CN110205287A - 一种治疗炎症性肠炎的细胞制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种治疗炎症性肠炎的细胞制剂,其为人脐带沃顿区间充质干细胞制剂,该细胞制剂来源于胎儿脐带沃顿区间充质干细胞,该细胞制剂通过细胞流式检测鉴定的CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率均在90%以上,优选在95%以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗炎症性肠炎的细胞制剂,其为一种脐带沃顿区间充质干细胞制剂,其制备方法、制备培养基及应用。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)是一种慢性肠道炎症性疾病,包括溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)和克罗恩病(Crohn Disease,CD),该病与自身免疫功能紊乱密切相关,该病在西方国家很常见,近年我国IBD病例数激增,现已成为消化系统常见病及慢性腹泻的主要病因。到目前为止,其病因及具体的发病机理仍不清楚,临床上缺少对该病的根本性治疗方案。世界卫生组织把该病列为现代难治病之一。
现有的IBD治疗主要在于控制活动性炎症和调节免疫紊乱,常用的有3类药物:水杨酸制剂、糖皮质激素和免疫抑制剂。长期使用上述药物会给患者带来很多不良反应,且对危重病例的疗效有限。对病情危重者须采用外科手术治疗,手术治疗后亦存在严重影响患者生活质量以及术后复发等问题。随着生物治疗技术迅猛发展,间充质干细胞移植治疗为IBD的治疗带来新的曙光。
常用的间充质细胞包括骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、脐带血间充质干细胞等,其中脐带沃顿区间充质干细胞最有研究潜力。与常用的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)相比,脐带沃顿区间充质干细胞具有来源丰富、对供体无影响、易于采集和运输、致癌性可能性小、病毒污染概率低、免疫源性弱、无社会、伦理和法律方面争议等诸多优点。更重要的是从脐带沃顿区分离的间充质干细胞含量高、增殖能力高于骨髓MSCs,免疫原性低于骨髓MSCs,现已成为科研及临床的研究热点。
发明内容
为了解决上述本领域中存在的问题,本发明的目的在于提供一种新型的能够用于治疗IBD的脐带沃顿区间充质干细胞制剂。
本发明的目的还在于提供一种能够用于制备用于治疗IBD的脐带沃顿区间充质干细胞制剂的方法,以及制备其的培养基。
本发明的目的还在于提供该脐带沃顿区间充质干细胞制剂用于治疗IBD的用途。
具体来说,本发明涉及以下方面:
1.一种脐带沃顿区间充质干细胞制剂,其中,
所述细胞制剂来源于胎儿脐带沃顿区间充质干细胞,
所述细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率均在90%以上,优选在95%以上。
2.根据项1所述的细胞制剂,其中,
所述细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD31阳性率低于10%,优选低于9%,
所述细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD45和CD34的阳性率低于5%,优选低于4%,进一步优选低于3%。
3.根据项1或2所述的细胞制剂,其是通过如下方法制备的细胞制剂,所述方法包括如下步骤:
利用低血清培养基培养来自胎儿脐带的脐带沃顿区间充质干细胞以获得脐带沃顿区间充质干细胞制剂。
4.根据项3所述的细胞制剂,其中,
所述低血清培养基中的血清浓度低于5vol%,优选为3vol%,
所述低血清培养基包括基础培养基以及生长因子及其他利于细胞生长的物质的组合物。
5.根据项4所述的细胞制剂,其中,所述生长因子及其他利于细胞生长的物质的组合物包括:
人上皮生长因子,即hEGF,
人碱性成纤维生长因子,即b-FGF,
重组人胰岛素样生长因子,
血小板衍生因子,即PDGF,
氢化可的松,
抗坏血酸,
肝素以及,
纤维连接蛋白。
6.根据项4或5所述的细胞制剂,其中,所述基础培养基是DMEM高糖培养基。
7.一种生长因子及其他利于细胞生长的物质的组合物,其包括:
人上皮生长因子,即hEGF,
人碱性成纤维生长因子,即b-FGF,
重组人胰岛素样生长因子,
血小板衍生因子,即PDGF,
氢化可的松,
抗坏血酸,
肝素,以及
纤维连接蛋白。
8.根据项7所述的组合物,其中,
所述人上皮生长因子的浓度为1~100ng/ml,优选为1~30ng/ml;
所述人碱性成纤维生长因子的浓度为1~100ng/ml,优选为1~30ng/ml;
所述重组人胰岛素样生长因子的浓度为1~50ng/ml,优选为优选1-20ng/ml;
所述血小板衍生因子的浓度为1~100ng/ml,优选为1~20ng/ml;
所述氢化可的松的浓度为1~50μg/ml,优选为1~20μg/ml;
所述抗坏血酸的浓度为1~100μg/ml,优选为5~30μg/ml;
所述肝素的浓度为1~100μg/ml,优选为1~30μg/ml;以及
所述纤维连接蛋白的浓度为1~100ng/ml,优选1-30ng/ml。
9.一种培养脐带沃顿区间充质干细胞的培养基,其包括:
项7或8所述的组合物,以及基础培养基。
10.一种人脐带沃顿区间充质干细胞制剂的制备,该细胞制剂用于治疗炎症性肠病,以及炎症性肠病相关并发症及发病机理相似的疾病的药物中的用途。
11.根据项10所述的用途,所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
12.根据项10所述的用途,所述炎症性肠病相关并发症及发病机理相似的疾病包括但不限于肠易激综合征、关节炎和其他肠外并发症包括强直性脊柱炎、坏疽性脓皮病、结节性红斑、虹膜炎、葡萄膜炎、巩膜外层炎和原发性硬化性胆管炎。
13.根据项10~12中任一项所述的用途,其中,
所述细胞制剂来源于胎儿脐带沃顿区间充质干细胞,
所述细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率均在90%以上,优选在95%以上。
14.根据项13所述的用途,其中,
所述细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD31阳性率低于10%,优选低于9%,
所述细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD45和CD34的阳性率低于5%,优选低于4%,进一步优选低于3%。
15.一种制备人脐带沃顿区间充质干细胞制剂的方法,其包括以下步骤:
利用低血清培养基培养来自胎儿脐带的脐带沃顿区间充质干细胞以获得脐带沃顿区间充质干细胞制剂。
16.根据项15所述的方法,其中,
所述低血清培养基包含的血清浓度低于5vol%,进一步优选为3vol%,
所述低血清培养基包括基础培养基以及生长因子的组合物。
附图说明
图1流式细胞仪检测CD29、CD44、CD90、CD105、CD31、CD45、CD34及HLA-DR标志物的检测结果图。
图2示出本发明的人脐带沃顿区间充质干细胞制剂有效治疗炎症性肠炎的效果图。
图3示出本发明的人脐带沃顿区间充质干细胞制剂的的安全评价结果。
图4示出本发明的人脐带沃顿区间充质干细胞制剂对AOM/DSS诱导结肠癌发生的影响。
具体实施方式
以下通过具体实施例来详细阐述和说明本发明的实施方式,但以下内容不应理解为对本发明作任何限制。
本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义,如有冲突以本说明书中的定义为准。
本发明涉及一种脐带沃顿区间充质干细胞制剂,该细胞制剂来源于胎儿脐带沃顿区间充质干细胞,该细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率均在90%以上,进一步优选在95%以上。
进一步,该细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD31阳性率低于10%,优选低于9%,该细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD45和CD34的阳性率低于5%,优选低于4%,进一步优选低于3%。
其中,脐带是由中胚层发育而来,是胎儿时期连接胎儿和母体的索状结构,外由羊膜包被,内有两条动脉和一条静脉及血管周围富含蛋白糖和黏多糖的胶状组织构成。沃顿区呈胶状,由成纤维细胞、胶原纤维和蛋白多糖组成。胎儿脐带沃顿区间充质干细胞是从脐带的沃顿区分离得到的间充质干细胞。
在本发明中,CD29、CD44、CD90和CD105均为鉴定间充质干细胞常用的表面标志物,CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率证明该细胞制剂是间充质干细胞且其纯度很高。
在本发明中,CD31是内皮祖细胞的标志物、CD45是白细胞的标志物和CD34造血干细胞的标志物,CD31、CD45以及CD34的三个指标的阳性率低,说明本发明的细胞制剂纯度高。本发明制备的脐带沃顿区间充质干细胞制剂的纯度与用10vol%FBS培养的脐带间充质干细胞纯度相当,说明采用本发明的低血清培养基来培养人脐带沃顿区间充质干细胞切实可行。
在本发明中,采用流式细胞术来检测上述细胞制剂,具体来说将脐带沃顿区间充质干细胞用胰酶消化后计数,每份细胞为5x105个,一共分为12份。其中一份作为阴性对照,三份分别作为FITC、PE及APC三种荧光染料的单阳管(以上4个样品用于调试流式细胞仪,即调节电压和补偿)。另外8份细胞为样品管,分别加入FITC、PE或APC三种荧光染料其中之一标记的CD90、CD29、CD44、CD105、CD31、CD45、CD34和HLA-DR的抗体,冰上孵育20分钟,洗去多余抗体,每管加入200微升PBS重悬细胞,将样品通过流式细胞仪分析即可以得到CD90、CD29、CD44、CD105、CD31、CD45、CD34和HLA-DR的抗体各指标的阳性率。
在本发明中,对于所使用的流式细胞仪没有特别的限定,可以使用任何本领域中常用的流式细胞仪。
本发明的细胞制剂是通过如下方法制备的,该方法包括:利用低血清培养基培养来自胎儿脐带的脐带沃顿区间充质干细胞以获得脐带沃顿区间充质干细胞制剂。
该方法还包括从脐带获取沃顿区间充质干细胞。对于从脐带获取沃顿区间充质干细胞的方法没有具体的限定,任何本领域常规的方法均可以使用。在一个具体的实施方式中,采用组织块培养法获取原代脐带间充质细胞。即将脐带沃顿区组织用眼科剪刀减成1cm3左右的小块,用镊子将小组织块铺于10cm的培养皿内,加入本申请中所述的低血清培养基,在37℃的培养箱内培养,2周左右细胞爬出。
在本发明中采用了低血清培养基来进行培养。通常在间充质干细胞培养方面,不同的研究人员或机构采用的血清浓度各不相同,大部分人使用10%(体积百分数)的胎牛血清,有的血清浓度高达20%(体积百分数)。一般来说,培养基中的血清浓度为3%(体积百分数),可以称为低血清培养基。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、碳水化合物、生长因子、激素等。血清成分复杂,每批血清之间都有差别,不能保证其成分一致。另外,虽然血清内含有很多利于细胞生长的成分,但不可避免的含有一些对细胞有伤害的成分,如补体、抗体、内毒素等。因此,高浓度血清培养出的细胞不适合于临床应用,会增加了临床过敏的风险。而低血清培养基对于细胞生长、增殖、形态及功能无不良影响。本发明的低血清培养基包括基础培养基、生长因子及促进细胞生长各物质的组合物。
在上述体积百分比(以含3%FBS的培养基为例)是指每配制100毫升培养基,加3毫升胎牛血清(FBS)和97毫升的基础培养基,即FBS与总培养基体积的比例。
上述基础培养基是指包括碳水化合物、氨基酸、维生素和无机盐的培养基。
在本发明的一个优选的实施例中,使用DMEM高糖培养基,其能够提供间充质干细胞在体外生存所必需的营养物质,包括四大类物质,即碳水化合物、氨基酸、维生素和无机盐。DMEM培养基是在MEM培养基的基础上研制而成,其营养成分含量比MEM及α-MEM更高。
上述生长因子及利于细胞生长的多种物质的组合物包括:人上皮生长因子,即hEGF,人碱性成纤维生长因子,即b-FGF,重组人胰岛素样生长因子,血小板衍生因子,即PDGF,氢化可的松,抗坏血酸,以及肝素。
其中,人上皮生长因子(hEGF),促进外胚层及中胚层细胞生长,如成纤维细胞。
人碱性成纤维生长因子(b-FGF),促进成纤维细胞生长。
重组人胰岛素样生长因子,促进多种细胞生长。
血小板衍生因子(PDGF),促进间充质细胞生长。
氢化可的松,促进表皮细胞生长。
本发明中使用的低血清培养基,其包括:
人上皮生长因子(hEGF)1~100ng/ml(优选1-30ng/ml),人碱性成纤维生长因子(b-FGF)1~100ng/ml(优选1-30ng/ml),重组人胰岛素样生长因子1~50ng/ml(优选1-20ng/ml),血小板衍生因子(PDGF)1~100ng/ml(优选1-20ng/ml),肝素1~100μg/ml(优选1-30μg/ml),氢化可的松1~50μg/ml(优选1-20μg/ml),抗坏血酸1~100μg/ml(优选5-30μg/ml),纤维连接蛋白1~100ng/ml(优选1-30ng/ml),FBS 1-20vol%(优选3-5vol%),0.1-1vol%非必需氨基酸水溶液(优选1vol%)。另外,在本发明使用的DMEM高糖培养基补充2mmol/L的L-左旋谷氨酰胺,50U/ml青霉素,50μg/ml链霉素。
本发明的胎儿脐带沃顿区间充质干细胞制剂,在本发明中是指利用低血清培养基对胎儿脐带的脐带沃顿区间充质干细胞进行培养而得到的制剂。通过流式细胞仪检测,发现本发明的细胞制剂高表达CD29、CD90、CD44、CD105等干细胞高表达的标志物,且这些干细胞标志物的比例均在95%以上;另外,本发明的细胞制剂低表达造血及内皮细胞标志物,CD45和CD31的比例均低于5%;更重要的是,本发明的细胞制剂不表达移植排斥相关的标志物HLA-DR,本发明的细胞制剂纯度较高,且移植排斥的风险极低。
利用的本发明的人沃顿区脐带间充质干细胞制剂能够有效降低DSS诱导的小鼠的死亡率,并且人沃顿区脐带间充质干细胞制剂能够有效抑制肠炎小鼠的体重降低,有效抑制肠炎小鼠的疾病活动指数,有效延长肠炎小鼠的结肠长度。可见本发明的细胞制剂可有效治疗小鼠的炎症性肠炎。
并且利用本发明的脐带间充质干细胞制剂无成瘤风险,安全可靠。本发明的人沃顿区脐带间充质干细胞制剂可有效抑制AOM/DSS诱导的结肠癌的发生,以及可以有效降低AOM/DSS诱导的肿瘤数目。
进一步本发明的细胞制剂是利用低血清培养基来制备的,利用低血清培养基进行培养对于细胞生长、增殖、形态及功能无不良影响。
本发明的细胞制剂可用于治疗炎症性肠病,例如可以用于治疗溃疡性结肠炎和克罗恩病。
本发明涉及上述细胞制剂在用于制备治疗炎症性肠病,以及炎症性肠病相关并发症及发病机理相似的疾病的药物中的用途,其中,炎症性肠病相关并发症及发病机理相似的疾病包括但不限于肠易激综合征、关节炎和其他肠外并发症包括强直性脊柱炎、坏疽性脓皮病、结节性红斑、虹膜炎、葡萄膜炎、巩膜外层炎和原发性硬化性胆管炎。
实施例
下述实施例中使用的低血清培养基的组成如下:
人上皮生长因子(hEGF)10ng/ml
人碱性成纤维生长因子(b-FGF)10ng/ml
重组人胰岛素样生长因子(IGF)5μg/ml
血小板衍生因子(PDGF)10ng/ml
肝素5μg/ml
氢化可的松1μg/ml
抗坏血酸10μg/ml
纤维连接蛋白10ng/ml
非必需氨基酸水溶液1%(体积百分比)
L-左旋谷氨酰胺2mmol/L
DMEM培养基补充3-5%的FBS(体积百分比),50U/ml青霉素,50μg/ml链霉素。
以上培养液、血清、细胞因子及活性材料可以选自一个公司或多个公司(如Sigma、hyclone、Gibco公司)的市售产品。
实施例1获得脐带沃顿区间充质干细胞
1.胎儿脐带的获取
取足月、无先天性疾病的新生儿的脐带;该产妇无肝炎、梅毒、艾滋病等传染性疾病,产妇及家属对脐带用于试验研究均知情同意。
2.脐带沃顿区间充质细胞的获取
在无菌实验台内,将脐带用磷酸缓冲液(PBS)反复冲洗,洗去残余血液。用无菌手术器械将脐带剪成2-3cm的小段,将脐带纵向剖开,去除脐动脉、脐静脉和羊膜后,将沃顿区剪成0.5-1mm3左右的小块。采用组织块培养法获取原代脐带间充质细胞:将上述脐带沃顿区组织块均匀的铺在10cm无菌培养皿内,覆盖60-70%皿底面积,倒置放入37℃培养箱15min;翻转培养皿,轻轻加入10ml间充质干细胞的上述低血清培养基,在37℃,5%CO2的培养箱内培养。3天后半量换液,7-10天左右,待组织块下均匀爬出细胞后,去除组织块,PBS清洗2次,每皿加入10ml新鲜的本申请中所述的间充质干细胞低血清培养基,此后3-4天换一次液。细胞铺满80%左右时进行传代。待细胞80%左右汇合时,0.25%的胰酶消化1-2min,按照1:3传代即得到我们所描述的脐带沃顿区间充质干细胞。
实施例2获得脐带沃顿区间充质干细胞制剂
采用上述低血清培养基培养实施例1获得脐带沃顿区间充质干细胞。具体来说,组织块法分离得到的人脐带间充质干细胞,用上述低血清培养基培养,待细胞80%左右汇合时,0.25%的胰酶消化1-2分钟,大部分细胞用于扩大培养,小部分细胞用于鉴定干细胞的标志物。用流式细胞术检测CD29、CD44、CD90、CD105、CD31、CD45、CD34及HLA-DR的表达(细胞分别与以上相应的抗体共同孵育后,洗去多余的抗体,用PBS重悬细胞,利用BD公司的LSRFortessa仪器检测以上各指标的阳性率),结果如图1所示。从图1的实验结果表明,实施例2得到的细胞制剂高表达间充质干细胞的标志物,CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率均在95%以上;低表达造血干细胞及内皮细胞标志物,CD31、CD45和CD34的比例低于10%;更重要的是,该细胞制剂不表达移植排斥前关的标志物HLA-DR。
实施例3利用实施例2的制剂治疗小鼠DSS诱导的炎症性肠炎
C57BL/6小鼠适应环境3天,随机分为三组,即正常对照组,DSS模型组(DSS即硫酸葡聚糖钠,是肠炎模型的造模试剂,购于MP公司)及细胞治疗组。小鼠给予3.5%的DSS水6天,细胞治疗组,在给DSS水的1,3,5天分别由尾静脉注射1x106个人沃顿区脐带间充质干细胞制剂(也称MSCs),注射体积为100微升/只。DSS模型组,在给DSS水的1,3,5天分别由尾静脉注射体积为100微升/只的PBS缓冲液。每天称小鼠的体重,检测便血及稀便程度。实验结束时,处死小鼠,取完整的结肠,检测其长度,并且对小鼠的死亡率、体重指数、疾病活动指数以及结肠长度进行检测(具体的检测方法可以参见论文Sala E,Genua M,Petti L,etal.Mesenchymal Stem Cells Reduce Colitis in Mice via Release of TSG6,Independently of Their Localization to the Intestine.Gastroenterology 2015;149:163-176),实验结果如图2所示,其中图2A的结果显示人沃顿区脐带间充质干细胞制剂有效降低DSS诱导的小鼠的死亡率,图2B的结果显示人沃顿区脐带间充质干细胞制剂有效抑制肠炎小鼠的体重降低,图2C的结果显示人沃顿区脐带间充质干细胞制剂有效抑制肠炎小鼠的疾病活动指数,图2D的结果显示沃顿区脐带间充质干细胞制剂有效延长肠炎小鼠的结肠长度。可以看出本发明的细胞制剂可有效治疗小鼠的炎症性肠炎。
实施例4人脐带沃顿区间充质干细胞制剂的安全评价
在实施例4中,选用免疫缺陷小鼠做皮下荷瘤试验。裸鼠腋下分别接1x106个B16细胞(鼠黑色素瘤细胞株)或实施例2得到的人沃顿区脐带间充质干细胞制剂,一个月后,我们发现接种B16细胞的一侧均已成瘤,而接种脐带间充质干细胞的一侧均未成瘤,证明本发明的脐带间充质干细胞制剂无成瘤风险。为了进一步验证这一实验结果,选用正常的小鼠做皮下荷瘤试验。ICR鼠腋下分别接5x106个H22细胞(小鼠肝癌细胞株)或人沃顿区脐带间充质干细胞,一个月后,我们发现接种H22细胞的一侧均已成瘤,而接种脐带间充质干细胞的一侧均未成瘤,再次证明本发明的脐带间充质干细胞制剂无成瘤风险,安全可靠。结果图3A和3B所示,其中图3A显示B16细胞可在免疫缺陷的裸鼠上成瘤,人沃顿区脐带间充质干细胞不能成瘤,图3B显示H22细胞可在无免疫缺陷(正常)的小白鼠上成瘤,人沃顿区脐带间充质干细胞不能成瘤。
实施例5人脐带沃顿区间充质干细胞制剂对AOM/DSS诱导结肠癌发生的影响
为了验证长期给予人沃顿区脐带间充质干细胞制剂有无成瘤风险,在实施例5中采用了AOM/DSS模型。造模方法:C57BL/6小鼠适应环境后,腹腔注射10mg/kg的AOM(一种诱导大肠癌发病的试剂,购于sigma公司),并给予正常水。一周后,换正常水为2.5%的DSS水,一周后,换DSS水为正常水,两周后换正常水为2.5%的DSS水,以此类推,一共给予3轮的DSS水。注射AOM的当天为第一天,第90天实验结束,处死小鼠收集样本。将小鼠随机分为两组,一组尾静脉注射100微升的PBS内含1x106个人沃顿区脐带间充质干细胞,另一组以同样的方式注射等量的PBS;注射频率为每周一次。结果如图4所示,图4A显示人沃顿区脐带间充质干细胞制剂可有效抑制AOM/DSS诱导的结肠癌的发生,图4B显示人沃顿区脐带间充质干细胞制剂可有效降低AOM/DSS诱导的肿瘤数目。
以上结果表明,在AOM诱导癌症的微环境下,长期注射人脐带沃顿区间充质干细胞制剂不会促进肿瘤生长,相反,本发明的细胞制剂可以显著的抑制肿瘤的生成。因此,本发明的细胞制剂无成瘤风险、安全有效。
Claims (10)
1.一种人脐带沃顿区间充质干细胞制剂,其中,
所述细胞制剂来源于胎儿脐带沃顿区间充质干细胞,
所述细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率均在90%以上,优选在95%以上。
2.根据权利要求1所述的细胞制剂,其中,
所述细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD31阳性率低于10%,优选低于9%,
所述细胞制剂通过细胞流式检测测定的CD45和CD34的阳性率低于5%,优选低于4%,进一步优选低于3%。
3.根据权利要求1或2所述的细胞制剂,其是通过如下方法制备的细胞制剂,所述方法包括如下步骤:
利用低血清培养基培养来自胎儿脐带的脐带沃顿区间充质干细胞以获得脐带沃顿区间充质干细胞制剂。
4.根据权利要求3所述的细胞制剂,其中,
所述低血清培养基中的血清浓度低于5vol%,优选为3vol%,
所述低血清培养基包括基础培养基以及生长因子和其他利于细胞生长的物质的组合物。
5.根据权利要求4所述的细胞制剂,其中,所述生长因子及其他利于细胞生长的物质的组合物包括:
人上皮生长因子,即hEGF,
人碱性成纤维生长因子,即b-FGF,
重组人胰岛素样生长因子,
血小板衍生因子,即PDGF,
氢化可的松,
抗坏血酸,
肝素,以及
纤维连接蛋白。
6.根据权利要求4或5所述的细胞制剂,其中,所述基础培养基是DMEM高糖培养基。
7.一种生长因子及其他利于细胞生长的物质的组合物,其包括:
人上皮生长因子,即hEGF,
人碱性成纤维生长因子,即b-FGF,
重组人胰岛素样生长因子,
血小板衍生因子,即PDGF,
氢化可的松,
抗坏血酸,
肝素,以及
纤维连接蛋白。
8.根据权利要求7所述的组合物,其中,
所述人上皮生长因子的浓度为1~100ng/ml,优选为1~30ng/ml;
所述人碱性成纤维生长因子的浓度为1~100ng/ml,优选为1~30ng/ml;
所述重组人胰岛素样生长因子的浓度为1~50ng/ml,优选为优选1-20ng/ml;
所述血小板衍生因子的浓度为1~100ng/ml,优选为1~20ng/ml;
所述氢化可的松的浓度为1~50μg/ml,优选为1~20μg/ml;
所述抗坏血酸的浓度为1~100μg/ml,优选为5~30μg/ml;
所述肝素的浓度为1~100μg/ml,优选为1~30μg/ml;以及
所述纤维连接蛋白的浓度为1~100ng/ml,优选1-30ng/ml。
9.一种培养脐带沃顿区间充质干细胞的培养基,其包括:
权利要求7或8所述的组合物,以及基础培养基。
10.一种人脐带沃顿区间充质干细胞制剂的制备,该细胞制剂用于治疗炎症性肠病,以及炎症性肠病相关并发症及发病机理相似的疾病的药物中的用途。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112159794A (zh) * | 2020-09-17 | 2021-01-01 | 中国人民解放军空军军医大学 | 骨相关间充质干细胞cd166+亚群的制备及应用 |
CN112516169A (zh) * | 2020-12-17 | 2021-03-19 | 陕西佰傲干细胞再生医学有限公司 | 一种用于治疗肠炎的间充质干细胞及其制备方法 |
CN114107185A (zh) * | 2021-11-01 | 2022-03-01 | 上海市东方医院(同济大学附属东方医院) | 一种用于治疗克罗恩病的药物组合物及其制备方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101525594A (zh) * | 2009-04-17 | 2009-09-09 | 中国医学科学院血液学研究所 | 一种培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基和利用该培养基培养间充质干细胞的方法 |
CN102191229A (zh) * | 2010-03-16 | 2011-09-21 | 侯亚义 | 一种快速有效获得脐带间充质干细胞(msc)的方法 |
CN102827807A (zh) * | 2012-09-19 | 2012-12-19 | 北京京蒙高科干细胞技术有限公司 | 一种间充质干细胞无血清培养基 |
US20160066566A1 (en) * | 2014-09-10 | 2016-03-10 | Healthbanks Biotech Co., Ltd. | Cryopreservation of umbilical cord tissue strips for cord tissue-derived stem cells |
-
2018
- 2018-02-28 CN CN201810166382.3A patent/CN110205287A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101525594A (zh) * | 2009-04-17 | 2009-09-09 | 中国医学科学院血液学研究所 | 一种培养间充质干细胞的低血清浓度完全培养基和利用该培养基培养间充质干细胞的方法 |
CN102191229A (zh) * | 2010-03-16 | 2011-09-21 | 侯亚义 | 一种快速有效获得脐带间充质干细胞(msc)的方法 |
CN102827807A (zh) * | 2012-09-19 | 2012-12-19 | 北京京蒙高科干细胞技术有限公司 | 一种间充质干细胞无血清培养基 |
US20160066566A1 (en) * | 2014-09-10 | 2016-03-10 | Healthbanks Biotech Co., Ltd. | Cryopreservation of umbilical cord tissue strips for cord tissue-derived stem cells |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
PANAGIOTIS MALLIS ET AL.: "Wharton Jelly Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Umbilical Cord Capable to Differentiate into Neural-Like Cells and their Potential Use in Neurological Disorders", 《ELECTRONIC JOURNAL OF BIOLOGY》 * |
SUNGHOON JUNG ET AL.: "Ex Vivo Expansion of Human Mesenchymal Stem Cells in Defined Serum-Free Media", 《STEM CELLS INTERNATIONAL》 * |
YAN LIN ET AL.: "Transplantation of human umbilical mesenchymal stem cells attenuates dextran sulfate sodium-induced colitis in mice", 《CEPP》 * |
ZHONG-BAO RUAN ET AL.: "Karyotype stability of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells during in vitro culture", 《EXPERIMENTAL AND THERAPEUTIC MEDICINE》 * |
葛翠翠 等: "人脐带间充质干细胞对炎症性肠病小鼠模型的治疗作用", 《生物技术通讯》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112159794A (zh) * | 2020-09-17 | 2021-01-01 | 中国人民解放军空军军医大学 | 骨相关间充质干细胞cd166+亚群的制备及应用 |
CN112159794B (zh) * | 2020-09-17 | 2022-07-15 | 中国人民解放军空军军医大学 | 骨相关间充质干细胞cd166+亚群的制备及应用 |
CN112516169A (zh) * | 2020-12-17 | 2021-03-19 | 陕西佰傲干细胞再生医学有限公司 | 一种用于治疗肠炎的间充质干细胞及其制备方法 |
CN114107185A (zh) * | 2021-11-01 | 2022-03-01 | 上海市东方医院(同济大学附属东方医院) | 一种用于治疗克罗恩病的药物组合物及其制备方法 |
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