JPWO2020054647A1 - アストロサイトの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]胚様体を単一細胞に解離させてBasic fibroblast growth factor(bFGF)及びEpidermal Growth Factor(EGF)を含有する無血清培地中で浮遊培養し、神経幹細胞塊を得ることと、前記神経幹細胞塊を単一細胞に解離させて無血清培地中で接着培養し、アストロサイトを含む細胞集団を得ることと、を備える、アストロサイトの製造方法。
[2]前記胚様体が、多能性幹細胞を無血清培地中で培養することにより得られたものである、[1]に記載のアストロサイトの製造方法。
[3]前記多能性幹細胞が、健常人由来の人工多能性幹細胞又は神経疾患患者由来の人工多能性幹細胞である、[2]に記載のアストロサイトの製造方法。
[4]前記神経幹細胞塊を得ることが、前記胚様体を単一細胞に解離させてbFGF及びEGFを含有する無血清培地中で浮遊培養し、1次神経幹細胞塊を得ることと、前記1次神経幹細胞塊を単一細胞に解離させてbFGF及びEGFを含有する無血清培地中で浮遊培養し、高次神経幹細胞塊を得ることと、を含む、[1]〜[3]のいずれかに記載のアストロサイトの製造方法。
[5]前記アストロサイトを含む細胞集団を得ることにおいて、前記無血清培地にBrain derived neurotrophic factor(BDNF)及び/又はGlial−Cell Derived Neurotrophic Factor(GDNF)を更に含有させる、[1]〜[4]のいずれかに記載のアストロサイトの製造方法。
[6]前記細胞集団中のアストロサイトの割合が90%以上である、[1]〜[5]のいずれかに記載のアストロサイトの製造方法。
[7]前記アストロサイトが静的状態である、[1]〜[6]のいずれかに記載のアストロサイトの製造方法。
[8]容器内に無血清状態で収容された細胞集団であって、アストロサイトの割合が90%以上である、細胞集団。
[9]静的状態である、[8]に記載の細胞集団。
[10]細胞密度が1×105/mL以上である、[8]又は[9]に記載の細胞集団。
[11]Glial Fibrillary Acidic Protein(GFAP)陽性細胞を95%以上含み、S100 Calcium Binding Protein B(S100B)陽性細胞を95%以上含む、[8]〜[10]のいずれかに記載の細胞集団。
[12]培地に血清を添加するとGFAP、NFIA、ALDH1L1又はEAAT2の発現量が上昇する、[8]〜[11]のいずれかに記載の細胞集団。
[13][8]〜[12]のいずれかに記載の細胞集団及び神経細胞の共培養物。
[14]被験物質の存在下で、[8]〜[12]のいずれかに記載の細胞集団及び神経細胞を共培養することと、前記神経細胞の、突起伸長、形態、シナプス小胞、遺伝子発現、タンパク質発現又は電気生理学的パラメータを評価し、評価結果を得ることと、を備え、前記評価結果が、被験物質の非存在下における評価結果と比較して有意に変化したことが、前記被験物質が神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。
[15]トランスフェリン、プトレシン、インスリン、プロゲステロン、亜セレン酸ナトリウム及びB27サプリメントを含有する、神経幹細胞からアストロサイトへの分化誘導用無血清培地。
[16]BDNF及び/又はGDNFを更に含有する、[15]に記載の神経幹細胞からアストロサイトへの分化誘導用無血清培地。
1実施形態において、本発明は、胚様体を単一細胞に解離させてbFGF及びEGFを含有する無血清培地中で浮遊培養し、神経幹細胞塊を得る工程と、前記神経幹細胞塊を単一細胞に解離させて無血清培地中で接着培養し、アストロサイトを含む細胞集団を得る工程と、を備える、アストロサイトの製造方法を提供する。
1実施形態において、本発明は、容器内に無血清状態で収容された細胞集団であって、アストロサイトの割合が90%以上、好ましくは95%以上、更に好ましくは100%である、細胞集団を提供する。
α=GLASTの発現量/GFAPの発現量 …(1)
β=EAAT2の発現量/GFAPの発現量 …(2)
1実施形態において、本発明は、上述した細胞集団及び神経細胞の共培養物を提供する。
1実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、上述した細胞集団及び神経細胞を共培養する工程と、前記神経細胞の、突起伸長、形態、シナプス小胞、遺伝子発現、タンパク質発現又は電気生理学的パラメータを評価し、評価結果を得る工程と、を備え、前記評価結果が、被験物質の非存在下における評価結果と比較して有意に変化したことが、前記被験物質が神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供する。本実施形態のスクリーニング方法により、神経疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。
1実施形態において、本発明は、トランスフェリン、プトレシン、インスリン、プロゲステロン、亜セレン酸ナトリウム及びB27サプリメントを含有する、神経幹細胞からアストロサイトへの分化誘導用無血清培地を提供する。
(ヒトiPS細胞からアストロサイトへの分化誘導)
ヒトiPS細胞を分化誘導し、アストロサイトを製造した。ヒトiPS細胞としては、ヒトiPS細胞株である201B7細胞を使用した。
まず、フィーダー入りの10cmディッシュ上にセミコンフルエントのヒトiPS細胞を準備した。続いて、解離液Tでフィーダー細胞をはがした。解離液Tの組成を下記表1に示す。続いて、5mLのPBS(−)で2度洗浄した。
続いて、ヒト胚様体を15mLチューブに回収し、5分間静置した。続いて、上清を除去し、細胞解離酵素であるTrypLE Select(サーモフィッシャーサイエンテェフィック社)1mLで細胞を懸濁した。続いて、37℃の温浴で10分間細胞をインキュベートした。続いて、温浴から出して、細胞の分離具合を見ながら素早くトリプシンインヒビター1mLを加え、ピペッティングを行った。
20ng/mL FGF、10ng/mL EGFをT75フラスコに添加した(20日目)。続いて、1次神経幹細胞塊を50mLチューブに回収し、1,000rpmで10分間遠心した。20ng/mL FGF、10ng/mL EGF、1μM Purmorphamineを含む新しいproliferation培地30mlをT75フラスコに用意しておき、細胞を全量フラスコに移し、培地交換した(24日目)。続いて、20ng/mL FGF、10ng/mL EGFをT75フラスコに添加した(28日目)。
1次神経幹細胞塊を50mLチューブに回収し、1,000rpmで5分間遠心した。続いて、上清を除去し、TrypLE Select 1mLで1次神経幹細胞塊を懸濁した。続いて、37℃の温浴で10〜15分間インキュベートした。続いて、細胞の分離具合を見ながら、素早くトリプシンインヒビター1mLを添加し混合した。
20ng/mL FGF、10ng/mL EGFをT75フラスコに添加した(36日目)。続いて、2次神経幹細胞塊を50mLチューブに回収し、1,000rpmで10分間遠心した。20ng/mL FGF、10ng/mL EGFを含む新しいproliferation培地30mlをT75フラスコに用意しておき、細胞を全量フラスコに移し、培地交換した(40日目)。続いて、20ng/mL FGF、10ng/mL EGFをT75フラスコに添加した(44日目)。
2次神経幹細胞塊を50mLチューブに回収し、1,000rpmで5分間遠心した。続いて、上清を除去し、TrypLE Select 1mLで2次神経幹細胞塊を懸濁した。続いて、37℃の温浴で10〜15分間インキュベートした。続いて、細胞の分離具合を見ながら、素早くトリプシンインヒビター1mLを添加し混合した。
続いて、A0からA1に継代した。まず、培地を除去し、細胞剥離液(商品名「アキュターゼ」、フナコシ株式会社)700μL/ウェルを添加し、37℃で30〜60分間インキュベートした。
(ヒトiPS細胞から分化誘導したアストロサイトの遺伝子発現の検討)
実験例1と同様にして分化誘導したアストロサイトの各分化段階における、アストロサイト関連遺伝子の発現を定量的RT−PCR法により検討した。アストロサイト関連遺伝子としては、Glial Fibrillary Acidic Protein(GFAP)、S100 Calcium Binding Protein B(S100B)、Nuclear Factor IA(NFIA)、Aldehyde Dehydrogenase 1 Family Member L1(ALDH1L1)、GLutamate ASpartate Transporter(GLAST、SLC1A3とも呼ばれる)、Excitatory amino acid transporter 2(EAAT2、SLC1A2とも呼ばれる)を検討した。
α=GLASTの発現量/GFAPの発現量 …(1)
β=EAAT2の発現量/GFAPの発現量 …(2)
(ヒトiPS細胞から分化誘導したアストロサイトの機能解析1)
実験例1と同様にして分化誘導したアストロサイトの機能を解析した。具体的には、実験例1と同様にして分化誘導開始後51日目のアストロサイトにおける、グルタミン酸取り込み及びグルタミンレセプター刺激への応答性を検討した。
アストロサイトはグルタミン酸を取り込むことが知られている。そこで、実験例1と同様にして分化誘導したアストロサイトと、分化誘導に用いたヒトiPS細胞株である201B7のそれぞれについて、グルタミン酸添加後の培地中のグルタミン酸濃度を継時的に測定した。
実験例1と同様にして分化誘導したアストロサイトにカルシウム蛍光指示薬であるFluo−4を終濃度5μg/mLで培地に添加し、37℃で30分〜1時間インキュベートした。続いて、蛍光顕微鏡を用いて10秒毎にタイムラプス撮影を行った。
(ヒトiPS細胞から分化誘導したアストロサイトの培地ヘの血清添加の影響)
実験例1と同様にして分化誘導したアストロサイトは、無血清状態であり、静的状態である。このアストロサイトの培地に血清を添加し、アストロサイト関連遺伝子の発現量の変化を定量的RT−PCR法により検討した。アストロサイト関連遺伝子としては、実験例2と同様の遺伝子、すなわち、GFAP、S100B、NFIA、ALDH1L1、SLC1A3、SLC1A2を検討した。
(ヒトiPS細胞から分化誘導したアストロサイトと神経細胞の共培養1)
実験例1と同様にして分化誘導したアストロサイトと神経細胞との共培養を行った。神経細胞としては、iPS細胞から分化誘導した神経細胞を使用した。
(ヒトiPS細胞から分化誘導したアストロサイトと神経細胞の共培養2)
アポリポタンパクEは、VLDL、IDL、HDL等のリポタンパク質を構成している主要なアポリポタンパク質の1つである。アポリポタンパクEをコードするAPOE遺伝子にはε2、ε3、ε4の3つの対立遺伝子があり、アポリポタンパクEには、各対立遺伝子に対応するE2、E3、E4の3つのアイソフォームが存在する。ε3/ε3アリルにコードされるアポリポタンパクE3は正常型(野生型)であり、ε4/ε4アリルにコードされるアポリポタンパクE4はアルツハイマー病(AD)の危険因子と考えられている。また、ε2/ε2アリルにコードされるアポリポタンパクE2は受容体との結合力が低く高脂血症の原因になると考えられている。
(ヒトiPS細胞から分化誘導したアストロサイトの機能解析2)
アストロサイトの活動性を評価するシステムを構築した。まず、実験例1と同様にして、ヒトiPS細胞を分化誘導し、アストロサイトを製造した。ヒトiPS細胞としては、健常人由来のiPS細胞株である201B7、WD39、1210C1、及び、アルツハイマー病患者由来のiPS細胞株であるADを使用した。
Claims (16)
- 胚様体を単一細胞に解離させてBasic fibroblast growth factor(bFGF)及びEpidermal Growth Factor(EGF)を含有する無血清培地中で浮遊培養し、神経幹細胞塊を得ることと、
前記神経幹細胞塊を単一細胞に解離させて無血清培地中で接着培養し、アストロサイトを含む細胞集団を得ることと、
を備える、アストロサイトの製造方法。 - 前記胚様体が、多能性幹細胞を無血清培地中で培養することにより得られたものである、請求項1に記載のアストロサイトの製造方法。
- 前記多能性幹細胞が、健常人由来の人工多能性幹細胞又は神経疾患患者由来の人工多能性幹細胞である、請求項2に記載のアストロサイトの製造方法。
- 前記神経幹細胞塊を得ることが、
前記胚様体を単一細胞に解離させてbFGF及びEGFを含有する無血清培地中で浮遊培養し、1次神経幹細胞塊を得ることと、
前記1次神経幹細胞塊を単一細胞に解離させてbFGF及びEGFを含有する無血清培地中で浮遊培養し、高次神経幹細胞塊を得ることと、
を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のアストロサイトの製造方法。 - 前記アストロサイトを含む細胞集団を得ることにおいて、前記無血清培地にBrain derived neurotrophic factor(BDNF)及び/又はGlial−Cell Derived Neurotrophic Factor(GDNF)を更に含有させる、請求項1〜4のいずれか一項に記載のアストロサイトの製造方法。
- 前記細胞集団中のアストロサイトの割合が90%以上である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のアストロサイトの製造方法。
- 前記アストロサイトが静的状態である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のアストロサイトの製造方法。
- 容器内に無血清状態で収容された細胞集団であって、アストロサイトの割合が90%以上である、細胞集団。
- 静的状態である、請求項8に記載の細胞集団。
- 細胞密度が1×105個/mL以上である、請求項8又は9に記載の細胞集団。
- Glial Fibrillary Acidic Protein(GFAP)陽性細胞を95%以上含み、S100 Calcium Binding Protein B(S100B)陽性細胞を95%以上含む、請求項8〜10のいずれか一項に記載の細胞集団。
- 培地に血清を添加するとGFAP、NFIA、ALDH1L1又はEAAT2の発現量が上昇する、請求項8〜11のいずれか一項に記載の細胞集団。
- 請求項8〜12のいずれか一項に記載の細胞集団及び神経細胞の共培養物。
- 被験物質の存在下で、請求項8〜12のいずれか一項に記載の細胞集団及び神経細胞を共培養することと、
前記神経細胞の、突起伸長、形態、シナプス小胞、遺伝子発現、タンパク質発現又は電気生理学的パラメータを評価し、評価結果を得ることと、
を備え、前記評価結果が、被験物質の非存在下における評価結果と比較して有意に変化したことが、前記被験物質が神経疾患の治療薬の候補であることを示す、神経疾患の治療薬のスクリーニング方法。 - トランスフェリン、プトレシン、インスリン、プロゲステロン、亜セレン酸ナトリウム及びB27サプリメントを含有する、神経幹細胞からアストロサイトへの分化誘導用無血清培地。
- BDNF及び/又はGDNFを更に含有する、請求項15に記載の神経幹細胞からアストロサイトへの分化誘導用無血清培地。
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