CN105255824A - 一种牙周膜干细胞成骨分化诱导液及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种牙周膜干细胞成骨分化诱导液及方法。所述诱导液由下述含量的下述组分组成：包含基础培养基、维生素C、地塞米松、β-磷酸甘油钠、FBS、IGF-1和BMP-2。所述牙周膜干细胞成骨分化诱导方法，使用上述的成骨分化诱导液进行诱导。本发明提供一种多种诱导因子成骨诱导液，多诱导因子联合应用作用于PDLSCs，能有效的诱导PDLSCs骨向分化。本发明采用的原材料是12-18岁青少年在进行牙齿正畸治疗时需要拔除的第三磨牙，目前基本作为医疗废弃物而扔掉；而本发明将其用于分离培养PDLSCs，进行骨向诱导，有效的实现了医疗废弃物的再利用。

Description

一种牙周膜干细胞成骨分化诱导液及方法

技术领域

本发明涉及干细胞诱导分化领域，尤其涉及一种牙周膜干细胞成骨分化诱导液及方法。

背景技术

牙周组织是牙齿周围的组织，又叫牙齿的支持组织，包括牙槽骨、牙龈、牙周膜和牙骨质。牙周病是指发生在牙周组织的疾病，包括仅累及牙龈组织的牙龈病和波及深层牙周组织(牙周膜、牙槽骨、牙骨质)的牙周炎两大类。牙周疾病是常见的口腔疾病，是引起成年人牙齿丧失的主要原因之一，也是危害人类牙齿和全身健康的主要口腔疾病。牙周病的早期症状不易引起重视，造成牙周组织长期慢性感染，炎症反复发作，不仅损害口腔咀嚼系统的功能，还会严重影响健康。

牙周病是牙周组织在慢性炎症刺激下的感染性疾病，是牙菌斑中的微生物在相应的微环境下引起的炎症，它损坏牙周组织，破坏牙槽骨，最终导致牙齿松动脱落以及牙槽骨的吸收。牙周治疗通过改善微环境重新再生出新的结缔组织和支持组织，完成牙槽骨、牙骨质和牙周膜的构建来治疗牙周炎症。常用的牙周再生方法有引导组织再生术、根面平整术等，此类方法简单易行但并不能完全实现功能性和结构性牙周组织再生，具有相应的局限性。

牙周组织工程技术的出现和发展为牙周再生提供了崭新的思路和方法。牙周膜是牙根与牙槽骨之间的一层结缔组织，是重要的牙周支持组织，主要由成纤维细胞、成牙骨质细胞和一些未分化的间充质细胞组成。正常情况下，牙周组织具有自身的更新和修复能力，其修复活动是通过牙周膜细胞自我更新实现的。在疾病或在受到外界刺激时，通过牙周膜中细胞的不断增殖和分化使组织再生。2004年Seo等从拔除的第三磨牙牙周膜组织中分离得到牙周膜干细胞(PeriodontalLigamentSemCells,PDLSCs)。此外，在拔牙后牙槽窝的内表面也有PDLSCs存在。近来，有人从成人牙周组织中得到了高度纯化的PDLSCs克隆。值得注意的是，更多研究发现，从炎症牙周膜组织中也可分离得到PDLSCs，并证明其仍保持再生牙骨质和牙周膜组织的潜能，也在一定程度弥补了其来源不足的弊端。

研究表明，PDLSCs表达间充质干细胞的标记物STRO-1和CD146/MUC18,这意味着PDLSCs很有可能是来源于血管周围的细胞群。而这一点恰恰与同样表达STRO-1和CD146/MUC18的骨髓间充质干细胞(BoneMarrowMesenchymalStemCells，BMMSCs)非常相似。PDLSCs也具有与BMSCs相似的多向分化能力，可体外分化为多种细胞，如脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞等，在维持牙周组织的稳态，维护牙槽骨的新陈代谢过程中发挥了重要作用。虽然有研究采用包括脂肪、骨髓在内的多种组织来源的成体干细胞进行牙周再生，但取材的有创性和伦理性等问题仍然制约了其发展。因此，PDLSCs有望成为牙周组织再生的首选种子细胞。

抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松等是间充质细胞向成骨细胞分化的必需条件，也是成骨细胞体外成骨的重要条件，是骨髓基质干细胞及牙髓干细胞体外定向诱导向成骨及成牙本质细胞分化的有效途径。公开号为CN103667182A的中国发明专利申请公开了一种骨髓间充质干细胞在体外向成骨细胞分化的诱导方法，所述诱导培养基的终浓度组成如下：地塞米松1×10^-8mol/L，抗坏血酸50μmol/L，β-甘油磷酸钠10mmol/L，溶剂为骨片培养72～96小时的上清液。在骨髓间充质干细胞和骨片的培养中都使用了1:1的DMEM和F12培养基。在这种矿化诱导培养条件下，PDLSCs也取得了一定的成骨分化效果，但诱导条件仍有很大的改善空间。

胰岛素样生长因子-1(Insulin-likegrowthfactor-1,IGF-1)又名生长调节素C，是由人IGF-1基因编码合成。胰岛素样生长因子-1与胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)(Ⅰ类酪氨酸激酶受体)结合，激活下游信号通路调控DNA合成及蛋白翻译从而影响细胞生长增殖、分化及组织器官的发育等。许多研究证实：IGF-1是一种多功能肽，可以调节细胞生长、分化及细胞外基质蛋白表达；IGF-1可以促进间充质细胞增殖，促进伤口愈合；IGF-1可以上调抗凋亡分子表达及抑制促凋亡前体分子提高牙周膜成纤维细胞的存活。

骨形成蛋白2(bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2)是多功能细胞生长因子，为转化生长因子β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)超家族的成员之一，具有调节间充质干细胞成骨向分化、血管发生、神经元向分化等功能。在胚胎发育过程中，BMP-2与胚胎干细胞的演变、人背部脊柱的发育密切相关；同时BMP-2还具有促进神经组织、心血管组织、胃肠组织、肾脏组织形成的作用。在颅颌面部发育、再生重建的研究中发现：BMP-2的作用贯穿于牙齿发育的全过程，可诱导牙囊细胞向成牙骨质细胞/成牙本质细胞表型分化，促进牙根及牙周支持组织的发育，促进牙髓血管生成；在牙周组织缺损区局部应用BMP-2，能有效促进牙周韧带、牙骨质和牙槽骨的重建，并可提高成骨细胞特异性基因的表达(OPN，OC，BSP，Cbfa1等)，促进成骨细胞的成熟，加快骨再生愈合过程。

目前，对于PDLSCs成骨分化诱导的研究主要集中于不同细胞因子对其生物学行为产生的不同影响，但是往往局限于单一细胞因子对其作用的研究。由于生物体是一个复杂的、存在多诱导因素的有机体，因此在牙周组织复杂的微环境中，多种诱导因子在牙周再生的过程中可能会起到相互协同或拮抗的作用，其效果不确定。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种牙周膜干细胞成骨分化诱导液及方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种牙周膜干细胞成骨分化诱导液，包含基础培养基、维生素C、地塞米松、β-磷酸甘油钠、胎牛血清(FBS)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和骨形成蛋白-2(BMP-2)。

更优选地，所述IGF-1的含量为15-40μg/L，所述BMP-2的含量为30-70μg/L。

更优选地，所述IGF-1的含量为20-30μg/L，所述BMP-2的含量为40-60μg/L。

更进一步优选地，所述IGF-1的含量为25μg/L，所述BMP-2的含量为50μg/L。

优选地，所述诱导牙周膜干细胞成骨分化的诱导液，由下述含量的下述组分组成：50μg/L维生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/Lβ-磷酸甘油钠，体积分数10％FBS，25μg/LIGF-1，50μg/LBMP-2，余量为基础培养基，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。

一种牙周膜干细胞成骨分化诱导方法，使用上述成骨分化诱导液进行诱导。

优选地，所述牙周膜干细胞成骨分化诱导方法，包括以下步骤：消化后进行细胞培养，自其中分选出STRO-1⁺PDLSCs进行培养，使用上述成骨分化诱导液对第2-5代PDLSCs进行诱导。

更优选地，使用磁珠分选法分选出STRO-1⁺PDLSCs。

更进一步优选地，磁珠分选法为：将收集消化后培养的细胞与STRO-1单抗4℃孵育1h，与磁珠30min4℃孵育，在磁力设备作用下筛选出STRO-1⁺PDLSCs。

优选地，所述牙周膜干细胞成骨分化诱导方法，包括以下步骤：

1)PDLSCs原代分离培养及传代：

刮取牙齿根中下1/3段的牙周膜组织，剪成约为1mm³大小；加入适量胶原酶-Dispase酶1:1混合消化液，37℃消化30-35min后，1000r/min离心5min，弃上清，加入适量PBS重悬，1000r/min离心5min，弃上清，加入含体积分数10％FBS的DMEM/F12培养液重悬细胞，调整细胞密度至1×10⁴cell/mL，2mL每孔接种于六孔板，于5％CO₂、37℃条件下培养；

待细胞长至汇合度80-90％，收集细胞，用磁珠分选法分选出STRO-1⁺PDLSCs，用含体积分数10％FBS的DMEM/F12培养液重悬细胞，调整细胞密度至1×10⁴cell/mL，2mL每孔接种于六孔板中，于5％CO₂、37℃条件下培养；

待细胞长至汇合度80-90％，弃培养液，加入适量0.25％胰蛋白酶，消化1-3min，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入适量含体积分数10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清；用含体积分数10％FBS的DMEM/F12培养液重悬细胞，调整细胞密度至5×10⁴cell/mL，接种于培养皿中于5％CO₂、37℃条件下进行传代培养，每隔2-3天换液一次；

2)PDLSCs成骨分化：取第3代PDLSCs，按1×10⁴cell/mL密度接种于12孔培养板内，培养至汇合度达到70-80％以上时，更换为上述成骨分化诱导液，于5％CO₂、37℃条件下进行诱导培养7-28d。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)牙周组织处于复杂的微环境中，在牙周再生的过程中会由多种诱导因子相互起协同或拮抗的作用。本发明提供一种多种诱导因子成骨诱导液，多诱导因子联合应用作用于PDLSCs，能有效的诱导PDLSCs骨向分化。

2)本发明采用的原材料是12-18岁青少年在进行牙齿正畸治疗时需要拔除的第三磨牙，目前基本作为医疗废弃物而扔掉；而本发明将其用于分离培养PDLSCs，进行骨向诱导，有效的实现了医疗废弃物的再利用。

附图说明

图1为PDLSCs细胞表面标志物表达的流式检测图。

图2为细胞形态图。其中，图2A、图2B为P0代在40倍、100倍下的图片，图2C、图2D为P1代在40倍、100倍下的图片，图2E、图2F为P3代在40倍、100倍下的图片。

图3为茜素红染色图。

图4为茜素红染色的矿化面积图。

图5为细胞碱性磷酸酶活性结果图。

图6为成骨诱导后不同时间细胞OCN、Col-I、Runx2表达水平图。其中，图6A为诱导后7d细胞OCN、Col-I、Runx2表达水平，图6B为诱导后14d细胞OCN、Col-I、Runx2表达水平，图6C为诱导后21d细胞OCN、Col-I、Runx2表达水平。

具体实施方式

为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施方式做进一步说明。除本发明中记载的外，本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。

本发明使用的部分试剂或仪器来源如表1所示。

表1、本发明使用的部分试剂和仪器来源

实施例1

一种牙周膜干细胞成骨分化诱导液，包含下述含量的下述组分：50μg/L维生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/Lβ-磷酸甘油钠，25μg/LIGF-1，50μg/LBMP-2，体积分数10％FBS，余量为DMEM/F12培养基。

一种牙周膜干细胞成骨分化诱导方法，使用上述成骨分化诱导液进行诱导，具体包括以下步骤：

1)PDLSCs原代分离培养及传代：

取材：将12-18岁健康供者的因正畸需要拔除的第3磨牙快速浸入含3倍双抗的4℃预冷的PBS中备用。用含3倍双抗的PBS从牙根到牙冠的方向冲洗牙体，彻底清除血污，重复3次。用手术刀片冠根单向刮取根中下1/3段的牙周膜组织，移入离心管，并用眼科剪将组织块剪成约为1mm³大小。

消化：向组织碎块中加入适量混合消化液，所述混合消化液由3g/L胶原酶溶液与4g/LDispase酶溶液按体积比1:1的比例混合而成，置于37℃恒温摇床中消化30-35min，消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清，加入适量PBS重悬，1000r/min离心5min，弃上清；加入培养液(含体积分数10％FBS的DMEM/F12培养液)重悬细胞，使其密度为1×10⁴cell/mL，接种于六孔板，每孔2mL，5％CO₂培养箱37℃培养。

纯化：待细胞长至汇合度80-90％，收集细胞，用磁珠分选法纯化细胞；具体方法为：将收集的细胞与STRO-1单抗4℃孵育1h，与磁珠4℃孵育30min，在磁力设备作用下筛选出STRO-1⁺PDLSCs，加入培养液(含体积分数10％FBS的DMEM/F12培养液)重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁴cell/mL，2mL每孔接种于新的六孔板中，5％CO₂培养箱37℃培养。

PDLSCs鉴定：待细胞长至汇合度80-90％，收集细胞(约1×10⁶个)，加入3g/LTritonX-100浸泡20min，PBS洗3遍，10％山羊血清室温封闭2h，分别滴加1:200稀释的CD146、CD105、CD73、HLA-DR、CD34、CD45抗体各50ul，同时对照组滴加单纯PBS50μL，4℃处理16h。次日室温放置30min，PBS漂洗3遍，各组分别滴加1:500稀释的FITC标记二抗IgG，常温避光孵育1h，PBS漂洗2遍，10％福尔马林固定细胞，上机测定抗原的阳性率。

流式细胞检测结果如图1所示，PDLSCs细胞表面标志物表达率如表2所示。由表2和图1可知，克隆细胞表面抗原CD146、CD105、CD73表达阳性，而HLA-DR、CD34、CD45表达阴性，说明本发明中得到的为PDLSCs，且其属来源于中胚层的间充质干细胞。

表2、PDLSCs细胞表面标志物表达率

细胞表型	CD146	CD105	CD73	HLA-DR	CD34	CD45
							阳性表达率(％)	99.8	99.8	99.8	0.2	0.2	0.3

传代：将已鉴定正确的PDLSCs进行传代培养，用吸管吸弃旧培养液，加入适量0.25m/v％胰蛋白酶溶液，消化1-3min，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入适量含体积分数10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量含体积分数10％FBS的DMEM/F12培养液，进行细胞记数，按5×10⁴cell/mL密度接种于培养皿中进行传代培养，5％CO₂培养箱37℃培养，每隔2-3天换液一次。培养过程中观察细胞形态，结果如图2所示。细胞接种约4h后开始贴壁，2-3d进入指数生长期，细胞增殖速度较快，4-6d进入平台期。细胞生长速度平稳，呈单层贴壁生长。大部分细胞呈类梭形，形态不规则。

2)成骨分化诱导：取第3代PDLSCs，按1×10⁴cell/mL密度接种于12孔培养板内，培养至细胞汇合度达到70-80％以上时，更换为上述成骨分化诱导液，5％CO₂培养箱37℃培养，每隔3天换液一次。

为了验证本发明成骨分化诱导的效果，将实施例1中的诱导液及方法作为实验组1，同时设置6组对照组，对实验组和对照组进行茜素红染色、碱性磷酸酶活性测定及成骨基因OCN、Col-I、Runx2的检测。每个对照组都与实施例1基本相同，仅使用的成骨诱导液不同。

对照组1中使用的成骨诱导液为：含体积分数10％FBS的DMEM培养液。

对照组2中使用的成骨诱导液为：50μg/L维生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/Lβ-磷酸甘油钠，体积分数10％FBS，余量DMEM/F12。

对照组3中使用的成骨诱导液为：50μg/L维生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/Lβ-磷酸甘油钠，25μg/LIGF-1，体积分数10％FBS，余量DMEM/F12。

对照组4中使用的成骨诱导液为：50μg/L维生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/Lβ-磷酸甘油钠，50μg/LBMP-2，体积分数10％FBS，余量DMEM/F12。

对照组5中使用的成骨诱导液为：50μg/L维生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/Lβ-磷酸甘油钠，5μg/LIGF-1，50μg/LBMP-2，体积分数10％FBS，余量为DMEM/F12。

对照组6中使用的成骨诱导液为：50μg/L维生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/Lβ-磷酸甘油钠，25μg/LIGF-1，100μg/LBMP-2，体积分数10％FBS，余量DMEM/F12。

效果实施例1、茜素红染色

在使用上述各成骨分化诱导液进行细胞成骨诱导培养28天后，对各组细胞进行茜素红染色。茜素红染色的具体方法为：

弃培养液，用PBS清洗细胞2到3次；加入4％多聚甲醛固定10-15min；吸弃多聚甲醛，PBS清洗3次；加入2％茜素红，37℃孵育30min。孵育结束后吸弃残液，用37℃预热的去离子水清洗2到3次，每次20s；晾干后在倒置显微镜下观察并拍照。使用图像分析软件Image-Pro-Plus5.0(MediaCybernetics,美国)进行矿化结节面积计算。染色结果如图3，矿化结节面积如图4和表3所示。

表3、矿化面积计算结果

注：**表示P﹤0.01。

由表3和图3-4可知，对照组1不含诱导因子，不对细胞进行成骨分化诱导，因此，没有着色，矿化面积为零。实验组1与其他各组均有显著性差异(P﹤0.01)；其他各组之间无显著性差异。实验组1中的矿化面积均值为89.50±0.77％，是对照组矿化面积的2.5倍左右。说明本发明实施例1所示的成骨分化诱导液进行成骨分化诱导的效果最好。

效果实施例2、碱性磷酸酶活性(ALP)测定

对各实验组和对照组PDLSCs分别于诱导分化培养0d、7d、14d、21d和28d对细胞进行碱性磷酸酶活性定量测定。具体测定方法为：

弃原培养液，PBS洗3次，每孔加200μL0.2％TritonX-100，37℃孵育1h，镜下可见细胞裂解完全，吸出裂解液至新离心管，离心后取上清，留作备用。

对上述裂解液进行蛋白含量测定，于96孔板中进行。按BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书要求设置测定孔、标准孔和空白孔，每组设3个复孔，每孔液体20μL，37℃孵育30min后检测562nmOD值，空白孔调零。根据标准孔OD值绘制蛋白浓度标准曲线，代入各孔OD值，算出各组的蛋白浓度。

对上述裂解液进行碱性磷酸酶活性测定，于96孔板中进行。按碱性磷酸酶测定试剂盒说明书要求设置测定孔、标准孔和空白孔，37℃孵育15min，每组设3个复孔，每孔加150μL显色液，轻轻震荡孔板混匀。检测520nmOD值，空白孔调零。根据以下公式计算碱性磷酸酶活性：

碱性磷酸酶(U/gprot)＝(测定孔吸光度-空白孔吸光度)÷(标准孔吸光度-空白孔吸光度)×酚标准品浓度÷待测样本蛋白浓度(gprot/mL)。

表4、不同时间点各组细胞碱性磷酸酶活性

实验结果如表4和图5所示。实验结果表明，细胞培养7d、14d、21d、28d后，在同一时间内，各诱导组与未诱导组(对照组1)碱性磷酸酶的活性均有显著性差异(P﹤0.01，*)，实验组1与对照组2-6均有显著性差异(P﹤0.01，**)。碱性磷酸酶活性随细胞培养时间增加而升高，但未诱导组(对照组1)上升不明显，实验组1显著升高。

效果实施例3、成骨基因OCN、Col-I、Runx2的检测

实验组和对照组PDLSCs分别于诱导分化培养7d、14d、21d后，RT-PCR法检测成骨细胞标志性基因OCN、Col-I、Runx2的表达。按TRIzol试剂盒说明书进行细胞总RNA提取，M-MLV反转录试剂盒获得cDNA。按SYBRGreen定量PCR试剂盒说明书对成骨细胞标志性基因OCN、Col-I、Runx2表达水平进行检测。β-actin作为内参基因。2-^△△Ct法定量分析。使用的引物如表5所示。

表5、引物序列表

实验结果如图6所示。由图6可知，细胞培养7d、14d、21d后，在同一时间点，各诱导组与未诱导组(对照组1)比较，成骨细胞标志性基因OCN、Col-I、Runx2表达水平均有显著性差异(P﹤0.01，*)，实验组1与其他各诱导组均有显著性差异(P﹤0.01，**)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种牙周膜干细胞成骨分化诱导液，其特征在于，包含基础培养基、维生素C、地塞米松、β-磷酸甘油钠、FBS、IGF-1和BMP-2。

2.根据权利要求1所述的牙周膜干细胞成骨分化诱导液，其特征在于，所述IGF-1的含量为15-40μg/L，所述BMP-2的含量为30-70μg/L。

3.根据权利要求2所述的牙周膜干细胞成骨分化诱导液，其特征在于，所述IGF-1的含量为20-30μg/L，所述BMP-2的含量为40-60μg/L。

4.根据权利要求3所述的牙周膜干细胞成骨分化诱导液，其特征在于，所述IGF-1的含量为25μg/L，所述BMP-2的含量为50μg/L。

5.根据权利要求1所述的牙周膜干细胞成骨分化诱导液，其特征在于，由下述含量的下述组分组成：50μg/L维生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/Lβ-磷酸甘油钠，体积分数10％FBS，25μg/LIGF-1，50μg/LBMP-2，余量为基础培养基，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。

6.一种牙周膜干细胞成骨分化诱导方法，其特征在于，使用权利要求1-5任一项所述的成骨分化诱导液进行诱导。

7.根据权利要求6所述的牙周膜干细胞成骨分化诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：消化后进行细胞培养，自其中分选出STRO-1⁺PDLSCs进行培养，使用上述成骨分化诱导液对第2-5代PDLSCs进行诱导。

8.根据权利要求7所述的牙周膜干细胞成骨分化诱导方法，其特征在于，使用磁珠分选法分选出STRO-1⁺PDLSCs。

9.根据权利要求8所述的牙周膜干细胞成骨分化诱导方法，其特征在于，磁珠分选法为：将收集消化后培养的细胞与STRO-1单抗4℃孵育1h，与磁珠30min4℃孵育，在磁力设备作用下筛选出STRO-1⁺PDLSCs。

10.根据权利要求9所述的牙周膜干细胞成骨分化诱导方法，其特征在于，所述牙周膜干细胞成骨分化诱导方法，包括以下步骤：

1)PDLSCs原代分离培养及传代：

刮取牙齿根中下1/3段的牙周膜组织，剪成约为1mm³大小；加入适量胶原酶-Dispase酶1:1混合消化液，37℃消化30-35min后，1000r/min离心5min，弃上清，加入适量PBS重悬，1000r/min离心5min，弃上清，加入含体积分数10％FBS的DMEM/F12培养液重悬细胞，调整细胞密度至1×10⁴cell/mL，2mL每孔接种于六孔板，于5％CO₂、37℃条件下培养；

待细胞长至汇合度80-90％，收集细胞，用磁珠分选法分选出STRO-1⁺PDLSCs，用含体积分数10％FBS的DMEM/F12培养液重悬细胞，调整细胞密度至1×10⁴cell/mL，2mL每孔接种于六孔板中，于5％CO₂、37℃条件下培养；

待细胞长至汇合度80-90％，弃培养液，加入适量0.25％胰蛋白酶，消化1-3min，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入适量含体积分数10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清；用含体积分数10％FBS的DMEM/F12培养液重悬细胞，调整细胞密度至5×10⁴cell/mL，接种于培养皿中于5％CO₂、37℃条件下进行传代培养，每隔2-3天换液一次；

2)PDLSCs成骨分化：取第3代PDLSCs，按1×10⁴cell/mL密度接种于12孔培养板内，培养至汇合度达到70-80％以上时，更换为成骨分化诱导液，于5％CO₂、37℃条件下进行诱导培养7-28d。