JP6047403B2 - 幹細胞免疫変調の使用方法及び装置 - Google Patents

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関連出願
本願は、２００９年１２月８日出願の特許文献１「幹細胞エデュケーター及び臨床応用」及び２００９年１２月８日出願の特許文献２「幹細胞の免疫変調及びその分子機構」の恩典を主張するものであり、参照によりこれらの開示の全内容を本明細書に組み入れる。本願はまた、２００８年４月７日出願の特許文献３「ヒト臍帯血由来胚様幹細胞の単離」の一部継続出願であり、これも同様に参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。

本発明は一般に、自己免疫疾患及び免疫障害関連疾患の処置のための方法及び装置に関する。

ヒト自己免疫疾患及び免疫障害関連疾患、例えば、心血管疾患、糖尿病及び神経変性疾患の罹患率の高まりは、より有効な療法を探す挑戦となって表れている。幹細胞（胚幹細胞及び成体幹細胞を含む）に基づく療法は再生医療の合理的治療ツールを提供し、近代の療法に変革をもたらす可能性がある。胚幹(embryonic stem)（ＥＳ）細胞は、その高い自己再生能及び多分化能のために、極めて活発な発明分野となっている。しかしながら、倫理的な問題がそれらの利用可能性及び実用有効性を制限している。これらの倫理的問題を別としても、ＥＳ細胞を作出するための体外受精(in vitro fertilization)（ＩＶＦ）及び改変核移植(altered nuclear transfer)（ＡＮＴ）の使用は、必要とされる技術が複雑なため問題となっている。

近年、ヒト臍帯血が、造血系及び他の器官を再増殖させるための幹細胞の供給源として用いられてきた。臍帯血は、間葉系幹細胞及び単球由来幹細胞を含む幹細胞の作出のための豊富な供給源となる。ＥＳ分子マーカーを発現する幹細胞は、造血系細胞の除去（全ての白血球共通抗原ＣＤ４５陽性細胞の欠損を含む）後の臍帯血から報告されている。しかしながら、臍帯血におけるこの細胞集団の欠乏によって、その実用的適用が著しく制限される。

胚由来ではなく成体由来の他の数種の胚様幹細胞も開示されている。例えば、特許文献４〜１１は、胎盤または臍帯血から得られる胚様幹細胞を開示している。特許文献１２は、臍帯羊膜に由来する胚様幹細胞を開示している。これらの特許または特許出願に開示されている幹細胞は、ＣＤ４５マーカーを発現しない（ＣＤ４５⁻）間葉由来のものである。別の例では、特許文献１３は、ヒト骨髄に由来する幹細胞を開示している。Zhao及びＭazzoneによる特許文献１４は、幹細胞療法に好適な臍帯血からの胚様幹細胞の単離を開示している。さらにZhao及びMazzoneによる特許文献１５は、これもまた幹細胞療法に好適な末梢血からの胚様幹細胞の単離を開示している。

米国仮特許出願第６１／２８３７８２号 米国仮特許出願第６１／２８３８１０号 米国特許出願第１２／０９９０５４号 米国特許第７０４５１４８号 米国特許出願第２００５／０１４８０３４号 米国特許出願第２００５／０１１８７１５号 米国特許出願第２００４／００２８６６０号 米国特許出願第２００３／０２３５９０９号 米国特許出願第２００２／０１６０５１０号 米国特許出願第２００３／０１８０２６９号 国際公開第０３／０６８９３７号 米国特許出願第２００６／００７８９９３号 米国特許出願第２００６／０１４７４２６号 国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ０６／３８５２４号 国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ０７／２２２６０号

J. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press;第3版, 2001 F. M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, CurrentProtocols;第5版, 2002 E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1988

自己免疫疾患を処置するための機構として自己反応性免疫細胞を教育するために、胚様幹細胞の特徴を有する幹細胞を用いる方法及び装置を提供する。

本発明の一態様では、リンパ球を変調し、自己反応性Ｔ細胞を抑制するためのバイオリアクタであって、正電荷を有し、及び／または疎水性の少なくとも１つの支持体表面を備えたチャンバと、支持体表面に付着された幹細胞の集団と、チャンバにリンパ球を導入するための流入コンジットと、幹細胞と同時培養した後に処置済みのリンパ球を抜き取るための流出コンジットとを備えたバイオリアクタを開示する。

バイオリアクタの支持体表面は１以上のシート層として形成され得る。あるいは、支持体表面は複数の微小担体により形成されてもよい。さらに別の実施形態では、支持体表面は透過膜層であり得る。

いくつかの実施形態では、支持体表面は、幹細胞が容易に付着するポリスチレンなどの疎水性ポリマーを含む。幹細胞は、支持体表面で少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％もの集密度を示し得る。バイオリアクタは好ましくはチャンバ内に少なくとも１０^６個の幹細胞の集団を担持する。いくつかの場合では、幹細胞はチャンバ内にリンパ球に対して少なくとも１：１０の比率で存在する。

バイオリアクタのチャンバは、幹細胞とリンパ球の間の細胞間接触を許容するように、または（例えば、処置済みのリンパ球をチャンバから取り出す際に幹細胞の同伴を避けるために）このような細胞間接触を妨げるように構成することができる。さらに、これらの幹細胞をチャンバ内の複数の支持体表面層で培養することができる。

幹細胞は臍帯血または末梢血から得ることができる。幹細胞はリンパ球に対して同種であるか、またはリンパ球に対して自己であり得る。

本発明の別の態様では、自己免疫障害を抑制するためのシステムであって、被験体から血液を抜き取るための流体コンジットと；抜き取られた血液からリンパ球を分離するためのアフェレーシス装置と；幹細胞集団が支持体表面に付着され得るように、正電荷を有し、及び／または疎水性の少なくとも１つの支持体表面を備えたチャンバと、そのチャンバにリンパ球を導入するための流入コンジットと、幹細胞と同時培養した後に処置済みのリンパ球を抜き取るための流出コンジットとを含むバイオリアクタと；処置済みのリンパ球を被験体に戻すための流体コンジットと、を含むシステムを開示する。バイオリアクタは上記の要素、特徴または機能の全てまたはいずれかを備えることができる。

本発明の別の態様では、自己反応性Ｔ細胞による自己免疫障害を抑制する方法であって、処置を必要とする被験体から血液を抜き取る工程、抜き取られた血液からリンパ球を単離する工程、そのリンパ球を幹細胞に曝し、その結果、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞が活性化されて自己反応性Ｔ細胞を抑制する工程、及び処置済みのリンパ球の少なくとも一部を被験体に戻す工程を含む方法を開示する。例えば、その方法は自己免疫障害が糖尿病である場合に実施可能である。

リンパ球を幹細胞に曝す工程は、リアクタ内で幹細胞を培養すること（例えば、正味の正電荷を有する支持体表面で幹細胞をコンフルエントに達するまで増殖させることによる）、及びそのリアクタに被験体のリンパ球を導入することをさらに含み得る。

その方法は、被験体のリンパ球に対して同種または自己である幹細胞を用いて実施され得る。幹細胞は臍帯血または末梢血から得ることができ、例えば、被験体自身の末梢血から得られる自己幹細胞である。

バイオリアクタ内で幹細胞を培養する工程は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む末梢血を回収すること；ＰＢＭＣを培養し、その結果、ＰＢＭＣが胚様幹細胞に戻ること；その胚様幹細胞を単離すること；及びその胚様幹細胞をリアクタの表面に付着させることをさらに含み得る。

その方法は、幹細胞によるプログラムされた細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の発現によりＴｒｅｇ細胞を変調することを含むことができ、及び／またはこの場合、Ｔｒｅｇ細胞は幹細胞による酸化窒素（ＮＯ）の放出により活性化される。その方法は、幹細胞との細胞間接触による、及び／またはリアクタ内の幹細胞により分泌された可溶性因子による、Ｔｒｅｇ細胞の活性化を含み得る。この調節性（Ｔｒｅｇ）細胞を活性化する方法は、Ｔｒｅｇ細胞を、カルボキシペプチダーゼＭ（ＣＰＭ）を発現する幹細胞もしくはブラジキニンＢ１受容体を発現する幹細胞に曝すことをさらに含むことができるか、またはＴｒｅｇ細胞を、自己免疫レギュレーター（ＡＩＲＥ）タンパク質を発現する幹細胞に曝すことによるものである。

変調／活性化されたＴｒｅｇ細胞は、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ６９マーカーの少なくとも１つ、好ましくはこれらのマーカーの全ての発現によって特徴付けることができる。

一実施形態では、血液を抜き取る工程及び処置済みのリンパ球を被験体に戻す工程を連続的に行うことができる。例えば、被験体の血液は、少なくとも１リットルの被験体血液を抜き取るのに十分な時間、連続的に処置することができる。

別の態様において、本発明は、被験体から胚様幹細胞を採取する方法であって、胚様幹細胞を含む供給源から幹細胞を抽出すること；その幹細胞を増殖培地で培養し、その結果、幹細胞が胚様幹細胞に戻ること；及びその胚様幹細胞を単離することを含む方法を開示する。いくつかの実施形態では、増殖培地は血清含有培地及び血清非含有培地を含み得る。これらの細胞はin vitro増殖にフィーダー細胞層を必要とせず、in vivo増殖時に奇形腫を形成しない。培養は、ポリスチレンまたは他の好適なプラスチック材料及びガラスなどの疎水面を備えた表面に幹細胞を播種することをさらに含み得る。

いくつかの実施形態では、胚様幹細胞は、オクタマー結合転写因子４（Ｏｃｔ−４）、Ｎａｎｏｇホメオボックス（Ｎａｎｏｇ）、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス２（Ｓｏｘ−２）、ＣＤ９、ＣＤ４５、カルボキシペプチダーゼＭ（ＣＰＭ）、ブラジキニンＢ１受容体（Ｂ１Ｒ）及びプログラムされた細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の少なくとも１つを発現する。別の実施形態では、胚様幹細胞は、誘導型酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）を発現する。さらに別の実施形態では、胚様幹細胞は、自己免疫レギュレーター（ＡＩＲＥ）を発現する。

別の態様において、本発明は、それを必要とする被験体においてリンパ球またはリンパ球機能を教育及び変調する方法であって、第一の胚様幹細胞集団を、リンパ球を含む第二の細胞集団と同時に培養すること、同時培養後に少なくとも処置済みの第二の細胞集団を被験体に投与することを含む方法を開示する。これらのリンパ球（Ｔリンパ球及びＢリンパ球を含む）はヒト末梢血由来の同種リンパ球または自己リンパ球であり得る。リンパ球を胚様幹細胞とともに培養すると、リンパ球が変調される。例えば、この変調は自己抗原の発現を媒介することを含み得る。別の実施形態では、胚様幹細胞はＣＤ４＋、ＣＤ６２Ｌ＋ Ｔリンパ球を変調する。その方法は酸化窒素（ＮＯ）産生を上方制御することを含み得る。さらに別の実施形態において、方法は自己免疫レギュレーター（ＡＩＲＥ）の発現の増強を含み得る。いくつかの実施形態では、その方法はＩ型糖尿病の症状を治療する、改善する、またはその発症を遅延させるために使用することができる。

さらに別の態様において、本発明は、それを必要とする哺乳動物被験体において糖尿病を治療する方法であって、被験体から少なくとも１種類の自己免疫リンパ球を取り出すこと、胚様幹細胞をそのリンパ球と同時培養すること、及びそのリンパ球を再び被験体に投与して糖尿病を治療することを含む方法を開示する。一実施形態では、リンパ球は被験体の末梢血から取り出される。この被験体はリンパ球を得るためにサイタフェレーシス下にあってもよい。別の実施形態では、リンパ球はＣＤ４＋、ＣＤ６２Ｌ＋ Ｔリンパ球である。この投与工程は、例えば静脈注射または動脈注射などの任意の好適な方法によるものであり得る。これらの細胞は被験体当たり約１×１０^４〜１×１０^１３細胞の量で投与することができる。その方法はインスリン依存性糖尿病の症状を治療または改善するために使用することができる。いくつかの実施形態では、リンパ球は末梢血からサイタフェレーシスにより得られる。

別の態様において、本発明は、幹細胞を第二の細胞集団と同時培養するための装置を開示する。その装置は、ある層から別の層へ細胞及び／または液体を通過させるための流通孔を備えた複数の幹細胞層が多層化したものであり得る。一実施形態では、その装置はポリスチレンまたは他の好適なプラスチック材料及びガラスなどの疎水面を備えた表面を有する。別の実施形態では、幹細胞はその装置の表面に付着される。その装置はさらに流入口と流出口を備えることができる。第二の細胞集団は流入口から装置へ流入する。この第二の集団は幹細胞と同時培養された後、装置の流出口から流出され得る。この装置はまた、第二の細胞集団を供給する連続流入及び同時培養された細胞を取り出す連続流出と直接接続して閉系としてもよい。連続流入はアフェレーシス装置などの供給源から供給することができる。別の実施形態では、連続流出はアフェレーシス装置などの供給源により取り出すことができる。

その装置はさらに幹細胞と第二の細胞集団の間に膜セパレータを含んでもよい。この膜は多孔質膜であり得る。この多孔質膜は幹細胞に膜を通過させないよう十分小さな孔を備えている。別の実施形態では、この多孔質膜は膜の一方の側から反対側へ因子を通過させるのに十分大きな孔を備えている。一実施形態では、多孔質膜の一方の表面に幹細胞を付着させる。別の実施形態では、この孔は平均幹細胞サイズの約半分以下である。

単針法によるブラッド・セル・セパレータＭＣＳ＋を用いた、自己免疫障害の処置のための本発明のシステムの概略説明図 本発明のシステムで用いるための幹細胞バイオリアクタの説明図 本発明のシステムで用いるための幹細胞バイオリアクタの別の実施形態の説明図 （Ａ）ヒト臍帯血幹細胞ＣＢ−ＳＣは、同種リンパ球の増殖を刺激することなく低い免疫原性を呈することを示すグラフ（Ｂ）in vitroにてＣＢ−ＳＣと同時培養した後のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇ、ＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋Ｔｒｅｇ、及びＣＤ４^＋ＣＤ６２Ｌ^＋Ｔｒｅｇのパーセンテージを示すグラフ（Ｃ）in vitroにてＣＢ−ＳＣと同時培養した後のＣＤ４^＋ＣＤ６２Ｌ^＋ＴｒｅｇにおけるＣＤ２５及びＦｏｘｐ３発現のフロー解析を示すグラフ（Ｄ）細胞内サイトカイン染色の後のＣＤ４^＋ＣＤ６２Ｌ^＋Ｔｒｅｇのフロー解析を示すグラフ。アイソタイプ適合ＩｇＧを対照とした。 （Ａ）ＣＢ−ＳＣにより変調されたＣＤ４^＋ＣＤ６２Ｌ^＋Ｔｒｅｇ細胞（ｍＣＤ４ＣＤ６２ＬＴｒｅｇ）は糖尿病ＮＯＤマウスにおいて高血糖を矯正し得ることを示すグラフ。精製した対照ＣＤ４ＣＤ６２ＬＴｒｅｇを対照とした（合計５００万細胞／マウス、ｉ．ｐ．、青い線、ｎ＝マウス５匹）。ＰＢＳをさらなる対照とした（黒い線、ｎ＝マウス５匹）。（Ｂ）最初のｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇ処置から３週間後の腹腔内ブドウ糖負荷試験(intraperitoneal glucose tolerance testing)（ＩＰＧＴＴ）を示すグラフ。７週齢のＮＯＤマウスを正常対照とした。（Ｃ）ＥＬＩＳＡによる血液インスリンレベルの測定を示すグラフ（Ｄ）マウス体重に対する処置の影響を示すグラフ （Ｅ）膵β細胞量の形態計測解析を示す。膵β細胞量は、インスリン陽性膵島β細胞に対するポイントカウント形態計測と、その後のモルモット抗インスリンＡｂ(Dako)による免疫染色とヘマトキシリンによる対比染色によって測定したグラフ（Ｆ）Ｋｉ６７及びインスリンＡｂによる二重免疫染色後の膵島におけるＫｉ６７陽性細胞の定量を示すグラフ。アイソタイプ適合ウサギＩｇＧをウサギ抗Ｋｉ６７ ｍＡの対照とした。 （Ａ）ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇによる処置は、糖尿病ＮＯＤマウスのインスリン炎及び免疫不全を逆転させることができることを示すグラフ。ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇによる処置は顕性１型糖尿病ＮＯＤマウスのインスリン炎を矯正する。（Ｂ）種々のタイプのインスリン炎の代表的な画像。データはｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇで処置した糖尿病ＮＯＤマウスから収集したものである。スケールバーは５０μｍ。（Ｃ）６週齢のマウスにおけるＥＬＩＳＡによる血漿ＩＦＮ−γレベルの測定を示すグラフ（Ｄ）ＥＬＩＳＡによる血漿ＩＬ−４レベルの測定を示すグラフ （Ｅ）ＥＬＩＳＡによる血漿１Ｌ−１０レベルの測定を示すグラフ（Ｆ）ＥＬＩＳＡによる血漿ＴＧＦ−β１レベルの測定を示すグラフ 膵島においてＴＧＦ−β１発現を増強することによるｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇ処置からの、膵島における浸潤免疫細胞のアポトーシス結果を示すグラフ Ｔ１Ｄ患者から単離し、１０μｇ／ｍｌ ＰＨＡの存在下または不在下でＣＢ−ＳＣとＣＢ−ＳＣ：リンパ球の比率を１：１０として同時培養したリンパ球を示す。２４時間後に浮遊しているリンパ球をフロー解析のために回収した（Ａ及びＢ）。（Ａ）細胞内サイトカイン染色を示すグラフ（Ｂ）細胞内Ｆｏｘｐ３染色を示すグラフ（Ｃ）細胞増殖アッセイを示すグラフ。Ｔ１Ｄ患者由来ＧＡＤ特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞クローンを、抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び特異的ＧＡＤペプチドまたは非特異的対照プロインスリンペプチドの存在下で、ＣＢ−ＳＣと３日間同時培養した。 （Ａ）ＣＢ−ＳＣにおけるＣＰＭ、Ｂ１Ｒ及びｉＮＯＳの発現を示す写真。アイソタイプ適合ＩｇＧを免疫染色の対照とした。倍率は４００倍。（Ｂ）ＮＯ産生のリアルタイムアッセイを示すグラフ （Ｃ）ＮＯ産生のリアルタイムアッセイを示すグラフ（Ｄ）ＣＰＭ阻害剤ＭＧＴＡ（１０μＭ）及びＢ１ＲアンタゴニストＤＡＬＫＤ（２μΜ）の存在下でＣＢ−ＳＣと同時培養される、有糸分裂促進剤ＰＨＡ刺激リンパ球の同時培養実験を示すグラフ （Ａ）Ａｉｒｅ遺伝子のリアルタイムＰＣＲ解析とその後の２％アガロースゲルでの電気泳動を示す写真（Ｂ）転写因子Ａｉｒｅの免疫細胞化学を示す写真。ＡＩＲＥ染色（右）の対照としてアイソタイプ適合ＩｇＧを用いた（左）。倍率は２００倍。データは８つのＣＢ−ＳＣ調製物の代表例である。 （Ａ）ウエスタンブロットにより示されるＡｉｒｅ ｓｉＲＮＡの用量応答を示す写真。４０ｎＭの陰性対照ｓｉＲＮＡ（ＮＣ）を対照とした。（Ｂ）３対のＡｉｒｅ特異的ｓｉＲＮＡ（Ｐ１、Ｐ２及びＰ３）を用いたウエスタンブロットを示す写真（ＡＩＲＥ、ＣＰＭ及びＰＤ−Ｌ１発現をタンパク質レベルでノックアウトすることができた）。β−アクチンを内部対照とした。（Ｃ）Ｆｏｘｐ３発現に対するフロー解析を示すグラフ。成体末梢血から単離されたリンパ球を、５０ｎＭ Ａｉｒｅ ｓｉＲＮＡ及び陰性対照（ＮＣ）ｓｉＲＮＡの存在下で、リンパ球：ＣＢ−ＳＣの比率１：１０でＣＢ−ＳＣと同時培養した。２４時間ＰＨＡ刺激を行った後、フロー解析のために細胞を回収した。 本発明のシステムで用いるための幹細胞バイオリアクタの写真

本発明は、幹細胞の新規な使用のための方法及び装置を開示する。これらの幹細胞は臍帯血または末梢血由来のものであり得る（間葉由来ではない）。これらの細胞は簡単な技術を用いて単離及び拡張することができる。本発明の特に有用な態様は、自己幹細胞療法の場合にはこれらの細胞を個体、特に成体個体の末梢血から単離することができ、または非自己幹細胞療法のBAAにはこれらの細胞を別の個体から単離することができるというものである。本発明はまた、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞（ＤＣ）及び顆粒球などの単核細胞の機能を変調する上での幹細胞の使用も開示する。

好ましい実施形態では、幹細胞は、限定されるものではないが、幹細胞マーカーであるＯｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ及びＳｏｘ−２、ならびに他の胚幹（ＥＳ）細胞関連遺伝子、例えば、ジンクフィンガー及びＳＣＡＮドメイン含有１０（ＺＮＦ２０６、別名ＺＳＣＡＮ１０）、Ｚｉｃファミリーメンバー３ヘテロタキシー１（ＺＩＣ３）、Ｚｉｃファミリーメンバー２（ＺＩＣ２）、成長関連タンパク質４３（ＧＡＰ４３）、ＰＲドメイン含有１４（ＰＲＤＭ１４）、タンパク質チロシンホスファターゼ受容体型Ｚポリペプチド１（ＰＴＰＲＺ１）、ポドカリキシン様（ＰＯＤＸＬ）、ポリホメオティックホモログ１（ＰＨＣ１）、ジンクフィンガータンパク質５８９（ＺＮＦ５８９）、カルボキシペプチダーゼＭ（ＣＰＭ）、ブラジキニンＢ１受容体（Ｂ１Ｒ）（配列番号１）及びプログラムされた細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）を含む特徴を有する。別の実施形態では、胚様幹細胞は誘導型酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）を発現する。さらに別の実施形態では、胚様幹細胞は自己免疫レギュレーター（ＡＩＲＥ）（配列番号２）を発現する。Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ及びＳｏｘ−２の配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２７０１、Ｚ１１８９８及びＱ０１８６０；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２４８６５及びＮＰ＿０７９１４１；ならびにＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ３１５６０及びＣＡＡ８３４３５として見出すことができる。

別の実施形態では、幹細胞はまた、白血球共通抗原ＣＤ４５の発現を特徴とする造血系の特性も持ち得る。さらなる実施形態では、幹細胞は、ＣＤ３、ＣＤ２０（Ｂリンパ球細胞表面抗原Ｂ１、受託番号Ｍ２７３９４）、ＣＤ１１ｃ（インテグリン、αＸ、受託番号ＮＭ＿０００８８７）、ＣＤ１１ｂ／Ｍａｃ−１（補体成分３受容体３サブユニット、受託番号ＮＭ＿０００６３２）及びＣＤ１４（受託番号ＮＭ＿００１０４００２１及びＰ０８５７１）マーカーを発現しない。さらに別の実施形態では、幹細胞はＣＤ３４マーカー（造血前駆細胞抗原ＣＤ３４、受託番号Ｐ２８９０６）を発現しない。

本発明はまた、糖尿病（１型、１．５型及び２型を含む）などの自己免疫障害及び疾患の発症を予防するもしくは遅延させる、ならびに／またはその障害及び疾患を逆転させるもしくは治療するための幹細胞の使用も開示する。実施例に示されるように、幹細胞と同時培養した後、種々のＴリンパ球集団を単離し、糖尿病などの自己免疫障害及び疾患の発症を予防するもしくは遅延させる、ならびに／またはその障害及び疾患を逆転させるもしくは治療するために、被験体に投与することができる。例えば、ＣＤ６２Ｌマーカー（記憶リンパ球のマーカー）が陽性のＴ細胞を単離することができる。

ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ６９＋ Ｔ細胞は、リスクのある被験体において糖尿病の発症を有意に遅延させることができる。例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ６９＋ Ｔ細胞の投与は、糖尿病ＮＯＤマウスの自己免疫応答の初期段階を変調し、糖尿病の発症を有意に遅延させることが示されている。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ６９＋ Ｔ細胞のいずれかを投与した後、糖尿病などの自己免疫障害または疾患は逆転されて正常血糖に到達し得る。

本発明はさらに、本発明の胚様幹細胞を含む幹細胞に基づく療法のための方法及び装置を開示する。一実施形態では、幹細胞は、哺乳動物被験体において糖尿病などの自己免疫疾患及び免疫障害関連疾患を治療するために用いられる。

さらに別の実施形態では、本発明は、少なくとも１種類の自己免疫リンパ球の免疫調節のための方法を開示する。その方法は成人末梢血のサンプルを準備すること；そのサンプルからリンパ球を抽出すること；そのリンパ球を幹細胞と同時培養すること；同時培養物からリンパ球を採取し、そのリンパ球を再び被験体に投与することを含む。幹細胞はバイオリアクタの表面に付着させることができる。さらに、幹細胞は細胞フィーダー層を必要としない。本発明は幹細胞に基づく同時培養療法、自己及び非自己細胞療法に好適である。

調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）はホメオスタシスの維持、ならびに免疫抑制サイトカインであるインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）及び／またはトランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）の放出などの、自己反応性エフェクターＴ細胞に対する阻害的影響による自己寛容に重要な役割を果たす。細胞数または機能のいずれかにおけるＴｒｅｇの異常が糖尿病などの自己免疫疾患の誘発及び進行に関連することを示す証拠が増えつつある。自己免疫疾患の治療のためのＴｒｅｇの操作は新規のアプローチである。自己免疫性糖尿病に対する保護を与えるために、損なわれたＴｒｅｇ機能の回復に焦点を当てた研究は少数ながら存在するが、Ｔｒｅｇ機能の変調に焦点を当てたものはない。本明細書に開示される幹細胞はＴｒｅｇの機能的欠陥を補正し、糖尿病などの顕性自己免疫疾患の逆転をもたらし得る。

一態様において、本発明の幹細胞はＴリンパ球と同時培養し、それにより、糖尿病を予防し、遅延させ、治療し、及び／または軽減することができる種々のＴ細胞集団の産生を増強することができる。いくつかの実施形態では、同時培養されたリンパ球は、糖尿病などの自己免疫障害の発症を遅延させるため、その障害を軽減するため、または改善するために被験体に投与することができる。他の実施形態では、同時培養されたリンパ球は、少なくとも１つのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ６９＋Ｔ細胞を含み得る。さらに他の実施形態では、ＣＤ６２Ｌが陽性であり、かつ、ＣＤ６９またはＣＤ４の少なくとも１つが陽性であるＴ細胞を、糖尿病などの自己免疫障害の少なくとも１つの症状を軽減するために、または被験体における障害を改善するために投与することができる。例えば、同時培養されたリンパ球を被験体に投与し、被験体のグルコースレベルをその被験体の正常範囲のレベルにまで引き下げることができる。いくつかの実施形態では、同時培養されたリンパ球は、リンパ球増殖因子を使用することにより、in vitroで拡張することができる。同時培養されたリンパ球の集団及び／または同時培養されたリンパ球の特定の部分集団（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ６９＋ Ｔ細胞など）を拡張するために使用可能な増殖因子の限定されない例。

Ｉ．定義
本発明に用いられる用語は一般に、分子生物学の熟練者により一般に認識されている定義を遵守するものとする。以下に挙げるようないくつかの例外を本発明の範囲内でさらに定義した。

本明細書において「胚幹細胞」とは、胚盤胞（例えば、４〜７日齢のヒト胚）の内部細胞塊に由来し、多能性である幹細胞を指す。「胚様幹細胞」、「幹細胞」、「臍帯血幹細胞（ＣＢ−ＳＣ）」及び「臍帯血由来インスリン産生細胞（ＣＢ−ＩＰＣ）」、「末梢血幹細胞（ＰＢ−ＳＣ）」及び「末梢血由来インスリン産生細胞（ＰＢ−ＩＰＣ）」の用語は、本明細書では胚盤胞の内部細胞塊に由来しない幹細胞を指して互換的に用いられる。胚様幹細胞は多能性である。胚様幹細胞は、胚幹細胞（ＥＳ）及び造血細胞の特徴の、少なくともサブセットを示す。「幹細胞」とは、組織及び器官の特化した細胞を形成するために無限に再生可能なマスター細胞を指す。幹細胞は発生上、多能性細胞である。幹細胞は分裂して２つの娘幹細胞か、または１つの娘幹細胞と１つの前駆（「移行(transit)」細胞を生じることができ、この移行細胞はその後、増殖して組織の成熟した、完全に形成された細胞となる。本明細書で用いられる「幹細胞」は、そうではないことが示されない限り、「前駆」細胞を含む。

本明細書において「多能性(pluripotential)」、「多分化能性(pluripotential for
differentiation)」または「多能性(pluripotent)」とは、限定されるものではないが、細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ及びＳｏｘ−２などの１以上の多能性マーカーについて陽性であること、及びこの細胞が、適当な増殖因子によるなどの適当な刺激の際に、哺乳動物身体のおよそ２６０の細胞種の少なくともサブセットに分化する能力を有することを指す。

本明細書において「全能性細胞」とは、完全な胚を形成することができる細胞（例えば、胚盤胞）を指す。

「被験体」とは、免疫応答が惹起される任意の生物体を指す。この用語は、望まないまたは所望でない微生物が関わる症状に対する処置（例えば、下記に定義されるような望まない病的細胞を有する症状に対する特定の処置）を必要とする、またはその症状に感受性のある、生きている動物またはヒトを指す。被験体は、限定されるものではないが、ヒト、チンパンジーならびに他の類人猿及びサル種などの非ヒト霊長類；畜牛、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマなどの農用動物；イヌ及びネコなどの飼い哺乳動物；マウス、ラット及びモルモットなどの齧歯類を含む実験動物などが挙げられる。この用語は特定の齢または性を表すものではない。従って、雄であれ雌であれ、成体及び新生被験体、ならびに胎児を包含するものとする。好ましい実施形態では、被験体は、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物である。最も好ましい実施形態では、被験体はヒトである。

本明細書において「未分化」とは、より特化した細胞の特徴を発現していない多能性胚幹細胞を指す。当業者に認識されているように、「未分化」と「分化」は互いに相対的なものである。「分化」した幹細胞はより特化した細胞の特徴を有する。分化細胞と未分化細胞は、相対的大きさ及び形状などの形態的特徴、細胞質容量に対する核容積の比率、及び発現の特徴（例えば、既知の分化マーカーの検出可能な存在）を含む、いくつかの十分に確立された基準により、互いに区別される。細胞が分化しているか未分化であるかを示す分化マーカーとしては、分化細胞に特異的なタンパク質、炭水化物、脂質、核酸、機能的特徴及び／または形態的特徴が挙げられる。

本明細書において、細胞に対して適用される「実質的に均質」とは、集団中の少なくとも約７０％、好ましくは約８０％、より好ましくは９０％の細胞が同じ細胞種である細胞集団を指す。細胞種の例としては、限定されるものではないが、胚様幹細胞、β細胞様インスリン産生細胞、神経細胞、心筋細胞、巨核細胞、内皮細胞、上皮細胞、赤血球、リンパ球、単球、マクロファージ、顆粒球、肝細胞、腎性細胞、脂肪生成細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肺胞細胞、心臓細胞、腸管細胞、腎臓細胞、及び網膜細胞などが挙げられる。いくつかの実施形態では、「実質的に均質」は、集団中の少なくとも約７０％、好ましくは約８０％、より好ましくは９０％の細胞が未分化である細胞集団を表す。さらなる実施形態では、実質的に均質な細胞集団は、９５％を超える細胞が未分化である細胞集団である。別の実施形態では、実質的に均質な細胞集団は、９９％を超える細胞が未分化である細胞集団である。細胞集団の１以上の分化マーカーをアッセイすれば、その細胞集団が実質的に均質かどうかを判定することができる。

胚様幹細胞及び／または分化細胞種の実質的に均質な集団の生産及び／または維持は、その細胞集団を、未分化細胞及び／または分化細胞の特定のマーカーについて評価することによって測定することができる。例えば、Ｏｃｔ４などの未分化細胞のマーカー、ネスチン及びＮｇｎ−３などの神経前駆体マーカー、ならびにβチューブリン及びＴＰＨ２などの成熟ニューロンマーカーのマーカーの転写産物の相対比は定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価される。また、未分化細胞のマーカーの産生及び局在は免疫細胞化学によって評価することができる。

未分化幹細胞及び分化細胞のマーカーは、特定のマーカーに特異的な抗体を用いた抗体に基づく検出技術などの種々の方法のいずれかによってアッセイされる。抗体に基づく技術は免疫蛍光及び免疫ブロット法を含む。さらなるアッセイとしては、特定のマーカーをコードするｍＲＮＡの検出のためのアッセイがある。このようなアッセイには、ポリメラーゼ連鎖反応、ブロットハイブリダイゼーション（ノーザンブロットとしても知られる）及びin situハイブリダイゼーションが含まれる。これらの、またその他のこのようなアッセイの詳細は本明細書に、また、非特許文献１〜３をはじめとする標準的な参考文献に記載されている。

本明細書において「リンパ球」及び「白血球」は互換的に用いられ、一般に、限定されるものではないが、白血球、Ｔ細胞及びＢ細胞、Ｔリンパ球、エフェクターＴ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、未熟Ｔ細胞、Ｂリンパ球、未熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、造血系抗原提示細胞、記憶Ｂ細胞を含む造血系単核細胞を指す。

本明細書において「培養培地」とは、一般に、生細胞の培養に用いられる任意の物質または調製物を指す。「細胞培養」とは、in vitroにおける細胞の増殖であり、細胞は増殖するが、それ自体、組織へと組織化しない。

本明細書において「治療」とは、障害及び／またはそれに関連する症状を軽減または改善することを指す。除外されるものではないが、障害または病状の治療は、その障害またはそれに関連する病状もしくは症状が完全に除去されることを必要としない。本明細書において「予防」とは「予防的処置」を含み、この予防的処置とは、障害または病状を持たないが、障害または病状を発症するリスクがある、または発症しやすい被験体において、その障害または病状を発症する確率を軽減することを指す。

「投与」とは、本明細書を通じ、本発明の胚様幹細胞が被験体に送達されるプロセスを表して用いられる。胚様幹細胞は、必要とされる部位へこれらの細胞を遊走させる方法の中でもとりわけ、非経口（この用語は静脈経路及び動脈経路ならびに他の適当な非経口経路を指す）、くも膜下腔内、脳室内、実質内（脊髄、脳幹または運動野を含む）、大槽内、頭蓋内、線条体内及び黒質内を含むいくつかの方法で投与することができる。本発明の組成物は、インデューサーで処置せずに（「非処置」、すなわち、幹細胞サンプル内の細胞の分化を促進するためにさらなる処置を行わずに）使用することもできるし、または胚様幹細胞を都合のよい表現型を示す細胞へ分化させるインデューサーもしくは他の薬剤で処置した後に使用することもきる。投与は多くの場合、処置される疾患または病状によって異なり、好ましくは非経口経路、例えば、静脈内、脳脊髄液への投与、または脳もしくは他の身体部位の罹患組織への直接投与によるものであり得る。例えば、糖尿病の場合、好ましい投与経路は膵臓への投与であるか、または循環系及び「ホーミング(homing)」を介して罹患部位への移行を可能とする静脈経路によるものであり得る。

「自己免疫障害」及び「自己免疫疾患」とは、本明細書を通じ、アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、グレーブス病、ギラン−バレー症候群、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、狼瘡腎炎、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ及びブドウ膜炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、Ｉ型糖尿病、乾癬及び種々のアレルギーなどの自己免疫症状を有する疾患を表して同義的に用いられる。

「免疫障害関連疾患」とは、本明細書を通じ、ＩＩ型糖尿病、肥満、心血管疾患、高血圧、高脂血症、慢性腎疾患、原発性糸球体腎炎；紫斑病腎炎、狼瘡腎炎、糖尿病性腎症、糖尿病性足病変及び糖尿病性眼病変などの疾患の病因に関与する免疫障害を有する疾患を表して同義的に用いられる。

「グラフト」及び「移植」とは、本明細書を通じ、本発明の胚様幹細胞または他の細胞が、それらの細胞が自己免疫疾患の治療及び糖尿病の治療などの好都合の効果を示すことを意図する部位に送達されるプロセスを表して同義的に用いられる。本発明で用いるための胚様幹細胞または他の細胞はまた、移植を行うのに適当な身体の領域への細胞遊走に頼り、上記のような任意の投与様式により身体の遠位部位に送達することもできる。

「本質的に」とは、少なくとも９０％有効、より好ましくは少なくとも約９５％有効、より好ましくは少なくとも９８％有効である細胞集団または方法を表して用いられる。従って、ある細胞集団を「本質的に」除去する方法は、標的細胞集団の少なくとも約９０％、最も好ましくは細胞集団の少なくとも約９８％を除去する。特定の実施形態に従う胚様幹細胞は、本質的に造血細胞非含有（すなわち、造血幹細胞マーカーＣＤ３４陰性）であり、本質的にリンパ球非含有（すなわち、リンパ球マーカーＣＤ３、ＣＤ２０及びＣＤ９０陰性）であり、本質的に単球／マクロファージ抗原ＣＤ１１ｂ／Ｍａｃ−１及びＣＤ１４非含有であり、本質的に樹状細胞抗原ＣＤ１１ｃ非含有であり、かつ、本質的に間葉（ＣＤ４５⁻）細胞非含有である。

「非腫瘍形成」とは、細胞が新生物または腫瘍を生じないことを指す。本発明で用いるための胚様幹細胞は一般に新生物及び癌非含有である。

ＩＩ．幹細胞の単離方法
本発明は、胚臍帯血または末梢血から単離された幹細胞集団の使用を開示する。それらは本明細書では臍帯血幹細胞（ＣＢ−ＳＣ）または末梢血幹細胞（ＰＢ−ＳＣ）と呼ぶ。本明細書において「臍帯血(umbilical cord blood)」及び「臍帯血(cord blood)」は互換的である。

本発明の方法によれば、幹細胞は、リンパ球集団との同時培養中、付着細胞集団を呈する。リンパ球は成人末梢血由来である。リンパ球はまた、限定されるものではないが、臍帯血、骨髄細胞、脾細胞、胸腺細胞、リンパ節、脂肪細胞組織及び肝細胞由来のものであってもよい。これらのリンパ球は、血清パーセンテージが低い（例えば、７％ウシ胎仔血清）極めて基本的な細胞培養培地、無血清細胞培養培地で、細胞フィーダーを用いずに同時培養することができる。付着幹細胞集団は正電荷表面に付着させることができる。この表面はまた、例えばポリスチレン及びガラスなどの疎水面であってもよい。

本発明において「単離された」によって意味されるのは、幹細胞またはリンパ球が、赤血球及び他の非付着性単核細胞など、臍帯血または末梢血に見られる他の細胞から、限定されるものではないが、機械的分離または選択培養などの１以上の単離方法によって分離される、ということである。第二の細胞集団に存在している可能性のある他の細胞種は、同時培養プロセスまたは採取プロセス中に除去され得る。好ましい実施形態では、第二の集団は５０％を超える単核細胞から構成される。さらに別の好ましい実施形態では、第二の集団は７５％を超える単核細胞から構成される。さらなる好ましい実施形態では、第二の集団は９０％を超える単核細胞から構成される。別の実施形態では、第二の細胞集団は、赤血球、骨髄細胞、脾細胞、胸腺細胞、リンパ節、脂肪細胞組織及び肝細胞の除去後、少なくとも５０％の成人末梢血由来単核細胞である。

ＩＩＩ．幹細胞の特性決定
幹細胞に基づく療法に好適であるべき幹細胞の重要な特徴の１つは、その増殖能である。本明細書において「増殖能」とは、細胞が、限定されるものではないが、Ｎａｎｏｇなどの１以上の自己再生マーカーを発現し、かつ、細胞が増殖可能であることを指す。好ましくは、細胞は無限に増殖し得る。本開示において「増殖する」によって意味されるのは、細胞を培養した際に、細胞が増殖し、数を増すことができることである。「増殖する」及び「拡張する」は本明細書において互換的に用いられる。

特定の理論に縛られるものではないが、幹細胞の低い免疫原性は、Ｔリンパ球などの免疫細胞を調節する幹細胞の能力に寄与する可能性がある。免疫細胞を幹細胞と同時培養した後、免疫細胞により産生される炎症性サイトカインの産生は少なくとも２〜３倍といった低下を見せる場合があり、他のサイトカインの産生は増加する場合がある（例えば、ＴＧＦ−β１は２〜３倍増加する）。幹細胞との同時培養によって低下され得る炎症性サイトカインの例としては、ＴＮＦ−α、ＩＬ−β、ＩＬ−γ、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１β、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−６が挙げられる。幹細胞は、免疫細胞と同時培養した際に、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞及びＩＬ−２刺激ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋調節性Ｔ細胞などの刺激免疫細胞のパーセンテージを引き下げるとともに、ＣＤ４／ＣＤ８比などの他の免疫細胞を正常化することができる。活性化Ｔリンパ球に対する負のレギュレーターであるＣＤ６９分子もまた、幹細胞と同時培養した後にＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔリンパ球などの免疫細胞で増加させることができる。さらに、幹細胞は、ＩＬ−２により刺激されたリンパ球及び／またはＰＨＡにより刺激されたリンパ球などの刺激された免疫細胞の増殖を阻害することができる。

幹細胞とリンパ球の間の細胞間接触は阻害作用を媒介し得る。幹細胞上及び／またはリンパ球上の細胞表面受容体を介した幹細胞とリンパ球の間の直接的相互作用。このような受容体としては、限定されるものではないが、カルボキシペプチダーゼＭ（ＣＰＭ）、ブラジキニンＢ１受容体（Ｂ１Ｒ）及びプログラムされた細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）が挙げられる。

酸化窒素シンターゼ阻害剤（Ｎ−ω−ニトロ−Ｌ−アルギニン、Ｌ−ＮＮＡ）での遮断により実証されるように、幹細胞によって分泌される可溶性因子（酸化窒素（ＮＯ）など）もまたこの阻害作用を媒介する。さらに、機構研究から、ＣＢ−ＳＣにより産生された酸化窒素（ＮＯ）が調節性リンパ球に対するＣＢ−ＳＣの変調機構に関与することが実証された。ＣＢ−ＳＣにより誘導されたＮＯによる、リンパ球のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）活性に対する後成的調節は、特定の誘導型酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）阻害剤１４００Ｗの存在によって有意に遮断され得る。

ＩＶ．処置方法
糖尿病は主要な健康問題である。インスリン産生細胞の欠如が、１型及び２型双方の糖尿病の重大な問題である。幹細胞由来インスリン産生細胞は、合理的な治療ツールとなり得る。この療法の成功の鍵は、倫理的問題と免疫拒絶が無く、入手、選択、培養、拡張及び分化が容易な細胞を特定する必然性である。胚幹細胞と成体幹細胞は双方とも臨床治療薬の潜在的供給源として役立ち得る。しかし、同種の胚幹細胞を適用する場合であっても、免疫系は、ヒト身体の免疫監視のために、外来細胞を認識して攻撃する。従って、自己幹細胞の適用は、潜在的に魅力的な戦略となる。ヒト骨髄及び末梢血が、ＣＤ３４^＋造血幹細胞、間葉系幹細胞及び単球由来幹細胞を含む自己幹細胞の作製の有用な供給源となることを示す証拠が増えてきている。

本発明は、哺乳動物被験体において自己免疫疾患を予防または治療する方法を開示する。自己免疫障害はアジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、グレーブス病、ギラン−バレー症候群、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、狼瘡腎炎、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ及びブドウ膜炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、乾癬及び種々のアレルギーのいずれか１つであり得る。自己免疫疾患の一例は１型糖尿病である。一実施形態では、リンパ球などの単核細胞は被験体から採取される。単核細胞はまた、限定されるものではないが、骨髄細胞、脾細胞、胸腺細胞、リンパ節、脂肪細胞組織及び肝細胞であってもよい。

臨床適用では、単核細胞は被験体の末梢血から得ることができる。これらの単核細胞はまた、単核細胞を幹細胞と同時培養して複数の幹細胞処置済み単核細胞を得ることによって、上記に開示された幹細胞で処置することができる。同時培養中、幹細胞は単核細胞と直接相互作用してそれらの機能を変調する。変調された機能は、限定されるものではないが、休止または活性化に関するマーカーの細胞表面発現の発現変化（増加または低下）、及び休止もしくは活性化または細胞死に関連する遺伝子発現の発現変化（増加または低下）によって評価することができる。単核細胞は、自己抗原に対するそれらの自己免疫の低下によって変調される。同時培養後、幹細胞処置済み単核細胞を採取することができる。幹細胞処置済み単核細胞は、自己免疫疾患を予防または治療するために再び被験体に投与することができる。好ましくは、幹細胞処置済み単核細胞は同時培養物から採取した後に被験体に投与する。別の実施形態では、幹細胞処置済み単核細胞は同時培養物から採取すると同時に被験体に投与する。

一態様において、哺乳動物被験体において自己免疫疾患を予防または治療する方法が開示され、その方法は、少なくとも１種類の単核細胞を含む被験体の末梢血から単核細胞を取り出し、その単核細胞を幹細胞と同時培養し、それにより、少なくとも１種類のリンパ球が幹細胞と同時培養され、少なくとも１種類の幹細胞処置済みリンパ球を含む同時培養単核細胞を採取し、少なくとも１種類の幹細胞処置済みリンパ球を含む同時培養単核細胞を再び被験体に投与する連続的閉系を含む。単核細胞は、限定されるものではないが、リンパ球、Ｔリンパ球、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ６９＋Ｔリンパ球、Ｂ細胞、エフェクターＴ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、未熟Ｔ細胞、Ｂリンパ球、未熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、記憶Ｂ細胞、顆粒球、単球、樹状細胞及び他の抗原提示細胞であり得る。

この連続的閉系は、被験体から末梢血を得、その被験体の末梢血から単核細胞及びリンパ球を分離するアフェレーシス技術を利用することができる。単核細胞は少なくとも１種類のリンパ球を含む。被験体の末梢血を取り出し、その末梢血中の血漿及び赤血球から単核細胞を分離し、その単核細胞を次に、幹細胞と同時培養しつつ、血漿及び赤血球を被験体に戻す装置に移すことができる。単核細胞は、単核細胞を含有する溶液を幹細胞上に送ることによって幹細胞と同時培養することができる。この同時培養物から単核細胞を取り出し、重力またはポンプ機構によって被験体へ戻す。

さらに別の実施形態では、本発明は、少なくとも１種類のリンパ球を免疫調節する方法を開示する。その方法は、成人末梢血のサンプルを準備すること；そのサンプルから赤血球を除去して単核細胞を得ること；その単核細胞を幹細胞と同時培養すること；同時培養物から単核細胞を採取し、再び被験体に投与することを含む。本発明は幹細胞に基づく同時培養療法、自己及び非自己細胞療法に好適である。

幹細胞の、単核細胞及び／またはリンパ球との同時培養は、単核細胞及び／またはリンパ球の活性化をもたらし得る。活性化は、限定されるものではないが、ＣＤ６９、ＣＤ１００、リンパ球増殖増強因子、胸腺細胞活性化因子、ＣＤ２２３など、細胞の活性化に関連する特定の遺伝子の合成を誘導し得る単核細胞及び／またはリンパ球の形態変化及び機能変化である。活性化はまた、単核細胞及び／またはリンパ球を誘導して細胞周期へ入らせることができる。活性化はまた、単核細胞及び／またはリンパ球を誘導して増殖させることができる。

本発明の別の態様では、幹細胞は、単核細胞及び／またはリンパ球と同時培養する前に、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％の集密度まで増殖させる。一実施形態では、幹細胞は単核細胞及び／またはリンパ球と、少なくとも１：２の比率で同時培養することができる。一実施形態では、幹細胞は単核細胞及び／またはリンパ球と少なくとも１：５の比率で同時培養することができる。一実施形態では、幹細胞は単核細胞及び／またはリンパ球と、少なくとも１：１０の比率で同時培養することができる。一実施形態では、幹細胞は単核細胞及び／またはリンパ球と、少なくとも１：２０の比率で同時培養することができる。一実施形態では、幹細胞は単核細胞及び／またはリンパ球と、少なくとも１：５０の比率で同時培養することができる。一実施形態では、幹細胞は単核細胞及び／またはリンパ球と、少なくとも１：１００の比率で同時培養することができる。

Ｖ．装置
図１は、被験体２から血液を抜き取るための流体コンジット１２、ならびにアフェレーシス装置１４、幹細胞リアクタ１６及び流体リターンコンジット１８を備えた、自己免疫障害の処置のための本発明のシステム１０を示す。使用時には、血液は、例えば血液ポンプを用いて流体コンジット１２を経て被験体から抜き取られ、アフェレーシス装置１４により、血液からリンパ球を分離する処置が施される。この血液は、流体リターンコンジット１８を経て患者に戻すことができる。分離されたリンパ球は幹細胞リアクタ（「幹細胞エデュケーター」）１６へ送られ、そこで、リンパ球集団の一部が、リアクタ１６内の幹細胞と相互作用することにより改質される。好ましい一実施形態では、幹細胞はＴｒｅｇ細胞を活性化し、これをリアクタ１６から取り出し、例えば流体リターンコンジット１８を経て被験体へ戻すことができる。

図２は、チャンバ２２、流体流入口２３、幹細胞２６が播種された複数の支持体表面層２４を含む、本発明の幹細胞リアクタ２０の概略図を示す。層間の流通路２５は、リンパ球を流入口２３から流路２７に沿って流出口２９へ流動させる。使用時には、請求項１のアフェレーシス装置からのリンパ球がチャンバ２２に送られ、そこで変調／活性化が起こる。好適な期間の後、活性化されたＴｒｅｇ細胞（及び／または存在すれば、他の変調されたリンパ球）をリアクタから取り出し、被験体へ戻すことができる。

図３は幹細胞リアクタ３０の別の実施形態の概略図を示すが、この場合には、条件付けを受けているリンパ球が、幹細胞３６との直接的接触から物理的に隔離されている。リアクタ３０は、培養幹細胞を収容するチャンバ３２を含む。このチャンバは幹細胞栄養培地を循環させるための流入口３４と流出口３５を備えることができる。このチャンバ内には、リンパ球流路を幹細胞３６から隔離する膜によって画定された１以上の流通路３７があり、幹細胞３６は、例えばリンパ球を幹細胞との直接的接触から隔離する管状膜３７の外側など、チャンバ内のいずれの場所でも増殖することができる。使用時には、請求項１のアフェレーシス装置からのリンパ球が流体コンジット３１を経てチャンバ３２に送られ、流体コンジット３９を経て取り出される。チャンバ内にある間に、ある種のリンパ球の変調／活性化が起こる。好適な期間の後、活性化されたＴｒｅｇ細胞（及び／または存在すれば、他の変調されたリンパ球）をリアクタから取り出し、被験体へ戻すことができる。

これらの例は、自己免疫を原因とする１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の発症及び進行に関する調節性リンパ球（Ｔｒｅｇ）の内因的な欠陥を示す。従って、リンパ球の操作は、自己免疫障害を予防及び治療するために好結果をもたらす免疫療法の開発に向けた魅力的な研究対象である。ＣＢ−ＳＣまたはＰＢ−ＳＣなどの幹細胞を使用すると、全体的な遺伝子発現特性の変調を介してリンパ球の機能的欠陥が矯正でき、顕性自己免疫障害の逆転をもたらすことができる。特に、リンパ球と幹細胞の同時培養処置は自己免疫を軽減するだけではない。手順全体が簡単、安全であり、コストパフォーマンスが高い。このような方法及び装置の開示は、糖尿病及びその他の自己免疫疾患に臨床的影響を与え、患者において疾病を逆転させるための、幹細胞により変調されたリンパ球を用いた新規な療法への道を開く可能性を持つ。

本発明はさらに、本発明の幹細胞を含む幹細胞に基づく療法のための装置を開示する。一実施形態では、本発明の幹細胞は、哺乳動物被験体において自己免疫疾患及び免疫障害関連疾患、例えば糖尿病を治療するために用いられる。

その装置は自己反応性リンパ球を抑制するためのバイオリアクタであり得る。そのバイオリアクタは、少なくとも１つの正電荷支持体表面を備えたチャンバを含み得る。幹細胞集団はこの支持体表面に付着させることができる。その表面はさらに、シート層、複数の微小担体及び透過膜層の形態であってもよい。支持体表面はまた、幹細胞が付着可能なポリスチレンまたはガラスなどの疎水性物質を含んでもよい。一実施形態では、チャンバは複数の支持体層を備える。一実施形態では、チャンバは少なくとも２つの層、また３５もの多数の層、またはその間の任意の数の層を備えることができる。

チャンバはまた、幹細胞と単核細胞／リンパ球の間の相互作用を可能とする。この相互作用は細胞間接触によるものであり得る。この相互作用はまた、ある細胞から別の細胞へと放出される可溶性因子によるものであってもよい。チャンバはまた、幹細胞と単核細胞／リンパ球の間の細胞間接触を妨げることもできる。多孔質膜を用いて、幹細胞と単核細胞／リンパ球の間に可溶性因子は膜を通過させるが、細胞は通さないバリアを設けることができる。この多孔質膜は、細胞、幹細胞、同時培養細胞集団、リンパ球、Ｔ細胞が膜の反対側へ通り抜けるのを妨げるのに十分小さい孔径を持ち得る。別の実施形態では、多孔質膜は、幹細胞により放出された因子、増殖因子、サイトカイン、ｉＮＯＳを膜の一方の側から反対側へ通過させるのに十分大きな孔を持つ。一実施形態では、多孔質膜の一方の表面に幹細胞を付着させる。別の実施形態では、この孔は平均幹細胞サイズの約半分以下である。

バイオリアクタはまた、チャンバ内にリンパ球を導入するための流入コンジットを含み得る。この流入コンジットは、細胞集団を流入口からバイオリアクタに流入させることができる。バイオリアクタはまた、処置済みの同時培養されたリンパ球をチャンバから抜き取るための流出コンジットも含み得る。重力及び／またはポンプ機構によって、細胞集団を流入口から流出コンジットへ送ることができる。

バイオリアクタは幹細胞を含むチャンバを含み得る。幹細胞をチャンバ内の支持体表面に播種することができる。さらに、幹細胞は少なくとも１０^７細胞の密度で存在することができる。幹細胞はまた、少なくとも１０^４、１０^ｓ、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０細胞の密度で播種することができる。一実施形態では、幹細胞は支持体表面に少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％の集密度で存在する。幹細胞はまた、最適な集密度を得るためにバイオリアクタ内で増殖させることもできる。別の実施形態では、幹細胞を、支持体表面上で少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％の集密度まで増殖させる。

幹細胞はまた、複数の供給源から得ることもできる。幹細胞は、抽出された単核細胞／リンパ球に対して自己であり得る。あるいは、幹細胞は単核細胞／リンパ球に対して同種であり得る。さらに、幹細胞は末梢血、臍帯血、骨髄細胞、脾細胞、胸腺細胞、リンパ節、脂肪細胞組織及び肝細胞由来のものであり得る。

別の態様では、本発明は、自己免疫障害を抑制するためのシステムを開示する。このシステムは被験体から血液を抜き取るための流体コンジットと、処置済みのリンパ球を被験体に戻すための流体コンジットを含み得る。このシステムはまた、抜き取られた血液からリンパ球を分離するためのアフェレーシス装置も含み得る。アフェレーシス装置は大きさ、重さ、遠心分離などに基づいてリンパ球を分離することができる。さらに、アフェレーシス装置は単核細胞、リンパ球、血漿及び赤血球などを選択的に分離することができる。アフェレーシス装置は単針法または二本針法であり得る。アフェレーシス装置はＢａｘｔｅｒ（ＵＫ）によるＡＬＹＸシステム、Ｂａｘｔｅｒ（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）によるＣＳ３０００ｐｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ、ＭＡ）によるＭＣＳ＋９０００及びＣａｒｉｄｉａｎＢＣＴ（Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＣＯ）によるＣＯＢＥ Ｓｐｅｃｔｒａ（登録商標）などの市販の装置であってよい。

この自己免疫障害を抑制するためのシステムはまた、自己反応性リンパ球を抑制するバイオリアクタも含む。そのバイオリアクタは少なくとも１つの正電荷支持体表面を備えたチャンバを含み得る。幹細胞集団はこの支持体表面に付着させることができる。その表面はさらに、シート層、複数の微小担体及び透過膜層の形態であってもよい。支持体表面はまた、幹細胞が付着可能なポリスチレンまたはガラスなどの疎水性物質を含んでもよい。一実施形態では、チャンバは複数の支持体層を備える。一実施形態では、チャンバは少なくとも２つの層、また３５もの多数の層、またはその間の任意の数の層を備えることができる。

そのシステムはまた、幹細胞とリンパ球の間の相互作用を可能とするチャンバも含み得る。この相互作用は細胞間接触によるものであり得る。この相互作用はまた、ある細胞から別の細胞へと放出される可溶性因子によるものであってもよい。チャンバはまた、幹細胞とリンパ球の間の細胞間接触を妨げることもできる。多孔質膜を用いて、幹細胞とリンパ球の間に、可溶性因子は通過するが細胞は通さないバリアを設けることができる。この多孔質膜は、細胞、幹細胞、同時培養細胞集団、リンパ球、Ｔ細胞が膜の反対側へ通り抜けるのを妨げるのに十分小さい孔径を持ち得る。別の実施形態では、多孔質膜は、幹細胞により放出された因子、増殖因子、サイトカイン、ｉＮＯＳを膜の一方の側から反対側へ通過させるのに十分大きな孔を持つ。一実施形態では、多孔質膜の一方の表面に幹細胞を付着させる。別の実施形態では、この孔は平均幹細胞サイズの約半分以下である。

自己免疫障害を抑制するためのシステムは、チャンバ内にリンパ球を導入するための流入コンジットと、処置済みの同時培養されたリンパ球をチャンバから抜き取るための流出コンジットを備えたバイオリアクタを含み得る。バイオリアクタはまた、幹細胞が付着された支持体表面も含み得る。幹細胞は少なくとも１０^７細胞の密度で存在することができる。幹細胞はまた、少なくとも１０^４、１０^ｓ、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０細胞の密度で播種することができる。一実施形態では、幹細胞は支持体表面に少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％の集密度で存在する。幹細胞はまた、最適な集密度を得るためにバイオリアクタ内で増殖させることもできる。別の実施形態では、幹細胞を、支持体表面上で少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％の集密度まで増殖させる。

そのシステムはまた、被験体の血液の連続的処置を考慮した閉系であってもよい（図１２参照）。被験体は静脈針などの流体コンジットを介してアフェレーシス装置に接続され得る。そして、アフェレーシス装置は、被験体から抜き取られた末梢血からリンパ球を分離する。これらのリンパ球は流入コンジットを介してバイオリアクタ内の幹細胞へ導入することができる。リンパ球は活性化されて、自己反応性Ｔ細胞などの自己反応性リンパ球を抑制できるようになり、これらの処置済みリンパ球が流出コンジットを介してバイオリアクタから抜き取られ、流体コンジットを介して被験体に戻される。

被験体に戻された、幹細胞により変調された患者の単核細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、Ｂ細胞、単球、ＤＣ）は、免疫バランスの組織的な変調、膵島などの組織における免疫寛容の誘導、浸潤免疫細胞のアポトーシスの誘導による炎症の軽減、及び膵島β細胞の複製などの組織細胞の新生の刺激とその後の膵島構造の全面的回復といった種々の治療的可能性を示し得る。

本発明をさらに以下の実施例により説明するが、これらの実施例は限定とみなすべきではない。以下の実験は本発明の種々の態様を示すために実施したものである。

以下の実施例のデータの統計分析は、統計的有意性を判定するための対応スチューデントｔ検定によって行った。値は平均値±ＳＤ（標準偏差）として表す。

実施例１
方法及び材料
５〜６週齢の雌ＮＯＤ／ＬｔＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入し、シカゴのイリノイ大学にて病原体不在条件下で維持した。午前９〜１１時の間に非空腹時条件下でＡｓｃｅｎｓｉａ ＥＬＩＴＥ グルコメーター（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｌｋｈａｒｔ、ＩＮ）を用いて血糖値をモニタリングした。体重減少、多尿、及び少なくとも連続２日間にわたる非空腹時血糖値＞２５０ｍｇ／ｄＬにより確認された自然発症自己免疫性糖尿病を有する雌糖尿病ＮＯＤ／ＬｔＪマウス（２４〜２８週齢）を、シカゴのイリノイ大学の動物実験委員会(Animal Care Committee)（ＡＣＣ）により認可されたプロトコールに従い、処置に用いた。

同時培養
ヒト臍帯血（６０〜１２０ｍｌ／単位／バッグ）をＬｉｆｅ−Ｓｏｕｒｃｅ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｇｌｅｎｖｉｅｗ、ＩＬ）を購入した。これらは健康なドナーから得られたものであった。本発明者らの研究に用いる臍帯血については、それらが商業的に入手可能なものであるため、本大学からの倫理的認可及びドナーの同意サインの必要はない。ヒト臍帯血由来幹細胞（ＣＢ−ＳＣ）は従前に記載されているように作製した。簡単に述べれば、臍帯血単核細胞を１５０×１５ｍｍのペトリ皿（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、組織培養処置を施されていないペトリ皿）に、１×１０^６細胞／ｍｌ、７％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地中、２５ｍｌ／ペトリ皿で播種し、３７℃、８％ＣＯ_２中でインキュベートした。２〜３週間後、８０〜９０％の集密度で増殖しているＣＢ−ＳＣを、全ての非接着臍帯単核細胞を除去した後のマウスリンパ球と同時培養した。同時培養のために、６〜８週齢のＮＯＤマウス脾臓からマウスリンパ球を単離し、７％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した２５ｍｌ ＲＰＭＩ １６４０培地を含有する１５０×１５ｍｍペトリ皿中、ＣＢ−ＳＣ：リンパ球 １：１０の比率でＣＢ−ＳＣ上に播種し、８％ＣＯ_２のインキュベータにて３７℃でインキュベートした。２〜４日間同時培養した後、ＣＢ−ＳＣの混入が最小の実験とするために懸濁しているリンパ球を回収した（浮遊細胞の１％未満がＣＢ−ＳＣマーカーヒト白血球共通抗原ＣＤ４５陽性であった）。ＣＢ−ＳＣは培養皿に強固に付着し、大きな丸い形態を示すことから、ＣＢ−ＳＣからリンパ球を識別すること、及びそれらを回収することは容易である。対照実験では、リンパ球は、ＣＢ−ＳＣを含まないこと以外は同一の増殖条件で培養した。

フロー解析及び選別
フロー解析及び細胞選別を従前に記載されているように行った。フロー解析のため、細胞を、２．５％ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有する培地で希釈したラット抗マウスＣＤ１６モノクローナル抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンディエゴ、ＣＡ）とともに４℃で１５分間インキュベートして、Ｆｃ受容体を遮断し、非特異的染色を妨げた。細胞を、Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲートＣＤ３、ＦＩＴＣもしくはフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートＣＤ４、ＦＩＴＣコンジュゲートＣＤ２５、及び／またはフィコエリトリン−Ｃｙ７（ＰＥ−Ｃｙ７）コンジュゲートＣＤ６２Ｌを含む抗マウスモノクローナル抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともに４℃で４５分間インキュベートし、その後ＰＢＳで洗浄した後にフロー解析を行った。アイソタイプ適合ラット抗マウスＩｇＧ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を陰性対照とした。染色後、細胞をＣｙＡｎ ＡＤＰ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いて分析した。細胞内サイトカイン染色のため、細胞をまず細胞表面抗原に関して染色し（例えば、ＰＥコンジュゲートＣＤ４、ＦＩＴＣコンジュゲートＣＤ２５、及びＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲートＣＤ６２Ｌ）、その後、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンホゼ、ＣＡ）を用いて調製した。次に、細胞を、ＦＩＴＣコンジュゲートＩＬ−４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲートＩＬ−１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲートＩＬ−１２、パシフィックブルーコンジュゲートＩＦＮ−γ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ビオチン化抗ＴＧＦ−β１ Ａｂ（カタログ番号ＢＡＦ２４０、Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ＭＮ）を含む抗体の種々の組合せで染色した。ＴＧＦ−β１染色のため、細胞をストレプトアビジン コンジュゲートＦＩＴＣ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で再染色した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート抗Ｆｏｘｐ３はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。種々の細胞集団を単離するための細胞選別では、ＣＢ−ＳＣ同時培養リンパ球及び対照マウスリンパ球、または新たに単離したマウス脾細胞をまずＣＤ１６ ＡｂとインキュベートしてＦｃ受容体結合を遮断し、次に、ＦＩＴＣコンジュゲートＣＤ４及びＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲートＣＤ６２Ｌなどの抗体の種々の組合せとともに４℃で４５分間インキュベートし、ＭｏＦｌｏ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いて細胞選別を行った。集団の純度（＞９８％）を確認した後、ＣＤ４^＋ＣＤ６２Ｌ^＋ Ｔｒｅｇを回収し、種々のin vitro及びin vivo実験に用いた。

定量的リアルタイムＰＣＲ
種々のｍＲＮＡの発現を定量的リアルタイムＰＣＲにより分析した。全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎキット（バレンシア、ＣＡ）を用いて抽出した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キットを製造者の説明書（Ｑｉａｎｇｅｎ、バレンシア、ＣＡ）に従って用い、全ＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡを合成した。各サンプルに対してＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ）を用い、以下の条件下：９５℃１５分、その後、９５℃１５分を４０回、そして６０℃６０分で、各遺伝子に関してバリデートされた遺伝子特異的ＲＴ^２ ＰＣＲプライマーセット（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ、フレデリック、ＭＤ）を用い、リアルタイムＰＣＲを３反復で行った。内部対照としてのβアクチンに対する各遺伝子の発現レベルを測定した。リアルタイムＰＣアレイのため、マウスＴｈ１−Ｔｈ２−Ｔｈ３ ＰＣＲアレイキットを製造者の説明書に従って用いた。これらのデータを、製造者（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ）により提供されている、ウェブに基づくＰＣＲアレイデータ分析ソフトウエアを用いて分析した。

in vivo処置
確立された糖尿病ＮＯＤマウスを処置するため、６〜８週齢の雌ＮＯＤマウスから単離された脾臓リンパ球を上記のようにＣＢ−ＳＣと同時培養した。２〜４日間同時培養した後、浮遊しているリンパ球を上記のように細胞選別のために回収した。精製ＣＤ４^＋ＣＤ６２Ｌ^＋ Ｔｒｅｇ（ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇ、３×１０^６細胞）を初回用量として１００μｌＰＢＳ／マウス（ｉ．ｐ．、膵臓付近）にて顕性糖尿病ＮＯＤマウスに腹腔内投与した後、１週間後に１００μｌＰＢＳ／マウス（ｉ．ｐ．、膵臓付近）中、２００万の細胞の第２用量を投与した。同容量のＰＢＳを注射した糖尿病マウスを１つの対照とした。ＣＢ−ＳＣの不在下でのin vitro培養後のリンパ球生存力の著しい低下のため、ＣＢ−ＳＣと同時培養しなかった新しく単離したマウス脾臓リンパ球から選別したＣＤ４^＋ＣＤ６２Ｌ^＋ Ｔｒｅｇ（対照ＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇ）をさらなる対照とした。実験が終わるまで、血糖値及び体重を週に２回モニタリングした。処置の開始から３週間後、下記のように糖負荷試験を行った（各群ｎ＝３）。処置の開始後７週間目に、重篤な高血糖症（＞６００ｍｇ／ｄＬ）及び体重減少（＞２０％）のために対照マウスを病理目的で犠牲にした。ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇで処置した後に糖尿病を示さないマウスも組織学検査のために犠牲にした。インスリンを測定するために、血液サンプルを尾静脈から採取した。超高感度マウスインスリン酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＩＡ）キット（Ａｌｐｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、ＮＨ）を製造者のプロトコールに従って用い、血中インスリンレベルを測定した。アッセイ感度は０．０１９ｎｇ／ｍｌである。

腹腔内ブドウ糖負荷試験
マウスを一晩（１２時間）絶食させ、体重を測定し、グルコースボーラス（２ｍｇ／ｇ体重）を腹腔内注射した。次に、グルコース投与後０、１０、２０、３０、４５、６０、９０及び１２０分時点で尾静脈から採血した。上記のように、全尾静脈血からグルコースレベルを測定した。

免疫組織化学
膵臓を１０％ホルムアルデヒド中で固定し、処置し、パラフィンに包埋した。５μＭ厚の連続切片を作製した。従前に記載されている方法に軽微な変更を加えて、免疫染色を行った。非特異的染色を遮断するため、切片を２．５％ウマ血清（Ｖａｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有するバッファ中、室温で２０分インキュベートした。一次抗体としては、モルモットポリクローナル抗インスリンＡｂ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、カーピンテリア、ＣＡ）、マウス抗グルカゴンｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ）、マウス抗ＴＧＦ−β１ ｍＡｂ（カタログ番号ＭＡＢ２４０、潜在型のＴＧＦ−β１と２５％の交差反応性、ＴＧＦ−β２とは交差反応性無し、ＴＧＦ−β３及びＴＧＦ−β５と交差反応性＜２％、Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、マウス抗ＳＭＡＤ４ ｍＡｂ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、サンタクルス、ＣＡ）、ウサギ抗Ｋｉ６７ ｍＡｂ及びラット抗マクロファージマーカーＦ４／８０ ｍＡｂ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、リトルトン、ＣＯ）ならびにハムスター抗マウス樹状細胞マーカーＣＤ１１ｃ（ＢＤ Ｐｈａｎｎｉｎｇｅｎ）が含まれていた。二次Ａｂとしては、テキサスレッドコンジュゲートＡｆＦｉｎｉＰｕｒｅロバ抗モルモットＩｇＧ、ローダミンコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ウサギＩｇＧ、ＡＭＣＡ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ウサギＩｇＧ、ＦＩＴＣコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗マウスＩｇＧ、及びＣｙ５コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗マウスＩｇＧ、ＡＭＣＡ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗アルメニアハムスターＩｇＧ、及びＣｙ５コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ラットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウエストグローブ、ＰＡ）を含んだ。非蛍光染色のため、一次抗体ともにインキュベートした後、細胞をＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、ＣＡ）を含んだ。ビオチン化ウマ抗ウサギＡｂ及びビオチン化ヤギ抗モルモットＡｂはＶａｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（バーリンゲーム、ＣＡ）から購入した。アイソタイプ適合対照として、マウスＩｇＧ_１κをＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから、モルモット血清及びウサギＩｇＧをＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。膵臓スライドについては、本発明者らは免疫染色後にヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ）対比染色を行った。どの実験にも、アイソタイプ適合抗体を陰性対照として用いた。細胞の写真撮影は、ＨＲＰ免疫染色画像の場合には、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ／Ｄｉｇｉｔａｌ蛍光顕微鏡を用いてＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｃａｍ Ｃｏｌｏｒカメラにて、蛍光画像の場合にはＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡ共焦顕微鏡を用いて行った。

インスリンＡｂを用いた免疫染色後の全β細胞量を比較するため、β細胞量は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウエアを用いたポイントカウント形態計測分析により測定及び計算した。

インスリン炎のスコアをとるため、各実験群からの膵臓切片をヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ、Ｓｉｇｍａ）で染色した。各膵臓２００の連続切片からの少なくとも５０個の膵島を調べ、白血球浸潤の程度を評価した。インスリン炎は、白血球の膵島内浸潤の程度に基づき、インスリン炎無し（浸潤無し）、軽度インスリン炎（浸潤＜２５％）、中度インスリン炎（浸潤２５％〜５０％）、重度インスリン炎（浸潤５０％〜７５％）及び著しいインスリン炎（浸潤＞７５％）の５つのカテゴリーに分類した。

浸潤白血球のアポトーシスを測定するため、in situ細胞死検出キット（蛍光）（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、インディアナポリス、ＩＮ）を、製造者の推奨プロトコールを用いて適用及び実行した。ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇ処置糖尿病マウス及び対照群からの凍結膵臓の凍結切片（８μｍ厚）を、ミクロトームクリオスタットＨＭ ５００ ＯＭ（Ｍｉｃｒｏｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＧｍｂＨ）を用いて作製した。どの細胞種がアポトーシスをきたすのか決定するため、本発明者らはＣＤ４^＋Ｔ細胞に対するＰＥコンジュゲートＣＤ４ ｍＡｂ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対するＰＥコンジュゲートＣＤ８ ｍＡｂ、Ｂ細胞に対するＰＥコンジュゲートＢ２２０ ｍＡｂ及びマクロファージに対するラット抗マウスＦ４／８０ ｍＡｂを含む種々のマーカーを、それぞれＴＵＮＥＬ染色と組み合わせて用いる。ＣＤ４、ＣＤ８及びＢ２２０に対するｍＡｂはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した。凍結切片はまずin situ細胞死検出キット（Ｒｏｃｈｅ）で検出した後、種々のモノクローナルＡｂで免疫染色し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡ共焦顕微鏡で撮像した。二重染色後、陽性細胞を共焦顕微鏡及び／または画像上で直接定量した。ＴＵＮＥＬ反応混合物を含まない標識溶液とともにインキュベートした凍結切片及び／またはアイソタイプ適合ＩｇＧを陰性対照とした。

サイトカインアッセイ
マウス血漿中のサイトカインレベルを、市販のＥＬＩＳＡキットを製造者の説明書に従って用いて定量した。本発明者らはマウスＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡキットをＢｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｉｎｃ．（サンディエゴ、ＣＡ）から、マウスＩＬ−４及びＩＬ−１０ ＥＬＩＳＡキットをＡｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ（アナーバー、ＭＩ）から、そしてＴＧＦ−β１ ＥＬＩＳＡキットをＰｒｏｍｅｇａ（マディソン、ＷＩ）から購入した。

実施例２
マウス調節性リンパ球の調節
Ｔ１ＤにおけるＴｒｅｇの治療能を調べるため、本発明者らは実験的非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルを用いた。まず、本発明者らは、ＣＢ−ＳＣとＮＯＤマウス脾臓由来リンパ球の同時培養を試験し、ＣＢ−ＳＣとの同時培養が種々の比率のＣＢ−ＳＣ：リンパ球（１：５、１：１０及び１：２０）でマウスリンパ球の増殖を有意に刺激せず（図４Ａのそれぞれｐ＝０．２５、ｐ＝０．１５、ｐ＝０．１６）、それはＣＢ−ＳＣとヒトリンパ球の同時培養と同様であることを見出した。データは４回の独立した実験の平均値±ｓ．ｄ．で表した。

次に、本発明者らは、従来のＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ Ｔｒｅｇ及びＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ Ｔｒｅｇ、ならびにＣＤ４^＋ＣＤ６２Ｌ^＋ Ｔｒｅｇを含むＴｒｅｇの存在に関するＣＢ−ＳＣとマウスリンパ球の同時培養を分析した。本発明者らは、単独でまたはＣＢ−ＳＣとともに培養された全マウス脾臓リンパ球においてＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ ＴｒｅｇとＣＤ４^＋Ｆｏｘｐ３^＋ Ｔｒｅｇに有意な違いはないことを見出した。これに対して、ＣＤ４^＋ＣＤ６２Ｌ^＋ ＴｒｅｇのパーセンテージはＣＢ−ＳＣと同時培養した後に約５倍増大した（図４Ｂ）。さらにフローサイトメトリーにより、これらのＣＤ４^＋ＣＤ６２Ｌ^＋ ＴｒｅｇのうちＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＣＤ６２Ｌ^＋Ｆｏｘｐ３^＋陽性であったものは極めて小さいパーセンテージに過ぎないことが明らかになり（図４Ｃ）、このパーセンテージに関して、ＣＢ−ＳＣと同時培養したリンパ球と同時培養しないリンパ球との間で違いは無かった（０．１１±０．０４％対０．１０±０．０３％、Ｐ＝０．４４）。本発明者らは次に、主にＣＢ−ＳＣとの同時培養により影響を受けたＣＤ４^＋ＣＤ６２Ｌ^＋ Ｔｒｅｇ（ＣＢ−ＳＣにより変調されたＣＤ４^＋ＣＤ６２Ｌ^＋ Ｔｒｅｇ、ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇと呼ぶ）に着目した。Ｂ〜Ｃのデータは３〜５回の実験の代表的なものである。

in vitro同時培養後のＣＢ−ＳＣによるＣＤ４^＋ＣＤ６２Ｌ^＋ Ｔｒｅｇの変調を表すため、ヘルパーＴ（Ｔｈ）１及びＴｈ２免疫応答に関連する細胞内サイトカインを、フロー解析を用いて測定した（図４Ｄ）。結果は、対照ＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇに比べてｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇでは、ＩＬ−４レベルは有意に下方制御されたが（ｐ＝０．００４）、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＴＧＦ−β１レベルは上方制御された（それぞれｐ＝０．００１、ｐ＝０．０００１及びｐ＝０．００６）ことを示した。これに対し、ＩＦＮ−γの発現は、ＣＢ−ＳＣとの同時培養後も変化しなかった（図４Ｄ、ｐ＝０．５）。次に、本発明者らは、ＣＢ−ＳＣと同時培養した後の精製ＣＤ４^＋ＣＤ６２Ｌ^＋ Ｔｒｅｇにおいて、定量的リアルタイムＰＣＲアレイを使用することにより、Ｔｈ１−Ｔｈ２−Ｔｈ３細胞関連遺伝子の発現を調べた。結果は、ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇが、複数のサイトカイン及びそれらの受容体、ケモカイン及びそれらの受容体、細胞表面分子、ならびにシグナル伝達経路分子及び転写因子を含むＴｈ細胞関連遺伝子の顕著な下方制御を示すことを実証した。これらのデータは明らかに、in vitroでのＣＢ−ＳＣとの同時培養が、機能的に関連するサイトカイン及びケモカイン遺伝子に特異的に、マウスＣＤ４^＋ＣＤ６２Ｌ^＋ Ｔｒｅｇにおける遺伝子発現の実質的改変を生じることを示唆する。

ＣＢ−ＳＣにより変調されたＣＤ４^＋ＣＤ６２Ｌ^＋ Ｔｒｅｇはマウスにおいて高血糖症を矯正
次に、顕性糖尿病ＮＯＤマウス（雌、２４〜２８週齢）を、Ｔ１Ｄの診断後５〜２０日間、ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇ（計５００万細胞／マウス、ｉ．ｐ．、マウスｎ＝８）で処置し、それらの治療能を判定した。同じ細胞量の対照ＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇ（ｉ．ｐ．、マウスｎ＝５）とビヒクルＰＢＳ（計２００μｌ／マウス、ｉ．ｐ．、マウスｎ＝５）を対照とした。特に、本発明者らは、ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇによる処置がこれらの顕性糖尿病マウス（６／８マウス）において正常血糖を回復させることを見出した（図５Ａ）。しかしながら、対照ＣＤ４ＣＤ６２Ｌ ＴｒｅｇまたはＰＢＳによる処置は糖尿病マウスの高血糖を軽減することはできなかった（それぞれ５／５、５／５マウス）（図５Ｂ）。ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇで処置した後に正常血糖となった糖尿病マウスも、７週目に非糖尿病ＮＯＤマウスの場合と同様の糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）の改善を示した（図５Ｂ）。しかしながら、ＰＢＳまたは対照ＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇで処置した糖尿病マウスは、見て取れる下方制御はなく、高いグルコースレベル（＞５００ｍｇ／ｄＬ）を維持していた（図５Ｂ）。さらに、本発明者らは、ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇ処置から６週間後に血中インスリンレベルをモニタリングした。結果は、対照ＣＤ４ＣＤ６２Ｌ ＴｒｅｇまたはＰＢＳビヒクルで処置された糖尿病マウスにおけるインスリンはＥＬＩＳＡにより検出不能であることを示した（ＥＬＩＳＡキット感度は０．０１９ｎｇ／ｍｌ、図５Ｃ）。これらのマウスは、動物実験委員会により認可されたプロトコールに従い、重篤な高血糖（ＢＧ＞６００ｍｇ／ｄＬ）と体重減少（＞２０％）のために犠牲にしなければならなかった（図５Ｄ）。これに対して、ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇで処置した糖尿病ＮＯＤマウスの血中インスリンレベルは有意に上昇した（図５Ｄ、ｐ＝０．００２５）。

処置後４５日目に、本発明者らは膵臓に組織学的分析を行い、全β細胞量を評価した後、膵臓連続切片に対してインスリンＡｂで免疫染色を施した。形態計測分析は、ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇによる処置が全β細胞量を有意に増加させたことを示した（図５Ｅ、ｐ＝０．００２６）。これに対して、ビヒクルＰＢＳ処置または対照ＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇ処置後ではβ細胞量は著しく低下した（図５Ｅ）。全β細胞量の増加機構を理解するために、本発明者らは膵島における細胞増殖核マーカーＫｉ６７の発現を測定した。インスリンとＫｉ６７Ａｂによる二重染色により、２０±８β細胞／膵島がｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇ処置マウスの膵島においてＫｉ６７を発現し（図５Ｆ）、これは対照ＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇで処置したマウスの膵島におけるもの（１±０．４）よりはるかに高い（ｐ＝０．００１４）ことが明らかになった。これは、β細胞のde novo増殖が全β細胞量の顕著な増加の原因であることを示唆している。さらに、β細胞マーカーインスリンとα細胞マーカーグルカゴンによる二重免疫染色により、ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇで処置された糖尿病マウスの膵島は、非糖尿病ＮＯＤマウスの正常膵島で見られるものと同様のα細胞及びβ細胞分布パターンを示すことが明らかになった。しかしながら、対照ＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇで処置した糖尿病マウスにおいて、膵島構造は、β細胞のほぼ完全な消失によって完全に破壊された。従って、ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇによる処置は、β細胞再生と膵島細胞構造の再構築を促進することにより、Ｔ１Ｄマウスの高血糖を矯正することができる。

ＮＯＤマウスにおけるインスリン炎及び免疫不全の逆転
ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇが自己反応性エフェクターＴ細胞に対して免疫抑制作用を示すかどうかを確認するため、本発明者らは処置後４５日目に膵臓の組織学的分析とインスリン炎のスコア化を行った。組織学的評価は、処置前の糖尿病ＮＯＤマウスでは、膵島β細胞のおよそ８０％（顕著なインスリン炎）が破壊されていたことを示した。処置６週間後、本発明者らは、ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇを受容した糖尿病マウスで、膵島の３６％で炎症性細胞の浸潤の徴候が全くないか少なく、膵島の２０％が軽度のインスリン炎を示し、膵島の１％が中度のインスリン炎を示し、膵島の１８％が重度のインスリン炎を有し、膵島のわずか１１％が顕著なインスリン炎を示したことを見出した（図６Ａ及び６Ｂ）。インスリン炎不在の膵島は小さく、増殖マーカーＫｉ６７が陽性であり（データは示されていない）、これらのことは、これらの膵島が新たに生成された可能性があることを示唆する。これに対して、対照ＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇを受容した糖尿病マウスの全ての膵島は、炎症性細胞の大量浸潤と膵臓構造の重大な破壊を示し（図６Ｂ）、インスリン陽性細胞の存在は少ないか、全く無かった。同様に、膵臓の組織学的検査は、ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇ処置に耐性のあった２匹のマウス（２／８マウス）も、観察４５日後に顕著なインスリン炎を示したことを実証した（データは示されていない）。代表的なデータは、ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇ処置に感受性のある、正常血糖の６匹の糖尿病マウス（６／８マウス）からのものである。インスリンに対する免疫染色とヘマトキシリンによる対比染色の後、膵島を、単核細胞浸潤のパーセントに関してスコア化した。

インスリン炎の軽減の基礎にある分子機構を理解するため、本発明者らはＥＬＩＳＡにより血漿Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインレベルを測定した。本発明者らは、Ｔｈ１サイトカインＩＦＮ−γ及びＴｈ２サイトカインＩＬ−４が、ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇにより処置した糖尿病マウスの血漿では対照ＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇにより処置した糖尿病マウスよりもかなり低下することを見出した（それぞれＰ＝０．０１７、図６Ｃ、Ｐ＝０．０１８、図６Ｄ）。これに対して、ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇを受容した糖尿病マウスは、対照ＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇで処置したマウス（Ｐ＝０．０１６）及び６週齢の非糖尿病ＮＯＤマウス（Ｐ＝０．０１４）に比べて、血漿ＩＬ−１０レベルに顕著な上昇を示した。データは３回の実験からのマウス血漿サイトカインレベルの平均値±ｓ．ｄ．として示す。さらに、血漿ＴＧＦ−β１レベルも、ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇにより処置した糖尿病マウスでは、対照ＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇにより処置した糖尿病マウス（Ｐ＝０．０４１）に比べて有意に上昇していた。これらのデータは、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−β１は双方とも、ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇで処置した後に免疫寛容の誘導に寄与し得ることを示唆する。これらのデータは、ＣＢ−ＳＣに曝すとｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇに顕著な変化が誘導され、これが「正常な」膵島構造とβ細胞機能の回復を助け、糖尿病の抑制をもたらしたことを示す。

ＴＧＦ−β１は、免疫抑制の誘導に寄与し、自己寛容を維持する最もよく特徴付けられたサイトカインの１つである。ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇによる処置後の膵島β細胞の保護の基礎にあるde novo分子機構を解明するために、本発明者らは、血漿ＴＧＦ−β１測定の他、免疫組織化学により膵島におけるＴＧＦ−β１発現を測定した。結果は、ＴＧＦ−β１が、ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇにより処置した糖尿病マウスの膵島では、対照ＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇにより処置した糖尿病マウスに比べて高レベルで存在することを示した。ＴＧＦ−β１陽性細胞の染色は２つのパターンを示し、１つのパターンは平均陽性細胞数１４±９細胞／膵島で膵島β細胞間に分布するものであり、もう１つのパターンは膵島β細胞周囲に存在するものであった。重要なことに、本発明者らは、これらの周囲のＴＧＦ−β１陽性細胞（マクロファージマーカーＦ４／８０陰性であり、樹状細胞マーカーＣＤ１１ｃ陽性である、データは示されていない）が、それらがマトリックス中に放出したＴＧＦ−β１（偽染色）とともに膵島を取り囲むリングを形成することを見出した。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色により判定されるように（ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ処置群のＴＵＥＬ^＋浸潤白血球５８±２３対、対照ＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇ処置群のＴＵＮＥＬ^＋浸潤白血球９±３、ｐ＝０．０２）、このリングは新たに生成された膵島を、自己攻撃性エフェクターリンパ球のアポトーシスを誘導することにより攻撃から保護する可能性がある。どの細胞種がアポトーシスをきたすのか明らかにするため、本発明者らは、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞に対するＣＤ４、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞に対するＣＤ８、Ｂ細胞に対するＢ２２０、及びマクロファージに対するＦ４／８０を含む種々の細胞マーカーをそれぞれＴＵＮＥＬ染色と組み合わせた二重染色を行った。本発明者らは、ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇによる処置が対照ＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇ処置に比べて浸潤Ｔ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージのアポトーシスを増大させることを見出した（それぞれｐ＝０．００３４、ｐ＝０．０２４、ｐ＝０．０４１及びｐ＝０．０３２）。しかしながら、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞は、他の３つの細胞種に比べてはるかに高いアポトーシス細胞のパーセンテージを示した（図７）。従って、これらのデータは、ｍＣＤ４ＣＤ６２Ｌ Ｔｒｅｇによる処置が膵島におけるＴＧＦ−β１の発現を増強し、これが新たに生成された膵島を自己反応性免疫細胞の再破壊から局部的に保護することに寄与し得ることを示唆する。データは５回の実験の平均値±ｓ．ｄ．を表す。

実施例３
in vitro免疫変調
ＣＢ−ＳＣは、ＮＯＤマウスモデルにおいて、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ Ｔｒｅｇの機能を変調し、顕性自己免疫性１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の予防及び逆転をもたらし得る。本発明者らは、有糸分裂促進剤ＰＨＡの存在下で、Ｔ１Ｄ患者のＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ Ｔｒｅｇに対するＣＢ−ＳＣの免疫変調を調べた（図８Ａ及び図８Ｂ）。細胞内サイトカイン染色の結果は、対照ＰＨＡ処置に比べ、ＣＢ−ＳＣと同時培養した後のＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ Ｔｒｅｇでは、ＩＬ−５レベルが有意に下方制御され（ｐ＝０．００７）、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−１が上方制御されることを示し（それぞれｐ＝０．００１８及びｐ＝０．０１９）、これはＮＯＤマウスのＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ Ｔｒｅｇの場合と一致していた。これに対して、ＩＬ−４、ＩＬ−１２及びＩＦＮの発現はＣＢ−ＳＣとの同時培養後も変化しなかった（図８Ａ）。さらに、Ｔｒｅｇの特異的マーカーである転写因子Ｆｏｘｐ３もまた、対照ＰＨＡ処置に比べてＰＨＡ＋ＣＢ−ＳＣによる処置後に２．７倍上方制御された（図８Ｂ）。従って、これらのデータは、ＣＢ−ＳＣがＴ１Ｄ患者のＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ Ｔｒｅｇを変調し得ることを示唆する。

Ｔ１ＤにおけるＣＢ−ＳＣの治療能を判定するため、本発明者らは、Ｔ１Ｄ患者から作出した膵島細胞ＧＡＤ特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞クローンに対するＣＢ−ＳＣの直接的変調を検討する。結果は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び種々の用量のＧＡＤペプチドで刺激されたこのＴ細胞クローンの増殖が、ＣＢ−ＳＣ不在の対照群に比べて、ＣＢ−ＳＣの存在下で、著しくかつ特異的に低下されることを示した（図８Ｃ）。従って、ＣＢ−ＳＣが病原体Ｔ細胞除去能を持つことが示唆される。データ３回の実験からの平均値と標準偏差として示す。

カルボキシペプチダーゼＭ（ＣＰＭ）及びブラジキニンＢ１受容体
本発明者らは、ＣＢ−ＳＣが膜カルボキシペプチダーゼＭ（ＣＰＭ）、ブラジキニンＢ１受容体、及び誘導型酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）を発現することを見出した（図９Ａ）。カルボキシペプチダーゼＭにより媒介されるｉＮＯＳのアルギニン基質の生成は、マクロファージ及び内皮細胞においてＮＯの産生を増強することが示された。結果は、ＮＯ産生はＢ１Ｒアクチベーターｄｅｓ−Ａｒｇ １０−ブラジキニン（ＤＡＫＤ）の存在下で増大するが、ｉＮＯＳ特異的阻害剤１４００Ｗまたは選択的Ｂ１受容体アンタゴニスト［Ｄｅｓ−Ａｒｇ １０、Ｌｅｕ９］カリジン（ＤＡＬＫＤ）と組み合わせると阻害されることを示した（図９Ｂ及び図９Ｃ）。特異的Ｂ型カルボキシペプチダーゼ阻害剤である２−メルカプトメチル−３−グアニジノエチルチオプロパン酸（ＭＧＴＡ）による遮断は、ＣＢ−ＳＣのＮＯ産生を遮断し、ｉＮＯＳ阻害剤１４００Ｗを用いた場合と同様に、同種リンパ球に対するＣＢ−ＳＣの抑制を逆転させることができる。

ヒトＴｒｅｇにおけるＣＢ−ＳＣの免疫変調に対する細胞間接触の効果、ならびにＣＰＭ及びＢ１Ｒの寄与を調べるため、本発明者らはＣＰＭ特異的阻害剤ＭＧＴＡ及びＢ１Ｒ特異的阻害剤ＤＡＬＫＤの存在下で同時培養実験を行った。トランスウェルに播種したリンパ球を対照とした。結果は、ＣＰＭ及び／またはＢ１Ｒの遮断がＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ６９＋ Ｔｒｅｇの陽性パーセンテージを低下させ得ることを示した（図９Ｄ）。データは５回の実験の代表的なものである。

ＣＢ−ＳＣにおける自己免疫レギュレーター（Ａｉｒｅ）発現
Ａｉｒｅは、末梢自己抗原の異所発現及び自己反応性Ｔ細胞の欠損を媒介することにより、免疫寛容に重要な役割を果たす。ＣＢ−ＳＣの免疫変調の基礎にある分子機構を探るため、本発明者らは、ＣＢ−ＳＣが遺伝子レベル（図１０Ａ）とタンパク質レベル（図１０Ｂ）の両面でＡｉｒｅを発現することを見出した。ＣＢ−ＳＣにおけるＡｉｒｅは免疫変調に寄与する可能性があることが示唆される。データは３つのＣＢ−ＳＣ調製物の代表的なものである。

ＣＢ−ＳＣにおけるＡｉｒｅの作用を探るため、３対のＡｉｒｅ特異的ｓｉＲＮＡを投与して、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることでＡｉｒｅ遺伝子発現をノックダウンした（ＦＩＧ．１１Ａ）。データは５つのＣＢ−ＳＣ調製物の代表的なものである。ウエスタンブロットにより、陰性対照ｓｉＲＮＡに比べ、５０ｎＭ ａｉｒｅ ｓｉＲＮＡの存在下ではＡｉｒｅタンパク質の７０％がノックダウンされ得ることが明らかになった（図１１Ｂ）。特に、ウエスタンブロットはまた、ａｉｒｅ ｓｉＲＮＡの存在下で、ＣＰＭ及びＰＤ−Ｌ１タンパク質が下方制御されることも示した。ウエスタンブロットはまた、ＣＰＭ及びＰＤ−Ｌ１タンパク質の下方制御も示す（図１１Ｂ）。これはＡｉｒｅがそれらの遺伝子発現を転写レベルで調節し得ることを暗示している。データは３回の実験の代表的なものである。

Ａｉｒｅが免疫変調に寄与するかどうかさらに検討するため、本発明者らは、Ａｉｒｅ ｓｉＲＮＡ及び陰性対照ｓｉＲＮＡの存在下でヒトＴｒｅｇマーカーＦｏｘｐ３を調べた。フロー解析は、Ｆｏｘｐ３の発現が、対照ｓｉＲＮＡに比べて、Ａｉｒｅ ｓｉＲＮＡ の存在下で著しく低下することを示した（ｐ＝０．０２８、図１１Ｃ）。従って、これらのデータはＣＢ−ＳＣにおけるＡｉｒｅ発現は免疫変調に寄与することを示唆する。データは３回の実験の平均値±ＳＤを表す。

本発明を特定の方法及び組成物に関して記載したが、当業者には、本発明に鑑みて変形形態及び改変が存在することが理解される。当業者は、上記の実施形態に基づく本発明のさらなる特徴及び利点を企図し、または慣例の実験だけを用いて確認することができる。本発明の実施には、特に断りのない限り、当業者の範囲内にある、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、形態学、遺伝子工学、及び免疫学の慣例技術を採用及び組み込むことができる。本発明は、現在のところ最も実用的な好ましい実施形態であると考えられるものに関して記載されるが、本発明は開示されている実施形態に限定されず、特許請求の趣旨及び範囲内に含まれる種々の改変及び等価の構成を包含する。特許請求の範囲に定義される本発明の新規な態様から逸脱することなく、本発明の改変及び変形がなされ得る。よって、本発明は、特に記載されているものに限定されない。また、全ての刊行物及び参照文献は参照によりその全内容が本明細書の一部とされる。

Claims (19)

1. リンパ球中に含まれる調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を変調し、自己反応性Ｔ細胞を抑制するためのバイオリアクタであって、
   幹細胞が培養される少なくとも１つの正電荷及び疎水性支持体表面層を備えたチャンバと、
   その支持体表面に付着された幹細胞であり、その幹細胞は、間葉細胞を本質的に非含有であり、また、（ａ）胚性幹細胞の特徴を示し、（ｂ）白血球共通抗原ＣＤ４５に対し陽性である造血細胞の特徴を示し、（ｃ）ＣＤ３４マーカーを発現せず、（ｄ）低い免疫原性を示し、（ｅ）自己免疫レギュレーターを発現する幹細胞である集団と、
   幹細胞と同時培養するためのチャンバに対して、チャンバに導入される前に血漿を含まないリンパ球を導入するための流入コンジットと、
   幹細胞と同時培養した後に処置済みのリンパ球を抜き取るための流出コンジットと、を備え、前記幹細胞がチャンバ内の複数の支持体表面層上で培養される
   ことを特徴とするバイオリアクタ。
2. 支持体表面が複数の微小担体を備える
   請求項１に記載のバイオリアクタ。
3. 支持体表面が少なくとも１つの透過膜層を備える
   請求項１に記載のバイオリアクタ。
4. 支持体表面が疎水性ポリスチレンを備える
   請求項１に記載のバイオリアクタ。
5. 幹細胞が支持体表面で少なくとも５０％の集密度である
   請求項１に記載のバイオリアクタ。
6. 幹細胞が支持体表面で少なくとも９０％の集密度である
   請求項１に記載のバイオリアクタ。
7. チャンバが幹細胞とリンパ球の間の細胞間接触を許容する構成である
   請求項１に記載のバイオリアクタ。
8. チャンバが幹細胞とリンパ球の間の細胞間接触を妨げる構成である
   請求項１に記載のバイオリアクタ。
9. 幹細胞が臍帯血から得られたものである
   請求項１に記載のバイオリアクタ。
10. 幹細胞が末梢血から得られたものである
    請求項１に記載のバイオリアクタ。
11. 幹細胞がリンパ球に対して同種である
    請求項１に記載のバイオリアクタ。
12. 幹細胞がリンパ球に対して自己である
    請求項１に記載のバイオリアクタ。
13. 少なくとも１０^６個の幹細胞の集団がチャンバ内に存在する
    請求項１に記載のバイオリアクタ。
14. 幹細胞がリンパ球に対して少なくとも１：１０の比率でチャンバ内に存在する
    請求項１に記載のバイオリアクタ。
15. 自己免疫障害を抑制するためのシステムであって、
    被験体から血液を抜き取るための流体コンジットと、
    抜き取られた血液からリンパ球を分離するためのアフェレーシス装置と、
    幹細胞集団が支持体表面に付着され得るように少なくとも１つの正電荷及び疎水性支持体表面を備えたチャンバ、そのチャンバにリンパ球を導入するための流入コンジット、及び幹細胞と同時培養した後に処置済みのリンパ球を抜き取るための流出コンジットを備えるバイオリアクタと、
    処置済みのリンパ球を被験体に戻すための流体コンジットと、を備えると共に、
    閉じたシステム、かつ、循環式及び連続式システム、かつ、複数層培養システムであり、
    前記幹細胞が、間葉細胞を本質的に非含有であり、また、（ａ）胚性幹細胞の特徴を示し、（ｂ）白血球共通抗原ＣＤ４５に対し陽性である造血細胞の特徴を示し、（ｃ）ＣＤ３４マーカーを発現せず、（ｄ）低い免疫原性を示し、（ｅ）自己免疫レギュレーターを発現する
    ことを特徴とするシステム。
16. 支持体表面に付着された幹細胞がチャンバ内で少なくとも１０^７個の細胞の集団にまで培養される
    請求項１５に記載のシステム。
17. 請求項１に記載のバイオリアクタで、前記調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を、前記幹細胞に曝すことにより、前記Ｔｒｅｇ細胞を活性化し、また、前記幹細胞がカルボキシペプチダーゼＭ（ＣＰＭ）をさらに発現する
    ことを特徴とする方法。
18. 請求項１に記載のバイオリアクタで、前記調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を、前記幹細胞に曝すことにより、前記Ｔｒｅｇ細胞を活性化し、また、前記幹細胞がブラジキニンＢ１受容体をさらに発現する
    ことを特徴とする方法。
19. 請求項１に記載のバイオリアクタで、前記調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を、前記幹細胞に曝すことにより、前記Ｔｒｅｇ細胞を活性化し、また、前記幹細胞が自己免疫レギュレーター（ＡＩＲＥ）タンパク質をさらに発現する
    ことを特徴とする方法。

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