KR20160058822A - 약물 스크리닝 및 근위축성 측삭 경화증 (ａｌｓ) 의 치료에서 사용하기 위한 인간 다능성 줄기 세포로부터의 성상세포의 유도 분화 - Google Patents

약물 스크리닝 및 근위축성 측삭 경화증 (ａｌｓ) 의 치료에서 사용하기 위한 인간 다능성 줄기 세포로부터의 성상세포의 유도 분화 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체외 분화된 다능성 줄기 세포 (PSC) 를 사용하여 인간 성상세포 기능에 영향을 미치는 물질을 확인하는 방법을 공개한다. 게다가, 인간 대상에서 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 의 치료를 위한, 인간 선조 성상세포 또는 인간 성상세포의 용도가 또한 공개된다.

Description

약물 스크리닝 및 근위축성 측삭 경화증 (ＡＬＳ) 의 치료에서 사용하기 위한 인간 다능성 줄기 세포로부터의 성상세포의 유도 분화 {DIRECTED DIFFERENTIATION OF ASTROCYTES FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS FOR USE IN DRUG SCREENING AND THE TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)}
본 발명은, 일부 구현예에서, 생체외 분화된 다능성 줄기 세포 (pluripotent stem cell) (PSC) 를 사용하여 인간 성상세포 기능에 영향을 미치는 물질을 확인하는 방법에 관한 것이다. 게다가, 근위축성 측삭 경화증 (Amyotrophic Lateral Sclerosis) (ALS) 의 치료를 위한 인간 성상세포의 용도가 또한 제공된다.
ALS 는 운동 뉴런 (motor neuron) (MN) 질환이며 상위 및 하위 MN 의 상실을 특징으로 한다 (Moloney et al., Front Neurosci 2014, 8:252). ALS 는 미국에서 대략 30,000 명의 개체, 전세계적으로 약 150,000 명의 환자 및 이스라엘에서 대략 400 명의 개체에게서 발생한다. ALS 사례의 5-10% 는 가족성 ALS 이지만, ALS 사례의 대부분은 산발성으로 원인 불명이다. ALS-연관 돌연변이 인간 SOD1 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스 및 랫트는 인간 질환의 많은 특색들을 재현한다. 지금까지, 수명만 최대 3 개월까지 연장하는 하나의 FDA-승인된 화합물, Rilutek (Riluzole) 을 제외하면 효과적인 치료제가 이용가능하지 않다는 점에 주목하는 것이 중요하다.
ALS 는 이미 상당한 세포 상실이 발생한 시점에 진단된다. MN 의 엑손의 길이는 1 미터 이하이다. MN 의 엑손은 세포체를 그것의 표적인, 근육에 연결한다. MN 대체 요법 후에 기능적 연결을 적절히 재설계하고 보장하는 능력은 여전히 벅찬 업무이며 미심쩍은 결과를 낳고, 지금까지 이것이 인간에서 가능할 것이라는 점에 대해 증거가 없다. 그러므로, 추가적인 세포 상실을 면하려는 시도는 MN 생존 및 환자의 삶의 질 및 진단후 수명에 상당한 영향을 미칠 것이다.
그러나, ALS 에서의 세포 이상은 MN 에 국한되지 않는다. ALS 환자, 산발성 ALS (sALS) 및 가족성 ALS (fALS) 둘 모두에서 성상세포 기능장애가 많이 관찰된다. ALS 환자로부터의 성상세포와 정상 운동 뉴런의 시험관내 공배양은 운동 뉴런의 죽음을 가속화하는 것 같다.
따라서 이들 결핍을 다루는 인간 PSC 세포로부터 증식 및 확장된 인간 성상세포를 생산할 필요가 널리 인식되고 있다.
본 발명의 하나의 양상에 따르면, 하기 단계를 포함하는, 운동 뉴런 질환 (MND), 예컨대 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법이 제공된다:
(a) 다능성 줄기 세포 (PSC) 로부터 생체외 분화된 성상세포의 집단을 물질과 접촉시키는 단계;
(b) 단계 (a) 의 성상세포의 집단 또는 그의 조건 배지 (conditioned medium) 를 뉴런의 집단과 공배양하는 단계; 및
(c) 뉴런의 집단의 생존 또는 신경 기능을 향상시키는 상기 물질의 효과를 정량화하는 단계.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 뉴런의 집단은 산화 스트레스 하에, 글루타메이트 독성 하에 또는 글루타메이트/NMDA/AMPA/카이네이트 독성 하에 저산소성이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 성상세포 대 뉴런의 집단의 비율은 1:1, 10:1, 100:1, 1000:1, 또는 10,000:1 초과이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 성상세포는 GFAP, GLAST, AQP4 각각, 또는 그들의 조합을 발현한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 성상세포는 BDNF, GDNF 및 VEGF 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 신경영양 인자의 분비를 나타낸다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 산화 스트레스는 반응성 산소 종 (reactive oxygen species) (ROS), 과산화수소 (H2O2), 및 그의 임의의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 세포자멸사 중인 뉴런의 수를 계수함으로써 정량화가 수행된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 뉴런의 세포자멸사는 Caspase-3a 라벨링, Annexin V, Tubulin-B3, HB9 또는 DAPI 에 의해 탐지된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 물질은 소분자이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 정상 인간 선조 성상세포 또는 성상세포는 운동 뉴런 죽음을 방지하는 환경을 제공할 것이다.
본 발명의 또다른 양상에 따르면, ALS 진행의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상에서 ALS 진행의 치료 또는 예방 방법으로서, 다능성 줄기 세포 (PSC) 로부터 생체외 분화된 인간 선조 성상세포 (human progenitor astrocyte) (hAPC) 또는 성상세포를 그것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 투여는 그것을 필요로 하는 대상의 뇌척수액, 뇌 또는 척수 실질로 향한다.
본 발명의 일부 구현예의 하나의 양상에 따르면 활성 물질로서의 본 발명의 세포 집단, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 세포 집단은 유전자 조작되지 않는다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 인간 선조 성상세포 또는 성상세포는 상기 대상에게 비-자가이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 인간 선조 성상세포 또는 성상세포는 상기 대상에게 동종이계이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, ALS 를 치료하는 것으로 확인된 약제의 제조를 위한, 다능성 줄기 세포 (PSC) 로부터 생체외 분화된 인간 선조 성상세포 또는 성상세포의 용도가 제공된다.
다르게 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및/또는 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사 또는 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 구현예의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적 방법 및/또는 재료가 아래 기재되어 있다. 상충하는 경우에, 정의를 포함하여, 특허 명세서가 우선할 것이다. 게다가, 재료, 방법, 및 실시예는 오직 설명적이고 반드시 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 만들어진 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 포함하는 이 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청에 따라 필요한 수수료의 납부 후에 청에 의해 제공될 것이다.
본 발명의 일부 구현예는 오직 예로서 첨부된 도면 및 이미지를 참조하여 본원에 기재되어 있다. 이제 도면을 구체적으로 상세히 참조하여, 제시된 명세는 예이고 본 발명의 구현예의 설명적 논의를 목적으로 하는 것이라는 점이 강조된다. 이와 관련하여, 명세서는 도면과 함께 통상의 기술자에게 어떻게 본 발명의 구현예가 실시될 수 있는지를 명백하게 해준다.
도면에서:
도 1 은 hESC 유래 성상세포에 의한 성상세포 계통 유전자 발현의 동역학을 보여준다. 각각의 유전자에 관해 day 0, 7, 14, 21, 28 및 35 의 발현이 제시되어 있다. 인간 성체 및 태아 뇌를 대조군으로서 사용했다. 다음 색상 오렌지색, 파란색, 초록색, 노란색, 빨간색 및 밝은 파란색은 GFAP, BDNF, PDGFRα, GLAST, GDNF 및 ALDH1L1 각각의 유전자 발현 동역학을 나타낸다. 각각의 유전자에 관하여 태아 뇌 발현이 기준 유전자로서의 역할을 했다 (상대적 정량화 (Relative Quantification), RQ=1).
도 2A-C 는 hESC 유래 성상세포가 성상세포 마커를 발현하는 것을 보여준다. A. CD44, B. CXCR4 및 C. GLAST 를 day 0, 7, 14, 21, 28, 35 및 43 에 FACS 에 의해 측정했다. PDGF 및 CNTF 는 APC 구속 및 분화를 촉진하는 것으로 알려진 인자이다. hESC-APC 분화에 대한 무처리 (non-treated) (NT), PDGF, CNTF 및 PDGF+CNTF 처리의 효과를 시험했다 (마커 발현의 %). 파란색 선: NT, 빨간색 선: CNTF, 초록색 선: CNTF+PDGF 및 밝은 파란색: PDGF. hPSC 유래 성상세포 프로토콜에 의해 수득되는 집단은 성상세포의 농축 집단을 초래한다.
도 3A-E 는 hESC 유래 성상세포가 성숙한 성상세포의 마커를 발현하는 것을 보여준다. A. GFAP 양성 세포의 그레이 레벨. B. GLAST 양성 세포의 그레이 레벨. C. A+B 의 오버레이 몽타주 이미지, 빨간색은 GFAP 양성 세포이고, 초록색은 GLAST 양성 세포이고, 파란색은 Dapi 양성 세포이다. 노란색 염색은 GFAP 및 GLAST 에 대한 동시-염색을 나타낸다. D. C 인서트의 확대 (노란색 염색에 관해 동일한 언급). E. 초록색은 Aquaporin-4 양성 세포 (AQP4) 이고, 빨간색은 GLAST 양성 세포이다. A-C 및 E 스케일 바: 100㎛ 및 D 스케일 바: 30㎛.
도 4A-C 는 hPSC 유래 성상세포가 신경영양 인자를 생산 및 분비하는 것을 보여주며, 이들은 각각 세포 내용물에서 및 성상세포 활성화 후에 배지에서 측정된다. A. GDNF 세포 내용물 및 IFN-γ 활성화 후의 분비 (빨간색). B. BDNF 세포 내용물 및 IFN-γ 활성화 후의 분비 (오렌지색). C. VEGF 세포 내용물 및 LPS 활성화 후의 VEGF 분비 (자주색).
도 5A-B 는 hESC 유래 성상세포에 의한 500μM 및 2mM 글루타메이트 흡수의 동역학을 보여준다. A. 왼쪽에서부터 오른쪽으로 (초록색 막대): 분화의 day 100 에 hESC 유래 성상세포에 500μM 글루타메이트의 첨가 후 0', 10', 30', 60' 90' 및 120'. 밝은 빨간색 막대: 1st 음성 대조군, 60' 후 성상세포의 존재 없이 500μM 글루타메이트를 포함하는 배지. 어두운 빨간색 막대: 2nd 음성 대조군, 120' 후 인간 섬유아세포를 성장시킨 배지 중 글루타메이트의 수준. 오른쪽 막대 (파란색): 양성 대조군, 인간 척수 유래 성상세포를 성장시킨 배지 중 글루타메이트의 수준. B. 왼쪽에서부터 오른쪽으로 (밝은 초록색 막대): 분화의 day 100 에 hESC 유래 성상세포에 2mM 글루타메이트의 첨가 후 0', 10', 30', 60' 90' 및 120'. 파란색 막대: 음성 대조군, 성상세포의 존재 없이 60' 후 2mM 글루타메이트를 포함하는 배지.
도 6A-D 는 산화 스트레스 하의 운동 뉴런에 대한 인간 PSC 유래 성상세포의 신경보호 효과를 보여준다.
A. MN 를 6 시간 동안 H2O2 (50μM 및 150μM) 로 보충하거나 처리하지 않고 놔두었다. 이 기간 동안 MN 을 단독으로 놔두거나 성상세포 상청액 (24 hour 조건 배지) 또는 성상세포로 보충했다. A: H2O2 로 보충하지 않은 MN 중 %Caspase-3a 는 회색 막대 (오른쪽) 로 표시되어 있다. H2O2 단독과 함께 인큐베이션된 MN 중 %Caspase-3a 는 빨간색 (50μM H2O2) 및 올리브 초록색 막대 (150μM H2O2), 성상세포 조건 배지의 첨가 후에 오렌지색 및 엷은 초록색 막대, 성상세포의 존재 하에 핑크색 및 엷은 초록색 막대로 표시되어 있다. B 및 C. Caspase-3 활성화 (빨간색). 운동 뉴런은 beta3 튜뷸린 (초록색) 으로 염색되고 핵은 DAPI 로 염색되어 있다. D. 이미지 정량화 및 분석에 사용된 하이 컨텐트 분석 (high content analysis) 장치의 이미지.
도 7A-C 는 인간 선조 성상세포 (hAPC) 의 주입이 hSOD1 마우스의 생존을 증가시켰음을 보여준다. A. 두 개의 시점 (day 130 및 day 140) 에서 hSOD1 마우스의 생존을 비교하는 표. "day7" 세포 (7 일 동안 성장 인자의 부재 하에 성장시킴) 를 이식한 마우스의 생존이 증가했으며 이는 day140 에서 보여진다. B. 모든 실험 군을 비교하는 Kaplan-Meir 생존 그래프. C. 모든 실험 군을 비교하는 Rotarod<106 에 의해 측정되는 질환 발생에 관해 생성된 Kaplan-Meier 그래프.
도 8A-C 는 젊은 인간 유래 성상세포가 hSOD1 마우스에서 운동 성능을 증가시켰음을 보여준다. A. 모든 군을 비교하는 BBB 점수에 의해 기술되는 질환 진행의 동역학. 0=정상 마우스 5= 마비된 마우스. B. 모든 실험 군을 비교하는 Rotarod 점수에 의해 기술되는 질환 진행의 동역학, 180 sec= 정상 마우스 0= 로드 (rod) 를 잡을 수 없는 마우스. C. Rotarod 장비 위의 마우스.
도 9 는 젊은 인간 유래 성상세포가 이식된 hSOD1 체중을 유지했음을 보여준다. 모든 군을 비교하는 질환 진행 전체에 걸친 체중 변화의 동역학.
도 10 은 Kapaln Meier Log 순위 통계 분석을 보여준다. Log 순위 생존 분석을 집단의 50% 에 대해 수행했다.
본 발명의 구체적 구현예의 설명
본 발명은, 일부 구현예에서, 생체외 분화된 다능성 줄기 세포 (PSC) 를 사용하여 인간 성상세포 기능에 영향을 미치는 물질을 확인하는 방법에 관한 것이다. 게다가, 인간 대상에서 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 의 치료를 위한 인간 성상세포 또는 인간 선조 성상세포의 용도가 또한 공개된다.
대량의 인간 성상세포를 얻기 위해서 본 발명의 발명자들은 분화 전에 무한 증식될 수 있는 인간 다능성 줄기 세포 (hPSC) 로부터 인간 성상세포를 분화시키는 것을 제안한다.
본 발명은 또한 인간 다능성 줄기 세포 (hPSC) 로부터 성상세포의 고도로 균일한 집단 (>90% GFAP, S100b) 을 생성하기 위한 독특하고 강력한 프로토콜을 공개했다. 상기 분화 프로토콜은 규모확대가능한 배양 기술과 함께 시험관내에서 성상세포의 대량 생산을 허용한다. 이러한 hPSC-유래 성상세포는 일차 인간 성상세포와 유사한 유전자 발현 패턴 뿐만 아니라 하기를 포함하는 기능적 특성을 보인다: I) 운동 뉴런을 보호하는 신경영양 인자 (BDNF, GDNF 및 VEGF) 의 분비, II) 글루타메이트 흡수 능력 및 III) 시험관내에서 산화 스트레스로부터 뉴런의 보호. 이러한 hPSC 유래 성상세포는 동결 상태로 유지되고 필요시 사용될 수 있다.
상기 인간 성상세포의 치료적 특성을 생체내에서 평가했으며, 이 목적을 위해 세포를 G93A 높은 카피수 (high copy number) hSOD1 마우스 (ALS 질환에 관한 마우스 모델) 에게 경막내 이식했다. 인간 성상세포 이식은 모든 기능 시험에서 운동 성능의 유의한 개선 (P<0.05) 을 초래했다. 게다가, 이식된 마우스에서 생존 및 질환 지속기간에 대한 양성 효과가 관찰되었다.
ALS 는 피질, 뇌간, 및 척수에서의 운동 뉴런의 죽음을 특징으로 한다. ALS 는 사례의 약 5-10% 에서 가족성이고 나머지에서 산발성이다. 질환의 경과는 가족성 ALS 와 산발성 ALS 사이에 구분이 안된다. 이 질환은 일생 중 늦은 시기에 평균 연령 56 세에 발현하고, 일단 진단되면, 2-5 년 내에 완전한 마비 및 사망을 초래한다.
가족성 환자의 부분집합에서, 구리-아연 초과산화물 디스무타제 1 (SOD1) 에 대해 코딩하는 유전자에서 돌연변이가 발견되었다. SOD1 는 자유 라디칼의 해독에 관여하는 시토졸 효소이다. 나아가, 운동 뉴런에서의 병원성 인간 SOD1 단백질 인코딩 대립인자의 과생산은 늦은 발병, 진행성 신경변성 질환을 초래한다. 연구들의 결과로 단백질 응집물의 형성, 세포골격 이상, 프로테오솜 기능장애 및 세포 사망 신호에 대한 증가된 민감성을 포함하여, ALS 운동 뉴런의 고유의 병원성 특성이 확인되었다. 부가적으로, 종종 생체내에서 운동 뉴런과 연관되는 것으로 발견되는 다른 세포, 예컨대 이에 제한되는 것은 아니나 신경교 세포 (예를 들어 성상세포, 슈반 세포 등) 에서의 병원성 인간 SOD1 단백질 인코딩 대립인자의 과생산은 비-세포 자율 운동 뉴런 병리를 초래할 수 있다. 병원성 SOD1 단백질 인코딩 대립인자의 예는 SOD1G93A, SOD1G85R, 및 SOD1G37R 을 포함하나 그에 제한되지 않는다.
신경변성 질환 예컨대 ALS, 알츠하이머 질환 및 파키슨 질환은 전체적으로 주요한 건강관리 부담에 해당하는 치료할 수 없는 상태이다. 신경보호 및 궁국적으로 회복 치료를 개발하기 위해 이들 질환의 생물학의 향상된 이해가 요구된다. 최근까지, 신경변성 질환은 대체로 오로지 뉴런 장애로 여겨져 왔다. 그러나, 최근의 발견들은 이 개념에 도전하여, 급성 및 만성 장애에서 성상세포에 의해 매개되는 신경변성의 비-세포-자율 메카니즘이 원인임을 보여주었다. 인간 줄기 세포 생물학은 생리학 및 부상 패러다임 하에 인간 성상세포-뉴런 상호작용의 모형화를 가능하게 한다. 신경 줄기 세포 및 기능적 뉴런의 생성을 위한 강력한 플랫폼이 존재하지만, 농축되고 기능적인 인간 성상세포의 생성이 비교하여 연구된다. 인간 성상세포가 병든 뉴런을 보호하고 그것의 생존을 증가시키는 메카니즘은 다음을 포함하는 것으로 가설이 제기되었다: 글루타메이트 신경독성의 예방, 신경영양 인자 (NTF) 예컨대 BDNF 및 GDNF 의 분비, 및 VEGF 분비에 의한 신경혈관 변화.
본 발명은 시험관내에서 인간 다능성 줄기 세포 유래 선조 성상세포 및 성상세포의 농축되고 기능적인 집단의 생성, 및 ALS 에 관한 약물 스크리닝 플랫폼 (여기에서 산화 스트레스 하의 운동 뉴런에 대한 인간 성상세포의 신경보호 효과가 시험됨) 의 확립에 부분적으로 기초한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 신경보호 효과를 나타내고 인간 성상세포 기능을 향상시키는 선두 화합물 (lead compound) 의 확인, 특성분석 및 최적화를 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
본 발명의 검정법을 사용하여 시험될 수 있는 물질은 소분자 물질, 화학물질, 펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드 물질 (예를 들어 siRNA 물질) 을 포함한다.
세포와 물질의 접촉은, 예를 들어, 물질을 세포에 첨가하여 물질이 세포와 직접 접촉되게 하는 것을 포함하여, 기술 분야에 알려진 임의의 시험관내 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에 따르면, 세포는 물질과 함께 인큐베이션된다. 세포 인큐베이션에 사용되는 조건은 물질이 세포 변화, 예컨대 분석되는 특정 유전자의 전사 및/또는 번역 속도의 변화를 유도하는 것을 가능하게 하는 기간/세포 농도/물질 농도/세포와 물질 사이의 비율 등으로 선택된다. 구체적 구현예에 따르면, 세포는 물질과 적어도 1 일, 3 일, 5 일, 7 일, 10 일, 14 일 또는 적어도 21 일 동안 접촉된다.
후보 신경보호 선두 화합물은 본 발명의 세포의 배양 배지에 첨가되고 바람직한 특성에 관해 검정될 수 있다. 후보 신경보호 선두 화합물의 부재 하의 생존가능한 운동 뉴런의 수와 비교할 때 배양물 중 생존가능한 운동 뉴런의 수를 증가시키는 화합물과 같은 바람직한 특성을 보이는 화합물이 추가의 특성분석 및 최적화를 위해 선택될 수 있다. 화합물은 인간 성상세포와의 공배양물에서, 또는 그의 조건 배지에서 운동 뉴런의 생존력을 증가시키는 그들의 능력으로 선택될 수 있다.
높은 처리율 스크린을 또한 사용하여 임의의 질환-연관 표현형, 예를 들어, 생존, 세포자멸사, 괴사, 축삭 변성, 축삭 안내, 축삭 형태, 가지돌기 형태, 수용체 밀도, 시냅스생성, 신경발생, 시냅스 밀도, 시냅스 전파, 시냅스 신호전달, 수용체 수송, 단백질 수송, 단백질 응집, 프로테아솜 활성, 수용체 발현, 산화 스트레스 (ROS), FGFR-신호전달 및 FGF 신호전달을 바로잡을 수 있는 화합물을 확인할 수 있다.
세포 표현형을 조정하는 능력 (예를 들어, 신경보호 효과) 으로 선택된 후보 선두 화합물의 특성분석 및 최적화는 추가의 스크리닝, 유도체 및 유사체의 생성, 흡수 분포, 대사, 및 분비 (Absorption Distribution, Metabolism, and Excretion) (ADME) 특성의 분석, 안전성 시험, 및 효능 시험을 포함하나 그에 제한되지 않는다. 특히, 최적화 노력은 혈액 뇌 장벽을 가로지르도록 디자인되는 화합물을 개발하는 것을 수반할 수 있다.
약물 후보 화합물 (또는 "시험 물질") 은 선택된 개별 소분자 (예를 들어, 이전 약물 스크린으로부터의 선두 화합물) 일 수 있으며 또는 어떤 경우에는, 스크리닝될 약물 후보 화합물은 조합적 라이브러리, 즉, 다수의 화학적 "빌딩 블록" 을 조합함으로써 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의해 생성되는 다양한 화학적 화합물의 집합에서 비롯된다. 예를 들어, 선형 조합적 화학적 라이브러리 예컨대 폴리펩티드 라이브러리는 아미노산으로 호칭되는 한 세트의 화학적 빌딩 블록을 주어진 화합물 길이 (즉, 폴리펩티드 화합물 중의 아미노산의 수) 에 관한 모든 가능한 방식으로 조합함으로써 형성된다. 수백만 가지의 화학적 화합물이 그러한 화학적 빌딩 블록의 조합적 혼합을 통해 합성될 수 있다. 실제로, 이론적으로, 100 가지 교환가능한 화학적 빌딩 블록의 체계적, 조합적 혼합은 1 억 가지의 사합체 화합물 또는 100 억 가지의 오합체 화합물의 합성을 초래한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "생존" 은 세포가 죽음을 회피하는 임의의 과정을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 생존은 또한 괴사, 세포자멸사에 의해 입증되는 세포 상실의 예방, 또는 세포 상실의 기타 메카니즘의 예방을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 증가하는 생존은 무처리 대조군에 비해 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 또는 그 이상 만큼의 세포 죽음의 비율의 감소를 나타낸다. 생존 비율은 배양물에서 죽은 세포에 특이적인 염료 (예를 들어, 프로피디움 요오드화물) 로 염색될 수 있는 세포의 수를 계수함으로써 측정될 수 있다.
본 발명의 검정법에서 사용되는 세포는 다능성 줄기 세포로부터 생체외 분화된 성상세포를 포함한다.
예를 들어, 인간 배아 줄기 세포는 인간 배반포 또는 지연된 배반포 시기로부터 단리할 수 있다 (WO2006/040763 에 기재되어 있음). 인간 배반포는 전형적으로 인간 생체내 착상전 배아로부터 또는 시험관 수정된 (in-vitro fertilized) (IVF) 배아로부터 얻는다. 대안적으로, 단일 세포 인간 배아를 배반포 시기까지 증식시킬 수 있다. 인간 ES 세포의 단리를 위해 투명대를 배반포로부터 제거하고 속세포 덩이 (inner cell mass) (ICM) 를 면역수술에 의해 단리하며, 이 경우에 영양외배엽 세포를 용해시키고 무손상 ICM 으로부터 부드러운 피펫팅에 의해 제거한다. 그 후 ICM 를 증식을 가능하게 하는 적절한 배지를 함유하는 조직 배양 플라스크에 플레이팅한다. 9 내지 15 일 후에, ICM 유래 증식물을 기계적 해리에 의해 또는 효소적 분해에 의해 무더기 (clump) 로 해리하고, 그 후 세포를 새로운 조직 배양 배지에 다시 플레이팅한다. 미분화 형태를 보이는 콜로니를 마이크로피펫에 의해 개별적으로 선택하고, 기계적으로 무더기로 해리하고, 다시 플레이팅한다. 그 후 결과적인 ES 세포를 1-2 주 마다 규칙적으로 분할한다. 인간 ES 세포의 준비 방법에 대한 추가의 세부사항에 대해 Thomson et al., [미국 특허 번호 5,843,780; Science 282: 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995]; Bongso et al., [Hum Reprod 4: 706, 1989]; Gardner et al., [Fertil. Steril. 69: 84, 1998] 을 참고한다.
상업적으로 입수가능한 줄기 세포도 또한 본 발명의 이러한 양상에서 사용할 수 있다고 이해될 것이다. 인간 ES 세포는 NIH 인간 배아 줄기 세포 등록소 (<http://escr.nih.gov>) 로부터 구입할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배아 줄기 세포주의 비제한적 예는 BG01, BG02, BG03, SA01, TE03 (I3), TE04, TE06 (I6), HES-1, HES-2, HES-3, UC01, UC06, WA01, WA07 및 WA09 이다.
본 발명에 의해 사용되는 줄기 세포는 또한 유도된 다능성 줄기 세포 (induced pluripotent stem cell) (IPSc) 에서 유래할 수 있다.
그들의 기원과 무관하게, 본 발명에 따라 사용되는 줄기 세포는 적어도 50 % 정제, 75 % 정제 또는 적어도 90 % 정제된 것이다. 인간 배아 줄기 세포주를 사용할 때, 인간 ES 세포 콜로니를 그들의 피더 층 (x-선 조사된 섬유아세포-유사 세포) 으로부터 예컨대 실질적으로 순수한 줄기 세포 집단을 제공하는 기계적 및/또는 효소적 수단에 의해 분리한다.
인간 줄기 세포를 얻으면, 그들을 성상세포로 분화하도록 처리할 수 있다. 예시적 방법이 아래 재료 및 방법 부분에 기재되어 있다. 그러나, 본 발명의 방법이 기술분야에 알려진 부가적인 성상세포 생성 방법을 고려한다는 것이 이해될 것이다.
사용되는 배양 배지는 사용되는 줄기 세포에 따라 선택된다. 따라서, 예를 들어, ES 세포 성장에 적합한 배지는, 예를 들어, 지지 효소 및 호르몬으로 보충된, DMEM/F12 (Sigma-Aldrich, St. Lewis, MO) 또는 알파 MEM 배지 (Life Technologies Inc., Rockville, MD, USA) 일 수 있다. 이들 효소는 예를 들어 인슐린 (ActRapid; Novo Nordisk, Bagsvæd, DENMARK), 프로게스테론 및/또는 아포 트랜스페린 (Biological Industries, Beit Haemek, Israel) 일 수 있다. 기타 구성요소가 실시예 부분에 나열되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 구절 "레티노산" 은 신경 세포 분화를 유도할 수 있는 활성 형태 (합성 또는 천연) 의 비타민 A 를 지칭한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 레티노산의 예는 레티노산, 레티놀, 레티날, 11-시스-레티날, 올-트랜스 (all-trans) 레티노산, 13-시스 레티노산 및 9-시스-레티노산 (모두 Sigma-Aldrich, St. Lewis, MO 에서 입수가능) 을 포함하나, 그에 한정되지 않는다.
본 발명의 일부 구현예에서 레티노산은 1-50 μM 의 농도 범위에서 사용된다.
배양 배지는 추가로 성장 인자로 보충될 수 있으며, 이러한 성장 인자는 배양 기간의 적어도 일부에 존재하여 세포 증식을 촉진하고 뉴런 신경교 계통으로의 분화를 가속시킬 수 있다. 본 발명의 이러한 양상의 구현예에 따르면, 그러한 성장 인자는 예를 들어, EGF (5-50 ng/㎖) 및 bFGF (5-50 ng/㎖) (R&D Systems, Minneapolis, MN, Biotest, Dreieich, Germany) 를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 구절 "신경구" 는 주로 신경 줄기 세포 및 뉴런, 희소돌기아교세포 및 성상세포 뿐만 아니라 기타 신경교 세포로 분화할 수 있는 조기 다능성 선조를 함유하는 준-구형 집락 또는 구체를 지칭한다.
세포는 성숙한 신경구가 형성될 때까지 배양된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 구절 "성숙한 신경구" 는 신경 줄기 세포의 일부는 희소돌기아교세포 계통의 마커를 획득한 특수 희소돌기아교세포 선조로 분화되고 (예를 들어 Sox10, Nkx2.2., NG2, A2B5), 한편 나머지는 신경 선조 또는 성상세포 선조로 분화된 신경구를 지칭한다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면 세포는, 예를 들어 10-30 (예를 들어, 20-30) 일 동안 배양되고, 이 기간의 마지막에 탈착된 신경구가 형성된다. 구체, 또는 그로부터 해리된 세포는 그 후 부착 기질 (예를 들어 Matrigel 또는 세포외 매트릭스 성분 (예를 들어, 콜라겐, 라미닌 및 피브로넥틴)) 에 부착되고, 성장 인자에 의한 추가의 증식에 적용되고, 궁국적으로 성장 인자의 제거 후에 양이온성 부착 기질 (예를 들어 폴리-D-라이신 또는 폴리오르니틴과 피브로넥틴 (FN)) 또는 부착 기질 (예를 들어 Matrigel 또는 세포외 매트릭스 성분 (예를 들어, 콜라겐, 라미닌 및 피브로넥틴)) 에서의 분화에 적용된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "인간 성상세포 선조 세포 (hAPC)" 또는 "인간 선조 성상세포" 는 성숙한 성상세포인 자손을 생성할 수 있는 세포를 의미한다. 전형적으로, 이러한 세포는 성상세포 계통의 특징인 표현형 마커의 일부를 발현한다.
용어 "투여하다" 및 "투여" 는 본원에서 고찰되는 성상세포 또는 약제의 치료 유효량이 대상에게 예방 및/또는 치료 목적으로 전달되는 과정을 지칭한다. 성상세포 및 약제는 적절한 의료 관행에 따라 대상의 임상 상태, 투여 자리 및 방법, 투여량, 환자 연령, 성별, 체중, 및 의사에게 알려진 기타 인자들을 고려하여 투여된다.
용어 "치료하다" 는 그 용어가 적용되는 질환, 또는 그러한 질환의 하나 이상의 증상의 진행을 역전, 완화, 또는 저해하는 것을 지칭한다. 치료는 진단시 또는 그 이후의 대상의 관리 및 보호를 포함한다. 치료는 급성 또는 만성 방식으로 수행될 수 있다. 대상의 상태에 따라, 이 용어는 질환의 예방을 지칭할 수 있고, 질환의 발생의 예방, 또는 질환과 연관되는 증상의 예방을 포함한다. 이 용어는 또한 질환으로 인한 고통에 앞서 질환 또는 그러한 질환과 연관되는 증상의 중증도를 감소시키는 것을 지칭한다. 그러한 고통에 앞선 질환의 중증도의 예방 또는 감소는 성상세포 또는 성상세포를 포함하는 약제를 투여 시점에 질환으로 고통받고 있지 않은 대상에게 투여하는 것을 지칭한다. "예방하다" 는 또한 질환 또는 그러한 질환과 연관되는 하나 이상의 증상의 재발을 예방하는 것을 지칭한다. 치료의 목적은 질환을 방지하는 것이고, 성상세포를 투여하여 증상 또는 합병증의 발생을 예방 또는 지연, 또는 증상 또는 합병증을 완화, 또는 질환을 제거 또는 부분적으로 제거하는 것을 포함한다. 용어 "치료" 및 "치료적으로" 는 위에 정의된 "치료하다" 의 작용을 지칭한다.
본 발명은 무수한 신경변성 질환을 치료하기 위해 환자 내에 이식될 수 있는 세포 및 그의 집단에 관한 것이다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면 세포 및 그의 집단은 본원에 기재된 세포 및 세포 집단을 생성하도록 유전자 조작 (즉, 발현 구축물로 형질전환) 되지 않는다.
용어 또는 구절 "이식", "세포 대체" 또는 "그래프팅" 은 본원에서 호환되게 사용되고, 본 발명의 세포를 표적 조직에 도입하는 것을 지칭한다.
세포는 중추 신경계 내에 또는 뇌실 강 내에 또는 경막하에 숙주 뇌의 표면에 또는 숙주 뇌척수액에 그래프팅될 수 있다. 성공적 이식을 위한 조건은 다음을 포함할 수 있다: (i) 삽입물의 생존력; (ii) 이식 자리에서 이식편의 잔류; 및 (iii) 이식 자리에서 최소량의 병적 반응. 다양한 신경 조직, 예를 들어 배아 뇌 조직을 숙주 뇌 내에 이식하는 방법이: "Neural grafting in the mammalian CNS", Bjorklund and Stenevi, eds. (1985); Freed et al., 2001; Olanow et al., 2003) 에 기재되어 있다. 이들 절차는 실질내 이식, 즉, 이식 시점의 뇌 실질에 대항하도록 숙주 뇌 내부에의 조직의 주입 또는 침착에 의해 달성되는 숙주 뇌 내부 이식 (뇌 외부 또는 실질외 이식과 비교됨) 을 포함한다. 실질내 이식은 다음 2 가지 접근법을 사용하여 실현될 수 있다: (i) 숙주 뇌 실질 내에 세포를 주입함 또는 (ii) 외과적 수단에 의해 강을 만들어서 숙주 뇌 실질을 노출시킨 후 이식편을 강 내에 침착시킴. 두 가지 방법 모두 이식편과 그래프팅 시점의 숙주 뇌 조직 사이의 실질 침착을 제공하고, 둘 모두 이식편과 숙주 뇌 조직 사이의 해부학적 통합을 촉진한다. 이것은 이식편이 숙주 뇌의 구성 부분이 되어 숙주의 일생 동안 생존하는 것이 요구되는 경우에 중요하다.
대안적으로, 이식편은 뇌실, 예를 들어 대뇌 뇌실에 또는 경막하에 뇌척수액에, 즉 숙주 뇌의 표면에 놓여질 수 있으며, 거기에서 이식편은 개재하는 연질막 또는 거미막 및 연질막에 의해 숙주 뇌 실질로부터 분리되어 있다. 뇌실로의 그래프팅은 세포의 주입에 의해 달성될 수 있다. 경막하 그래프팅을 위해, 경막에 좁고 기다란 틈을 만든 후에 뇌의 표면 주위에 세포를 주입할 수 있다. 숙주 뇌의 선택된 영역 내로의 주입은 드릴로 구멍을 뚫고 경막을 뾰족한 기구로 찔러서 미량주사기의 바늘이 삽입되는 것을 허용함으로써 실시될 수 있다. 미량주사기는 바람직하게는 정위 프레임으로 장착되고 3 차원 정위 좌표는 바늘을 뇌 또는 척수의 원하는 위치 내에 배치하기 위해 선택된다. 세포는 또한 뇌의 조가비핵, 핵 기저부, 해마 피질, 줄무늬체, 흑색질 또는 꼬리엽 영역, 뿐만 아니라 척수 내에 도입될 수 있다.
세포는 또한 조직의 건강한 영역에 이식될 수 있다. 어떤 경우에는 손상된 조직 부위의 정확한 위치가 알려지지 않을 수 있고 세포는 부주의로 건강한 영역에 이식될 수 있다. 다른 경우에, 세포를 건강한 영역에 투여하여, 그 영역에 대한 추가의 손상을 피하는 것이 바람직할 수 있다. 어떤 경우에서든지, 이식 후에, 세포는 손상된 부위로 이주할 수 있다.
이식을 위해, 세포 현탁액은 주사기 내로 뽑아지고 마취된 이식 수령자에게 투여된다. 복수의 주입이 이러한 절차를 사용하여 실시될 수 있다.
세포 현탁액 절차는 따라서 뇌 또는 척수의 소정의 자리로의 세포의 그래프팅을 허용하고, 비교적 비-외상성이고, 동일한 세포 현탁액을 사용하여 동시에 여러 상이한 자리 또는 동일한 자리에서 복수의 그래프팅을 허용한다.
척수 그래프팅에 바람직할 수 있는, 강 내로 이식하기 위해, 예를 들어 Stenevi et al. (Brain Res. 114:1-20., 1976) 에 기재된 바와 같이, 뇌 위에 가로놓인 뼈를 제거하고 겔폼과 같은 재료로 출혈을 중단시킴으로써, 중추 신경계 (CNS) 의 외부 표면에 가까운 영역으로부터 조직을 제거하여 이식 강을 형성한다. 강을 형성하는데 석션을 사용할 수 있다. 그 후 이식편을 강 내에 위치시킨다.
비-자가 세포는 신체에 투여될 때 면역 반응을 유도할 가능성이 높으므로, 비-자가 세포의 거부의 가능성을 감소시키는 여러 접근법이 개발되었다. 이들은 수령자 면역계를 억제하는 것을 포함한다. 면역억제제의 예는 메토트렉세이트, 시클로포스파미드, 시클로스포린, 시클로스포린 A, 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 술파살라진 (술파살라조피린), 골드 염, D-페니실라민, 레플루노미드, 아자티오프린, 아나킨라, 인플릭시맙, 에타네르셉트, TNF.알파 차단제, 염증성 사이토카인을 표적화하는 생물학적 물질, 및 비-스테로이드성 항-염증 약물 (NSAIDs) 을 포함하나, 그에 한정되지 않는다. NSAID 의 예는 아세틸 살리실산, 콜린 마그네슘 살리실레이트, 디플루니살, 마그네슘 살리실레이트, 살사레이트, 소듐 살리실레이트, 디클로페낙, 에토돌락, 페노프로펜, 플루르비프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토로락, 메클로페나메이트, 나프록센, 나부메톤, 페닐부타존, 피록시캄, 술린닥, 타크롤리무스, 톨메틴, 아세트아미노펜, 이부프로펜, Cox-2 저해인자 및 트라마돌을 포함하나, 그에 한정되지 않는다.
용어 "대상", "개체", 또는 "환자" 는 본원에서 호환되게 사용되고, 온혈 동물 예컨대 포유류를 포함하는 동물을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "건강한 대상" 은 ALS 로 진단받지 않거나 ALS 의 증상이 없는 대상, 특히 포유류를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "약학적 조성물" 은 본원에 기재된 활성 구성요소 또는 세포 중 하나 이상과 다른 화학적 성분 예컨대 생리적으로 적합한 담체 및 부형제의 제제를 지칭한다. 약학적 조성물의 목적은 유기체에 대한 세포 또는 화합물의 투여를 촉진하는 것이다.
본원에서 용어 "활성 구성요소" 는 운동 뉴런의 집단의 생존 또는 신경 기능을 향상시키는 물질을 지칭한다.
이후, 구절 "생리적으로 허용가능한 담체" 및 "약학적으로 허용가능한 담체" 는 호환되게 사용될 수 있으며, 유기체에 유의한 자극을 야기하지 않고 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 없애지 않는 담체 또는 희석제를 지칭한다. 보강제가 이들 구절에 포함된다.
본원에서 용어 "부형제" 는 약학적 조성물에 첨가되어 활성 구성요소의 투여를 추가로 촉진하는 불활성 물질을 지칭한다. 부형제의 예는 제한 없이 칼슘 카르보네이트, 칼슘 포스페이트, 다양한 당 및 유형의 전분, 셀룰로스 유도체, 겔라틴, 식물유 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
"치료 유효량" 은 하나 이상의 원하는 효과, 특히, 하나 이상의 유익한 효과를 초래할, 성상세포 또는 그의 약제의 양 또는 용량에 관한 것이다. 물질의 치료 유효량은 대상의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 대상에서 원하는 응답을 유발하는 물질의 능력과 같은 인자들에 따라 다를 수 있다. 투여량 섭생법은 최적의 치료 응답 (예를 들어 유익한 효과, 더욱 특히 지속적인 유익한 효과) 을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 여러 분할된 용량이 매일 투여되거나 용량이 치료 상황의 긴급사태에 의해 권고되는 것에 비례하여 감소될 수 있다.
유도된 만능성 및 다능성 줄기 세포주는 본원에서 "유도된 줄기 세포주" (iSC 주) 를 지칭한다. 유도된 다능성 줄기 세포는 iPS 세포 또는 iPSC 로서 지칭된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 표현형 "바로잡음" 은 표현형을 변경하여 표현형이 정상 표현형에 더욱 가깝게 되게 하는 것을 지칭한다.
약물의 배합 및 투여 기술은 본원에 참조로 포함되는 "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, 최신판에서 찾을 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "약" 은 ±10 % 를 지칭한다.
용어 "포함한다", "포함하는", "포함된다", "포함되는", "갖는" 및 그들의 활용형은 "포함하나 그에 한정되지 않는다" 를 의미한다.
용어 "~ 로 이루어진다" 은 "~ 를 포함하고 그에 한정된다" 를 의미한다.
용어 "~ 로 본질적으로 이루어진다" 는 조성물, 방법 또는 구조가 부가적 구성요소, 단계 및/또는 부분을 포함할 수 있으나, 부가적 구성요소, 단계 및/또는 부분이 청구되는 조성물, 방법 또는 구조의 기본적 신규한 특성을 실질적으로 변경하지 않을 경우에만 그렇다는 것을 의미한다
이 출원 전체에서, 본 발명의 다양한 구현예는 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의 및 간결성을 위한 것이고 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 여겨져서는 안된다고 이해될 것이다. 따라서, 범위의 설명은 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위 범위 뿐만 아니라 그 범위 내의 개별 수치 값을 갖는 것으로 여겨질 것이다. 예를 들어, 1 내지 6 과 같은 범위의 설명은 구체적으로 개시된 하위 범위 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등, 뿐만 아니라 그 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6 을 갖는 것으로 여겨질 것이다. 이는 범위의 너비와 무관하게 적용된다.
본원에서 수치 범위가 제시되면, 그것은 제시된 범위 내의 임의의 언급된 수치 (분수 또는 정수) 를 포함하는 것으로 여겨진다. 구절 첫번째 명시된 숫자와 두번째 명시된 숫자 "사이의 범위의/범위" 및 첫번째 명시된 숫자 "내지" 두번째 명시된 숫자의 "범위의/범위" 는 본원에서 호환되게 사용되고 첫번째 및 두번째 명시된 숫자 및 그 사이의 모든 분수 및 정수를 포함하는 것으로 여겨진다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "방법" 은 화학, 약물학, 생물학, 생화학 및 의학 기술의 전문가에게 알려진 방식, 수단, 기술 및 절차, 또는 그것으로부터 화학, 약물학, 생물학, 생화학 및 의학 기술의 전문가에 의해 쉽게 개발된 방식, 수단, 기술 및 절차를 포함하나 그에 한정되지 않는 주어진 임무를 완수하기 위한 방식, 수단, 기술 및 절차를 지칭한다.
명확성을 위해 별도의 구현예의 맥락에서 기재되어 있는 본 발명의 특정 특색들은 또한 조합되어 단일 구현예로 제공될 수 있다고 이해될 것이다. 반대로, 간결성을 위해 단일 구현예의 맥락에서 기재되어 있는 본 발명의 다양한 특색들은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 하위 조합으로 또는 적합하게 본 발명의 임의의 기타 기재된 구현예에서 제공될 수 있다. 다양한 구현예의 맥락에서 기재된 특정 특색들은 구현예가 그러한 요소들 없이 실시불가능하지 않는 한, 구현예의 본질적 특색으로 여겨지면 안된다.
위에 설명되고 아래 청구항 부분에서 청구되는 본 발명의 다양한 구현예 및 양상은 하기 실시예에서 실험적 지지를 발견한다.
실시예
이제 하기 실시예를 참조하며, 이 실시예는 상기 설명과 함께 본 발명의 일부 구현예를 비제한적 방식으로 설명한다.
일반적으로, 본원에서 사용되는 명명법 및 본 발명에서 이용되는 실험 절차는 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 그러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국 특허 번호 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 및 5,272,057 에 제시된 방법론; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980) 참고; 이용가능한 면역검정법은 특허 및 과학 문헌에 폭넓게 기재되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 및 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996) 참고; 이들 모두 마치 본원에 전부 제시된 것처럼 참조로 포함된다. 다른 일반 참고문헌은 이 문헌 전체에 제공되어 있다. 그안의 절차는 기술분야에 잘 알려져 있는 것으로 여겨지고 독자의 편의를 위해 제공된다. 그안에 포함된 모든 정보는 본원에 참조로 포함된다.
재료 및 방법
검정법에 사용되는 성상세포의 생성
인간 ES 세포주를 인간 신생아 포피 섬유아세포 (HEF) 의 피더 층 위에서 5 % CO2 로 37 ℃ 에서 배양했다. 성장 배지 (ES1) 는 DMEM/F12 (Sigma), 14 % 녹아웃 혈청 대체물 (KSR), 비필수 아미노산 (1/100), 0.1 mM 베타-메르캅토에탄올 (셋 모두 Invitrogen/Gibco 로부터 입수), 1 mM Na 피루베이트, 2 ㎍/㎖ 헤파린 (Sigma) 및 8 ng/㎖ 인간 재조합 염기성 FGF (FGF-2; Preprotech) 로 구성되었다. 시딩 후 5 일째에, hES 세포 콜로니를 37 ℃ 에서 45-90 분 동안 1.2 ㎎/㎖ 콜라게나제 IV (Worthington) 로 탈착시켰다. 집합체를 추가로 상기와 같이 배양하거나, 기재된 바와 같이 분화에 적용했다 (Izrael et al Mol Cell Neurosci 34, 310-323 (2007).
단계 1-이행 (transition) : 이러한 이행 단계 동안, hES 세포 콜로니를 조직 배양 플레이트에 50 % (v/v) 의 ES1 배지 및 50 % (v/v) 의 ITTSPP/B27 배지로 이루어지는 배지 T (Transition) 중에 옮겼다. ITTSPP/B27 은 그 자체로 1 부피의 2 % B27 보충제 (Invitrogen) 함유 DMEM/F12 및 1 부피의 25 ㎍/㎖ 인간 인슐린 (ActRapid, Novo Nordisk), 50 ㎍/㎖ 인간 아포-트랜스페린 (Biological Industries, Israel), 6.3 ng/㎖ 프로게스테론, 10 ㎍/㎖ 푸트레신, 50 ng/㎖ 소듐 셀레나이트 및 40 ng/㎖ 트리요오드티로닌 (T3) (모두 Sigma 사제) 함유 DMEM/F12 와, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신의 혼합물이었다. 배지 T 에 20 ng/㎖ r-인간 EGF (R&D Systems) 및 4 ng/㎖ r-인간 bFGF 를 보충했다. 1 일 후에, 비-부착 hES 세포 콜로니 및 집합체의 대부분을 6 cm 박테리아 (비-부착) 플레이트에 옮기고 20 ng/㎖ r-인간 EGF (R&D Systems) 및 2 ng/㎖ r-인간 bFGF 를 보충한 T 배지에서 성장시켰다.
단계 2: 올-트랜스 레티노산 (ATRA) 처리 : 배지를 20 ng/㎖ EGF 및 10 μM ATRA 를 첨가한 ITTSPP/B27 로 바꾸었다. 배지를 7 일 동안 매일 교환했다.
단계 3: 현탁 배양: 이 단계는 신경구 (NS) 의 성숙을 허용하며, 이 단계 동안 20 ng/㎖ EGF 함유 ITTSPP/B27 배지에서 18 일 동안 배양을 계속했다. 배지를 하루 걸러 교환했다.
신경 줄기 세포 증식 및 분화
단계 4: Matrigel 부착 1 : 구체/집락을 DMEM/F12 에 1:30 희석된 BD Matrigel (성장 인자 감소된 Matrigel, BD Biosciences) 로 실온 (RT) 에서 1.5 h 동안 코팅한 6-웰 조직 배양 플레이트에 옮겼다. 배양 배지는 20 ng/㎖ EGF 함유 ITTSPP/B27 였고, 1 일 후에 비-부착 집합체를 폐기했다. 배지를 7-9 일 동안 하루 걸러 교환했다.
단계 5: Matrigel 부착 2 : 섬유아세포 및 상피 세포가 없는 신경구/집락을 선별하여 떼어내어 새로운 Matrigel 플레이트에 옮겼다. 신경구 (10 개 이하의 NS) 를 탈착하고 37 ℃ 에서 2-3 min 동안 PBS (Ca+ 및 Mg2+ 비함유) 중 0.025% 트립신 (InVitrogen) 으로 부분적으로 해리시켰다 (계대 1). 트립신을 ITTSPP/B27 중 1 부피의 트립신 저해인자 (Invitrogen) 및 4 부피의 2 ㎎/㎖ BSA 에 의해 중화시켰다. 세포를 Eppendorf 원심분리기에서 5 분 동안 1200 rpm 에서 회전시켰다. 해리된 작은 집락을 Matrigel-코팅된 플레이트 (1:1 내지 1:3 비율) 위에 20 ng/㎖ EGF 함유 ITTSPP/B27 중에 다시 시딩했다 (단계 4). 2-3 주 후에, 세포를 상기와 같이 트립신 처리에 의해 해리하고 (계대 2), 결과적인 hES-NS 세포를 하루 동안 20 ng/㎖ EGF 함유 ITTSPP/B27 중 Matrigel 및 마우스 라미닌 (20 ㎍/㎖) 또는 PDL (20 ㎍/㎖) 및 피브로넥틴 5 ㎍/㎖ 로 코팅된 플레이트 또는 폴리-D-라이신 (PDL, 100 ㎍/㎖) 으로 코팅된 플레이트에 시딩했다. 각각의 새로운 시딩에서, 1 ㎍/㎖ 마우스 라미닌 (Sigma) 을 배지에 첨가했다.
단계 6 및 7: 폴리-D-라이신 또는 Matrigel 에서의 증식 : 하루 후에, 배지를 0.5% (v/v) N2 보충제 (Invitrogen), 1% (v/v) B27 보충제 함유 DMEM/F12 로 이루어지는 N2/B27 배지로 교환했다. 성장 인자 EGF 및 bFGF 를 각각 10 ng/㎖ 첨가했다. 7-14 일 후에, 세포를 트립신처리에 의해 분할하여 (1:2 또는 1:3) (계대 2) (P2) 단층을 얻었다. 1 주일 후에, 세포를 트립신으로 수집하고 0.5x106 세포 앰플 내에서 동결시켰다 (P3). 매주 필요할 때 추가의 계대를 실시했다.
성상세포 구속을 농축 및 촉진하기 위해 세포를 Matrigel, Cultrex 또는 Geltrex 에서 성장시켰다.
단계 8: GF 제거 : 상이한 계대에서, 성장 인자를 제거하여 말기 분화를 개시했다. 성장 인자를 제거할 때마다 50 ㎍/㎖ 비타민 C 를 N2/B27 배지에 첨가했다. 세포를 성장 인자 bFGF 및 EGF 를 보충한 N2/B27 배지에서 해동시켰다. 분할 및 96 웰 플레이트에 시딩하기 하루 전에, 성장 인자를 제거했다.
성상세포 조건 배지 또는 성상세포 첨가를 이용하는 신경보호 검정법
일반적 계획
Figure pct00001
화합물의 효과를 다음 단계에서 시험할 수 있다 (노란색 동그라미):
1. 성숙한 성상세포로 향하는 hAPC 분화 동안 화합물을 첨가할 수 있고, 그 후 화합물 노출된 성상세포 또는 그의 조건 배지를 뉴런에 첨가할 수 있다.
2. 산화 스트레스를 유도하기 전 24-72 hrs 동안 마지막 배지 교환에서.
3. 공배양에서 산화 스트레스 동안.
4. 조합, 즉 1+2, 1+3, 2+3 등을 수행할 수 있다.
단계 1: 설치류의 척수로부터 운동 뉴런의 생성
랫트 배아 (E15) 로부터의 척수를 각각의 실험에 사용했다. 모든 척수로부터 뇌척수막을 제거했다. 척수 조직을 작은 단편으로 썰고 15 ㎖ 튜브 (튜브 1 개 당 배아 5 개) 에 나누었다. 트립신 (2 ㎖, 0.25%) (Gibco #250050014) 을 각각의 튜브에 첨가하고 37℃ 에서 15 분 동안 인큐베이션했다. 세포를 NB 배지 (7 ㎖) 및 FCS (1 ㎖) 에 재현탁시키고, 5 분 동안 300g 에서 원심분리하고, 상청액을 흡입했다. 펠렛을 NB 배지 (2 ㎖) 에 재현탁시켰다. 단일 세포를 계수하고 Matrigel (BD #FAL354230) 코팅된 96 웰 플레이트 (Costar #cc-3596) 에 시딩했다 (120K 세포/웰). 50 ng/㎖ NGF (Alomone #n-100) 를 보충한 NB 배지에서 세포를 배양했고, 2-day 배지 교환했다. 3 일의 배양 후에 운동 뉴런의 특성분석을 수행했다. 뉴런을 Tubulin-b3, Neurofilament 및 HB9 (운동 뉴런 특이적 전사 인자) 로 염색했다. 뉴런의 적어도 70% 가 이들 항체에 대해 양성이었다.
단계 2: 성상세포 시딩
성상세포를 day 8-10 (척수 수술 후) 에 시딩했다. 세포를 50 ng/㎖ NGF (Alomone #n-100) 를 보충한 NB 배지에서 배양했다.
단계 3: 성상세포 조건 배지 생성
hPSC 유래 성상세포 (30-150 일령 성상세포) 로부터의 배지를 수집했다; 비타민 C 를 보충한 새로운 N2B27 로 1:1 희석했다. 배지를 ACM (성상세포 조건 배지) 로 명명했다.
단계 4: 산화 스트레스 유도 (day 9-10 에 수행함)
50 μM 또는 150 μM H2O2 (Sigma # 216763) 를 비타민 C 를 보충한 N2B27 또는 ACM (150 ㎕) 로 희석하고, 성상세포를 시딩한 플레이트의 각각의 웰에 첨가했다. 플레이트를 37℃ 에서 6 hrs 동안 인큐베이션했다.
플레이트를 10 분 동안 4% PFA, 100㎕/웰 로 고정하고, 그 후 플레이트를 2 회 세정하고 염색하기 전까지 4℃ 에서 저장했다.
단계 5: 운동 뉴런 세포 사망 분석:
염색:
세포를 실온 (RT) 에서 1hr 동안 Tx-100 0.3% (sigma) 를 보충한 차단 완충액과 함께 인큐베이션하고, 그 후 PBS (-/-) 로 세정했다.
세포를 RT 에서 1hr 동안 하기 항체와 함께 인큐베이션했다:
1st 항체 - Rb-anti Caspase-3a (Promega # G7481) (1:250)
M-anti-β-Tub3 (Convence # MMS-435P) (1:500)
Rb-anti-HB9 (Abcam # AB-ab92606 ) (1:100)
세포를 PBS (-/-) 를 사용하여 2 회 세정하고, RT 에서 1hr 동안 하기 항체와 함께 인큐베이션했다:
2nd 항체 - Goat-anti-Rb-568 (Invitrogen # A11036) (1:1000)
Goat-anti-mouse-488 (Invitrogen #A11029) (1:1000)
세포를 PBS (-/-) 를 사용하여 2 회 세정하고, DAPI (1:1000) 로 라벨링하고, 5 분 동안 인큐베이션하고, PBS (-/-) 를 사용하여 2 회 세정했다. Scan Array -Cellomics (Thermo-scientific inc) 를 사용하여 HCS 분석을 수행했다.
ACM 또는 hPSC 유래 성상세포의 첨가의 효과를 하기와 같은 다른 스트레스 유도인자에 대해 시험할 수 있다:
- 운동 뉴런 흥분독성. 구체적으로, 글루타메이트 독성 (운동 뉴런 세포 생존력에 더하여 글루타메이트 흡수 능력을 시험한다)
- 부가적 반응성 산소 종 독성
- AMPA/카이네이트 독성
배지 조성:
N2B27 배지:
- DMEM/F12 (Sigma #01-170) 96.5%.
- N2 (Invitrogen #17502-048) 0.5%.
- B27 (Invitrogen #17504044) 1%.
- Pen/Srep/Ampho B (Biological ind. #03-033-1B) 1%.
- GlutaMAX (Invitrogen #35050038) 1%.
NB 배지:
- Neurobasal 배지 (Gibco # 21103049) 97%.
- B27 (Invitrogen #17504044) 1%.
- Pen/Srep/Ampho B (Biological ind. #03-033-1B) 1%.
- GlutaMAX (Invitrogen #35050038) 1%.
FACS 분석을 사용하는 인간 PSC 유래 성상세포의 특성분석:
FACS 에 사용된 샘플:
상이한 발달 시기의 hPSC 유래 성상세포로부터의 샘플을 염색했다;
Day 0 = EGF 및 bFGF 의 존재 하에 성장시킨 hPSC 유래 성상세포
Days 7-14 = 7-14 일 동안 EGF 및 bFGF 의 부재 하에 성장시킨 hPSC 유래 성상세포
Days 14-28 = 14-28 일 동안 EGF 및 bFGF 의 부재 하에 성장시킨 hPSC 유래 성상세포
Days 28-42 = 28-42 일 동안 EGF 및 bFGF 의 부재 하에 성장시킨 hPSC 유래 성상세포
Days 42-56 = 42-56 일 동안 EGF 및 bFGF 의 부재 하에 성장시킨 hPSC 유래 성상세포
FACS 염색:
시약:
FACS 완충액: PBS (Gibco #14190-094) 99.5%
BSA (sigma #A9418) 0.5%
항체:
-GLAST (Miltenyi)
-A2B5 (Miltenyi)
-CD44 (Miltenyi)
-CXCR4 (Miltenyi)
-CD140 (BD)
-CD9 (Miltenyi)
-CD133 (Miltenyi)
-TRA1-60 (Miltenyi)
-EpCAM (Miltenyi)
-ALDH1L1 (Miltenyi)
-GFAP (고정 후) (Sigma)
-Aqua4 (고정 후+Tx-100)
부착 세포를 위한 세포 제제:
세포를 트립신 (Gibco) 을 사용하여 3 분 동안 트립신처리하고, DMEM/F12 (Sigma) 중 2 ㎎/㎖ BSA (Sigma, Cat#: A9418) 를 보충한 DTI (Gibco) 로 불활성화시켰다. 세포를 배지와 함께 원뿔형 튜브 내에 수집하고, RT 에서 5 분 동안 300g 에서 원심분리하고, 상청액을 폐기했다. 세포를 차가운 PBS 완충액 (Gibco, Cat#:14190-094) 으로 재현탁시키고, RT 에서 5 분 동안 300g 에서 원심분리하고, 상청액을 폐기했다.
고정:
세포를 PFA 0.5% (희석됨, EMC) 로 재현탁시키고, 4℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션했다. 세포를 5 분 동안 300g 에서 원심분리하고, 상청액을 폐기했다. 세포를 1 ㎖ PBS 에서 세정하고, 5 분 동안 300g 에서 원심분리하고, 상청액을 폐기했다.
세포내 항원 염색을 위한 투과성화:
세포를 4℃ 에서 30 분 동안 Tx-100 0.5% 와 함께 인큐베이션하여 세포 막을 투과성화했다. 세포를 5 분 동안 300g 에서 원심분리하고, 상청액을 폐기했다. 세포를 PBS 에 재현탁시키고, 5 분 동안 300g 에서 원심분리하고, 상청액을 폐기했다.
면역염색:
세포를 FACS 완충액 (FB) (1x105 세포/튜브, 100 ul 의 부피) 으로 재현탁시켰다.
비접합 일차 항체의 경우:
비접합 일차 항체 및 비접합 동형 대조군 항체를 별도로 FB 에 희석했다. 일차 항체를 제조사의 지침에 따라 최적 희석률로 희석했다. 세포를 희석된 일차 항체 또는 희석된 동형 대조군 항체로 재현탁시키고, 4℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션했다.
세포를 5 분 동안 300g 에서 원심분리하고, 상청액을 폐기했다. 세포를 FB 로 세정하고, 5 분 동안 300g 에서 원심분리하고, 상청액을 폐기했다. 상응하는 형광색소 접합된 이차 항체를 FB 에 희석했다. 세포를 희석된 이차 항체로 재현탁시키고, 4 ℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션했다. 이차 항체를 제조사의 지침에 따라 최적 희석률로 희석했고, 이 인큐베이션을 어둠 속에서 실시해야 했다. 세포를 FB 로 재현탁시키고, 5 분 동안 300g 에서 원심분리하고, 상청액을 폐기했다. 세포를 0.5 ㎖ FB 에 재현탁시키고, 유세포 분석기에서 분석했다.
형광색소 접합된 일차 항체의 경우:
형광색소 접합된 일차 항체를 제조사의 지침에 따라 FB 에 희석했다. 세포를 접합된 일차 항체로 재현탁시키고, 어둠 속에서 4℃ 에서 15 분 동안 인큐베이션했다. 세포를 5 분 동안 300g 에서 원심분리하고, 상청액을 폐기했다. 세포를 FB 로 재현탁시키고, 5 분 동안 300g 에서 원심분리하고, 상청액을 폐기했다. 세포를 0.5 ㎖ PBS 에 재현탁시키고, 유세포 분석기에서 분석했다.
인간 PSC 유래 성상세포의 유전자 발현:
RNA 추출에 사용된 샘플:
RNA 샘플을 상이한 발달 시기의 hPSC 유래 성상세포로부터 추출했다;
Day 0 = EGF 및 bFGF 의 존재 하에 성장시킨 hPSC 유래 성상세포
Days 7-14 = 7-14 일 동안 EGF 및 bFGF 의 부재 하에 성장시킨 hPSC 유래 성상세포
Days 14-28 = 14-28 일 동안 EGF 및 bFGF 의 부재 하에 성장시킨 hPSC 유래 성상세포
Days 28-42 = 28-42 일 동안 EGF 및 bFGF 의 부재 하에 성장시킨 hPSC 유래 성상세포
Days 42-56 = 42-56 일 동안 EGF 및 bFGF 의 부재 하에 성장시킨 hPSC 유래 성상세포
hPSC 유래 성상세포로부터 RNA 의 추출:
0.05% 트립신 (Invitrogen#25200-056) 을 세포 샘플 (1*106-10*106 세포) 에 첨가했다. 세포를 37℃ 에서 5 분 동안 인큐베이션했다. 트립신을 2 부피의 2 ㎎/㎖ BSA (Sigma) 의 첨가에 의해 불활성화시켰다. 세포를 300 rpm 에서 원심분리하고, 상청액을 제거했다. 펠렛을 1 ㎖ 의 RLT (Qiagen) 및 10 ㎕ 베타-메르캅토에탄올에 재현탁시키고, -80℃ 에서 저장했다.
실시간 RT-PCR
시약 및 장비
TaqMan® 유전자 발현 검정법 프로브:
- A2B5 (ABI, Life technologies)
- GFAP Hs00909236 (life technologies)
- BDNF (ABI, Life technologies)
- PDGFR Hs00998018 (life technologies)
- GLAST (ABI, Life technologies)
- GDNF (ABI, Life technologies)
- ALDH1L1 Hs00201836 (life technologies)
- TRA-1-60 (ABI, Life technologies)
- Nanog Hs04260366 (life technologies)
- Oct4 (ABI, Life technologies)
- Glul Hs00365928 (life technologies)
- IGF-1(ABI, Life technologies)
- NGF (ABI, Life technologies)
- Aqua4 (ABI, Life technologies)
- Connexin30 (ABI, Life technologies)
- CD44 (ABI, Life technologies)
ㆍ Human total RNA (Ambion).
ㆍ Human Fetal RNA (Clontech).
ㆍ TaqMan PCR master mix, 50㎖ (Applied Biosystems).
ㆍ Fast Optical 96-well reaction plate (Applied Biosystems).
ㆍ RT-PCR 용 T-Professional basic gradient (Biometra).
ㆍ High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (200 회 반응) (Applied Biosystems).
ㆍ Step One Plus real time PCR system (Applied Biosystems).
역전사
역전사를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) 및 T-Professional basic gradient 를 사용하여 수행했다. 하기 절차는 Invitrogen 의 프로토콜에 기초했다.
하기 RNA/프라이머 혼합물을 각각의 튜브 내에서 제조했다:
RT 완충액 2㎕
Total RNA 1㎍
RT 랜덤 프라이머 1㎕
RNase 저해인자 1㎕
역전사 효소 1㎕
100mM dNTP 믹스 0.8㎕
DEPC H2O ~ 10㎕
자동 서모사이클러를 하기와 같이 프로그램했다:
1. 25℃ 10 분
2. 37℃ 120 분
3. 85 ℃ 5 분
4. 4℃ 중지
cDNA 를 실시간 PCR 에 사용하기 전까지 -20℃ 에서 저장했다.
실시간 PCR
하기 혼합물을 광학 플레이트의 각각의 웰 내에서 제조했다 (10 ㎕ 반응 혼합물을 위해).
5 ㎕ TaqMan 믹스
0.5 ㎕ 프로브+프라이머
0.5 ㎕ cDNA
4 ㎕ H2O
각각의 유전자에 대해 qPCR 에 의해 얻어진 데이타를 성체 태아 뇌 RNA 를 기준으로 사용하여 분석했다.
hPSC 유래 성상세포 신경영양 인자 분비 검정법
Elisa 프로토콜:
사용된 상업적 키트: - BDNF (promega #G7610)
- GDNF (promega #G7620)
- IGF-1 (R&D Systems # DG100)
- VEGF (R&D Systems #DVE00)
- NGF (promega #G7630)
hPSC 유래 성상세포를 적어도 20 일 동안 성장 인자 (EGF+bFGF) 의 부재 하에 성장시켰다. hPSC 유래 성상세포 상청액 배지 (조건 배지) 및/또는 세포 내용물 (24h-72h) 을 마지막 배지 보충 후에 수집했다.
각각의 인자에 대해 Elisa 를 제조 프로토콜 지침에 따라 수행했다.
글루타메이트 흡수 프로토콜:
상업적 키트: - EnzyChrom Glutamate Assay Kit (Bioassay Systems # EGLT-100) 를 사용했다.
사용된 세포 배양물 샘플: 적어도 20 일 성장 인자 박탈된 (EGF+bFGF) hPSC 유래 성상세포, 양성 대조군- 인간 성상세포 (Gibco), 음성 대조군- 인간 섬유아세포. 글루타메이트 (0.5-3mM) 를 각각의 실험 웰에 첨가했다.
시험된 세포로부터 적어도 0.5 ㎖ 의 배지 샘플을 하기 시점: T=0', 10', 30', 60', 90', 120' 에 취하고, 그것을 추가 가공 전까지 4℃ 에서 저장했다. 글루타메이트 흡수를 제조사의 프로토콜 (Bioassay Systems # EGLT-100) 에 따라 수행했다.
이식에 사용된 인간 성상세포:
인간 성상세포를 위에 기재된 바와 같이 ("검정법에 사용되는 성상세포의 생성") 단계 1 내지 8 을 통하여 생성했다. 이식을 위해, 성장 인자의 제거에 의해 인간 성상세포 전구 세포가 분화하게 했다. 2 개의 세포 집단을 실험에 사용했다: 하나는 성장 인자의 부재 하에 7 일 동안 성장시킨 것이고 ("Day7"), 다른 하나는 42 일 동안 성장시킨 것이다 ("day42"). "day7" 및 "day42" 의 인간 성상세포를 DMEM/F12 에 2.85×105 세포/㎕ 의 농도로 현탁시켰다.
세포 이식
실험 디자인
5 개의 이식 실험 군을 시험했다. 군 #1 에서, 67±2 일령 SOD1G93A 마우스에 "day42" 분화된 인간 성상세포를 이식했다 (n
Figure pct00002
=
Figure pct00003
10 SOD1G93A 마우스). 군#2 에서, 67±2 일령 SOD1G93A 마우스에 "day7" 분화된 인간 성상세포를 이식했다 (n
Figure pct00004
=
Figure pct00005
12 SOD1G93A 마우스). 군#3 에서, 67±2 일령 SOD1G93A 마우스 및 97±2 일령 SOD1G93A 마우스 (n
Figure pct00006
=
Figure pct00007
13) 에 "day 7" 세포의 2 회 주입을 수행했다. 군#4 에서 67±2 일령 SOD1G93A 마우스 (n=10) 에 오직 비히클만 주입했고 (DMEM/F12 가짜 주입된 군), 군#5 에서는 어떠한 처리도 하지 않았다 (무손상 군, n=4). 마우스에게 이식 전 3 일에 시작하여 실험 마지막까지 10 ㎎/Kg 시클로스포린 (Sandimmun, Novartis) 을 매일 I.P. 주입하여 면역억제했고, 또한 이식 전 3 일에 시작하여 이식 후 day7 까지 15 ㎎/kg CellCept (Roche) (per O.S) 를 1 일 2 회 제공했다.
인간 성상세포 이식
면역 억제된 동물은 67±2 일 (모든 군) 및 97±2 (군#3) 에 이식을 받았다. 7 ㎕ 의 배지 또는 총 부피 7 ㎕ 의 2.0×106 세포를 소뇌숨뇌수조 (Cisterna Magna) 를 통하여 척추강내 주입했다. 30-게이지 45° 빗각 바늘 (beveled needle) (Hamilton; Reno, NV) 이 부착된 Hamilton 기밀 주사기 (10 ㎕) 를 사용하여 세포를 전달했다. 이식 시간의 완료 후에, 세포 생존력을 Nucleocounter 를 사용하여 평가했고, 85% 초과인 것으로 밝혀졌다.
SOD1 G93A 마우스
G93A 돌연변이를 갖는 인간 SOD1 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 사용했다 (B6SJL-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J). 수컷 및 암컷 마우스를 실험 군 사이에 균일하게 분포시켰다. 마우스를 The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) 로부터 얻었고, 인 하우스 콜로니 (in-house colony) 로서 유지했다.
동물의 관리 및 처리
모든 절차를 이스라엘 가이드라인에 엄격히 부합되게 수행했다; 임의의 잠재적 통증 또는 동물 불편을 최소화하기 위한 조치를 취했다. 마우스를 표준 온도 (21℃) 에서 빛 제어되는 환경에서 수용하고 먹이 및 물을 무제한 공급하였으며, 동일한 방에 위치하는 환기되는 우리의 랙에 유지했다. 탈수를 피하기 위해, 동물이 질환 증상을 보이기 시작할 때 우리의 물 접시에 대한 접근을 제공했다.
거동 및 운동 성능 분석
앞다리 악력 (Grip Strength)
동물 체중측정 및 모든 거동 데이타 수집을 이식 1 주 전에 시작했고, 말기 전까지 매주 2 회 수행했다. 앞다리 근육 악력을 "악력 측정기 (Grip Strength Meter)" 를 사용하여 별도로 확인했다. 힘 측정기에 부착된 얇은 막대를 동물이 움켜잡는 것을 허용하여 악력 시험을 수행했다. 이에 뒤이어 뒷- 또는 앞다리가 막대를 놓을 때까지 동물을 측정기로부터 잡아당겼다. 이는 최대 악력에 관한 값을 제공한다. 힘 측정을 3 회의 별도의 시험에서 기록하고, 평균값을 분석에 사용했다.
Rotarod 성능 시험
운동 기능을 1 주 2 회 수행했다. 운동 기능을 가속 Rota-Rod 장치 (180 초 동안, Rota-Rod 7650; Ugo Basile, Comerio, Italy) 를 사용하여 시험했다. 마우스가 막대로부터 떨어지기 까지의 시간을 기록했다. 동물을 기록 전에 1 주일 동안 훈련시켰다. 기록을 삽입 1 주 전에 시작했다.
BBB-임상 점수부여
점수부여를 하기 표에 따라 0 내지 5 의 등급으로 수행했다. 임상 사진이 2 개의 정의된 점수 사이에 있을 때 마우스에게 "중간 (in-between)" 점수 (즉, 0.5, 1.5, 2.5, 3.5) 를 부여할 수 있다.
점수는 등급 0 내지 5 로 매겼다:
Figure pct00008
Figure pct00009
임상 사진이 2 개의 정의된 점수 사이에 있을 때 마우스에게 "중간" 점수 (즉, 0.5, 1.5, 2.5, 3.5) 를 부여한다. 대부분의 경우에 마우스는 3.5-4 의 임상 점수에 도달하고, 그들의 임상 징후는 그 시점 이후에 계속 악화된다.
체중
체중을 1 주일에 2 회 측정했다.
생존/말기 및 발병 분석
신뢰할 수 있는 윤리적 방식으로 질환 말기를 확인하기 위해, 마우스가 옆으로 놓였을 때 30 초 안에 바로 서는 능력이 없을 때를 말기를 정의했다.
질환 발생을 160 초 보다 밑으로의 rotarod 성능의 감소에 의해 정의했다.
통계 분석
통계 소프트웨어 Sigmastat (SAS Software) 를 사용하여 SOD1G93A 마우스의 Kaplan-Meier 분석을 수행하여 생존, 질환 발생 및 지속기간 데이타를 분석했다. 체중, Rotarod, BBB 및 악력 결과를 반복 측정 ANOVA 를 통해 분석했다. 일부 경우에, Student t-시험을 수행하여 동물 군 사이에 데이타를 비교했다. 모든 데이타가 평균 ± S.E.M. 로서 제시되어 있고, 유의성 수준은 p≤0.05 에서 설정되었다.
조직학적 및 생화학적 분석
조직 가공
동물을 말기에 0.3% 염분, 그에 뒤이어 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드 (Fisher Scientific; Pittsburgh, PA) 를 경심 관류하여 희생시켰다. 동물로부터 척수를 제거하고, 그에 뒤이어 3 일 동안 4℃ 에서 30% 수크로스 (Fisher)/.1 M 포스페이트 완충액 중에서 냉동보호했다. 조직을 OCT (Fisher) 에 포매시키고, 드라이 아이스로 급속 냉동시키고, 가공되기 전까지 -80℃ 에서 저장했다. 척수 조직 블록을 정중 또는 횡단 면으로 30 ㎛ 두께로 잘랐다. 절편을 유리 슬라이드 위에 수집하고, 분석되기 전까지 -20℃ 에서 저장했다. 척수 슬라이스의 부분집합을 자유 부동 조직화학을 위해 PBS 중에 수집했다.
이식물 생존 및 이주의 정량화
HuNA (인간 핵 항원; Millipore; Temecula, CA; 모노클로날; 1
Figure pct00010
400) 을 사용하여 이식물-유래 인간 세포 (hGRPs 및 hFs 둘 모두) 를 선별적으로 식별했다.
실시예 1
시험관내에서 인간 다능성 줄기 세포 (PSC) 유래 성상세포의 생성 및 특성분석.
성숙한 성상세포로 향하는 인간 성상세포 전구 세포 (APC) 의 분화를 각각의 성상세포주에 대해 시험관내에서 하기에 의해 시험했다:
a. 실시간 PCR (qPCR). 하기 프로브 (mRNA) 를 시험했다: BDNF, GDNF, PDGFR, GFAP, GLAST 및 ALDH1L1. 도 1 은 hESC 유래 성상세포의 성상세포 계통 유전자 발현의 동역학을 보여준다. 성숙한 표현형으로 향하는 성상세포 전구 세포 분화를 촉진하기 위해, 성장 인자를 배지로부터 제거했다. day 0 (성장 인자 존재함) 에 그리고 성장 인자 제거 후 격주로 샘플을 수집하여 시험했다. 인간 태아 뇌가 모든 시험된 유전자 (상대적 정량화 (RQ) =1) 에 대해 기준 샘플로서 사용되었고, 인간 성체 뇌와 함께 양성 대조군으로서의 역할을 했다. 인간 성체 뇌가 50% 초과의 성상세포로 이루어진다는 점을 주목하는 것이 중요하다. 이 연구에서 세포 분화 후에 모든 시험된 성상세포 유전자에서 유의한 증가가 발견되었고, 많은 경우에 성상세포 유전자 (즉 GFAP, BDNF, PDGFRα 및 GLAST) 의 발현이 인간 태아 뇌보다 유의하게 더 높았다 (도 1). 이들 결과는 이 프로토콜이 인간 성상세포의 농축된 집단을 초래한다는 것을 입증한다.
b. 조기 및 후기 신경교 한정 마커 예컨대: CD44, CXCR4 및 GLAST 를 사용하는 형광-활성화 세포 분류 (FACS, 유세포분석법) 분석. 제시된 FACS 분석 (도 2) 에서 조기 성상세포 마커 예컨대 CD44 및 CXCR4, 및 후기 성상세포 마커로서의 GLAST 의 동역학을 시험했다. Fusin 또는 CD184 로서도 알려진 CXCR4 는 CNS 에서 강력한 화학주성 활성을 갖는 케모카인 수용체이다. 세포의 95% 초과가 day 0 에서 21 까지 CXCR4 및 CD44 를 발현했고, 이들 수준은 성상세포 성숙 후에 감소하는 것으로 밝혀졌다. 이와 병행하여, GLAST 의 수준은 성상세포 성숙 후에 증가했다 (도 2). CXCR4 발현은 hESC 유래 성상세포 전구 세포의 높은 이주 잠재력 (세포가 그들의 목적지에 도달하는데 필요한 능력) 을 시사한다.
c. 성상세포 특이적 항체: GFAP, GLAST, S100b 및 Aquaporin4 를 사용하는 면역조직화학 (IHC). 우리의 ScanArray 하이 컨텐트 스크리닝 장치 (HCS) 에 의해 염색을 정량화한다. 도 3 에서 hPSC 유래 성상세포를 시험관내에서 분화의 day 50 에 염색했다. 이미지에서 볼 수 있는 바와 같이, 대부분의 세포는 성상세포-특이적 마커; GFAP, GLAST 및 AQP4 에 대해 양성이다.
실시예 2
hPSC 유래 성상세포의 생물학적 기능의 시험
여러 실험을 수행하여 hPSC 유래 인간 성상세포가 성숙한 건강한 성상세포의 기능적 특성을 나타내는 것을 입증했다. 시험관내 결과는 잠재적 생체내 작용 메카니즘을 밝혔다. 그 목적을 위해 하기 기능적 메카니즘을 시험했다:
a. 신경영양 인자 (NTF) 분비: 성상세포 상청액 배지 및 세제 추출물에 대해 BDNF, GDNF 및 VEGF 에 관해 Elisa 를 수행했다. 상이한 성상세포 활성화인자 예컨대 IFN-γ 및 LPS 를 사용했다. 도 4 는 hPSC 유래 성상세포의 활성화 후에, GDNF, BDNF 및 VEGF 가 배지로 분비되는 것을 보여준다 (도 4, 각각 가운데 칼럼).
b. 글루타메이트 흡수: 성상세포 상청액 배지 중 글루타메이트의 수준을 측정함으로써 성상세포 글루타메이트 흡수 능력을 시험했다. 비색 검정법 (Enzychrom) 을 사용하여 배지 중 글루타메이트의 수준을 측정했다. 섬유아세포를 음성 대조군으로서 사용했으며, 한편 성체 인간 조직으로부터의 성상세포는 양성 대조군로서 역할을 했다. 데이타는 인간 PSC 유래 성상세포에 의한 글루타메이트 흡수를 보여준다 (도 5). 이 연구에서 2 가지 글루타메이트 농도 (0.5mM 및 2mM) 의 글루타메이트 흡수의 동역학을 하기 시점에 시험했다: 글루타메이트의 첨가 후 0', 10', 30', 60' 90' 및 120'. 2 가지 농도 모두에서 hPSC 유래 성상세포가 배지로부터 글루타메이트를 시간 의존적 방식으로 흡수하는 것으로 밝혀졌다. 이는 성상세포의 특정 샘플의 글루타메이트 흡수 능력을 시사한다.
c. MN 신경보호 검정법: 이 검정법에서, 마우스 또는 인간 유래 운동 뉴런 (MN) 을 과산화수소 (H2O2) 로 자극했다. 산화 스트레스의 유도 후에 MN 의 생존에 대한 hPSC 유래 성상세포 조건 배지 및/또는 성상세포 첨가의 효과를 시험했다. 살아 있는/죽은 MN 의 수를 하이 컨텐트 스크리닝 장치 (Cellomics-Scan Array) 를 사용하여 평가했다. 이 검정법은 ALS 질환에서 MN 의 생존에 영향을 미치는 새로운 약물을 찾기 위한 귀중한 도구로서의 역할을 할 수 있다. 데이타는 산화 스트레스 (H2O2 에 의함) 하에 있던 설치류 척수 MN 에 대한 hPSC 유래 성상세포 조직 배양물로부터의 조건 배지의 신경보호 효과를 보여줬다. 도 6 에서 보여지는 바와 같이, hPSC 유래 성상세포로부터의 조건 배지의 보호 효과 및 마우스 MN 배양물에 대한 hPSC 유래 성상세포의 직접 첨가의 효과를 2 가지 농도의 H2O2 (50μM 및 150μM) 에서 시험했다. 2 가지 H2O2 농도 모두에서 hPSC 유래 성상세포 조건 배지의 첨가 후에 MN 죽음의 유의한 감소가 발견되었다. 현저히, 산화 스트레스 하에 있던 MN 배양물에 대한 hPSC 유래 성상세포 첨가의 신경보호 효과는 hPSC 유래 성상세포의 조건 배지를 첨가한 경우보다 훨씬 컸고 (도 6), 이는 hPSC 유래 성상세포의 존재가 산화 스트레스를 낮추는데 있어서 단지 hPSC 유래 성상세포의 분비물보다 더욱 유의함을 시사한다. 이들 결과는 우리의 hPSC 유래 성상세포의 신경보호 능력을 시험관내에서 추가로 입증한다. hPSC 유래 성상세포 프로토콜은 높은 순도의 인간 성상세포를 초래한다. 인간 성상세포는 시험관내에서 다음과 같은 기능적 성상세포 특성을 나타낸다; 신경영양 인자의 분비 및 글루타메이트 흡수 (운동 뉴런의 생존을 증가시키는 것으로 알려진 특성들). 시험관내 모델을 사용하여 산화 스트레스 하의 운동 뉴런을 보호함에 있어서의 hPSC 유래 성상세포의 잠재력을 직접 입증했다. 이 검정법은 생체내에서 인간 성상세포 신경보호 잠재력을 증가시키는 약물을 발견하는 귀중한 도구이다.
실시예 3
hPSC 유래 성상세포의 이식을 위한 최적 조건의 발견
SOD1 동물에 대한 실험에 앞서 상이한 이식 양상에 관해 최적화 실험을 수행했다.
a. 세포 주입 방법의 최적화
i. 상이한 이식 위치를 시험했다 (즉, 직접 척수 복측 각 내에, 경막 내에 또는 뇌실 내에).
ii. hPSC 유래 성상세포의 수를 시험했다 (주입/s 자리/s 당).
b. 뉴런 손상의 측정 및 삽입된 세포의 탐지를 위한 조직학 방법의 평가 (대규모 효능 연구를 최적화하는데 사용됨) 를 수행했다.
c. 질환에 뒤따르는 거동 및 전기생리학 시험의 유용성 평가.
d. 이식 후 hPSC 유래 성상세포 생존, 이주 및 세포 분화의 동역학을 면역조직화학을 사용하여 시험했다.
실시예 4
ALS 동물 모델 - SOD1 마우스 내 hPSC 유래 성상세포 이식
MN 에 대한 hPSC 유래 성상세포의 신경보호 효과를 생체내에서, 즉, 동물 운동 개선 및 생존에 대해 시험했다. 그 목적을 위해, hSOD1 G93A C57BL6/SJL 배경 (높은 카피 수) 마우스 모델을 사용했고 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 처리했다.
도 7 에서 보여지는 바와 같이 젊은 인간 유래 성상세포의 주입은 hSOD1 마우스의 생존을 증가시켰다. 도 8 은 가짜 주입과 비교할 때 "day7 (통합됨 (pooled))" 의 BBB Rotarod 성능의 유의한 개선을 보여준다 (P<0.05).
도 9 에서 보여지는 바와 같이, 가짜 주입 군과 비교할 때 "d7" 군은 체중을 유의하게 유지했다 (P<0.05).
도 10 에서 보여지는 바와 같이, T1/2 통계 분석은 가짜 주입 군과 비교할 때 "day7" 2 회 주입 군에서 생존의 유의한 증가가 관찰됨을 밝혔다 (P=0.046).
본 발명은 구체적 구현예와 함께 기재되었지만, 많은 대안, 변형 및 변화가 통상의 기술자에게 명백할 것이라는 점이 분명하다. 따라서, 첨부된 청구항의 주제 및 넓은 범위에 속하는 모든 그러한 대안, 변형 및 변화를 포괄하는 것이 의도된다.
이 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 개별적으로 본원에 참조로 포함되는 것으로 명시된 것처럼 전문이 본원에 참조로 포함된다. 또한, 이 출원에서 임의의 참고문헌의 언급 또는 확인은 그러한 참고문헌이 본 발명에 대한 선행 기술로서 입수가능하다는 것을 인정하는 것으로 여겨져서는 안된다. 섹션 제목이 사용되는 경우에, 그들은 반드시 제한적인 것으로 여겨져서는 안된다.

Claims (18)

  1. 하기 단계를 포함하는, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법:
    (a) 다능성 줄기 세포 (PSC) 로부터 생체외 분화된 성상세포의 집단을 물질과 접촉시키는 단계;
    (b) 단계 (a) 의 성상세포의 집단 또는 그의 조건 배지를 뉴런의 집단과 함께 공배양하는 단계; 및
    (c) 뉴런의 집단의 생존 또는 신경 기능을 향상시키는 상기 물질의 효과를 정량화하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 뉴런의 집단이 산화 스트레스 하에, 글루타메이트 독성 하에 또는 AMPA/카이네이트 독성 하에 저산소성인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 단계 (b) 에서 성상세포 대 뉴런의 집단의 비율이 1:1, 10:1, 100:1, 1000:1, 또는 10,000:1 초과인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 성상세포가 GFAP, GLAST, AQP4 각각, 또는 그들의 조합을 발현하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 성상세포가 BDNF, GDNF 및 VEGF 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 신경영양 인자의 분비를 나타내는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 산화 스트레스가 반응성 산소 종 (ROS), H2O2, 및 그의 임의의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 정량화가 세포자멸사 중인 뉴런의 수를 계수함으로써 수행되는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 세포자멸사가 Caspase-3a 라벨링, Annexin V, Tubulin-B3, HB9 또는 DAPI 에 의해 탐지되는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 물질이 소분자인 방법.
  10. ALS 진행의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상에서의 ALS 진행의 치료 또는 예방 방법으로서, 다능성 줄기 세포 (PSC) 로부터 생체외 분화된 인간 선조 성상세포 또는 성상세포의 세포 집단의 치료 유효량을 그것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 선조 성상세포 또는 성상세포가 GFAP, GLAST, AQP4 각각 또는 그들의 조합을 발현하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 선조 성상세포 또는 성상세포가 BDNF, GDNF 및 VEGF 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 신경영양 인자의 분비를 나타내는 방법.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 선조 성상세포 또는 성상세포가 글루타메이트 흡수 능력을 나타내는 방법.
  14. 제 10 항에 있어서, 상기 투여가 그것을 필요로 하는 대상의 뇌척수액, 뇌 또는 척수로 향하는 방법.
  15. 제 10 항에 있어서, 상기 인간 선조 성상세포 또는 성상세포가 상기 대상에게 비-자가인 방법.
  16. 제 10 항에 있어서, 상기 인간 선조 성상세포 또는 성상세포가 상기 대상에게 동종이계인 방법.
  17. 제 10 항에 있어서, 상기 인간 선조 성상세포 또는 성상세포가 유전자 조작되지 않은 세포인 방법.
  18. ALS 를 치료하는 것으로 확인된 약제의 제조를 위한, 다능성 줄기 세포 (PSC) 로부터 생체외 분화된 인간 선조 성상세포 또는 성상세포의 세포 집단의 용도.
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