CN103215222A - 一种将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导培养基及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于干细胞诱导分化技术领域，具体涉及一种诱导分化培养基及方法。一种将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导培养基，由A液、B液、C液组成，采用如下方法配制而成：A液：8～12ug bFGF溶于500ml人间充质干细胞无血清培养基中，过滤除菌，即得A液；B液：10～20ml香丹注射液加入到490～480ml人间充质干细胞无血清培养基中，即得B液；C液：4～8ugbFGF、4～8ugEGF、40～60ugBDNF、80～120ug GM1溶于500ml人间充质干细胞无血清培养基中，即得C液。本发明的将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的培养基，采用香丹注射液联合生长因子EGF、bFGF、BDNF、GM1诱导人脂肪间充质干细胞分化为神经细胞，所选用的诱导成分均无毒，诱导效率高，诱导时间短，诱导的细胞移植后无排斥，无伦理问题，安全性高。
Description
技术领域
本发明属于干细胞诱导分化技术领域，具体涉及一种诱导分化培养基及方法。
背景技术
神经系统损伤和神经退行性病变如帕金森氏病、阿尔茨海默病、亨廷顿氏病等，一直是困扰人类健康的难题，而细胞移植是治愈此类疾病的希望。目前用于移植治疗中枢神经系统损伤的主要是胚胎干细胞和神经干细胞，但由于供体来源难，伦理学异议、免疫排斥反应以及移植细胞存活困难等问题，发展空间有限。脂肪间充质干细胞来源广泛、取材容易，便于自体移植，具有强大的增殖能力，在体外长期培养过程中可以始终保持其多向分化潜能，在特定条件诱导下可以分化为成骨、软骨、肌腱、肌细胞、脂肪细胞、神经细胞和肝细胞等，是一种理想的组织工程种子细胞。
干细胞的分化是部分基因选择性地被激活或差异性表达，从而控制细胞表型和蛋白质的特异性分布。间充质干细胞分化为特定细胞类型主要取决于基因的激活，而细胞外微环境中各种因子类型和浓度则是基因激活的重要因素。间充质干细胞向神经细胞的诱导分化至少具有两方面的意义：一方面，揭示细胞的基因机制具有可塑性，外环境的变化能够激发出细胞的多能性，从而超越起源胚层的固有限制，分化为携带本胚层/其它胚层标志物的细胞。另一方面，作为产生移植用神经细胞的新途径，为临床移植治疗神经系统损伤提供机会。
目前文献报道的运用间充质干细胞体外诱导分化为神经细胞的研究报道非常多，主要有：(1)传统的化学诱导剂(抗氧化剂)法如：β-ME(β-巯基乙醇)、DMSO(二甲基亚砜)、BHA(丁基羟基茴香醚)联合诱导等；(2)生长因子诱导法如：神经生长因子NGF，表皮生长因子EGF，碱性成纤维细胞生长因子bFGF、维甲酸(RA)单独或者联合诱导等；(3)生长因子与化学诱导剂联合；(4)共培养或用接近生理状态的条件培养基；(5)基因转染；(6)中药丹参、黄芩苷等。
表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)在胚脑和成年脑组织中均有分泌，是促细胞生长作用很强的多肽因子，又是重要的致有丝分裂原，主要通过细胞表面相应的受体促进神经干细胞向神经细胞增殖和分化。bFGF在体内作用广泛，在神经系统能维持神经元和神经胶质细胞的存活，诱导神经元合成神经特异性基因产物等，并能促进交感和副交感神经元的轴突生长，具有丝裂原样作用。EGF在神经系统可促进神经元轴突的延长和维持神经元的存活。EGF和bFGF作为中枢神经系统的重要生长因子，在神经系统形成过程中发挥重要作用，但两者对神经干细胞增殖、分化的作用不同。在胚胎干细胞向神经细胞分化的过程中，bFGF可促进神经外胚层向神经前体细胞转化；用定量PCR检测，bFGF能够促进未分化状态细胞的一些神经外胚层相关基因的表达。研究表明，不同浓度bFGF可使皮层神经前体细胞增殖或分化成神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞，而EGF则对发育较晚期的神经前体细胞有促进增殖和分化作。
中药香丹注射液已被证明对心脑疾病确有临床疗效，且在临床广泛应用，具有抗氧化、抗缺血、改善微循环等功效。香丹注射液由丹参和降香组成，其浓度均为12g/100ml，其中主要含有丹参的水溶性成分丹参素。以蔡梅等对香丹注射液中丹参素的检测量为标准，推算出丹参素实际在注射液中的浓度约为1μg/μl；实验时，直接将香丹注射液加入培养基，使其体积百分比浓度为2～4％，则丹参素的浓度为2～4μg/μl。因为丹参素为超氧负离子的清除剂，具有抗氧化作用，且已证实其具有诱导MSCs向神经细胞分化的功能。
脑源性神经营养因子(brain derived neurophic factor，BDNF)是在脑内合成的一种蛋白质，它广泛分布于中枢神经系统内，在中枢神经系统发育过程中，对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用，并能防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化等生物效应，而且也是成熟的中枢及周围神经系统的神经元维持生存及正常生理功能所必需。
GM1是最重要的神经节苷脂之一，在中枢神经系统病变的治疗中起重要作用。GM1除具有上述神经节苷脂的共同作用外，还可以通过维持中枢神经细胞膜上的Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，起到维持细胞内外离子平衡、减轻神经细胞水肿、防止细胞内Ca2+积聚的作用；GM1可以对抗兴奋性氨基酸的神经毒性作用，减少自由基对神经细胞的损害等。因此，GM1具有促进神经重构(神经重塑，神经可塑性)的作用，即通过促进各种形态、生化、组化、神经生理及行为参数的改善，最终可以加速神经修复，最大程度地恢复原有的神经功能。GM1能促进多种原因引起的中枢神经系统损伤后神经功能的恢复，促进神经重构。
传统的化学诱导剂法虽然可以高效、快速地将脂肪间充质干细胞分化为神经细胞，但细胞死亡率较高(化学诱导剂具有一定毒性，BHA、DMSO等可使细胞突变，用于细胞移植存在致瘤性的危险)；生长因子诱导方法虽然诱导后细胞存活率高，但诱导时间长、诱导效率低。基因转染诱导因为基因改变存在罹患癌症的潜在风险。
发明内容
本发明的目的是针对现有的诱导剂及诱导方法存在的缺陷，提供一种安全无毒、诱导效率高，诱导时间短的将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导分化完全培养基。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导培养基，由A液、B液、C液组成，采用如下方法配制而成：
A液：8～12ug bFGF溶于500ml人间充质干细胞无血清培养基中，过滤除菌，即得A液，其中bFGF浓度16～24ng/ml；
B液：10ml～20ml香丹注射液加入到490～480ml人间充质干细胞无血清培养基中，混合后总体积为500ml，即得B液，其中香丹注射液体积终浓度为2％～4％；
C液：4～8ugbFGF、4～8ugEGF、40～60ugBDNF、80～120ug GM1溶于500ml人间充质干细胞无血清培养基中，即得C液，其中bFGF终浓度8～16ng/ml，EGF终浓度8～16ng/ml，BDNF终浓度80～120ng/ml，GM1终浓度160～240ng/ml。
本发明的另一个目的是提供一种将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的方法，采用本发明提供的诱导培养基，具体包括以下步骤：1、制备脂肪间充质干细胞；2、脂肪间充质干细胞的鉴定：取P3代脂肪间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表面标记；3、诱导脂肪间充质干细胞分化为神经细胞：先用A液预诱导24h，然后B液诱导6h，PBS洗涤，最后C液诱导分化5d；4、诱导后神经细胞鉴定：形态学观察法；免疫细胞化学法检测诱导后NeuN、β-TubulinIII、GFAP的表达情况，NeuN、β-TubulinIII表达阳性者为神经细胞，GFAP表达阳性为神经胶质细胞；免疫荧光染色法检测诱导后细胞β-TubulinIII的表达情况，β-TubulinIII表达阳性为神经细胞。
本发明的将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导培养基，采用香丹注射液(有效成分丹参素)联合生长因子EGF、bFGF、BDNF、GM1诱导人脂肪间充质干细胞分化为神经细胞，所选用的诱导成分均无毒，诱导效率高，诱导时间短，诱导后细胞移植后无排斥，无伦理问题，安全性高。采用本发明提供的方法诱导脂肪间充质干细胞分化为神经细胞，诱导成功率高。
附图说明
图1是人脂肪间充质干细胞形态图(×200)；
图2是采用本发明的培养基诱导后出现的神经细胞形态图(×200)；
图3是采用本发明的培养基诱导后NeuN阳性表达细胞免疫细胞化学染色结果图(×400)；
图4是采用本发明的培养基诱导后β-TubulinIII阳性表达细胞免疫细胞化学染色结果图(×400)；
图5采用本发明的培养基诱导后GFAP阳性表达细胞免疫细胞化学染色结果图(×400)；
图6是采用本发明的培养基诱导后β-TubulinIII阳性表达免疫荧光染色结果图(×200)；图中：a示β-TubulinIII阳性细胞，呈红色荧光；b示Hoechst33258复染的胞核，呈蓝色荧光；c为a与b的合成。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的一种将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导培养基及方法作详细说明。
实施例1本实施例的一种将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导培养基，由A液、B液、C液组成，采用如下方法配制而成：
A液：10ug bFGF(碱性成纤维细胞生长因子，peprotech，96-100-18B-50)溶于500ml人间充质干细胞无血清培养基(LONZA，货号00190632)中，过滤除菌，即得A液，其中bFGF浓度20ng/ml；
B液：10ml香丹注射液(有效成分丹参素，江苏常熟雷允上制药有限公司)加入到490ml人间充质干细胞无血清培养基中，即得B液，其中香丹注射液体积终浓度为2％；
C液：5ug bFGF、5ug EGF(表皮生长因子，peprotech，96-AF-100-15-500)、50ug BDNF(脑源性神经营养因子，peprotech，货号450-02)、100ug GM1(神经节苷脂，Sigma，G7641-1MG)溶于500ml人间充质干细胞无血清培养基中，即得C液，其中bFGF终浓度10ng/ml，EGF终浓度10ng/ml，BDNF终浓度100ng/ml，GM1终浓度200ng/ml。
实施例2采用本发明的诱导培养基将人脂肪间充质干细胞诱导分化成神经细胞的方法，步骤如下：
一、人脂肪间充质干细胞制备：
1、接收脂肪组织，用75％的酒精擦拭装脂肪组织的容器外壁；
2、分装脂肪组织，每一个T175培养瓶分装脂肪组织为50ml。10ml移液管，去吸头，于脂肪采集瓶先吸取下层红色液体弃掉，剩余上层脂肪混匀后进行分装。
3、洗涤脂肪组织，除去血细胞。向T175培养瓶中加入100ml氯化钠注射液，拧紧盖子，剧烈晃动3分钟以充分洗涤脂肪组织，接着静止3～5分钟，使不同相分离，吸去下层水相；重复以上操作三次，直到下层液较为清澈。
4、胶原酶I消化：加入等量新配制的预热(提前半小时于37℃的气浴摇床预热)的胶原酶I溶液(0.1％胶原酶I配制方法：称取0.1g胶原酶I粉末溶解于100ml未加任何因子的培养基中，用之前37℃预热)，封口膜封口，剧烈晃动培养瓶5～10秒，置于振动气浴锅中，37℃，70rpm，消化60分钟，每隔15分钟剧烈晃动培养瓶5～10秒，直到看起来较为平滑。
5、分离基质血管组分(SVF)：将消化后的组织用无菌40目滤网分装到50ml的心管中，室温400g离心10分钟，得到的沉淀即为SVF。
6、净化沉淀：离心后，SVF沉积于离心管底部，用移液管自上而下小心除去上层油脂和下层的胶原酶溶液。注意：在SVF沉淀上方留下少量的溶液，以免扰动沉淀细胞。适量生理盐水重悬细胞，吹散，室温400g，10分钟离心。离心完毕，小心吸去上清液，不能直接倒掉。吸取时移液管头应该置于离心管的上部以便于彻底的出去油。10ml培养基悬浮细胞，然后将细胞汇总到50ml离心管中，过100目筛，再次室温300g，10分钟离心。
7、细胞种植：离心后加20ml培养基充分混匀。基于组织块法：根据培养瓶的面积进行细胞种植。按照每平方厘米接种0.16ml抽脂得到的脂肪量进行接种，即每个T75培养瓶中接种12ml抽脂脂肪量。即每100ml脂肪组织，最终可以接种8个T75培养瓶。进行未处理脂肪量和最终得到的细胞悬液换算，进而接种细胞。
8、原代细胞培养：平置培养瓶，将培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱。培养条件：37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2％。培养基：人间充质干细胞无血清培养基(LONZA，00190632)。
9、换液：原代培养第24h，进行全量换液。此后每隔3天全量换液，放置二氧化碳恒温恒湿培养箱进行培养。
10、原代细胞收获：7d左右，原代培养的细胞克隆团的面积百分比到达70％～80％时，消化收获。
在培养瓶中加入消化酶(消化酶为0.125％Trypsin-EDTA溶液，使用前室温(20～25℃)放置15～25min，每75cm2加入2ml消化酶溶液)，消化时间为5～8min，加入培养基2～3ml反复吹打瓶底至细胞大部分脱落，移入50ml离心管中，原培养瓶中加入4～5ml氯化钠注射液冲洗瓶壁，加入离心管中定容至50ml，移液管吹打悬浮后，100um无菌滤网过滤，过滤液收集到50ml离心管中，1000rpm，10min离心洗涤。
11、原代细胞传代：观察单个离心管内余下细胞沉淀量，适当合并数个离心管中细胞沉淀至1个离心管中，加入适量培养基，轻轻吹打重悬浮细胞，定容至30ml，吹打混匀，取样计数。计数后1000rpm，10min二次离心。去除上清液，在离心管中加入培养基适量，轻轻吹打重悬浮细胞，定容后接种至新的培养容器中，传代细胞密度为5000～6000个/cm2，即(3.75～4.5)×105个cells/T75，按照4.5×105个cells/T75进行传代。在培养容器上标示细胞代数与培养时间等信息。将培养容器放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱开始培养，培养条件：二氧化碳恒温恒湿培养箱，37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2％。培养至细胞融合达85％～90％。
二、脂肪间充质干细胞的鉴定
1、取P3代脂肪间充质干细胞，流式检测细胞表面标记，结果见表1：
表1流式细胞仪检测P3代脂肪间充质干细胞表面标记物
其中，阳性标记物CD29、CD73、CD90、CD49d表达大于95％，阴性标记物CD14、CD34、CD45、HLA-DR表达低于2％，证明该细胞为脂肪间充质干细胞。
三、诱导脂肪间充质干细胞分化为神经细胞：传3代的脂肪间充质干细胞，0.125％Trypsin-EDTA溶液消化收集细胞，制备细胞悬液，细胞计数板计数活细胞密度，并调整密度1×104/cm2，接种于事先放置有经多聚赖氨酸处理的消毒盖玻片的24孔板内，制备细胞爬片。待细胞接近80％融合，生长旺盛时再进行诱导分化，分组如表2：
表2诱导脂肪间充质干细胞分化为神经细胞的实验分组
四、诱导后神经细胞鉴定
1、形态学观察：倒置显微镜下，动态观察脐血MSCs诱导前后形态学变化。
2、免疫细胞化学染色法(SABC法)检测：
(1)收集诱导后细胞爬片，0.01M PBS(PH＝7.2)冲洗，5min×3次，冷丙酮固定10min，PBS冲洗5min×3次；
(2)3％H2O2溶液孵育30min，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M PBS冲洗，5min×3次；
(3)滴加封闭用羊血清(试剂A)，37℃孵育30min，吸除多余血清，不洗；
(4)分别滴加小鼠抗NeuN、兔抗β-TubulinIII一抗、小鼠抗GFAP，4℃冰箱过夜，PBS冲洗，5min×3次；
(5)滴加生物素标记的相应的抗小鼠或抗兔二抗(试剂B)，37℃孵育1h，0.01M PBS冲洗，5min×3次；
(6)滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素(试剂C)，37℃孵育30min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；
(7)DAB显色：取蒸馏水1ml，加入试剂盒中A、B、C成分各一滴，混匀后，滴加至上述处理的细胞标本上；室温下显色，镜下控制反应时间。至显色满意时(一般2～10min)加蒸馏水终止反应；
(8)常规脱水透明封片：50％酒精1min，70％酒精1min，80％酒精1min，95％酒精1min，100％酒精I5min，100％酒精II5min，二甲苯I5min，二甲苯II5min，中性树胶封片。
对照实验：以0.01M PBS代替第一抗体，其余步骤相同。
免疫细胞化学法检测诱导前后NeuN、β-TubulinIII、GFAP的表达情况，随机抽取4张玻片，200倍视野下随机选取5个视野，分别计算阳性细胞的比例。阳性细胞占总细胞比例以均数±标准差
表示。采用SPSS11.0软件进行统计分析，实验数据以
表示，多组比较采用方差分析，两组间率的比较采用χ2检验，P＜0.05认为有统计学意义。
3、免疫荧光染色法检测
免疫荧光染色步骤同上，一抗为兔抗β-TubulinIII，荧光二抗为Cy3-羊抗兔IgG，阴性对照用PBS代替第一抗体。
免疫荧光染色法检测诱导前后三组β-TubulinIII的表达情况，并随机抽取4张玻片，每张玻片200倍视野下随机选取5个视野，计数阳性细胞总数和Hoechst复染的细胞总数，计算β-TubulinIII阳性细胞的比例。阳性细胞占总细胞比例以
表示。采用SPSS11.0软件进行统计分析，实验数据以
表示，多组比较采用方差分析，两组间率的比较采用χ2检验，P＜0.05认为有统计学意义。
五、结果
1、形态学观察
化学诱导组：传代后脂肪间充质干细胞贴壁快，细胞增殖旺盛，细胞呈均一的成纤维细胞样形态，如图1所示。预诱导12h后，原来梭形的脂肪间充质干细胞胞体发生收缩，细胞边缘变得不规整，有许多细的突起。预诱导结束时，一部分细胞胞体呈圆形。正式诱导后，细胞胞体进一步收缩，呈圆形、三角形，可见多个突起，而且发出分支，形成圆锥状终末端；有的突起逐渐伸长。5h后细胞形态不再发生明显变化，大部分细胞呈现典型的神经元样形态。诱导后，细胞部分死亡、脱落。继续培养5d后大部分细胞漂浮死亡。
生长因子组：诱导分化培养后，3d内脂肪间充质干细胞基本无变化。5～10d部分细胞胞体逐渐增大，胞突变细伸长。2周左右，部分细胞胞体呈圆形，较大，胞体伸出一个、两个或多个突起，突起较长，折光性好，局部区域相邻细胞突起连成网状，约一半的细胞呈现典型的神经细胞形态。细胞存活良好，继续培养2周未见到明显的细胞漂浮、脱落现象。
本发明的诱导培养基组：经A液预诱导后，细胞形态无明显变化。换B液后，其形态很快发生变化，1～2h后细胞形态变化明显，细胞胞浆、细胞质以细胞核为中心收缩，细胞变短，体积变小，细胞形成双极或多极的细胞体，部分细胞的细胞质收缩形成细胞突起，细胞形态呈小椭圆形、星型、蝌蚪型、细长条状等，细胞反光增强。用C液维持诱导，细胞突起进一步延长和变细，部分细胞伸出多根突起，折光性好，局部区域相邻细胞突起连成网状，大部分细胞呈现典型的神经细胞形态，如图2所示。细胞状态好，存活时间长，继续培养7d未见到明显的细胞漂浮、脱落现象。
2、免疫细胞化学染色结果
免疫细胞化学染色结果显示，NeuN阳性细胞胞核着色，胞浆着色浅，如图3所示。诱导前三组NeuN均为阴性表达，化学诱导剂诱导后NeuN阳性细胞率为(71.6±4.6)％；生长因子诱导后NeuN阳性细胞率为(43.6±3.9)％；本发明的诱导培养基诱导后NeuN阳性细胞率为(78.6±4.5)％。本发明的诱导培养基诱导分化率高于化学诱导剂和生长因子(P＜0.05)，差异有统计学意义。
免疫细胞化学染色结果显示，β-TubulinIII阳性细胞胞浆着色，呈棕黄色颗粒，细胞核不着色，如图4所示。诱导前三组β-TubulinIII均为阴性表达，化学诱导后β-TubulinIII阳性细胞率为(73.8±2.3)％；生长因子诱导后β-TubulinIII阳性细胞率为(54.6±4.1)％；本发明诱导剂诱导后β-TubulinIII阳性细胞率(82.6±4.3)％。本发明的诱导培养基诱导分化率高于化学诱导剂和生长因子(P＜0.05)，差异有统计学意义。
免疫细胞化学染色结果显示，GFAP阳性细胞胞浆着色，呈棕黄色颗粒，细胞核不着色，如图5所示。诱导前三组GFAP均为阴性表达，化学诱导后GFAP阳性细胞率为(12.6±2.0)％；生长因子诱导后GFAP阳性细胞率为(31.8±5.0)％；本发明诱导后GFAP阳性细胞率(15.6±3.6)％。本发明的诱导培养基诱导脂肪间充质干细胞向星形胶质细胞分化率低于生长因子(P＜0.05)，差异有统计学意义，略高于化学诱导剂。
3、免疫荧光染色结果
免疫荧光法染色结果显示，β-TubulinIII阳性细胞的胞浆呈红色荧光，如图6中a所示，Hoechst33258复染的胞核呈蓝色荧光，如图6中b所示。诱导前三组β-TubulinIII均为阴性表达，化学诱导后β-TubulinIII阳性细胞率为(72.6±2.7)％；生长因子诱导后β-TubulinIII阳性细胞率为(54.5±1.9)％；本发明的诱导培养基诱导后β-TubulinIII阳性细胞率为(79.8±3.0)％。本发明的诱导培养基诱导分化率高于化学诱导剂和生长因子(P＜0.05)，差异有统计学意义，见表3。
表3三组诱导结果比较(n＝20，
)
注P*＜0.05相对于生长因子组和化学诱导组，P*Δ＜0.05相对于生长因子组
免疫细胞化学染色结果显示，用本发明的诱导培养基诱导后NeuN、β-TubulinIII阳性细胞率高于化学诱导和生长因子诱导(P＜0.05)，GFAP阳性细胞率低于生长因子诱导(P＜0.05)，说明本发明的诱导培养基诱导效率高于化学诱导剂和生长因子，且诱导后细胞主要分化为神经细胞，而非神经胶质细胞。
Claims (2)
1.一种将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的诱导培养基，其特征在于：由A液、B液、C液组成，采用如下方法配制而成：
A液：8～12ug bFGF溶于500ml人间充质干细胞无血清培养基中，过滤除菌，即得A液，其中bFGF浓度16～24ng/ml；
B液：10ml～20ml香丹注射液加入到490～480ml人间充质干细胞无血清培养基中，混合后总体积为500ml，即得B液，其中香丹注射液体积终浓度为2％～4％；
C液：4～8ug bFGF、4～8ug EGF、40～60ug BDNF、80～120ug GM1溶于500ml人间充质干细胞无血清培养基中，即得C液，其中bFGF终浓度8～16ng/ml，EGF终浓度8～16ng/ml，BDNF终浓度80～120ng/ml，GM1终浓度160～240ng/ml。
2.一种采用权利要求1所述的诱导培养基将人脂肪间充质干细胞诱导成神经细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)、制备脂肪间充质干细胞；(2)、脂肪间充质干细胞的鉴定：取P3代脂肪间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表面标记；(3)、诱导脂肪间充质干细胞分化为神经细胞：先用A液预诱导24h，然后B液诱导6h，PBS洗涤，最后C液诱导分化5d；(4)、诱导后神经细胞鉴定：形态学观察法；免疫细胞化学法检测诱导后NeuN、β-TubulinIII、GFAP的表达情况，NeuN、β-TubulinIII表达阳性者为神经细胞，GFAP表达阳性者为神经胶质细胞；免疫荧光染色法检测诱导后细胞β-TubulinIII的表达情况，β-TubulinIII表达阳性为神经细胞。
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