CN113980892A - 一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基、含有其的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基、含有其的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基、含有其的试剂盒及其应用。该培养基包括基础培养基、血小板裂解液、抗坏血酸、地塞米松、β‑磷酸甘油钠。该培养基含有的几种组分之间具有良好的协同作用，能够实现牙髓干细胞向成骨细胞的诱导分化，其成骨定向分化特异性高，专一性强，并且能够大大缩短牙髓干细胞成骨诱导分化的时间，提高诱导分化效率。同时将该培养基应用到诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的试剂盒中，利用该试剂盒对牙髓干细胞进行诱导，能够实现稳定、高效的牙髓干细胞向成骨细胞的诱导分化。

Description

一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基、含有其的试 剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基、含有其的试剂盒及其应用。
背景技术
骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有良好的分化为成骨细胞的潜能，但获取BMSCs的过程困难且会对人体造成创伤，因此人们致力于寻找比它更普适的骨组织工程的细胞种子。有研究发现牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)也可以在体外诱导向骨组织分化，它和BMSCs具有相似的免疫表型，免疫原性低，异体使用也不会产生排斥反应。同时，DPSCs的增殖能力和克隆能力比BMSCs更强，其经过体外诱导后能够形成大且多的矿化结节。此外，DPSCs的来源丰富、取材过程中避免了对人体的二次创伤和伦理法律问题。由于DPSCs具有上述提及的优势，DPSCs成为一种极具研究潜力的种子细胞。
目前，诱导牙髓干细胞向成骨细胞分化的方法非常多，常使用成骨诱导分化液培养法、各种细胞因子等可溶性蛋白质，如转化生长因子-β、成骨细胞共培养等方法诱导DPSCs分化为成骨细胞。其中使用最广泛的是成骨诱导分化培养液培养法，该方法涉及的成骨诱导分化培养液中通常含有胎牛血清(Fetalbovine serum，FBS)。但是，胎牛血清的价格十分昂贵，且国外进口的胎牛血清很难购买，含胎牛血清的培养基诱导牙髓干细胞分化时，诱导时间比无血清培养基更长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基、含有其的试剂盒及其应用，以降低成骨细胞诱导培养基的成本，并缩短诱导分化时间和提高诱导分化效率。
根据本发明的第一个方面，提供一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基，该培养基包括基础培养基、血小板裂解液、抗坏血酸、地塞米松、β-磷酸甘油钠。
本发明提供的诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基为无血清培养基，该培养基是通过在基础培养基中添加血小板裂解液、抗坏血酸、地塞米松、β-磷酸甘油钠制备得到的。血小板裂解液中含有多种不同种类的细胞因子，能够对细胞起到支持生长的作用，可以完全替代胎牛血清，并且其在诱导牙髓干细胞分化为成骨活细胞的效果上优于胎牛血清。抗坏血酸则可以促进牙髓干细胞产生I型胶原，形成成骨钙化所需细胞外基质结构。地塞米松可以通过活化WNT/β-catenin信号通路上调Runx2分子磷酸化从而诱导牙髓干细胞向成骨细胞分化。β-磷酸甘油钠可以作为细胞磷酸盐来源，辅助促进成骨分化相关重要基因磷酸化，激活下游成骨分化相关途径。本发明提供的培养基中含有基础培养基、血小板裂解液、抗坏血酸、地塞米松和β-磷酸甘油钠，这几种组分之间能够产生良好的协同作用，能够上调成骨分化相关基因的磷酸化水平，从而激活成骨诱导分化的相关信号通路，使得牙髓干细胞能够成功向成骨细胞分化，并为成骨分化过程中的细胞生长提供支持作用。此外，与常用的血清培养基(如胎牛血清)相比，本发明提供的牙髓干细胞成骨诱导分化培养基为无血清培养基，其诱导时间短，成本低。
优选地，上述诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基包括基础培养基、5-20％(体积分数)血小板裂解液、0.1-0.5mM抗坏血酸、100-300mM地塞米松、10-50mMβ-磷酸甘油钠。
优选地，上述诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基还包括0.5-2％(体积分数)青霉素-链霉素混合溶液。
本方案通过对培养基中各组分的含量进行限定，使得培养基之间各组分之间具有更好的协同效果，能够更好地促进牙髓干细胞向成骨细胞分化，有利于提高牙髓干细胞向成骨细胞分化的效率。
同时，使用青霉素-链霉素混合溶液能够有效降低牙髓干细胞在分化为成骨细胞的过程中被污染的风险。
优选地，基础培养基为DMEM/F12培养基。
本方案涉及的DMEM/F12培养基为高糖型DNEM培养基，其中的D-葡萄糖浓度为3151mg/L，有利于细胞的快速生长，降低细胞生长过程中贴壁困难的问题。
优选地，上述诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基由以下方法制备得到：向基础培养基中添加血小板裂解液、抗坏血酸、地塞米松、β-磷酸甘油钠、青霉素-链霉素混合溶液，混合均匀，并用0.22μm滤膜过滤除菌，得到诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基。
本方案涉及的牙髓干细胞成骨诱导分化培养基的制备方法简单，不涉及复杂的操作过程，有利于降低生产成本。
根据本发明的第二个方面，提供上述诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基在促进牙髓干细胞向成骨细胞分化中的应用。
根据本发明的第三个方面，提供一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的试剂盒，该试剂盒包括第一培养基，第一培养基为上述诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基。
优选地，上述试剂盒还包括第二培养基，按照体积分数计算，第二培养基包括5-20％血小板裂解液(HPL)、0.05-0.3％表皮生长因子(EGF)溶液、0.05-0.3％碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、0.1-1％含有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的添加剂(GlutaMAXTM)、基础培养基；
EGF溶液浓度为100ng/mL；
bFGF溶液浓度为100ng/mL。
本方案提供的试剂盒中包括第二培养基，该培养基中含有HPL、EGF、bFGF、GlutaMAXTM和基础培养基。HPL含有多种生长因子，有利于促进牙髓干细胞的增殖；EGF和bFGF则能够促进牙髓干细胞的增殖；GlutaMAXTM被细胞释放的氨肽酶水解后，能够缓慢释放L-谷氨酰胺和L-丙氨酸至培养基中，随后被细胞吸收，使得培养基中的L-谷氨酰胺始终保持较低的浓度且不会生产过多的氨，避免氨的产生对细胞产生毒害作用。第二培养基中的各组分之间相互配合使用，有利于牙髓干细胞的快速生长和提高牙髓干细胞的活性，为成骨诱导分化提供了更多的、活性更高的牙髓干细胞，以提高牙髓干细向成骨细胞分化的效率。
优选地，上述试剂盒中的第二培养基还包括0.5-2％(体积分数)PSN抗生素组合物。
本方案涉及的PSN抗生素组合物是一种由青霉素、链霉素和新霉素组成的抗生素组合物，这三种抗生素联合使用能够降低细胞被污染的风险。
优选地，上述试剂盒中第二培养基中的基础培养基为DMEM/F12培养基。
根据本发明的第四个方面，提供上述诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的试剂盒在促进牙髓干细胞向成骨细胞分化中的应用。
根据本发明的第五个方面，提供一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的方法，包括以下步骤：利用上述牙髓干细胞成骨诱导分化培养基或上述诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的试剂盒对牙髓干细胞进行诱导，获得成骨细胞。
本方案利用上述牙髓干细胞成骨诱导分化培养基或上述诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的试剂盒对牙髓干细胞进行诱导分化，使牙髓干细胞能够有效地、定向地分化为成骨细胞，分化效率高。
优选地，诱导的时间为18-25天。利用本发明提供的牙髓干细胞成骨诱导分化培养基对牙髓干细胞进行诱导，获得成骨细胞，其诱导时间大大缩短。
优选地，牙髓干细胞为第3-5代的牙髓干细胞。
优选地，诱导的温度为36-38℃。本方案采用的诱导温度为36-37℃，诱导温度适中，有利于细胞的生长和成骨分化。
本发明的有益效果为：
1.本发明提供的诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基为无血清培养基，能够降低培养基的成本，其中含有基础培养基、血小板裂解液、抗坏血酸、地塞米松、β-磷酸甘油钠，这几种成分之间具有良好的协同作用，能够实现牙髓干细胞向成骨细胞的诱导分化，其成骨定向分化特异性高，专一性强。与现有技术诱导间充质干细胞成骨分化所需4周相比，本发明提供的牙髓干细胞成骨诱导分化培养基，对牙髓干细胞进行诱导分化3周，即可出现大量成骨钙结节，大大缩短牙髓干细胞成骨诱导分化的时间，并且能够提高诱导效率。此外，本发明提供的牙髓干细胞成骨诱导分化培养基的制备方法简单，有利于降低生产成本，并且使用方便，可实现稳定、高效的牙髓干细胞成骨诱导分化。
2.本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒含有上述诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基，可以用于诱导牙髓干细胞向成骨细胞定向分化，提高诱导分化效率。
3.本发明最后提供了一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的方法，该方法利用上述诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基或试剂盒对牙髓干细胞进行诱导，得到成骨细胞，该诱导分化方法简单，使得牙髓干细胞能够有效地分化为成骨细胞。
附图说明
图1为牙髓干细胞在本发明实施例1的成骨诱导分化培养基中诱导25天时成骨诱导分化碱性磷酸酶染色结果图。
图2为牙髓干细胞在本发明实施例2的成骨诱导分化培养基中诱导18天时成骨诱导分化碱性磷酸酶染色结果图。
图3为牙髓干细胞在本发明实施例3的成骨诱导分化培养基中诱导21天时成骨诱导分化碱性磷酸酶染色结果图。
图4为牙髓干细胞在本发明实施例1的成骨诱导分化培养基中诱导25天时成骨诱导分化茜素红染色结果图。
图5为牙髓干细胞在本发明实施例2的成骨诱导分化培养基中诱导18天时成骨诱导分化茜素红染色结果图。
图6为牙髓干细胞在本发明实施例3的成骨诱导分化培养基中诱导21天时成骨诱导分化茜素红染色结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明提供的技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1-3和对比例1-5
一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基，成分如表1所示，制备方法具体包括以下步骤：向基础培养基(DMEM/F12培养基，葡萄糖浓度3151mg/L)中添加5-20％(体积分数)血小板裂解液、0.1-0.5mM抗坏血酸、100-300mM地塞米松、10-50mMβ-磷酸甘油钠、0.5-2％(体积分数)青霉素-链霉素混合溶液，混合均匀，并用0.22μm滤膜过滤除菌，得到诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基。
表1牙髓干细胞成骨诱导分化培养基组分
Figure BDA0003380994050000051
Figure BDA0003380994050000061
实施例4
一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的方法，具体包括以下步骤：
(1)在六孔板(每孔面积为9.6cm2)中按照1mL/孔铺上Matrigel胶溶液(Matrigel胶溶液由含有1％
Figure BDA0003380994050000062
Matrix的DMEM培养基组成)，放入37℃培养箱中孵育1h，成为牙髓干细胞成骨诱导分化专用培养器皿；
(2)按照体积分数计算，向高糖型DMEM培养基(葡萄糖浓度3151mg/L)中添加1％PSN抗生素组合物(青霉素-链霉素-新霉素)、10％血小板裂解液、0.2％EGF溶液(100ng/mL)、0.2％bFGF溶液(100ng/mL)和0.5％GlutaMAXTM，混合均匀，并用0.22μm滤膜过滤除菌，得到牙髓干细胞培养液；
(3)从-196℃液氮中取出装有处于对数生长期的牙髓干细胞的冻存管，立即放入37℃恒温水浴锅内，不断来回摇晃，直至所有冰块消融，从水浴锅中取出冻存管，用75％的酒精喷洒冻存管表面，放入生物安全柜内充分擦拭，将牙髓干细胞转移至装有10mL牙髓干细胞培养液的15mL离心管中，于1000rpm下离心5min，舍弃上清，用25mL牙髓干细胞培养液重悬细胞，转移到步骤(1)铺好胶的牙髓干细胞成骨诱导分化专用培养器皿中进行培养，其中，每孔添加2mL重悬液，每孔细胞数为6-8×104个；
(4)待细胞融合度约达90-98％时(需要大约1-5天)，将牙髓干细胞培养液更换为实施例1所得到的诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基，每3-4天更换培养基至骨基质形成，观察成骨诱导分化情况并记录骨基质形成时间。
实施例5
一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的方法，具体包括以下步骤：
(1)在六孔板(每孔面积为9.6cm2)中按照1mL/孔铺上Matrigel胶溶液(Matrigel胶溶液由含有1％MatrigelMatrix的DMEM培养基组成)，放入37℃培养箱中孵育1h，成为牙髓干细胞成骨诱导分化专用培养器皿；
(2)按照体积分数计算，向高糖型DMEM培养基(葡萄糖浓度3151mg/L)中添加1％PSN抗生素组合物(青霉素-链霉素-新霉素)、10％血小板裂解液、0.2％EGF溶液(100ng/mL)、0.2％bFGF溶液(100ng/mL)和0.5％GlutaMAXTM，混合均匀，并用0.22μm滤膜过滤除菌，得到牙髓干细胞培养液；
(3)从-196℃液氮中取出装有处于对数生长期的牙髓干细胞的冻存管，立即放入37℃恒温水浴锅内，不断来回摇晃，直至所有冰块消融，从水浴锅中取出冻存管，用75％的酒精喷洒冻存管表面，放入生物安全柜内充分擦拭，将牙髓干细胞转移至装有10mL牙髓干细胞培养液的15mL离心管中，于1000rpm下离心5min，舍弃上清，用25mL牙髓干细胞培养液重悬细胞，转移到步骤(1)铺好胶的牙髓干细胞成骨诱导分化专用培养器皿中进行培养，其中，每孔添加2mL重悬液，每孔细胞数为6-8×104个；
(4)待细胞融合度约达90-98％时(需要大约1-5天)，将牙髓干细胞培养液更换为实施例2所得到的诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基，每3-4天更换培养基至骨基质形成，观察成骨诱导分化情况并记录骨基质形成时间；
实施例6
一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的方法，具体包括以下步骤：
(1)在六孔板(每孔面积为9.6cm2)中按照1mL/孔铺上Matrigel胶溶液(Matrigel胶溶液由含有1％MatrigelMatrix的DMEM培养基组成)，放入37℃培养箱中孵育1h，成为牙髓干细胞成骨诱导分化专用培养器皿；
(2)按照体积分数计算，向高糖型DMEM培养基(葡萄糖浓度3151mg/L)中添加1％PSN抗生素组合物(青霉素-链霉素-新霉素)、10％血小板裂解液、0.2％EGF溶液(100ng/mL)、0.2％bFGF溶液(100ng/mL)和0.5％GlutaMAXTM，混合均匀，并用0.22μm滤膜过滤除菌，得到牙髓干细胞培养液；
(3)从-196℃液氮中取出装有处于对数生长期的牙髓干细胞的冻存管，立即放入37℃恒温水浴锅内，不断来回摇晃，直至所有冰块消融，从水浴锅中取出冻存管，用75％的酒精喷洒冻存管表面，放入生物安全柜内充分擦拭，将牙髓干细胞转移至装有10mL牙髓干细胞培养液的15mL离心管中，于1000rpm下离心5min，舍弃上清，用25mL牙髓干细胞培养液重悬细胞，转移到步骤(1)铺好胶的牙髓干细胞成骨诱导分化专用培养器皿中进行培养，其中，每孔添加2mL重悬液，每孔细胞数为6-8×104个；
(4)待细胞融合度约达90-98％时(需要大约1-5天)，将牙髓干细胞培养液更换为实施例3所得到的诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基，每3-4天更换培养基至骨基质形成，观察成骨诱导分化情况并记录骨基质形成时间。
对比例6
一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的方法，具体包括以下步骤：
(1)在六孔板(每孔面积为9.6cm2)中按照1mL/孔铺上Matrigel胶溶液(Matrigel胶溶液由含有1％MatrigelMatrix的DMEM培养基组成)，放入37℃培养箱中孵育1h，成为牙髓干细胞成骨诱导分化专用培养器皿；
(2)按照体积分数计算，向高糖型DMEM培养基(葡萄糖浓度3151mg/L)中添加1％PSN抗生素组合物(青霉素-链霉素-新霉素)、10％血小板裂解液、0.2％EGF溶液(100ng/mL)、0.2％bFGF溶液(100ng/mL)和0.5％GlutaMAXTM，混合均匀，并用0.22μm滤膜过滤除菌，得到牙髓干细胞培养液；
(3)从-196℃液氮中取出装有处于对数生长期的牙髓干细胞的冻存管，立即放入37℃恒温水浴锅内，不断来回摇晃，直至所有冰块消融，从水浴锅中取出冻存管，用75％的酒精喷洒冻存管表面，放入生物安全柜内充分擦拭，将牙髓干细胞转移至装有10mL牙髓干细胞培养液的15mL离心管中，于1000rpm下离心5min，舍弃上清，用25mL牙髓干细胞培养液重悬细胞，转移到步骤(1)铺好胶的牙髓干细胞成骨诱导分化专用培养器皿中进行培养，其中，每孔添加2mL重悬液，每孔细胞数为6-8×104个；
(4)待细胞融合度约达90-98％时(需要大约1-5天)，将牙髓干细胞培养液更换为对比例1所得到的诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基，每3-4天更换培养基至骨基质形成。
对比例7
对比例7提供一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的方法，与对比例6的区别在于，步骤(4)中采用对比例2所得到的诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基代替对比例1所得到的诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基。
对比例8
对比例8提供一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的方法，与对比例6的区别在于，步骤(4)中采用对比例3所得到的诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基代替对比例1所得到的诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基。
对比例9
对比例9提供一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的方法，与对比例6的区别在于，步骤(4)中采用对比例4所得到的诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基代替对比例1所得到的诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基。
对比例10
对比例10提供一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的方法，与对比例6的区别在于，步骤(4)中采用对比例5所得到的诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基代替对比例1所得到的诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基。
测试例
1.实验构建方式
(1)碱性磷酸酶染色
①利用碱性磷酸酶试剂盒(购自于上海翊圣生物的Alkaline Phosphatase StainKit碱性磷酸酶染色试剂盒)中的试剂，按照缓冲液：染色液BCIP：染色液NBT＝3mL:10μL:20μL的比例配制适量体积的AP染色工作液；
②消化六孔板上的牙髓干细胞，消化完毕后于1000rpm下离心5min，舍弃上清，收集细胞，用1mL生理盐水对牙髓干细胞进行洗涤3-5次，每次3-5min，在最后一次洗涤后去除生理盐水，加入1mL AP染色工作液，避光孵育24h，直至显色达到深蓝色至蓝紫色效果，去除AP染色工作液，用蒸馏水洗涤2次以终止显色反应，同时加入1mL生理盐水，用显微镜对细胞的染色情况进行观察。
(2)茜素红染色
茜素红S是一种蒽醌衍生物：9,10-二氢-3,4-二羟基-9,10-二氧代-2-蒽磺酸单钠盐，又称媒介红或茜素磺酸钠，分子式为C14H7NaO7S，分子量为342.25。茜素红和钙离子以螯合方式形成复合物，用以识别组织细胞的钙盐成分。钙盐变化是成骨分化的标志之一，成骨细胞中含有的钙盐与茜素红S结合后能够形成橙红色复合物，钙沉积阳性细胞呈现橙红色。
具体操作步骤如下：去除诱导培养基，取出细胞爬片至载玻片上，用1×PBS缓冲液(pH7.2，不含钙镁)洗涤细胞爬片2次，加入4％多聚甲醛固定30min，吸去多聚甲醛固定液，用1×PBS缓冲液洗涤2次，然后滴加适量茜素红S对细胞进行染色3～5min，去除染色液，用1×PBS缓冲液洗涤2次，干燥、封片，于镜下观察。
对碱性磷酸酶染色和茜素红染色的细胞分别进行计数，计算牙髓干细胞成骨诱导分化率，具体操作为：用倒置显微镜100倍放大视野下，每孔随机记数3个视野，计算分化细胞占细胞总数的比例，每次平行计数3个孔，计算平均值。诱导分化率按照下式计算：诱导分化率＝染色阳性细胞数/细胞总数×100％。最后将两种染色结果进行汇总，诱导分化率取平均值。
2.实验结果
表2各组诱导分化率
组别 诱导分化率均值(％)
实施例4 92.28
实施例5 93.67
实施例6 91.89
对比例6 67.63
对比例7 49.02
对比例8 46.70
对比例9 46.80
对比例10 46.01
碱性磷酸酶染色结果如图1、图2、图3所示，结果显示，实施例4-6中利用本发明提供的牙髓干细胞成骨诱导分化培养基对牙髓干细胞进行诱导之后，成骨细胞被碱性磷酸酶试剂染成深蓝色或蓝紫色，证明牙髓干细胞定向分化为成骨细胞(实施例4-6的细胞染色图分别对应图1-3)。其次，本发明提供牙髓干细胞成骨诱导分化培养基为无血清培养基，利用其对牙髓干细胞进行诱导分化，虽然培养基中添加的是不同浓度的成分，对其成骨诱导形成的矿化结节的数量和大小存在一定的影响，但均比对比例6中利用血清培养基对其成骨诱导形成的矿化结节的数量多且形成的矿化结节都比较大，并且，通过染色和观察发现，对比例7-10涉及的诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的方法中，采用的培养基由于缺少血小板裂解液、抗坏血酸、地塞米松、β-磷酸甘油钠中的其中一种，只能观察到极少量的成骨细胞被碱性磷酸酶染色，这说明血小板裂解液、抗坏血酸、地塞米松和β-磷酸甘油钠这四种组分之间具有协同作用，本发明提供的培养基正是由于这几种组分之间的相互作用才使得牙髓干细胞能够定向分化为成骨细胞。此外，实施例4-6中骨基质的形成时间分别为25、18、21天，而对比例2中骨基质的形成时间为28天。
茜素红染色结果如图4、图5、图6所示，结果显示，实施例4-6中利用本发明提供的牙髓干细胞成骨诱导分化培养基对牙髓干细胞进行诱导之后，成骨细胞被茜素红S染成橙红色，证明牙髓干细胞定向分化为成骨细胞(实施例4-6的细胞染色图分别对应图4-6)。与对比例7-10相比，实施例4-6中大量的成骨细胞被茜素红S染成橙红色，这说明实施例4-6所得到的成骨细胞数量更多，茜素红S与成骨细胞中大量的钙盐形成橙红色的螯合物，说明实施例4-6中大量的牙髓干细胞诱导分化为成骨细胞。虽然对比例6中利用血清培养基对牙髓干细胞进行成骨诱导分化得到的成骨细胞数量也较多，但是其诱导时间较长，并且染色细胞数量少于实施例4-6；而对比例7-10中只能观察到少量的细胞被染成橙红色，并且说明利用对比例7-10的方法对牙髓干细胞进行诱导，只有少数的牙髓干细胞分化为成骨细胞。
上述结果说明，本发明提供的无血清培养基对诱导牙髓干细胞向成骨细胞的分化效果比对比例2中含有血清的培养基成骨诱导分化效果更好，能够缩短诱导分化时间，提高牙髓干细胞的成骨诱导分化效率，在更短的时间内形成更多的矿化结节。
此外，还对各组诱导分化率结果进行统计，结果如表2所示。由表2可知，实施例4-6的成骨诱导分化效率显著高于对比例6-10的成骨诱导分化效率，说明本发明提供的培养基中含有的血小板裂解液、抗坏血酸、地塞米松、β-磷酸甘油钠这几种组分之间具有良好的协同作用，正是由于这几种组分之间的协同作用才使得牙髓干细胞能够定向分化为成骨细胞，并提高成骨诱导分化效率。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但这些修改或替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基，其特征在于：包括基础培养基、血小板裂解液、抗坏血酸、地塞米松、β-磷酸甘油钠。
2.如权利要求1所述诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基，其特征在于：包括基础培养基、5-20％(体积分数)血小板裂解液、0.1-0.5mM抗坏血酸、100-300mM地塞米松、10-50mMβ-磷酸甘油钠。
3.如权利要求2所述诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基，其特征在于：还包括0.5-2％(体积分数)青霉素-链霉素混合溶液。
4.如权利要求1所述诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基，其特征在于：所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
5.如权利要求1-4任意一项所述诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基在促进牙髓干细胞向成骨细胞分化中的应用。
6.一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的试剂盒，其特征在于：包括第一培养基，所述第一培养基为如权利要求1-4任意一项所述的培养基。
7.如权利要求6所述诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的试剂盒，其特征在于：还包括第二培养基，按照体积分数计算，所述第二培养基包括5-20％血小板裂解液、0.05-0.3％EGF溶液、0.05-0.3％bFGF、0.1-1％GlutaMAXTM、基础培养基；
所述EGF溶液浓度为100ng/mL；
所述bFGF溶液浓度为100ng/mL。
8.如权利要求7所述诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的试剂盒，其特征在于：所述第二培养基还包括0.5-2％(体积分数)PSN抗生素组合物；
所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
9.如权利要求6-8任意一项所述诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的试剂盒在促进牙髓干细胞向成骨细胞分化中的应用。
10.一种诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：利用如权利要求1-4任意一项所述诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的培养基或如权利要求6-8任意一项所述诱导牙髓干细胞分化为成骨细胞的试剂盒对牙髓干细胞进行诱导，获得所述成骨细胞。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100005060A (ko) * 2007-10-01 2010-01-13 재단법인서울대학교산학협력재단 광화능을 갖는 인간 치아 줄기세포 및 그의 배양방법
CN103667182A (zh) * 2012-12-17 2014-03-26 湖州市中心医院 一种骨髓间充质干细胞在体外向成骨细胞分化的诱导方法及诱导培养基
CN105255824A (zh) * 2015-10-29 2016-01-20 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种牙周膜干细胞成骨分化诱导液及方法
CN105802905A (zh) * 2016-04-21 2016-07-27 天津普瑞赛尔生物科技有限公司 用于牙髓干细胞采集、分离、扩增的试剂盒及其使用方法
CN105802906A (zh) * 2016-05-27 2016-07-27 中国医学科学院医学生物学研究所 树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基及其制备方法与应用
CN107418928A (zh) * 2017-09-05 2017-12-01 安徽瑞杰赛尔生物科技有限公司 一种人间充质干细胞成骨诱导分化培养基及制备方法
CN110819586A (zh) * 2019-11-26 2020-02-21 广州赛莱拉生物基因工程有限公司 一种用于牙髓干细胞向成骨细胞诱导分化的培养基及其制备方法以及应用
CN111172107A (zh) * 2020-03-02 2020-05-19 上海市口腔病防治院 一种牙髓干细胞条件培养基及其制备方法和应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100005060A (ko) * 2007-10-01 2010-01-13 재단법인서울대학교산학협력재단 광화능을 갖는 인간 치아 줄기세포 및 그의 배양방법
CN103667182A (zh) * 2012-12-17 2014-03-26 湖州市中心医院 一种骨髓间充质干细胞在体外向成骨细胞分化的诱导方法及诱导培养基
CN105255824A (zh) * 2015-10-29 2016-01-20 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种牙周膜干细胞成骨分化诱导液及方法
CN105802905A (zh) * 2016-04-21 2016-07-27 天津普瑞赛尔生物科技有限公司 用于牙髓干细胞采集、分离、扩增的试剂盒及其使用方法
CN105802906A (zh) * 2016-05-27 2016-07-27 中国医学科学院医学生物学研究所 树鼩骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基及其制备方法与应用
CN107418928A (zh) * 2017-09-05 2017-12-01 安徽瑞杰赛尔生物科技有限公司 一种人间充质干细胞成骨诱导分化培养基及制备方法
CN110819586A (zh) * 2019-11-26 2020-02-21 广州赛莱拉生物基因工程有限公司 一种用于牙髓干细胞向成骨细胞诱导分化的培养基及其制备方法以及应用
CN111172107A (zh) * 2020-03-02 2020-05-19 上海市口腔病防治院 一种牙髓干细胞条件培养基及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DUAA ABUARQOUB 等: "Comparison of osteo/odontogenic differentiation of human adult dental pulp stem cells and stem cells from apical papilla in the presence of platelet lysate", 《ARCHIVES OF ORAL BIOLOGY》 *
DUAA ABUARQOUB 等: "Comparison of osteo/odontogenic differentiation of human adult dental pulp stem cells and stem cells from apical papilla in the presence of platelet lysate", 《ARCHIVES OF ORAL BIOLOGY》, vol. 60, no. 10, 31 October 2015 (2015-10-31), pages 1545 - 1533 *
兰岚 等: "根尖牙乳头干细胞成牙本质分化的研究进展", 《贵州医药》, vol. 41, no. 03, 28 March 2017 (2017-03-28), pages 320 - 323 *
赵伟 等: "山羊乳牙牙髓细胞分离培养与矿化诱导的体外研究", 《上海口腔医学》 *
赵伟 等: "山羊乳牙牙髓细胞分离培养与矿化诱导的体外研究", 《上海口腔医学》, vol. 20, no. 03, 30 June 2011 (2011-06-30), pages 234 - 240 *

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