CN107058214A - 诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基和培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞工程领域，尤其是涉及一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基和培养方法。本发明诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基包括DEME基础培养基10‑15g/L，甘露醇0.1‑0.5mM，肝素钠4‑8U，L‑谷氨酰胺1‑1.5mM，丙酮酸钠0.5‑0.85mM，β‑巯基乙醇0.15‑0.2mM，粘连蛋白1‑3mg/L，定向分化诱导因子27‑39ng/mL和血清替代物。本发明诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基能有效促进诱导多能干细胞向肾脏细胞定向分化，且本发明培养基中无胎牛血清添加，避免了动物病原菌感染的风险。

Description

诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基和培养方法
技术领域
本发明涉及细胞工程领域，尤其是涉及一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基和培养方法。
背景技术
慢性肾脏疾病是临床常见的多发病之一。据最新流行病学调查显示，目前我国慢性肾脏疾病患者高达1.2亿，患病率高达10.8％，且呈现逐年不断增长的趋势。肾脏移植术是临床最有效的治疗手段，但该技术存在供体短缺、同种异体排斥反应和终身服用免疫抑制剂等问题。因此，寻找到具有强大的再生能力且无排斥反应的种子细胞就成为了解决该问题的关键。目前用于再生医学研究的细胞主要有成体干细胞和胚胎干细胞，但这两种细胞均存在某些弊端，比如成体干细胞的数量和增殖能力有限；而胚胎干细胞的使用面临道德伦理争议问题。近年来，诱导性多能干细胞的出现为再生医学的研究提供了比较理想的种子细胞。
IPS细胞是用反转录病毒将多能性基因Sox2、Klf4、OCT4和c-Myc转染至体细胞，并使之重编程为能够无限增殖与分化的一类细胞，它与胚胎干细胞类似，体内外均能无限增殖，可分化为人体内几乎所有类型的细胞；同时，IPS具有取材简便、无免疫排斥反应、无道德伦理争议等优点，从而成为再生医学治疗研究中理想的种子细胞。但IPS细胞直接移植治疗存在致癌风险，必须在体外将其诱导为相对成熟的肾脏细胞才能用于移植治疗。
目前在再生研究领域中主要采用细胞因子进行定向诱导分化，研究发现生肾因子活化素A、骨形成蛋白7(bone morphogenetic protein-7，BMP7)、维甲酸(retinoic acid，RA)可以诱导鼠ES细胞向肾脏上皮细胞分化。利用Activin A、BMP4、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basicityfibroblast growth factor，b-FGF)等细胞因子诱导人ES细胞分化并得到一群早期的CD326－CD56+细胞，而该群细胞可进一步分化为中胚层前体细胞。
黄佳卉等人在《体外诱导人iPS细胞向肾脏细胞定向分化的实验研究》中将经Dispase消化后的iPS细胞采用机械切割法传代，mTeSR培养液培养约3d至80％融合，进行实验分组：对照组(正常mTeSR培养组)和诱导组(诱导培养液中含有以下因子：10ng/mL的生肾因子活化素A、BMP7、hVEGF和b-FGF，0.1mol/LRA，10μmol/L lithium)，隔日换液。诱导组培养21d后加入1/2体积的肾脏上皮细胞培养液继续培养7d，同时观察细胞形态变化(上海交通大学学报(医学版)，2014，34(7):957-961.)。
目前，体外诱导人IPS细胞向肾脏细胞定向分化培养基，诱导率低，且培养基多含有胎牛血清，不能满足研究生产的大量需要。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基。本发明定向分化培养基，能有效促进IPS细胞向肾脏细胞定向分化，本发明诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基能有效促进诱导多能干细胞向肾脏细胞定向分化，用本发明制备的定向分化培养培养得到的肾脏细胞中Bry、Pax2、AQP1和E-cad mRNA表达分别较未分化前的诱导多能干细胞均发生上调，其中Bry、Pax2、AQP1和E-cad mRNA可上调10、50、55和40倍，此外，本发明培养基中无胎牛血清添加，避免了动物病原菌感染的风险。
本发明通过以下技术方案实现：
一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基，包括DEME基础培养基10-15g/L，甘露醇0.1-0.5mM，肝素钠4-8U，L-谷氨酰胺1-1.5mM，丙酮酸钠0.5-0.85mM，β-巯基乙醇0.15-0.2mM，粘连蛋白1-3mg/L，定向分化诱导因子27-39ng/mL和血清替代物。
优选地，所述定向分化诱导因子由以下成分及浓度组成：活化素A11-12.5ng/mL、人血管内皮生长因子7.5-9ng/mL、β-磷酸甘油3.5-7.5ng/mL及丹参酮ⅡA 5-10ng/mL。
优选地，所述血清替代物由以下成分及其浓度组成：燕麦蛋白5-10g/L，转铁蛋白0.3-0.5g/L，重组人表皮生长因子0.5-1.5ng/mL，成纤维细胞生长因子1-2ng/mL，血小板来源的生长因子0.75-2.5ng/mL，甘氨酸3.5-6.5g/L，脯氨酸0.1-0.3g/L，酪氨酸磷酸肽2-4g/L和维生素D 0.3-1.2mg/L。
优选地，所述燕麦蛋白的提取方法为：称取脱脂燕麦，按浸提料液质量比1:9的比例加入pH值为10.2的氢氧化钠溶液进行浸提：浸提温度为46℃，浸提时间为3h，10000r/min离心20min，取上清液并用1mol/L盐酸调节pH至4，10000r/min离心20min，将沉淀物水洗两次后喷雾干燥即得。
一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基的培养方法，包括以下步骤：
S1收集活化后的诱导多能干细胞，4℃，200g/min离心3-5min后弃上清后，加入细胞培养液1-3mL悬浮细胞，吸取细胞悬液到15mL离心管中，200g/min离心3-5min，弃上清加入2mL细胞培养液悬浮细胞，并将细胞悬液加入细胞培养皿中于细胞培养箱中培养2小时；
S2吸取S1中培养2小时后的细胞悬液，按体积比1:20-1:25接种量接种于含成纤维细胞生长因子的DMEM培养液中，培养3-4天后，更换所述定向分化培养基，并定期观察，即得。
优选地，所述步骤S1中细胞培养液为DMEM/F12基础培养基，10％胎牛血清，4g/L大豆蛋白，3mM的L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠和7.5mg/L甘氨酰丙氨酸。
本发明诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基所用定向分化诱导因子中含有能够促进诱导多能干细胞向肾脏细胞定向分化的生肾因子活化素A和人血管内皮生长因子；此外本发明技术人员发现将β-磷酸甘油、丹参酮Ⅱ添加到本发明培养基体系中能够提高生肾因子活化素A和人血管内皮生长因子的诱导能力。细胞生长环境中的渗透压对细胞增殖和分化有重要的影响作用，本发明诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基中甘露醇和其它成分相互作用不仅能维持诱导多能干细胞分化所需的渗透压，并且加快了诱导多能干细胞向肾脏干细胞定向分化的速度。
本发明培养基中利用血清替代物替代了胎牛血清，其中燕麦蛋白中含有丰富的氨基酸群且必需氨基酸比重较高，与甘氨酸，脯氨酸和酪氨酸磷酸肽共同使用为细胞生长提供了充足的氨基酸；并且酪氨酸磷酸肽和维生素D相互发挥协同作用，促进矿物质的运输和吸收；重组人表皮生长因子，成纤维细胞生长因子和血小板来源的生长因子有助于细胞的生长。此外，本发明在进行诱导多能干细胞定向分化培养时，用本发明提供的细胞培养液培养诱导多能干细胞有助于其向肾脏细胞定向分化。
与现有技术相比，本发明培养基中各成分间具有协同作用，能显著促进诱导干细胞向肾脏细胞的定向分化。本发明的诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基能有效促进诱导多能干细胞向肾脏细胞定向分化，用本发明制备的定向分化培养培养得到的肾脏细胞中Bry、Pax2、AQP1和E-cad mRNA表达分别较未分化前的诱导多能干细胞均发生上调，其中Bry、Pax2、AQP1和E-cad mRNA可上调10、50、55和40倍，此外，本发明培养基中无胎牛血清添加，规避了添加胎牛血清带来的风险。
附图说明
图1实施例1定向诱导培养基诱导相关基因基因相对表达量的Real-Time PCR鉴定；
图2实施例2定向诱导培养基诱导相关基因基因相对表达量的Real-Time PCR鉴定；
图3实施例3定向诱导培养基诱导相关基因基因相对表达量的Real-Time PCR鉴定；
图4对比例1定向诱导培养基诱导相关基因基因相对表达量的Real-Time PCR鉴定；
图5对比例2定向诱导培养基诱导相关基因基因相对表达量的Real-Time PCR鉴定。
具体实施方式
下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
酪蛋白磷酸肽购于武汉远成共创科技有限公司，大豆蛋白购于石家庄春信生物科技有限公司，β-磷酸甘油(CAS号154804-51-0)购于sigma公司。
诱导多能干细胞购于上海斯丹赛生物技术有限公司，货号HIPS-01/03。
实施例1一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基
一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基，由以下成分及其浓度组成：DEME基础培养基12g/L，甘露醇0.45mM，肝素钠5U，L-谷氨酰胺1.25mM，丙酮酸钠0.68mM，β-巯基乙醇0.17mM，粘连蛋白2.4mg/L，定向分化诱导因子36ng/mL和血清替代物。
所述定向分化诱导因子由以下成分及浓度组成：活化素A 12ng/mL，人血管内皮生长因子8.2ng/mL，β-磷酸甘油6.8ng/mL及丹参酮ⅡA9ng/mL。
所述血清替代物由以下成分及其浓度组成：燕麦蛋白7.5g/L，转铁蛋白0.45g/L，重组人表皮生长因子1.2ng/mL，成纤维细胞生长因子1.75ng/mL，血小板来源的生长因子2.35ng/mL，甘氨酸5.2g/L，脯氨酸0.23g/L，酪氨酸磷酸肽3.5g/L和维生素D 1mg/L。
其中所述燕麦蛋白的提取方法为：称取脱脂燕麦，按浸提料液质量比1:9的比例加入pH值为10.2的氢氧化钠溶液进行浸提：浸提温度为46℃，浸提时间为3h，10000r/min离心20min，取上清液并用1mol/L盐酸调节pH至4，10000r/min离心20min，将沉淀物水洗两次后喷雾干燥即得。
所述诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基的培养方法，包括以下步骤：
S1收集活化后的诱导多能干细胞，4℃，200g/min离心3-5min后弃上清后，加入细胞培养液1-3mL悬浮细胞，吸取细胞悬液到15mL离心管中，200g/min离心3-5min，弃上清加入2mL细胞培养液悬浮细胞，并将细胞悬液加入细胞培养皿中于细胞培养箱中培养2小时；
S2吸取S1中培养2小时后的细胞悬液，按体积比1:20接种量接种于DMEM培养液中，培养3-4天后，更换所述定向分化培养基，并定期观察，即得。
其中，步骤S1中细胞培养液为DMEM/F12基础培养基，10％胎牛血清，4g/L大豆蛋白，3mM的L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠和7.5mg/L甘氨酰丙氨酸。
实施例2一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基
一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基，由以下成分及其浓度组成：DEME基础培养基10g/L，甘露醇0.1mM，肝素钠4U，L-谷氨酰胺1mM，丙酮酸钠0.5mM，β-巯基乙醇0.15mM，粘连蛋白1mg/L，定向分化诱导因子27ng/mL和血清替代物。
所述定向分化诱导因子由以下成分及浓度组成：活化素A 11ng/mL，人血管内皮生长因子7.5ng/mL，β-磷酸甘油3.5ng/mL及丹参酮ⅡA 5ng/mL。
所述血清替代物由以下成分及其浓度组成：燕麦蛋白5g/L，转铁蛋白0.3g/L，重组人表皮生长因子0.5ng/mL，成纤维细胞生长因子1ng/mL，血小板来源的生长因子0.75ng/mL，甘氨酸3.5g/L，脯氨酸0.1g/L，酪氨酸磷酸肽2g/L和维生素D 0.3mg/L。
所述诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基的培养方法与实施例1类似。
实施例3一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基
一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基，由以下成分及其浓度组成：DEME基础培养基15g/L，甘露醇0.5mM，肝素钠8U，L-谷氨酰胺1.5mM，丙酮酸钠0.85mM，β-巯基乙醇0.2mM，粘连蛋白3mg/L，定向分化诱导因子39ng/mL和血清替代物。
所述定向分化诱导因子由以下成分及浓度组成：活化素A 12.5ng/mL，人血管内皮生长因子9ng/mL，β-磷酸甘油7.5ng/mL及丹参酮ⅡA 10ng/mL。
所述血清替代物由以下成分及其浓度组成：燕麦蛋白10g/L，转铁蛋白0.5g/L，重组人表皮生长因子1.5ng/mL，成纤维细胞生长因子2ng/mL，血小板来源的生长因子2.5ng/mL，甘氨酸6.5g/L，脯氨酸0.3g/L，酪氨酸磷酸肽4g/L和维生素D 1.2mg/L。
所述诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基的培养方法与实施例1类似。
对比例1一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基
一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基，由以下成分及其浓度组成：DEME基础培养基12g/L，氯化钠0.45mM，肝素钠5U，L-谷氨酰胺1.25mM，丙酮酸钠0.68mM，β-巯基乙醇0.17mM，粘连蛋白2.4mg/L，定向分化诱导因子36ng/mL和血清替代物。
所述定向分化诱导因子由以下成分及浓度组成：活化素A 12ng/mL，人血管内皮生长因子8.2ng/mL，β-磷酸甘油6.8ng/mL及丹参酮ⅡA9ng/mL。
所述血清替代物由以下成分及其浓度组成：燕麦蛋白7.5g/L，转铁蛋白0.45g/L，重组人表皮生长因子1.2ng/mL，成纤维细胞生长因子1.75ng/mL，血小板来源的生长因子2.35ng/mL，甘氨酸5.2g/L，脯氨酸0.23g/L，酪氨酸磷酸肽3.5g/L和维生素D 1mg/L。
诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基的培养方法与实施例1类似。
与实施例1的区别在于，将甘露醇替换为氯化钠。
对比例2一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基
一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基，由以下成分及其浓度组成：DEME基础培养基12g/L，甘露醇0.45mM，肝素钠5U，L-谷氨酰胺1.25mM，丙酮酸钠0.68mM，β-巯基乙醇0.17mM，粘连蛋白2.4mg/L，定向分化诱导因子36ng/mL和血清替代物。
所述定向分化诱导因子由以下成分及浓度组成：骨形成蛋白712ng/mL，人血管内皮生长因子8.2ng/mL，β-磷酸甘油6.8ng/mL及丹参酮ⅡA9ng/mL。
所述血清替代物由以下成分及其浓度组成：燕麦蛋白7.5g/L，转铁蛋白0.45g/L，重组人表皮生长因子1.2ng/mL，成纤维细胞生长因子1.75ng/mL，血小板来源的生长因子2.35ng/mL，甘氨酸5.2g/L，脯氨酸0.23g/L，酪氨酸磷酸肽3.5g/L和维生素D 1mg/L。
诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基的培养方法与实施例1类似。
与实施例1的区别在于，将活化素A替换为骨形成蛋白7。
试验例1定向诱导肾系分化过程中肾脏发育相关基因的表达水平检测
Real-Time PCR检测分别用实施例1-3及对比例1-2定向分化培养基培养得到的肾脏细胞中相关基因转录水平变化，检测基因包括肾脏发育早期中胚层标志物Bry，IM标志物Pax2，肾小管标志物AQP1和成熟肾上皮细胞标志物E-cad。
Real-Time PCR：总RNA采用TRIzol法提取(按照厂家建议步骤)，提取后的总RNA的浓度及纯度用Thermo Scientific NanoDrop 2000分光光度计测定。按照RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit说明书操作，将提取的RNA反转录为cDNA。Real-Time PCR反应采用TOYOBO公司的SYBR Green Real-Time PCR Master Mix的操作步骤，在ABI Prism7900HT型荧光定量PCR仪上检测。10μL的反应体系。反应条件：95℃15s、60℃15s、72℃45s，40个循环。数据分析以GAPDH为内参，数据采用2－ΔΔCt法进行分析。反应所用引物如表1所示。
表1 Real-Time PCR引物
注：F.forwardprimer，R.reverse primer。
结果发现：利用实施例1-3定向分化培养基培养得到的肾脏细胞中Bry、Pax2、AQP1和E-cad mRNA表达分别较未分化前的诱导多能干细胞均发生上调，其中实施例1中上调最为明显，Bry、Pax2、AQP1和E-cad mRNA表达分别上调10、50、55和40倍(P＜0.05)，具体结果如图1至图5所示。
由以上实验结果可知，本发明诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基能够有效促进诱导多能干细胞向肾脏细胞的定向分化。

Claims (6)

1.一种诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基，其特征在于，包括DEME基础培养基10-15g/L，甘露醇0.1-0.5mM，肝素钠4-8U，L-谷氨酰胺1-1.5mM，丙酮酸钠0.5-0.85mM，β-巯基乙醇0.15-0.2mM，粘连蛋白1-3mg/L，定向分化诱导因子27-39ng/mL和血清替代物。
2.根据权利要求1所述诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基，其特征在于，所述定向分化诱导因子由以下成分及浓度组成：活化素A 11-12.5ng/mL，人血管内皮生长因子7.5-9ng/mL，β-磷酸甘油3.5-7.5ng/mL及丹参酮ⅡA 5-10ng/mL。
3.根据权利要求1所述诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基，其特征在于，所述血清替代物由以下成分及其浓度组成：燕麦蛋白5-10g/L，转铁蛋白0.3-0.5g/L，重组人表皮生长因子0.5-1.5ng/mL，成纤维细胞生长因子1-2ng/mL，血小板来源的生长因子0.75-2.5ng/mL，甘氨酸3.5-6.5g/L，脯氨酸0.1-0.3g/L，酪氨酸磷酸肽2-4g/L和维生素D 0.3-1.2mg/L。
4.根据权利要求3所述诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基，其特征在于，所述燕麦蛋白的提取方法为：称取脱脂燕麦，按浸提料液质量比1:9的比例加入pH值为10.2的氢氧化钠溶液进行浸提：浸提温度为46℃，浸提时间为3h，10000r/min离心20min，取上清液并用1mol/L盐酸调节pH至4，10000r/min离心20min，将沉淀物水洗两次后喷雾干燥即得。
5.根据权利要求1-4任一所述的诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1收集活化后的诱导多能干细胞，4℃，200g/min离心3-5min后弃上清后，加入细胞培养液1-3mL悬浮细胞，吸取细胞悬液到15mL离心管中，200g/min离心3-5min，弃上清加入2mL胚胎干细胞完全培养基悬浮细胞，并将细胞悬液加入细胞培养皿中于细胞培养箱中培养2小时；
S2吸取S1中培养2小时后的细胞悬液，按体积比1:20-1:25接种量接种于含成纤维细胞生长因子的DMEM培养液中，培养3-4天后，更换所述定向分化培养基，并定期观察，即得。
6.根据权利要求5所述诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基的培养方法，其特征在于，所述步骤S1中细胞培养液为DMEM/F12基础培养基，10％胎牛血清，4g/L大豆蛋白，3mM的L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠和7.5mg/L甘氨酰丙氨酸。
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