CN103210082A - 扩增胰岛β细胞和使其再分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了离体提高表达SLUG的祖细胞中的胰岛素含量的方法。该方法包括使祖细胞中的SLUG的量或活性下调。还提供了从而生成的细胞的群体和其用途。

Description

扩增胰岛β细胞和使其再分化的方法

发明领域和背景

I型糖尿病是由于胰岛产胰岛素β细胞的自身免疫破坏所导致的。因为难以调整最佳胰岛素剂量，胰岛素施用不能阻止该疾病的长期并发症。用经调控的产胰岛素细胞替换损伤的细胞被认为是1型糖尿病的终极疗法。胰腺移植已获成功，但受供体缺乏的严重限制。随着新型胰岛分离和免疫抑制方法的发展，已报道了每个接受者利用来自2-3个供体的胰岛的显著成功(Shapiro AM，Lakey JR，Ryan EA等人.New Engl J Med2000；343：230-238)。该进展强调了开发人类胰腺供体的替代形式的迫切需要，即用于移植的培养的人类β细胞的丰富来源。

终末分化的、有丝分裂期后的胰岛细胞难以在组织培养中扩增(expand)。将成体的和胎儿的人类胰岛细胞培养于含11mM葡萄糖并补充有10％FBS和肝细胞生长因子的RPMI 1640培养基中的HTB-9基质上，其表现以最多10-15次群体倍增增殖，之后经历衰老。利用逆转录病毒将人类端粒酶(hTERT)的催化亚基导入到细胞中，其表达不能延长复制时间跨度(Halvorsen TL，Beattie GM，Lopez AD，Hayek A，Levine F.JEndocrinol 2000；166：103-109)。由于大量的细胞死亡，该方法导致胰岛细胞团块的3-4次扩增。

通过延长的培养进行β细胞扩增的过程伴有细胞的去分化。

在许多情况下，细胞的去分化伴有表型的重大改变，其中其形态从含大量细胞-细胞连接和细胞角蛋白纤维网络的上皮细胞的形态变为具有成纤维细胞或间充质外观的细胞的形态。该去分化的过程称作上皮细胞-间充质细胞转变(EMT)，并认为其部分地受锌指转录因子Snail的诱导介导。

Slug，是Snail家族成员，已参与皮肤创伤的再上皮化和损伤后受损的骨骼肌的再生。在胰腺干细胞的领域中，Gershengorn等人[Science，2004，306，2261-2264]，提出了培养的原代β细胞能够EMT和去分化为成纤维细胞样(fibroblastoid-like)的细胞类型。Gershengorn提出了该过程可被逆转，且这些成纤维细胞样细胞随后可通过所谓的间充质细胞-上皮细胞转变再分化为胰腺内分泌细胞。该文章发表后，Gershongorn收回了该说法并表明，经历分化的是存在于胰岛中的间充质干细胞而非去分化的β细胞[Davani等人，Stem cells，卷25，第12期，3215-3222页，2007]。

有丝分裂后的β细胞的被迫扩增的替代方式是诱导具有天然的自我扩增能力的干细胞/祖细胞分化成产胰岛素细胞。胚胎干细胞的定向分化已生成了与β细胞相比较仅产生少量胰岛素的细胞，且其在移植中的潜在用途遭遇伦理上的反对、以及有关畸胎瘤的风险的担心。

还已将成体干细胞分化为产胰岛素细胞。然而，这些细胞类型在组织培养中的扩增效率和其分化为产胰岛素细胞的比率需要极大地提高以允许用于移植的大量细胞数目的产生。

已清楚地证明，利用激活发育事件的级联反应的主要基因(dominantgene)可至少部分地使定型细胞重编程。本发明人的美国专利申请第20050244966号教导了通过导向内分泌胰腺发育的主要转录因子诸如Pdx1的表达，胎儿肝细胞重编程为β样产胰岛素细胞。诱导人类胎儿肝细胞大量地产生并贮存成熟的胰岛素，其中约三分之一由正常β细胞产生，响应于生理葡萄糖水平而释放，并在STZ-糖尿病非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷(NOD-scid)小鼠中替代β-细胞功能。该修饰的细胞表达多种β-细胞基因。

已在表皮生长因子和神经生长因子的存在下离体(ex vivo)扩增了胰岛细胞。虽然这些细胞表现了高胰岛素含量，但它们不响应于葡萄糖分泌胰岛素(Lechner A.等人，Biochem Biophys Res Commun327：581-588，2005)。

国际申请WO2006/054305教导了在CMRL-1066培养基中扩增胰岛细胞。

已显示大量的因子促进组织培养中的β-细胞增殖和分化二者。生长激素家族成员，包括胎盘催乳激素(PL)、生长激素(GH)和促乳素(PRL)，在新生大鼠胰岛细胞中诱导复制。已观察到肝细胞生长因子(HGF)对人类胎儿和成体胰岛以及小鼠胰岛的显著的促分裂效应。在激活素A或烟酰胺存在下，已显示HGF在培养的胎儿胰岛中以及胰腺细胞系中刺激β-细胞分化。已显示胰高血糖素样肽1(GLP-1)和其更稳定的类似物exendin-4在胰腺细胞系中刺激β-细胞增殖和诱导胰岛素基因表达。还已显示表皮生长因子(EGF)家族成员，包括EGF、TGFα和β细胞素(betacellulin)，刺激β-细胞增殖和分化。β细胞素对于包括胰岛β(β)细胞的多种细胞类型是有效的有丝分裂原。显示其可在阿脲和STZ处理的小鼠中增加胰岛素新生，并在90％胰腺切除术的大鼠中加速胰岛素再生[Li L，等人，Endocrinology 2001；142：5379-5385]。

Rukstalis等人[Endocrinology 147(6)2997-3006]教导了转录因子Snail在永生化的胰腺内分泌细胞系中调节激素表达。而且，公开了，在那些细胞系中利用siRNA使Snail下调提高了胰岛素基因表达。

美国专利申请第20060292127号教导了通过将细胞与调控转录因子Snail/slug/slit家族的剂相接触使β细胞去分化而不是再分化。

国际申请WO2006/054305教导了在含β细胞素和/或ngn-3的培养基中的扩增的β细胞的再分化。

发明概述

根据本发明的一些实施方案的方面，提供了离体提高成体胰岛β细胞中胰岛素含量的方法，该方法包括将成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺、exendin-4、激活素A和葡萄糖的培养基，该培养基不含血清，从而提高成体胰岛β细胞中的胰岛素含量。

离体提高表达SLUG的祖细胞中胰岛素含量的方法，所述方法包括使所述祖细胞中的所述SLUG的量或活性下调，从而提高所述祖细胞中的胰岛素含量。

根据本发明的一些实施方案的方面，提供了细胞的分离的群体(isolated population of cells)，其包含下调SLUG的siRNA，其中所述细胞分泌胰岛素。

根据本发明的一些实施方案的方面，提供了根据本发明的方法生成的细胞的分离的群体。

根据本发明的一些实施方案的方面，提供了在受治疗者中治疗糖尿病的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的成体胰岛β细胞的群体移植到受治疗者中，从而治疗糖尿病。

根据本发明的一些实施方案的方面，提供了本发明的成体胰岛β细胞的群体在受治疗者中治疗糖尿病的应用。

包含本发明的成体胰岛β细胞的群体作为活性成分的药物组合物。

根据本发明的一些实施方案，方法包括：

(a)将成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺、exendin-4、激动素A的培养基，其中葡萄糖以10-100mM的浓度存在；和随后

(b)将成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺和exendin-4的另外的培养基，其中葡萄糖以0.5-10mM的浓度存在。

根据本发明的一些实施方案，烟酰胺以1-100mM的浓度存在。

根据本发明的一些实施方案，exendin-4以1-100nM的浓度存在。

根据本发明的一些实施方案，激动素A以1-100nM的浓度存在。

根据本发明的一些实施方案，另外的培养基不含激动素A。

根据本发明的一些实施方案，培养基不含β细胞素。

根据本发明的一些实施方案，另外的培养基不含β细胞素。

根据本发明的一些实施方案，成体胰岛β细胞包括去分化的成体胰岛β细胞。

根据本发明的一些实施方案，去分化的成体胰岛β细胞包括从β细胞生成的诱导性多能干细胞。

根据本发明的一些实施方案，去分化的成体胰岛β细胞通过培养成体胰岛β细胞至少10代而生成。

根据本发明的一些实施方案，培养在CMRL培养基中进行。

根据本发明的一些实施方案，方法还包括在步骤(a)之前扩增胰岛β细胞。

根据本发明的一些实施方案，步骤(a)进行6天。

根据本发明的一些实施方案，步骤(b)进行2天。

根据本发明的一些实施方案，方法还包括在步骤(b)之后分离成体胰岛β细胞。

根据本发明的一些实施方案，分离利用锌结合染料来进行。

根据本发明的一些实施方案，锌结合染料包括新点绿(Newport green)。

根据本发明的一些实施方案，分离利用抗NCAM抗体来进行。

根据本发明的一些实施方案，用胰酶消化成体胰岛β细胞。

根据本发明的一些实施方案，方法还包括将成体胰岛β细胞与下调SLUG的量或活性的剂接触。

根据本发明的一些实施方案，祖细胞选自由去分化的成体胰岛β细胞、间充质干细胞和从β细胞去分化的诱导性多能干细胞组成的组。

根据本发明的一些实施方案，利用针对SLUG的多核苷酸剂进行下调。

根据本发明的一些实施方案，利用抗体来进行下调。

根据本发明的一些实施方案，多核苷酸包括siRNA剂或shRNA剂。

根据本发明的一些实施方案，接触在暴露之后进行。

根据本发明的一些实施方案，去分化的成体胰岛β细胞通过培养成体胰岛β细胞至少10代而生成。

根据本发明的一些实施方案，培养在CMRL培养基中进行。

根据本发明的一些实施方案，分离的成体胰岛β细胞的群体经遗传修饰以表达药剂。

除非另外指定，否则本文所用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。虽然与本文所描述的方法和材料相似的或等效的那些方法和材料可用于本发明的实施方案的实践或试验中，以下描述了示例性的方法和/或材料。如有冲突，以本发明的说明书，包括定义为准。此外，材料、方法和例子仅为示例性的而并不意在必须限制。

附图简述

本文通过仅举例的方式参照附图和图像描述了本发明的一些实施方案。现详细地具体参照了附图，应强调的是以举例的方式显示了细节，并用于示例性地讨论本发明的实施方案的目的。在这一方面，关于附图所采用的描述使本领域技术人员清楚可以如何实践本发明的实施方案。

在附图中：

图1A-B示出了可在无外源的(xeno-free)和无血清的条件下扩增β细胞来源的细胞。A：在无外源的(XF)或含血清的CMRL 1066培养基(CMRL)中扩增的胰岛细胞在第2代的显微照片。B：对于增殖标志物Ki67的GFP-标记的β细胞来源的(BCD)细胞的免疫荧光分析。

图2示出了不同的再分化条件对胰岛素mRNA表达的影响。从两个供体扩增并在不同的再分化条件下孵育共8天，第7代的细胞中的胰岛素转录子的qPCR分析。完全再分化混合物(RC)包括：CMRL 1066培养基、25mM葡萄糖、抗生素、胰岛素、铁传递蛋白、硒(ITS)、N2补充物、B27补充物、烟酰胺(NA)、激活素A(ActA)、β细胞素(BTC)、Exendin4(EX)。

1.步骤1：第1-6天无BTC的RC

步骤2：第7-8天无BTC的RC，5.6mM葡萄糖

2.步骤1：第1-6天无BTC的RC

步骤2：第7-8天无BTC和ActA的RC，5.6mM葡萄糖

数值为平均值±SD，相对于人类RPLPO标准化。

图3示出了降低的葡萄糖水平诱导胰岛素表达，同时减少了其他激素的转录子。在RC中再分化8天，第9代的、或在RC中再分化7天、和在带有5.6mM葡萄糖的RC中在第8天时的细胞中的胰岛激素转录子的qPCR分析。数值为平均值±SD，相对于人类RPLPO标准化。INS＝胰岛素，SST＝生长激素抑制素，GCG＝胰高血糖素，PPY＝胰多肽。

图4是显现活胰岛细胞中的分化的显微照片。用在胰岛素启动子控制下表达荧光标志物DsRed2的慢病毒感染胰岛细胞培养物。通过转移到RC而在第6代时诱导分化。如通过DsRed2表达所显现的(右)，这导致了细胞群集和胰岛素启动子活性的激活。左侧是相同视野的相差图像。UTR：未处理的。

图5A-B是示出分选DsRed2表达之后再分化的效应的图。将第6-7代的扩增的细胞在RC中孵育8-11天，然后通过FACS分选。A：qPCR分析显示了再分化后胰岛素表达的上调。数值为平均值±SD，相对于人类RPLPO(大核糖体蛋白)标准化。B：分选的细胞每百万个细胞含375ng C-肽，为人类胰岛中的水平的8％。UTR：未处理的。

图6A-B示出了利用新点绿(NG)对再分化的细胞的分选。A：使第5代的胰岛细胞在RC中分化8天。利用NG对含胰岛素的细胞染色，并通过FACS分选。分选的点图显示了在P2门中分选的荧光细胞的不同群体。B：分选的细胞、未分选的分化的细胞和未处理的(UTR)细胞中胰岛素转录子的qPCR分析。数值为平均值±SD，相对于人类RPLPO标准化。

图7A-F示出了胰岛细胞分化的条件的开发，且表明分化主要代表BCD-细胞再分化。A：在SFM中孵育指定的天数的在第6代的扩增的胰岛细胞中的β细胞基因表达的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞(第0天)的平均值±SD(n＝3-4个供体)，并相对于人类RPLPO标准化。*p＜0.05；**p＜0.005。B-D：用于筛选胰岛细胞分化条件的测定。用RIP-DsRed2慢病毒感染胰岛细胞(B)，然后试验不同的分化条件。C：在第5代的扩增的细胞(UTR，未处理的细胞)中未观察到DsRed2表达，而将细胞转移到SFM或RC导致了胰岛素启动子激活，其可通过DsRed2荧光的出现在活细胞中监测。线条＝200μm。D：分化的流式细胞术定量显示，用RC处理导致了与SFM相比较再分化的细胞数目增高6倍。E：用于β细胞标记的病毒载体(vector)的示意图。F：由扩增的胰岛细胞的群体中的不同的细胞来源生成胰岛素表达细胞的预测。胰岛细胞的初始培养物由约一半的产胰岛素β细胞(紫色实心圆)和一半非β细胞(空心圆)组成。β细胞的标记效率为约50％(绿色实心圆)。扩增去分化的胰岛细胞且然后在SFM或RC中分化，并定量C-肽⁺细胞中eGFP⁺细胞的百分比。考虑到eGFP标记效率，预计BCD细胞的再分化导致～50％共染色。来自非BCD细胞的胰岛素表达细胞的从头分化应导致无共染色，而两种机制的出现将导致低百分比的共染色的细胞。共染色定量显示，BCD细胞的再分化是在两种条件下生成的胰岛素表达细胞的主要来源。百分比指示从第4-6代的扩增的胰岛细胞再分化的C-肽⁺细胞中eGFP⁺细胞的比例(基于3个供体的每个中计数＞400个细胞)。显示了代表性的显微照片。用DAPI将DNA染为蓝色。线条＝10μm。

图8A-E示出了通过可溶性因子诱导的BCD细胞的再分化。A、B：用RC处理的第5代的胰岛细胞中的β细胞基因的诱导的动力学。A：qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞(第0天)的平均值±SE(n＝3-4个供体)并相对于人类RPLPO或GAPDH标准化。*p＜0.05；**p＜0.01。B：C-肽和PDX1共染色的细胞的免疫荧光分析。数值为平均值±SE(对数尺度)，基于每个时间点处从3个供体中的每一个计数＞500个细胞。*p≤0.05，相对于未处理的细胞(第0天)。显示了代表性的显微照片。线条＝25μm。C、D：用RC处理8天的第5-7代的胰岛细胞中的β细胞基因表达的分析。C：qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞(第0天)的平均值±SE(对数尺度)(n＝3-4个供体)，并相对于人类RPLPO标准化。*p＜0.05；**p＜0.005；***p＜0.0005。D：共染色C-肽和指定的蛋白(绿色的)的细胞的免疫荧光分析。线条＝10μm。百分比指示C-肽⁺细胞中对于每个标志物呈阳性的细胞的比例。数据为平均值±SD，基于从3个供体的每个中计数＞200个细胞。E：在来自4个供体的未培养的胰岛细胞、来自4个供体的第5代的扩增的胰岛细胞(UTR)、和用RC处理的来自3个供体的第5代的扩增的胰岛细胞的cDNA微阵列分析中检测到的基因表达模式的无监督聚类(unsupervised clustering)。

图9A-D示出了分选的再分化的BCD细胞中的胰岛素产生和分泌。用RIP-DsRed2病毒感染扩增的胰岛细胞(第6-7代)并用RC处理8天。分选DsRed2⁺细胞并分析。A：β细胞转录子的qPCR分析。数值为相对于人类胰岛的平均值±SE(n＝3个供体)，并相对于人类RPLPO标准化。B：新鲜人类胰岛和DsRed2分选的RC处理的胰岛细胞的人类C-肽含量。数值为平均值±SE(n＝3个供体)。注意，绝大多数所贮存的胰岛素是经加工的(仅9％胰岛素原(proinsulin))。C：在16.7mM葡萄糖和IBMX存在下来自人类胰岛和RC处理的扩增的胰岛细胞的葡萄糖诱导的胰岛素分泌。数值为人类C-肽的平均值±SD，相对于0mM葡萄糖和IBMX(n＝3个供体)。D：电子显微镜分析显示在用RC处理8天的第6代的细胞中典型的胰岛素分泌囊泡的存在，与在分离的人类胰岛中的β细胞中所观察到的那些相当。线条＝0.5μm。

图10A-H示出了BCD细胞再分化包括间充质细胞-上皮细胞转变(MET)。A、B：胰岛细胞去分化期间SLUG表达的诱导。A：所示的传代的扩增的胰岛细胞的qPCR分析。数值为相对于未培养的胰岛的平均值±SE(n＝4个供体)并相对于人类RPLPO标准化。*p＜0.05。B：从未培养的胰岛和所示的传代数目的扩增的胰岛细胞中提取的蛋白的免疫印迹分析。HSC70，热休克同源物70。C：在胰岛细胞再分化期间SLUG表达的下调。在用RC处理8天后第6-7代的扩增的胰岛细胞的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞的平均值±SE(n＝4个供体)，并相对于人类RPLPO标准化。*p＜0.05。D：在用RC处理8天期间第5代的扩增的胰岛细胞中的NCAD和ECAD转录子的变化的动力学的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞的平均值±SE(关于ECAD的对数尺度)(n＝4个供体)，并相对于人类RPLPO或GAPDH标准化。*p＜0.05；**p＜0.01。E：在用RC处理8天后第6代的扩增的胰岛细胞的免疫染色分析显示了波形蛋白阳性的细胞数目的减少(平均值±SD，基于从3个供体的每个中计数＞400个细胞)，和波形蛋白和C-肽的互斥表达。箭头指向可能已丢失波形蛋白表达但还未激活胰岛素表达的细胞。线条＝10μm。F：在用RC处理8天后第5代的扩增的胰岛细胞中C-肽和BrdU的共染色。百分比指示在再分化处理的第2-8天掺入BrdU之后，总细胞中BrdU阳性细胞的比例。数据为平均值±SD，基于从3个供体的每个中计数500个细胞。线条＝20μm。G：用表达两种SLUG shRNA中的一种或乱序(SCR)shRNA的慢病毒感染的第5代的扩增的胰岛细胞的免疫印迹分析。UTR，未处理的细胞。H：用表达两种SLUG shRNA中的一种或乱序shRNA的慢病毒感染并用RC处理4天的第5代的扩增的胰岛细胞中的胰岛素转录子的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞的平均值±SE(n＝3-6个供体)，并相对于人类RPLPO或GAPDH标准化。p-值为相对于SCR的。UI，用RC处理的未感染的细胞。

图11A-H分别示出了BCD细胞再分化包括胰腺和胰岛祖细胞转录因子SOX9和NGN3的表达。A：扩增的胰岛细胞(第6代)的RC处理导致激素表达细胞而非胰岛素表达细胞的生成。用RC处理细胞8天并用对于指定的激素的抗体染色(通过对C-肽的染色鉴定产胰岛素细胞)。数值为平均值±SE(n＝4个供体)，基于从每个供体计数＞500个细胞。绿色的数值指示了在与来自6个供体的谱系示踪细胞的平行实验中评分的共1736个激素阳性的eGFP⁺细胞中对于每种激素呈阳性的细胞的百分比。B-D：再分化期间的SOX9激活。用RC处理第5代的胰岛细胞8天。B：SOX9的上调的动力学的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞(第0天)的平均值±SE(n＝4个供体)，并相对于人类RPLPO或GAPDH标准化。*p＜0.05。C：通过免疫荧光分析对SOX9⁺细胞的定量。数值为平均值±SD，基于每个时间点从3个供体中的每个中计数＞500个细胞。**p≤0.01，***p≤0.001，相对于未处理的细胞(第0天)。D：左侧，免疫荧光分析检测单独的波形蛋白或SOX9染色的细胞，以及双阳性的细胞。右侧，C-肽和SOX9染色是互斥的。线条＝10μm。E：利用表达两种SLUG shRNA中的一种或乱序的shRNA的慢病毒感染并用RC处理4天，第5代的扩增的胰岛细胞中SOX9转录子的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞的平均值±SE(n＝4-6个供体)，并相对于人类RPLPO或GAPDH标准化。UI，RC处理的未感染的细胞。F：再分化期间激活了NGN3。人类胎儿胰腺细胞(左图)和利用RC处理的胰岛细胞处理8天后第5代的扩增的胰岛细胞(右图)中NGN3mRNA表达的原位杂交分析。线条＝25μm。G-H：胰岛细胞去分化期间SOX9的瞬时激活。G：所示的传代的扩增的胰岛细胞的qPCR分析。数值为相对于未培养的胰岛的平均值±SE(n＝3个供体)并相对于人类RPLPO标准化。*p＜0.05。H：从未培养的胰岛和所示的传代数目的扩增的胰岛细胞中提取的蛋白的免疫印迹分析。

图12A-B示出了β细胞中RIP-CreER转基因表达的特异性。利用RIP-CreER病毒感染人类胰岛细胞并在感染后2-3天对Cre蛋白和4种胰岛激素共染色(胰岛素⁺细胞通过对C-肽的染色而鉴定)。数值为平均值±SD(n＝3个供体；基于从每个供体计数400个细胞)。

图13A-B示出了RC处理期间胰岛祖细胞基因的上调的动力学。用RC处理所示的天数的第5代的扩增的胰岛细胞的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞(第0天)的平均值±SE(n＝4个供体)，并相对于人类GAPDH标准化，*p＜0.05，**p≤0.01，***p≤0.001。

图14示出了RC处理后INSM1的上调。在用RC处理8天后第5代的扩增的胰岛细胞中的INSM1转录子的qPCR分析。数值为相对于未处理的细胞的平均值±SE(n＝4个供体)，并相对于人类RPLPO标准化。

发明具体实施方式的描述

本发明，在其一些实施方案中，涉及在成体胰岛β细胞中增加胰岛素含量的方法。

在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解，本发明的应用不必限于以下描述中所列出的或通过实施例所示例的细节。本发明能够以其他实施方案或能够以多种方式实践或进行。

因此，根据本发明的一方面，提供了离体提高成体胰岛β细胞中胰岛素含量的方法，所述方法包括将成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺、exendin-4、激活素A和葡萄糖的培养基，所述培养基不含血清，从而提高成体胰岛β细胞中的胰岛素含量。

如本文所用的短语“离体(ex-vivo)”指从活的生物体中移出并在生物体外(例如，在试管中)培养的细胞。

如本文所用的，短语“成体胰岛β细胞”指出生后的(例如，非胚胎的)胰岛内分泌细胞，其能够响应于增高的葡萄糖浓度分泌胰岛素并表达典型的β细胞标志物。β细胞标志物的例子包括，但不限于，胰岛素和pdx。

本发明的该方面的分离的成体胰岛β细胞可以是同种性质的或异种性质的(homogeneous or heterogeneous nature)。

因此，例如，本发明的该方面的成体胰岛β细胞可被包括在分离的胰岛中。胰岛细胞可包括以下：1)产生胰岛素的β细胞；2)产生胰高血糖素的α细胞；3)产生生长激素抑制素的δ细胞(或D细胞)；和/或产生胰多肽的F细胞。这些细胞中的多肽激素(胰岛素、胰高血糖素、生长激素抑制素和胰多肽)以分泌颗粒的形式贮存于分泌囊泡中。

分离胰岛的方法是本领域中熟知的。例如，可利用胶原酶和ficoll梯度从胰腺组织中分离胰岛。优选地将本发明的成体胰岛β细胞分散成单细胞悬液-例如，通过添加胰酶或通过研磨。

可将成体胰岛β细胞进一步分离，使其基本上不含在其体内环境中存在的其他物质(例如，其他细胞、蛋白、核酸等)，例如，通过FAC分选来分离。

成体胰岛β细胞可获自任何自体的或非自体的(即，同种异体的或异种的)哺乳动物供体。例如，细胞可从人类尸体中分离。

成体胰岛β细胞的去分化可通过扩增(即，培养)延长的传代数目而进行，-例如，在CMRL培养基中。

如本文所用的，术语“扩增(expanding)”指通过细胞分裂的过程而非简单地通过过度生长而扩大，增加本发明的成体胰岛β细胞的数目和总量。

根据一个实施方案，细胞在含约10-100mM葡萄糖，更优选地为10-50mM，更优选地为10-25mM，比如例如25mM浓度的葡萄糖的MesencultXF培养基中扩增。

优选地扩增细胞至少6代、7代、8代、9代、10代、11代、12代、13代、14代、15代、或至少16代。

根据一个具体的实施方案，扩增在粘附条件下进行，所述粘附条件包括在选自由层粘连蛋白、纤连蛋白、基质胶和Mesencult XF粘附基质组成的组的粘附培养基上孵育。

根据另一个实施方案，成体胰岛β细胞的去分化可通过利用已知生成诱导性多能干细胞(iPS)细胞的基因转染细胞来实现。已将Oct-3/4和Sox基因家族的某些成员(Sox1、Sox2、Sox3和Sox15)鉴定为参与诱导过程的关键转录调控子，其缺失使诱导不可能。然而，已鉴定包括Klf家族的某些成员(Klf1、Klf2、Klf4和Klf5)、Myc家族的某些成员(C-myc、L-myc和N-myc)、Nanog和LIN28的另外的基因提高诱导效率。

根据一个实施方案，通过以下使细胞再分化：

(a)在含烟酰胺、exendin-4、激活素A和10-50mM葡萄糖的培养基中孵育成体胰岛β细胞，该培养基不含血清；和随后

(b)在含烟酰胺、exendin-4和0.5-10mM葡萄糖的另外的培养基中孵育成体胰岛β细胞。

烟酰胺的示例性的浓度范围包括1-100mM，更优选地为1-50mM、更优选地为1-20mM，比如例如10mM。

exendin 4的示例性的浓度范围包括1-100nM，更优选地为1-50nM，更优选地为1-20nM，比如例如8nM。

激活素A的示例性的浓度范围包括1-100nM，更优选地为1-50nM，更优选地为1-20nM，比如例如8nM。

对于步骤A，葡萄糖的示例性的浓度范围包括10-100mM，更优选地为10-50mM，更优选地为10-25mM，比如例如25mM。

对于步骤B，葡萄糖的示例性的浓度范围包括0.5-10mM，更优选地为1-10mM，更优选地为2.5-7.5mM，比如例如5.6mM。

利用本文描述的方法获得的细胞能够以葡萄糖响应方式分泌胰岛素并典型地表达β细胞特异性基因(例如PDX-1)。

根据一个特定的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少10％是由β细胞再分化的细胞。

根据一个特定的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少20％是由β细胞再分化的细胞。

根据一个特定的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少30％是由β细胞再分化的细胞。

根据一个特定的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少40％是由β细胞再分化的细胞。

根据又一个另外的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少20％分泌胰岛素。

根据又一个另外的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少30％分泌胰岛素。

根据又一个另外的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少40％分泌胰岛素。

根据又一个另外的实施方案，根据本文描述的方法生成的分离的群体的细胞的至少50％分泌胰岛素。

优选地，本文所描述的群体中的细胞中的大多数表达PDX1、NKX2.2、NKX6.1、IAPP和PCI/3和β细胞功能必需的其他蛋白。

优选地，如通过RT-PCR所测量的，与非再分化的β细胞相比较，细胞表达增加的量的β细胞转录因子(例如，HBLX9、NEUROD、NKX2.2和NKX6.1)。

可以在本文所描述的分离的群体中被上调的其他基因包括KIR6.2、SUR1和GCK。

本发明人已显示，以上所描述的再分化方案导致了称作SLUG(snail同源物2，编码具有Swiss prot编号043623的蛋白)的基因-GenBankTM登录号BC014890的下调。

将理解的是，本发明涵盖用于该再分化方案(或任何另外的再分化方案)的下调SLUG的另外的方式(例如，通过利用特异性地针对该蛋白的剂，比如通过利用抗体或siRNA剂)。

以下是能够下调SLUG的表达水平和/或活性的剂的列表。

能够下调SLUG的剂的一个例子是能够特异性地结合SLUG的抗体或抗体片段。优选地，该抗体特异性地结合SLUG的至少一个表位。如本文所用的，术语“表位”指抗原上与抗体的互补位结合的任何抗原决定簇。

如本发明所用的术语“抗体”包括完整的分子以及能够与巨噬细胞结合的其功能性片段，比如Fab、F(ab′)2和Fv。这些功能性抗体片段如下所定义：(1)Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，可通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体生成完整的轻链和一个重链的部分而产生；(2)Fab′，可通过用胃蛋白酶处理整个抗体，然后还原，产生完整的轻链和重链的部分而获得的抗体分子的片段；每个抗体分子获得两个Fab′片段；(3)(Fab′)2，可通过用胃蛋白酶处理整个抗体而不进行随后的还原而获得的抗体的片段；F(ab′)2是通过两个二硫键保持在一起的两个Fab′片段的二聚体；(4)Fv，定义为含表达为两个链的轻链的可变区和重链的可变区的遗传工程化的片段；和(5)单链抗体(“SCA”)，含轻链的可变区和重链的可变区的遗传工程化的分子，通过适宜的多肽连接物连接作为遗传融合的单链分子。

SLUG的下调还可通过RNA沉默来实现。如本文所用的，短语“RNA沉默”指由RNA分子所介导的一组调控机制[例如，RNA干扰(RNAi)、转录基因沉默(TGS)、转录后基因沉默(PTGS)、压制、共抑制和翻译阻抑]，导致对应的蛋白编码基因的表达的抑制或“沉默”。已在包括植物、动物和真菌的许多类型的生物体中观察到RNA沉默。

如本文所用的，术语“RNA沉默剂”指能够特异性地抑制或“沉默”靶基因的表达的RNA。在某些实施方案中，RNA沉默剂能够通过转录后沉默机制阻止mRNA分子的完全加工(例如，完整的翻译和/或表达)。RNA沉默剂包括非编码RNA分子，例如包括成对的链的RNA双链体，以及前体RNA，可由其生成小的非编码RNA。示例性的RNA沉默剂包括dsRNA诸如siRNA、miRNA和shRNA。在一个实施方案中，RNA沉默剂能够诱导RNA干扰。在另一个实施方案中，RNA沉默剂能够介导翻译阻抑。

根据本发明的一个实施方案，RNA沉默剂对于靶标RNA(例如，SLUG)是特异性的，且并不交叉抑制或沉默与靶基因表现99％或更小总体同源性的基因或剪接变体，所述更少总体同源性例如，与靶基因小于98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％的总体同源性。

RNA干扰指在动物中由短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。在植物中对应的过程通常称作转录后基因沉默或RNA沉默，且在真菌中还被称作压制。转录后基因沉默的过程被认为是用于阻止外源基因表达的进化保守的细胞防卫机制，并通常为多种植物群(flora)和动物门(phyla)所共有。这种对于外源基因表达的阻止可经由特异性地破坏同源的单链RNA或病毒基因组RNA的细胞反应响应于双链RNA(dsRNA)的产生而演变，所述双链RNA来源于病毒感染或来自随机整合进入到宿主基因组中的转座子元件。

细胞中的长dsRNA的存在刺激了称作dicer的核糖核酸酶III的活性。Dicer参与将dsRNA加工成称作短干扰RNA(siRNA)的dsRNA的短片段。来源于dicer活性的短干扰RNA通常长度约21至约23个核苷酸，且包括约19个碱基对双链体。RNAi响应还以核酸内切酶复合物为特征，其通常称作RNA诱导的沉默复合物(RISC)，其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域中部。

因此，本发明的一些实施方案涵盖dsRNA用于下调从mRNA的蛋白表达的用途。

根据一个实施方案，dsRNA大于30bp。长dsRNA(即，dsRNA大于30bp)的用途非常有限，由于认为这些双链RNA的较长的区域将导致干扰素的诱导和PKR应答。然而，使用长dsRNA可提供大量的优点，原因在于细胞可选择最佳沉默序列，减少了试验大量siRNA的必要；长dsRNA将允许沉默文库具有比siRNA必需的复杂性小的复杂性；并且，可能最重要的是，当用作治疗剂时，长dsRNA能够阻止病毒逃逸突变。

多项研究证明长dsRNA可用于沉默基因表达，而不会诱导应激反应或导致显著的偏离靶标效应-参见例如[Strat等人，Nucleic Acids Research，2006，卷34，第13号3803-3810；Bhargava A等人.Brain Res.Protoc.2004；13：115-125；Diallo M.，等人，Oligonucleotides.2003；13：381-392；Paddison P.J.，等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA.2002；99：1443-1448；Tran N.，等人，FEBS Lett.2004；573：127-134]。

具体地，本发明根据其一些实施方案涵盖导入长dsRNA(超过30个碱基转录子)以用于其中不激活干扰素途径的细胞(例如，胚细胞和卵母细胞)中的基因沉默，参见例如Billy等人，PNAS 2001，卷98，第14428-14433页.和Diallo等人，Oligonucleotides，2003年10月1日，13(5)：381-392.doi：10.1089/154545703322617069。

本发明根据其一些实施方案还涵盖导入特别设计以不诱导干扰素和PKR途径的长dsRNA以用于下调基因表达。例如，Shinagwa和Ishii[Genes& Dev.17(11)：1340-1345，2003]已开发了称作pDECAP的载体，以从RNA聚合酶II(Pol II)启动子表达长的双链RNA。由于来自pDECAP的转录子缺少协助ds-RNA输出到细胞质的5’-帽结构和3’-聚腺苷酸尾巴二者，来自pDECAP的长ds-RNA不会诱导干扰素应答。

避开哺乳动物系统中的干扰素和PKR途径的另一种方法是通过经由转染或内源性表达而导入小抑制性RNA(siRNA)。

术语“siRNA”指诱导RNA干扰(RNAi)途径的小抑制性RNA双链体(通常在18-30碱基对之间)。通常，siRNA是化学合成的21mer，具有中央的19bp双链体区域和对称的末端2-碱基3’-悬突，虽然最近已描述，化学合成的25-30碱基长度的RNA双链体与在相同的位置的21mer相比较可具有多达100倍增高的效力。理论认为在触发RNAi时利用较长的RNA获得的所观察到的增高的效力起因于向Dicer提供了底物(27mer)而非产物(21mer)，且这提高了siRNA双链体进入到RISC的速率或效率。

已发现3’-悬突的位置影响着siRNA的效力，且在反义链上具有3’-悬突的不对称的双链体一般比在有义链上具有3’-悬突的那些更有效(Rose等人，2005)。这可归因于不对称的链载入到RISC中，因为当靶向反义转录子时观察到相反的效率模式。

可连接双链干扰RNA(例如，siRNA)的链以形成发夹或茎-环结构(例如，shRNA)。因此，如所提到的，本发明的一些实施方案的RNA沉默剂还可以是短发夹RNA(shRNA)。

如本文所用的，术语“shRNA”指具有茎-环结构的RNA剂，包括具有互补序列的第一区域和第二区域，互补的程度和区域的方向足以使区域之间发生碱基配对，第一区域和第二区域通过环区域连接，环由环区域中的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺少碱基配对而引起。环中的核苷酸的数目是3至23、或5至15、或7至13、或4至9、或9至11之间并包括端点的数目。环中的某些核苷酸可参与与环中的另外的核苷酸的碱基配对相互作用。可用于形成环的寡核苷酸序列的例子包括5′-UUCAAGAGA-3′(Brummelkamp，T.R.等人.(2002)Science 296：550)和5′-UUUGUGUAG-3′(Castanotto，D.等人.(2002)RNA 8：1454)。本领域技术人员将认识到，所得的单链寡核苷酸形成包括能够与RNAi机器(RNAi machinery)相互作用的双链区域的茎-环或发夹结构。

根据另一个实施方案，RNA沉默剂可以是miRNA。miRNA是由编码不同大小的初级转录子的基因产生的小RNA。其已在动物和植物二者中被鉴定。初级转录子(称作“初级-miRNA”)经过多种核水解(nucleolytic)步骤被加工成较短的前体miRNA，或“前-miRNA”。前-miRNA以折叠的形式存在，从而最终的(成熟)miRNA以双链体存在，该两个链被称作miRNA(将最终与靶标碱基配对的链)。前-miRNA是将miRNA双链体从前体移除的dicer形式的底物，之后，与siRNA类似，双链体可被捕获到RISC复合物中。已证明miRNA可转基因地表达且通过前体形式而非整个初级形式的表达而生效。(Parizotto等人.(2004)Genes & Development18：2237-2242和Guo等人.(2005)Plant Cell 17：1376-1386)。

不同于siRNA，miRNA仅以部分互补性结合转录子序列(Zeng等人，2002，Molec.Cell 9：1327-1333)并抑制翻译而不影响稳态的RNA水平(Lee等人，1993，Cell 75：843-854；Wightman等人，1993，Cell 75：855-862)。miRNA和siRNA二者被Dicer加工并与RNA诱导的沉默复合物的组分缔合(Hutvagner等人，2001，Science 293：834-838；Grishok等人，2001，Cell 106：23-34；Ketting等人，2001，Genes Dev.15：2654-2659；Williams等人，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：6889-6894；Hammond等人，2001，Science293：1146-1150；Mourlatos等人，2002，Genes Dev.16：720-728)。最近的报告(Hutvagner等人，2002，Sciencexpress 297：2056-2060)假设，通过miRNA途径还是通过siRNA途径进行基因调控是仅由与靶转录子的互补性的程度来决定的。据推测，与mRNA靶标仅部分相同的siRNA将与miRNA相似地在翻译抑制而非触发RNA降解中起作用。

适用于本发明的一些实施方案的RNA沉默剂的合成可按如下来进行。首先，在SLUG mRNA序列的AUG起始密码子的下游扫描AA二核苷酸序列。将每个AA和3’邻近的19个核苷酸的存在记录为可能的siRNA靶位点。优选地，siRNA靶位点选自开放读码框，因为非翻译区(UTR)中调控蛋白结合位点较为丰富。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合[Tuschl ChemBiochem.2：239-245]。然而将理解的是，针对非翻译区的siRNA也可以是有效的，如对GAPDH所证明的，其中针对5’UTR的siRNA介导了细胞GAPDH mRNA约90％的下降并完全消除了蛋白水平(www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html)。

其次，利用任何序列比对软件，诸如从NCBI服务器可获得的BLAST软件(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，将可能的靶位点与适当的基因组数据库(例如，人类、小鼠、大鼠等)比较。过滤掉与另外的编码序列表现出显著同源性的推测的靶位点。

选择符合条件的靶序列作为siRNA合成的模板。优选的序列是包括低G/C含量的那些序列，因为已证明这些序列与具有高于55％的G/C含量的那些序列相比较更有效地介导基因沉默。沿着靶基因的长度，优选选择多个靶位点用于评价。为了更好地评价所选择的siRNA，优选地共同使用阴性对照。阴性对照siRNA优选地包括与该siRNA相同的核苷酸组成，但与基因组无显著同源性。这样，优选地使用该siRNA的乱序的核苷酸序列，条件是其不会表现出与任何其他基因的任何显著的同源性。

将理解的是，本发明的一些实施方案的RNA沉默剂不必限于仅含RNA的那些分子，而还包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。

在一些实施方案中，本文提供的RNA沉默剂可在功能上与细胞渗透肽”结合。如本文所用的，“细胞渗透肽”是包括短(约12-30个残基)氨基酸序列或功能基序的肽，其赋予与膜可渗透复合物跨细胞的质膜和/或核膜的转运有关的不依赖能量的(即，非内吞作用)移位性质。本发明的一些实施方案的膜可渗透复合物中所用的细胞渗透肽优选地包括至少一个非功能的半胱氨酸残基，其是游离的或被衍生以与双链核糖核酸形成二硫键，所述双链核糖核酸已经被修饰以用于这样的键合。赋予这样的性质的代表性的氨基酸基序在美国专利第6,348,185号中列出，其内容在此通过引用明确地并入。本发明的一些实施方案的细胞渗透肽优选地包括但不限于，穿膜肽(penetratin)、转运素(transportan)、pIsl、TAT(48-60)、pVEC、MTS、和MAP。

能够下调SLUG的另一种剂是能够特异性地切割SLUG的mRNA转录子或DNA序列的脱氧核酶(DNAzyme)分子。脱氧核酶是单链的多核苷酸，其能够切割单链的和双链的靶序列二者(Breaker，R.R.和Joyce，GChemistry and Biology1995；2：655；Santoro，S.W.& Joyce，G.F.Proc.Natl，Acad.Sci.USA 1997；943：4262)。已提出了脱氧核酶的一般模型(“10-23”模型)。“10-23”脱氧核酶具有15个脱氧核糖核苷酸的催化域，侧翼为各7至9个脱氧核糖核苷酸的两个底物识别域。该类型的脱氧核酶可在嘌呤：嘧啶连接处有效地切割其底物RNA(Santoro，S.W.& Joyce，G.F.Proc.Natl，Acad.Sci.USA 199；关于脱氧核酶的综述参见Khachigian，LM[Curr OpinMol Ther 4：119-21(2002)]。

Joyce等人的美国专利第6,326,174号中公开了识别单链和双链靶切割位点的合成的、工程化的脱氧核酶的构建和扩增的实例。最近观察到相似设计的针对人类尿激酶受体的脱氧核酶抑制尿激酶受体表达，且成功地在体内抑制结肠癌细胞转移(Itoh等人，20002，Abstract 409，Ann Meeting AmSoc Gen Ther www.asgt.org)。在另一个应用中，与bcr-ab1癌基因互补的脱氧核酶成功地在白血病细胞中抑制癌基因表达，并在CML和ALL病例中的自体骨髓移植中减少了复发率。

SLUG的下调还可通过利用能够与编码SLUG的mRNA转录子特异性地杂交的反义多核苷酸来进行。

能够下调SLUG的另一种剂是能够特异性地切割编码SLUG的mRNA转录子的核酶分子。核酶正在被越来越多地用于通过切割编码感兴趣的蛋白的mRNA而序列特异性抑制基因表达[Welch等人，Curr Opin Biotechnol.9：486-96(1998)]。设计核酶以切割任何特定的靶RNA的可能性使其成为基础研究和治疗应用中有价值的工具。

调控细胞中SLUG基因的表达的另一种方法是经由三链体形成寡核苷酸(TFO)。最近的研究已显示，可设计能够以序列特异性的方式识别并结合双链螺旋DNA中的多嘌呤/多嘧啶区域的TFO。这些识别规则由以下所概述：Maher III，L.J.，等人，Science，1989；245：725-730；Moser，H.E.，等人，Science，1987；238：645-630；Beal，P.A.，等人Science，1992；251：1360-1363；Cooney，M.，等人，Science，1988；241：456-459；和Hogan，M.E.，等人，欧洲公布375408。对寡核苷酸的修饰，诸如引入嵌入剂和骨架取代，以及优化结合条件(pH和阳离子浓度)，已帮助克服了对TFO活性的固有障碍，比如电荷排斥和不稳定性，且最近已显示可使合成的寡核苷酸靶向特定的序列(关于最近的综述参见Seidman和Glazer，J Clin Invest 2003；112：487-94)。

一般，三链体形成寡核苷酸具有序列对应：

寡核苷酸     3′--A     G     G     T

双链体       5′--A     G     C     T

双链体       3′--T     C     G     A

然而，已显示A-AT和G-GC三链体具有最大的三螺旋稳定性(Reither和Jeltsch，BMC Biochem，2002，9月12日，电子出版)。相同的作者已证明，根据A-AT和G-GC规则设计的TFO不会形成非特异性三链体，表明三链体形成确实是序列特异性的。

因此对于SLUG调控区域中的任何给定的序列，可设计三链体形成序列。三链体形成寡核苷酸长度优选地为至少15bp，更优选地为25bp，更加优选地为30bp或更多核苷酸，长达50bp或100bp。

用TFO转染细胞(例如，经由阳离子脂质体)，且与靶DNA形成三螺旋结构诱导了空间的和功能的改变，阻断了转录起始和延伸，允许在内源性的DNA中导入所需的序列改变并导致基因表达的特异性下调。这种在用TFO处理的细胞中抑制基因表达的例子包括哺乳动物细胞中的游离体supFG1基因和内源性HPRT基因的敲除(Vasquez等人，Nucl Acids Res.1999；27：1176-81，和Puri，等人，J Biol Chem，2001；276：28991-98)，和在前列腺病因中重要的Ets2转录因子(Carbone，等人，Nucl Acid Res.2003；31：833-43)，以及促炎性ICAM-1基因(Besch等人，J Biol Chem，2002；277：32473-79)的表达的序列和靶标特异性下调。此外，Vuyisich和Beal最近已显示，序列特异性的TFO能够与dsRNA结合，抑制dsRNA依赖性酶诸如RNA依赖性激酶的活性(Vuyisich和Beal，Nuc.Acids Res2000；28：2369-74)。

此外，根据上述原则设计的TFO可诱导能够实现DNA修复的定向诱变，从而提供了内源性基因的表达的下调和上调二者(Seidman和Glazer，JClin Invest 2003；112：487-94)。有效的TFO的设计、合成和施用的详细描述可见于Froehler等人的美国专利申请第2003 017068号和第2003 0096980号、和Emanuele等人的第2002 0128218号和第2002 0123476号、和Lawn的美国专利第5,721,138号。

能够下调SLUG的另一种剂可以是与SLUG结合和/或切割SLUG的任何分子。这样的分子可以是SLUG拮抗剂、或SLUG抑制肽。

将理解的是，SLUG的至少催化部分或结合部分的非功能类似物也可用作下调SLUG的剂。

可与本发明的一些实施方案一起使用以下调SLUG的另一种剂是阻止SLUG激活或DNA结合的分子。

还可进一步修饰(例如，遗传修饰)本发明的成体胰岛β细胞的群体以表达药剂，诸如治疗剂、端粒酶基因、减少免疫介导的排斥的剂或标志物基因。预期治疗剂诸如抗代谢物(例如，嘌呤类似物、嘧啶类似物)、酶抑制剂和肽模拟物在本发明中通常可以是有用的。可减少免疫介导的排斥的基因的例子是子宫珠蛋白基因。子宫珠蛋白是在孕期表达的蛋白，其赋予免疫耐受性并阻止炎症反应。上文描述了遗传修饰本发明的成体胰岛β细胞的方法。

根据一个实施方案，再分化之后，将β细胞与胰岛中存在的其他胰腺细胞分离。这可利用锌结合染料诸如新点绿来进行(参见Parnaud G，等人.Proliferation of sorted human and rat beta cells.Diabetologia 2008.51：91-100)或利用抗NCAM抗体来进行(参见Banerjee M，Otonkoski T.A simpletwo-step protocol for the purification of human pancreatic beta cells.Diabetologia 2009.52：621-625.)。

因为本发明的成体胰岛细胞以葡萄糖响应方式贮存和分泌胰岛素，其可用于治疗与胰岛素缺乏相关的疾病比如糖尿病。

因此，根据本发明的另一方面，提供了在受治疗者中治疗糖尿病的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的离体扩增和再分化的成体胰岛β细胞的群体移植到受治疗者中，从而治疗糖尿病。

如本文所用的，“糖尿病”指在生物体中由因为胰岛素的生物合成或产生的缺陷所致的胰岛素的绝对缺乏引起(1型糖尿病)或由存在胰岛素抵抗即受损的胰岛素作用的胰岛素的相对缺乏引起(2型糖尿病)的疾病。因此糖尿病患者具有绝对的胰岛素缺乏或相对的胰岛素缺乏，并除其他症状和病征外表现出增高的血糖浓度、尿中葡萄糖的存在和排尿过多。

短语“治疗”指在患有或诊断为疾病、疾患或病症的个体中抑制或阻止疾病、疾患或病症的发展和/或导致疾病、疾患或病症的减少、减轻或消退。本领域技术人员将知道可用于评估疾病、疾患或病症的发展的多种方法和测定，和类似地，可用于评估疾病、疾患或病症的减少、减轻或消退的多种方法和测定。

如本文所用的，“移植”指利用任何适宜的途径提供本发明的再分化的成体胰岛β细胞。虽然设想了其他施用方法，通常，β细胞治疗通过利用导管注射到肝的门静脉中而实现。

如上所述，本发明的成体胰岛β细胞可来源于自体来源或来源于同种异体来源诸如人类尸体或供体。因为当非自体细胞被施用于身体时可能诱导免疫反应，已开发了一些方法来减少非自体细胞的排斥的可能性。这些方法包括抑制接受者的免疫系统，或在移植前将非自体细胞胶囊化到免疫隔离的半渗透性膜中。

胶囊化技术通常分类为包括小球形囊泡的微囊化和包括较大的平面片和中空纤维膜的巨囊化(Uludag，H.等人.Technology of mammalian cellencapsulation.Adv Drug Deliv Rev.2000；42：29-64)。

制备微胶囊的方法是本领域中已知的，且包括例如以下中所公开的：Lu MZ，等人，Cell encapsulation with alginate andalpha-phenoxycinnamylidene-acetylated poly(allylamine).Biotechnol Bioeng.2000，70：479-83，Chang TM和Prakash S.Procedures for microencapsulationof enzymes，cells and genetically engineered microorganisms.Mol Biotechnol.2001，17：249-60，和Lu MZ，等人，A novel cell encapsulation method usingphotosensitive poly(allylamine alpha-cyanocinnamylideneacetate).JMicroencapsul.2000，17：245-51。

例如，微胶囊的制备是通过将改性的胶原与2-甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸(MAA)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)的三元聚合物壳复合，生成2-5μm厚的胶囊。这样的微胶囊可利用另外的2-5μm的三元聚合物壳进一步胶囊化以赋予带负电荷的平滑表面并使血浆蛋白吸附最小化(Chia，S.M.等人.Multi-layered microcapsules for cell encapsulationBiomaterials.2002 23：849-56)。

其他微胶囊是基于海洋多糖藻酸盐(Sambanis，A.Encapsulated isletsin diabetes treatment.Diabetes Thechnol.Ther.2003，5：665-8)或其衍生物。例如，微胶囊可通过在氯化钙存在下在聚阴离子藻酸钠和硫酸纤维素钠与聚阳离子聚(亚甲基-共-胍)盐酸盐之间的聚合电解质络合来制备。

将理解的是，当使用较小的胶囊时，细胞胶囊化得以改进。因此，当胶囊尺寸从1mm降低到400μm时，胶囊化的细胞的质量控制、机械稳定性、扩散性质和体外活性提高了(Canaple L.等人，Improving cellencapsulation through size control.J Biomater Sci Polym Ed.2002；13：783-96)。并且，发现具有良好控制的小至7nm的孔径、定制的表面化学和精确的微结构的纳米孔生物胶囊成功地免疫隔离了细胞的微环境(Williams D.Small is beautiful：microparticle and nanoparticle technologyin medical devices.Med Device Technol.1999，10：6-9；Desai，T.A.Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation.Expert OpinBiol Ther.2002，2：633-46)。

免疫抑制剂的例子包括但不限于，氨甲蝶呤、环磷酰胺、环孢素、环孢霉素A、氯喹、羟氯喹、硫氮磺胺吡啶(sulphasalazopyrine)、金盐、D-青霉胺、来氟米特、硫唑嘌呤、阿那白滞素、英夫利昔单抗(REMICADE.sup.R)、靶向炎性细胞因子的生物剂TNFα阻断剂依那西普、和非甾体类抗炎药(NSAID)。NSAID的例子包括但不限于，乙酰水杨酸、胆碱水杨酸镁、二氟尼柳、水杨酸镁、双水杨酯、水杨酸钠、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、氟吡洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氧胺苯酸钠、萘普生、萘丁美酮、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美汀、扑热息痛、布洛芬、Cox-2抑制剂和曲马多。

可将本发明的成体胰岛β细胞本身，或在其中其与适宜的运载体(carrier)或赋形剂混合的药物组合物中移植到人类受治疗者中。

如本文所用的“药物组合物”指本文所描述的一种或多种活性成分与其他化学组分诸如生理上适宜的运载体和赋形剂的制品。药物组合物的目的是为了协助将化合物施用到生物体。

本文中术语“活性成分”指负责生物效应的本发明的成体胰岛β细胞。

下文中，短语“生理学上可接受的运载体”和“药学上可接受的运载体”可互换地使用，指不会对生物体产生显著的刺激和不会消除所施用的化合物的生物活性和性质的运载体或稀释剂。这些短语中包括佐剂(adjuvant)。

本文中术语“赋形剂”指添加到药物组合物中以进一步协助活性成分的施用的惰性物质。非限制地，赋形剂的例子包括碳酸钙、磷酸钙、多种糖类和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

本发明的药物组合物可通过本领域中熟知的方法来制造，例如，通过常规的混合、溶解、粒化、制造糖衣药丸、磨细、乳化、胶囊化、包埋(entrapping)或冻干工艺。

因此用于根据本发明的用途的药物组合物可以常规的方式利用一种或多种生理学上可接受的运载体来配制，所述生理学上可接受的运载体包括赋形剂和助剂，其协助将活性成分加工为可用于药学应用的制品。合适的制剂取决于所选择的施用途径。

对于注射，药物组合物的活性成分可在水溶液中配制，优选地在生理学相容的缓冲液诸如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐缓冲液。

适用于本发明中的药物组合物包括其中含有有效实现预期目的的量的活性成分的组合物。更具体地，治疗有效量意为有效预防、减轻或改善疾患(例如，糖尿病)的症状或延长被治疗的受治疗者的生存的活性成分(产胰岛素细胞)的量。

治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力之内，尤其是根据本文提供的详细的公开内容。

对于本发明的方法中所用的任何制品，可从动物模型(例如，STZ糖尿病小鼠)估计治疗有效量或剂量以达到想要的浓度或效价。这样的信息可用于更准确地确定在人类中有效的剂量。

本文所描述的活性成分的毒性和治疗效力可在实验动物中通过标准的药学方案来确定。可将从这些动物研究中获得的数据用于配制一系列用于人类的剂量。根据所用的剂型和所用的施用途径，剂量可以是不同的。确切的制剂、施用途径和剂量可由每个医师参照患者的状况来选择。(参见，例如，Fingl，等人，1975，于″The Pharmacological Basis of Therapeutics″，中第1章第1页)。

施药量和间隔可单独地调整以提供足以诱导血糖量正常的细胞数(最低有效浓度，MEC)。对于每种制品，MEC将是不同的，但可从体外数据来估计。获得MEC所必需的剂量将取决于个体的特征和施用的途径。可使用检测测定来确定血浆浓度。

当然，待施用的组合物的量将取决于被治疗的受治疗者、疾病的严重度、施用的方式、处方医师的判断等。

若需要，本发明的组合物可存在于包装或分配器装置中，比如FDA批准的药盒，其可含有一种或多种含活性成分的单位剂型。包装可以，例如，包括金属箔或塑料箔，比如泡罩包装。包装或分配器装置可附有施用说明书。包装或分配器还可设有与容器一起的须知，该须知为监管药物的制造、使用或销售的政府机构指定的形式，其反映了组合物的形式或人类施用或兽医施用获机构批准。这样的须知，例如，可以是关于处方药由美国食品与药物管理局批准的标签，或批准的产品内页。还可制备在相容的药物运载体中配制的包括本发明的制剂的组合物，并将其置于适当的容器中，并贴上关于适应症(indicated condition)的治疗的标签，如以上所详述。

术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(having)”和其同根词意为“包括但不限于”。

术语“由......组成”意为“包括且限于”。

术语“基本上由......组成”意为该组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部件，但条件是另外的成分、步骤和/或部件不会实质性地改变所请求保护的组合物、方法或结构的基本的和新颖的特征。

如本文所用的，除非文中另外清楚地规定，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代对象。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。

遍及本申请，本发明的多种实施方案可以范围形式来呈现。应理解的是，范围形式的描述仅为方便和简洁，并不应解释为对本发明的范围的硬性限制。因此，应认为范围的描述具体地公开了该范围中的所有可能的子范围以及单独的数值。例如，应认为比如从1至6的范围的描述具体地公开了子范围比如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围中的单独的数目，例如，1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何其均适用。

当本文指定了数值范围时，其意在包括该指定的范围中的任何引用的数字(分数或整数)。短语第一指定数字和第二指定数字“之间的范围(ranging)/范围(ranges)”和短语第一指定数字“至”第二指定数字“之间的范围(ranging)/范围(ranges)”在本文可互换地使用，且意为包括第二和第二指定的数字和其间的所有分数和整数。

如本文所用的术语“方法”指用于实现给定的任务的方式、工具、技术和方案，包括但不限于，化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域中的专业人员已知的或易于从其已知的方式、工具、技术和方案中开发的那些方式、工具、技术和方案。

如本文所用的，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病症的发展，基本上减轻病症的临床上的或美学上的症状，或基本上阻止病症的临床上或美学上的症状的出现。

应理解的是，为清楚起见而在分开的实施方案中描述的本发明的某些特征，也可在单一的实施方案中组合地提供。相反地，为简便起见而在单一的实施方案中描述的本发明的多种特征，也可分开来提供，或以任何适宜的子组合来提供，或在本发明的任何其他所描述的实施方案中适宜地提供。多个实施方案中描述的某些特征不应被认为是那些实施方案的必要特征，除非无那些元素时该实施方案不生效。

如上文所描绘和以下权利要求书部分中所请求保护的本发明的多个实施方案和方面在以下的实施例中得到实验支持。

实施例

现参考以下实施例，其连同以上描述以非限制的方式示出了本发明的一些实施方案。

一般，本文所用的名称和本发明中所用的实验室方案包括分子技术、生物化学技术、微生物技术和重组DNA技术。文献中充分地解释了这些技术。参见，例如，“Molecular C1oning：A laboratory Manual”Sambrook等人，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”卷I-III Ausubel，R.M.，编(1994)；Ausubel等人，“Current Protocols in Molecular Biology”，JohnWiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide toMolecular Cloning”，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson等人，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York；Birren等人.(编)“Genome Analysis：A Laboratory Manual Series”，卷1-4，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1998)；如以下中所列出的方法：美国专利第4,666,828号；第4,683,202号；第4,801,531号；第5,192,659号和第5,272,057号；“Cell Biology：ALaboratory Handbook”，卷I-III Cellis，J.E.，编(1994)；Freshney的“Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique”Wiley-Liss，N.Y.(1994)，第三版；“Current Protocols in Immunology”卷I-IIIColigan J.E.，编(1994)；Stites等人.(编)，“Basic and Clinical Immunology”(第八版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编)，“Selected Methods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman and Co.，NewYork(1980)；可获得的免疫测定在专利和科学文献中广泛地描述，参见，例如，美国专利第3,791,932号；第3,839,153号；第3,850,752号；第3,850,578号；第3,853,987号；第3,867,517号；第3,879,262号；第3,901,654号；第3,935,074号；第3,984,533号；第3,996,345号；第4,034,074号；第4,098,876号；第4,879,219号；第5,011,771号和第5,281,521号；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.，编(1984)；“Nucleic AcidHybridization”Hames，B.D.，和Higgins S.J.，编.(1985)；“Transcription andTranslation”Hames，B.D.，和Higgins S.J.，编(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.I.，编(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press，(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)和“Methods in Enzymology”卷1-317，Academic Press；“PCR Protoeols：AGuide To Methods And Applicatiohs”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等人，“Strategies for Protein Purification and Characterization-ALaboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；其全部通过引用并入，如同其在本文中完全列出。遍及本文提供了其他一般参考文献。其中的方案被认为是本领域中熟知的，并为方便读者而提供。其中所含的全部信息通过引用并入本文。

实施例1

作为胰岛素来源的扩增的β细胞

材料和方法

无外源条件下的扩增：将成体人类胰岛细胞铺板到包被有MesenCultXF附着基质(Stem Cell Technology，Canada)的平板中并在MesenCult XF培养基(Stem Cell Technology，Canada)中扩增。

在可溶性因子混合物中的再分化：再分化方案基于超低附着平板中的无血清培养基(SFM)中的细胞的群集，并以2个步骤暴露于可溶性因子的混合物：

步骤1：在含25mM葡萄糖并补充有1％BSA级分V、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、ITS(胰岛素、铁传递蛋白、硒)、N2补充物、B27补充物、10mM烟酰胺、8nM exendin-4和8nM激活素A的CMRL 1066培养基中孵育6天。

步骤2：在含5.6mM葡萄糖并补充有1％BSA级分V、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、ITS、N2补充物、B27补充物、10mM烟酰胺和8nM exendin-4的CMRL 1066培养基中孵育2天。

新点绿(NG)：将再分化的细胞经胰酶消化成单细胞悬液，在PBS中2.5μM NG中与0.00125％普朗尼克F-127一起孵育10分钟，并进行FACS分析。

结果

诱导细胞以与血清存在时细胞生长的速率相当的速率进行复制(图1A)。如通过Ki67染色所判断的(图1B)，显示谱系示踪β细胞来源的(BCD)细胞在这些条件下复制。

与试验的所有其他组合相比，再分化方案导致了最高水平的胰岛素mRNA(图2)。这些水平与组合中的一些相比是其4倍以上。步骤2中葡萄糖浓度的降低不仅导致了较高的胰岛素mRNA水平，还导致了其他胰岛激素的较低的mRNA水平(图3)。利用我们的谱系示踪方法，本发明人已显示该处理导致了BCD细胞的特异性再分化，这与来自存在于胰岛制品中的其他细胞类型的细胞不同。在获自4个不同的人类供体的细胞中，再分化后C-肽阳性细胞的百分比为9.1±3.5％。因为β细胞占原代胰岛细胞群体的约40％(43±3％)，且BCD细胞的比例在扩增期间保持稳定，C-肽阳性细胞的百分比代表BCD细胞中约23％再分化。

使用了报告子RIP-DsRed2慢病毒以允许通过追寻活细胞中红色荧光的出现而优化再分化方案(图4)。该标记方法还允许在步骤2结束时分选再分化的胰岛素阳性细胞。DsRed2阳性细胞含胰岛素mRNA水平为人类胰岛中发现的胰岛素mRNA水平的52％(图5A)。人类C-肽含量为374±160ng/10⁶细胞，代表其在人类胰岛中的水平的8％(图5B)。胰岛素原含量为171±22ng/10⁶细胞，表示85.6％的胰岛素原被加工为成熟的胰岛素。

再分化方案重复地对来自所有供体的细胞起作用。显示响应于该处理的目前最近的传代为第12代，代表着4096倍扩增。

新点绿(NG)，已知与Zn⁺⁺离子结合的一种荧光染料，用于标记β细胞，β细胞在胰岛素囊泡中含Zn⁺⁺离子。已显示该染料与细胞生存力和功能完全相容。如图6A中所见，被标记的细胞可易于与未标记的细胞区分和通过FACS分选。分选导致胰岛素阳性细胞的大量富集(图6B)。

实施例2

BCD细胞再分化的条件的开发

材料和方法

细胞培养：

分离后2.8±1.2天收到人类胰岛。如通过双硫腙染色所确定的，胰岛纯度为83±9％。将来自单独的供体的胰岛(参见表1中的供体列表)分散为单细胞，如先前所描述(1-4)的标记β细胞并在含5.6mM葡萄糖和补充有10％FCS、青霉素(50单位/ml)和链霉素(50μg/ml)(均来自Gibco-Invitrogen)的CMRL 1066培养基(除另指明外，组织培养试剂来自Biological Industries，Israel)中扩增。

表1

在培养的前10天添加5μg/ml的两性霉素B。每周一次1∶2分开细胞。对于分化实验，用PBS洗涤附着的扩增的胰岛细胞并进行胰酶消化。用PBS洗涤细胞悬液，重悬于指定的培养基中，并以每em²3.2X10⁴细胞接种到超低附着平板中(Corning)。无血清培养基(SFM)由含5.6mM葡萄糖并补充有1％BSA级分V(Sigma)、1x ITS(Gibco-Invitrogen)、青霉素(50单位/ml)和链霉素(50μg/ml)的CMRL 1066组成。再分化混合物(RC)培养基由补充有D-葡萄糖(终浓度25mM)、1x N2补充物、1x B27补充物(均来自Stem Cell Technologies)、10mM烟酰胺(Sigma)、8nM exendin-4(Acris)、和8nM激活素A(Peprotech)的SFM组成。至少每48小时更换分化培养基。在含10％FCS(Gibco)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中维持原代人类成纤维细胞。如所描述的(5)分离和培养人类骨髓来源的间充质干细胞(BM-MSC)。

病毒产生和细胞感染：已描述了RIP-Cre/ER和pTrip-loxP-NEO-STOP-loxP-eGFP慢病毒载体(4)。SLUG shRNA(登录号TRCN-15389、-15388、-15390、-15391、-15392)和非靶标shRNA获自RNAi Consortium(Sigma-Aldrich)，全部被克隆到含有嘌呤霉素抗性基因的pLKO.1慢病毒载体中。如先前所描述的(4)产生病毒颗粒。简言之，将慢病毒载体质粒与pCMVdR8.91质粒和pMD2.G质粒共转染到293T细胞中，并每24小时收集细胞培养基，持续3天。在8μg/ml聚凝胺(Sigma-Aldrich)存在下感染细胞过夜。对于SLUG抑制实验，选择嘌呤霉素抗性(1μg/ml)的感染的细胞，持续3天。

细胞分选：利用FACS Aria cell sorter(Becton Dickinson，San Jose，CA)如所描述的(2、4)分选标记的细胞。

流式细胞术：用PBS洗涤附着的细胞和浮动细胞团，并在37℃下通过胰酶处理5-10分钟而将其分散。将细胞重悬于含2％FCS的PBS中并通过细胞过滤器过滤。利用FlowJo软件(Tree Star)在FACsort(BDBioscience)上进行流式细胞术。利用Cyflogic软件(Cyflogic)进行最终分析。在所有的实验中将未处理的细胞和无分化处理的感染的细胞用作对照。

细胞增殖和凋亡分析：对于BrdU掺入，在开始RC处理后第一天开始，用10μM BrdU(Sigma)孵育细胞7天。按照制造商的说明，利用TACS·XL凋亡检测试剂盒(R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN)通过TUNEL染色检测凋亡细胞的DNA碎片化。

qPCR分析：根据制造商的说明利用RNAeasy Plus Micro Kit(Qiagen)或利用Trizol(Sigma-Aldrich)提取总RNA，并用DNA-free(Ambion)处理以去除基因组DNA。利用High Capacity cDNA RT Kit(AppliedBiosystems)制备cDNA。利用TaqMan Universal PCR Master Mix(AppliedBiosystems)或Universal Probe Library Master Mix(Roche)在7300Real-time PCR System(Applied Biosystems)中以两个重复或三个重复进行qPCR。将结果相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和/或人类大核糖体蛋白(RPLPO)转录子标准化。引物序列列于表2中。

表2

所有反应在60℃时退火，进行40个循环。对于不可检测的转录子，将循环数设为40以用于比较。

DNA微阵列分析：根据制造商的方案，利用Trizol(Sigma-Aldrich)分离总RNA，并用DNA-free(Ambion)处理以去除基因组DNA。根据制造商的方案，进行与GeneChip Human Gene 1.0ST Arrays(Affymetrix)的杂交，洗涤并扫描。利用多次平均方法(multi-average method)将数据标准化。对不同的样品应用批次效应消除，然后进行单因素方差分析。通过皮尔逊差异相关性(Pearson′s dissimilarity correlation)和平均连锁法(average linkage method)利用Partek Genomics Suite软件进行聚类分析。

透射电子显微术：将细胞固定在含2.5％戊二醛(EMS)的PBS中，在4℃过夜。在PBS中洗涤几次之后，在4℃下在含1％OsO4(EMS)的PBS中后固定细胞，持续2小时。在梯度乙醇溶液中进行脱水，然后在缩水甘油醚中包埋。在Formvar/Carbon包被的格栅中固定薄切片并在Jeol1200EX透射电子显微镜中检验。利用SIS Megaview III相机和iTEM成像平台(Olympus)拍摄图像。

免疫荧光分析：将附着的细胞或细胞团胰酶消化并利用ShandonCytospin4离心机(Thermo Scientific)布点在载玻片上。在室温下在4％PFA中将所布点的细胞固定15分钟。使人类胰腺的石蜡切片再水化，并在染色前进行抗原修复。对于BrdU染色，将载玻片在1.5M HCl中孵育20分钟，然后在室温下在0.1M硼酸钠(pH8.5)中孵育10分钟，并在PBS中洗涤3次。将所有样品在由1％BSA、5％FGS和0.2％皂甙组成的封闭缓冲液中封闭＞10分钟。在封闭缓冲液中稀释一级抗体，并将样品在室温下孵育1小时或在4℃下过夜。然后在PBST中洗涤载玻片，并利用适当的与Alexa荧光团缀合的二级抗体(均来自Invitrogen，1∶1000)孵育40分钟。利用Leica SP5共聚焦显微镜拍摄图像。利用装备有NIS Elements相机和软件的Nikon显微镜拍摄荧光的活细胞的图像。利用小鼠抗GFP(Chemicon，1∶500)或兔抗GFP(Invitrogen，1∶1000)检测eGFP的表达。通过内源性荧光显现DsRed2。所用的其他一级抗体：小鼠抗人类C-肽(Biodesign，1∶200)、兔抗人类C-肽(Abcam，1∶100)、兔抗人类C-肽(BCBC，1∶1000)、小鼠抗胰高血糖素(Sigma，1∶2000)、兔抗生长激素抑制素(Dako，1∶400)、兔抗胰多肽(Dako，1∶200)、兔抗人类Ki67(Zymed，1∶50)、小鼠抗波形蛋白(Calbiochem，1∶50)、兔抗人类PDX1(Abcam，1∶500)、小鼠抗激素原转化酶1/3(Milipore，1∶1000)、小鼠抗IAPP(ThermoScientific，1∶30)、小鼠抗-NKX2.2(Hybridoma Bank74.5A5，1∶1000)、小鼠抗NKX6.1(由P.Serup惠赠，1∶1000)、兔抗SOX9(Chemicon，1∶200)、兔抗FOXA2(Abcam，1∶1000)、和小鼠抗BrdU(Chemicon，1∶100)。用DAPI(Sigma)染色DNA。

免疫印迹：通过将细胞在含1％NP40的蛋白酶抑制剂混合物中孵育10分钟来提取总蛋白。利用BCAProtein Assay Kit(Pierce)确定蛋白浓度。在SDS-PAGE凝胶上解析20μg蛋白。将凝胶电转染(electroblot)到Immobilon-P Transfer Membrane(Milipore)上，然后用兔抗SOX9(Chemicon，1∶200)或小鼠抗SLUG(Sigma，1∶50)孵育。使用小鼠抗肌动蛋白(Sigma，1∶2000)或小鼠抗HSC70(SantaCruz，1∶1000)监测凝胶上样。利用适当的辣根过氧化酶缀合的抗IgG和SuperSignal West Pico ChemiluminescentSubstrate(Pierce)显现结合的抗体。利用TINA软件进行定量。

原位杂交：如所描述的(6)，在胎儿胰腺的脱蜡的石蜡切片和细胞团的冷冻切片上进行原位杂交分析。将细胞团用PBS洗涤一次并在4℃下在含4％PFA的PBS中固定过夜。然后用PBS洗涤细胞团3次并转移到含30％蔗糖的PBS中，在4℃下持续48小时。将细胞团包埋在OCT中并快速冷冻。利用CM3050S cryostat(Leica)切割9μm切片并在室温下干燥过夜。利用引物5′-agggagaagcagaaggaacaag-3′(SEQ ID NO：53)和5′-cctaagagcgagttggcactg-3′(SEQ ID NO：54)从人类基因组DNA中扩增来自NGN3的第一个外显子的557bp片段。将PCR产物克隆到pMEG-T EasyVector系统(Promega)中，利用Sp6或T7聚合酶生成有义/反义探针并用地高辛配基标记。在55℃利用地高辛配基标记的探针(3μg/ml)进行杂交过夜。然后用RNA酶A处理载玻片，洗涤，并用10％正常山羊血清(NGS)封闭，并在4℃下在含0.1％Tween20的PBS(PBST，Sigma-Alrich)和1％NGS中与与碱性磷酸酶缀合的绵羊抗地高辛配基Fab片段(1：2500，Roche)孵育过夜。然后洗涤载玻片并在BM Purple(Roche)中复染。

胰岛素含量和分泌：将细胞团和胰岛转移到Eppendorf试管中并在Krebs-Ringer缓冲液(KRB)中预孵育1小时，然后在含0.5mM1-异丁基3-甲基黄嘌呤(IBMX)和16.7mM葡萄糖的KRB中孵育2小时。使用酸性醇(acidic alcohol)中的细胞提取物来确定C-肽含量。根据制造商的说明，利用超灵敏的ELISA试剂盒(Mercodia)定量人类C-肽水平(测定灵敏度为1.5pmol/L)。胰岛素和胰岛素原的测定交叉反应性分别为＜0.0006％和＜1.8％。根据制造商的方案利用胰岛素原ELISA试剂盒(Mercodia)定量人类胰岛素原水平(测定灵敏度为0.5pmol/L)。

绕计分析：利用双尾t检验和χ²检验确定显著性。为达到qPCR数据的正态分布，进行了对数变换。

结果

为检验扩增的胰岛细胞的分化能力，将细胞转移到无血清培养基(SFM)，先前已显示其诱导扩增的人类胰岛细胞的分化[2、3]。该处理导致在8天的孵育期中细胞团的形成(图7C)和胰岛素及其他β细胞转录子表达的适度的渐增(图7A)。为筛选诱导扩增的胰岛细胞进一步分化的剂，使用了含胰岛素启动子-DsRed2基因(RIP-DsRed2)的报告子慢病毒(图7B)。用该病毒感染未培养的胰岛细胞，该病毒稳定地整合到宿主基因组中，由于持续的胰岛素启动子活性，在培养的最初几天中在所有被感染的β细胞中表达荧光标志物。然而，在细胞扩增期间，快速去分化和胰岛素启动子活性的丢失，连同DsRed2的4.5天的半衰期，导致标志物消失(图7C)。扩增后，将胰岛细胞转移到含多种剂的SFM中，并通过评分荧光再现评价活细胞中的分化。基于对单独的剂和其组合的初步筛选，开发了两步分化方案。在步骤1中，将扩增的胰岛细胞转移到含25mM葡萄糖、1xN2、1x B27、1x ITS、8nM exendin-4、4nM激活素A和100μM烟酰胺的SFM中，持续6天。在步骤2中，将培养基更换为不含激活素A且含降低的葡萄糖浓度(5.6mM)的相同的培养基，持续2天。该处理(称作再分化混合物，RC)导致细胞团的形成，其与利用单独的SFM所观察到的相似(图7C)。然而，通过流式细胞术的定量显示了与SFM相比，RC处理中的DsRed2⁺细胞数目的6倍增加(图7D)。

由于扩增的胰岛细胞培养物代表几种细胞类型的非均质混合物，所观察到的分化可由去分化的BCD细胞的再分化或来源于其他来源的细胞的从头分化导致。为确定新生成的胰岛素表达细胞的细胞来源，本发明人利用了可诱导的谱系示踪方法(图7E)。如先前所描述的[12]，在他莫昔芬(TM)脉冲的存在下，通过利用RIP-Cre/ER和pTrip-loxP-NEO-STOP-loxP-eGFP慢病毒载体进行感染，在培养的前几天中对人类胰岛细胞中的BCD细胞进行标记。如图12中所见，Cre特异性地表达于C-肽⁺细胞中。分别用SFM或RC处理第4代或第6代的标记的胰岛细胞，并将分化的细胞对人类C-肽和eGFP染色。由于平均β细胞标记效率为57.5±8.9％[ii]，再分化情况中，C-肽/eGFP双阳性细胞的预期的发生率应为约50％，而在TM不存在时从头分化应导致0％的共标记。SFM处理后发现的双阳性细胞的实际发生率为60±16％，这与如果再分化为主要机制的预期值接近。然而，整体再分化率相对低，全部GFP⁺细胞的4.7±3.0％表达C-肽(总细胞的1-2％，与含血清的培养基中孵育的对照细胞中的＜0.05％相比较)。如利用单独的SFM所观察到的，RC处理后C-肽⁺细胞的大比例(38±17％)对eGFP共染色，表明在两种培养条件下C-肽⁺细胞的生成主要通过BCD细胞的再分化而发生。

再分化生成β-样细胞：利用RIP-DsRed2报告子构建体监测活细胞中的再分化表明该过程是逐步的，开始于处理的第二天(数据未示出)。RC处理的细胞在不同时间点的基因表达分析显示了胰岛素表达的渐增，其证实了荧光报告子的可靠性(图8A)。编码成熟的β细胞功能所必需的两种转录因子的PDX1和MAFA转录子，与胰岛素转录子相似地随时间而增加(图8A)。为确定C-肽⁺细胞出现的动力学，每隔一天用作为成熟β细胞的标志物的C-肽和PDX1共染色用RC处理的细胞。如在图8B中所见的，双阳性的细胞的数目随时间增加。该发现支持了再分化过程的随机激活，而非进一步成熟后同步发生的最初启动。在第6天，总细胞的10.9±3.7％的分化率达到顶峰，并且在第8天前不再增加。该比率比利用单独的SFM获得的高5-10倍。假设扩增的细胞的群体中BCD细胞的比例为～40％[11]，该效率代表BCD细胞的～25％再分化。在RC处理8天后，β细胞转录因子HBLX9、NEUROD、NKX2.2和NKX6.1的转录子也被强烈诱导(图8C)。此外，与未处理的细胞相比，对于胰岛素成熟和分泌重要的KIR6.2、SUR1、GCK、IAPP和PC1/3的转录子显著上调。再分化的细胞的大部分共表达C-肽和β细胞功能必需的蛋白，包括PDX1(93±1％)、NKX2.2(65±19％)、NKX6.1(55±3％)、IAPP(47±9％)和PC1/3(68±14％)。基因表达的微阵列分析显示，RC处理诱导了扩增的胰岛细胞中朝向未培养的胰岛细胞的表型的总体表型改变，如通过层级聚类分析所显示的(图8E)。然而，RC处理的样品仍与胰岛细胞显著不同。该差异可能由用RC处理获得的部分再分化(BCD细胞的～25％)所引起。在RC中孵育原代人类成纤维细胞或骨髓来源的间充质干细胞(BM-MSC)不会导致可检测的胰岛素或PDX1转录子，进一步支持了BCD细胞的特异性再分化能力。

为更加详细地表征再分化的细胞，用RC孵育携带RIP-DsRed2报告子基因的扩增的胰岛细胞。8天后将形成的细胞团分散，对细胞进行FACS分选和表征。分选的DsRed2⁺细胞的qPCR分析检测了胰岛素转录子的水平平均为分离的人类胰岛中存在的那些的50％(图9A)。与未分选的再分化的细胞相比较，这些水平代表约19倍的富集，且比未处理的对照细胞高13,300倍(图9A)。PDX1和MAFA转录子的水平与人类胰岛中的那些相当(图9A)。此外，分选的再分化的细胞贮存了分离的人类胰岛中发现的C-肽水平的10％(图9B)。如通过人类胰岛素原特异性ELISA所判断的，胰岛素的大部分(～91％)被加工，该ELISA显示仅9％胰岛素原。当用16.7mM葡萄糖和0.5mM1-异丁基3-甲基黄嘌呤(IBMX)激发再分化的细胞时，与用分离的人类胰岛获得的3倍增加相比，检测到胰岛素释放的2倍增加(图9C)。通过电子显微镜分析检测了典型的胰岛素囊泡，虽然与人类胰岛中的那些相比致密中心胰岛素结晶显得较小(图9D)。

再分化与MET(间充质细胞-上皮细胞转变)相关：因为在培养初始期间β细胞经历EMT(上皮细胞-间充质细胞转变)，本发明人研究了BCD细胞再分化是否与反向MET过程相关。qPCR分析显示了EMT效应物SLUG(SNAI2)的转录子和蛋白二者在去分化期间的显著上调，和在RC诱导的再分化期间小但显著的下调(图10A-C)。相比之下，参与EMT的两种其他转录因子，SNAIL(SNAI1)的表达(图10A、C)和TWIST的表达(数据未示出)未发现显著变化。上皮标志物E-钙粘蛋白的转录子在RC处理后显著上调，而编码间充质细胞标志物N-钙粘蛋白的那些显著降低了(图10D)。此外，虽然几乎所有扩增的胰岛细胞对于间充质细胞标志物波形蛋白呈阳性染色，再分化后，C-肽⁺细胞是波形蛋白阴性的，且波形蛋白⁺细胞在细胞的群体中的发生率从98±2％下降到81±9％(图10E)。还发现了对两种标志物均呈阴性的细胞，其可代表关闭波形蛋白表达但尚未激活胰岛素表达的细胞(图10E)。这些数据表明再分化的BCD细胞确实从间充质细胞表型转变为上皮细胞表型。

再分化的细胞对于增殖标志物Ki67的染色没有检测到阳性细胞，表明响应于RC处理的细胞分化伴随着生长阻滞(数据未示出)。为进一步验证该可能性，在BrdU存在下(在8天中持续7天)，利用RC使扩增的胰岛细胞分化。尽管在常规扩增培养基中生长的对照细胞容易地掺入BrdU，在分化的8天全过程之后，在来自3个独立的供体的培养物中未发现BrdU阳性的细胞。此外，如通过TUNEL测定所确定的，在RC处理的全过程后，仅极少的细胞(基于在3个供体的每个中计数＞500个细胞的0.9±0.6％)凋亡(数据未示出)。

为进一步研究SLUG下调在BCD细胞再分化中的作用，除RC处理诱导的小的降低(38±6％)之外，使用两种SLUG shRNA来降低SLUG表达。利用SLUG shRNA慢病毒感染扩增的胰岛细胞使SLUG蛋白水平降低了～70％(图10G)。与利用乱序的shRNA相比，当与RC处理组合时，两种不同的SLUG shRNA分别刺激了胰岛素转录水平12.4倍和5.5倍(图10H)，验证了SLUG下调对于BCD细胞再分化的重要性。

BCD细胞产生了表达其他胰岛激素的细胞：除失去胰岛素表达之外，扩增的胰岛细胞的群体无表达另外3种主要的胰岛激素-胰高血糖素、生长激素抑制素和胰多肽的细胞(数据未示出)。RC处理导致了在～2％的处理的细胞中对这些激素中的每一种的免疫染色的出现(图11A)。未检测到激素共表达。为确定这些细胞的来源，用RC处理eGFP标记的扩增的细胞8天并对eGFP和4种胰岛激素共染色。如图11A中所见，激活了胰岛激素表达的eGFP⁺细胞的绝大部分(91.8％)再分化为C-肽⁺细胞。然而，其中的小部分反而表达另外的胰岛激素之一，最显著的是生长激素抑制素(6.5％)。这些分析表明，表达胰岛激素而非胰岛素的细胞的至少部分来源于BCD细胞，提出了再分化中的BCD通过胰岛祖细胞-样阶段转变的可能性。对扩增的胰岛细胞的胰腺祖细胞转录因子和胰岛祖细胞转录因子的分析未检测到PTF1A、TCF2和PAX4的表达(Ct＞40)，并显示了SOX9、FOXA2和ARX转录子的低的但可检测的水平。在RC诱导的再分化后，显著诱导了这些因子中的一些的表达。因此，SOX9转录子上调了4倍(图11B)，且在RC处理的2天中全部扩增的胰岛细胞中的＞20％变为SOX9⁺(图11C)。此外，在该处理期间FOXA2、PAX4和ARX显著上调了(图13A-B)。可检测到共表达SOX9和波形蛋白的细胞，然而，SOX9和C-肽表达是互斥的(图11D)，表明在再分化和MET期间SOX9的瞬时激活。SOX9转录子水平被SLUG shRNA刺激了5倍(图11E)，表明SOX9表达在MET的下游。RC处理后未能检测到CK19阳性细胞或淀粉酶阳性细胞(数据未示出)，表明扩增的胰岛细胞不产生导管样或腺泡样细胞。

NGN3的表达不能通过qPCR重复地检测到。然而，检测到NGN3的直接靶标INSM1[13]的转录子的显著增加(图14)，表明了NGN3表达。在不存在可信的NGN3抗体下，进行了原位杂交以揭示NGN3⁺细胞的可能的存在。该分析显示了在RC处理的第2天的极少的NGN3⁺细胞，和在第4天、第6天和第8天渐增的数目(图11F)，表明在BCD细胞再分化期间通过NGN3⁺阶段的转变。在未用RC处理的扩增的胰岛细胞中未检测到NGN3⁺细胞。总之，这些发现表明BCD细胞再分化经历类胰岛素祖细胞-样阶段进行，其可允许低比率地分化为除产胰岛素细胞外的其他胰岛细胞类型，尤其是发育相关的表达生长激素抑制素的细胞。在培养中的原代胰岛细胞适应增殖期间检测到SOX9瞬时激活(图11G、H)，表明细胞去分化还通过类祖细胞阶段转变。

讨论

本文所呈现的结果，呈现了用于以两步扩增来自成体人类胰岛的产胰岛素细胞的方法，第一步包括将包含～40％去分化的BCD细胞的混合的胰岛细胞的群体扩增至高达16次群体倍增，然后第二步为扩增的胰岛细胞群体中的BCD细胞的特异性再分化。所用的RC处理在来自所试验的所有人类供体的细胞中实现了显著地可重复的分化。这些条件诱导了扩增的细胞的深刻表型变化，其包括多种基因的激活和关闭。谱系示踪表明，这些培养中的新生成的产胰岛素细胞的主要来源是BCD细胞的再分化。混合的胰岛细胞培养物可包含从最初存在于胰岛制备物中的间充质干细胞(MSC)扩增的细胞[14]；然而，本发明人未能在非BCD间充质细胞类型诸如成纤维细胞或BM-MSC中利用RC处理诱导胰岛素表达。去分化的BCD细胞的特定的再分化能力可通过允许的(permissive)表观遗传状态(“表观遗传记忆”)来解释。因此，β细胞基因可以是表达平衡的，而其转录的缺乏可能反映了转录激活子和抑制子、和/或其他染色质修饰之间的异常平衡。再分化培养基中的培养条件可恢复合适的平衡，而不需大量的表观遗传修饰。

在暴露于RC处理之后，BCD细胞耗尽了存在于扩增培养基的血清中的生长因子，导致生长阻滞。然而生长阻滞本身不足以诱导扩增的胰岛细胞的再分化，如通过诱导生长阻滞而不分化的细胞周期抑制物p57的过表达所证明的。血清的缺乏还刺激了细胞聚集为胰岛样团，其可能有助于BCD细胞再分化所需的细胞构象的形成和细胞间接触。

如通过基因表达的变化和通过利用shRNA抑制EMT效应物SLUG后显现的再分化的刺激所判断的，BCD细胞再分化涉及MET。ECAD表达的恢复使β细胞基因的激活所需要的正常的细胞间接触复原是可能的。换言之，参与EMT的转录因子可作为β细胞基因表达的抑制子起作用。

用RC的处理诱导了第5代-第7代的所有BCD细胞的高达25％的再分化。这代表与未培养的胰岛相比较，产胰岛素细胞的数量的8-32倍净增加。

本发明人在所分析的最近传代(第11代)的β细胞基因中发现了开放染色质痕迹。当与未处理的细胞相比时，在第12代(代表高达4096倍扩增)被诱导再分化的BCD细胞显示了胰岛素转录子的增加，这与较早传代中所观察到的相当。

生长激素抑制素阳性的细胞和较小程度的胰高血糖素阳性细胞和胰多肽阳性细胞从BCD细胞的生成表明，再分化涉及通过胰岛祖细胞-样阶段的转变。再分化期间胰岛祖细胞典型的转录因子，包括SOX9、FOXA2、PDX1、NGN3、PAX4和ARX，其表达的激活支持了该可能性。然而，通过RC处理从BCD细胞生成的主要的产激素细胞类型是胰岛素阳性的细胞(91.8％)，其次是生长激素抑制素阳性的细胞(6.5％)，以及小比例的胰高血糖素阳性的细胞和胰多肽阳性的细胞(分别为1.2％和0.5％)。有兴趣的是推测表观遗传记忆指导这些暂时的胰岛祖细胞样细胞回到其来源的细胞类型，及一些“泄漏”为发育相关的生长激素抑制素阳性的细胞。该培养系统可提供人类胰岛祖细胞发育的有吸引力的模型，其中可验证从小鼠基因敲除模型阐明的转录因子激活的级联反应。

实施例2的参考文献

1.Hayek A，Beattie GM，Cirulli V，Lopez AD，Ricordi C，Rubin JS.Growth factor/matrix-induced proliferation of human adult beta-cells.Diabetes1995.44：1458-1460.

2.Gershengorn MC，Hardikar AA，Wei C，Geras-Raaka E，Marcus-Samuels B，Raaka BM.Epithelial-to-mesenchymal transition generatesproliferative human islet precursor cells，Science 2004.306：2261-2264.

3.Lechner A，Nolan AL，Blacken RA，Habener JF.Redifferentiation ofinsulin-secreting cells after in vitro expansion of adult human pancreatic islettissue.Biochem Biophys Res Commun 2005.327：581-588.

4.Ouziel-Yahalom L，Zalzman M，Anker-Kitai L，Knoller S，Bar Y，Glandt M，Herold K，Efrat S.Expansion and redifferentiation of adult humanpancreatic islet cells.Biochem Biophys Res Commun 2006.341：291-298.

5.Parnaud G，Bosco D，Berney T Pattou F，Kerr-Conte J，Donath MY，Bruun C，Mandrup-Poulsen T，Billestrup N，Halban PA.Proliferation of sortedhuman and rat beta cells.Diabetologia 2008.51：91-100

6.Meier JJ，Bhushan A，Butler AE，Rizza RA，Butler PC.Sustainedbeta-cell apoptosis in patients with long-standing type 1 diabetes：indirectevidence for islet regeneration？Diabetologia 2005.48：2221-2228.

7.Butler AE，Janson J，Bonner-Weir S，Ritzel R，Rizza RA，Butler PC.Beta cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with tyPe 2diabetes.Diabetes 2003.52：102-110.

8.Meier JJ，Butler AE，Saisho Y，Monchamp T，Galasso R，Bhushan A，Rizza RA，Butler PC.Beta-cell replication is the primary mechanismsubserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans.Diabetes 2008.57：1584-1594.

9.20.Nielsen JH，Brunstedt J，Andersson A，

C.Preservation of beta cell function in adult human pancreatic islets for severalmonths in vitro.Diabetologia 1979.16：97-100.

10.Nielsen JH，Galsgaard ED，

A，Friedrichsen BN，Billestrup N，Hansen JA，Lee YC，Carlsson C.Regulation of beta-cell mass by hormones andgrowth factors.Diabetes 2001.50(增刊1)：S25-S29.

11.Russ HA，Bar Y，Ravassard P，Efrat S.In vitro proliferation of cellsderived from adult human beta cells revealed by cell-lineage tracing.Diabetes2008.57：1575-1583.

12.Russ HA，Ravassard P，Kerr-Conte J，Pattou F，Efrat S.Epithelial-mesenchymal transition in cells expanded in vitro fromlineage-traced adult human pancreatic beta cells.PLoS ONE 2009.4：e6417.

13.Mellitzer G，BonnéS，Luco RF，Van De Casteele M，Lenne-Samuel N，Collombat P，Mansouri A，Lee J，Lan M，Pipeleers D，Nielsen FC，Ferrer J，Gradwohl G，Heimberg H.IAl is NGN3-dependent and essential fordifferentiation of the endocrine pancreas.EMBO J2006.25：1344-1352.

14.Davani B，Ikonomou L，Raaka BM，Geras-Raaka E，Morton RA，Marcus-Samuels B，Gershengorn MC.Human islet-derived precursor cells aremesenchymal stromal cells that differentiate and mature to hormone-expressingcells in vivo.Stem Cells 2007.25：3215-3222.

15.Smukler SR，Arntfield ME，Razavi R，Bikopoulos G，KarpoWicz P，Seaberg R，Dai F，Lee S，Ahrens R，Fraser PE，Wheeler MB，van der Kooy D.The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells thatexpress insulin.Cell Stem Cell 2011.8：281-293.

材料和方法的参考文献

1.Ouziel-Yahalom L，Zalzman M，Anker-Kitai L，Knoller S，Bar Y，Glandt M，Herold K，Efrat S.Expansion and redifferentiation of adult humanpancreatic islet cells Biochem Biophys Res Commun 2006.341：291-298.

2.Russ HA，Bar Y，Ravassard P，Efrat S.In vitro proliferation of cellsderived from adult human beta cells revealed by cell-lineage tracing.Diabetes2008.57：1575-1583.

3.Bar Y，Russ HA，Knoller S，Ouziel-Yahalom L，Efrat S.HES1 isinvolved in adaptation of adult human beta cells to proliferation in vitro.Diabetes 2008.57：2413-2420.

4.Russ HA，Ravassard P，Kerr-Conte J，Pattou F，Efrat S.Epithelial-mesenchymal transition in cells expanded in vitro fromlineage-traced adult human pancreatic beta cells.PLoS ONE 2009.4：e6417.

5.Karnieli O，Izhar-Prato Y，Bulvik S，Efrat S.Generation ofinsulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells bygenetic manipulation.Stem Cells 2007.25：2837-2844.

6.Yaron O，Farhy C，Marquardt T，Applebury M，Ashery-Padan R.Notchlfunctions to suppress cone-photoreceptor fate specification in the developingmouse retina.Development 2006.133：1367-1378.

虽然已结合其具体的实施方案描述了本发明，明显地是，许多替代形式、更改形式和变化形式对于本领域技术人员是明显的。因此，意在涵盖落入所附权利要求书的精神和宽泛的范围中的所有这样的替代形式、更改形式和变化形式。

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用全文并入本说明书，其程度如同每个独立的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入本文。此外，本申请中对任何参考文献的引用或标识不应解释为承认该参考文献可作为本发明的现有技术而获得。就章节标题来说，它们不应被解释为必要的限制。

Claims (51)

1.一种离体提高表达SLUG的祖细胞中的胰岛素含量的方法，所述方法包括下调所述祖细胞中的所述SLUG的量或活性，从而提高所述祖细胞中的胰岛素含量。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述祖细胞选自由去分化的成体胰岛β细胞、间充质干细胞和从β细胞去分化的诱导性多能干细胞组成的组。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述下调通过利用多核苷酸剂来进行。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述下调通过利用针对所述SLUG的抗体来进行。

5.如权利要求3所述的方法，其中所述多核苷酸剂包括针对所述SLUG的siRNA剂或shRNA剂。

6.如权利要求2所述的方法，其中所述下调通过将所述去分化的成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺、exendin-4、激活素A和葡萄糖的培养基来进行，所述培养基不含血清。

7.如权利要求6所述的方法，包括：

(a)将所述成体胰岛β细胞暴露于含所述烟酰胺、所述exendin-4、所述激活素A的培养基，其中所述葡萄糖以10-100mM的浓度存在；和随后

(b)将所述成体胰岛β细胞暴露于含所述烟酰胺和所述exendin-4的另外的培养基，其中所述葡萄糖以0.5-10mM的浓度存在。

8.如权利要求6或7所述的方法，其中所述烟酰胺以1-100mM的浓度存在。

9.如权利要求6或7所述的方法，其中所述exendin-4以1-100mM的浓度存在。

10.如权利要求6或7所述的方法，其中所述激活素A以1-100nM的浓度存在。

11.如权利要求7所述的方法，其中所述另外的培养基不含激活素A。

12.如权利要求6或7所述的方法，其中所述培养基不含β细胞素。

13.如权利要求7所述的方法，其中所述另外的培养基不含β细胞素。

14.如权利要求2或6所述的方法，其中所述去分化的成体胰岛β细胞通过培养所述成体胰岛β细胞至少10代而生成。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述培养在CMRL培养基中进行。

16.如权利要求7所述的方法，还包括在步骤(a)之前扩增所述胰岛β细胞。

17.如权利要求7所述的方法，其中步骤(a)进行6天。

18.如权利要求7所述的方法，其中步骤(b)进行2天。

19.如权利要求7所述的方法，还包括在步骤(b)之后分离所述成体胰岛β细胞。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述分离利用锌结合染料来进行。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述锌结合染料包括新点绿。

22.如权利要求19所述的方法，其中所述分离利用抗NCAM抗体来进行。

23.如权利要求2所述的方法，其中用胰酶消化所述去分化的成体胰岛β细胞。

24.一种离体提高成体胰岛β细胞中的胰岛素含量的方法，所述方法包括将所述成体胰岛β细胞暴露于含烟酰胺、exendin-4、激活素A和葡萄糖的培养基，所述培养基不含血清，从而提高所述成体胰岛β细胞中的胰岛素含量。

25.如权利要求24所述的方法，包括：

(a)将所述成体胰岛β细胞暴露于含所述烟酰胺、所述exendin-4、所述激活素A的培养基，其中所述葡萄糖以10-100mM的浓度存在；和随后

(b)将所述成体胰岛β细胞暴露于含所述烟酰胺和所述exendin-4的另外的培养基，其中所述葡萄糖以0.5-10mM的浓度存在。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述烟酰胺以1-100mM的浓度存在。

27.如权利要求24所述的方法，其中所述exendin-4以1-100nM的浓度存在。

28.如权利要求24所述的方法，其中所述激活素A以1-100nM的浓度存在。

29.如权利要求25所述的方法，其中所述另外的培养基不含激活素A。

30.如权利要求24所述的方法，其中所述培养基不含β细胞素。

31.如权利要求25所述的方法，其中所述另外的培养基不含β细胞素。

32.如权利要求24所述的方法，其中所述成体胰岛β细胞包括去分化的成体胰岛β细胞。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述去分化的成体胰岛β细胞包括从β细胞生成的诱导性多能干细胞。

34.如权利要求32所述的方法，其中所述去分化的成体胰岛β细胞通过培养所述成体胰岛β细胞至少10代而生成。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述培养在CMRL培养基中进行。

36.如权利要求25所述的方法，还包括在步骤(a)之前扩增所述胰岛β细胞。

37.如权利要求25所述的方法，其中步骤(a)进行6天。

38.如权利要求25所述的方法，其中步骤(b)进行2天。

39.如权利要求25所述的方法，还包括在步骤(b)之后分离所述成体胰岛β细胞。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述分离利用锌结合染料来进行。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述锌结合染料包括新点绿。

42.如权利要求39所述的方法，其中所述分离利用抗NCAM抗体来进行。

43.如权利要求24所述的方法，其中用胰酶消化所述成体胰岛β细胞。

44.如权利要求24所述的方法，还包括将所述成体胰岛β细胞与下调SLUG的量或活性的剂接触。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述接触在所述暴露之后进行。

46.一种细胞的分离的群体，包含下调SLUG的siRNA，其中所述细胞分泌胰岛素。

47.一种细胞的分离的群体，根据权利要求24-45中任一项所述的方法生成。

48.一种在受治疗者中治疗糖尿病的方法，所述方法包括将治疗有效量的权利要求46或47所述的成体胰岛β细胞的群体移植到所述受治疗者中，从而治疗糖尿病。

49.权利要求46或47所述的成体胰岛β细胞的群体用于在受治疗者中治疗糖尿病的用途。

50.如权利要求46或47所述的分离的成体胰岛β细胞的群体，所述成体胰岛β细胞经遗传修饰以表达药剂。

51.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求46或47所述的成体胰岛β细胞的群体作为活性成分和药学上可接受的运载体。

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