CN103013920A - 大胚龄神经干细胞的高-低密度贴壁细胞培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种大胚龄神经干细胞的高-低密度贴壁细胞培养方法，所述培养方法包括以下步骤：皮层神经干细胞的分离和培养，高-低密度贴壁细胞培养法培养神经干细胞，神经干细胞的传代培养，神经干细胞的单细胞克隆，神经干细胞的分化培养以及免疫荧光法检测。本发明采用无血清培养和单细胞克隆技术从13周人胚大脑皮层中分离和培养出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞，采用先高密度而后密度逐渐递减的高-低密度贴壁细胞培养法，形成大量神经干细胞，该细胞具有连续克隆能力，可传达培养，表达神经巢蛋白抗原；分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原，解决了胚胎神经干细胞较难培养的问题。

Description

大胚龄神经干细胞的高-低密度贴壁细胞培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域的一种胚胎神经干细胞培养方法，特别涉及一种大胚龄神经干细胞的高-低密度贴壁细胞培养方法。

背景技术

神经干细胞的发现是神经科学领域的重大突破，为神经发育和神经组织移植等研究领域开辟了广阔前景。神经干细胞是一种具有自我更新及广泛分化潜能的细胞，它处于分化的非终末状态，可通过对称或不对称分裂出新的干细胞或分化潜能逐渐变小的子细胞，最终产生中枢神经系统的三种主要细胞，即神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。一般认为神经干细胞主要存在于哺乳动物胎脑的纹状体、小脑半球、脑室区等，成年哺乳动物脑的侧脑室壁和海马等区。有关哺乳动物胚胎阶段和成年动物在特定脑区存在神经干细胞已不断得到证实，但大胚龄神经干细胞的分离和培养较为困难。传统的高密度悬浮细胞培养法克隆球形成和生长缓慢，存在高密度的抑制作用；低密度难以培养成功则可能是与细胞的密度依赖性和神经干细胞的绝对数量过少有关；中等密度悬浮细胞培养2周后可见克隆球形成，但有其它细胞吸附现象。

发明内容

为了解决胚胎神经干细胞较难培养的问题，本发明采用无血清培养和单细胞克隆技术13周人胚大脑皮层中分离和培养出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞，采用先高密度而后密度逐渐递减的高-低密度贴壁细胞培养法，在3周后可形成大量神经干细胞，该细胞具有连续克隆能力，可传达培养，表达神经巢蛋白抗原；分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。

具体的，本发明的大胚龄神经干细胞的高-低密度贴壁细胞培养方法包括以下步骤：皮层神经干细胞的分离和培养，高-低密度贴壁细胞培养法培养神经干细胞，神经干细胞的传代培养，神经干细胞的单细胞克隆，神经干细胞的分化培养以及免疫荧光法检测。

其中，所述皮层神经干细胞的分离和培养步骤包括：

取7周自然流产和13周水囊引产的人胚胎，无菌条件下分离出胚胎前脑和大脑皮层组织，制成单细胞悬液，加入无血清培养基中，台盼蓝染色计数活细胞，调整细胞浓度为1×10⁷/ml，分别种植于多聚赖氨酸包被的培养瓶中，37℃、体积浓度为5％CO₂条件下静置进行贴壁细胞培养；

所述高-低密度贴壁细胞培养法培养神经干细胞的步骤包括：应用高密度贴壁细胞培养5天后后吸出部分细胞改为低密度培养，培养2周时经多次换液去除悬浮细胞继续培养至4周时形成大量大小不等的克隆球；

所述的神经干细胞的传代培养步骤包括：待原代细胞培养出现大量悬浮克隆球后进行传代培养，在严格无菌条件下操作，在倒置显微镜下用自制玻璃微针将其中的大于200μm的大克隆球切成数块，继续培养，7～10天传代1次，方法同上述的高-低密度贴壁细胞培养法培养神经干细胞的步骤；

所述的神经干细胞的单细胞克隆步骤包括：在贴壁细胞培养中，当细胞密度降至1×10⁴/ml时，挑选散在出现、明显增大、具有强折光性的细胞，在培养瓶底面用记号笔分别标记，动态定点观察并照相记录；当单个细胞形成克隆球并逐渐增大即将悬浮脱离时，用玻璃微管逐个吸出克隆球进行分化试验；将原代细胞制成单细胞悬液，稀释至40个/ml，于96孔培养板中滴加稀释的细胞悬液，每孔100μl，选取仅有1个细胞的培养孔作标记；

所述神经干细胞的分化培养步骤包括：将以上获得的、来自单细胞的克隆球经胰酶消化后，种植于预先用多聚赖氨酸包被的小培养皿中，用DMEM/F12+5％Fcs+EGF+bFGF培养基和经过滤灭菌后的新鲜成人脑脊液中进行分化培养；

所述免疫荧光法检测步骤包括：将上述获得的克隆球种入包被的小培养皿中，用无血清培养基贴壁培养12小时后行荧光检测；经分化培养后的细胞分别于2、7、14和21天行荧光检测。

优选的，所述皮层神经干细胞的分离和培养步骤中的血清培养基为含B27(1∶50)和EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)的DMEM/F12(1∶1)无血清培养基。

再优选的，所述的高-低密度贴壁细胞培养法培养神经干细胞的步骤中，所述高密度贴壁细胞培养的细胞密度为1×10⁷/ml，所述低密度贴壁细胞培养的细胞密度为1×10⁶/ml。

附图说明

通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中：

图1所示为本发明的大胚龄神经干细胞的高-低密度贴壁细胞培养方法的步骤流程图。

具体实施方式

如图1所示的本发明的大胚龄神经干细胞的高-低密度贴壁细胞培养方法的步骤流程图，所述方法具体包括以下步骤：

S1、皮层神经干细胞的分离和培养：

取7周自然流产和13周水囊引产的人胚胎，无菌条件下分离出胚胎前脑和大脑皮层组织，制成单细胞悬液，加入含B27(1∶50)和EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)的DMEM/F12(1∶1)无血清培养基，台盼蓝染色计数活细胞，调整细胞浓度为1×10⁷/ml，分别种植于多聚赖氨酸包被的25cm²培养瓶(8ml细胞悬液/瓶)中，37℃、体积浓度为5％CO₂条件下静置培养。培养方法为贴壁细胞培养法。

S2、高-低密度贴壁细胞培养法培养神经干细胞：

首先应用高密度贴壁细胞培养1×10⁷/ml，原代细胞聚集成团块状，团块中可形成少量克隆球，但克隆球生长缓慢。培养5d后后吸出部分细胞改为1×10⁶/ml培养，克隆球形成和生长明显增快。首次换液发现，每高倍镜视野(倒置显微镜×100倍)下大约有200个细胞贴壁，其中处于有丝分裂期的极强折光性大细胞平均大约有5个，少数散在的贴壁细胞出现分化现象；2周时极强折光性大细胞数量增多，至每高倍视野下大约有20个，多数贴壁未分裂的原代细胞和分化细胞开始脱落死亡，此时经多次换液去除悬浮细胞，细胞密度由1×10⁷/ml降至1×10⁴/ml左右，无细胞聚集现象；3周时已经有极强折光性大细胞开始形成紧密小克隆球(大约5～20个细胞组成，直径约40～60μm)；4周时已有大量大小不等的克隆球形成，许多大克隆球(直径大于200μm)已脱壁悬浮生长。

S3、神经干细胞的传代培养：

待原代细胞培养出现大量悬浮克隆球后进行传代培养。采用严格无菌操作，在倒置显微镜下用自制玻璃微针将其中的大克隆球(大于200μm)切成数块，小克隆球(小于100μm)不作处理，继续培养。根据克隆球生长情况，7～10d传代1次，方法同前。

S4、神经干细胞的单细胞克隆：

在贴壁细胞培养法中，当细胞密度降至1×10⁴/ml时，挑选散在出现、明显增大、具有强折光性的细胞，在培养瓶底面用记号笔分别标记，动态定点观察并照相记录。能清楚地观察从单个细胞逐渐分裂增殖形成克隆球，无其它细胞吸附聚集现象，克隆球用微管吸出分离后活力仍很旺盛。当单个细胞形成克隆球并逐渐增大即将悬浮脱离时，用自制玻璃微管(内径约250～500μm)逐个吸出克隆球进行分化试验。(2)有限稀释法：将原代细胞制成单细胞悬液，稀释至40个/ml，于96孔培养板中滴加稀释的细胞悬液，每孔100μl，选取仅有1个细胞的培养孔作标记，仅少数单个细胞逐渐分裂增殖形成克隆球。

S5、神经干细胞的分化培养：

将以上获得的、来自单细胞的克隆球经胰酶消化后，种植于预先用多聚赖氨酸包被的、直径3.5cm的小培养皿中，用DMEM/F12+5％Fcs+EGF+bFGF培养基和经过滤灭菌后的新鲜成人脑脊液中进行分化培养。神经干细胞在DMEM/F12+50g/L Fcs有血清培养基中培养，12h后即可见部分细胞贴壁并有短小突起伸出，2d后可见大部分细胞贴壁生长，形态不规则，突起不断增粗和伸长，1周后分化成形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞，突起互相交织成网状。2周后部分分化细胞开始衰退。在DMEM/F12+5％Fcs+EGF+bFGF培养基中，一部分细胞出现贴壁分化现象，另一部分细胞则继续分裂增殖，最后细胞可以很快贴满整个皿底。新鲜成人脑脊液中亦出现很好的分化现象，经适时更换脑脊液，细胞可以长期存活。

S6、免疫荧光法检测：

将上述获得的克隆球种入包被的小培养皿中，用无血清培养基贴壁培养12h后行荧光检测。经分化培养后的细胞分别于2、7、14和21d行荧光检测。每个培养皿用蜡笔画五个圈，分别用抗NestinIgG、抗NSE IgG、抗GFAPIgG、抗CNP IgG和空白对照行免疫荧光染色，二抗为FITC荧光二抗。贴壁的克隆球呈巢蛋白(Nestin)抗原阳性，同时NSE、GFAP和CNP免疫荧光染色均呈阴性。在DMEM/F12+5％Fcs+EGF+bFGF培养基和新鲜成人脑脊液中分化的细胞，不同时间点均检测到NSE、GFAP和CNP阳性细胞，2周后几乎未找到Nestin阳性细胞。

13周胚胎神经干细胞较难培养，可能是由于13周胎脑中神经干细胞的数量较小胚龄胎脑减少或者其生物学特性已有某些改变的缘故。高密度悬浮细胞培养法克隆球形成和生长缓慢，存在高密度的抑制作用；低密度难以培养成功则可能是与细胞的密度依赖性和神经干细胞的绝对数量过少有关；中等密度悬浮细胞培养2周后可见克隆球形成，但有其它细胞吸附现象。我们在实验中发现神经干细胞具有一定的贴壁能力，在形成克隆球并长大至200μm前，能够保持贴壁状态，有利于在不改变细胞培养环境状态下，定点动态观察从单个干细胞分裂增殖形成克隆球的全过程。我们采用开始高密度而后密度逐渐递减的贴壁细胞培养法，在3周后可形成大量克隆球，认为在原代首次培养时使用高密度，神经干细胞和其它细胞一样有较多数量贴壁，由于前体细胞和各种终末神经细胞在无血清培养基中生长不良，活力下降，出现脱壁悬浮和逐渐死亡。每次换液去除悬浮细胞，细胞密度逐渐下降，大约3周时，剩余的贴壁细胞大部分是活力较强的神经干细胞，密度为1×10⁴/ml左右，该密度可以很好地避免发生细胞聚集现象，且神经干细胞仍能较好地分裂增殖，并大量形成克隆球。我们从人胚中分离出来自单细胞的克隆球经分裂增殖多次传代后仍然保持较强的活力，并呈巢蛋白的阳性表达，分化后细胞行免疫荧光检测显示均有NSE、GFAP和CNP阳性细胞，具有自我更新及多分化潜能，证明是神经干细胞。

本发明并不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的精神即公开范围内，仍可作一些修正或改变，故本发明的权利保护范围以权利要求书限定的范围为准。

Claims (3)

1.一种大胚龄神经干细胞的高-低密度贴壁细胞培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：皮层神经干细胞的分离和培养，高-低密度贴壁细胞培养法培养神经干细胞，神经干细胞的传代培养，神经干细胞的单细胞克隆，神经干细胞的分化培养以及免疫荧光法检测；其中，

所述皮层神经干细胞的分离和培养步骤包括：取13周自然流产和13周水囊引产的人胚胎，无菌条件下分离出胚胎前脑和大脑皮层组织，制成单细胞悬液，加入无血清培养基中，台盼蓝染色计数活细胞，调整细胞浓度为1×10⁷/ml，分别种植于多聚赖氨酸包被的培养瓶中，37℃、体积浓度为5％CO₂条件下静置进行贴壁细胞培养；

所述高-低密度贴壁细胞培养法培养神经干细胞的步骤包括：应用高密度贴壁细胞培养5天后后吸出部分细胞改为低密度培养，培养2周时经多次换液去除悬浮细胞继续培养至4周时形成大量大小不等的克隆球；

所述的神经干细胞的传代培养步骤包括：待原代细胞培养出现大量悬浮克隆球后进行传代培养，无菌条件下在倒置显微镜下用自制玻璃微针将其中的大于200μm的大克隆球切成数块，继续培养，7～10天传代1次，方法同上述的高-低密度贴壁细胞培养法培养神经干细胞的步骤；

所述的神经干细胞的单细胞克隆步骤包括：在贴壁细胞培养中，当细胞密度降至1×10⁴/ml时，挑选散在出现、明显增大、具有强折光性的细胞，在培养瓶底面用记号笔分别标记，动态定点观察并照相记录；当单个细胞形成克隆球并逐渐增大即将悬浮脱离时，用玻璃微管逐个吸出克隆球进行分化试验；将原代细胞制成单细胞悬液，稀释至40个/ml，于96孔培养板中滴加稀释的细胞悬液，每孔100μl，选取仅有1个细胞的培养孔作标记；

所述神经干细胞的分化培养步骤包括：将以上获得的、来自单细胞的克隆球经胰酶消化后，种植于预先用多聚赖氨酸包被的小培养皿中，用DMEM/F12+5％Fcs+EGF+bFGF培养基和经过滤灭菌后的新鲜成人脑脊液中进行分化培养；

所述免疫荧光法检测步骤包括：将上述获得的克隆球种入包被的小培养皿中，用无血清培养基贴壁培养12小时后行荧光检测；经分化培养后的细胞分别于2、7、14和21天行荧光检测。

2.如权利要求1所述的大胚龄神经干细胞的高-低密度贴壁细胞培养方法，其特征在于，所述皮层神经干细胞的分离和培养步骤中的血清培养基为含B27(1∶50)和EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)的DMEM/F12(1∶1)无血清培养基。

3.如权利要求1所述的大胚龄神经干细胞的高-低密度贴壁细胞培养方法，其特征在于，所述的高-低密度贴壁细胞培养法培养神经干细胞的步骤中，所述高密度贴壁细胞培养的细胞密度为1×10⁷/ml，所述低密度贴壁细胞培养的细胞密度为1×10⁶/ml。

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