CN112159794A - 骨相关间充质干细胞cd166+亚群的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及骨相关间充质干细胞CD166⁺亚群的制备及其应用，所涉及的制备包括利用抗‑CD45抗体、抗‑Ter119抗体和抗‑CD166抗体对骨相关间充质干细胞进行分选得到骨相关间充质干细胞CD166⁺亚群。所涉及的应用是骨相关间充质干细胞CD166⁺亚群用于制备治疗炎症性肠病的应用。

Description

骨相关间充质干细胞CD166+亚群的制备及应用

技术领域

本发明涉及骨相关间充质干细胞，具体涉及骨相关间充质干细胞CD166⁺亚群的制备及应用。

背景技术

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是常见消化系统疾病，一种慢性非特异性的肠道炎症性疾病，目前病因不明，发病机制尚不十分清楚。IBD好发于青壮年人群，有溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn's disease，CD)两种临床亚型。

IBD常有腹痛、腹泻等典型消化道症状，病情加重时可出现发热、消瘦等全身体征，部分患者还可出现泌尿、呼吸及皮肤等消化系统外症状。IBD易反复发作、迁延不愈，病程往往较长。当病情迁延时，患者可出现肠道穿孔、梗阻、腹腔脓肿，甚至是中毒性巨结肠、直结肠癌变等并发症，严重影响患者的生活质量，对患者造成极大的精神痛苦。因此探索安全有效的IBD治疗方案，显得十分迫切和必要。

现有IBD治疗方案存在较多不足当前IBD以逐步升级的药物治疗为主，包括抗炎类药物(氨基水杨酸、糖皮质激素)和免疫抑制剂(硫唑嘌呤)等。对于激素、免疫抑制剂治疗无效或激素依赖、不能耐受上述药物治疗的患者，则使用生物制剂如TNF-α单抗来治疗，但该方法的长期应用效果并不理想。而对于药物治疗无法控制的IBD患者，只能采用外科手术来治疗，术后造瘘以及并发症等，都会严重降低患者的生活质量。另一方面，药物治疗虽然可以缓解IBD的临床症状，但难以彻底治愈IBD；而且很多药物的副作用较大，因为激素类药物长期使用容易产生多种不良反应，如高血压、糖尿病、骨质疏松等；嘌呤类药物的长期应用可能会增加血液病、皮肤癌、泌尿系统肿瘤及宫颈癌等恶性肿瘤发生的风险；生物制剂如单抗会引起头痛、恶心、上呼吸道感染、红斑狼疮等不良反应发生。这些药物副作用并不利于原发病的治疗。因此，临床上亟需新的治疗策略，以延长IBD缓解期时间，减少毒副作用，提高IBD患者生活质量。

现有技术中MSCs对IBD具有一定的临床治疗效果，但是预后并不稳定。

发明内容

针对现有技术的缺陷或不足，本发明提供了骨相关间充质干细胞CD166⁺亚群的制备方法。

为此，所提供的制备方法包括：利用抗-CD45、抗-Ter119和抗-CD166对骨相关间充质干细胞进行分选得到骨相关间充质干细胞CD166⁺亚群。

本发明同时还提供了骨相关间充质干细胞CD166⁺亚群用于治疗IBD的应用。

附图说明

图1.骨相关间充质干细胞CD166⁺亚群(CD166⁺MSCs)的鉴定。A-B.流式细胞仪鉴定CD166⁺MSCs分选纯化的结果:A分选后细胞的血细胞标记Ter119、CD45的阳性率；B:分选后细胞的CD166阳性率。C.光镜下CD166⁺MSCs亚群培养7天的图片，显微镜放大倍率为400×。

图2.IBD模型的建立。给8周龄的C57BL/6小鼠饮用含3％DSS水7天，正常饮水为对照组。每日监测体重、粪便情况、有无腹泻、血便、活动力等，。A.每日体重变化；B.临床评分的变化；C.建模第7天，处死小鼠，分离结肠图片；D.结肠长度的分析。Ctrl：对照组；DSS：饮用3％DSS水组。N＝5，**P<0.001。

图3.IBD模型小鼠H&E切片病理组织学分析。IBD模型小鼠建模成功后，解剖结肠，制备石蜡切片，做H&E染色。A.H&E染色结肠切片；B.组织学评分。Ctrl：对照组；DSS：饮用3％DSS水的小鼠组。N＝4，***P<0.001。

图4.CD166⁺MSCs移植输注的临床效果分析。经静脉给IBD模型小鼠体内分别注射PBS，CD166⁺MSCs，每日称重、观察粪便情况、活动力，移植3天后解剖小鼠。A.临床评分分析；B.结肠图片；C.结肠长度分析；D.石蜡H&E染色图片；E.组织学评分分析。PBS：注射PBS的IBD小鼠；CD166⁺MSC：注射CD166⁺MSCs。N＝4，*p<0.05，**p<0.01。

具体实施方式

除非另有说明，本文中的相关术语根据本领域技术人员的常规认识理解。

本发明所述骨相关间充质干细胞CD166⁺、骨相关间充质干细胞CD166⁺亚群、CD166⁺MSCs为相同含义，均指本发明所制备的细胞。

以下实施例所用生物材料分别来自：小鼠购自空军军医大学实验动物中心SPF级小鼠；MEM-α培养基购自Gibco公司；DSS购自Sigma-aldrich公司；Ter119抗体,CD45抗体购自eBioscience公司；CD166抗体购自R&D公司；间充质干细胞免疫磁珠富集试剂盒和CD166阳性磁珠分选试剂盒购自Stem Cell公司。如无特殊说明，以下实施例中所采用的实验方法或相关检测方法采用本领域已知方法。

实施例1.骨相关间充质干细胞CD166⁺亚群CD166⁺MSCs的制备

①取8-12周龄的C57BL/6小鼠股骨和胫骨，手术刀片清理去除所有肌肉组织。骨头放于研磨杯内研磨至骨髓释放，加入PBS冲洗骨头以去除骨髓，再次研磨和冲洗，直到骨头全部变成白色；

②加入0.5％I型胶原酶混匀后，摇床上37℃消化1h，然后取70μm孔径滤网，过滤消化后骨混合物，收集过滤液，用红细胞裂解液(ACK)裂解红细胞后PBS洗涤三次；

③使用间充质干细胞免疫磁珠富集试剂盒富集MSCs，获得MSCs细胞；

④将得到MSCs细胞转入5mL试管中并计数，然后按照CD166阳性磁珠分选试剂盒要求加入适量的分选缓冲液以及标记缓冲液、磁珠；按照磁珠分选试剂盒操作要求进行细胞分选获得CD166⁺MSCs亚群。

⑤取适量细胞转入流式管中，加入抗-CD45、抗-Ter119、抗-CD166混匀，2-8℃染色20min后，流式仪上机分析细胞，结果见图1A,B；所获得的细胞在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养7天后，光镜照片如图1C。

IBD小鼠模型是化学诱导疾病模型，例如DSS、TNBS、恶唑酮等诱导的疾病模型，化学诱导的IBD模型的主要优点是造模成本相对低且易于开发。以下实施例采用DSS诱导的IBD小鼠模型，DSS是带负电荷的硫酸化多糖，小鼠食用后会破坏上皮细胞，然后，非特异性免疫细胞释放细胞因子，导致结肠发炎，特点是溃疡和粒细胞浸润。DSS诱发结肠炎模型的常见用途包括研究先天免疫系统如何参与肠道炎症，以及寻找在损伤期间/之后维持或重建上皮完整性的重要环节。

实施例2.炎性肠病IBD小鼠模型的建立

①采用C57/BL6小鼠自由饮用3％DSS溶液7d，隔天换入新的DSS溶液。

②每天观察、记录两组模型小鼠的一般情况、体重、粪便、隐性或显性出血情况以及活动力，并根据临床评分标准(表1)进行评分；小鼠经过7天自由饮用3％DSS水，出现了腹泻、血便、体重减少等症状，临床评分逐日提高(图2A-B)；解剖后发现DSS组小鼠结肠明显缩短，局部糜烂、出血(图2C-D)；取部分结肠清洗干净，用4％多聚甲醛固定，石蜡切片并做HE染色，显微镜观察拍照，并作组织学病理分析。结肠病理切片HE染色显示，隐窝破坏，杯状细胞减少，组织病理学评分升高，符合急性炎症的特征(图3)。

表1.IBD小鼠模型临床评分标准

注：半成形大便：大便松散，不黏附于肛门，呈糊状；水样便：可黏附于肛门的稀便。临床分数为各项分数相加。

实施例3.CD166⁺MSCs细胞输注治疗

①将上面获得的CD166⁺MSCs通过静脉注射方式，给予IBD模型小鼠进行输注治疗，输注量为CD166⁺MSCs输注量为5×10⁵/只。

②每日称量小鼠体重，观察大便性状及血便情况，并参照上述方法做临床评分。

③移植输注3天后，处死小鼠，解剖结肠，并做病理切片组织染色分析。

与未进行MSCs亚群细胞移植治疗的IBD模型小鼠相比，CD166⁺MSC移植输注后，IBD模型小鼠的临床评分、结肠长度以及结肠组织病理情况都有好转(图4)；结肠长度明显增加，组织病理学切片中的隐窝破坏较少，杯状细胞增多，组织病理学评分较低。

这些结果说明：对于IBD疾病模型移植CD166⁺MSCs可获得较显著的临床治疗效果。

Claims (2)

1.骨相关间充质干细胞CD166⁺亚群的制备方法，其特征在于，包括：利用抗-CD45抗体、抗-Ter119抗体和抗-CD166抗体对骨相关间充质干细胞进行分选得到骨相关间充质干细胞CD166⁺亚群。

2.权利要求1所述方法制备的骨相关间充质干细胞CD166⁺亚群用于制备治疗炎症性肠病药物的应用。

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