をスキャフォールド上に播種するステップをさらに含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、再凝集させるステップは、ステップ（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に用いられるものより少ないグルコースを含む培地において実施される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培地のそれぞれのグルコース濃度は５ｍＭ〜１００ｍＭの間である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、島細胞を作製するステップは、胚様体の生成なしに実施される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、島細胞はインスリンを合成する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、島細胞はグルコース応答性である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、島細胞はグルカゴンをさらに合成する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、島細胞はソマトスタチンをさらに合成する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、内胚葉細胞はＳｏｘ１７及びＦｏｘＡ２の発現によって特徴づけられる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、内胚葉細胞はＯｃｔ４を発現しない。
本発明のいくつかの実施形態によれば、その方法は、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）の間に、膵臓十二指腸ホメオボックス１（ｐｄｘ１）、ニューロゲニン３（ｎｇｎ３）、ペアードボックス遺伝子４（ｐａｘ４）、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ−２．２（ｎｋｘ２．２）、ホメオボックスタンパク質ＮＫ−６相同体Ａ（ｎｋｘ６．１）、及びｖ−ｍａｆ筋腱膜線維肉腫癌遺伝子相同体Ａ（ｍｕｓｃｕｌｏａｐｏｎｅｕｒｏｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ Ａ）（ＭＡＦ−Ａ）からなる群から選択される分化因子をコードするｍＲＮＡをさらに分化した細胞にトランスフェクトするステップをさらに含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ステップ（ａ）は約５日間実施される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ステップ（ｂ）は約５日間実施される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養するステップは約２日間まで実施される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞の集団は、遺伝子改変されていない。
他に規定がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び／又は科学的用語は、本発明の属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと類似した、又は等価の方法及び材料は、本発明の実施形態の実施又は試験に用いることができるが、例示的な方法及び／又は材料が下に記載されている。矛盾する場合、定義を含む本特許明細書が支配するものとする。さらに、材料、方法、及び例は、例証となるのみであり、必ずしも限定することを意図するものではない。
本発明のいくつかの実施形態は、例としてのみ、添付の画像を参照して本明細書に記載されている。今、図面を詳細に具体的に参照しているが、示された事項は例とするものであり、且つ本発明の実施形態の例証的論議を目的とすることを強調しておく。この点において、図面に関して記載される説明によって、本発明の実施形態がどのように実施され得るかが当業者に明らかになる。
５日間のアクチビンＡでの条件付け後、ＥＳ細胞の大部分が胚体内胚葉マーカーＦｏｘＡ２及びＳｏｘ１７を獲得することを示す写真である。像は、抗ＦｏｘＡ２（ＨＮＦ３ｂ）抗体及び抗Ｓｏｘ１７抗体での染色を示す。スケールバーは、２００μｍを表す。高倍率においてＤＡＰＩで染色された全細胞核に対して陽性核を数えることにより、ＦｏｘＡ２（８９％）又はＳｏｘ１７（９８％）を発現する細胞の収量を評価することが可能になる。 ５日間のアクチビンＡでの条件付け後、ＥＳ細胞の大部分が胚体内胚葉マーカーＦｏｘＡ２及びＳｏｘ１７を獲得することを示す写真である。像は、抗ＦｏｘＡ２（ＨＮＦ３ｂ）抗体及び抗Ｓｏｘ１７抗体での染色を示す。スケールバーは、１００μｍを表す。高倍率においてＤＡＰＩで染色された全細胞核に対して陽性核を数えることにより、ＦｏｘＡ２（８９％）又はＳｏｘ１７（９８％）を発現する細胞の収量を評価することが可能になる。 ５日間のアクチビンＡでの条件付け後、ＥＳ細胞の大部分が胚体内胚葉マーカーＦｏｘＡ２及びＳｏｘ１７を獲得することを示す写真である。像は、抗ＦｏｘＡ２（ＨＮＦ３ｂ）抗体及び抗Ｓｏｘ１７抗体での染色を示す。スケールバーは、１００μｍを表す。高倍率においてＤＡＰＩで染色された全細胞核に対して陽性核を数えることにより、ＦｏｘＡ２（８９％）又はＳｏｘ１７（９８％）を発現する細胞の収量を評価することが可能になる。 ５日間のアクチビンＡでの条件付け後、ＥＳ細胞の大部分が胚体内胚葉マーカーＦｏｘＡ２及びＳｏｘ１７を獲得することを示す写真である。像は、抗ＦｏｘＡ２（ＨＮＦ３ｂ）抗体及び抗Ｓｏｘ１７抗体での染色を示す。スケールバーは、２００μｍを表す。高倍率においてＤＡＰＩで染色された全細胞核に対して陽性核を数えることにより、ＦｏｘＡ２（８９％）又はＳｏｘ１７（９８％）を発現する細胞の収量を評価することが可能になる。 ５日間のアクチビンＡでの条件付け後、ＥＳ細胞の大部分が胚体内胚葉マーカーＦｏｘＡ２及びＳｏｘ１７を獲得することを示す写真である。像は、抗ＦｏｘＡ２（ＨＮＦ３ｂ）抗体及び抗Ｓｏｘ１７抗体での染色を示す。スケールバーは、１００μｍを表す。高倍率においてＤＡＰＩで染色された全細胞核に対して陽性核を数えることにより、ＦｏｘＡ２（８９％）又はＳｏｘ１７（９８％）を発現する細胞の収量を評価することが可能になる。 ５日間のアクチビンＡでの条件付け後、ＥＳ細胞の大部分が胚体内胚葉マーカーＦｏｘＡ２及びＳｏｘ１７を獲得することを示す写真である。像は、抗ＦｏｘＡ２（ＨＮＦ３ｂ）抗体及び抗Ｓｏｘ１７抗体での染色を示す。スケールバーは、１００μｍを表す。高倍率においてＤＡＰＩで染色された全細胞核に対して陽性核を数えることにより、ＦｏｘＡ２（８９％）又はＳｏｘ１７（９８％）を発現する細胞の収量を評価することが可能になる。 アクチビンＡ及びレチノイン酸／ＡＴＲＡでの処理後（１４日目）のＰｄｘ１の誘導を示す写真である。ＤＡＰＩ染色によって検出された細胞が単層として付着しており、抗Ｐｄｘ１抗体でほとんど一律に染色され、その染色が核内に位置しているドメインを示している。 アクチビンＡ及びレチノイン酸／ＡＴＲＡでの処理後（１４日目）のＰｄｘ１の誘導を示す写真である。２倍に拡大された同じドメインの形態が示されており、ＤＡＰＩ染色とＰｄｘ１染色の重ね合わせが、Ｐｄｘ１染色が核であることを示している。 アクチビンＡ及びレチノイン酸／ＡＴＲＡでの処理後（１４日目）のＰｄｘ１の誘導を示す写真である。２倍に拡大された同じドメインの形態が示されている。 アクチビンＡ及びレチノイン酸／ＡＴＲＡでの処理後（１４日目）のＰｄｘ１の誘導を示す写真である。２倍に拡大された同じドメインの形態が示されている。 アクチビンＡ及びレチノイン酸／ＡＴＲＡでの処理後（１４日目）のＰｄｘ１の誘導を示す写真である。２倍に拡大された同じドメインの形態が示されている。 分化の２１日目におけるＰｄｘ１染色を示す図である。この領域における細胞形態（扁平で、隆起した核を有する（図２Ｈ））は、１４日目におけるＰｄｘ１陽性細胞の細胞形態と類似している。 分化の２１日目におけるＰｄｘ１染色及びＣ−ペプチド染色を示す図である。Ｐｄｘ１染色とＣ−ペプチド染色の重ね合わせを示している。Ｐｄｘ１は細胞核内に位置し、Ｃ−ペプチドは細胞の細胞質ドメイン内に位置する。この領域における細胞形態（扁平で、隆起した核を有する（図２Ｈ））は、１４日目におけるＰｄｘ１陽性細胞の細胞形態と類似している。 分化の２１日目におけるＰｄｘ１染色及びＣ−ペプチド染色を示す図である。この領域における細胞形態（扁平で、隆起した核を有する（図２Ｈ））は、１４日目におけるＰｄｘ１陽性細胞の細胞形態と類似している。 分化の２１日目におけるＰｄｘ１染色及びＣ−ペプチド染色を示す図である。この領域における細胞形態（扁平で、隆起した核を有する（図２Ｈ））は、１４日目におけるＰｄｘ１陽性細胞の細胞形態と類似している。 ＩＴＳ、ニコチンアミド、及び５ｎｇ／ｍｌにおけるエキセンディン−４が、単層の再編成及びＰｄｘ１陽性３Ｄクラスターの形成を引き起こすことを示す写真である。像は、分化プロトコールの３２日目から取った。分化の２５日目から、単層は裂け、（高い細胞密度を有する）上皮蕾が単層の島から盛り上がる。３２日目、上皮蕾は典型的にはＰｄｘ１陽性である。プレートを、ニコチンアミド及びエキセンディン−４、５ｎｇ／ｍｌで２０日間、処理した。示されているように、単層及び蕾は両方ともＰｄｘ１陽性である。 ＩＴＳ、ニコチンアミド、及び５ｎｇ／ｍｌにおけるエキセンディン−４が、単層の再編成及びＰｄｘ１陽性３Ｄクラスターの形成を引き起こすことを示す写真である。像は、分化プロトコールの３２日目から取った。分化の２５日目から、単層は裂け、（高い細胞密度を有する）上皮蕾が単層の島から盛り上がる。３２日目、上皮蕾は典型的にはＰｄｘ１陽性である。プレートを、ニコチンアミド及びエキセンディン−４、５ｎｇ／ｍｌで２０日間、処理した。示されているように、単層及び蕾は両方ともＰｄｘ１陽性である。 ＩＴＳ、ニコチンアミド、及び５ｎｇ／ｍｌにおけるエキセンディン−４が、単層の再編成及びＰｄｘ１陽性３Ｄクラスターの形成を引き起こすことを示す写真である。像は、分化プロトコールの３２日目から取った。分化の２５日目から、単層は裂け、（高い細胞密度を有する）上皮蕾が単層の島から盛り上がる。３２日目、上皮蕾は典型的にはＰｄｘ１陽性である。プレートをニコチンアミドでのみ処理した。単層は、エキセンディン−４が用いられているプレートよりＰｄｘ１陽性が少ない。 ＩＴＳ、ニコチンアミド、及び５ｎｇ／ｍｌにおけるエキセンディン−４が、単層の再編成及びＰｄｘ１陽性３Ｄクラスターの形成を引き起こすことを示す写真である。像は、分化プロトコールの３２日目から取った。分化の２５日目から、単層は裂け、（高い細胞密度を有する）上皮蕾が単層の島から盛り上がる。３２日目、上皮蕾は典型的にはＰｄｘ１陽性である。プレートをニコチンアミドでのみ処理した。単層は、エキセンディン−４が用いられているプレートよりＰｄｘ１陽性が少ない。 細胞を、アクチビンＡ処理後、トリプシン処理した場合にも分化が起こることを示す写真である。７日目にトリプシンによって解離し、さらなる培養のために新しいゼラチンコーティングプレート上に再プレーティングされた細胞の２９日目が示されている。Ｃ−ペプチド陽性でもあるＰｄｘ１陽性細胞の大きな島が見られる。 細胞を、アクチビンＡ処理後、トリプシン処理した場合にも分化が起こることを示す写真である。７日目にトリプシンによって解離し、さらなる培養のために新しいゼラチンコーティングプレート上に再プレーティングされた細胞の２９日目が示されている。Ｃ−ペプチド陽性でもあるＰｄｘ１陽性細胞の大きな島が見られる。 細胞を、アクチビンＡ処理後、トリプシン処理した場合にも分化が起こることを示す写真である。７日目にトリプシンによって解離し、さらなる培養のために新しいゼラチンコーティングプレート上に再プレーティングされた細胞の２９日目が示されている。Ｃ−ペプチド陽性でもあるＰｄｘ１陽性細胞の大きな島が見られる。 単層と蕾領域の両方がＣ−ペプチド陽性ドメイン及びＰｄｘ１陽性ドメインを含有することを示す写真である。像は、分化過程の３７日目からである。この像における細胞は、ニコチンアミドで最後の２５日間、及び５０ｎｇ／ｍｌのエキセンディン−４で１３日目から２９日目まで処理された。Ｃ−ペプチド陽性領域が、細胞の残りから単離されていることを示している。 単層と蕾領域の両方がＣ−ペプチド陽性ドメイン及びＰｄｘ１陽性ドメインを含有することを示す写真である。像は、分化過程の３７日目からである。この像における細胞は、ニコチンアミドで最後の２５日間、及び５０ｎｇ／ｍｌのエキセンディン−４で１３日目から２９日目まで処理された。Ｃ−ペプチド陽性領域が、より高密度に集合した領域を含有する広範なドメイン内にあることを示している。 単層と蕾領域の両方がＣ−ペプチド陽性ドメイン及びＰｄｘ１陽性ドメインを含有することを示す写真である。像は、分化過程の３７日目からである。この像における細胞は、ニコチンアミドで最後の２５日間、及び５０ｎｇ／ｍｌのエキセンディン−４で１３日目から２９日目まで処理された。Ｐｄｘ１陽性細胞を含有する典型的な領域を示している。 単層と蕾領域の両方がＣ−ペプチド陽性ドメイン及びＰｄｘ１陽性ドメインを含有することを示す写真である。像は、分化過程の３７日目からである。この像における細胞は、ニコチンアミドで最後の２５日間、及び５０ｎｇ／ｍｌのエキセンディン−４で１３日目から２９日目まで処理された。Ｐｄｘ１陽性細胞を含有する典型的な領域を明視野像として示している。 島様ドメインが、Ｃ−ペプチド陽性細胞及びグルカゴン陽性細胞を含有することを示す写真である。この像における細胞は、分化過程の３７日目である。ここで見られる細胞は、１３日目以降、ニコチンアミド及び５ｎｇ／ｍｌのエキセンディン−４で処理された。島様構造が示されている。Ｃ−ペプチド陽性領域（緑色）は、島様構造の輪郭となる、より高密度に集合したドメインである。グルカゴン陽性細胞（赤色）は、これらの島様構造の中央にある。 島様ドメインが、Ｃ−ペプチド陽性細胞及びグルカゴン陽性細胞を含有することを示す写真である。この像における細胞は、分化過程の３７日目である。ここで見られる細胞は、１３日目以降、ニコチンアミド及び５ｎｇ／ｍｌのエキセンディン−４で処理された。島様構造が示されている。Ｃ−ペプチド陽性領域（緑色）は、島様構造の輪郭となる、より高密度に集合したドメインである。グルカゴン陽性細胞（赤色）は、これらの島様構造の中央にある。 島様ドメインが、Ｃ−ペプチド陽性細胞及びグルカゴン陽性細胞を含有することを示す写真である。この像における細胞は、分化過程の３７日目である。ここで見られる細胞は、１３日目以降、ニコチンアミド及び５ｎｇ／ｍｌのエキセンディン−４で処理された。島様構造が示されている。Ｃ−ペプチド陽性領域（緑色）は、島様構造の輪郭となる、より高密度に集合したドメインである。グルカゴン陽性細胞（赤色）は、これらの島様構造の中央にある。 島様ドメインが、Ｃ−ペプチド陽性細胞及びグルカゴン陽性細胞を含有することを示す写真である。この像における細胞は、分化過程の３７日目である。ここで見られる細胞は、１３日目以降、ニコチンアミド及び５ｎｇ／ｍｌのエキセンディン−４で処理された。島様構造が示されている。Ｃ−ペプチド陽性領域（緑色）は、島様構造の輪郭となる、より高密度に集合したドメインである。グルカゴン陽性細胞（赤色）は、これらの島様構造の中央にある。 島様ドメインが、Ｃ−ペプチド陽性細胞及びグルカゴン陽性細胞を含有することを示す写真である。この像における細胞は、分化過程の３７日目である。ここで見られる細胞は、１３日目以降、ニコチンアミド及び５ｎｇ／ｍｌのエキセンディン−４で処理された。島様構造が示されている。Ｃ−ペプチド陽性領域（緑色）は、島様構造の輪郭となる、より高密度に集合したドメインである。グルカゴン陽性細胞（赤色）は、これらの島様構造の中央にある。 Ｃ−ペプチド陽性細胞はまたグルコース受容体Ｇｌｕｔ−２についても陽性であり、且つ分化の５６日目においてＰｄｘ１陽性であることを示す写真である。分化７日目において、コロニーのコアを、新しいゼラチンプレート上に再プレーティングし、それらの分化を、通常のプロトコール（ＲＡ、その後、１３日目以降、エキセンディン−４（１３日目から２９日目まで５ｎｇ／ｍｌ）及びニコチンアミド）下で継続させた。 Ｃ−ペプチド陽性細胞はまたグルコース受容体Ｇｌｕｔ−２についても陽性であり、且つ分化の５６日目においてＰｄｘ１陽性であることを示す写真である。分化７日目において、コロニーのコアを、新しいゼラチンプレート上に再プレーティングし、それらの分化を、通常のプロトコール（ＲＡ、その後、１３日目以降、エキセンディン−４（１３日目から２９日目まで５ｎｇ／ｍｌ）及びニコチンアミド）下で継続させた。 Ｃ−ペプチド陽性細胞はまたグルコース受容体Ｇｌｕｔ−２についても陽性であり、且つ分化の５６日目においてＰｄｘ１陽性であることを示す写真である。分化７日目において、コロニーのコアを、新しいゼラチンプレート上に再プレーティングし、それらの分化を、通常のプロトコール（ＲＡ、その後、１３日目以降、エキセンディン−４（１３日目から２９日目まで５ｎｇ／ｍｌ）及びニコチンアミド）下で継続させた。 Ｃ−ペプチド陽性細胞はまたグルコース受容体Ｇｌｕｔ−２についても陽性であり、且つ分化の５６日目においてＰｄｘ１陽性であることを示す写真である。分化７日目において、コロニーのコアを、新しいゼラチンプレート上に再プレーティングし、それらの分化を、通常のプロトコール（ＲＡ、その後、１３日目以降、エキセンディン−４（１３日目から２９日目まで５ｎｇ／ｍｌ）及びニコチンアミド）下で継続させた。 Ｃ−ペプチド陽性細胞はまたグルコース受容体Ｇｌｕｔ−２についても陽性であり、且つ分化の５６日目においてＰｄｘ１陽性であることを示す写真である。分化７日目において、コロニーのコアを、新しいゼラチンプレート上に再プレーティングし、それらの分化を、通常のプロトコール（ＲＡ、その後、１３日目以降、エキセンディン−４（１３日目から２９日目まで５ｎｇ／ｍｌ）及びニコチンアミド）下で継続させた。図７Ａの細部の拡大である。 Ｃ−ペプチド陽性細胞はまたグルコース受容体Ｇｌｕｔ−２についても陽性であり、且つ分化の５６日目においてＰｄｘ１陽性であることを示す写真である。分化７日目において、コロニーのコアを、新しいゼラチンプレート上に再プレーティングし、それらの分化を、通常のプロトコール（ＲＡ、その後、１３日目以降、エキセンディン−４（１３日目から２９日目まで５ｎｇ／ｍｌ）及びニコチンアミド）下で継続させた。Ｃ−ペプチド染色とＧｌｕｔ−２染色が、細胞質及び周辺膜において共存することを示している。 Ｃ−ペプチド陽性細胞はまたグルコース受容体Ｇｌｕｔ−２についても陽性であり、且つ分化の５６日目においてＰｄｘ１陽性であることを示す写真である。分化７日目において、コロニーのコアを、新しいゼラチンプレート上に再プレーティングし、それらの分化を、通常のプロトコール（ＲＡ、その後、１３日目以降、エキセンディン−４（１３日目から２９日目まで５ｎｇ／ｍｌ）及びニコチンアミド）下で継続させた。５６日目において、Ｐｄｘ１が、全てのＣ−ペプチド陽性細胞の核に存在することを示している。 Ｃ−ペプチド陽性領域が、６０日間の分化後、３次元構造へ再組織化することを示す写真である。像は、６０日間のエキセンディン高濃度処理（１３日目以降、５０ｎｇ／ｍｌのエキセンディン−４）後のＣ−ペプチド陽性領域を示す。図８Ａ〜Ｃは、同じ領域を、それぞれ、垂直光において（図８Ａ）、抗Ｃ−ペプチド抗体での免疫染色において（図８Ｂ）、及びＣ−ペプチド染色とＤＡＰＩ染色のオーバーレイにおいて（図８Ｃ）、表している。 Ｃ−ペプチド陽性領域が、６０日間の分化後、３次元構造へ再組織化することを示す写真である。像は、６０日間のエキセンディン高濃度処理（１３日目以降、５０ｎｇ／ｍｌのエキセンディン−４）後のＣ−ペプチド陽性領域を示す。図８Ａ〜Ｃは、同じ領域を、それぞれ、垂直光において（図８Ａ）、抗Ｃ−ペプチド抗体での免疫染色において（図８Ｂ）、及びＣ−ペプチド染色とＤＡＰＩ染色のオーバーレイにおいて（図８Ｃ）、表している。 Ｃ−ペプチド陽性領域が、６０日間の分化後、３次元構造へ再組織化することを示す写真である。像は、６０日間のエキセンディン高濃度処理（１３日目以降、５０ｎｇ／ｍｌのエキセンディン−４）後のＣ−ペプチド陽性領域を示す。図８Ａ〜Ｃは、同じ領域を、それぞれ、垂直光において（図８Ａ）、抗Ｃ−ペプチド抗体での免疫染色において（図８Ｂ）、及びＣ−ペプチド染色とＤＡＰＩ染色のオーバーレイにおいて（図８Ｃ）、表している。 Ｃ−ペプチド陽性領域が、６０日間の分化後、３次元構造へ再組織化することを示す写真である。像は、６０日間のエキセンディン高濃度処理（１３日目以降、５０ｎｇ／ｍｌのエキセンディン−４）後のＣ−ペプチド陽性領域を示す。図８Ｅ〜Ｇは、同じ領域を、それぞれ、表している（図８Ｄ、ＤＡＰＩ染色、図８Ｅ、抗Ｃ−ペプチド抗体での免疫染色、及び図８Ｆ、Ｃ−ペプチド染色とＤＡＰＩ染色のオーバーレイ）。 Ｃ−ペプチド陽性領域が、６０日間の分化後、３次元構造へ再組織化することを示す写真である。像は、６０日間のエキセンディン高濃度処理（１３日目以降、５０ｎｇ／ｍｌのエキセンディン−４）後のＣ−ペプチド陽性領域を示す。図８Ｅ〜Ｇは、同じ領域を、それぞれ、表している（図８Ｄ、ＤＡＰＩ染色、図８Ｅ、抗Ｃ−ペプチド抗体での免疫染色、及び図８Ｆ、Ｃ−ペプチド染色とＤＡＰＩ染色のオーバーレイ）。 Ｃ−ペプチド陽性領域が、６０日間の分化後、３次元構造へ再組織化することを示す写真である。像は、６０日間のエキセンディン高濃度処理（１３日目以降、５０ｎｇ／ｍｌのエキセンディン−４）後のＣ−ペプチド陽性領域を示す。図８Ｅ〜Ｇは、同じ領域を、それぞれ、表している（図８Ｄ、ＤＡＰＩ染色、図８Ｅ、抗Ｃ−ペプチド抗体での免疫染色、及び図８Ｆ、Ｃ−ペプチド染色とＤＡＰＩ染色のオーバーレイ）。 Ｃ−ペプチド陽性領域が、６０日間の分化後、３次元構造へ再組織化することを示す写真である。像は、６０日間のエキセンディン高濃度処理（１３日目以降、５０ｎｇ／ｍｌのエキセンディン−４）後のＣ−ペプチド陽性領域を示す。図８Ｅ〜Ｇは、同じ領域を、それぞれ、表している（図８Ｄ、ＤＡＰＩ染色、図８Ｅ、抗Ｃ−ペプチド抗体での免疫染色、及び図８Ｆ、Ｃ−ペプチド染色とＤＡＰＩ染色のオーバーレイ）。 低濃度のエキセンディン−４の、Ｃ−ペプチド陽性細胞の形成への効果を示すグラフである。グラフは、１３日目から６０日目までのエキセンディン−４（５ｎｇ／ｍｌ）の添加が、Ｃ−ペプチド陽性細胞の総数（積分光学密度、ＩＯＤ）を増加させるのに十分であることを示している。 低濃度のエキセンディン−４の、Ｃ−ペプチド陽性細胞の形成への効果を示すグラフである。グラフは、１３日目から６０日目までのエキセンディン−４（５ｎｇ／ｍｌ）の添加が、Ｃ−ペプチド陽性である培養物の表面（面積）を増加させるのに十分であることを示している。 インスリン及びＰｄｘ１ ｍＲＮＡが分化中、増加することを示す写真である。全ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって単離し、１μｇのＲＮＡを、２０μｌ中、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって逆転写した。２０μｌ中での特異的プライマーによるＲＴ ＰＣＲのために、その反応生成物の２μｌを採取した。レーン１：分化１２日目；レーン２及び３：分化２５日目；レーン４及び５：３６日目（ＩＴＳ培地中ＢＳＡなし）；レーン６及び７：３６日目（ＩＴＳ培地中２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）；レーン８及び９：多能性ＥＳ細胞；レーン１０：ヒト島ｃＤＮＡ陽性対照（逆転写前に１：１５０希釈） アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションが、レチノイン酸処理の必要性を回避することを示す写真である。アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションは、短期間（分化の１２日間）でＰｄｘ１タンパク質の発現を誘導し、それは分化の３１日目において持続する。Ｐｄｘ−１トランスフェクションの結果として、Ｃ−ペプチド発現は、レチノイン酸処理を必要とすることなく、３１日目に上昇する。最後のトランスフェクションから２４時間後（分化の１２日目）の培養物の領域が示されている。Ｐｄｘ１発現は強く、たいていのコロニーにおいて目に見える。 アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションが、レチノイン酸処理の必要性を回避することを示す写真である。アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションは、短期間（分化の１２日間）でＰｄｘ１タンパク質の発現を誘導し、それは分化の３１日目において持続する。Ｐｄｘ−１トランスフェクションの結果として、Ｃ−ペプチド発現は、レチノイン酸処理を必要とすることなく、３１日目に上昇する。最後のトランスフェクションから２４時間後（分化の１２日目）の培養物の領域が示されている。Ｐｄｘ１発現は強く、たいていのコロニーにおいて目に見える。 アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションが、レチノイン酸処理の必要性を回避することを示す写真である。アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションは、短期間（分化の１２日間）でＰｄｘ１タンパク質の発現を誘導し、それは分化の３１日目において持続する。Ｐｄｘ−１トランスフェクションの結果として、Ｃ−ペプチド発現は、レチノイン酸処理を必要とすることなく、３１日目に上昇する。最後のトランスフェクションから２４時間後（分化の１２日目）の培養物の領域が示されている。Ｐｄｘ１発現は強く、たいていのコロニーにおいて目に見える。 アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションが、レチノイン酸処理の必要性を回避することを示す写真である。アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションは、短期間（分化の１２日間）でＰｄｘ１タンパク質の発現を誘導し、それは分化の３１日目において持続する。Ｐｄｘ−１トランスフェクションの結果として、Ｃ−ペプチド発現は、レチノイン酸処理を必要とすることなく、３１日目に上昇する。最後のトランスフェクションから２４時間後（分化の１２日目）の培養物の領域が示されている。Ｐｄｘ１発現は強く、たいていのコロニーにおいて目に見える。 アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションが、レチノイン酸処理の必要性を回避することを示す写真である。アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションは、短期間（分化の１２日間）でＰｄｘ１タンパク質の発現を誘導し、それは分化の３１日目において持続する。Ｐｄｘ−１トランスフェクションの結果として、Ｃ−ペプチド発現は、レチノイン酸処理を必要とすることなく、３１日目に上昇する。最後のトランスフェクションから２４時間後（分化の１２日目）の培養物の領域が示されている。Ｐｄｘ１発現は強く、たいていのコロニーにおいて目に見える。Ｐｄｘ１標識は、コロニーの辺縁においてより強い。 アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションが、レチノイン酸処理の必要性を回避することを示す写真である。アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションは、短期間（分化の１２日間）でＰｄｘ１タンパク質の発現を誘導し、それは分化の３１日目において持続する。Ｐｄｘ−１トランスフェクションの結果として、Ｃ−ペプチド発現は、レチノイン酸処理を必要とすることなく、３１日目に上昇する。図１１Ｆ〜Ｈ及び１１Ｉ〜Ｋは、最後のトランスフェクションから２２日後（分化の３２日目）に固定された、Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクトウェルのランダムに選択された異なる領域を表す。Ｐｄｘ１陽性領域は、非常に高密度に集合しており（図１１Ｆ、Ｉ）、これらの細胞の大部分はまたＣ−ペプチド陽性である（図１１Ｈ、Ｋ）。 アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションが、レチノイン酸処理の必要性を回避することを示す写真である。アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションは、短期間（分化の１２日間）でＰｄｘ１タンパク質の発現を誘導し、それは分化の３１日目において持続する。Ｐｄｘ−１トランスフェクションの結果として、Ｃ−ペプチド発現は、レチノイン酸処理を必要とすることなく、３１日目に上昇する。図１１Ｆ〜Ｈ及び１１Ｉ〜Ｋは、最後のトランスフェクションから２２日後（分化の３２日目）に固定された、Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクトウェルのランダムに選択された異なる領域を表す。 アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションが、レチノイン酸処理の必要性を回避することを示す写真である。アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションは、短期間（分化の１２日間）でＰｄｘ１タンパク質の発現を誘導し、それは分化の３１日目において持続する。Ｐｄｘ−１トランスフェクションの結果として、Ｃ−ペプチド発現は、レチノイン酸処理を必要とすることなく、３１日目に上昇する。図１１Ｆ〜Ｈ及び１１Ｉ〜Ｋは、最後のトランスフェクションから２２日後（分化の３２日目）に固定された、Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクトウェルのランダムに選択された異なる領域を表す。Ｐｄｘ１陽性領域は、非常に高密度に集合しており（図１１Ｆ、Ｉ）、これらの細胞の大部分はまたＣ−ペプチド陽性である（図１１Ｈ、Ｋ）。 アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションが、レチノイン酸処理の必要性を回避することを示す写真である。アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションは、短期間（分化の１２日間）でＰｄｘ１タンパク質の発現を誘導し、それは分化の３１日目において持続する。Ｐｄｘ−１トランスフェクションの結果として、Ｃ−ペプチド発現は、レチノイン酸処理を必要とすることなく、３１日目に上昇する。図１１Ｆ〜Ｈ及び１１Ｉ〜Ｋは、最後のトランスフェクションから２２日後（分化の３２日目）に固定された、Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクトウェルのランダムに選択された異なる領域を表す。Ｐｄｘ１陽性領域は、非常に高密度に集合しており（図１１Ｆ、Ｉ）、これらの細胞の大部分はまたＣ−ペプチド陽性である（図１１Ｈ、Ｋ）。 アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションが、レチノイン酸処理の必要性を回避することを示す写真である。アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションは、短期間（分化の１２日間）でＰｄｘ１タンパク質の発現を誘導し、それは分化の３１日目において持続する。Ｐｄｘ−１トランスフェクションの結果として、Ｃ−ペプチド発現は、レチノイン酸処理を必要とすることなく、３１日目に上昇する。図１１Ｆ〜Ｈ及び１１Ｉ〜Ｋは、最後のトランスフェクションから２２日後（分化の３２日目）に固定された、Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクトウェルのランダムに選択された異なる領域を表す。 アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションが、レチノイン酸処理の必要性を回避することを示す写真である。アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションは、短期間（分化の１２日間）でＰｄｘ１タンパク質の発現を誘導し、それは分化の３１日目において持続する。Ｐｄｘ−１トランスフェクションの結果として、Ｃ−ペプチド発現は、レチノイン酸処理を必要とすることなく、３１日目に上昇する。図１１Ｆ〜Ｈ及び１１Ｉ〜Ｋは、最後のトランスフェクションから２２日後（分化の３２日目）に固定された、Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクトウェルのランダムに選択された異なる領域を表す。Ｐｄｘ１陽性領域は、非常に高密度に集合しており（図１１Ｆ、Ｉ）、これらの細胞の大部分はまたＣ−ペプチド陽性である（図１１Ｈ、Ｋ）。 アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションが、レチノイン酸処理の必要性を回避することを示す写真である。アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションは、短期間（分化の１２日間）でＰｄｘ１タンパク質の発現を誘導し、それは分化の３１日目において持続する。Ｐｄｘ−１トランスフェクションの結果として、Ｃ−ペプチド発現は、レチノイン酸処理を必要とすることなく、３１日目に上昇する。分化の３１日目及びＰｄｘ１ ｍＲＮＡでのトランスフェクション後２２日目において、Ｐｄｘ１タンパク質が核に発現しており、ｃ−ペプチドが同じ細胞の細胞質内に発現していることを実証するための、図１１Ｋの領域の拡大を示している。 アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションが、レチノイン酸処理の必要性を回避することを示す写真である。アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションは、短期間（分化の１２日間）でＰｄｘ１タンパク質の発現を誘導し、それは分化の３１日目において持続する。Ｐｄｘ−１トランスフェクションの結果として、Ｃ−ペプチド発現は、レチノイン酸処理を必要とすることなく、３１日目に上昇する。分化の３１日目及びＰｄｘ１ ｍＲＮＡでのトランスフェクション後２２日目において、Ｐｄｘ１タンパク質が核に発現しており、ｃ−ペプチドが同じ細胞の細胞質内に発現していることを実証するための、図１１Ｋの領域の拡大を示している。 アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションが、レチノイン酸処理の必要性を回避することを示す写真である。アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションは、短期間（分化の１２日間）でＰｄｘ１タンパク質の発現を誘導し、それは分化の３１日目において持続する。Ｐｄｘ−１トランスフェクションの結果として、Ｃ−ペプチド発現は、レチノイン酸処理を必要とすることなく、３１日目に上昇する。分化の３１日目及びＰｄｘ１ ｍＲＮＡでのトランスフェクション後２２日目において、Ｐｄｘ１タンパク質が核に発現しており、ｃ−ペプチドが同じ細胞の細胞質内に発現していることを実証するための、図１１Ｋの領域の拡大を示している。 アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションが、レチノイン酸処理の必要性を回避することを示す写真である。アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションは、短期間（分化の１２日間）でＰｄｘ１タンパク質の発現を誘導し、それは分化の３１日目において持続する。Ｐｄｘ−１トランスフェクションの結果として、Ｃ−ペプチド発現は、レチノイン酸処理を必要とすることなく、３１日目に上昇する。分化の３１日目及びＰｄｘ１ ｍＲＮＡでのトランスフェクション後２２日目において、Ｐｄｘ１タンパク質が核に発現しており、ｃ−ペプチドが同じ細胞の細胞質内に発現していることを実証するための、図１１Ｋの領域の拡大を示している。 アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションが、レチノイン酸処理の必要性を回避することを示す写真である。アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションは、短期間（分化の１２日間）でＰｄｘ１タンパク質の発現を誘導し、それは分化の３１日目において持続する。Ｐｄｘ−１トランスフェクションの結果として、Ｃ−ペプチド発現は、レチノイン酸処理を必要とすることなく、３１日目に上昇する。分化の３１日目及びＰｄｘ１ ｍＲＮＡでのトランスフェクション後２２日目において、Ｐｄｘ１タンパク質が核に発現しており、ｃ−ペプチドが同じ細胞の細胞質内に発現していることを実証するための、図１１Ｋの領域の拡大を示している。 アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションが、レチノイン酸処理の必要性を回避することを示す写真である。アクチビンＡ処理後のＰｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションは、短期間（分化の１２日間）でＰｄｘ１タンパク質の発現を誘導し、それは分化の３１日目において持続する。Ｐｄｘ−１トランスフェクションの結果として、Ｃ−ペプチド発現は、レチノイン酸処理を必要とすることなく、３１日目に上昇する。分化の３１日目及びＰｄｘ１ ｍＲＮＡでのトランスフェクション後２２日目において、Ｐｄｘ１タンパク質が核に発現しており、ｃ−ペプチドが同じ細胞の細胞質内に発現していることを実証するための、図１１Ｋの領域の拡大を示している。 ＲＡ処理及びＰｄｘ１トランスフェクションの両方を欠く、アクチビンＡ処理細胞がＰｄｘ１を弱く発現することを示す写真である。ＲＡを含まず、且つＰｄｘ１トランスフェクションなしで成長したアクチビンＡ処理細胞は、分化の１２日目において極少数のＰｄｘ１陽性細胞を有し、３１日目においてＣ−ペプチド陽性細胞へ分化していない。Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡをトランスフェクトされず、且つレチノイン酸で処理されていない細胞を、培養の１２日目に固定した（同時にＰｄｘ１ ｍＲＮＡをトランスフェクトされた試料（図１１Ａ〜Ｅ）と比較した）。Ｐｄｘ１抗体で標識された領域は極わずかである。 ＲＡ処理及びＰｄｘ１トランスフェクションの両方を欠く、アクチビンＡ処理細胞がＰｄｘ１を弱く発現することを示す写真である。ＲＡを含まず、且つＰｄｘ１トランスフェクションなしで成長したアクチビンＡ処理細胞は、分化の１２日目において極少数のＰｄｘ１陽性細胞を有し、３１日目においてＣ−ペプチド陽性細胞へ分化していない。Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡをトランスフェクトされず、且つレチノイン酸で処理されていない細胞を、培養の１２日目に固定した（同時にＰｄｘ１ ｍＲＮＡをトランスフェクトされた試料（図１１Ａ〜Ｅ）と比較した）。Ｐｄｘ１抗体で標識された領域は極わずかである。 ＲＡ処理及びＰｄｘ１トランスフェクションの両方を欠く、アクチビンＡ処理細胞がＰｄｘ１を弱く発現することを示す写真である。ＲＡを含まず、且つＰｄｘ１トランスフェクションなしで成長したアクチビンＡ処理細胞は、分化の１２日目において極少数のＰｄｘ１陽性細胞を有し、３１日目においてＣ−ペプチド陽性細胞へ分化していない。Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡをトランスフェクトされず、且つレチノイン酸で処理されていない細胞を、培養の１２日目に固定した（同時にＰｄｘ１ ｍＲＮＡをトランスフェクトされた試料（図１１Ａ〜Ｅ）と比較した）。Ｐｄｘ１抗体で標識された領域は極わずかである。 ＲＡ処理及びＰｄｘ１トランスフェクションの両方を欠く、アクチビンＡ処理細胞がＰｄｘ１を弱く発現することを示す写真である。ＲＡを含まず、且つＰｄｘ１トランスフェクションなしで成長したアクチビンＡ処理細胞は、分化の１２日目において極少数のＰｄｘ１陽性細胞を有し、３１日目においてＣ−ペプチド陽性細胞へ分化していない。Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡをトランスフェクトされず、且つレチノイン酸で処理されていない細胞を、培養の１２日目に固定した（同時にＰｄｘ１ ｍＲＮＡをトランスフェクトされた試料（図１１Ａ〜Ｅ）と比較した）。Ｐｄｘ１抗体で標識された領域は極わずかである。 ＲＡ処理及びＰｄｘ１トランスフェクションの両方を欠く、アクチビンＡ処理細胞がＰｄｘ１を弱く発現することを示す写真である。ＲＡを含まず、且つＰｄｘ１トランスフェクションなしで成長したアクチビンＡ処理細胞は、分化の１２日目において極少数のＰｄｘ１陽性細胞を有し、３１日目においてＣ−ペプチド陽性細胞へ分化していない。分化の３１日目の後、弱いＰｄｘ１陽性領域は、あまり集合しておらず、Ｃ−ペプチドについて染色されない。 ＲＡ処理及びＰｄｘ１トランスフェクションの両方を欠く、アクチビンＡ処理細胞がＰｄｘ１を弱く発現することを示す写真である。ＲＡを含まず、且つＰｄｘ１トランスフェクションなしで成長したアクチビンＡ処理細胞は、分化の１２日目において極少数のＰｄｘ１陽性細胞を有し、３１日目においてＣ−ペプチド陽性細胞へ分化していない。分化の３１日目の後、弱いＰｄｘ１陽性領域は、あまり集合しておらず、Ｃ−ペプチドについて染色されない。 ＲＡ処理及びＰｄｘ１トランスフェクションの両方を欠く、アクチビンＡ処理細胞がＰｄｘ１を弱く発現することを示す写真である。ＲＡを含まず、且つＰｄｘ１トランスフェクションなしで成長したアクチビンＡ処理細胞は、分化の１２日目において極少数のＰｄｘ１陽性細胞を有し、３１日目においてＣ−ペプチド陽性細胞へ分化していない。分化の３１日目の後、弱いＰｄｘ１陽性領域は、あまり集合しておらず、Ｃ−ペプチドについて染色されない。 ＲＡ処理及びＰｄｘ１トランスフェクションの両方を欠く、アクチビンＡ処理細胞がＰｄｘ１を弱く発現することを示す写真である。ＲＡを含まず、且つＰｄｘ１トランスフェクションなしで成長したアクチビンＡ処理細胞は、分化の１２日目において極少数のＰｄｘ１陽性細胞を有し、３１日目においてＣ−ペプチド陽性細胞へ分化していない。Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡの代わりにＧＦＰ ｍＲＮＡをトランスフェクトした対照実験である。 ＲＡ処理及びＰｄｘ１トランスフェクションの両方を欠く、アクチビンＡ処理細胞がＰｄｘ１を弱く発現することを示す写真である。ＲＡを含まず、且つＰｄｘ１トランスフェクションなしで成長したアクチビンＡ処理細胞は、分化の１２日目において極少数のＰｄｘ１陽性細胞を有し、３１日目においてＣ−ペプチド陽性細胞へ分化していない。Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡの代わりにＧＦＰ ｍＲＮＡをトランスフェクトした対照実験である。 ＲＡ処理及びＰｄｘ１トランスフェクションの両方を欠く、アクチビンＡ処理細胞がＰｄｘ１を弱く発現することを示す写真である。ＲＡを含まず、且つＰｄｘ１トランスフェクションなしで成長したアクチビンＡ処理細胞は、分化の１２日目において極少数のＰｄｘ１陽性細胞を有し、３１日目においてＣ−ペプチド陽性細胞へ分化していない。Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡの代わりにＧＦＰ ｍＲＮＡをトランスフェクトした対照実験である。 Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡでのトランスフェクションあり、又はなしの、Ｃ−ペプチド陽性細胞の定量化を示すグラフである。図は、図１１及び１２に示された実験からのデータの定量的分析を示す。Ｐｄｘ１陽性細胞に対するＣ−ペプチド陽性細胞の比率を、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏというプログラムを用いて推定した。そのプログラムを、Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクト細胞の中での、又はＧＦＰ−ｍＲＮＡトランスフェクト細胞（対照細胞）の中でのＰｄｘ１陽性細胞の２０個のフィールドについて実行した。Ｃ−ペプチド染色によって測定されるように、外から加えられたＰｄｘ１ ｍＲＮＡが、インスリン産生細胞になるＰｄｘ１陽性細胞のパーセントを著しく増加させることを示している。 Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡでのトランスフェクションあり、又はなしの、Ｃ−ペプチド陽性細胞の定量化を示すグラフである。図は、図１１及び１２に示された実験からのデータの定量的分析を示す。Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションが、Ｐｄｘ−１陽性細胞のうちのＣ−ペプチド陽性細胞の比率だけでなく、全細胞（Ｄapi染色）のうちのＣ−ペプチド陽性細胞の比率も増加させることを示している。 Ｐｄｘ−１ ｍＲＮＡでのトランスフェクションから２２日後のＣ−ペプチド陽性細胞が、強くＰｄｘ−１陽性であることを示す写真である。Ｐｄｘ−１陽性細胞の２つのドメインが示されている。図１４Ａ〜Ｄは、扁平な核を有する大きな六角形の細胞を含むドメインであって、その細胞の大部分がＰｄｘ１陽性である、ドメインを示す。これらの細胞は、Ｃ−ペプチド陽性ではなく、前駆体を表す。 Ｐｄｘ−１ ｍＲＮＡでのトランスフェクションから２２日後のＣ−ペプチド陽性細胞が、強くＰｄｘ−１陽性であることを示す写真である。Ｐｄｘ−１陽性細胞の２つのドメインが示されている。図１４Ａ〜Ｄは、扁平な核を有する大きな六角形の細胞を含むドメインであって、その細胞の大部分がＰｄｘ１陽性である、ドメインを示す。これらの細胞は、Ｃ−ペプチド陽性ではなく、前駆体を表す。 Ｐｄｘ−１ ｍＲＮＡでのトランスフェクションから２２日後のＣ−ペプチド陽性細胞が、強くＰｄｘ−１陽性であることを示す写真である。Ｐｄｘ−１陽性細胞の２つのドメインが示されている。図１４Ａ〜Ｄは、扁平な核を有する大きな六角形の細胞を含むドメインであって、その細胞の大部分がＰｄｘ１陽性である、ドメインを示す。これらの細胞は、Ｃ−ペプチド陽性ではなく、前駆体を表す。 Ｐｄｘ−１ ｍＲＮＡでのトランスフェクションから２２日後のＣ−ペプチド陽性細胞が、強くＰｄｘ−１陽性であることを示す写真である。Ｐｄｘ−１陽性細胞の２つのドメインが示されている。図１４Ａ〜Ｄは、扁平な核を有する大きな六角形の細胞を含むドメインであって、その細胞の大部分がＰｄｘ１陽性である、ドメインを示す。これらの細胞は、Ｃ−ペプチド陽性ではなく、前駆体を表す。 Ｐｄｘ−１ ｍＲＮＡでのトランスフェクションから２２日後のＣ−ペプチド陽性細胞が、強くＰｄｘ−１陽性であることを示す写真である。Ｐｄｘ−１陽性細胞の２つのドメインが示されている。図１４Ｅ〜Ｈは、細胞集団が高密度であるドメインを示し、その細胞の大部分が非常に強いＣ−ペプチド陽性である。Ｃ−ペプチド陽性細胞核の大部分において、ＰＤＸ１抗体での強い染色が注目される。 Ｐｄｘ−１ ｍＲＮＡでのトランスフェクションから２２日後のＣ−ペプチド陽性細胞が、強くＰｄｘ−１陽性であることを示す写真である。Ｐｄｘ−１陽性細胞の２つのドメインが示されている。図１４Ｅ〜Ｈは、細胞集団が高密度であるドメインを示し、その細胞の大部分が非常に強いＣ−ペプチド陽性である。Ｃ−ペプチド陽性細胞核の大部分において、ＰＤＸ１抗体での強い染色が注目される。 Ｐｄｘ−１ ｍＲＮＡでのトランスフェクションから２２日後のＣ−ペプチド陽性細胞が、強くＰｄｘ−１陽性であることを示す写真である。Ｐｄｘ−１陽性細胞の２つのドメインが示されている。図１４Ｅ〜Ｈは、細胞集団が高密度であるドメインを示し、その細胞の大部分が非常に強いＣ−ペプチド陽性である。Ｃ−ペプチド陽性細胞核の大部分において、ＰＤＸ１抗体での強い染色が注目される。 Ｐｄｘ−１ ｍＲＮＡでのトランスフェクションから２２日後のＣ−ペプチド陽性細胞が、強くＰｄｘ−１陽性であることを示す写真である。Ｐｄｘ−１陽性細胞の２つのドメインが示されている。図１４Ｅ〜Ｈは、細胞集団が高密度であるドメインを示し、その細胞の大部分が非常に強いＣ−ペプチド陽性である。Ｃ−ペプチド陽性細胞核の大部分において、ＰＤＸ１抗体での強い染色が注目される。 ヒトＥＳ細胞を、精製された膵島様クラスターへと分化させる全体で８ステップのスキームを記載する図である。 ＥＤＴＡによって懸濁状態で再凝集している細胞が生存し続けていることを示す写真である。分化の１９日目に単離されたＥｐＣａｍ＋細胞を、４日間、懸濁状態のままにしておき、顕微鏡下で写真撮影を行った。ＥＤＴＡの添加なしで懸濁状態のままである細胞（Ａ）は、ＥＤＴＡで再凝集した細胞（Ｂ）より大きいサイズの凝集物を形成する。 ＥＤＴＡによって懸濁状態で再凝集している細胞が生存し続けていることを示す写真である。分化の１９日目に単離されたＥｐＣａｍ＋細胞を、４日間、懸濁状態のままにしておき、顕微鏡下で写真撮影を行った。ＥＤＴＡの添加なしで懸濁状態のままである細胞（Ａ）は、ＥＤＴＡで再凝集した細胞（Ｂ）より大きいサイズの凝集物を形成する。 ＥＤＴＡによって懸濁状態で再凝集している細胞が生存し続けていることを示す写真である。分化の１９日目に単離されたＥｐＣａｍ＋細胞を、４日間、懸濁状態のままにしておき、顕微鏡下で写真撮影を行った。ＥＤＴＡの添加なしで懸濁状態のままである細胞（Ａ）は、ＥＤＴＡで再凝集した細胞（Ｂ）より大きいサイズの凝集物を形成する。１９＋４日目に、ＥＤＴＡ ０．５ｍＭによる精製された凝集物に、ｌｉｖｅ−ｄｅａｄ試薬を適用した。凝集物は、緑色に染まる生細胞で形成されている。 （図１５に記載されているように実施された）ｈＥＳ細胞培養におけるＣ−ペプチド蓄積の速度を示すグラフである。黒色四角形：全培養物。黒色三角形：ＥｐＣａｍ−ＭＡＣＳソーティング後のＥｐＣａｍ＋細胞画分において。 たいていのＣ−ペプチド発現細胞がＥｐＣａｍを共発現することを示す写真である。分化の２３日目における細胞を、フルオレセインコンジュゲート化抗ＥｐＣａｍ Ｍｃ抗体３２６（緑色）及びフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート化抗Ｃ−ペプチド抗体Ｍｃ ＡｂＣａｍ １９７５（赤色）と反応させた。 たいていのＣ−ペプチド発現細胞がＥｐＣａｍを共発現することを示す写真である。分化の２３日目における細胞を、フルオレセインコンジュゲート化抗ＥｐＣａｍ Ｍｃ抗体３２６（緑色）及びフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート化抗Ｃ−ペプチド抗体Ｍｃ ＡｂＣａｍ １９７５（赤色）と反応させた。 たいていのＣ−ペプチド発現細胞がＥｐＣａｍを共発現することを示す写真である。分化の２３日目における細胞を、フルオレセインコンジュゲート化抗ＥｐＣａｍ Ｍｃ抗体３２６（緑色）及びフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート化抗Ｃ−ペプチド抗体Ｍｃ ＡｂＣａｍ １９７５（赤色）と反応させた。同じ細胞におけるその２つのマーカーの共発現が示されている。 たいていのＣ−ペプチド発現細胞がＥｐＣａｍを共発現することを示す写真である。細胞を、抗ＥｐＣａｍ抗体（緑色）及び抗グルカゴン抗体（赤色）と反応させた。 再凝集した細胞の大部分が、ｃ−ペプチド陽性であり、その細胞の一部はまたグルカゴンを発現することを示す写真である。分化手順の２０日目に単離されたＥｐＣａｍ陽性細胞を、懸濁状態で４日間、培養し、ＰＦＡ ４％で固定し、３０％スクロースと平衡化し、ＯＣＴ中に包埋した。スライドガラス上の１２ ｍの凍結切片を以下の抗体で染色した。Ａ：ヤギポリクローナル抗グルカゴン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）及びＦＩＴＣとコンジュゲートしたロバ抗ヤギＩｇｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ）；Ｂ：ＰＥとコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗ｃ−ペプチドＡｂ ＡｂＣＡｍ １９７５；Ｃ：ロバ抗ウサギＦＩＴＣとウサギ抗ソマトスタチン抗体；Ｄは、Ｂと同様に抗ｃ−ペプチド染色とＤＡＰＩでの核染色のオーバーレイである。 ＥＤＴＡの存在下でのＥｐＣａｍ陽性細胞の再凝集が、凝集物のサイズ、及びｃ−ペプチド陽性細胞の陰性細胞に対する比率に影響することを示す写真である。２０日間分化した細胞を解離し、ＥｐＣａｍ陽性細胞を選択し、ＥＤＴＡなしで、再凝集のための条件下で３日間、懸濁状態で培養した。細胞を、ＰＥと連結した抗ｃ−ペプチド抗体ＭＣ ＡｂＣＡｍ １９７５と反応させた（赤色）。 ＥＤＴＡの存在下でのＥｐＣａｍ陽性細胞の再凝集が、凝集物のサイズ、及びｃ−ペプチド陽性細胞の陰性細胞に対する比率に影響することを示す写真である。２０日間分化した細胞を解離し、ＥｐＣａｍ陽性細胞を選択し、１ｍＭ ＥＤＴＡありで、再凝集のための条件下で３日間、懸濁状態で培養した。細胞を、ＰＥと連結した抗Ｃ−ペプチド抗体ＭＣ ＡｂＣＡｍ １９７５と反応させた（赤色）。 ＥＤＴＡの存在下でのＥｐＣａｍ陽性細胞の再凝集が、凝集物のサイズ、及びｃ−ペプチド陽性細胞の陰性細胞に対する比率に影響することを示す写真である。２０日間分化した細胞を解離し、ＥｐＣａｍ陽性細胞を選択し、ＥＤＴＡなしで、再凝集のための条件下で３日間、懸濁状態で培養した。細胞を、ＰＥと連結した抗ＥｐＣａｍ抗体ＣＤ３２６と反応させた（赤色）。 ＥＤＴＡの存在下でのＥｐＣａｍ陽性細胞の再凝集が、凝集物のサイズ、及びｃ−ペプチド陽性細胞の陰性細胞に対する比率に影響することを示す写真である。２０日間分化した細胞を解離し、ＥｐＣａｍ陽性細胞を選択し、１ｍＭ ＥＤＴＡありで、再凝集のための条件下で３日間、懸濁状態で培養した。細胞を、ＰＥと連結した抗ＥｐＣａｍ抗体ＣＤ３２６と反応させた（赤色）。 ＥＤＴＡの存在下で再凝集した細胞が、均一なサイズ（７０〜５０ミクロン）の小さな凝集物を形成することを示す写真である。 血清代替物及びノギンを用いる本発明の実施形態に従って、ヒトＥＳ細胞を、精製された膵島様クラスターへと分化させる全体で８ステップのスキームを記載する図である。 多孔性Ａｌｇｉｍａｔｒｉｘ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）内に形成されるＥｐＣａｍ陽性細胞の凝集物が、グルコース刺激にインスリン分泌の増加によって応答することを示す図である。図２２に記載されているように１９日間分化させた細胞を、解離した。ＭＡＣＳによって選択されたＥｐＣａｍ陽性細胞を、Ａｌｇｉｍａｔｒｉｘ ２４ウェルプレートに分配した。各ウェルは、ＤＭ８中２×１０６個の細胞を受け、実施例セクションに記載されているように、処理した。３連のウェルを、２．８ｍＭグルコース、５．５ｍＭグルコース、２７ｍＭグルコース、又は３０ｍＭ ＫＣｌと２７ｍＭグルコースのいずれかに曝した。 多孔性Ａｌｇｉｍａｔｒｉｘ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）内に形成されるＥｐＣａｍ陽性細胞の凝集物が、グルコース刺激にインスリン分泌の増加によって応答することを示す図である。図２２に記載されているように１９日間分化した細胞を、解離した。ＭＡＣＳによって選択されたＥｐＣａｍ陽性細胞を、Ａｌｇｉｍａｔｒｉｘ ２４ウェルプレートに分配した。各ウェルは、ＤＭ８中２×１０６個の細胞を受け、実施例セクションに記載されているように、処理した。
本発明は、そのいくつかの実施形態において、多能性幹細胞に由来するインスリン産生細胞、及びそれを作製する方法に関する。
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明が、その適用において、以下の説明に示された、又は実施例によって例示された詳細に必ずしも限定されるわけではないことを理解されるべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、又は様々な方法で実施若しくは実行することができる。
Ｉ型糖尿病は、膵島インスリン産生β細胞の自己免疫性破壊によって引き起こされる。インスリン投与は、最適なインスリン投与量を調整することが難しいため、その疾患の長期的合併症を防止しない。損傷細胞の制御されたインスリン産生細胞での代替は、Ｉ型糖尿病についての究極の治療法と考えられる。膵臓移植術は成功しているが、ドナーの不足によって非常に限定される。
有糸分裂後のβ細胞の強制的増殖に代わるものは、（自然の自己増殖能力を有する）幹細胞のインスリン産生細胞への分化の誘導である。様々なグループが、子宮内発生中に働く、正常な分化経路に基づいた異なる分化プロトコールを示唆している（例えば、Ｄ’Ａｍｏｕｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００６；Ｊｉａｎｇ、Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、２００７；及びＫｒｏｏｎ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００８参照）。しかしながら、現在まで、胚性幹細胞の定方向分化は、β細胞と比較して、少量のインスリンを産生するのみである細胞を生じている。
糖尿病を処置するのに有効であろう細胞集団を作製する試みにおいて、本発明者らは、新規の分化プロトコールを考案し、図４〜１１、１８、及び表４に示されているように、その作製された細胞が高レベルのインスリンとグルカゴンの両方を合成することを実証した。
具体的には、本発明者らは、インスリンＣ−ペプチド及びグルカゴンについての二重染色によって、作製された島における細胞の約３分の１がグルカゴンを産生し（α細胞表現型）、３分の２がインスリンを産生する（β細胞表現型）ことを示した（図６Ａ〜Ｅ）。それゆえに、その分化過程は、天然の膵臓ランゲルハンス島の構造を再現する。
このように、本発明の一態様によれば、多能性幹細胞から島細胞を作製する方法であって、
（ａ）多能性幹細胞を内胚葉細胞へ分化するために分化培地において多能性幹細胞を培養するステップと、
（ｂ）さらに分化した細胞を生じさせるために、少なくとも１つの成長因子、ｃＡＭＰ誘導剤、及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む培地において内胚葉細胞を培養するステップであって、前記少なくとも１つの成長因子がＦＧＦ１０及びＦＧＦ７からなる群から選択される上記ステップと、
（ｃ）ニコチンアミド、ＧＬＰ−１、及びエキセンディン４からなる群から選択される成熟因子を含む培地において前記さらに分化した細胞を培養し、それにより、多能性幹細胞から島細胞を作製するステップと
を含む上記方法が提供される。
本明細書に用いられる場合、句「島細胞」は、以下の島特異的ポリペプチドホルモンの少なくとも１つを合成する細胞を指す：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド。したがって、本発明の方法により作製された島細胞は、インスリンを産生するβ細胞；２）グルカゴンを産生するα細胞；３）ソマトスタチンを産生するδ細胞（又はＤ細胞）；及び／又は膵臓ポリペプチドを産生するＦ細胞と解釈され得る。
典型的には、本発明のこの態様の島細胞は、ホルモンを分泌顆粒の形で分泌小胞中に貯蔵する。
本明細書の上記で述べられているように、本発明者らは、本発明の方法を用いて、島細胞集団を作製することができ、その各細胞型の相対量が、天然の島における相対量（すなわち、３分の２のインスリン産生細胞及び３分の１のグルカゴン産生細胞）を反映することを示している。
本明細書に用いられる場合、句「多能性幹細胞」は、３つの胚性生殖細胞層、すなわち、内胚葉、外胚葉、及び中胚葉へ分化する能力がある細胞を指す。
一実施形態によれば、多能性幹細胞は、胚性幹細胞及び／又は誘導多能性幹細胞を含む。
句「胚性幹細胞」は、全ての３つの胚性胚葉（すなわち、内胚葉、外胚葉、及び中胚葉）の細胞へ分化する能力があり、又は未分化状態のままである胚性細胞を指す。句「胚性幹細胞」は、妊娠後に形成される胚性組織（例えば、胚盤胞）から胚の着床前（すなわち、着床前胚盤胞）に得られる細胞、着床後／原腸陥入前の段階の胚盤胞から得られる拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）（ＷＯ２００６／０４０７６３参照）、及び妊娠中の任意の時、好ましくは妊娠１０週前に、胎児の生殖組織から得られる胚性生殖（ＥＧ）細胞を含んでもよい。
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ；胚様幹細胞）は、多能性が賦与されている（すなわち、３つの胚性生殖細胞層、すなわち、内胚葉、外胚葉、及び中胚葉へ分化する能力がある）成体体細胞の脱分化により得られる細胞である。本発明のいくつかの実施形態によれば、そのような細胞は、分化組織（例えば、皮膚などの体細胞組織）から得られ、細胞を胚性幹細胞の特性を獲得するように再プログラムする遺伝子操作により脱分化を起こしている。本発明のいくつかの実施形態によれば、誘導多能性幹細胞は、体性幹細胞においてＯｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｋｆｌ４、及びｃ−Ｍｙｃの発現を誘導することにより形成される。
本発明の胚性幹細胞は、よく知られた細胞培養方法を用いて得ることができる。例えば、ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚盤胞から単離することができる。ヒト胚盤胞は、典型的には、ヒトインビボ着床前胚から、又はインビトロ受精（ＩＶＦ）胚から得られる。或いは、単細胞ヒト胚は、胚盤胞期へ増殖することができる。ヒトＥＳ細胞の単離について、透明帯が胚盤胞から除去され、内部細胞塊（ＩＣＭ）は、免疫手術により単離され、その手術において、栄養外胚葉細胞が溶解され、穏やかなピペッティングにより無傷ＩＣＭから除去される。その後、ＩＣＭは、その増殖を可能にする適切な培地を含有する組織培養フラスコ内にプレーティングされる。９〜１５日後、ＩＣＭ由来増殖物は、機械的解離か又は酵素分解かのいずれかによって凝集塊へ解離され、その後、その細胞は、新鮮な組織培養培地へ再びプレーティングされる。未分化形態を示すコロニーは、個々にマイクロピペットにより選択され、機械的に凝集塊へ解離され、再びプレーティングされる。その後、生じたＥＳ細胞は４〜７日ごとに定期的に分割される。ヒトＥＳ細胞の調製方法に関するさらなる詳細については、Ｔｈｏｍｓｏｎら、［米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５、１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３、１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７８４４、１９９５］；Ｂｏｎｇｓｏら、［Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ ４：７０６、１９８９］；及びＧａｒｄｎｅｒら、［Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．６９：８４、１９９８］を参照されたい。
市販の幹細胞もまた本発明のこの態様と共に用い得ることは認識されているであろう。ヒトＥＳ細胞は、ＮＩＨヒト胚性幹細胞登録簿（ｗｗｗ．ｅｓｃｒ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から購入することができる。市販の胚性幹細胞系の非限定的例は、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＣＹ１２、ＣＹ３０、ＣＹ９２、ＣＹ１０、ＴＥ０３、及びＴＥ３２である。
さらに、ＥＳ細胞は、マウス（Ｍｉｌｌｓ及びＢｒａｄｌｅｙ、２００１）、ゴールデンハムスター［Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８８、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．１２７：２２４〜７］、ラット［Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅら、１９９４、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．１６３：２８８〜９２］、ウサギ［Ｇｉｌｅｓら、１９９３、Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ．３６：１３０〜８；Ｇｒａｖｅｓ ＆ Ｍｏｒｅａｄｉｔｈ、１９９３、Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ．１９９３、３６：４２４〜３３］、いくつかの家畜動物種［Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉら、１９９１、Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｕｐｐｌ．４３：２５５〜６０；Ｗｈｅｅｌｅｒ １９９４、Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｄｅｖ．６：５６３〜８；Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａら、２００１、Ｃｌｏｎｉｎｇ．３：５９〜６７］、及び非ヒト霊長類種（アカゲザル及びマーモセット）［Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９２：７８４４〜８；Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９６、Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４〜９］を含む他の種からも得ることができる。
拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）は、原腸陥入前の段階において受精から少なくとも９日後の胚盤胞から得ることができる。胚盤胞を培養する前に、内部細胞塊を露出させるために透明帯は、［例えば、タイロードの酸性溶液により（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）］消化される。その後、胚盤胞は、標準胚性幹細胞培養方法を用いてインビトロで受精後少なくとも９日間で、且つ最長１４日間までの間（すなわち、原腸陥入事象前）、全胚として培養される。
ＥＧ細胞は、当業者に知られた実験技術を用いて、妊娠約８〜１１週（ヒト胎児の場合）の胎児から得られる始原生殖細胞から調製される。生殖隆起は、解離され、小さな塊へ切断され、それは、その後、機械的解離によって細胞へ脱凝集される。その後、ＥＧ細胞は、適切な培地を含む組織培養フラスコ内で成長させる。細胞は、ＥＧ細胞と一致した細胞形態が観察されるまで、典型的には７〜３０日後又は１〜４継代後まで、毎日培地を交換して培養される。ヒトＥＧ細胞の調製方法に関するさらなる詳細については、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６、１９９８］及び米国特許第６，０９０，６２２号を参照されたい。
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）（胚様幹細胞）は、体細胞の遺伝子操作により、例えば、線維芽細胞、肝細胞、胃上皮細胞などの体細胞のＯｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、及びＫＬＦ４などの転写因子でのレトロウイルス形質導入により、体細胞から作製することができる［Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００７、１（１）：３９〜４９；Ａｏｉ Ｔら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ａｄｕｌｔ Ｍｏｕｓｅ Ｌｉｖｅｒ ａｎｄ Ｓｔｏｍａｃｈ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８ Ｆｅｂ １４．（印刷物より先の電子出版）；ＩＨ Ｐａｒｋ、Ｚｈａｏ Ｒ、Ｗｅｓｔ ＪＡら、Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｗｉｔｈ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ ２００８；４５１：１４１〜１４６；Ｋ Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｔａｎａｂｅ Ｋ、Ｏｈｎｕｋｉ Ｍら、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ ２００７；１３１：８６１〜８７２］。他の胚様幹細胞は、卵母細胞への核移植、胚性幹細胞との融合、又はレシピエント細胞が有糸分裂で停止している場合には接合体への核移植により作製することができる。
未分化幹細胞は、当業者により胚又は成体起源の分化細胞とは明らかに区別することができる、特徴的な形態であることは認識されているであろう。典型的には、未分化幹細胞は、高い核／細胞質の比、顕著な核小体、及び細胞間結合が不明瞭であるコンパクトなコロニー形成を有する。未分化幹細胞の追加の特徴は、下文でさらに記載されている。
現在実施されているＥＳ培養方法は、主に、幹細胞増殖に必要とされる因子を分泌し、同時にそれらの分化を阻害するフィーダー細胞層の使用に基づいている。フィーダー細胞を含まない系もまたＥＳ細胞培養に用いられており、そのような系は、フィーダー細胞層の代替として、血清、サイトカイン、及び成長因子を補充したマトリックスを利用する。
フィーダー層に基づいた培養
マウスフィーダー層−ＥＳ細胞を培養するための最も一般的な方法は、ＥＳ細胞の増殖及び多能性を支援する血清又は白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含有する組織培地を補充したフィーダー細胞層としてのマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）に基づいている［Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ、Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ Ｊ、Ｓｈａｐｉｒｏ ＳＳ、Ｗａｋｎｉｔｚ ＭＡ、Ｓｗｉｅｒｇｉｅｌ ＪＪ、Ｍａｒｓｈａｌｌ ＶＳ、Ｊｏｎｅｓ ＪＭ．（１９９８）．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５〜７；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ＢＥ、Ｐｅｒａ ＭＦ、Ｆｏｎｇ Ｃ、Ｔｒｏｕｎｓｏｎ Ａ、Ｂｏｎｇｓｏ Ａ．（２０００）．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ：ｓｏｍａｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３９９〜４０４］。ＭＥＦ細胞は、ウシ胎仔血清を補充した培地中の１２〜１３日目のマウス胚に由来する。これらの条件下で、マウスＥＳ細胞は、多能性幹細胞として培養中、維持することができ、それらの表現型的及び機能的特性を保存する。しかしながら、マウスＥＳ細胞と違って、外から加えられたＬＩＦの存在は、ヒトＥＳ細胞の分化を阻止しない。さらに、フィーダー細胞の使用は、生産コストを大幅に増加させ、ヒトＥＳ細胞培養のスケールアップを非現実的なものにさせている。加えて、フィーダー細胞は、それらが幹細胞より成長しないように代謝的に不活性化されており、それゆえ、ヒトＥＳ培養の分割ごとに新鮮なフィーダー細胞を有する必要がある。現在のところ、バルク培養で調製された胚性細胞からのフィーダー細胞成分の分離は効率的に達成することができないため、フィーダー細胞層で調製されるＥＳ培養は、ヒト治療に適していない。
ＥＳ細胞はまた、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を補充した血清代替物を用いる無血清条件下、ＭＥＦ上で培養することができる［Ａｍｉｔ Ｍ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ＭＫ、Ｉｎｏｋｕｍａ ＭＳ、Ｃｈｉｕ ＣＰ、Ｈａｒｒｉｓ ＣＰ、Ｗａｋｎｉｔｚ ＭＡ、Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ Ｊ、Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ．（２０００）．Ｃｌｏｎａｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｍａｉｎｔａｉｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｐｅｒｉｏｄｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２７：２７１〜８］。これらの条件下において、ＥＳ細胞のクローニング効率は、ウシ胎仔血清下より４倍高い。加えて、血清代替物下での６ヶ月間の培養後、ＥＳ細胞は、全ての３つの胚性胚葉を含有する奇形腫を形成するそれらの能力によって示されているように、それらの多能性をなお維持している。この系は、より十分に定義された培養条件を用いるが、培養中のマウス細胞の存在は、ヒト培養物を病原体に曝し、そのことが、細胞に基づいた治療におけるそれら使用を制限している。
フィーダー細胞層としてのヒト胚性線維芽細胞又は成体ファロピウス上皮細胞−ヒトＥＳ細胞は、ヒト胚性線維芽細胞、臍帯血線維芽細胞、又は成体ファロピウス上皮細胞を用いて成長させ、維持することができる。これらのヒトフィーダー細胞上で成長した場合、ヒトＥＳ細胞は正常な核型を表し、アルカリフォスファターゼ活性を示し、Ｏｃｔ−４、並びにＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、及びＧＣＴＭ−２を含む他の胚性細胞表面マーカーを発現し、インビボで奇形腫を形成し、全ての重要な形態学的特性を保持する［Ｒｉｃｈａｒｄｓ Ｍ、Ｆｏｎｇ ＣＹ、Ｃｈａｎ ＷＫ、Ｗｏｎｇ ＰＣ、Ｂｏｎｇｓｏ Ａ．（２００２）．Ｈｕｍａｎ ｆｅｅｄｅｒｓ ｓｕｐｐｏｒｔ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓｅｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：９３３〜６］。
包皮フィーダー層−ヒトＥＳ細胞は、米国特許出願第１０／３６８，０４５号に開示されているように、ヒト包皮フィーダー層上で培養することができる。包皮由来フィーダー細胞層は、ヒトＥＳ細胞を培養するのに適した完全に動物質を含まない環境からなる。加えて、包皮細胞は、それらの誘導から４２継代もの間、培養中、維持することができ、ＥＳ細胞に比較的一定した環境を提供する。これらの条件下で、ヒトＥＳ細胞は、代わりのプロトコール（例えば、ＭＥＦ）で成長した細胞とは機能的に区別できないことが見出された。分化後、ＥＳ細胞は、インビトロで、全ての３つの胚性胚葉に関連した遺伝子を発現し、インビボで、全ての３つの胚葉から生じた組織からなる奇形腫を形成した。加えて、ヒトファロピウス上皮細胞又はヒト胚性線維芽細胞と違って、包皮フィーダー層上で培養されたヒトＥＳ細胞は、少なくとも８７継代の間、多能性且つ未分化状態で培養中維持された。
フィーダーを含まない培養
幹細胞は、培養培地の存在下で細胞外マトリックス（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）又はラミニン）などの固体表面上で成長させることができる。
多能性幹細胞の増殖後、本発明は、多能性幹細胞を内胚葉細胞へ分化させるための分化培地中でのそれらの培養を企図する。
本発明は、接着条件下（細胞外マトリックス又はゼラチンコーティングプレートに付着している）又は懸濁下（非組織培養処理プレート内）で多能性幹細胞を培養することを企図する。企図される細胞外マトリックスには、単独又は様々な組合せでの、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫酸などが挙げられるが、それらに限定されない。
「接着培養」は、適切な成長培地と接触した細胞が存在し、基質へ接着した状態で生存可能な又は増殖することができる培養を指す。「非接着培養」は、細胞が、典型的には、適切な成長培地と懸濁状態にあり、基質に接着していない状態で生存可能な又は増殖することができる培養を指す。
一実施形態によれば、多能性幹細胞はまず、（それらが増殖した）照射された線維芽細胞のその最初の表面から、例えばコラゲナーゼを用いることにより、脱離し、その後、分化のために異なる接着表面（例えば、ゼラチンコーティング表面）上に再びプレーティングされる。
別の実施形態によれば、多能性幹細胞は、それらが増殖した照射線維芽細胞の同じ表面上で分化する。
句「内胚葉細胞」は、その少なくとも５０％、より好ましくはその少なくとも７０％が、２つのマーカーＳｏｘ１７又はＦｏｘＡ２の少なくとも１つを発現する、細胞の集団を指す。好ましい実施形態によれば、細胞の２０％未満、より好ましくは細胞の１０％未満は、多能性についてのマーカー、例えば、Ｏｃｔ４を発現する。
Ｓｏｘ１７、ＦｏｘＡ２、又はＯｃｔ４の発現レベルを決定する方法は当技術分野において知られており、それらには、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫組織化学法などが挙げられる。
多能性幹細胞から内胚葉細胞を作製する方法は当技術分野において知られており、それらには、例えば、Ｎｏｄａｌ（ＮＭ＿０１８０５５；ＮＰ＿０６０５２５．３）及び小分子（例えば、Ｂｏｒｏｗｉａｋら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、４巻、４号、３４８〜３５８、３ Ａｐｒｉｌ ２００９参照）の使用が挙げられる。或いは、内胚葉細胞は、胚様体を経由して作製されてもよい。具体的には、ｈＥＳ細胞を、ＦＧＦを含まない懸濁状態で培養して、胚様体を生じさせることができる。内胚葉細胞は、ＥＢから選び出すことができ、例えば、Ｓｅｇｅｖ、Ｆｉｓｃｈｍａｎ、Ｚｉｓｋｉｎｄら、Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、２００４；２２（３）：２６５〜７４を参照されたい。
一実施形態によれば、内胚葉細胞への分化は、アクチビンＡの存在下で実行される。
アクチビンＡの例示的な濃度範囲には、１〜５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜２５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは５０〜２００ｎｇ／ｍｌが挙げられ、例えば、１００ｎｇ／ｍｌなどである。
本発明のこの態様の特定の実施形態によれば、多能性幹細胞は、アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドを含む培地中での最初の培養（例えば、約２日間）、並びにアクチビンＡを含むがＷｎｔ−３を欠く培地中でのその後の培養（例えば、１日間）により内胚葉細胞へ分化する。
典型的には、第１の培養培地において、第２の培養培地と比較して、より低い濃度の血清が存在してもよい。第２の培養培地において血清濃度を増加させることは、細胞の生存時間を増加させ、又は代わりに、細胞の増殖を増強し得る。第１の培地の血清濃度は、約０％〜約１０％の範囲にあってもよい。或いは、第１の培地の血清濃度は、約０％〜約２％の範囲にあってもよい。或いは、第１の培地の血清濃度は、約０％〜約１％の範囲にあってもよい。或いは、第１の培地の血清濃度は、約０．５％であってもよい。
特定の実施形態によれば、第１の培養培地と第２の培養培地の両方が血清を欠く。典型的には、血清の代わりに、代替物が加えられる。そのような代替物は、少なくとも０．１％の濃度、例えば、少なくとも０．２％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、又は少なくとも２％の濃度などの様々な濃度で供給されてもよい。血清代替物は、いろいろな所から、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（商標））及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、入手できる。血清に代わって用いることができる追加の作用物質はアルブミン、例えば、ヒト組換えアルブミンである。
本発明者らは、血清が上記の培地から除去された場合、より後の段階でのノギンの添加が、細胞中に産生されるインスリンの量に相乗効果を生じることを示している。典型的には、本明細書の下文でさらに記載されているように、ノギンは、成長因子、ｃＡＭＰ誘導剤、及びレチノイン酸と共に（すなわち、プロトコールの段階（ｂ）で）加えられる。
Ｗｎｔリガンドの選択を最適化して、分化過程の効率を向上させることができる。Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−５ａ、及びＷｎｔ−７ａからなる群から選択されてもよい。一実施形態において、ＷｎｔリガンドはＷｎｔ−１である。代わりの実施形態において、ＷｎｔリガンドはＷｎｔ−３ａである。
分化過程が実行され得る、企図される培養培地には、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２；Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２９−０１８；ＨａｍのＦ１２／５０％ ＤＭＥＭ基本培地、ＣＭＲＬ−１０６６が挙げられる。好ましくは、培養培地は、医療グレードの純度である。典型的には、培養培地は、約５ｍＭ〜１００ｍＭの間、より好ましくは約１０ｍＭ〜５０ｍＭの間、より好ましくは約１５ｍＭ〜５０ｍＭの間、例えば、１７ｍＭのグルコース濃度を有する。
本発明者らは、内胚葉細胞を膵臓系統（すなわち、膵臓前駆細胞）へ分化させるために一緒に用いることができる３つの作用物質の新規のカクテルを発見している。
句「膵臓前駆細胞」は、膵臓細胞へ完全には分化していないが、膵臓細胞の少なくとも１つの型、例えば、インスリンを産生するβ細胞；グルカゴンを産生するα細胞；ソマトスタチンを産生するδ細胞（又はＤ細胞）；及び／又は膵臓ポリペプチドを産生するＦ細胞への分化にコミットした細胞の集団を指す。
典型的には、膵臓前駆細胞は、膵臓系統に特徴的な表現型マーカー（例えば、ＧＬＵＴ２、ＰＤＸ−１ Ηｎｆ３β、ＰＣ１／３、β２、Ｎｋｘ２．２、及びＰＣ２）のいくつかを発現する。典型的には、それらは、脱分化又は再プログラムされない限り、インビトロで単独で培養された場合、他の胚性胚葉の子孫を産生しない。多分化能膵臓前駆細胞である個々の細胞が存在する可能性があるが、集団内の細胞のそれぞれが１つより多い型の子孫を形成する能力を有することを意味するものではないことは認識されているであろう。
したがって、多能性細胞の内胚葉細胞への分化後、細胞は、その後、線維芽細胞成長因子（例えば、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ７、又はｂＦＧＦ）、ｃＡＭＰ誘導剤、及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む培地中、分化する。本明細書の上記で述べられているように、内胚葉細胞の生成のための最初の培養が血清の非存在下で実施される場合、ＦＧＦ、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＲＡを含む分化培地はまたノギンを含んでもよい。
線維芽細胞成長因子の企図される濃度範囲は、５０ｐｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌの間（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）である。
本明細書に用いられる場合、用語「ｃＡＭＰ誘導剤」は、フォルスコリン若しくはＮＰＡ（Ｒ（−）−プロピルノルアポモルフィン、ＰＫＡのＤ２受容体アゴニストであり、ｃＡＭＰを増加させる）により直接的にか、又はイソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）によって、若しくはｃＡＭＰ特異的Ｒｏ ２０−１７２４、ロリプラム、若しくはエタゾレートなどのＩＢＭＸ様活性を有する化合物によってホスホジエステラーゼを阻害することにより間接的にかのいずれかで、ｃＡＭＰ活性を誘導する化合物を指すが、より好ましくは、単独又は組み合わせて用いられる、イソブチル−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）又はフォルスコリンを含む群から選択される。
フォルスコリンについての企図される濃度範囲は、１〜１００μＭの間（例えば、１０μＭ）である。
レチノイン酸は、１ｎＭ〜１ｍＭの間（例えば、１〜１０μＭ）の濃度で用いられてもよい。
ノギンの企図される濃度範囲は、５０〜５００ｎｇ／ｍｌの間（例えば、１００ｎｇ／ｍｌ）である。ノギンはいくつかの供給源、例えば、Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈから市販されている。
典型的には、上記のカクテルを含む分化過程は、約２〜１０日間（例えば、５日間）実施される。典型的には、添加される場合のノギンは、この培養するステップの全期間（例えば、５日間）、加えられる。
上記のカクテルの存在下での分化の前に、内胚葉細胞は、さらなる分化のために、（レチノイン酸を含まず）ＦＧＦ及びｃＡＭＰ誘導剤を含む培地において前条件付けされてもよい。この前条件付けは、１〜５日間の間（例えば２日間）、実施されてもよい。
本プロトコールの最終分化ステップは、ニコチンアミド及び／又はエキセンディン４を含む培地中での成熟を含む。この成熟ステップは、３０〜６０日間、続いてもよい。
ニコチンアミドの企図される濃度範囲は、１〜１００ｍＭの間（例えば、１０ｍＭ）である。
エキセンディン−４の企図される濃度範囲は、１〜１００ｎｇ／ｍｌの間である。
本発明者らは、インスリン産生細胞の濃縮が、ＥｐＣＡＭを発現する細胞について選択することによって実施され得ることを見出している。
典型的には、選択するステップは、この細胞表面タンパク質を特異的に認識する能力がある抗体を用いて実施されるが、本発明は、ポリヌクレオチド又は小分子などの追加の作用物質を企図する。
濃縮するステップは、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いることなどによる公知の細胞ソーティング手順を用いて実施されてもよい。
本明細書に用いられる場合、用語「フローサイトメトリー」は、試料中の材料（例えば、特定のマーカーを含む腎細胞）の割合が、（例えば、標識抗体をその材料に結合することにより）その材料を標識し、その材料を含有する流体の流れを光線の中に通過させ、その試料から放射された光を一連のフィルター及び鏡により構成波長へと分離し、その光を検出することにより決定される、アッセイを指す。
多数のフローサイトメーターが市販されており、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎ ａｎｄ ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）が挙げられる。ＦＡＣＳ分析に用いられ得る抗体は、Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ Ｓ、Ｂｏｕｍｅｌｌ Ｌら、［Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｖ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；１９９５］に教示されており、いろいろな所で市販されている。
ＥｐＣＡＭ抗体が磁気部分に（直接的か、又は同族結合分子を通して間接的かのいずれかで）付着している場合、不均一な細胞集団は、磁気活性化細胞分離によりＥｐＣＡＭ＋について濃縮されてもよい。
ＥｐＣＡＭ抗体が親和性部分に付着している場合、不均一な細胞集団は、同族結合分子での親和性精製によりＥｐＣＡＭ＋細胞について濃縮することができる。したがって、例えば、ＥｐＣＡＭ抗体がビオチンに付着している場合には、不均一な細胞集団は、ストレプトアビジンのビーズ又はカラムでの精製によりＥｐＣＡＭ＋を除去することができる。その後、ＥｐＣＡＭ＋細胞は回収することができる。例えば、ＥｐＣＡＭ抗体が抗体又は抗体のＦｃに付着している場合には、不均一な細胞集団は、プロテインＡのビーズ又はカラムでの精製によりＥｐＣＡＭ＋を除去することができる。その後、ＥｐＣＡＭ＋細胞は回収することができる。
本発明のこの態様の分化細胞が典型的には接着性クラスターとして成長するため、細胞ソーティングの前に、不均一な細胞集団は、好ましくは、分散剤を用いて分散されるべきであることは認識されているであろう。
分散剤の例には、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、アキュターゼ（aｃｃｕｔａｓｅ）、及びトリプシンが挙げられるが、それらに限定されない。代わりに、又は追加として、研和もまた、細胞の分散を増加させるために実施されてもよい。
ＥｐＣＡＭ＋細胞の濃縮後、細胞は、典型的には、その再凝集を可能にする条件下で、少なくともさらに２日間、好ましくは８日間以内（例えば、２〜６日間）培養される。典型的には、細胞は、例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、シトレート、及びホスフェートが挙げられるカルシウムをキレート化する作用物質の存在下で再凝集される。特定の実施形態によれば、再凝集は、低いグルコース濃度（すなわち、最初の分化段階のグルコース濃度より低い）で実施される。本発明者らによって企図される濃縮相中のグルコースの例示的な範囲には、１〜１０ｍＭ、より好ましくは２〜８ｍＭ、例えば、５．５ｍＭが挙げられる。
再凝集が起こるために、細胞は、培養皿（例えば、低接着性結合プレート）上で培養されてもよいし、又は固体支持体（すなわち、本明細書の下文でさらに記載されているようなスキャフォールド）上に播種されてもよい。
本発明により企図される典型的なスキャフォールドには、コラーゲン、エラスチン、トロンビン、フィブロネクチン、デンプン、ポリ（アミノ酸）、ポリ（プロピレンフマレート）、ゼラチン、アルギネート、ペクチン、フィブリン、酸化セルロース、キチン、キトサン、トロポエラスチン、ヒアルロン酸、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、及びポリ（ビニルアルコール）から製作されているものが挙げられる。
一実施形態によれば、スキャフォールドは、生体適合性ポリマーから製作されている。
句「生体適合性ポリマー」は、生物体の細胞、組織、又は体液と接触した場合、免疫学的反応及び／又は拒絶反応などの有害作用を誘導しない任意のポリマー（合成又は天然）を指す。生体適合性ポリマーはまた生分解性ポリマーであり得ることは認識されているであろう。
句「生分解性ポリマー」は、プロテアーゼなどによる生理的環境において分解する（すなわち、破壊する）ことができる合成又は天然のポリマーを指す。生分解性は、分解基質（すなわち、生物学的材料、又はそのポリマーの一部であるその部分）の入手可能性、生分解作用の材料（例えば、微生物、酵素、タンパク質）の存在、並びに酸素（好気性生物体、微生物、又はその部分について）、二酸化炭素（嫌気性生物体、微生物、又はその部分について）、及び／又は他の栄養素の入手可能性に依存する。生分解性ポリマーの例には、コラーゲン（例えば、コラーゲンＩ又はＩＶ）、フィブリン、ヒアルロン酸、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリジオキサノン（ＰＤＯ）、トリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、コラーゲン、ＰＥＧ−ＤＭＡ、アルギネート、キトサンコポリマー、又はそれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されない。
例示的な実施形態によれば、スキャフォールドは多孔性アルギネートスポンジを含む。
本発明者らはまた、分化過程のステップ（ｃ）の前又はそれと同時であるが、分化過程のステップ（ｂ）の後又はそれと同時に、分化因子をコードするｍＲＮＡでの内胚葉細胞のトランスフェクションが、島細胞を作製するために有用であり得ることを見出している。トランスフェクションは、分化の特定の段階における細胞で培養物を濃縮するのに役立つ可能性がある。
したがって、例えば、本発明は、以下のｍＲＮＡ作用物質のうちの１つでのトランスフェクションを企図する：膵臓十二指腸ホメオボックス１（Ｐｄｘ１）、ニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）、ペアードボックス遺伝子４（Ｐａｘ４）、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ−２．２（Ｎｋｘ２．２）、ホメオボックスタンパク質ＮＫ−６相同体Ａ（Ｎｋｘ６．１）及びｖ−ｍａｆ筋腱膜線維肉腫癌遺伝子相同体Ａ（ＭＡＦ−Ａ）。
Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡ又はニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）ｍＲＮＡは、レチノイン酸を培養するステップと共に、レチノイン酸処理の前に、又はレチノイン酸処理を回避して成熟ステップの直前に、トランスフェクトされてもよい。Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡがＮｇｎ３ ｍＲＮＡと共にトランスフェクトされてもよいことは認識されているであろう。
好ましくは、ペアードボックス遺伝子４（Ｐａｘ４）ｍＲＮＡトランスフェクションは、レチノイン酸培養後１日以内に実施される。
好ましくは、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ−２．２（Ｎｋｘ２．２）、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ−６．１相同体Ａ（Ｎｋｘ６．１）ｍＲＮＡトランスフェクションは、レチノイン酸処理の終了後３０日以内に実施される。
ＭＡＦ−Ａ ｍＲＮＡトランスフェクションは、レチノイン酸培養段階後１週間で実施されてもよい。
本発明者らは、Ｐｄｘ−１ ｍＲＮＡトランスフェクションが、プロトコールのレチノイン酸培養ステップ（ｂ）の代わりに用いられ得ることを見出しているが、それは、より後の段階でも（すなわち、プロトコールのステップ（ｂ）の後に）、例えば、成熟過程が開始されてから数日後、例えば、分化の３０日目に、実施され得ることは認識されているであろう。
ｍＲＮＡのトランスフェクションのための方法は、市販されている方法を含め、当技術分野において知られており、それらには、エレクトロポレーション（Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ−ＩＩ（Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ））、（ＥＣＭ ８３０（ＢＴＸ）（Ｈａｒｖａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）、又はＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ、Ｄｅｎｖｅｒ、Ｃｏｌｏ．）、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ、Ｈａｍｂｕｒｇ Ｇｅｒｍａｎｙ）、リポフェクションを用いるカチオン性リポソーム媒介型トランスフェクション、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介型トランスフェクション、又は「遺伝子銃」などの微粒子銃の粒子送達システムが挙げられるが、それらに限定されない（例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１２（８）：８６１〜７０（２００１）参照）。
インビトロでｍＲＮＡを合成する方法は、当技術分野において知られている。
好ましい実施形態において、ｍＲＮＡは、リボソーム結合、翻訳開始、及び細胞内でのｍＲＮＡの安定性を決定する、５’末端でのキャップと３’ポリ（Ａ）テールの両方を有する。
ポリＡ／Ｔのひと続きのＤＮＡ鋳型への組込みの通常の方法は分子クローニングである。転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、１００ＴテールなどのポリＴテール（サイズは５０〜５０００Ｔであり得る）を含有するリバースプライマーを用いることによりＰＣＲ中に、又は非限定的に、ＤＮＡライゲーション若しくはインビトロ組換えを含む任意の他の方法によりＰＣＲ後に、作製することができる。ポリ（Ａ）テールはまた、ＲＮＡに安定性を与え、それらの分解を低減する。一般的に、ポリ（Ａ）テールの長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正に相関する。一実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、１００個から５０００個の間のアデノシンである。
ＲＮＡのポリ（Ａ）テールは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリＡポリメラーゼ（Ｅ−ＰＡＰ）などのポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてインビトロ転写後にさらに伸長させることができる。さらに、異なる化学基の３’末端への付着は、ｍＲＮＡ安定性を増加させることができる。そのような付着は、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマー、及び他の化合物を含有することができる。例えば、ＡＴＰ類似体は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてポリ（Ａ）テールへ組み入れることができる。ＡＴＰ類似体は、ＲＮＡの安定性をさらに増加させることができる。適切なＡＴＰ類似体は、カルジオリピン及び８−アザアデノシンを含むが、それらに限定されない。
５’キャップもまた、ＲＮＡ分子に安定性を与える。好ましい実施形態において、５’キャップは、例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、又はＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａキャップ類似体であってもよく、それらは全て市販されている。５’キャップはまた、アンチリバースキャップ類似体（ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ−ｃａｐ−ａｎａｌｏｇ）（ＡＲＣＡ）（Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉら、ＲＮＡ、７：１４６８〜９５（２００１））又は任意の他の適切な類似体であり得る。
ＲＮＡはまた、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含有してもよい。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡへのキャップ非依存性リボソーム結合を惹起し、且つ翻訳開始を促進する任意のウイルス配列、染色体配列、又は人工的に設計された配列であってもよい。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤、及び界面活性剤などの細胞透過性及び生存能を促進する因子を含有することができる、細胞エレクトロポレーションに適した任意の溶質を含むことができる。
膵内分泌系統の細胞に特徴的なマーカーは当業者によく知られており、膵内分泌系統に特徴的な追加のマーカーの同定が継続中である。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して、膵内分泌系統に特徴的な性質を獲得していることを確認するために用いることができる。膵内分泌系統特異的マーカーには、例えば、Ｎｇｎ−３、ＮｅｕｒｏＤ、及びＩｓｌｅｔ−１などの１つ又は複数の転写因子の発現が挙げられる。
β細胞系統の細胞に特徴的なマーカーは当業者によく知られており、β細胞系統に特徴的な追加のマーカーの同定が継続中である。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して、β細胞系統に特徴的な性質を獲得していることを確認するために用いることができる。β細胞系統特異的特性には、例えば、とりわけ、Ｐｄｘ１（膵臓十二指腸ホメオボックス遺伝子１）、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、Ｉｓｌ１、Ｐａｘ６、Ｐａｘ４、ＮｅｕｒｏＤ、Ｈｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ−６、Ｈｎｆ−３β、及びＭａｆＡなどの１つ又は複数の転写因子の発現が挙げられる。これらの転写因子は、内分泌細胞の同定として当技術分野において十分確立されている。例えば、Ｅｄｌｕｎｄ（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：５２４〜６３２（２００２））を参照されたい。
分化の効率は、膵内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現するタンパク質マーカーを特異的に認識する作用物質（抗体など）に、処理された細胞集団を曝すことによって決定されてもよい。或いは、分化の効率は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現するタンパク質マーカーを特異的に認識する作用物質（抗体など）に、処理された細胞集団を曝すことによって決定されてもよい。
培養細胞又は単離細胞においてタンパク質マーカー及び核酸マーカーの発現を評価するための方法は、当技術分野において標準である。これらには、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００１ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照）、及び切片化材料の免疫組織化学的分析、ウェスタンブロッティングなどのイムノアッセイ、並びに無傷細胞においてアクセス可能であるマーカーについて、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）参照）が挙げられる。
分化及び成熟後、最終生成物は、例えば、島形態を有する領域を選択且つ採取するために顕微鏡に連結されたコンピュータ制御のロボットアームを用いることにより、又は代わりに、ＦＡＣＳを用いて、特定のマーカーについて選択することにより、膵島細胞について濃縮することができる。この手順は、多能性ＥＳ細胞の混入のリスク、及びインビボでの細胞の移入後の奇形腫のリスクを回避する。
本発明者らは、本発明の島細胞がグルコース応答性であることを企図し、それは、作製されたインスリン発現細胞が、グルコース輸送体膜貫通タンパク質Ｇｌｕｔ−２（グルコース依存性インスリン分泌に必須のタンパク質の１つ）もまた発現することが示されたからである（図７Ｄ）。その細胞のグルコース応答性は、図２３Ａでさらに実証された。本発明のこの態様によれば、句「グルコース応答性」は、本発明の分化細胞の、グルコースに応答してインスリンを分泌する能力を指す。好ましくは、成体島β細胞は、１６ｍＭグルコースに応答して、０ｍＭグルコースにおいてそれらが分泌する量の少なくとも２倍のインスリン量を分泌する。
本発明の成体島β細胞集団はさらに、治療剤などの医薬品、テロメラーゼ遺伝子、免疫媒介性拒絶反応を低下させる作用物質、又はマーカー遺伝子を発現するように改変（例えば、遺伝子改変）されてもよい。代謝拮抗剤（例えば、プリン類似体、ピリミジン類似体）、酵素阻害剤、及びペプチド模倣薬などの治療剤が本発明において一般的に有用であり得ることが企図される。免疫媒介性拒絶反応を低下させ得る遺伝子の例はウテログロビン遺伝子である。ウテログロビンは、免疫寛容を与え、且つ炎症反応を防ぐ、妊娠中に発現するタンパク質である。本発明の成体島β細胞を遺伝子改変する方法は、上文に記載されている。
本発明の島細胞はインスリンを発現するため、それらは、糖尿病などのインスリン欠乏に関連している疾患を処置するために用いられてもよい。
天然の島におけるレベルと類似したインスリンレベルをまだ発現しない膵内分泌系統にコミットした細胞もまた、それらがＰｄｘ１、Ｎｋｘ６．１、及びＭＡＦ−Ａを共発現するならば、移入に用いられてもよい（未成熟島細胞）ことは認識されているであろう。これらの細胞は、それらが正しいインビボ環境にある場合、成熟するように、すなわち、高レベルのインスリンを発現するように、刺激され得る。
したがって、本発明の別の態様によれば、治療的有効量の本発明の島細胞を対象に移植し、それにより糖尿病を処置するステップを含む、対象において糖尿病を処置する方法が提供される。
本明細書に用いられる場合、「糖尿病」は、生物体において、インスリンの生合成若しくは産生における欠陥によるインスリンの絶対的欠乏（１型糖尿病）か、又はインスリン抵抗性、すなわち、インスリン作用の障害の存在下でのインスリンの相対的欠乏（２型糖尿病）かのいずれかに起因する疾患を指す。このように、糖尿病患者は、絶対的又は相対的インスリン欠乏を有し、症状及び徴候の中でも、血糖濃度の上昇、尿中グルコースの存在、及び多尿を示す。
句「処置すること」は、疾患、障害、若しくは状態の発生を阻害若しくは阻止すること、及び／又は疾患、障害、若しくは状態を患っている、若しくはそれと診断された個体において、疾患、障害、若しくは状態の低減、寛解、若しくは退行を引き起こすことを指す。当業者は、疾患、障害、又は状態の発生を評価するために用いることができる様々な方法及びアッセイ、並びに同様に、疾患、障害、又は状態の低減、寛解、又は退行を評価するために用いることができる様々な方法及びアッセイを知っているであろう。
本明細書に用いられる場合、「移植すること」は、任意の適切な経路を用いて、本発明の島細胞を供給することを指す。典型的には、β細胞治療は、肝臓の門脈へのカテーテルを用いる注入により実施されるが、他の投与方法（例えば、皮下、又は腹腔内、又は脂肪組織内）が構想される。
本発明の島細胞は、自己供給源、半自己供給源、又は同種異系供給源に由来し得る。非自己細胞は、身体へ投与された場合、免疫反応を誘導する可能性が高いため、非自己細胞の拒絶反応の可能性を低下させるためにいくつかのアプローチが開発されている。これらは、レシピエント免疫系を抑制するか、又は移植術前に非自己細胞を免疫隔離半透膜内にカプセル化することのいずれかを含む。
カプセル化技術は、一般的に、小球状媒体を利用するマイクロカプセル化、及びより大きいフラットシートの中空繊維膜を利用するマクロカプセル化として分類される（Ｕｌｕｄａｇ，Ｈ．ら、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０００；４２：２９〜６４）。
マイクロカプセルを調製する方法は当技術分野において知られており、それらには、例えば、Ｌｕ ＭＺら、Ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｌｇｉｎａｔｅ ａｎｄ ａｌｐｈａ−ｐｈｅｎｏｘｙｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅ−ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ）．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０００、７０：４７９〜８３、Ｃｈａｎｇ ＴＭ及びＰｒａｋａｓｈ Ｓ．Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ， ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１、１７：２４９〜６０、並びにＬｕ ＭＺら、Ａ ｎｏｖｅｌ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｏｌｙ（ａｌｌｙｌａｍｉｎｅ ａｌｐｈａ−ｃｙａｎｏｃｉｎｎａｍｙｌｉｄｅｎｅａｃｅｔａｔｅ）．Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．２０００、１７：２４５〜５１によって開示されたものが挙げられる。
例えば、マイクロカプセルは、２−ヒドロキシエチルメチルアクリレート（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）、及びメチルメタクリレート（ＭＭＡ）のターポリマーシェルと修飾コラーゲンを複合体化することにより調製され、その結果として、厚さ２〜５μｍのカプセルが生じる。そのようなマイクロカプセルは、負に帯電した滑面を与え、且つ血漿タンパク質吸収を最小限にするために、追加の２〜５μｍのターポリマーシェルでさらにカプセル化することができる（Ｃｈｉａ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｍｕｌｔｉ−ｌａｙｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００２ ２３：８４９〜５６）。
他のマイクロカプセルは、海洋性多糖であるアルギネート（Ｓａｍｂａｎｉｓ，Ａ．Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｉｓｌｅｔｓ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｔｈｅｃｈｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００３、５：６６５〜８）、又はその誘導体に基づいている。例えば、マイクロカプセルは、塩化カルシウムの存在下における、アルギン酸ナトリウムとセルロース硫酸ナトリウムとのポリアニオンの間の、ポリ（メチレン−コ−グアニジン）ハイドロクロライドのポリカチオンでの多価電解質複合体形成によって調製することができる。
より小さいカプセルが用いられる場合、細胞カプセル化が向上することは認識されているであろう。したがって、カプセルサイズを１ｍｍから４００μｍへ低下させた場合、カプセル化された細胞の品質管理、機械的安定性、拡散性、及びインビトロでの活性が向上した（Ｃａｎａｐｌｅ Ｌ．ら、Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｉｚｅ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｊ Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｐｏｌｙｍ Ｅｄ．２００２；１３：７８３〜９６）。さらに、小さくも７ｎｍほどに十分制御されたポアサイズ、目的に合った表面化学的性質、及び正確な微細構造を有するナノ多孔性生物的カプセルが、細胞についての微小環境をうまく免疫隔離することが見出された（Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｄ．Ｓｍａｌｌ ｉｓ ｂｅａｕｔｉｆｕｌ：ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ ａｎｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｍｅｄｉｃａｌ ｄｅｖｉｃｅｓ．Ｍｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９、１０：６〜９；Ｄｅｓａｉ，Ｔ．Ａ．Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２００２、２：６３３〜４６）。
免疫抑制剤の例には、メトトレキセート、シクロホスファミド、シクロスポリン、シクロスポリンＡ、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン（スルファサラゾピリン）、金塩、Ｄ−ペニシラミン、レフルノミド、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、エタネルセプト、ＴＮＦαブロッカー、炎症性サイトカインを標的にする生物学的作用物質、及び非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられるが、それらに限定されない。ＮＳＡＩＤの例には、アセチルサリチル酸、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサレート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラック、メクロフェナメート、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Ｃｏｘ−２阻害剤、及びトラマドールが挙げられるが、それらに限定されない。
適切な場合、患者は、移植された細胞の生存及び機能を促進する医薬品又は生物活性物質でさらに処置することができる。これらの作用物質には、例えば、とりわけ、インスリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−β１、２、及び３、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、及び−１３）を含むＴＧＦβファミリーのメンバー、線維芽細胞成長因子−１、及び−２、血小板由来成長因子−ＡＡ、及び−ＢＢ、多血小板血漿、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−７、−８、−１０、−１１、−１５）、血管内皮細胞由来成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、β−セルリンを挙げることができる。他の薬学的化合物には、例えば、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）及びＩＩ、ＧＬＰ−１及び２ミメティボディ（ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ）、エキセンディン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモンを挙げることができる。
インドラクタムＶ、又はＰＭＡ、又は例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び米国特許出願公開第２００４／０１３２７２９号に開示された化合物などのＭＡＰＫ阻害剤。
本発明の細胞は、それ自体で、又は適切な担体若しくは賦形剤と混合されている薬学的組成物として、ヒト対象に移植されてもよい。
本明細書に用いられる場合、「薬学的組成物」は、本明細書に記載された細胞集団の１つ又は複数の、生理学的に適切な担体及び賦形剤などの他の化学的成分との調製物を指す。薬学的組成物の目的は、化合物の生物体への投与を促進することである。
以下、交換可能に用いられ得る、句「生理学的に許容される担体」及び「薬学的に許容される担体」は、生物体に有意な刺激作用を引き起こさず、且つ投与された化合物の生物学的活性及び性質を抑止しない担体又は希釈剤を指す。補助剤は、これらの句の下に含まれる。
本明細書において、用語「賦形剤」は、活性成分の投与をさらに促進する、薬学的組成物に加えられる不活性物質を指す。賦形剤の例は、非限定的に、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖及び様々な型のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、並びにポリエチレングリコールが挙げられる。
本発明の薬学的組成物は、当技術分野においてよく知られた工程によって、例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠作製、粉末化、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥工程を用いて製造されてもよい。
したがって、本発明に従って用いられる薬学的組成物は、薬学的に用いることができる調製物への活性成分の加工を促進する賦形剤及び助剤を含む１つ又は複数の生理学的に許容される担体を用いる通常の様式で製剤化されてもよい。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。
注射用として、薬学的組成物の活性成分は、水溶液中、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩緩衝液などの生理学的に適合した緩衝液中に製剤化されてもよい。
本発明の関連において用いられるのに適した薬学的組成物には、活性成分が、意図された目的を達成するのに有効な量で含有されている組成物が挙げられる。より具体的には、治療的有効量とは、処置されている対象の障害（例えば、糖尿病）の症状を防ぎ、軽減し、若しくは改善し、又はその対象の生存を延ばすのに有効な活性成分（インスリン産生細胞）の量を意味する。
治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供された詳細な開示を鑑みれば、十分当業者の能力の範囲内である。
本発明の方法に用いられる任意の調製物について、治療的有効量又は有効用量は、所望の濃度又は力価を達成するように動物モデル（例えば、ＳＴＺ糖尿病マウス）から推定することができる。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。
本明細書に記載された活性成分の毒性及び治療効力は、実験動物における標準の薬学的手順によって決定することができる。これらの動物研究から得られたデータは、ヒトに用いる用量の範囲を策定するのに用いることができる。用量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に依存して変わり得る。的確な製剤、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」１章１ページを参照）。
投薬量及び間隔は、正常血糖を誘導するのに十分な細胞数を供給するように個々に調整され得る（最小有効濃度、ＭＥＣ）。ＭＥＣは、調製物ごとに異なるが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な用量は、個々の特性及び投与経路に依存する。検出アッセイは、血漿中濃度を決定するために用いることができる。
投与される組成物の量は、当然のことながら、処置されている対象、苦痛の重症度、投与様式、処方医師の判断などに依存する。
本発明の組成物は、必要に応じて、ＦＤＡ認可キットなどの、活性成分を含有する１つ又は複数の単位剤形を含有し得るパック又はディスペンサー装置内で提供されてもよい。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属箔又はプラスチック箔を含んでもよい。パック又はディスペンサー装置は、投与についての使用説明書を添付されてもよい。パック又はディスペンサーはまた、医薬品の製造、使用、又は販売を規制する行政機関によって規定された形で容器に付された注記を盛り込んでもよく、その注記は、組成物の形又はヒト若しくは獣医学的投与の行政機関による認可を反映している。そのような注記は、例えば、処方薬についての米国食品医薬品局によって認可されたラベル付け、又は認可された製品挿入物であってもよい。適合性薬学的担体内に製剤化された本発明の調製物を含む組成物もまた、上記でさらに詳述されているのと同様に、調製され、適切な容器に入れられ、指示された状態の処置についてラベルを貼られてもよい。
本発明はまた、細胞を３次元支持体へ組み入れることを企図する。細胞は、患者への移入前にインビトロのこの支持体上で維持することができる。或いは、細胞を含有する支持体は、追加のインビトロ培養なしに患者に直接移入することができる。支持体は、任意で、移植細胞の生存及び機能を促進する少なくとも１つの医薬品と共に組み入れることができる。
本発明の目的のために用いるのに適した支持体材料には、組織修復に有用な組織鋳型、導管、バリア、及びリザーバが挙げられる。特に、生物組織を再構築又は再生するために、及び組織成長を誘導するための走化性物質を送達するためにインビトロ及びインビボで用いられている、泡、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、及び不織構造の形をとる合成及び天然材料が、本発明の方法の実施に用いるのに適している。例えば、米国特許第５，７７０，４１７号、米国特許第６，０２２，７４３号、米国特許第５，５６７，６１２号、米国特許第５，７５９，８３０号、米国特許第６，６２６，９５０号、米国特許第６，５３４，０８４号、米国特許第６，３０６，４２４号、米国特許第６，３６５，１４９号、米国特許第６，５９９，３２３号、米国特許第６，６５６，４８８号、米国特許出願公開第２００４／００６２７５３ Ａ１号、米国特許第４，５５７，２６４号、及び米国特許第６，３３３，０２９号に開示された材料を参照されたい。
医薬品と共に組み入れられる支持体を形成するために、医薬品は、支持体を形成する前にポリマー溶液と混合することができる。或いは、医薬品は、製作された支持体上へ、好ましくは薬学的担体の存在下で、コーティングすることができる。その医薬品は、液体、微粉化固体、又は任意の他の適切な物理的形として存在してもよい。或いは、医薬品の放出速度を変化させるために支持体に賦形剤が加えられてもよい。代わりの実施形態において、支持体は、例えば、米国特許第６，５０９，３６９号に開示された化合物などの抗炎症化合物である少なくとも１つの薬学的化合物と共に組み入れられる。
支持体は、例えば、米国特許第６，７９３，９４５号に開示された化合物などの抗アポトーシス性化合物である少なくとも１つの薬学的化合物と共に組み入れられてもよい。
支持体はまた、例えば、米国特許第６，３３１，２９８号に開示された化合物などの線維症の阻害剤である少なくとも１つの薬学的化合物と共に組み入れられてもよい。
支持体はまた、例えば、米国特許出願公開第２００４／０２２０３９３号及び米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号に開示された化合物などの血管新生を増強する能力がある少なくとも１つの薬学的化合物と共に組み入れられてもよい。
支持体はまた、例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１６２３号に開示された化合物などの免疫抑制化合物である少なくとも１つの薬学的化合物と共に組み入れられてもよい。
支持体はまた、例えば、とりわけ、ＴＧＦ−β１、２、及び３、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、及び−１３）を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、線維芽細胞成長因子−１、及び−２、血小板由来成長因子−ＡＡ、及び−ＢＢ、多血小板血漿、インスリン成長因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、−１５）、血管内皮細胞由来成長因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンなどの成長因子である少なくとも１つの薬学的化合物と共に組み入れられてもよい。他の薬学的化合物には、例えば、ニコチンアミド、低酸素誘導因子１−α、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）及びＩＩ、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２ミメティボディ、エキセンディン−４、ノーダル（ｎｏｄａｌ）、ノギン、ＮＧＦ、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、テネイシン−Ｃ、トロポエラスチン、トロンビン由来ペプチド、カテリシジン、ディフェンシン、ラミニン、フィブロネクチン及びビトロネクチンなどの接着性細胞外マトリックスタンパク質の細胞結合ドメイン及びヘパリン結合ドメインを含有する生物学的ペプチド、例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び米国特許出願公開第２００４／０１３２７２９号に開示された化合物などのＭＡＰＫ阻害剤を挙げることができる。
本発明の細胞のスキャフォールドへの組入れは、細胞のスキャフォールド上への単純な沈着によって達成することができる。細胞は、単純拡散によりスキャフォールド中へ侵入することができる（Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．２３（１ Ｐｔ ２）：３〜９（１９８８））。細胞播種の効率を増強するためにいくつかの他のアプローチが開発されている。例えば、軟骨細胞のポリグリコール酸スキャフォールド上への播種にスピナーフラスコが用いられている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１４（２）：１９３〜２０２（１９９８））。細胞を播種するための別のアプローチは、播種された細胞に最小限のストレスをもたらし、播種効率を増強する遠心分離の使用である。例えば、Ｙａｎｇらは、遠心分離細胞固定化（ＣＣＩ）と呼ばれる細胞播種方法を開発した（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．５５（３）：３７９〜８６（２００１））。
本発明の追加の目的、利点、及び新規の特徴は、以下の実施例の検討によって、当業者に明らかになるであろうし、その実施例は、限定することを意図するものではない。加えて、上文で描写されているような、及び下の特許請求の範囲のセクションにおいて主張されているような本発明の様々な実施形態及び態様のそれぞれは、以下の実施例に実験的確証を見出す。
本明細書に用いられる場合、用語「約」は±１０％を指す。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、及びそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されないこと」を意味する。
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「含み、且つそれらに限定されること」を意味する。
用語「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、組成物、方法、又は構造が、追加の成分、ステップ、及び／又は部分を含んでもよいが、追加の成分、ステップ、及び／又は部分が、主張された組成物、方法、又は構造の基本的且つ新規の特性を物質的に変化させない場合のみであることを意味する。
本出願を通して、本発明の様々な実施形態が、範囲形式で提示されてもよい。範囲形式での記載は、単に便利さ及び簡潔さのためだけであり、本発明の範囲への確固たる限定として解釈されるべきではないことは理解されているはずである。したがって、範囲の記載は、全ての可能性のある部分的な範囲、加えて、その範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１から６までなどの範囲の記載は、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６までなどの部分的な範囲、加えて、その範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、及び６を具体的に開示しているとみなされるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
数値範囲が本明細書で示されている場合は常に、その示された範囲内の任意の挙げられた数字（分数又は整数）を含むことが意図される。第１の表示数から第２の表示数の「間の範囲であること／範囲である」、及び第１の表示数「から」第２の表示数「までの範囲であること／範囲である」という句は、本明細書で交換可能に用いられ、第１及び第２の表示数、並びにその間の全ての分数及び整数を含むことが意図される。
本明細書に用いられる場合、用語「方法」は、所定の課題を達成するための様式、手段、技術、及び手順を指し、それらには、化学的、薬理学的、生物学的、生化学的、及び医学的分野の実務者に知られているか、又はその実務者によって公知の様式、手段、技術、及び手順から容易に開発されるかのいずれかの様式、手段、技術、及び手順が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書に用いられる場合、用語「処置すること」は、状態の進行を抑止すること、実質的に阻害すること、遅らせること、若しくは逆転させること、状態の臨床症状若しくは審美的症状を実質的に改善すること、又は状態の臨床症状若しくは審美的症状の出現を実質的に防ぐことを含む。
明確にするために別々の実施形態の文脈において記載されている、本発明の特定の特徴もまた、組み合わせて、単一の実施形態において提供されてもよいことは認識されている。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈において記載されている、本発明の様々な特徴もまた、別々に、又は任意の適切な部分的組合せで、又は適するならば、本発明の任意の他の記載された実施形態において、提供されてもよい。様々な実施形態の文脈において記載された特定の特徴は、それらの要素なしでも実施形態が無効にならない限り、それらの実施形態の必須の特徴とみなされるべきではない。
上文で描写されているような、及び下の特許請求の範囲のセクションにおいて主張されているような本発明の様々な実施形態及び態様は、以下の実施例に実験的確証を見出す。
今、以下の実施例に言及し、その実施例は、上の説明と共に本発明のいくつかの実施形態を非限定的形式で示す。
一般的に、本明細書に用いられる命名法及び本発明に利用される実験手順は、分子技術、生化学的技術、微生物学的技術、及び組換えＤＮＡ技術を含む。そのような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら（編）「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」、１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）を参照；方法は米国特許第４，６６６，８２８号；第４，６８３，２０２号；第４，８０１，５３１号；第５，１９２，６５９号、及び第５，２７２，０５７号；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ−Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）、第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻 Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（編）、「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）に示されている；利用可能なイムノアッセイは特許及び科学的文献に広く記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；第３，８３９，１５３号；第３，８５０，７５２号；第３，８５０，５７８号；第３，８５３，９８７号；第３，８６７，５１７号；第３，８７９，２６２号；第３，９０１，６５４号；第３，９３５，０７４号；第３，９８４，５３３号；第３，９９６，３４５号；第４，０３４，０７４号；第４，０９８，８７６号；第４，８７９，２１９号；第５，０１１，７７１号、及び第５，２８１，５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、（１９８４）、及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい（それらの全ては、あたかも本明細書に完全に示されているように、参照により組み入れられている）。他の一般的な参考文献は、本文書を通じて提供されている。それらにおける手順は、当技術分野においてよく知られていると考えられ、読者の便宜のために提供される。そこに含まれる全ての情報は、参照により本明細書に組み入れられている。
（例１）
胚体内胚葉へのｈＥＳ細胞の分化の手順：５日間のアクチビンＡでの処理は、胚体内胚葉のマーカーを有する７５％の細胞を生じる
材料及び方法
ヒトＥＳ細胞の成長：γ線照射されたヒト包皮（又は臍帯血）線維芽細胞（ＨＥＦ、ウェルあたり２〜３×１０５個の細胞）を、０．１％ブタゼラチン（細胞培養試験済み）でコーティングされたｃｏｓｔａｒ ６×ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェル上に播種した。ゼラチンを、水に、１００ｍｌ再蒸留水あたり０．１ｇの濃度で溶解し、オートクレーブした。線維芽細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）、グルタミン２ｍＭ、及びペニシリン ストレプトマイシン（ＰＳ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｂｅｔ Ｈａ Ｅｍｅｋ）中、３７℃のインキュベータにおいて２時間〜一晩、放置した。
凍結後、又はコラゲナーゼＩＶ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ又はＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）での解離直後のヒトＥＳ細胞を、ＨＥＦ上に、ウェルあたり約４５０〜５００個のＥＳ細胞クラスターの濃度で播種した。ｈＥＳ細胞を、成長培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｂｅｔ Ｈａ Ｅｍｅｋ、Ｉｓｒａｅｌ）；２０％ノックアウト血清代替物（ＫＯＳＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；グルタミン２ｍＭ（ｇｌｕｔ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｂｅｔ ｈａ Ｅｍｅｋ）；β−メルカプトエタノール（βΜΕｔＯΗ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００μΜ；非必須アミノ酸１×（ＮＥＥＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ピルビン酸Ｎａ（１ｍＭ（ＮａＰｙｒ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び８ｎｇ／ｍｌの組換えｈｂＦＧＦ（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ））中で培養した。この培地は、毎日交換され、抗生物質を含有しなかった。細胞を、３〜５日間、成長させておいた。各コロニーは、直径６００〜９００μｍまで成長し、平均３，３００個の未分化ｈＥＳ細胞を含有した（合計約２×１０８個の細胞）。
ＥＳ細胞を継代するために、グルタミン２ｍＭを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中１．２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶのウェルあたり０．８ｍｌの添加前に、培地を除去した。細胞をコラゲナーゼと共に、２５〜４０分間、放置し、ＨＥＦに影響を及ぼさずに、ｈＥＳＣクラスターの脱離を引き起こした。細胞クラスターを、９００ｒｐｍ ５〜６分間の遠心分離によってコラゲナーゼから２回、洗浄した。そのペレットを３００μｌの培地中に再懸濁し、必要（１ｍｍより大きい直径）ならば、クラスターのサイズを約３〜４００μｍまで、１５０μｌに設定された２００μｌの自動ピペットでの上げ下げピペッティングによって低下させた。コラゲナーゼでの処理を、同時には３つより多いプレートに実施しなかった。
胚体内胚葉への分化：
ステップＩＡ：１日目、コラゲナーゼによって脱離した（４日間Ｃｏｒｎｉｎｇ ６×ウェルプレート上で成長した）ヒトＥＳ細胞コロニーの３つのウェルを１５ｍｌのチューブに収集し、コロニーを、分化培地Ａ（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２％ＫＯＳＲ、２ｍＭグルタミン、１×ＮＥＡＡ、１００μΜ βΜＥｔΟΗ、１ｍＭピルビン酸Ｎａ、及びペニシリンとストレプトマイシン（ＰＳ））中、低速遠心分離によって２回、洗浄した。
全てのｈＥＳクラスターを収集し、且つ洗浄した後、クラスターを、１．５ｍｌ／ウェルの分化培地Ａ１（すなわち、１００ｎｇ／ｍｌ組換えヒトアクチビンＡ（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ）及び２５ｎｇ／ｍｌ組換えＷｎｔ３（Ｒ＆Ｄ）、２％ノックアウト血清代替物、並びに２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、細胞培養試験済みＳＩＧＭＡ）を含む分化培地Ａ）中に懸濁した。４５０〜５００個のコロニー／ウェルを、１日前に０．１％ブタゼラチン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングされているＣｏｓｔａｒ ６×ウェルプレート中に播種した。或いは、約３０００個のコロニーを、１０ｃｍ直径のプレート上に播種した。プレートを、培地交換なしに２日間、インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）内に放置した。
ステップＩＢ：３日目、培地を、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ及び２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する分化培地Ａ２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２％ＫＯＳＲ、２ｍＭ ｇｌｕｔ、１×ＮＥＡＡ、１００μΜ βΜΕｔΟΗ、１ｍＭ ＮａＰｙｒ、及び２％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ））に交換した。この段階において、クラスターはまだ浮遊しており、多数の単細胞が目に見えた。クラスターがウェルの底縁に落下するようにプレートを傾け、（１．２ｍｌの培地Ａ２で完全なものにされる）３００μｌの培地中にクラスターを残して、古い培地を除去した。数個のクラスターを含有する収集された培養培地を、９００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。ペレットを、１．５ｍｌ培地Ａ２中に再懸濁し、ウェルの１つに加えた。４日目、たいていのクラスターがプレートに接着し、３日目と同様に、培養培地を、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ及び２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する分化培地Ａ３（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２ｍＭグルタミン、１×ＮＥＡＡ、１００μΜ βΜΕｔΟΗ、１ｍＭ ＮａＰｙｒ、ただし、０．２％ＦＣＳを含む）に交換した。細胞を、培地Ａ３中に２日間、放置した。
胚体内胚葉に特異的なマーカーの発現の間接的免疫蛍光による分析：細胞を固定し（Ｃａ２＋とＭｇ２＋を含まないＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド、２０分間）、ＰＢＳで３回、洗浄し、ＰＢＳ中１０％ウマ血清でブロッキングした。一次抗体（Ａｂ）との反応を、１％ＢＳＡを含む、又は含まない１０％ウマ血清中で実施した。二次抗体（蛍光タグ、Ａｌｅｘａ ４８８若しくはＡｌｅｘａ ５６６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はＣｙ３とコンジュゲートしたロバ抗マウス；ロバ抗ウサギ；ロバ又はウサギ抗ヤギ／ロバ抗ウサギＤｙＬｉｇｈｔ ４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のいずれか）。ＣＣＤカメラで写真を撮り、画像処理プログラムで処理した。マウスモノクローナル抗Ｓｏｘ１７ Ａｂ（Ｒ＆Ｄ）１０μｇ／ｍｌを０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００と共に用いた。ウサギポリクローナル抗ＦｏｘＡ２（ａｂ４０８７４）（Ａｂｃａｍ）を、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００と共に１／１０００の希釈で用いた。
結果
上記プロトコールを用いて、５日間のアクチビンＡ処理の終わりに、細胞の約７５％がＳｏｘ１７及び／又はＦｏｘＡ２を発現することが見出され（図１Ａ〜Ｆ）、細胞が胚体内胚葉段階にあることを示した。低倍率において、ＦｏｘＡ２（図１Ａ）又はＳｏｘ１７（図１Ｄ）の染色は、大きな領域が陽性であることを示すが、より高い倍率は核染色を示している（図１Ｂ、Ｅ）。核の約７５％がＦｏｘＡ２及び／又はＳｏｘ１７を発現すると計算された。ＲＮＡ抽出、続いて特異的プライマーでのＲＴ−ＰＣＲにより、これらのマーカーの強い発現が確認された。抗Ｏｃｔ４抗体での免疫染色により、細胞のたった５％が、この時点で抗Ｏｃｔ４陽性であることが示された（図示せず）。アクチビンＡでの５日間の処理の終わりに、６ウェルプレートのウェルあたり（播種された最初の３００〜５００個のＥＳ細胞コロニーのうち）約２００個の接着性クラスターを観察することができ、好収量の胚体内胚葉クラスターを示している。
（例２）
ステップＩＡ及びＩＢ由来の細胞のＦＧＦ１０、フォルスコリン、及びレチノイン酸での処理が、高パーセンテージのＰｄｘ１陽性細胞を生じる
材料及び方法
胚体内胚葉クラスターのＰｄｘ１陽性細胞への分化：
ステップＩＩＡ。６日目、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２、２ｍＭグルタミン、１×ＰＳで洗浄し、培地を分化培地Ｂ１（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１％ Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）、５０ｎｇ／ｍｌヒト組換えＦＧＦ１０（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ）、及び１０μΜフォルスコリン（コレウス・フォルスコリ（ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）由来Ｆ−６８８６（ＳＩＧＭＡ））に交換した。細胞を同じ培地中、２日間、放置した。
ステップＩＩＢ。８日目、培地を分化培地Ｂ２、すなわち、２μＭの新鮮なＡＴＲＡ（オールトランスレチノイン酸）を添加した培地Ｂ１に、５日間、交換した。培地を２日ごとに交換した。
ステップＩＩＩ。１３日目、培地を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、グルタミン２ｍＭ、ＰＳ、１×ＩＴＳ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、５μｇ／ｍｌウシフィブロネクチン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｂｅｔ Ｈａ’ｅｍｅｋ）、ニコチンアミド１０ｍＭ（ＳＩＧＭＡ）、及びエキセンディン−４、５〜５０ｎｇ／ｍｌに交換した。培地を２日ごとに交換した。Ｃ−ペプチド染色が陽性である細胞は、分化の１９日目頃に出現し始めるが、Ｃ−ペプチドについての強い免疫染色は、２３日目に出現し、陽性の島様構造は、５０日目まで形成し続け、少なくとも７０日間、持続する。細胞が１５〜２０日間より多く分化した場合、それらをさらに、トリプシン処理し、再びプレーティングすることができる。第２のプレーティングにおいて、島様構造は、再プレーティングから２０〜３０日後、出現する。
免疫蛍光による分析：例１のように実施した。（Ｔｒｉｔｏｎ ０．１％を含むＰＢＳ中５％ＢＳＡでブロッキング）１：１００でのヤギポリクローナル抗ヒトＰｄｘ１／ＩＰＦ１（Ｒ＆Ｄ）抗体を２時間、用いた。マウスモノクローナルＡｂ抗Ｎｋｘ６．１（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｔｕｄｙ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ ＤＳＨＢ）もまた用いた（データ図示せず）。
結果
分化プロトコールの１４日目、すなわち、レチノイン酸処理の終了から２日後において、培養細胞の約５０％がＰｄｘ１を発現する。図２Ａ〜Ｅは、いくつかの領域において、ほとんど全ての細胞がＰｄｘ１陽性であることを示している。Ｓｏｘ１７発現と比較してＰｄｘ１陽性細胞のより低い全体的パーセンテージは、分化が細胞クラスター内で起こるという事実による。図２Ｂ〜Ｅは、Ｐｄｘ１染色がＤＡＰＩ染色と共存することを示し（２Ｂ）、及びＰｄｘ１染色が核であることを示している。図２Ｆ〜Ｉは、２１日間の分化後、Ｐｄｘ１で共染色されている細胞のドメインにおいてインスリンの誘導があることを示している。
分化の２５日目から、単層は裂け、上皮蕾（すなわち、高い細胞密度の領域）は単層から盛り上がる。図３Ａ〜Ｄは、３２日後、上皮蕾は、典型的にはＰｄｘ１陽性であることを示している。最後の２０日間、培養物をニコチンアミド及びエキセンディン−４（５ｎｇ／ｍｌ）で処理した場合、単層及び蕾は、Ｐｄｘ１陽性であった（図３Ａ〜Ｂ）。プレートをニコチンアミドでのみ処理した場合、単層は、エキセンディン−４を用いた場合よりＰｄｘ１陽性が少なかった（図３Ｃ〜Ｄ）。細胞を数えることにより、５〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度におけるエキセンディン−４添加が、Ｐｄｘ１陽性細胞のパーセンテージにプラスの効果を生じることが確認された（データ図示せず）。
Ｐｄｘ１のパーセンテージにおけるさらなる増加が、７日目において培養物をトリプシン処理し、解離した細胞を、新しいゼラチンコーティングプレート上に再プレーティングすることにより、達成された（図４Ａ〜Ｃ）。大部分がＰｄｘ１陽性細胞を有する島は、これらの条件下で頻繁に観察された。
（例３）
インスリン産生細胞及びグルカゴン産生細胞を有する島の形成
材料及び方法
例１及び２と同様に得られた培養物を、（例２のステップＩＩＩに詳述されているような）ＩＴＳ培地中、さらに培養し、希釈１：２００におけるＣ−ペプチドに対するポリクローナルウサギ抗体（Ａｃｒｉｓ）又はモノクローナル抗体（ＭＡＢ１９７５、Ａｂｃａｍ）を用いて一晩、染色した。グルカゴン産生細胞を検出するために、培養物をまた、１：２００の濃度におけるグルカゴンに対するヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｎ−１７）を用いて一晩、染色した。グルコース輸送体Ｇｌｕｔ２を、１：２００の濃度で用いられたマウスモノクローナル抗Ｇｌｕｔ−２抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）で検出した。二次抗体は、１：２００で２時間の、ＤｙＬｉｇｈｔ ５４９又は４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とコンジュゲートしたロバ抗ウサギ、ロバ抗ヤギ、又はロバ抗マウスであった。
結果
細胞質における特異的Ｃ−ペプチド染色は、分化過程の３７日目に明瞭に観察された（図５Ａ〜Ｄ）。そのようなＣ−ペプチド染色は、２０〜２５日目からすでに見ることができる。図５Ａ〜Ｄに描かれた実験において、エキセンディン−４（５０ｎｇ／ｍｌ）を、１３日目から２９日目まで与え、その後、培養物をＩＴＳ培地（例２のステップＩＩＩ）中に存続させた。３７日目、多数の島様ドメインが、細胞質においてＣ−ペプチドについての強い染色を示し、それらの多くはまたＰｄｘ１陽性であった（図５Ａ〜Ｄ）。エキセンディン−４はまた、連続的に、且つさらに、より低い濃度（５ｎｇ／ｍｌ）で投与することができる。これらの条件下で、３７日目における島様構造は、よりコンパクトで、且つより良く構造化されているように見える（図６Ａ〜Ｅ）。インスリンＣ−ペプチド及びグルカゴンについての二重染色は、そのような島における細胞の約３分の１がグルカゴンを産生し（α細胞表現型）、３分の２がインスリンを産生する（β細胞表現型）ことを示している（図６Ａ〜Ｅ）。したがって、分化過程は、天然の膵臓ランゲルハンス島の構造を再生している。
Ｃ−ペプチド陽性細胞の島様ドメインは、分化の５６〜６０日目において発生し続けている（図７及び８）。Ｃ−ペプチド陽性細胞は、グルコース依存性インスリン分泌に必須のタンパク質の１つである、グルコース輸送体膜貫通タンパク質Ｇｌｕｔ−２が陽性であった（図７Ｄ）。Ｇｌｕｔ−２は膜タンパク質であり、より大きな倍率により、細胞の周辺におけるＧｌｕｔ−２染色が示されている（図７Ｆ）。分化の５６日目に、細胞は、Ｃ−ペプチドとＰｄｘ１の両方で共染色された（図７Ｇ）。
６０日目において、Ｃ−ペプチド陽性島様構造は、より凝縮した。これは、５０ｎｇ／ｍｌにおけるエキセンディン−４に関して特に明らかである（図８Ａ〜Ｆ）。Ｃ−ペプチド／グルカゴン陽性領域の数を数えることにより、５ｎｇ／ｍｌエキセンディン−４を有する試料と比較して、５０ｎｇ／ｍｌを有する培養物においてそのような領域が３倍多いことが示された（図示せず）。しかしながら、低濃度のエキセンディン−４（５ｎｇ／ｍｌ）が、少しのエキセンディン−４も含まない対照条件と比較して、６０日間の分化後、Ｃ−ペプチドが陽性である細胞の総量を増加させるのに十分であることが見出された（図９Ａ〜Ｂ）。
インスリンｍＲＮＡ濃度を半定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて調べた場合、インスリンｍＲＮＡは３６日間の培養後に（すなわち、ニコチンアミド及びＢＳＡを含むＩＴＳ培地中での培養中に）高いが、ＦｏｘＡ２ ｍＲＮＡ及びＰｄｘ１ ｍＲＮＡがより早い時点で存在することが見出された（図１０）。
（例４）
ｈＥＳ細胞分化の経過中に外から加えられたＰｄｘ１ ｍＲＮＡの効果
材料及び方法
ヒトＰｄｘ１ ｃＤＮＡを、最初のプラスミドｐｃＤＮＡ３ Ｐｄｘ１から、それぞれ、ＥｃｏＲＩ部位及びＭｓｃ１部位を含有するリバースプライマー及びフォワードプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ断片を、プラスミドＰＴＭＡ−ＧＦＰにおいてクローン化し、そのプラスミドから、Ｍｓｃ１及びＥｃｏＲ１を用いてＧＦＰ配列を切除した。ｃＤＮＡの５’ＵＴＲは、コンセンサスリボソーム侵入部位を含み、３’ＵＴＲにおいて、ｃＤＮＡの後にポリＴテールが続く。プラスミドＰＴＭＡ Ｐｄｘ１を、ポリＴテールの３’においてＳａｌ１で直線化し、ｍＲＮＡを、キットｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７（Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ）で、転写及び５’キャッピングした。デオキシリボヌクレアーゼＩ処理後、ＲＮＡを、ＲＮＡ ｅａｓｙカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で回収した。ＲＮＡ完全性を、アガロースゲル電気泳動により、並びにオリゴｄＴプライマー、及びＩＲＥＳ領域を網羅するプライマー、加えてＰｄｘ１特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲにより、モニターした。６ウェルプレート中で成長したヒトＥＳ細胞派生物に、培地Ｂ１中の１日後（段階ＩＩＡ、７日目）、３日間連続で、ＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションは、４μｇのインビトロ転写及びキャッピングされたｍＲＮＡ、並びに２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した、抗生物質を含まない１ｍｌの分化培地Ｂ１中であった。最後のトランスフェクションから２４時間後、分化の１２日目、及びより後、分化の３２日目に、分析を行った。
結果
図１１Ａ〜Ｋに示されているように、最後のトランスフェクションから１日後、ＲＡでの処理なしで（分化の１２日目）、Ｐｄｘ１は、たいていのコロニーにおいて広く発現している（図１１Ａ〜Ｋ）。対照的に、細胞をＲＡで処理せず、且つそれらに対照をトランスフェクトした場合、Ｐｄｘ１陽性領域はまれであり、各領域に細胞がほとんど存在していない（図１２Ａ〜Ｄ）。
トランスフェクションから１２日後、細胞を分析した場合、Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡをトランスフェクトされた細胞の大きなドメインがＰｄｘ１陽性として示された（図１１Ｆ〜Ｋ）。Ｐｄｘ−１陽性領域内において、Ｃ−ペプチド陽性細胞のいくつかのドメインがあった（図１１Ｈ及びＫ）。対照的に、ＲＡで処理されず、対照をトランスフェクトされた細胞は、Ｃ−ペプチド陽性細胞の領域に対応するＰｄｘ１陽性細胞のドメインを示さず、これらのトランスフェクトされていない細胞においてＰｄｘ１シグナルは非常に弱い。図１１Ｌ〜Ｑにより、予想された通り、Ｐｄｘ１染色が核であり、Ｃ−ペプチド染色が細胞質であり、共染色が、Ｃ−ペプチド細胞の大部分がＰｄｘ１陽性であることを示すことが、示されている。
図１３Ａは、外から加えられたＰｄｘ１ ｍＲＮＡが、Ｃ−ペプチド染色によって測定されるようなインスリン産生細胞になるＰｄｘ１陽性細胞のパーセントを著しく増加させることを示している。図１３Ｂは、Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクションが、Ｐｄｘ−１陽性細胞のうちのＣ−ペプチド陽性細胞の比率だけでなく、全細胞（ＤＡＰＩ染色）のうちのＣ−ペプチド陽性細胞の比率も増加させることを示している。
図１４Ａ〜Ｈは、Ｐｄｘ１ ｍＲＮＡトランスフェクション後、２つの型のＰｄｘ１陽性細胞を同定し得ることを示している。大きい陽性Ｐｄｘ１の核を有する細胞は、Ｃ−ペプチド抗体によって非常に弱く染色され、それはおそらく、前駆体を表している（図１４Ａ〜Ｄ）。他の領域において、Ｐｄｘ１染色は、Ｃ−ペプチドについて強く共染色された、限定された小さく且つコンパクトな核である。これらの細胞は、おそらく、より成熟したインスリン産生細胞を表している。トランスフェクションから２１日後に細胞に存在するＰｄｘ１タンパク質は、おそらく、内因性遺伝子の活性化から生じている。
ＤＮＡプラスミドを用いる代わりにｍＲＮＡをそれらにトランスフェクトすることによって、長期間にわたって胚性幹細胞派生物の運命に影響を及ぼすことが可能であることをこれは実証している。
（例５）
ヒトＥＳ細胞の分化及びＥｐＣＡＭ＋集団の単離
材料及び方法
ヒトＥＳ細胞の成長：例１に記載された通り。
ヒトＥＳ細胞の最初の分化：例１に記載されているように３ステップのプロトコールを用いて、細胞を最初に胚体内胚葉へ分化させた。これらのステップのそれぞれの必須の特徴は、図１５（ステップ１〜３）に記載されている。さらなる分化を、例２のステップＩＩＡ、ＩＩＢ、及びＩＩＩに記載されているように行った。これらのステップのそれぞれの必須の特徴は、図１５（ステップ４〜６）に記載されている。
ヒトＥＳ細胞のさらなる分化−図１５のステップ７及び８：
ステップ７：２０日目、例２のステップＩＩＩに用いられた培地を、グルコース濃度を５．５ｍＭに調整するように改変した（本明細書ではＤＭ７と呼ぶ）。磁気細胞ソーティング（ＭＡＣＳ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によるＥｐＣＡＭ＋細胞の単離について、１０ｃｍ直径のプレートをＰＢＳ−／−（Ｃａ＋＋なし、Ｍｇ＋＋なし）で洗浄した。その後、細胞を、３７℃、１０分間のＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｔｅｍｐｒｏ、２．５ｍｌ／１０ｃｍプレート）での処理及び上げ下げのピペッティングにより、解離させた。細胞をＤＭ７中に収集し、アリコートをＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）において数えた。細胞を、１，５００ｒｐｍ（３５０ｘｇ）で５分間、遠心分離し、ＭＡＣＳ緩衝液（０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ−／−）中に、５千万個の細胞に対して０．３ｍｌを用いて再懸濁した。抗ＥｐＣＡＭ抗体にコンジュゲートした磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ−ＣＤ３２６多能性幹細胞マイクロビーズ）を加えた（５千万個の細胞に対して０．１ｍｌのビーズ）。４℃で３０分後、細胞を、５０ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液中で１回、洗浄し、遠心分離し、最後に、０．５ｍｌ ＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した（最高で１０８個の細胞）。細胞懸濁液を、（あらかじめＭＡＣＳ緩衝液で洗浄された）ＭＡＣＳカラムにアプライし、ＭＡＣＳ分離器の磁場に置き、フロースルー細胞画分を収集した。３ｍｌの４回の洗浄後、カラムを分離器から取り外し、保持された細胞画分を収集した。４℃で５分間の３５０ｘｇでの遠心分離後、ペレットを３ｍｌのＤＭ７又はＰＢＳ中に再懸濁した。
上記の手順を改変して、細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅでの解離後、ＤＭ８、すなわち、１０μＭ ＲＯＣＫ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｙ０５０３）及び１μｇ／ｍｌラミニン（ヒト、胎盤由来、Ｓｉｇｍａ ＃６２７４）を補充したＤＭ７中に収集した。デオキシリボヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ４５２７）、２０μｇ／ｍｌでの処理を加えて、ＥｐＣＡＭ−ＭＡＣＳ分画前に細胞解離を完了した。
ステップ８：（上記のように）ＥｐＣＡＭ＋細胞を単離した後、細胞を、３５０ｘｇで５分間、遠心分離し、１ｍｌのＤＭ７又はＤＭ８培地あたり１０６個の細胞において再懸濁し、最後に、Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｂｉｎｄｉｎｇプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃ｃｃ−３４７１）に播種した。再播種された培養物を、インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）へ２〜６日間、戻した。顕微鏡観察により、細胞のクラスターへの再凝集の可視化が可能になった（図１６）。再凝集期間の終わりに、プレートを緩やかな渦運動に供し、細胞凝集物を、両眼顕微鏡下で吸引し、分析のためにアリコートに分けた。
事前ソート培養物のアリコート、及びＥｐＣＡＭ−ＭＡＣＳ分離画分のアリコート（ステップ７から）、加えて再凝集したクラスターのアリコート（ステップ８）を分析した。Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒを用いて、細胞の数を数えた。３５０ｘｇで５分間の遠心分離後、細胞ペレットをＭ−ＰＥＲ（哺乳類タンパク質抽出試薬、Ｐｉｅｒｃｅ）中に、典型的には、２百万個の細胞に対して０．１ｍｌのＭ−ＰＥＲを用いて、溶解し、ヒトインスリンＣ−ペプチドの含有量を、ＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｓａｌｈ、Ｓｗｅｄｅｎ、超高感度ｃ−ペプチドキット（最小検出５ｐＭ）又はＭｅｒｃｏｄｉａ ｃ−ペプチド ＥＬＩＳＡ（最小検出９０ｐＭ））を用いて測定した。Ｍ−ＰＥＲ中の試料をキット緩衝液中に３倍又はそれ以上、希釈し、２０μｌの１／３希釈液をアッセイした。結果は、（Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイにより測定された場合）１ｍｇの総タンパク質あたり、及び（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒにおいて数えられた）百万個の細胞あたりで表された。他の細胞ペレットを、ＲＮＡ抽出のために、百万個の細胞あたり０．７ｍｌの緩衝液RＬＴ（ＲＮＡｅａｓｙ、Ｑｉａｇｅｎ）中に懸濁した。ヒトインスリンｍＲＮＡを、参照としてＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）遺伝子を用いるＲＴ−ｑＰＣＲ（Ｔａｑ−Ｍａｎ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ）により定量化した。同じように、細胞をラバーポリスマンで掻爬した後、タンパク質及びＲＮＡを全プレートから抽出した。
結果
図１７は、全培養物のインスリンＣ−ペプチド含有量が、１４日後から始まって増加し、２３日目頃にプラトーに達したことを示している。ＥｐＣＡＭ陽性細胞におけるｃ−ペプチド含有量のピークは、分化の２３日目頃であった。この時点で、培養物を、フルオレセインコンジュゲート化抗ＥｐＣＡＭ抗体（図１８Ａ）及びフィコエリトリンコンジュゲート化抗Ｃ−ペプチド抗体（図１８Ｂ）で免疫染色した。インスリンＣ−ペプチドを発現する細胞クラスターと重複して、多数のＥｐＣＡＭ陽性（ＥｐＣＡＭ＋）構造が見られた（図１８Ｃ、３Ｃ）。これらのＥｐＣＡＭ＋細胞クラスターはまた、グルカゴン陽性細胞（図１８Ｄの赤色）を含有した。下記の表１は、保持されたＥｐＣＡＭ＋画分におけるインスリンＣ−ペプチド含有細胞の濃縮の程度、及びフロースルー（ＥｐＣＡＭ−）画分における同時的欠乏を示している。
ＥｐＣＡＭ＋画分は、一貫して、回収された総インスリンＣ−ペプチドの約７０％を含有し（表１）、そのことは、インスリンを発現する細胞の大部分がＥｐＣＡＭ陽性であったことを示している。解離した培養物全体においてＦＡＣＳ分析により決定された場合、ＥｐＣＡＭ＋細胞のパーセンテージは、２〜１０％の範囲であり、ＥｐＣＡＭ−ＭＡＣＳ上に保持された画分において回収された細胞の割合が、類似した範囲であった（表１）。ＦＡＣＳ分析によって分析された場合、フロースルーにおけるＥｐＣＡＭ陽性細胞のパーセントは、保持された画分における約５０％に対して、通常、０．２〜０．４％であった。
ＥｐＣＡＭ＋画分におけるインスリン産生細胞の濃縮を、ｑＰＣＲによるインスリンｍＲＮＡ含有量の測定によって確認した。表１の実験２において、２３日目、ヒトインスリンｍＲＮＡの参照ＴＢＰ ｍＲＮＡに対する比率は、ＥｐＣＡＭ＋画分における２．２３に対して培養物全体において０．５９であった。対照的に、ＥｐＣＡＭマイナス画分において、インスリンのＴＢＰに対する比率は０．０１２７であり、それは、インスリンｍＲＮＡを発現する細胞の９９．４％より多くがＥｐＣＡＭ＋画分中であったことの確認を可能にしている。
下記の表２に示されているように、ＥｐＣＡＭ＋細胞の再凝集後、インスリンＣ−ペプチドの含有量は、解離したＥｐＣＡＭ＋細胞においてより高かった。

これは、インスリン産生細胞の優先的な再凝集による可能性が最も高い。ＥｐＣＡＭ−ＭＡＣＳ後、保持された画分（ＥｐＣＡＭ＋）は不均一な集団であり、それは、ＦＡＣＳ分析により、平均して、保持された細胞の約５０％のみが、高度にＥｐＣＡＭ陽性であることを示したからである。再凝集後、細胞の約２０〜３０％が、図１６Ａ〜Ｃに示されているもののような２０〜１００ミクロンのクラスター内に見出された。したがって、再凝集は選択的であり、再凝集したクラスター内のＣ−ペプチドのより高い含有量が、インスリン産生細胞が再凝集ステップ中に濃縮されることを示している。
培養物全体と比較して、ＥｐＣＡＭ−ＭＡＣＳ及び再凝集手順の組合せは、その手順が１７〜２０日目に行われた場合、インスリンＣ−ペプチド含有量（ｎｇ／ｍｇタンパク質）に関して２０倍を超える濃縮を生じた（表２、実験１及び２）。精製は、より後の時点で減少する傾向にあった（表２、実験３、２４日目）。特に、カルシウム依存性細胞−細胞相互作用がＥＤＴＡの添加によって阻害された場合、Ｃ−ペプチド含有量のさらなる増加があった（表２、実験３、及び例６参照）。
（例６）
ヒトインスリンｍＲＮＡ及びＣ−ペプチドを発現するｈＥＳ細胞由来ＥｐＣＡＭ＋細胞の選択的再凝集による精製
ＥｐＣＡＭ−ＭＡＣＳソーティング及びＥｐＣＡＭ＋細胞画分の再凝集の組合せによって生じたインスリン産生細胞の精製を、インスリンｍＲＮＡの定量的測定によってさらに評価した。
材料及び方法
ｈＥＳ細胞の膵臓系統への分化：例５及び図１５のステップ１〜８に詳述されているように、ｈＥＳ細胞培養物を分化させ、異なるステップで抽出されたＲＮＡをＲＴ−ｑＰＣＲに供した。下記の表３は、インスリンｍＲＮＡの参照遺伝子ＴＢＰ（ＴＡＴＡ結合タンパク質）に対する比率を示している。
インスリンｍＲＮＡのレベルは、事前ソートされた細胞集団と比較して、再凝集されたクラスターにおいて約２０倍増加した。再凝集ステップ中にＥＤＴＡが加えられた場合、濃縮は増加した。表３はまた、再凝集ステップの終了と一致した日において、並行培養物から抽出されたＥｐＣＡＭ＋細胞が、再凝集したクラスターより低いインスリンｍＲＮＡを有したことを示しており、濃縮が、培養のより長い時間のせいではなかったことを示している。
再凝集したクラスター内の細胞数を、Ａｃｃｕｔａｓｅでの再解離後にＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒにおいて決定した（例５参照）。百万個の生細胞あたりのＣ−ペプチド含有量は、インスリンｍＲＮＡのレベルと類似した濃縮を示している（表３）。
（例７）
β細胞、α細胞、及びδ細胞を含有する島様構造へのＥｐＣＡＭ単細胞の再凝集
材料及び方法
ヒトＥＳ細胞を、図１５（ステップ１〜７）に概略を示されているような分化プロトコールに供した。したがって、分化の２０日目、培養物をＡｃｃｕｔａｓｅ処理によって解離させ、（図１５のステップ７と同様に）ＥｐＣＡＭ＋細胞をＥｐＣＡＭ−ＭＡＣＳによって精製した。（例１のステップ８と同様に）ＥｐＣＡＭ＋単細胞の懸濁液を、４日間、再凝集させた。再凝集したクラスターをＰＦＡ中に固定し、洗浄し、３０％スクロースと平衡化し、最後に、光学的切断温度コンパウンド（ｏｐｔｉｃａｌ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（ＯＣＴ）に包埋した。蛍光免疫染色を、１２ｍｍ厚さの凍結切片上で行った。スライスを、Ｃ−ペプチド、グルカゴン、及びソマトスタチンについて染色し、加えてＤＡＰＩで染色した。
結果
図１９は、精製されたクラスターが島様形態を有し、異なる島特異的ホルモンを産生する細胞を含有したことを示している。大部分の細胞は、インスリンＣ−ペプチドについて染色されるが（図１９Ｂ、１９Ｄ）、その細胞のかなりの割合は、グルカゴンについて染色され（図１９Ａ）、少数の細胞がソマトスタチンについて染色された（図１９Ｃ）。接着培養において、２０日目、ＥｐＣＡＭ染色領域（図１８参照）がグルカゴン染色細胞を含有すること、及びＥｐＣＡＭ−ＭＡＣＳ後の解離したＥｐＣＡＭ＋細胞もまたグルカゴンについて染色された解離細胞を含有することが示されたため、再凝集中、グルカゴン産生α細胞、加えてソマトスタチン産生δ細胞と共に、インスリン産生β細胞が自発的に集合して島様構造を形成していると結論づけることができる。
ＥＤＴＡの存在下での選択的再凝集は、インスリンｍＲＮＡ及びＣ−ペプチド含有量のより高い濃縮を生じる（例６参照）。包埋、スライス、及び染色後、１ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で得られた島様構造（図２０Ｂ）は、ＥＤＴＡの非存在下において（図２０Ａ）よりも小さく、そのサイズ範囲は５０〜１００ミクロンである（図２０Ｂ）。ＥＤＴＡの非存在下において、ＤＡＰＩによる核染色により、より大きい細胞のクラスターがあることが示され、細胞凝集が、ＥＤＴＡの存在下においてより、不均一であることを示唆している（図２０Ａ、２０Ｂ）。ＥｐＣＡＭについての染色により、ＥＤＴＡなしで再凝集したクラスター内の多くのＥｐＣＡＭ陰性細胞が示されるが（図２０Ａ、Ｃ）、ＥＤＴＡを用いて得られたクラスター内にそのような細胞はほとんどなかった（図２０Ｂ、Ｄ）。ＥｐＣＡＭによって媒介される細胞−細胞相互作用はカルシウム非依存性であるため、ＥＤＴＡの存在下において、再凝集は多くのＥｐＣＡＭ陰性細胞を排除し、その結果として、より選択的な再凝集、及び本物の島細胞のより良い精製を生じる可能性が高い。
図１５と同様に分化させたｈＥＳ細胞由来クラスターの解離、続いて、ＥｐＣＡＭ−ＭＡＣＳソーティング、及びカルシウム非依存性細胞−細胞相互作用に有利に働く条件下での保持された細胞の再凝集が、高度に精製された膵島様構造（光学顕微鏡法下で均一な収集物として見える（図２１））を得るための効果的な方法である。
（例８）
血清代替物（血清の代わり）及びノギン（レチノイン酸処理中）での分化、続いてＥｐＣａｍ精製及び再凝集：インスリンｍＲＮＡ及びＣ−ペプチド含有量の相乗的増加。
分化手順のステップ２及び３（図１５）におけるウシ胎仔血清（ＦＣＳ）の添加は、ｈＥＳ細胞コロニーのゼラチンコーティングプレートへの付着を促進するのに有用であるが、アクチビンＡ処理の効力を阻害する。実際、これらのステップでのＦＣＳの省略は、分化の終了時点においてインスリンｍＲＮＡ及びＣ−ペプチドのレベルの増加を生じたが、培養物の生存率は低下した（図示せず）。ＦＣＳの代わりの血清代替物の使用は、細胞生存率及びインスリン収量の増加を可能にした。
材料及び方法
ヒトＥＳ細胞を、図２２に示されたスキームに従って分化させた。例５に詳述された手順において２つの改変がなされた。したがって、ステップ２及び３において、ウシ胎仔血清を、同じ濃度（すなわち、ステップ２における２％、ステップ３における０．２％）での血清代替物（ＫＯＳＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に置き換えた。加えて、ステップ５において、ノギン（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ）を１００ｎｇ／ｍｌで加えた。ＥｐＣＡＭ−ＭＡＣＳ分画を、例５と同様に行った。
その後、解離したＥｐＣＡＭ＋細胞を、ＥＤＴＡの存在下で再凝集させた（ステップ８、例６参照）。その後、その凝集物を、５０ｘｇで５分間の遠心分離によって収集し、その遠心分離は、再凝集していない単細胞からの分離を可能にする。
アルギネートゲルにおけるＥｐＣａｍ陽性細胞の再凝集：ＥｐＣａｍ陽性細胞を、アルギネートゲル（Ａｌｇｉｍａｔｒｉｘ ３Ｄ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の細孔の内側に再凝集させた。多孔性Ａｌｇｉｍａｔｒｉｘゲルは、１０％固定緩衝液の存在下で形成される。１９日目、ＥｐＣＡＭ＋細胞を、０．５ｍｌの培地中２４ウェルプレートのウェルあたり２×１０６個の細胞で、５．５ｍＭグルコースを含む培地ＤＭ８に播種し、１００ｘｇで４分間、遠心分離した。
グルコース応答性の試験：１９＋４日目、培地を、ペニシリン ストレプトマイシン、ｇｌｕｔａｍａｘ、０．２％ＢＳＡ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｔ ＨａＥｍｅｋ Ｉｓｒａｅｌ）、及び２．８ｍＭグルコースを含むＲＰＭＩ １６４０（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ｂｅｔ Ｈａ Ｅｍｅｋ Ｉｓｒａｅｌ）に交換した。この培地中、細胞を１時間インキュベートし、その後、培地を除去し、同じ組成の培地を２時間、適用した。この時点の後、３連のウェルを、５．５ｍＭグルコース、２７ｍＭグルコース、又は３０ｍＭ ＫＣｌと共に２７ｍＭグルコースを含む同じ培地中でインキュベートした。２時間のインキュベーション後の上清を、培地中に放出されたインスリン濃度についてＥＬＩＳＡによって試験した。
結果
両方の改変が適用された場合、各変化単独と比較して、Ｃ−ペプチド及びインスリンｍＲＮＡのレベルの相乗的増加が観察された（表４及び５）。
ステップ２〜３におけるＫＯＳＲとステップ５におけるノギンの組み合わせた使用により、Ｃ−ペプチドとインスリンｍＲＮＡの両方について最も高い値が生じた（それぞれ、表４及び５）。

２０〜２３日目での培養物全体におけるＥｐＣＡＭ＋細胞のパーセンテージのＦＡＣＳによる分析により、（ＫＯＳＲ及びノギンを用いる）改変プロトコールが用いられた場合、標準プロトコールと比較して、約２分の１の低下が示された。インスリン収量の向上は、多くの非関連細胞を排除する、ＥｐＣＡＭ−ＭＡＣＳステップでの膵臓内分泌細胞のより優れた選択（選択的再凝集によって完成される選択）に関係している可能性が高い。
機能性β細胞は、血中グルコースレベルの増加に応答してインスリンを分泌する。本細胞は、培地中のグルコース濃度の増加に応答してインスリンを放出する（図２３）。インスリン放出が、グルコース濃度を２．８ｍＭから２７ｍＭへ増加させることによって２．５倍増加し、一方、それは、グルコースを５．５ｍＭへ増加させることによって５０％だけ増加することを、図２３に見ることができる（図２３Ａ）。ＥＤＴＡでの処理によってＡｌｇｉｍａｔｒｉｘゲルから単離された凝集物の形態が図２３Ｂに示されている。凝集物の大部分は、５０〜１００ｍＭの直径の範囲にあり、ほんの少数だけが２００ｍＭ以上の直径である。
注目すべきことには、アルギネートバイオスキャフォールドにおけるインスリンＣ−ペプチドの含有量（ｎｇ／ｍｇタンパク質）は、ＥｐＣＡＭ＋細胞が超低結合性プレート内に懸濁状態で再凝集した並行培養物において観察されたものと同じであった。
（例９）
ストレプトゾトシン（ｓｔｚ）誘導化糖尿病ｓｃｉｄ−ｂｇマウスにおけるヒトＥＳ細胞の治療効果の評価
材料及び方法
研究開始時点で７〜８週齢のＳＣＩＤ−ｂｇ雄マウスを、１８０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、６ｍｌ／ｋｇの体積用量での細胞毒ＳＴＺの単回の腹腔内（ＩＰ）注射に供した。＞２５０ｍｇ／１日目の血中グルコースレベルを示した動物だけを、（図１５に概略を示されているような分化プロトコールに従って処理された）３×１０６個のヒトＥＳ細胞の移入に供した。単回の移入を、左腎臓被膜の下に向けて行った。対照マウス群に偽注射した。
空腹時ではない血中グルコースレベルを、ＳＴＺ注射前に１回、移入前に１回、その後、研究の終わりまで週に２回、決定した。Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒを用いて、それぞれの日のほぼ同じ時間に測定を行った。血液試料を、尾静脈から採取した。
グルコース負荷試験（ＧＴＴ）を、２ｇ／ｋｇの用量レベルでの５０％デキストロースのＩＰ注射又は経口胃管栄養法（ＰＯ）投与により、約１６時間の絶食後、実施した。血中グルコースレベルを、以下の時点で、Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒを用いて尾静脈を介して全マウスにおいて決定した：デキストロース投与前、デキストロース投与から１０分後、３０分後、４５分後、６０分後、９０分後、及び１２０分後。
血液試料を、ＧＴＴ試験後（すなわち、デキストロース投与から約３時間後）、収集した。血液試料を、尾静脈から、又は後眼窩静脈洞出血により得た。グルコースレベルについて毎週収集された全血試料（合計２試料）を、２０〜２５μｌ／試料を超えない体積に限定し、ＧＴＴ及びＣ−ペプチド測定について、全血液循環体積の１０％を超えない体積に限定した。ＩＰ ＧＴＴ後のＣ−ペプチド測定値を、デキストロース投与から９０分後、収集した。最後のＩＰ ＧＴＴから１週間後、動物を安楽死させ、腎摘出術を施した。
腎臓を切除し、パラフィンブロックに包埋し、又は後の組織学的分析のために凍結した。
本発明は、その具体的な実施形態に関連して記載されているが、多くの代案、改変、及びバリエーションが当業者に明らかであろうことは明白である。したがって、添付された特許請求の範囲の精神及び幅広い範囲内に入るそのような代案、改変、及びバリエーションを全て包含することが意図される。
本明細書で言及された全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が、具体的且つ個々に示されて、参照により本明細書に組み入れられている場合と同じ程度で、本明細書に参照により全体として組み入れられている。加えて、本出願における任意の参考文献の引用又は同定は、そのような参考文献が、本発明の先行技術として有効であるという承認として解釈されるべきではない。セクション見出しが用いられる範囲で、それらは、必ずしも限定するものとして解釈されるべきではない。

Claims (19)

  1. ヒト多能性幹細胞からヒト島細胞又はヒト島前駆細胞を作製し、インスリン産生細胞を選択する方法であって、
    （ａ）ヒト多能性幹細胞を内胚葉細胞へ分化させるためにグルコースを含む分化培地においてヒト多能性幹細胞を５〜８日の期間培養するステップと、
    （ｂ）前記内胚葉細胞を得た後、Ｐｄｘ−１陽性細胞を生じさせるために、
    少なくとも１つの成長因子、フォルスコリン、及びレチノイン酸（ＲＡ）及びグルコースを含む培地において前記内胚葉細胞を２〜１０日の期間培養するステップであって、
    前記少なくとも１つの成長因子がＦＧＦ１０、ｂＦＧＦ、及びＦＧＦ７からなる群から選択される上記ステップと、
    （ｃ）グルコース；そして
    ニコチンアミド、ＧＬＰ−１、及びエキセンディン４からなる群から選択されるすくなくとも１つの成熟因子
    を含む培地において前記Ｐｄｘ−１陽性細胞を培養し、それにより、多能性幹細胞から島細胞又は島前駆細胞を作製するステップであって、
    ヒト島細胞又はヒト島前駆細胞の作製が、胚様体の生成なしに実施される上記ステップと、
    （ｄ）前記島細胞又は島前駆細胞を分散させて、分散したヒト島細胞を又は分散したヒト島前駆細胞生じさせるステップと、
    （ｅ）前記島細胞又は島前駆細胞を、ＥｐＣＡＭに結合する作用物質と接触させるステップと、
    （ｆ）前記作用物質に結合する細胞を選択して、インスリンを産生するヒト島細胞又はヒト島前駆細胞を作製するステップと、そして
    （ｇ）インスリンを産生する前記分散したヒト島細胞を又は分散したヒト島前駆細胞を再凝集させるステップと
    を含む上記方法。
  2. 前記分化培地がアクチビンＡを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記分化培地が血清又は血清代替代用物を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記分化培地が血清を欠く、請求項２に記載の方法。
  5. ステップ（ｂ）の前記培地がノギンをさらに含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記分化培地がＷｎｔ３をさらに含む、請求項２に記載の方法。
  7. 前記多能性幹細胞を培養するステップが、多能性幹細胞のコラゲナーゼ脱離クラスターをゼラチンコーティング表面上で培養することにより実施される、請求項１に記載の方法。
  8. 多能性幹細胞がヒト誘導多能性（ｉＰＰ）細胞を含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記再凝集させるステップが、
    ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、シトレート、及びホスフェートからなる群から選択される、カルシウムをキレート化する作用物質の存在下で実施される、
    請求項１に記載の方法。
  10. 前記分散した島細胞をスキャフォールド上に播種するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  11. 前記再凝集させるステップが、ステップ（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に用いられるものより少ないグルコースを含む培地において実施される、請求項１に記載の方法。
  12. 前記培地のそれぞれのグルコース濃度が５ｍＭ〜１００ｍＭの間である、請求項１に記載の方法。
  13. 前記島細胞がグルコース応答性であり、そしてインスリン、グルカゴン又はソマトスタチンを合成する、請求項１に記載の方法。
  14. 前記内胚葉細胞がＳｏｘ１７及びＦｏｘＡ２の発現によって特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
  15. 前記内胚葉細胞がＯｃｔ４を発現しない、請求項１に記載の方法。
  16. ステップ（ａ）又は（ｂ）が約５日間実施される、請求項１に記載の方法。
  17. ステップ（ｃ）の成熟因子が、ニコチンアミド、エキセンディン４又はその組み合わせである、請求項１に記載の方法。
  18. 糖尿病の治療用医薬の製造における、請求項１〜１７に記載の方法に従って作製される島細胞の集団の使用。
  19. ヒト島細胞又はヒト島前駆細胞を作製するために、内胚葉細胞からＰｄｘ−１陽性細胞を作製する方法であって、
    前記内胚葉細胞を２〜１０日の期間、
    ＦＧＦ１０、ｂＦＧＦ、及びＦＧＦ７からなる群から選択される少なくとも１つの成長因子；フォルスコリン；レチノイン酸（ＲＡ）及びグルコースを含む培地において前記内胚葉細胞を培養するステップを含む、
    上記方法。
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