CN103382458A - 诱导间充质干细胞向肾小球系膜细胞分化的培养液及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导间充质干细胞向肾小球系膜细胞分化的培养液及诱导方法，包括人血小板衍生生长因子-BB、全反式维甲酸、IV型胶原和基础培养基。基础培养基为含2%的马血清、5ng/ml的bFGF的低糖DMEM培养液。诱导方法包括配制诱导培养液；制备间充质干细胞；以5μg/cm2的浓度用IV型胶原包被培养板；取间充质干细胞，以5×103/cm2的细胞密度接种于已包被好的培养板中，加入诱导培养液；每3天换液一次，诱导培养7天。本发明利用人血小板衍生生长因子-BB、全反式维甲酸及Ⅳ型胶原联合诱导间充质干细胞向肾小球系膜细胞分化，诱导周期短，诱导效率高，分化形成的肾小球系膜细胞功能活性强，有利于移植治疗肾功能衰竭等肾脏疾病。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用新型细胞生长因子人血小板衍生生长因子-BB与全反式维甲酸联合高效诱导间充质干细胞分化为肾小球系膜细胞的培养液及诱导方法。
背景技术
各种肾脏疾病渐进发展成为终末期肾功能衰竭时通常只能借助于肾脏替代性手段进行治疗，主要是透析和肾脏移植两种治疗方法。但这两种治疗手段均存在难于克服的障碍和不足。其中透析仅限于滤过功能的替代，不具有正常肾脏的代谢、分泌及维持内环境稳态等一系列重要功能，肾脏移植虽然相对于透析具有更好的治疗效果，却也同样面临免疫排斥、供体短缺等问题，需要寻找新的功能性肾小球系膜细胞移植物。间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，它能够定向诱导为成骨细胞、神经细胞、肾脏细胞等多种功能性细胞。间充质细胞存在于人体多种组织中，包括骨髓、脐带、胎盘、脂肪等组织，具有来源广泛、易于采集、无伦理问题等优势，可规模化诱导分化为胰岛样细胞，为临床治疗肾功能衰竭提供新的技术方案。间充质干细胞能够通过分化成多种类型的肾实质细胞(包括肾小球系膜细胞、肾小球足细胞、肾小管上皮细胞和血管内皮细胞)，参与肾脏损伤后的细胞再生与结构重建以及功能的恢复。
人血小板衍生生长因子-BB通常被认为是一种多功能性的生长因子，在胚胎发育和成体稳态维持等方面均具有重要的作用。这种生长因子对细胞的效应，依细胞种类、作用浓度、微环境和细胞所处生理阶段的不同而不同，特别是对间充质干细胞的增殖、迁移和分化等方面均发挥重要的作用。人血小板衍生生长因子-BB也与肾小球系膜细胞的发育和增殖关系紧密，在生理或病理状态下体内包括系膜细胞在内的几种肾脏细胞均会产生血小板衍生生长因子-BB，以调节这些间质细胞的分裂和趋化效应，构建完整成熟的肾小球结构。
本发明建立了一种新的诱导间充质干细胞向肾小球系膜细胞分化的方法，联合使用血小板衍生生长因子-BB和全反式维甲酸，同时辅以IV型胶原作为胞外基质，与目前的常用诱导方法相比，提高了诱导效率和诱导周期，所获得的诱导形成的肾小球系膜前体细胞具有较强的生物活性，有助于更好的应用于临床移植，克服了现有诱导剂及诱导方法中诱导周期长、效率低、功能差等缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种诱导间充质干细胞向肾小球系膜细胞分化的培养液及诱导方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种诱导间充质干细胞向功能性肾小球系膜前体细胞分化的诱导培养液，包括人血小板衍生生长因子-BB、全反式维甲酸、IV型胶原和基础培养基。
所述诱导培养基中，人血小板衍生生长因子-BB的浓度为200 ng/ml，全反式维甲酸的浓度为1 μmol/L。
所述IV型胶原是以5μg/cm2的浓度包被于细胞培养板表面。
所述基础培养基为含有2%的马血清、5ng/ml的bFGF的低糖DMEM培养液。
一种诱导间充质干细胞向功能性肾小球系膜前体细胞分化的方法，包括以下步骤。
(1) 配制诱导培养液：以低糖DMEM 为基础培养基，添加2%的马血清、5ng/ml的bFGF和诱导剂人血小板衍生生长因子-BB、全反式维甲酸，混匀，4 度保存。
(2) 制备人间充质干细胞。
(3) IV型胶原包被培养板：按照每平方厘米培养板表面积5μg的IV型胶原的浓度包被24孔培养板。
(4) 取间充质干细胞，以5×103/cm2的细胞密度接种于IV型胶原包被的24孔培养板中，添加0.5ml诱导培养液进行诱导培养。
(5) 每3天换液，诱导培养9天去除培养液，收集细胞并置于-20度保存。
本发明的有益效果是：利用人血小板衍生生长因子-BB和全反式维甲酸联合诱导间充质干细胞向分化，并通过辅以IV型胶原模拟胞外基质环境，从而显著提高诱导分化效率，减少细胞因子使用种类，提高诱导细胞功能，降低临床应用风险。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1A 是诱导培养的人骨髓间充质干细胞的细胞形态（40×），其中（1）为对照组，（2）为诱导组。
图1B 是诱导培养的人骨髓间充质干细胞的生长曲线。
图2 是通过免疫荧光技术分析诱导分化后细胞特异性蛋白desmin、α-smooth muscle actin和vimentin的表达。
图3是分化后的细胞对血管紧缩素Ⅱ处理的收缩反应。
具体实施方式
一、人骨髓间充质干细胞制备。
1）在获得健康供体(5－36岁之间)知情同意的前提下，从健康供体无菌抽取骨髓5ml置于含有肝素的收集管中。
2）将骨髓按1:1的体积比向一15ml离心管中加入Ficoll淋巴细胞分离液，随后通过注射器缓慢加入骨髓液，保持分离液和骨髓液分层。
3）2000转/分钟离心15分钟，骨髓细胞分层后取出离心管。
4）利用毛细管吸取中层乳白色骨髓单个核细胞液，用D- Hank’s溶液冲洗2遍。
5）加入低糖DMEM培养液（含10% FBS，5ng/ml bFGF，2mM L-谷氨酰胺，青霉素 100u/ml，链霉素100μg/ml）重悬细胞，吹打成单细胞悬液。
6）以1×106/cm2的细胞密度接种于6孔培养板内，置于含5% CO2的37℃细胞培养箱中进行原代培养。
7）5天后换液，之后每3天换一次液，逐步去除非贴壁细胞，最终纯化人骨髓间充质干细胞。待细胞生长至约90％融合度时，即进行传代扩增培养。
二、人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肾小球系膜前体细胞。
1）在接种细胞前，先以5μg/cm2的浓度用小鼠IV型胶原包被24孔培养板。
2）取第5-12代的间充质干细胞，以5×103/cm2的细胞密度接种于已包被好的24孔培养板中，过夜培养。
3）次日待细胞贴壁后，弃常规生长培养液，换为系膜样细胞分化诱导培养液（即含2% 马血清、 2mM L-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、200ng/ml 人血小板衍生生长因子-BB 和1μmol/L全反式维甲酸的低糖DMEM细胞培养液）。
4）置37℃、5% CO2培养箱中培养7天，每3天换液一次。诱导培养7天后进行相关分析检测。
诱导过程种每隔一天取样进行细胞计数以分析细胞增殖情况。以含2% 马血清的低糖DMEM完全培养液进行相同的方式诱导培养作为对照组。
三、免疫荧光技术分析系膜细胞特异性蛋白的表达。
人骨髓间充质干细胞经诱导培养液培养7天后，即在原24孔培养板中行免疫细胞化学荧光染色分析，以常规生长培养液中培养的未分化人骨髓间充质干细胞作为阴性对照。荧光免疫染色检测具体方法如下。
1）0.5ml PBS冲洗细胞后，加入200μl 的4％多聚甲醛于室温固定15分钟。
2）0.5ml PBS冲洗，加入200μl的含0.1% Triton X-100的PBS渗透10分钟。
3）0.5ml PBS冲洗，加入200μl的1% 山羊血清于室温封闭30分钟。
4）弃羊血清，加入鼠抗人单克隆抗体[结蛋白（desmin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin）和波形蛋白（vimentin）]抗体稀释液200μl 于室温孵育1小时以上。
5) 0.5ml PBS冲洗，加PE或FITC标记的二抗稀释液200μl于室温闭光孵育1小时以上。
6) 0.5ml PBS冲洗，加DAPI于37℃反应5分钟进行核染。
7) 0.5ml PBS冲洗，加0.5ml PBS悬浮细胞后置荧光显微镜下观察并拍照。
四、流式细胞术分析系膜细胞特异性蛋白的表达。
人骨髓间充质干细胞经分化培养液诱导培养7天后，即行流式细胞术分析，检测肾小球系膜细胞特异性蛋白的表达。
1）弃培养液，0.25％胰蛋白酶消化，200g离心5分钟收集细胞。
2）PBS冲洗，4％多聚甲醛4℃固定15分钟。
3）PBS冲洗，200g离心5分钟收集细胞。
4）含0.1% Triton X-100的PBS重悬细胞，200g离心5分钟收集细胞。
5）含0.1% Triton X-100的PBS重悬细胞，加鼠抗人单克隆抗体desmin、α-smooth muscle actin和vimentin于4℃孵育45分钟。
6）含0.1% Triton X-100的PBS冲洗细胞二遍，并重悬于含0.1%Triton X-100的PBS中；加PE或FITC标记的二抗于4℃闭光孵育1小时。
7）含0.1% Triton X-100的PBS冲洗一遍，再PBS冲洗二遍，最后加0.5ml PBS重悬细胞上流式细胞仪进行荧光检测分析。
五、分化形成的系膜细胞收缩功能鉴定。
为进一步鉴定由人骨髓间充质干细胞分化后形成的系膜样细胞，我们将分化的细胞进行血管紧缩素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ）处理以分析分化形成的系膜细胞的收缩能力。具体方法是，将经过7天诱导分化培养的人骨髓间充质干细胞胰酶消化、离心收集并重悬后以2 ×104/孔的密度接种于经L-多聚赖氨酸包被的24孔培养板中。24小时后弃培养液，并用无血清低糖DMEM培养液冲洗，室温放置10分钟。然后向细胞中加入200μl 的10-6 mol/L血管紧缩素Ⅱ。在加入血管紧缩素Ⅱ之前和之后对培养孔中的同一细胞区域进行拍照，比较分化细胞经血管紧缩素Ⅱ处理前后的细胞形态变化并拍照。培养在常规生长培养液中的未分化细胞做同样处理作为对照。
Claims (6)
1.一种诱导间充质干细胞向肾小球系膜细胞分化的培养液，其特征在于，包括人血小板衍生生长因子-BB、全反式维甲酸、IV型胶原和基础培养基。
2.根据权利要求1 所述的诱导间充质干细胞向肾小球系膜细胞分化的培养液，其特征在于，人血小板衍生生长因子-BB 的浓度为200 ng/ml，全反式维甲酸的浓度为1 μmol/L。
3.根据权利要求1 所述的诱导间充质干细胞向肾小球系膜细胞分化的培养液，其特征在于，IV型胶原是以5μg/cm2的浓度包被于培养板表面。
4.根据权利要求1或2 所述的诱导间充质干细胞向肾小球系膜细胞分化的培养液，其特征在于，所述基础培养基为含有2%的马血清、5ng/ml的bFGF的低糖DMEM培养液。
5.一种诱导间充质干细胞向肾小球系膜细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 配制诱导培养液：以低糖DMEM 为基础培养基，添加2%的马血清、5ng/ml的bFGF和诱导剂人血小板衍生生长因子-BB、全反式维甲酸，混匀，4度保存；
(2) 制备人间充质干细胞；
(3) IV型胶原包被培养板：按照每平方厘米培养板表面积5μg的IV型胶原的浓度包被24孔培养板；
(4) 取间充质干细胞，以5×103/cm2的细胞密度接种于IV型胶原包被的24孔培养板中，添加0.5ml诱导培养液进行诱导培养。
6.(5) 每3天换液，诱导培养9天去除培养液，收集细胞并置于-20度保存。
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