CN1871340A - 从胚胎干细胞体外生产γ－氨基丁酸能神经元及其在神经障碍治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从多能干细胞如胚胎干细胞来有效地生产神经母细胞和分化神经细胞如γ－氨基丁酸能神经元的改进的方法。采用此方法可以分离出包含高比例γ－氨基丁酸能神经元的细胞群。本发明描述的神经母细胞和终末分化细胞可大量生产，因此可为神经变性症和神经元疾病，如中风、局部缺血、癫痫和亨廷顿病的细胞替换治疗提供优良的细胞来源。

Description

从胚胎干细胞体外生产γ-氨基丁酸能神经元 及其在神经障碍治疗中的应用

技术领域

本发明涉及一种从多能干细胞如鼠或者人胚胎干细胞来生产终末分化的神经元细胞，如γ-氨基丁酸能神经元的改进的方法。本发明所涉及的γ-氨基丁酸能神经元可以为神经变性症和神经元疾病，如中风、局部缺血、帕金森症、阿尔茨海默病、癫痫和亨廷顿病的细胞替换治疗提供优良的细胞来源。

背景技术

γ-氨基丁酸(GABA)是中枢神经系统(CNS)中的主要抑制性神经递质，其广泛地分布于脑组织，并在调节局部循环的中间神经元中表达。能够产生γ-氨基丁酸的γ-氨基丁酸能神经元是哺乳动物中枢神经系统中主要的抑制性神经元，中枢神经系统中60-75％的突触是γ-氨基丁酸能神经元(Schwartz，R.D.，1988，Biochem.Pharmacol.37：3369-75)。γ-氨基丁酸能神经元位于海马、小脑、大脑皮层和视丘下部，γ-氨基丁酸结合至少三种受体，其包括GABA-A和GABA-B。GABA-A受体介导快速抑制性突触传递，神经元兴奋性和情绪的迅速改变，例如发作的阈值、忧虑、恐慌和对压力的反应(例如，“搏斗或飞跃”反应)。GABA-A受体也是苯并二氮卓、乙醇、巴比妥酸盐和神经类固醇的结合位点。GABA-B受体介导缓慢抑制性传递，其对于记忆力、情绪和疼痛有重要作用。

一些神经紊乱的发病机理涉及γ-氨基丁酸能神经传递的减少，包括多种形式的癫痫、慢性痛、焦虑症和其它情绪紊乱。例如，正电子发射断层扫描研究(PET)表明恐慌失调的病人GABA-A受体的结合减少(Malizia etal.，1998，Arch.Gen.Psychiatry 55：715-20)。另外，血浆低浓度的γ-氨基丁酸是一个亚群的情绪紊乱病人的特征(Brambilla et al.，2003.Mol.Psychiatry8：721-37)。一些能够增强γ-氨基丁酸活性的药物已经被证明在这些失调的治疗中有效，例如，苯并二氮卓，2-丙基戊酸钠和苯巴比妥。

中枢神经系统的许多疾病例如帕金森症、阿尔茨海默病、多发性硬化、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化、脑缺血和中风等具有共同特征——在脑和脊髓区域的神经元退化。退化或者被损伤的细胞或者神经元无法被机体替换或修复，这样将会导致永久的不可逆的损伤(During et al.，2001，Human GeneTher.12：1589-1591)。当血液凝块封闭血管或动脉时，会中断血液流向脑组织的某个区域，引起封闭血管临近区域的脑细胞死亡，导致发生中风或者脑缺血。在中风或者缺血发生后，梗塞的脑细胞通常在几分钟或数小时内死亡。这些细胞的死亡会导致化学物质的释放，从而引发被称为“缺血级联反应”的链式反应，这将会危及血液供应受阻的脑组织周围的更大区域的脑细胞。如果没有及时的医疗救助，更大区域的脑细胞也会死亡，这甚至可能会对脑组织产生更为严重的长期损伤。考虑到局部缺血级联反应的快速性，介入治疗的窗口期仅约6小时。超过治疗窗口期，恢复血液流动及应用神经保护剂可能不会有所帮助，并且会引起脑功能的进一步损伤(Padosch et al.，2001，Anaesthesist50：905-920；Nishino and Borlongan，2000，Prog.Brain Res.127：461-476)。

当中风发生时，向脑部的血液流动被中断会对神经元细胞个体或亚群产生有害的和潜在的致死效应。由于脑缺血，在脑部特定区域大量神经细胞缺乏氧和必需的营养，这会导致病人严重的机能丧失。例如，中风病人会丧失讲话、记忆、认知的能力，活动性减退甚至瘫痪。缺乏充足的血液供应，脑细胞不能够产生能量，尤其是三磷酸腺苷(ATP)。如果能量衰竭的临界阈出现，会导致脑细胞损伤和死亡。许多研究者认为大量机制引发伴随能量衰竭的脑细胞损伤和死亡，其中每一个机制代表一种潜在的治疗方法。

脑细胞对能量衰竭的一种反应方式是通过提高胞内的钙浓度。此浓度可被一种称为兴奋性中毒的过程驱动到危险水平，在这个过程中脑细胞释放过量的谷氨酸，这是一种神经递质，其可导致位于脑组织海马、皮层和丘脑部关键细胞的降解和破坏(Nishino and Borlongan，2000，Prog.Brain Res.127：461-476)。另外，在脑组织海马区中产生γ-氨基丁酸的细胞通常在中风之后会衰退(Nishino and Borlongan，2000，Prog.Brain Res.127：461-476)。根据神经组织病理学和神经心理学的研究，已开发了许多神经保护性药物用于治疗与脑缺血或中风相关的神经紊乱，例如，γ-氨基丁酸能激动剂、钙拮抗剂、谷氨酸拮抗剂和抗氧化剂(Stutzmann et al.，2002，CNS Drug Rev.8：1-30；Rochelle et al.，2001，J.Neurochem.77：353-371；Blezer et al.，2002 Eur.J.Pharmacol.444：75-81)。当前在各种开发阶段有数百种药物和化合物可用于中风的预防和急性介入治疗(Rochelle et al.，2001，J.Neurochem.77：353-371)。预期这些药物中将会有一些申请呈交FDA，许多也已经进入最后一期临床试验。在这些药物中，已发现γ-氨基丁酸能类药物在治疗脑缺血或中风相关的神经紊乱中特别有效。

然而考虑到缺血性脑细胞损伤的多维特征，中风专家预测，在中风发作期间和中风之后，单一的药物治疗不能够完全地保护脑。尽管当前的治疗方法不能完全治疗脑缺血或中风相关的损伤，但是开发各种神经变性症和神经元疾病的其它治疗方法引起了很大的关注。细胞水平的治疗可能是有效地治疗上述损伤的唯一方法。许多神经疾病和病症是由于脑和脊髓中神经细胞死亡而引起的。这些神经疾病和病症有很大范围，包括但不局限于帕金森病，阿尔茨海默病、亨廷顿病和脊髓损伤，可以对它们进行细胞水平的治疗。例如，患有帕金森病的患者通过在患病个体的脑组织中植入多巴胺能神经元已经能够被成功治愈(Grisolia，2002，Brain Res Bull 57：823-826)。因此，当脑缺血或中风病人产生γ-氨基丁酸的细胞被侵袭或者损伤时，用新的健康的产生γ-氨基丁酸的细胞替换那些损伤的细胞，对于脑缺血或者中风的治疗可能是一种理想的疗法。

应用细胞移植作为神经变性症和神经元疾病的一种治疗方法所存在的一个主要问题是需要大量的神经元细胞，而这些细胞很难从胎儿或者成人分离。解决这个困难的一个方法是要获得多能干细胞，这些干细胞可被用来产生无限量的终末分化的细胞类型。多能胚胎干细胞(ES)是能够用于治疗各种神经变性症和神经元疾病的神经细胞的活的替代性来源。胚胎干细胞在未分化期能够无限增殖并且是多潜能的，这意味着它们能够分化成体内几乎所有细胞类型。因为胚胎干细胞能够变成体内几乎所有的专门细胞，所以对于广泛的组织和器官，例如心脏、胰脏、神经组织、肌肉、软骨等等，它们有潜力产生可供替换的细胞。胚胎干细胞能够从胚泡的内细胞群中获得，胚泡是植入期之前的胚胎发育阶段。人胚胎干细胞可以在胚胎发育早期(受精后的第4到第7天)从人胚泡中取得。从内细胞群取得的胚胎干细胞可以在体外培养，在合适条件下无限增殖。

许多物种的ES细胞系已经被成功建立，包括小鼠(Evans et al.，1981，Nature292：154-156)、大鼠(Iannaccone et al.，1994，Dev.Biol.，163：288-292)、猪(Evanset al.，1990，Theriogenology 33：125-128；Notarianni etal.，1990，J.Reprod.Fertil.Suppl.41：51-6)、绵羊和山羊(Meinecke-Tillmann andMeinecke，1996，J.Animal Breeding and Genetics 113：413-426；Notarianni etal.，1991，J.Reprod.Fertil.Suppl.43：255-60)、兔(Giles etal.，1993，Mol.Reprod.Dev.36：130-138；Graves etal.，1993，Mol.Reprod.Dev.36：424-433)、水貂(Sukoyan etal.，Mol.Reprod.Dev.1992，33：418-431)、仓鼠(Doetschman etal.，1988，Dev.Biol.127：224-227)、家禽(Pain et al.，1996，Development122(8)：2339-48)、灵长类(U.S.Patent No.5,843,780)和人(Thomson etal.，1998，Science 282：1145-1147；Reubinoff et al.，2000，Nature Biotech.18：399-403)。同其它哺乳动物ES细胞一样，当注射至免疫缺陷小鼠时，人ES细胞可以分化形成所有三胚层的组织，证明其具有多能性。已经发表的报道证明人ES细胞在培养液中培养维持一年多，在这期间仍能保持多能性、自我更新能力及正常核型(Thomson et al.，1995，PNAS 92：7844-7848)。

ES细胞被证明在体内模型(Bain et al.，1995，Dev.Biol.168：342-357)和体外模型中均可分化为神经元和神经胶质细胞(Brustle，et al.，1999，Science285：754-5；Bain et al.，1995，Dev.Biol.168：342-357)。同样地，囊胚期干细胞植入之后能够分化成多巴胺能和5-羟色胺能神经元(Deacon etal.，1998，Exp.Neurol.149：28-41)。人或啮齿动物干细胞当植入发育中的中枢神经系统(Flax et al.，1998，Nat.Biotechnol.16：1033-39；Brustle et al.，1998，Nat.Biotechnol.16：1040-44；Reubinoff et al.，2001，Nat.Biotechnol.19：1034-40)或成年中枢神经系统的神经性区域内时，能分化成为特定的神经细胞型(Fricker et al.，1999，J.Neurosci.19：5990-6005；Shihabuddin et al.，2000，J.Neurosci.20：8727-35)。

已报道了一种从未成熟神经细胞生产生成γ-氨基丁酸的细胞的方法(Rubenstein et al.，U.S.Patent No.6,602,680，参考合并于此)。Rubenstein等报道，在未成熟的神经细胞中，通过增强基因DLX例如DLX1、DLX2或者DLX5的活性来生产γ-氨基丁酸能细胞。基因DLX活性的增强使未成熟神经细胞分化为γ-氨基丁酸能表型细胞。从鼠胚胎干细胞获得产生γ-氨基丁酸的细胞的方法也已经有报道(Hancock et al.，2000，Biochem.Biophys.Res.Commun.271(2)：418-21，Westmoreland et al.，2001，Biochem.Biophys.Res.Commun.284(3)：674-80；U.S.Publication No.2003/0036195A1，每个均特别参考合并于此)，但是这些方法均不能产生高产量的γ-氨基丁酸能神经元。由于细胞替换治疗需要大量的γ-氨基丁酸能神经元，因此需要其它体外的方法从多能干细胞中产生大量的γ-氨基丁酸能神经元。

生产高产量的γ-氨基丁酸能神经元的方法对细胞移植治疗，尤其对患脑缺血或中风的病人有很大的临床意义。迄今为止，对脑缺血或中风相关的神经病理学可行的治疗非常有限，因此开发替代性疗法有很大的意义。细胞水平的治疗需要大量用于治疗的细胞或神经元，如果胎儿或成年组织是可用细胞或神经元的唯一来源，那么这种治疗就不可能进行。例如，为了研究运动功能的功能性恢复，必须将大约一百万个多巴胺能生成细胞植入到一个帕金森病动物模型中(Grisolia，2002，Brain Res.Bull.57：823-826)。从胎儿组织中获得如此大量的细胞会引发许多伦理问题。从多能干细胞生产γ-氨基丁酸能神经元能给细胞水平的治疗提供无限的γ-氨基丁酸能细胞的供应。为了使细胞的来源变得可行，必须要有能生产高产量的γ-氨基丁酸能神经元的方法，尤其是因为运用细胞的治疗可能需要大量的γ-氨基丁酸能神经元。

发明内容

本发明涉及从多能干细胞例如胚胎干细胞(ES)来生产神经母细胞(neuroprogenitor cells)和终末分化神经细胞或神经胶质细胞的改进的方法。在优选实施例中，多能干细胞或胚胎干细胞是鼠细胞。在此产生的细胞包括但不限于具有神经母细胞、诸如γ-氨基丁酸能、多巴胺能、5-羟色胺能和谷氨酸能神经元的神经细胞、以及诸如少突神经胶质细胞、星形胶质细胞的神经胶质细胞等的表型特征的细胞。本发明证明多能干细胞例如鼠胚胎干细胞能分化成高比例的γ-氨基丁酸能神经元(例如至少约60％)。根据本发明所述方法产生γ-氨基丁酸能神经元的比例高于以前叙述的方法。γ-氨基丁酸能神经元能够在多潜能的细胞水平的治疗中被运用，例如细胞替换治疗，或者治疗神经变性病和神经元疾病，包括例如中风、脑缺血、癫痫、帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病、慢性痛，焦虑症和其它情绪紊乱。

本发明提供了通过分化多能干细胞的体外培养获得分化细胞群，其中至少60％的分化神经细胞是γ-氨基丁酸能神经元，表现出γ-氨基丁酸能神经元表型的细胞，或者产生γ-氨基丁酸的细胞。优选地，γ-氨基丁酸能神经元表达GAD65，GAD67，GABA-A受体，或者GABA-B受体，或者他们的组合。在其它实施例中，至少约30％，35％，40％，45％，50％，55％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％的分化细胞是γ-氨基丁酸能神经元或者产生γ-氨基丁酸的细胞。优选γ-氨基丁酸能神经元或者产生γ-氨基丁酸的细胞源自胚胎干细胞，更优选是源自人或鼠的胚胎干细胞。在其它实施例中，分化细胞群也包含至少约15％的多巴胺能神经元，至少约10％谷氨酸能神经元，至少约5％的5-羟色胺能神经元，至少约5％的少突神经胶质细胞，至少约5％的星形胶质细胞，或者这些量的组合。

本发明也提供了从多能干细胞生产分化细胞群的方法，包括以下步骤：

(a)多能干细胞的扩增培养；

(b)培养多能干细胞来筛选巢蛋白阳性的神经母细胞；

(c)巢蛋白阳性的神经母细胞的扩增培养；

(d)在包含阿糖胞苷(Ara-C)的分化培养基中培养细胞，分化巢蛋白阳性的细胞来产生分化细胞群。

在优选的实施方式中，多能干细胞是胚胎干细胞，更优选是人或鼠的胚胎干细胞。

在其它实施例中，上述方法进一步包括培养步骤(b)的多能干细胞来形成胚状体的步骤。优选地，这些胚状体在筛选巢蛋白阳性的神经母细胞的条件下培养，例如：在无血清培养基中培养多能干细胞或胚状体，优选培养6-10天。在优选实施例中，无血清培养基是ITSFn无血清确定成分培养基，其更优选地包含一个或多个可溶因子，可溶因子选自由胰岛素，亚硒酸钠，碱性成纤维生长因子，转铁蛋白和纤维结合蛋白所组成的群组。优选地，ITSFn无血清确定成分培养基包括胰岛素，亚硒酸钠，转铁蛋白和纤维结合蛋白。在优选实施例中，这些方法会产生神经母细胞，其优选包含至少约60％-75％的巢蛋白阳性细胞，更优选包含约80％-90％的巢蛋白阳性细胞，最优选包含约95％-99％的巢蛋白阳性细胞。

在某些实施例中，上述方法进一步包含在中枢神经系统(CNS)扩增培养基中扩增步骤(c)的巢蛋白阳性神经母细胞的步骤，优选进行6-10天。优选地，CNS扩增培养基包括一个或多个可溶因子，可溶因子选自由N2补充物，B27补充物和神经诱导剂组成的群组。在优选实施例中，神经诱导剂是碱性成纤维生长因子(bFGF)。在另一优选实施例中，巢蛋白阳性神经母细胞在预先包被有聚L-鸟氨酸、聚L-层粘连蛋白或者两者组合的培养皿中培养。巢蛋白阳性神经母细胞可通过培养进行扩增，连续经过一次或多次的倍增。这些细胞在液氮中冷藏保存。

如上述方法中步骤(d)所述，巢蛋白阳性神经母细胞优先生长在分化培养基中两天或多天。优选地，分化培养基也包含N2补充物，B27补充物，或两者均包含，但不包括碱性成纤维生长因子(bFGF)。在优选实施例中，当神经母细胞在包含有阿糖胞苷(Ara-C)的分化培养基中生长之后，细胞进一步在不含有阿糖胞苷的分化培养基中培养，优选培养8-16天，更优选为12天。

本发明也提供从神经母细胞产生γ-氨基丁酸能神经元的方法，包含对巢蛋白阳性的神经母细胞进行富集，通过在含有阿糖胞苷的培养基中培养细胞使巢蛋白阳性细胞分化而产生γ-氨基丁酸能神经元。巢蛋白阳性细胞在含有阿糖胞苷的分化培养基中培养后，优选在不含有阿糖胞苷的分化培养基中进一步分化。优选地，这些方法使至少约40％-99％的巢蛋白阳性细胞分化为γ-氨基丁酸能神经元。

在优选实施例中，上述方法被用于产生分化细胞群，该细胞群优选包含约60-80％的γ-氨基丁酸能神经元，更优选约75-90％的γ-氨基丁酸能神经元，最优选约95-99％的γ-氨基丁酸能神经元。在另一实施例中，这些方法被用来产生分化细胞群，其优选包含约15-30％的多巴胺能神经元，更优选包含约20-40％的多巴胺能神经元，最优选包含约25-50％的多巴胺能神经元。在一些实施例中，这些方法被用于产生分化细胞群，其优选包含约5-20％的5-羟色胺能或谷氨酸能神经元，更优选的约10-25％的5-羟色胺能或谷氨酸能神经元，最优选的约15-30％的5-羟色胺能或谷氨酸能神经元。在其它实施例中，这些方法被用于产生分化细胞群，其优选包含约5-20％的少突神经胶质细胞或星形胶质细胞，更优选包含约10-25％的少突神经胶质细胞或星形胶质细胞，最优选的约15-30％的少突神经胶质细胞或星形胶质细胞。

本发明进一步提供了一种体外移植模型，用于在类似宿主的环境如脑环境中研究分化细胞的功效、可存活性和功能，分化细胞优选为神经元或神经细胞。例如，在此描述的γ-氨基丁酸能神经元与优选为神经细胞或海马细胞的成年脑细胞共同培养。优选地，γ-氨基丁酸能神经元在成年海马细胞上培养。这些细胞共培养至少3-20天，更优选为一周，确定神经元或神经细胞的存活率。优选地，至少约80％的神经元或神经细胞存活，更优选地，90-99％的细胞存活。高存活率表明这些细胞可能在成年脑环境中发挥了功能，其可用于治疗神经变性症或神经元疾病。

本发明也提供了一种治疗神经变性症或神经元疾病患者的方法，通过给受试者施用来源于例如在此描述的人或鼠的干细胞的多能干细胞的神经母细胞或分化神经细胞。该来源的细胞也可以用于受试者的细胞替换治疗。例如通过下述方法可以产生分化神经元细胞群：

(a)多能干细胞的扩增培养；

(b)培养多能干细胞来筛选巢蛋白阳性的神经母细胞；

(c)扩增巢蛋白阳性的神经母细胞；

(d)在包含阿糖胞苷(Ara-C)的分化培养基中培养细胞，使巢蛋白阳性细胞分化而产生分化细胞群。

在另一优选实施例中，步骤(d)中的分化细胞在不含有阿糖胞苷的分化培养基中进一步分化。在优选实施例中，受试者为病人，更优选是人类患者。优选地，源于多能干细胞的神经母细胞或分化细胞与受试者组织相容，例如神经母细胞或分化神经元细胞与受试者的基因组本质上相同。

在某些实施例中，γ-氨基丁酸能神经元，多巴胺能神经元，5-羟色胺能神经元，谷氨酸能神经元以及神经胶质细胞如少突神经胶质细胞和星型神经胶质细胞从分化神经元细胞群中被分离，并应用于患者。在优选实施例中，将γ-氨基丁酸能神经元应用于受试者。这些细胞以及神经母细胞或分化神经细胞群能被用在患者上，来治疗各种神经变性症或神经元疾病，这些疾病包含但不局限于中风，脑缺血，癫痫，帕金森病，亨廷顿病，阿尔茨海默病，脊髓损伤，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，癫痫症以及其它的中枢神经系统紊乱和慢性痛，焦虑症和其它的情绪紊乱。这些患者也可以通过细胞替换疗法治疗。优选地，这些细胞通过移植，例如将所需细胞移植进入患者脑组织的方式进行施用。

本发明的另一实施例是一种治疗神经变性症或神经元疾病的患者的方法，包括以下步骤：

(a)多能干细胞的扩增培养；

(b)培养多能干细胞来筛选巢蛋白阳性的神经母细胞；

(c)扩增巢蛋白阳性的神经母细胞；

(d)在包含阿糖胞苷(Ara-C)的分化培养基中培养巢蛋白阳性细胞，分化产生分化细胞群；

(e)移植治疗有效剂量的分化神经细胞群进入受试者的中枢神经系统。

在优选实施例中，多能干细胞是鼠或人的胚胎干细胞。在其它优选实施例中，受试者是病人，更优选的是人类患者。优选的分化神经细胞群与患者组织相容。在另一实施例中，步骤(d)进一步包括在分化培养基中分化细胞两天或多天，随后在不含阿糖胞苷(Ara-C)的第二分化培养基中分化细胞。在优选实施例中，γ-氨基丁酸能神经元从分化神经元细胞群中分离并应用于受试者，例如受试者的脑组织，优选通过移植的方式。在某些实施例中，神经变性症或神经元疾病选自由帕金森病，阿尔茨海默病，亨廷顿病，路易体痴呆，多发性硬化症，小脑性共济失调，进行性核上性麻痹，脊髓损伤，肌萎缩性侧索硬化(ALS)，癫痫，中风和局部缺血组成的组。

在其它实施例中，可利用来源于所述的多能干细胞的神经母细胞群或分化神经元细胞来筛选化合物，例如小分子化合物和药物，通过这些化合物对细胞群的效应，特别是对分化神经细胞或神经胶质细胞的效应，或对这些细胞的活性来筛选。这些化合物也可通过对神经细胞的毒性或调节来筛选。例如通过将化合物加到分化神经细胞中，例如γ-氨基丁酸能神经元，与在相同条件下培养但没有接触此化合物的分化神经细胞相比较，通过比较其存活率，形态，表型，功能活性或细胞的其它特征来评价此化合物。例如可以通过测定化合物是否能够引起细胞的神经递质合成、释放或摄入发生改变来筛选这些化合物。

本发明的另一实施例是一种建立神经细胞体外移植模型的方法，包含以下步骤：

(a)分离成年海马细胞；

(b)分散并培养海马细胞来产生海马细胞培养物；

(c)在海马细胞培养物中培养神经细胞；

在此，评价海马细胞培养物中神经细胞的存活率。在其它实施例中，评价神经细胞和海马细胞培养物间的突触形成。在本发明的一个实施例中，成年海马细胞从小鼠中分离。在一些实施例中，在海马细胞培养物中培养的神经细胞是例如γ-氨基丁酸能神经元，多巴胺能神经元，5-羟色胺能神经元或谷氨酸能神经元。在其它实施例中，神经胶质细胞，如少突神经胶质细胞和星型胶质细胞被培养在海马细胞培养物中。采用在此所述的方法或者已知的其它方法在海马细胞培养物中培养获得神经细胞或神经胶质细胞。优选地，在海马细胞培养物中培养的神经细胞至少约50％存活至少一周，更优选的比例为约60％，70％，80％，90％或者95％。在一个优选的实施例中，培养一周后大于90％的γ-氨基丁酸能神经元存活。

附图说明

所包含的附图用于进一步理解本发明，其并入到本说明书中构成本说明书的一部分，所述附图示出了本发明的实施例，并与文字描述一起用于解释本发明。

图1是从鼠胚胎干细胞产生γ-氨基丁酸能神经元及运用成年鼠脑获得的海马神经元来进行γ-氨基丁酸能神经元的体外移植的示意图。

图2是鼠胚胎干细胞分化成终末分化神经元细胞的步骤示意图，其包括：(1)未分化细胞的扩增；(2)胚状体的形成；(3)巢蛋白阳性细胞的筛选；(4)巢蛋白阳性细胞的扩增；(5)神经元前体细胞分化成终末分化的神经元细胞。

图3是在来源于鼠胚胎干细胞的神经细胞群中通过免疫反应对以下标记物的定位：(a)GAD-65和GAD-67；(b)GAT-1和GAT-2；(c)谷氨酸和γ-氨基丁酸；(d)巢蛋白和MAP-2。免疫反应性在4个不同时期被研究：巢蛋白阳性细胞的扩增以及分化后第8、12和16天。

图4是利用本文所述方法从鼠胚胎干细胞生成的γ-氨基丁酸能神经元中的γ-氨基丁酸和GAD-65/GAD-67的免疫反应性的共定位(co-localization)。GAD-65和GAD-67阳性细胞中存在的γ-氨基丁酸的免疫荧光证实这些γ-氨基丁酸能神经元细胞产生了γ-氨基丁酸。

图5是在鼠胚胎干细胞中γ-氨基丁酸能神经元特异因子及这些细胞体外分化为γ-氨基丁酸能神经元的不同时期的基因表达图。这些时期是未分化的鼠胚胎干细胞(Un)，胚状体(EB)，巢蛋白筛选(N)，巢蛋白扩增(NE)，分化2天(D-2)；分化4天(D-4)；分化8天(D-8)；分化12天(D-12)和分化16天(D-16)。分析以下γ-氨基丁酸能神经元特异基因的表达：GAD1，GAD2，VIAAT和GAD1胚胎转录物。观察到GAD1在所有时期均有表达，包括在未分化的胚胎干细胞。观察到GAD2在巢蛋白筛选、巢蛋白扩增和所有分化时期均有表达，但在未分化期和胚状体期没有表达。VIAAT仅在分化时期观察到有表达，尤其是分化8天和12天。有趣地是，VIAAT在分化16天后不表达。GAD1胚胎基因在除未分化期之外的所有时期都有表达。β-肌动蛋白，其是一个在所有时期均能检测到的持家基因，被用作阳性对照。

图6是来源于鼠胚胎干细胞的神经元细胞群的比较分析。通过形态测定分析，计算不同时期的细胞总数。被分析的时期是(a)巢蛋白阳性细胞的扩增(NE)；(b)分化8天；(c)分化12天；(d)分化16天。这些细胞的定量是根据：(1)总神经元；(2)谷氨酸表达；(3)γ-氨基丁酸表达；(4)酪氨酸羟化酶(TH)表达；(5)HT表达。

图7是在以下时期通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定胞外γ-氨基丁酸水平：巢蛋白扩增(NE)；分化8天(D-8)；分化12天(D-12)和分化16天(D-16)。γ-氨基丁酸仅在分化期被检测到，证明采用本文所述方法从鼠胚胎干细胞生成的神经元产生了γ-氨基丁酸。

图8为分化12天后，用抗GABA-A受体的抗体分析来源于鼠胚胎干细胞的细胞的免疫反应性。大约80％的细胞经免疫荧光分析对于抗GABA-A受体的抗体是阳性的。

图9为分化12天后，用抗GABA-B受体的抗体分析来源于鼠胚胎干细胞的细胞免疫反应性。大约25％的细胞经免疫荧光分析对于抗GABA-B受体的抗体是阳性的。

具体实施方式

本发明提供从多能干细胞分化来有效生产神经细胞的方法。在此产生的细胞包括但不限于那些具有神经母细胞、γ-氨基丁酸能神经元、多巴胺能神经元、5-羟色胺能神经元和谷氨酸能神经元及神经胶质细胞如少突神经胶质细胞、星形胶质细胞等的表型特征的细胞。在此产生的细胞通过表型特征、形态学特征和或细胞标记物来鉴定，这些都是本领域评价细胞的技术人员所容易理解的。如在此使用的术语“神经母细胞”是可以与神经前体细胞或神经元前体细胞，及神经前细胞或神经元前细胞这些术语互相替换的，它是指能产生子代的细胞，子代是指神经元细胞，如神经元前体，神经细胞，或神经元，或是神经胶质细胞，如神经胶质前体，星型胶质细胞或少突神经胶质细胞。在此所述的方法结合了可溶因子和环境条件来培养细胞，这将促进细胞分化为神经细胞。此方法优选用于从多能干细胞获得γ-氨基丁酸能神经元。

这些前体和分化的神经细胞有广泛的应用，包括治疗、实验应用及体外药物开发和筛选，例如筛选神经细胞毒性或能调节神经细胞功能的化合物。从多能干细胞生产前体细胞和分化神经细胞例如γ-氨基丁酸能神经元及其它特定神经细胞类型，能供应无限量的神经元，这对于患有使虚弱的神经变性症和神经元疾病的个体有巨大的潜在益处，这些疾病包括但不限于中风，局部缺血，亨廷顿病，癫痫，慢性痛，焦虑症和其它情绪紊乱。在此所述的前体细胞和分化神经细胞是所来源的细胞群的子代，因此与母细胞群的基因组本质上相同，包括遗传上被改变，转化或转染的母细胞群。

本发明的优选实施例是针对从多能干细胞生产γ-氨基丁酸能神经元的改进的方法，优选的多能干细胞是哺乳动物胚胎干细胞(ES)或哺乳动物胚胎生殖细胞(EG)。在尤其优选的实施例中，哺乳动物ES或EG细胞是鼠或人的ES细胞或EG细胞。通过在含有特定可溶因子和环境条件下培养多能干细胞获得这些神经元。

在此使用的术语γ-氨基丁酸能神经元是指能表达、生产或分泌神经递质γ-氨基丁酸的神经元细胞。优选的γ-氨基丁酸能神经元的终末分化包括合成γ-氨基丁酸所需基因的活化和调控，及囊泡包装和释放。在其它的优选实施例中，γ-氨基丁酸能神经元表达GABA-A和GABA-B受体。γ-氨基丁酸属于谷氨酸脱羧酶(GAD)化合物家族，谷氨酸脱羧酶(GAD)是γ-氨基丁酸合成的关键酶。哺乳动物类表达GAD的两个同种型，命名为GAD1和GAD2，它们在脑组织不同区域有不同的表达水平。GAD1和GAD2也分别被称为GAD67和GAD65，它们是用kDa表示的各自的相对分子质量。由于GAD67和GAD65是合成γ-氨基丁酸的酶，因此它们都能用作识别γ-氨基丁酸能神经元的标记物。另外，γ-氨基丁酸的突触包装需要囊泡抑制性氨基酸转运体(VIAAT)，VIAAT也是识别γ-氨基丁酸能神经元的标记物。一些神经变性症和神经元疾病的发病机理似乎与γ-氨基丁酸能神经元的缺失或者γ-氨基丁酸能神经传递的减少有关，所述疾病包括多种中风，局部缺血，亨廷顿病，癫痫，慢性痛，焦虑症和其它情绪紊乱。

本发明涉及一种分化多能干细胞成为神经前体细胞和与神经细胞系具有相似的表型、分子特征及/或细胞特征的分化神经细胞群的改进的方法。在优选实施例中，多能干细胞是鼠或人胚胎干细胞，采用特定的培养条件使它们分化成神经细胞，优选的是γ-氨基丁酸能神经元。本发明也涉及通过所述方法生产的细胞和细胞群。在某些实施例中，所述方法包括以下步骤：

1.分离多能干细胞群；多能干细胞优选的是鼠或人胚胎干细胞。

2.对多能干细胞进行扩增以提供足够的原材料。

3.将多能干细胞悬浮培养产生胚状体。

4.将胚状体重新铺在基底上，并在无血清培养基中孵育来筛选神经母细胞。

5.将神经母细胞在含神经系统相关可溶因子的扩增培养基上扩增培养。

6.神经母细胞在分化培养基中分化成成熟的神经元，优选的是此培养基包含多种神经系统相关的可溶因子的组合以及阿糖胞苷(Ara-C)。多能干细胞来源

在此所述的从多能干细胞分化神经细胞的方法包括使用特定培养条件，此培养条件能诱导显著的高比例的多能干细胞分化成特定的神经细胞型。受精后任何时间的胚前期，胚胎或胎儿组织中都能获得多能干细胞，其在合适的条件下能够分化成多种不同的细胞类型，它们是所有三胚层(内胚层，中胚层和外胚层)的衍生物。神经细胞也能从干细胞获得，这些干细胞是从具有分化能力或重新整编入神经细胞的胎儿或成年组织中分离的。多能干细胞包括但不限于哺乳动物胚胎干细胞和胚胎生殖细胞，优选是鼠胚胎干细胞或胚胎生殖细胞，或灵长类或人胚胎干细胞和胚胎生殖细胞。优选地，未分化的多能干细胞具有无限分化和增殖的能力。在此使用的术语分化是指一个过程，通过此过程未分化的多能干细胞或前体细胞获得了定向分化。例如分化细胞具有特定细胞型或组织的特征表型。

在优选实施例中，在此应用的胚胎干细胞和胚胎干细胞系是从胚泡的内细胞群中获得。这些胚泡可以从获得的体内受精的前植入胚胎中分离，或者通过体外受精(IVF)例如通过常规授精技术，精子卵浆内注射技术或卵质转移技术受精的胚胎中分离到。人胚泡是从自愿捐献其剩余胚胎的夫妇或供体中获得。这些胚胎在得到其供体自愿的书面同意之后被用于研究的目的。或者，胚泡也可以通过转移体细胞或细胞核至人或非人来源的去核卵母细胞中，然后经刺激发育到胚泡期来获得。所用的胚泡是冷藏保存的，或者来源于在早期阶段被冷藏的胚胎且可继续发育成胚泡期胚胎。众所周知，胚泡和内细胞群随物种不同会有不同的发育。

鼠胚胎干细胞可以在体外采用如免疫外科等常规技术从植入前的胚胎如胚泡中获得(Evans et al.，Nature 292：154-159，1981；Martin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：7634-7638，1981，每个均被参考合并于此)。鼠胚胎生殖细胞也可采用常规技术从胎儿生殖细胞中获得(Matsui et al.，Cell 70：8410847，1992，参考合并与此)。为保持鼠胚胎干细胞处于未分化期，细胞被优选地在含有白血病抑制因子(LIF)的成纤维细胞饲养层上培养(Williams et al.，Nature336：684-687，1998，参考合并于此)。

灵长类或人胚胎干细胞可以采用标准免疫外科技术从胚泡中获得(U.S.Patent.Nos.5,843,780 and 6,200,806，Thomson et al.Science 282：1145-1147，1998，Reubinoff et al.Natue Biotech.18：399-403，2000，每个均被参考特别合并于此)。尽管通过多种已知的方法获得的胚胎干细胞可以用在所述的方法中，但本发明的优选实施例是运用通过独特的激光消融技术产生的人胚胎干细胞(U.S.Serial No.10/226,711，参考合并于此)。简单的说，此方法通过对胚泡滋养外胚层和透明带部分的激光消融而从胚泡的内细胞群中分离细胞，激光消融可以在胚泡上形成一个孔或洞，内细胞群的细胞可以通过这个孔或洞呼吸。然后，这些细胞可以进一步培养建立胚胎干细胞系。此技术不需要进行常规的繁琐的免疫外科步骤因而具有优势。另外，应用此技术产生的胚胎干细胞系，尤其人胚胎干细胞系，能够在没有任何动物来源的抗体或血清的条件下被分离，这将会使动物微生物传染到胚胎干细胞系的风险降到最低。在另一实施例中，所用的人胚胎生殖细胞从存在于人胎儿的原生殖细胞中产生(U.S.Patent No.6,090,622，and Shamblott et al.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95：13726-13731每个均被参考合并于此)。

优选地，胚胎干细胞系能够被培养保持未分化状态持续很长的时间，例如一年多，并维持一个正常的整倍体的核型。人胚胎干细胞可以从形态学上鉴定，其具有高核质比例，突起的核仁且形成致密的群落，有明晰的细胞边缘和通常比鼠胚胎干细胞更平整的群落。人胚胎干细胞也优选地与人多能胚胎干细胞的标记物，例如SSEA-3，SSEA-4，GCTM-2抗原和TRA1-60有免疫反应性(Thomson et al.1998，Reubinoff et al.2000，Buehr and Mclaren.1993，每个均被参考合并于此)。优选地人胚胎干细胞也表达碱性磷酸酶和OCT-4。在其它实施例中，胚胎干细胞在非粘附培养条件下能够形成胚状体(U.S.Patent Nos.5,914,268和6,602,711，每个均被参考合并于此)。这些胚状体能够被用于产生内胚层、中胚层和外胚层的分化衍生物及其它需要的细胞系。

多能干细胞，尤其是胚胎干细胞或胚胎生殖细胞，能够在保持细胞未分化状态的培养条件下持续增殖培养。胚胎干细胞必须保持合适的细胞密度，且反复分离并进行传代培养，同时频繁地更换培养基以阻止其分化。对于细胞培养和胚胎干细胞培养相关的一般技术，从业者可以参考标准教科书和综述，例如：E.J.Robertson，“Teratocarcinomas and embryonic stem cells：A practicalapproach”ed.，IRL Press Ltd.1987；Hu and Aunins，1997，Curr.Opin.Biotechnol.8(2)：148-53；Kitano，1991，Biotechnology17：73-106；Spier，1991，Curr.Opin.Biotechnol.2：375-79；Birch and Arathoon，1990，Bioprocess Technol.10：251-70；Xu et al.，2001，Nat.Biotechnol.19(10)：971-4；and Lebkowski et al.，2001，Cancer J.7Suppl.2：S83-93；每个均被参考合并于此)。

传统地，胚胎干细胞在ES培养基饲养细胞层中培养。饲养细胞层是可与胚胎干细胞共培养的同一组织类型的细胞，它为胚胎干细胞不进行实质分化的生长提供环境。在饲养层培养胚胎干细胞的方法是本领域技术人员所公知的(U.S.Patent Nos.5,843,780 and 6,200,806，WO 99/20741，U.S.Serial Nos.09/530,346 and 09/849,022，WO 01/51616，每个均被参考特别合并于此)。饲养层优选地减少、抑制或阻止胚胎干细胞的分化。典型的饲养层是人或鼠源的胚胎成纤维细胞饲养层，例如鼠胚胎成纤维细胞，人胚胎成纤维细胞，人成纤维细胞样细胞或源自人胚胎干细胞的间质细胞或STO细胞。

胚胎干细胞优选地培养于ES培养基中，此培养基可减少、抑制或阻止胚胎干细胞的分化。优选地，用于培养胚胎干细胞的ES培养基补充有营养血清，例如添加有对保持胚胎干细胞存活和生长有效的营养素的血清或血清溶液。营养血清可以是动物血清，例如胎牛血清(FBS)或新生胎牛血清(FCS)(U.S.Patent Nos.5,453,357,5,670,372，和5,690,296，参考合并于此)。正如在此使用的，胎牛血清可被用于替代新生胎牛血清，反之亦然。ES培养基也是无血清的(WO 98/30679，WO 01/66697，U.S.Serial No.09/522,030，每个均被参考特别合并于此)。一种适合胚胎干细胞培养的加血清的ES培养基是Dulbecco’s改良的Eagle′s培养基(DMEM)，其不含丙酮酸钠，含高含量的葡萄糖(70-90％)(GIBCO)，添加了FBS或FCS(10-30％)，β-巯基乙醇(0.1mM)，非必需氨基酸(1％)和L-谷氨酰胺(2mM)，碱性成纤维生长因子(4ng/ml)，50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素。ES培养基也包括1000U/ml的白血病抑制因子(LIF)。一种适合培养胚胎干细胞的无血清的ES培养基是80％的“敲除”Dulbecco’s改良的Eagle′s培养基(DMEM)(GIBCO)，20％敲除的SR(无血清替代物，GIBCO)，β-巯基乙醇(0.1mM)，非必需氨基酸(1％)和L-谷氨酰胺(1mM)。

ES细胞也可以在无饲养层培养条件下培养。在无饲养层培养条件下培养ES细胞的方法是本领域技术人员所公知的(U.S.Publ.No.2002/0022268，WO03/020920，U.S.Serial No.10/235,094，每个均被参考特别合并于此)。无饲养层培养的ES细胞优选生长在合适的培养基底，例如细胞外基质如Matrigel(Becton Dickenson)或层粘连蛋白上。无饲养层培养也优选地采用条件培养液维持ES细胞生长。条件培养液是在培养液中通过对鼠胚胎成纤维细胞或人胚胎成纤维细胞的第一代细胞进行培养达充裕的时间而产生“条件”培养液，此培养液将维持未分化状态的ES细胞培养。或者，无饲养层培养可将细胞外基质和有效的培养液结合，其中所述的有效的培养液是新鲜地添加到培养物中而不会被别的细胞类型所限制(U.S.Publ.No.2003/0017589，参考特别合并于此)。

神经母细胞的制备

分离的多能干细胞可以扩增，然后转到分化为神经母细胞的培养条件下培养。根据这里所述的分化方案培养多能干细胞使其进入神经细胞分化途径。多能干细胞在分化营养培养液中的适宜基底上进行培养，此培养液含有例如可溶因子和生长因子的分化剂。适宜基底包括但不限于包被有正电荷的固体表面，例如聚L-赖氨酸或聚鸟氨酸，包被有细胞外基质成分的基底，如纤维结合蛋白，层粘连蛋白，血小板来源的生长因子(PDGF)，表皮生长因子(EGF)，胶原V，人羊膜或重组细胞基底膜(Matrigel^)，或者是它们的组合。优选的分化营养培养液能维持需要的神经细胞类型的增殖、分化和存活，它包括一种或多种适宜的分化剂。在此使用的术语生长因子是指能与细胞表面受体结合并激活细胞的增殖和分化的蛋白类。适合的可溶因子包括但不限于神经营养素分子，促细胞分裂剂，干细胞因子，生长因子，分化因子(如β-转化生长因子超家族)，β-转化生长因子超家族激动剂，神经营养因子，抗氧化剂，神经递质和存活因子。许多可溶因子是多能的，可以促进多种不同的细胞类型分裂，而其它可溶因子只适用于特定的细胞类型。

促进神经元细胞分化的适宜分化因子包括但不限于孕酮，腐胺，层粘连蛋白，胰岛素，亚硒酸钠，转铁蛋白，neurturin，信号蛋白sonic hedgehog(SHH)，noggin蛋白，卵泡抑素，表皮生长因子(EGF)，任何类型的成纤维生长因子，阿糖胞苷(Ara-C)，生长和分化因子5(GDF-5)，神经营养因子家族成员(神经生长因子(NGF)，神经营养因子3(NT-3)，神经营养因子4(NT-4)，脑源性亲神经因子(BDNF)，转化生长因子α(TGF-α)，转化生长因子β-3(TGF β3)，血小板衍生的生长因子(PDGF-AA)，胰岛素样生长因子(IGF-1)，成骨蛋白(BMP-2，BMP-4)，神经胶质细胞衍生的亲神经因子(GDNF)，肝素结合生长因子，维生素C，双丁酰环磷腺苷，多巴胺，和与gp130结合的受体的配体(如白细胞抑制因子(LIF)，亲胆碱能神经元因子(CNTF)，SCF，IL-11和IL-6))。在此使用的术语成纤维生长因子或FGF是指从表达这些因子的任一器官获得的任何适合的成纤维生长因子和其功能片断。各种FGF是本领域技术人员所公知的，其包括但不限于FGF-1(酸性成纤维生长因子)，FGF-2(碱性成纤维生长因子)，FGF-3(int-2)，FGF-4(hst/K-FGF)，FGF-5，FGF-6，FGF-7，FGF-8和FGF-9。分化营养培养基也含有帮助维持神经细胞培养的添加剂，例如添加剂N2和B27(Gibco)。优选地，本发明所述方法没有使用分化剂视黄酸，13-顺式视黄酸和反式视黄酸。

分化多能干细胞的第一步包含诱导细胞来形成胚状体。胚状体直接铺在含或不含细胞外基质成分如纤维结合蛋白、层粘连蛋白的合适基底上，在适合促分化为神经母细胞，例如巢蛋白阳性的神经母细胞的合适的分化营养培养基中培养。巢蛋白是神经元前体细胞的特征性细胞标记物。在另一实施例中，多能干细胞首先通过形成胚状体被聚集成异质的细胞群，例如通过悬浮培养多能干细胞。这些细胞在含或不含血清的营养培养基中培养来促进其胚状体中细胞的分化，上述营养培养基还含一种或多种前述的分化剂。优选地，多能干细胞在不含LIF的ES细胞培养基中培养。

在此使用的术语胚状体是指当多能干细胞在悬浮培养物中生长或在单细胞层培养物中生长过剩所产生的分化细胞的聚集。胚状体在聚集的细胞中也含有未分化的细胞。优选地，这些聚集的细胞被原始内胚层所包围。典型的胚状体包含所有三胚层(外胚层、中胚层和内胚层)衍生的细胞。在成熟的人胚状体中，辨别带有各种细胞类型标记物的细胞是可能的，例如神经元细胞，造血细胞，肝细胞和心肌细胞。成熟胚状体中细胞能够像分化细胞一样发挥功能。例如活性的心肌细胞能引起胚状体搏动。优选地，可以控制多能干细胞的分化来获得用于治疗目的的特定细胞类型。

培养胚状体使其达到足够的大小或需要的分化，例如培养3-10天之后，优选4-8天后，然后再在基底上培养。优选地，此基底包被有细胞外基质成分，该细胞外基质成分包含但不限于聚L-赖氨酸，聚L-鸟氨酸，层粘连蛋白，胶原，纤维结合蛋白，Matrigel^或它们的组合。优选地，不需要分散这些细胞，胚状体直接在基底上培养。然后胚状体在促进培养细胞进一步分化为神经元前体细胞或中枢神经系统前体细胞的培养条件下培养。例如胚状体在无血清确定成分培养基如ITSFn培养基中培养来筛选巢蛋白阳性细胞。或者，扩增的多能干细胞可以直接铺在基底上，在无血清确定成分培养基上培养来筛选巢蛋白阳性细胞。巢蛋白是在神经上皮表达的中间丝状蛋白。

优选地，用于胚状体扩增的无血清确定成分培养基是补充有一种或多种生长因子的DMEM：F-12培养基，这些生长因子选自由孕酮、腐胺、层粘连蛋白、胰岛素、亚硒酸钠、转铁蛋白、纤维结合蛋白、FGF、SHH、EGF和BDNF所组成的群组。更优选地，无血清确定成分培养基是补充有营养素、胰岛素、亚硒酸钠、转铁蛋白和纤维结合蛋白的ITSFn培养基。通常，细胞在此条件下生长5-16天，更优选为7天。在优选实施例中，采用上述无血清确定成分培养液来筛选，富集了可存活的巢蛋白阳性细胞群至约40-70％，更优选至约80-90％，最优选至约95-99％。

接着，产生的神经元前体细胞或中枢神经系统前体细胞在CNS扩增培养基中扩增。在此使用的术语扩增是指一个过程，在此过程中由于细胞的生长和分裂，细胞数增加。术语增殖可与术语扩增互换使用。优选地，CNS扩增培养基包含基本必需培养基，如DMEM/F12，它补充有帮助维持神经细胞培养物的添加物，例如添加剂N2和B27。优选地，CNS扩增培养基也包括一种或多种神经诱导剂，其可以促进CNS前体细胞增殖，并可增加γ-氨基丁酸能神经元生产的效率，例如碱性成纤维生长因子(bFGF)以及体内胚胎形成期间控制γ-氨基丁酸能神经元存活的其它因子。优选地，神经元前体细胞或CNS前体细胞在CNS扩增培养基中生长4-10天。另外，这些细胞优选地加到神经元前体细胞或CNS前体细胞可以附着的表面上，例如包被有聚L-赖氨酸、聚L-鸟氨酸、层粘连蛋白、胶原、纤维结合蛋白、Matrigel^或它们的组合的表面。

在一个实施例中，通过在不含饲养层细胞的合适培养基的细菌培养皿上培养鼠ES细胞而产生胚状体。优选地，鼠ES细胞首先被分散，例如通过胰蛋白酶处理，接着刮下细胞并分离成小细胞簇。然后这些细胞簇以合适的密度加到优选地有非附着表面的细菌培养皿中培养来促进胚状体的分化和形成，上述非附着表面会阻碍细胞的黏附。这些细胞在合适的培养基中培养，例如ES培养基，其优选为包含高糖的DMEM或添加10-20％FCS，FBS的敲除DMEM培养基，或敲除血清替代物，以及其它添加物例如β-巯基乙醇，L-谷氨酰胺(2mM)和抗生素。此培养基至少每隔一天更换一次，使胚状体生长，优选生长约4-8天。

在另一实施例中，通过在不含饲养层细胞的合适培养液中的细菌培养皿上培养人ES细胞产生胚状体。优选地，人ES细胞被分散成簇，然后加到有非附着表面的培养皿中培养来促进胚状体的发育。此适合的培养基优选地包含高糖的DMEM，且其中添加了10-20％FCS。也可补充其它的添加剂，例如0.1mM2-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素。

胚状体被分离之后，再将其加到包被有0.1-0.2％明胶的无血清培养基的培养皿上培养来筛选神经母细胞和CNS前体细胞，优选的是巢蛋白阳性细胞。优选地，无血清培养基是补充有生长因子的基础培养基，例如DMEM：F-12。可用来筛选巢蛋白阳性细胞的ITSFn培养基包含基础培养基DMEM：F-12(1∶1)或IMDM培养基，其补充有胰岛素、亚硒酸钠、转铁蛋白和纤维结合蛋白等生长因子。

优选地，这些神经母细胞或CNS前体细胞，优选的是巢蛋白阳性细胞，接着在含神经诱导生长因子的CNS扩增培养基中培养来筛选神经元前体细胞，优选的是γ-氨基丁酸能神经元前体。CNS扩增培养基的一个例子包含补充有N2，B27和bFGF的DMEM/F12培养基。神经母细胞或CNS前体细胞也可以重新加到预先包被有细胞外基质的另一个培养皿上培养，所述细胞外基质例如为聚L-赖氨酸，聚L-鸟氨酸，层粘连蛋白，胶原，或它们的组合。尽管不希望受到任何特定机制的束缚，但是确信CNS扩增培养基中的各种因子有助于神经细胞比例的增加和进一步诱导γ-氨基丁酸能神经元表型的分化。在优选实施例中，巢蛋白阳性前体细胞在CNS扩增培养基中生长5-8天。γ-氨基丁酸能神经元的分化

根据在此所述方法制备的神经母细胞能够进一步分化成高比例的成熟神经元，例如γ-氨基丁酸能神经元以及多巴胺能神经元、5-羟色胺能神经元和谷氨酸能神经元。神经母细胞也能进一步分化成神经胶质细胞，例如少突神经胶质细胞或星形胶质细胞。根据在此所述的分化方法培养这些细胞来获得神经母细胞或CNS前体细胞的终末分化。

优选地，巢蛋白阳性神经母细胞或CNS细胞在促进其分化成终末分化神经细胞或成熟神经元的分化培养基中进行扩增2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20天。另外，通过去除部分或全部因子如β-FGF来促进细胞的分化，这些因子可以促进神经母细胞或CNS细胞的分化、增殖或者分化和增殖二者。例如，在包含DMEM：F12培养基或Neurobasal A培养基的分化培养基中培养来分化扩增的神经母细胞或CNS细胞，此分化培养基中补充有FCS，N2，B27或它们的组合，其可以含或不含β-FGF。分化培养基也可以包含一些附加因子来增强终末分化或γ-氨基丁酸能神经元的产量，例如阿糖胞苷。在一个优选实施例中，神经母细胞或CNS细胞在包含阿糖胞苷的分化培养基中培养一天或多天，然后在不含阿糖胞苷的分化培养基中培养5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20天。在另一优选实施例中，神经母细胞或CNS细胞在分化培养基中培养一天，此分化培养基包含补充有N2和B27的DMEM：F12培养基；接着在分化培养基中补充培养两天，此分化培养基包含补充有5％的FBS，B27和阿糖胞苷的MMEM：F12培养基；最后在不含阿糖胞苷的同样的分化培养基中培养2-16天，优选的是12天。

优选地，高比例的神经母细胞分化成γ-氨基丁酸能神经元，例如至少约20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％的细胞。在一个优选实施例中，根据在此所述的方法扩增并分化的多能干细胞产生高比例(至少约60％)的γ-氨基丁酸能神经元。另外，γ-氨基丁酸能神经元可以进一步从分化神经细胞群中纯化，纯化方法是本领域专业人员所共知的，例如免疫标记和荧光分类，例如固相吸附、荧光激活细胞分类(FACS)、MACS等等。在此产生的其它分化神经细胞例如多巴胺能神经元、5-羟色胺能神经元和谷氨酸能神经元以及少突神经胶质细胞和星形胶质细胞也可以采用相似的方法分离。

神经元母细胞和分化神经细胞的应用

在此所述的神经母细胞和分化神经细胞(例如γ-氨基丁酸能神经元、多巴胺能神经元、5-羟色胺能神经元、谷氨酸能神经元、少突神经胶质细胞和星形胶质细胞)有很广泛的应用，例如治疗应用，以及体内外分析和筛选各种化合物，如对这些细胞有效的小分子药物。这些细胞也可以被用于制备cDNA表达文库来分析这些细胞的表达谱，以及用于制备特别针对特定细胞标记物的单克隆或多克隆抗体，所采用的技术是本领域专业人员所共知的。这些细胞也可以应用于治疗，其对那些患有使虚弱的神经变性症和神经元疾病的个体有益处。

本发明提出在此所述的神经母细胞和分化神经细胞在治疗或预防各种神经变性症和神经元疾病上的应用，在这些疾病中，中枢神经系统(CNS)或脊髓的神经元或神经胶质细胞受到损伤或死亡。需要这些治疗的患者可以通过有效治疗剂量的这些细胞来恢复在CNS或外周神经系统(PNS)中的功能。在此使用的细胞的有效治疗剂量是足以阻止或改善患者机体的生理效应的剂量，机体的这些效应是由于神经细胞如成熟的神经元(如γ-氨基丁酸能神经元、多巴胺能神经元、5-羟色胺能神经元)、星形胶质细胞和少突神经胶质细胞的丧失、损伤或退化而导致。例如可根据所治疗的疾病或病症，将这些细胞直接移植到中枢神经系统的软组织(parenchymal)或椎管(intrathecal)内而用于治疗用途中。

这些细胞可以用于治疗神经系统的急性或慢性损伤，以及使虚弱的神经变性症和神经元疾病，其包含神经系统的紊乱或疾病，该神经系统包括CNS和PNS。神经变性症和神经元疾病包括但不限于帕金森症、阿尔茨海默病、亨廷顿病、路易体痴呆、多发性硬化症、小脑性共济失调、进行性核上性麻痹、脊髓损伤、肌萎缩侧索硬化(ALS)、癫痫、中风、局部缺血、神经系统的损伤或外伤、神经中毒损伤等等。一些神经元疾病也可以用来源于多能细胞的分化神经细胞治疗，所述疾病例如是认知和心理相关的疾病，包括但不限于焦虑症、情绪紊乱、成瘾、强迫性神经失调(OCD)、人格障碍、注意力缺陷障碍(ADD)、注意力缺陷高活动性障碍(ADHD)和精神分裂症。

本发明一个实施例涉及治疗或预防神经变性症或神经元疾病的方法，这些疾病具有γ-氨基丁酸能神经元退化或损伤的特征，在此方法中可以施用有效治疗剂量的多能干细胞优选鼠或人的来源于多能干细胞的γ-氨基丁酸能神经元来治疗。优选地，患神经变性症或神经元疾病的病人可以通过移植治疗有效剂量的本发明所述的神经母细胞和分化神经细胞来治疗。当病人患有脑缺血或中风时，优选地施用有效治疗剂量的γ-氨基丁酸能神经元会大大减少脑缺血或中风的相关症状，例如记忆丧失、认知障碍或运动障碍。

细胞的有效治疗剂量依赖于患者的需要、年龄、生理条件和健康状况，以及需要达到的治疗效果和治疗目标的组织大小，移植位置、病理学程度(神经元退化水平)、所选的输送方式和治疗策略。例如影响脑组织较大区域的疾病的治疗与较小目标区域的治疗相比较需要更多量的细胞来达到治疗效应。通过多次低细胞剂量的小移植，细胞可以在给定的目标组织中不止一个位点施用。本发明所述细胞在施用前可以完全分散产生单细胞悬液，或者在施用前不完全分散产生细胞的小集落。这些细胞的施用方式可以允许其移植或移动到目标组织位点来使功能丧失的部位重建或再生。优选地，细胞用于自体治疗，因此降低或排除了移植后的免疫排斥问题，例如与目标受体的组织相容性。另外，这些细胞可以用于异体的治疗。

能够施用并获得治疗效应的合适的细胞量范围从约100到约1,000,000个神经元，优选为从约500到约500,000个神经元，或从约1000到约100,000个神经元。施用的细胞数量很大程度上依赖于治疗施用的细胞存活数。施用于患者的神经细胞治疗浓度的范围为从约10，100，500，1000，5000，10,000，15,000，20,000，25,000，30,000，35,000，40,000，45,000，50,000，60,000，70,000，80,000，90,000，100,000，150,000，200,000，250,000，300,000，350,000，400,000，450,000直至约500,000个细胞每微升药物载体。在载体中细胞的浓度范围包括例如100-50,000细胞/μl，1000-10,000细胞/μl，5000-25,000细胞/μl，15,000-45,000细胞/μl，20,000-50,000细胞/μl，55,000-200,000细胞/μl，100,000-40,000细胞/μl，150,000-50,000细胞/μl等等。植入移植位点的细胞数量会影响到治疗的效果。

在治疗应用上，通常优选前体细胞群或分化神经细胞纯度相当高，不含任何未分化的多能干细胞。一个从治疗制备物中去除多能干细胞的策略是用含有在未分化细胞中优选表达的基因的载体转染这些细胞，通过这个基因的表达来筛出多能干细胞。在未分化细胞中优选表达的合适的启动子是端粒末端转移酶逆转录酶(TERT)启动子和OCT-4启动子。例如载体中表达的基因是溶解细胞的，如毒素，或者可以通过应用表面剂(external agent)来筛选出。

在此所述的从多能干细胞生产γ-氨基丁酸能神经元、多巴胺能神经元和5-羟色胺能神经元的能力对于预防或治疗各种神经变性症和神经元疾病有很大的临床应用。例如γ-氨基丁酸能神经元能用于治疗或预防神经变性症和神经元疾病，这些疾病的特征是快速抑制性突触传递和神经兴奋性的异常及情绪骤变，例如发作的阈值、忧虑、恐慌和对压力的反应(例如，“搏斗或飞跃”反应)，和记忆、情绪或疼痛功能的异常。例如γ-氨基丁酸能神经元可以被用于治疗帕金森症、阿尔茨海默病、癫痫、路易体痴呆、多发性硬化症、小脑性共济失调、进行性核上性麻痹、脊髓损伤、肌萎缩侧索硬化(ALS)和亨廷顿病及中风，局部缺血、脑缺血、神经系统的损伤或外伤、神经中毒损伤等等。γ-氨基丁酸能神经元也可以用于治疗或预防一些神经疾病，包括但不限于认知和心理相关的疾病例如焦虑症、情绪紊乱、成瘾、强迫性神经失调(OCD)、人格障碍、注意力缺陷障碍、儿童多动症(ADD)和精神分裂症。

帕金森症是中脑黑质产多巴胺能神经元细胞的进行性变性引发的一种运动障碍疾病。移植多巴胺能神经元到帕金森症病人的黑质，这种细胞水平的治疗认为是有效的，但是症状没有完全得到缓解(Lindvall，O.，1997，Neuroreport.8(14)：iii-x)。因此移植多巴胺能神经元不能完全治愈帕金森症，最近研究表明帕金森症的神经病理涉及脑中称为丘脑下核(STN)另一区域(Bergman et al.，1998，Trends Neurosci.21：32-38；Luo et al.，2002，Science298：425-29)。丘脑下区含有谷氨酸能神经元和γ-氨基丁酸能神经元(Nishino etal.，1988，Japn.J.Pharmacol.48：331-339)。帕金森症患者位于STN的神经元连同黑质的神经元一起退化(During et al.，2001，Hum.Gene Ther.12(12)：1589-91)。因此，帕金森症患者的谷氨酸能神经元和γ-氨基丁酸能神经元也退化(Luo et al.，2002，Science 298(11)：425-429)。

最近的研究发现表明注射GAD到帕金森症模型的STN中可以减少帕金森症相关的运动异常(Luo et al.，2002，Science 298：425-29)，GAD是对γ-氨基丁酸的生物合成起关键作用的一种酶。因此γ-氨基丁酸能神经元也可以用来治疗帕金森症，例如通过给予或移植γ-氨基丁酸能神经元进入STN。γ-氨基丁酸能神经元可以单独注射或移植，或联合，或者与多巴胺能神经元共同注射或移植到黑质中。γ-氨基丁酸能神经元也可与其它来源的药物并用来治疗帕金森症，这些药物来自植物、植物提取物或有抗帕金森、抗神经变性或神经保护活性的合成物质。

阿尔茨海默病涉及脑基底核中广泛的胆碱能细胞缺失。尽管胞内给予或移植胆碱能细胞可以有效治疗阿尔茨海默病，但是不能够完全治愈，因为阿尔茨海默病患者脑中尤其是海马中其它的神经元类型也缺失。例如阿尔茨海默病患者记忆功能严重丧失，这部分由于海马神经元的丧失，而大多数海马神经元是γ-氨基丁酸能神经元(Seidl et al.，2001，Arch.Pharmacol.363：139-145)。另外，阿尔茨海默病患者颞皮层、枕皮层和小脑的γ-氨基丁酸含量显著缺失(Seidl etal.，2001)。在一个实施例中，在此所述的来源于多能干细胞的γ-氨基丁酸能神经元被单独施用于或移植于脑海马皮层，或与其它神经元如胆碱能神经元或多巴胺能神经元一起施用或移植来治疗阿尔茨海默病。

需要提高细胞在各种神经变性症和神经元疾病的存活能力，这些疾病包括但不限于帕金森症、阿尔茨海默病、脑缺血和中风。各种因素影响神经元的退化和死亡。在优选实施例中，诱导神经元退化和死亡的因素例如细胞外钙、谷氨酸的过量释放或氧自由基的释放在本文所述的神经母细胞或分化神经细胞如γ-氨基丁酸能神经元被施用于或移植于病人脑内之前就被阻断。。通过在给予细胞或移植细胞的部位阻断或拮抗这些因素，较高比例的细胞在这个过程中可以存活。

在其它实施例中，本发明涉及一个或多个神经元存活因子与本发明所述的神经母细胞和分化神经细胞共同施用来治疗神经变性症或神经元疾病。神经元存活因子可以在施用所需细胞之前或同时，或并用或在其之后施用。在此使用的神经元存活因子是任何与神经元接触能使神经元存活的时间长于不存在这些因子的存活时间的物质。在本实施例中，在此使用的神经存活因子包括但不限于γ-氨基丁酸激动剂(例如苯并二氮卓，丙戊酸盐和苯巴比妥)，钙拮抗剂、谷氨酸拮抗剂、抗氧化剂、组织纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)、胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、神经生长因子(NGF)、睫状节神经细胞营养因子(CNTF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)，神经营养因子-4(NT-4)、成纤维生长因子(FGF)、IL-1β，肿瘤坏死因子α(TNFα)、胰岛素样生长因子(IGF-1，IGF-2)、转化生长因子β(TGF-β，TGF-β1)、植物来源的药物、植物提取物或有抗帕金森、抗中风、抗脑缺血、抗神经变性或神经保护活性的合成物质。

在一个优选实施例中，神经存活因子与神经细胞，优选γ-氨基丁酸能神经元共同施用来治疗患有脑缺血或中风的患者。目前，γ-氨基丁酸激动剂(例如苯并二氮卓，丙戊酸盐和苯巴比妥)、钙拮抗剂、谷氨酸拮抗剂、抗氧化剂和其它神经保护剂或药物是被用来治疗脑缺血或中风的化学试剂。虽然这些药物可以帮助减缓中风或局部缺血患者神经障碍相关的症状，但它们不能治愈这些疾病。考虑到这些试剂或药物在中风或局部缺血患者中的关键作用，它们可以被用来与来源于多能干细胞的γ-氨基丁酸能神经元并用来治疗与中风和局部缺血相关的神经障碍和神经疾病，它们可以在施用γ-氨基丁酸能神经元之前、期间或之后进行施用。

在另一优选实施例中，组织纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)在神经细胞，优选的是γ-氨基丁酸能神经元的施用之前、期间或之后共同施用来治疗患有脑缺血或中风的患者。重组t-PA已经被用来消除血液凝块或与脑缺血或中风相关的阻塞，它是唯一被FDA批准的脑缺血或中风的治疗物。尽可能地供应血液到损伤部位，优选的是脑海马、皮层和丘脑，尤其是在脑损伤部位施用任何类型的神经细胞之前进行，可以改善中风或脑缺血患者的预后。这可以通过给患者施用t-PA而达到，t-PA可以通过消除血管阻塞提高施用的神经元在宿主环境中的存活，因此给神经元提供了充足的氧和营养素。

在此使用的术语治疗是指治疗性治疗和预防性治疗或预防措施。治疗性治疗包括但不限于减少或消除特定疾病或病症的症状，或者是减慢或减弱其过程，或者是治愈存在的疾病或病症。因此，需要治疗的患者包括那些已经被诊断患有神经变性症或神经元疾病的患者，以及那些需要预防神经变性症或神经元疾病的人。本发明所述的方法能被用来治疗需要治疗的任何哺乳类，包括但不限于人、灵长类和家养的、农场的、宠物或运动的哺乳动物，例如狗、马、猫、羊、猪、牛、大鼠、小鼠等等。病症是指能利用本发明所述方法获得的神经母细胞、分化神经元细胞或其它任何分化的细胞型进行治疗而有效的任何状况。用本发明所述的细胞，尤其是γ-氨基丁酸能神经元，治疗病症或疾病有效的例子有帕金森症、阿尔茨海默病、亨廷顿病、路易体痴呆、多发性硬化症、小脑性共济失调、进行性核上性麻痹、脊髓损伤、肌萎缩侧索硬化(ALS)和癫痫及中风，局部缺血等，及与认知和心理有关的障碍，其包括但不限于焦虑障碍、强迫性神经失调(OCD)、人格障碍、注意力缺陷症(ADD)、注意力缺陷高活动性障碍(ADHD)和精神分裂症。

将本发明所述的神经母细胞或分化神经细胞直接施用到损伤部位可以更益于实施本发明所描述的方法。神经细胞移植和细胞培养的方法是本领域技术人员所公知的(例如U.S.Pat.No.5,514,552；Yurek and Sladek，1990，Annu.Rev.Neurosci.13：415-440；Rosenthal，1998，Neuron 20：169-172；Vescovi et al.，1999，J.Neurotrauma 16(8)：689-93；Vescovi et al.，1999，Exp.Neuro.156(1)：71-83；Brustle et al.，1999，Science 285：754-56；每个均被参考并合并于此)。这些细胞可以单独施用，或与其它因子如神经元存活因子并用，这些细胞也可以与药用载体连用。理想的载体可以增强细胞的稳定性和传递性。

本发明也提供了包含细胞的药用组合物，这些细胞可以通过使用合适载体如脂质体、微粒或微囊来施用。本发明所述的细胞也可以以含等渗赋形剂的药用组合物形式提供，其是在制备人类施用药物的无菌条件下制备。细胞组合物的药用剂型的一般原则见细胞治疗(Cell Therapy)：Stem Cell Transplantation，Gene Therapy，and Cellular Immunotherapy，G.Morstyn&W.Sheridan eds，Cambrigge University Press，1996，and Hematopoietic Stem Cell Therpy，E.Ball，J.Lister&P.Law，Churchill Livingstone，2000，特别参考合并于此。另外，可以在需要治疗的部位局部施用包含神经细胞存活因子的药用组合物，例如可以通过外科手术中局部输液、注射、导管方式或移植的方式实现，其中移植物可能是多孔、无孔的材料或胶状材料，包括膜，例如硅橡胶膜或纤维。

患者可施用的本发明所述的神经母细胞和分化细胞可以是基本同质的、接近同质的或异质的细胞群。基本同质的细胞群包含大于75％的单一细胞型，例如γ-氨基丁酸能神经元，更优选的是大于90％，最优选的是大于95-99％。异质的细胞群包括混合在单一细胞群中的两种或多种细胞型，例如γ-氨基丁酸能神经元、多巴胺能神经元、5-羟色胺能神经元、雪旺细胞(Schwann cells)、少突神经胶质细胞、星型神经胶质细胞和神经胶质细胞。也可通过本领域技术人员所公知的方法改变这些细胞的基因而在脑、中枢神经系统、外周神经系统或其它组织的损伤部位表达或释放营养因子、生长因子、神经细胞存活因子或其它治疗用化合物。启动子及蛋白表达联合的细胞类型的使用是分子生物学领域技术人员所公知的，例如，(Sambrook，et al.1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual 2^nd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，作为参考并合并于此)。

为了使营养因子、生长因子、神经细胞存活因子或其它治疗用化合物在神经母细胞和分化神经细胞中获得表达，需要可被本领域专业人员易于选用的多种来源的合适的调控元件。调控元件包括转录启动子、增强子、RNA聚合酶结合序列以及核糖体结合序列，其包含翻译起始信号。其它额外的基因元件如筛选标记也被整合到重组分子中。通过体外传递载体或体内技术，重组分子被导入多能干细胞或者多能干细胞来源的神经母细胞或分化神经细胞。传递技术包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、DNA病毒载体、脂质体和物理技术如显微注射、通过电穿孔或磷酸钙沉淀法进行的转染、或者其它的本领域共知的用于构建重组细胞的转移方法。基因改变的细胞可以被包埋在微球中移植到患病或损伤的组织或其临近区域。所采用的方法是本领域技术人员所共知的或能够找到的(Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，N.Y.，1997，参考合并于此)。

优选地，本发明所述的细胞移植治疗也包括一些在移植外科中所使用的神经母细胞和分化细胞的储存及保藏的方法，例如通过低温保藏法长期保藏，或在保藏培养基中短期保存。低温保藏的胚胎中脑组织可以成功保存达到70天，并能作为同种移植物成功移植到啮齿动物(Collier et al.，Progress in BrainResearch，Vol.78，New York，Elsevier(1988)，pp.631-36，参考并合并于此)和灵长类(Collier et al.，1987，Brain Res.436：363-66，参考并合并于此)。已经证明胚胎中脑细胞在低温保藏后能够被成功培养。中脑组织也可以在保藏培养基中4℃下短期保存(2-5天)，然后用与新鲜组织相似的存活移植量移植(Sauer et al.，1989，Restor.Neurol.Neurosci.(Suppl.：3.sup.rd Int.Symp.Neural Tranplan.)：56，参考并合并于此)。也可以采用类似技术来储存和保藏神经母细胞和分化的细胞，这些技术是本领域技术人员所共知的。

在此所述的神经母细胞和分化神经细胞的另一个应用是用于筛选影响这些细胞特征或表型的物质因素，例如药用化合物、溶剂、小分子、肽或多核苷酸以及一些环境因素如培养或操作条件。例如用这些细胞来筛选和评价存在于植物、植物提取物或存在于动物、人中的生物活性分子或合成得到的物质。另外，这些细胞可以被用来分析候选的生长因子或分化因子。例如一个候选的药用化合物能够被添加到神经母细胞或成熟的神经元中，其可单独使用也可以与其它药物并用，可分析和评价这些细胞的形态、表型或功能活性的任何改变。在另一实施例中，γ-氨基丁酸能神经元也被用于筛选CNS、PNS或特定组织或器官中的影响γ-氨基丁酸能神经元的受体(如激动剂或拮抗剂)。γ-氨基丁酸能神经元也被用于筛选神经肽、神经递质、神经激素或γ-氨基丁酸的激动剂和/或拮抗剂。γ-氨基丁酸能神经元也可以用于检验生物活性分子的神经毒性。

另外，在此所述的神经母细胞和分化神经细胞在分化的任何阶段都可以被进一步修饰。例如，通过遗传修饰这些细胞可以有一个或多个的基因修饰，这可以是暂时的或是稳定的。这些细胞的基因改变可能是合乎需要的，因为可以提供用于基因治疗或移植用组织替换的修饰的细胞。本发明所述的这些细胞可以通过导入表达有筛选标记的载体来进行基因修饰，这些筛选标记是被神经细胞特异的启动子所控制的，这些是本领域技术人员所共知的。这些细胞也可以在任何阶段被修饰来表达特定的标记物或基因，它们能够被用来进一步纯化来源于多能干细胞的分化细胞，或以一种可替换方式来诱导分化成特定细胞系。这些细胞可以通过修饰来减少或阻止移植后的免疫排斥，例如与预期受体的组织相容性。

为了增强在此产生的细胞的复制能力，通过一个适合的载体来改变细胞基因使细胞被调聚(telomerized)来使其表达端粒酶催化成分(TERT)。TERT的序列来源于人或鼠(WO 98/14592and WO 99/27113，特别参考合并于此)及其它哺乳类。另外，内源TERT序列的转录可以被增强。基因修饰细胞所用的方法是本领域专业人员所共知的。这些方法利用了各种分子生物学技术(Sambrook，et al.1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2^nd Ed.ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，参考并合并于此)。成年脑细胞的体外移植

人脑基本没有自我修复的能力，开发治疗由疾病或损害引起的脑损伤的方法仍然很艰巨的。尽管对于细胞移植治疗脑损伤的可行性有很大的兴趣，但此方法仍然处于早期的实验阶段。由于实验表明多数移植的神经元在移植之后发生退化，因此神经细胞移植的一个主要困难是这些细胞的存活性。例如移植到实验动物或患有帕金森病的患者的多巴胺能细胞的通常存活率仅有约10％(Brundin et al.，1987，Ann.N.Y.Acad.Sci.495：473-96；Nakao et al.，1995，Nat.Med.1(3)：226-31)。尽管低存活率的原因不明，但可能由于受体的脑细胞的神经毒效应或移植细胞缺乏充足的营养和氧的供应。明显地，引起神经细胞死亡的因素应该进一步被调查，这样可以使移植后神经细胞的死亡降到最低。

识别和研究这些因素的一种方法是创造类似脑的环境，然后检验无论来源于多能干细胞还是从其它来源所分离获得的神经元或神经细胞的效能或存活性。本发明的一个实施例是通过对分离的神经元或神经细胞与成年神经细胞，优选从成年海马中分离的细胞，采用体外移植技术创造类似脑的环境。在此使用的术语体外移植是指在同样的培养环境下共培养两种不同类型的细胞。体外移植可以能被用来确定两种类型的细胞在相似环境中的相容性，并能研究和预测影响移植细胞存活性和功能性的因素。这个系统可以用来分析分离的神经元或神经细胞，尤其是来源于多能细胞的神经元或神经细胞的存活性和功能性。这个分析会反过来帮助确定这些细胞治疗神经变性症或神经元疾病的能力，这些疾病包括但不限于中风、局部缺血、帕金森症、阿尔茨海默病、癫痫和亨廷顿病。在优选实施例中，这个技术被用于分析来源于多能细胞的γ-氨基丁酸能神经元在类似宿主环境中的存活性或效能。在优选实施例中，源于多能细胞的神经元或神经细胞优选γ-氨基丁酸能神经元在体外移植后成年海马细胞环境中的存活性是至少90％。在另一实施例中，环境中至少约30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，95％或99％的γ-氨基丁酸能神经元存活。

在此所述的新型的体外移植模型也用来研究以下参数：(1)移植细胞和宿主细胞之间的突触形成；(2)细胞移植后涉及神经元或神经细胞死亡的因素；(3)神经元或神经细胞的死亡率。体外移植模型不仅帮助提供移植后改善细胞存活性和功能性的详细信息，也会帮助神经生物学家或神经外科医生在移植神经元之前决定策略。

通过下述实施来举例说明本发明的优选实施例。通过在此所述的实例，本领域技术人员可根据发明人已描述的技术更好地实现本发明目的，并为它的实施构建更优模型。然而，基于本发明的描述，本领域技术人员对已描述的特定实施例所做出的改变，在不脱离本发明目的的精神和范围内仍可获得一个相似的结果。

                       例1

下面的例子表示从鼠胚胎干细胞体外生产功能性的γ-氨基丁酸能神经元。图1是从鼠ES细胞生产γ-氨基丁酸能神经元，而图2是分化鼠ES细胞成终末分化神经元的不同步骤。

1)鼠胚胎干细胞的培养和扩增：

本实验使用的鼠ES细胞是从鼠胚泡内细胞群中分离，所用技术是本领域技术人员所共知的。鼠ES细胞是J-1来源(从National Institute of Dental andCraniofacial Research，National Institute of Health，Bathesda，Maryland，USA获得)，且传代14代。这些细胞培养在丝裂霉素-C处理的鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞上，其在ES细胞培养基中使有丝分裂受到阻止。将鼠ES细胞培养在ES细胞培养基中来扩增未分化细胞的数量。ES细胞通常可以扩增至少约1000倍而不丧失多能性。在此使用的ES培养基通常包括碳源、氮源和维持所需pH的缓冲液。ES培养基包括Dulbecco’s改良的Eegles培养基(DMEM)或敲除DMEM(Gibco)，其补充有10-20％适合ES细胞的胎牛血清(FBS)(Hyclone)或血清替换敲除血清(Gibco)，还有1％MEM非必需氨基酸溶液，2mM L-谷氨酸和0.1mM β-巯基乙醇。ES培养基也补充有浓度为1000单位/ml的白血病抑制因子(LIF)(ESGRO，Chemicon International Inc.)来抑制鼠ES细胞的分化。

鼠ES细胞被扩增培养，通过在ES细胞培养基中培养和定期传代抑制其分化，所用技术是本领域技术人员所共知的。37℃，在用含有0.1-0.2％明胶的磷酸盐缓冲液(PBS)处理的组织培养板中培养ES细胞至少1-2小时。ES细胞生长在浓度为1×10⁵/ml的丝裂霉素-C所灭活的鼠饲养细胞上。ES细胞在35-40℃之间，优选为约37℃，在约1-10％CO₂，更优选5％CO₂的氛围下培养四天。ES培养液每天或每隔一天换液一次，这依赖于培养基中ES细胞的生长。

2)胚状体的生产

在未分化的鼠ES细胞增殖和扩增之后，进行培养而形成胚状体。首先，通过短暂接触0.05％胰蛋白酶-乙二胺四乙酸而分散ES细胞，然后刮下细胞并分离成小细胞簇。接着这些小细胞簇以约4×10⁵细胞/ml的密度加到60mm细菌培养皿上培养，培养皿中含有不含饲养细胞的合适的培养基。细菌培养皿有非附着表面，会阻碍细胞的黏附，因此能促进ES细胞的分化和胚状体的形成。这些细胞在ES培养液中悬浮培养。培养这些细胞的ES培养基有含高糖的DMEM或补充有10-20％FBS的敲除DMEM或敲除血清替代物，以及其它添加物例如β-巯基乙醇(0.1mM)，L-谷氨酰胺(2mM)及抗生素。ES培养液中不添加碱性成纤维生长因子(bFGF)或白细胞抑制因子(LIF)。在第二天，细胞悬液被转移到一个新的培养皿上，剩下黏附在前培养皿上的细胞。ES细胞培养基每隔一天更换一次，旧培养基中的细胞被离心后，再将这些细胞重悬于新鲜的培养基中，将细胞转移到非附着表面的培养皿。胚状体生长4-8天。在4-8天结束时，收集胚状体并低速离心(1000rpm，5分钟)，然后重悬于ES细胞培养基中。然后约30-40个胚状体被转移到未包被的组织培养皿上培养24小时。

3)巢蛋白阳性神经母细胞的筛选或扩增

24小时后，通过用ITSFn(巢蛋白筛选)无血清确定成分培养基替换ES细胞培养基来筛选巢蛋白阳性细胞(神经母细胞)。ITSFn培养基包括补充有生长因子胰岛素(5-25μg/ml)(Sigma)、亚硒酸钠(1-5nM)(Sigma)、转铁蛋白(1-10μg/ml)(Gibco)和纤维结合素(1-5μg/ml)的DMEM：F12培养基(Gibco)。通常细胞在ITSFn培养基中培养大约6-10天，更优选约7天，且每隔一天需补充ITSFn培养基。细胞通常在大约35℃和40℃之间，优选在约37℃，且大约在1％和10％CO₂之间，更优选在大约2％和6％CO₂之间的氛围中生长。完全筛选之后，优选筛选7天，用免疫荧光技术显示神经母细胞具有表达巢蛋白的特征，并且表明约90％细胞的巢蛋白表达为阳性。接着巢蛋白阳性细胞按照下面所述的方法进行扩增。

用0.05％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸分散巢蛋白阳性细胞，然后将细胞加到含CNS扩增培养基且包被有聚鸟氨酸/层粘连蛋白的培养皿上。CNS扩增培养基包含添加N2(10μg/ml)和B27(20μg/ml)的DMEM：F12培养基。神经生长因子β-FGF(10-20ng/ml)也添加到此CNS扩增培养基中，它可以增加神经细胞的产量。神经元前体细胞被扩增培养6天来产生大量的神经元细胞。这些细胞在CNS扩增培养基中生长6天，培养基需每两天补充一次。

4)神经元前体细胞的分化：

通过在含Neurobasal A培养基(Gibco)、FCS(10-20％)(HYCLONE)和B27补充物(2-10％)(Gibco)且不含β-FGF的分化培养基中培养，使扩增的神经元前体细胞分化。另外，分化培养基含有一些因子可以增加γ-氨基丁酸能神经元的产量，优选的是阿糖胞苷(Sigma Chemical Co.USA)。在含阿糖胞苷(20μg/ml)的分化培养基中培养神经元前体细胞可以增加来源于鼠ES细胞的神经细胞群中的γ-氨基丁酸能神经元的比例。在含阿糖胞苷的分化培养基中培养3天后，使细胞在不含阿糖胞苷的同样的分化培养基中培养8、12或16天。神经元前体细胞在含阿糖胞苷的分化培养基中培养3天，然后细胞在不含阿糖胞苷的分化培养基中培养16天，至少约60％的神经元前体细胞分化成γ-氨基丁酸能神经元(图6)。

5)分化神经元的特征

对采用上述方法产生的总神经细胞群的分析表明超过90％的分化细胞是神经细胞。通过细胞的总形态分析和应用免疫荧光对其表型的分析对所述方法产生的分化神经细胞型进行评价。在神经元前体扩增期和分化后4、8、12和16天进行免疫荧光分析，同如上所述的方法。首先，将分离的细胞在2-孔室载片(2-well chamber slides)上生长，用缓冲液PBS冲洗，然后用4％多聚甲醛在室温固定10分钟。接着用含1％正常羊血清的PBS中的0.2％Triton X-100渗透处理，然后用1％牛血清白蛋白(BSA)/PBS室温封闭1小时。

然后将细胞与第一抗体(抗体用1％PBS稀释)在4℃下孵育过夜。下面是在此免疫荧光分析中使用的第一抗体：γ-氨基丁酸单克隆抗体，1∶200(Chemicon Inc.USA)；γ-氨基丁酸多克隆抗体，1∶500(Chemicon Inc.USA)；GAD65，1∶500(Chemicon Inc.USA)；GAD67，1∶500(Chemicon Inc.USA)；GAT-1，1∶500(Chemicon Inc.USA)，GAT-2，1∶500(Chemicon Inc.USA)；谷氨酸1∶500(Chemicon Inc.USA)；巢蛋白1∶50(Chemicon Inc.USA)；少突神经胶质细胞1∶500(Chemicon Inc.USA)；5-羟色胺1∶500(Chemicon Inc.USA)；酪氨酸羟化酶1∶800(Chemicon Inc.USA)；MAP-2，1∶500(Chemicon Inc.USA)；和GFAP，1∶500(Chemicon Inc.USA)。在与第一抗体过夜孵育后，用PBS漂洗细胞，然后与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的第二抗体避光孵育1小时。接着用PBS漂洗细胞3次，用封片剂封片。在荧光显微镜下观察，评价不同分化阶段的免疫阳性细胞。

分化细胞的免疫荧光分析显示约90％的分化神经细胞对神经细胞特异标记物，例如Gad-65、Gad-67、GAT-1、GAT-2、谷氨酸、γ-氨基丁酸、巢蛋白和MAP-2有免疫反应性(图3)。在培养的总神经细胞中，约60％的神经细胞呈现γ-氨基丁酸能神经元的标记物γ-氨基丁酸的染色阳性，而约15％的神经细胞呈现多巴胺能神经元的标记物酪氨酸羟化酶(TH)的染色阳性，另外，约10％的神经细胞呈谷氨酸染色阳性，而约5％的神经细胞呈5-羟色胺能神经元的标记物5-羟色胺的染色阳性。最后约5-10％的细胞作为少突神经胶质细胞呈染色阳性。细胞培养物中通常也包含约5-10％的神经胶质细胞。分析表明在细胞培养物中至少有一些分化的神经细胞是显突触活性的。通常，成熟神经元可以通过存在带有许多细微刺状结构的长的轴突(axonal projections)来鉴别。轴突上的髓磷脂相关蛋白-2(MAP-2)也表明了神经元的成熟。

分化的细胞也可以用第一抗体通过双重标记细胞来确定GAD65和GAD67是否被共定位表达(图4)。GAD65和GAD67是在合成γ-氨基丁酸所需的γ-氨基丁酸能神经元中表达的两个基因。使用GAD65/GAD67和γ-氨基丁酸抗体通过双重免疫标记技术研究分化神经细胞群。双重免疫标记的结果显示表达蛋白GAD65和GAD67的神经细胞也表达γ-氨基丁酸神经递质(图4)。这些结果证实用此方法产生的γ-氨基丁酸能神经元是产γ-氨基丁酸的细胞。表达蛋白GAD65和GAD67的神经细胞被证实其在发育早期也表达γ-氨基丁酸，因为在含GAD65和GAD67酶的γ-氨基丁酸能神经元中谷氨酸能够被转化。

对不同分化阶段所收集的细胞的基因表达信息进行分析。下面每个阶段均收集细胞并通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)对其进行分析：(1)未分化；(2)胚状体(EBS)；(3)巢蛋白扩增；(4)分化2天；(5)分化4天；(6)分化8天；(7)分化12天；(8)分化16天。收集细胞，然后离心，用Rneasy Qiagen kit从细胞沉淀中提取总细胞RNA。分离的RNA保存在-20℃。总细胞RNA经不含RNA酶的RQ DNA酶(Promega Corp.，Madison，WI)处理以消除痕量DNA。按照使用说明，用莫洛尼白血病毒superscript II逆转录酶从分离的总RNA合成cDNA。随机六聚体引物(GIBCO/BRL)被用来引发逆转录酶(RT)反应。

将逆转录酶反应合成的cDNA用于PCR的扩增，用不同组的特异引物进行PCR扩增来确定收集的细胞中基因的表达。设计引物来识别γ-氨基丁酸能神经元中表达的mRNAs，尤其是谷氨酸脱羧酶基因(GAD1和GAD2)、选择性拼接的GAD1胚胎RNA和囊泡抑制性氨基酸转运体(VIAAT)转录本的特异引物。GAD1在发育过程中被选择性拼接，在胚胎发育中神经干细胞/神经前体细胞主要表达胚胎转录本。β-肌动蛋白因其是广泛表达的基因，而作为阳性对照。在标准PCR反应条件下，用总第一链反应(逆转录合成的cDNA)的10％为模板以及platinum Taq polymerase进行这些PCR反应，这些是本领域技术人员所共知的。扩增DNA的一般循环参数如下：

1.模板cDNA在94℃变性30秒钟；

2.在55-65℃退火1分钟，具体条件依赖于所用的引物；

3.在72℃延伸1分钟，重复步骤1-3在25-40个循环之间。

PCR反应之后，产物和DNA size ladder进行琼脂糖凝胶电泳。采用表1所列的引物通过RT-PCR，分析GAD1、GAD2、胚胎GAD1、VIAAT和β-肌动蛋白的表达。

         表1：扩增γ-氨基丁酸能神经元特异基因的引物组

基因	引物序列
		GAD1(302bp)	正义：CCT TCG CCT GCA ACC TCC TCG AAC(SEQ ID NO：1)反义：GCG CAG TTT GCT CCC CGT TCT T(SEQ ID NO：2)
GAD2(583bp)	正义：ACT CTG GCA TTT CTA CAA GAT GTT AGT A(SEQ ID NO：3)反义：GAA TCA CAC TGT CTG TTC CAA TCC CTA A(SEQ ID NO：4)
		胚胎GAD1(234bp GAD1；320bp胚胎GAD1)	正义：TGG TTG ACT GTA GAG ACA CCC TGA ADT A(SEQ ID NO：5)反义：TCC CAT CAC CTT TAT TTG ACC ATC C(SEQ ID NO：6)
VIATT(572bp)	正义：TCC TGT CCT TTT CTC CCG CCC CGC CGC C(SEQ ID NO：7)反义：GCA CCA CCT CCC CGT CTT CGT TCT CCT C(SEQ ID NO：8)
		β-肌动蛋白(220bp)	正义：GGG TCA GAA GGA CTC CTA TG(SEQ ID NO：9)反义：GTA ACA ATG CCA CCA TGT TCA AT(SEQ ID NO：10)

通过上述RT-PCR的分析证明许多来源于胚胎干细胞的神经元细胞能够自发的分化成表达γ-氨基丁酸能表型标记物的神经元。在细胞培养的不同阶段，GAD1和GAD2的表达有所不同。在包括未分化阶段的几乎所有阶段(阶段1-阶段5)都有GAD1基因的表达(图5)。这个发现与以前关于ES细胞中GAD1表达的报道是一致的(Bain et al.，1993，Brain Res.Mol.Brain Res.17：23-30)。另一方面，GAD2只在分化阶段表达，如图5所示。这个结果表明应用上述方法产生的γ-氨基丁酸能神经元，GAD1和GAD2基因有不同的表型表达。GAD1胚胎拼接变体在除未分化阶段外的所有阶段都有表达，而可以运输γ-氨基丁酸的神经递质基因(VIAAT)仅在分化阶段表达(图5)。持家基因β-肌动蛋白的表达作为阳性对照(图5)。

也可以利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析γ-氨基丁酸能神经元中γ-氨基丁酸的表达。由于γ-氨基丁酸能神经元的一个明显特征是生产γ-氨基丁酸，所以通过反相高效液相色谱直接测定胞内γ-氨基丁酸水平，可以评价源于ES细胞的γ-氨基丁酸能神经元产生γ-氨基丁酸的能力。每次实验前后，立即用注射到色谱柱的每个样品中的γ-氨基丁酸浓度与γ-氨基丁酸标准液比较来确定每个样品中的浓度。

首先，收集所述方法的不同阶段的细胞：巢蛋白扩增阶段和分化8、12和16天后分离的分化细胞。收集不同阶段的培养上清液，然后立即用7.5％磷酸和焦亚硫酸盐(0.22mg/ml)处理来稳定神经递质用于测定，在-80℃保存直到通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析。用等强度HPLC法测定胞内γ-氨基丁酸水平，此方法是采用OPA/t-butylthiol的基于γ-氨基丁酸的电化学检测(Kehr and Ungerstedt，1988，J.Neurochem.51(4)：1308-10；Osborne et al.，1991，J.Neurosci.Method 34：99-106，均参考并合并于此)。将不同流速和灵敏度的高效液相色谱分析的γ-氨基丁酸数据标准化(图7)。

虽然在巢蛋白或巢蛋白扩增阶段均没有检测到γ-氨基丁酸，但分化8天的γ-氨基丁酸检测水平是20.95pg/ml，分化12和16天的检测水平分别是26.18pg/ml和18.60pg/ml。这个分析证明在分化12天γ-氨基丁酸能神经元产生的γ-氨基丁酸水平最高。γ-氨基丁酸从培养细胞中的释放总量是21.51pg/ml。

由于在分化12天γ-氨基丁酸能神经元产生的γ-氨基丁酸水平最高，因此利用同一分化阶段的细胞评价确定GABA-A和GABA-B受体的存在。功能性的神经递质受体如GABA-A和GABA-B受体在神经元如γ-氨基丁酸能神经元表面的分布与突触传递和信号处理高度相关(Eder et al.，2001，Eur.J.Neurosci.13：1065-69)。已知，成熟γ-氨基丁酸能神经元上的GABA-A和GABA-B受体均对这些神经元发挥正常功能起关键作用。为了确定是否在此所述的来源于鼠ES细胞的γ-氨基丁酸能神经元也表达这些γ-氨基丁酸能受体，通过上面所述的免疫荧光技术，用抗-GABA-A受体抗体，1∶250(Chemicon，USA)和抗-GABA-B受体抗体，1∶250(Chemicon，USA)对这些细胞进行免疫染色。

12天的分化培养物的免疫荧光分析表明GABA-A和GABA-B受体均存在于分化的γ-氨基丁酸能神经元。有趣地是，大约80％的分化细胞表达GABA-A受体(图8)，而仅仅大约25％的分化细胞表达GABA-B受体(图9)。由于GABA-A和GABA-B受体的表达与突触传递和信号处理高度相关，所以分离表达这两个受体的γ-氨基丁酸能神经元对于细胞移植后细胞功能的改善起关键作用。

                       例2

在下面例子中，本发明申请人应用一个体外移植模型来研究来源于鼠胚胎干细胞的γ-氨基丁酸能神经元的效能、存活性和功能。图1是体外移植模型。

通过γ-氨基丁酸能神经元和成年鼠脑海马细胞的体外移植来研究来源于鼠ES细胞的γ-氨基丁酸能神经元的存活性和功能。首先从成年鼠脑海马的分离细胞中分离海马细胞，然后用0.05％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸来分散细胞，接着在补充有B27(20μg/ml)和N2(10μg/ml)的Neurobasal-A培养基上培养细胞1周。成年海马脑细胞在包被有聚L-鸟氨酸和层粘连蛋白或明胶的100mm组织培养板上培养。1周以后，来源于鼠ES细胞的γ-氨基丁酸能神经元且分化12天后收集的细胞加到成年海马脑细胞中，两种细胞类型共培养约1周时间。用成年海马脑细胞体外移植一周之后，大约90％的γ-氨基丁酸能神经元存活。这一结果表明来源于多能干细胞的神经元在成年脑环境中具有功能，且与成年脑细胞形成突触连接，这也表明这些细胞是可以用来治疗各种神经变性症或神经元疾病的。

根据本发明的描述，无需特别实验可得到与实现所有在此公开和要求保护的组合物和方法。本发明的组合物和方法已在各个优选实施例中予以描述。不脱离本发明内容、精神和范围内的变化形式也属于本发明的组合物和/或方法，以及方法步骤或步骤次序，这对本领域技术人员来说是显而易见的。显然，在能够得到相同或相似的结果时，某一化学或与生理相关的试剂可以替代本文描述的试剂。对本领域技术人员来说，所有这些相似的替换和显而易见的变化，均被视为是包含在如所附权利要求定义的本发明的精神、范围和概念之内。

Claims (43)

1.通过体外培养分化鼠多能干细胞而获得的分化细胞群，其中至少60％的分化细胞是γ-氨基丁酸能神经元。

2.根据权利要求1所述的细胞群，其中所述鼠多能干细胞是鼠胚胎干细胞。

3.根据权利要求1所述的细胞群，其中所述γ-氨基丁酸能神经元表达GAD65。

4.根据权利要求1所述的细胞群，其中所述γ-氨基丁酸能神经元表达GAD67。

5.根据权利要求1所述的细胞群，其中所述γ-氨基丁酸能神经元表达GABA-A受体。

6.根据权利要求1所述的细胞群，其中所述γ-氨基丁酸能神经元表达GABA-B受体。

7.根据权利要求1所述的细胞群，其中所述γ-氨基丁酸能神经元表达GABA-A和GABA-B受体。

8.通过体外培养分化鼠多能干细胞而获得的分化细胞群，其中至少60％的分化细胞产生γ-氨基丁酸(GABA)。

9.根据权利要求8所述的细胞群，其中所述鼠多能干细胞是鼠胚胎干细胞。

10.从哺乳动物多能干细胞生产分化神经细胞群的方法，其包括以下步骤：

(a)多能干细胞的扩增培养；

(b)培养多能干细胞来筛选巢蛋白阳性的神经母细胞；

(c)扩增培养巢蛋白阳性的神经母细胞；并且

(d)通过在含有阿糖胞苷(Ara-C)的分化培养基中培养细胞，分化巢蛋白阳性的细胞来生产分化细胞群。

11.根据权利要求10所述的细胞群，其中所述哺乳动物多能干细胞是鼠胚胎干细胞。

12.根据权利要求10所述的细胞群，其中所述哺乳动物多能干细胞是人胚胎干细胞。

13.根据权利要求10所述的方法，其中所述分化细胞群包含至少约60％的γ-氨基丁酸能神经元。

14.根据权利要求10所述的方法，其中所述分化细胞群包含至少约15％的多巴胺能神经元。

15.根据权利要求10所述的方法，其中所述分化细胞群包含至少约10％的谷氨酸能神经元。

16.根据权利要求10所述的方法，其中所述分化细胞群包含至少约5％的5-羟色胺能神经元。

17.根据权利要求10所述的方法，其中所述分化细胞群包含至少约5％的少突神经胶质细胞。

18.根据权利要求10所述的方法，其中所述分化细胞群包含至少约5％的星形胶质细胞。

19.根据权利要求10所述的方法，其中通过在无血清培养基中培养干细胞来筛选巢蛋白阳性的神经母细胞。

20.根据权利要求19所述的方法，其中无血清培养基是ITSFn无血清确定成分培养基。

21.根据权利要求20所述的方法，其中细胞在ITSFn无血清确定成分培养基上培养6-10天。

22.根据权利要求19所述的方法，其中无血清培养基包含一种或多种可溶因子，该可溶因子选自由胰岛素、亚硒酸钠、转铁蛋白和纤维结合蛋白组成的群组。

23.根据权利要求10所述的方法，该方法进一步包含培养步骤(b)的哺乳动物多能干细胞以形成胚状体。

24.根据权利要求23所述的方法，其中培养胚状体来筛选巢蛋白阳性的神经母细胞。

25.根据权利要求24所述的方法，其中神经母细胞包含至少约90％的巢蛋白阳性的细胞。

26.根据权利要求23所述的方法，其中通过在无血清培养基中培养胚状体来筛选巢蛋白阳性的神经母细胞。

27.根据权利要求26所述的方法，其中无血清培养基是ITSFn无血清确定成分培养基。

28.根据权利要求26所述的方法，其中无血清培养基包含一种或多种可溶因子，该可溶因子选自由胰岛素、亚硒酸钠、碱性成纤维生长因子、转铁蛋白和纤维结合蛋白组成的群组。

29.根据权利要求10所述的方法，该方法进一步包含在CNS扩增培养基中扩增培养步骤(c)的巢蛋白阳性的神经母细胞。

30.根据权利要求29所述的方法，其中将巢蛋白阳性的神经母细胞加到预先包被有聚L-鸟氨酸或层粘连蛋白的培养皿上。

31.根据权利要求29所述的方法，其中CNS扩增培养基包含一种或多种可溶因子，该可溶因子选自由N2补充物、B27补充物和神经诱导剂组成的群组。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述神经诱导剂是碱性成纤维生长因子(bFGF)。

33.根据权利要求29所述的方法，其中细胞在CNS扩增培养基中培养6-10天。

34.根据权利要求10所述的方法，其中分化培养基包含N2补充物、B27补充物或二者组合，但不包含碱性成纤维生长因子(bFGF)。

35.根据权利要求10所述的方法，其中细胞在分化培养基中培养2天或多天。

36.根据权利要求10所述的方法，其进一步包含步骤(e)，其中通过在不含有阿糖胞苷(Ara-C)的第二分化培养基中培养细胞进一步分化步骤(d)中的分化细胞群。

37.根据权利要求36所述的方法，其中分化细胞群在第二分化培养基中培养8-16天。

38.从哺乳动物神经母细胞生产γ-氨基丁酸能神经元的方法，该方法包括富集巢蛋白阳性的神经母细胞，并且通过在阿糖胞苷(Ara-C)存在条件下培养细胞分化巢蛋白阳性的细胞以产生γ-氨基丁酸能神经元。

39.产生神经细胞体外移植模型的方法，该方法包括以下步骤：

(a)分离成年海马细胞；

(b)分散和培养海马细胞产生海马细胞培养物；并且

(c)在海马细胞培养物上培养神经细胞；

其中评价海马细胞培养物上神经细胞的存活率。

40.根据权利要求39所述的方法，其中从小鼠中分离成年海马细胞。

41.根据权利要求39所述的方法，其中所述神经细胞是γ-氨基丁酸能神经元。

42.根据权利要求41所述的方法，其中培养1周后超过90％的γ-氨基丁酸能神经元存活。

43.根据权利要求39所述的方法，该方法进一步包含评价神经细胞和海马细胞培养物间的突触形成。

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