KR20220004126A - 유도 다능성 줄기 세포로부터 생체내에서 기능적이고 환자-특이적인 흉선 조직의 생성 - Google Patents

유도 다능성 줄기 세포로부터 생체내에서 기능적이고 환자-특이적인 흉선 조직의 생성 Download PDF

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홀거 에이. 루스
스테판 에이. 라모스
안토니오 지메노
존 제이슨 모턴
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더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도, 어 바디 코포레이트
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Abstract

본 개시된 기술은 환자-특이적 기능적 흉선 상피 전구(TEP) 세포를 생성하기 위한 방법, 시스템, 및 장치를 포함한다. 일부 실행예에서, 방법은 HSC로부터 iPSC를 생성하는 단계; 상기 iPSC를 흉선 상피 전구(TEP) 세포로 분화를 유발하는 단계; 숙주 내로 상기 TEP 세포를 이식함으로써 흉선 상피 세포를 생성하는 단계;를 포함할 수 있고, 여기서 상기 TEP 세포는 성숙하고 기능적인 흉선 상피 세포(TEC)로 분화할 수 있다. 일부 실행예에서, 시스템은 환자 특이적 세포의 세포 개체군, iPSC의 개체군, 및 TEP 세포가 성숙하고 기능적인 TEC로 분화되게 하기 위하여 상기 iPSC를 숙주 또는 환자에게 전달하기 위한 환자-특이적 TEP 세포의 개체군으로 분화시키기 위한 배양 시스템을 포함할 수 있다.

Description

유도 다능성 줄기 세포로부터 생체내에서 기능적이고 환자-특이적인 흉선 조직의 생성
개시된 공정, 방법, 및 시스템은 유도 다능성 줄기 세포로부터 환자-특이적 흉선 상피 세포로 추가로 분화될 수 있는 인간 흉선 상피 전구 세포(progenitor cell)의 시험관내 생성에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2019년 4월 26일자로 출원되고 그 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 발명의 명칭이 "기능적 흉선 상피 전구 세포의 생성"인 미국 가특허 출원 제62/839,107호의 35 U.S.C. § 119(e)에 의한 우선권의 이익을 주장한다.
정부 라이선스 권리
본 발명은 미국 국립보건원에 의해 수여된 승인 번호 CA213102 및 CA149456 하의 정부 지원에 의해 수행되었다. 정부는 본 발명에 소정의 권리를 갖는다.
흉선은 T-세포 레퍼토리의 발달을 위해 필요한 샘기관이다. 흉선은 적응성, 자가-내성(self-tolerant) 면역 시스템의 확립을 위하여 T-세포의 양성 및 음성 선택에서 기능을 한다. 흉선 발달 및 기능에서의 결함은 면역학적 결핍 및 자가면역 질환의 개시로 귀결될 수 있다. 전통적으로, 흉선 발달 및 자가면역성에 대한 연구는 대체로 마우스 모델에 제한되어 왔다. 이것은 대부분 발달하는 인간 흉선의 이용가능성의 부재, 및 신뢰할만한 시험관내 인간 흉선 모델의 부재로 인한 것이다.
자가-항원에 대한 내성을 (재)유도하기 위하여 자가면역 환자, 예컨대 제1형 당뇨병(T1D)을 갖는 환자의 면역 시스템을 조정할 필요가 있다. 부가적으로, 화학치료법 및/또는 조혈 줄기 세포 치료로부터 림프구감소증을 겪은 환자는 성인으로서 적격(competent) 흉선 상피의 부재로 인해 느린 또는 비적격(incompetent) T-세포 재구성을 앓는다. 느린 또는 비적격 T-세포 재구성은 환자가 과잉(plethora)의 감염성 질환, 재발, 및 이식편대숙주 질환에 민감하게 할 수 있다. 아울러, 흉선은 연령 관련 위축을 겪기 때문에, 노화된 개인은 더 젊은 개인보다 덜 면역 적격이다. 고형 기관 또는 줄기 세포 유래의 세포/조직 이식과 연관된 치료를 겪는 환자는 또한 잠재적인 면역조정에 민감하게 되고, 따라서 이식-후 면역억제에 대한 필요성을 감소시키거나 없애기 위한 방법이 필요하다. 마우스에서의 이전의 연구는 노화된 마우스에 젊은 흉선을 제공하면 상기 노화된 마우스의 수명을 연장할 수 있고 노화된 마우스의 흉선에 FOXN1의 발현을 강제하면 흉선 기능을 재생 또는 회복할 수 있음을 보였다. 따라서, 노화된 개인에서 기능적 흉선을 재생하는 것은 인간에서 노화의 효과를 방지하기 위한 매력적인 치료법으로 작용하고, 잠재적으로 인간의 기대 수명의 연장을 유도할 수 있다. 그러나, 인간 흉선의 발달 및 기능에 대한 현재의 이해에는 결정적인 간극이 있다.
개시된 기술은 환자-특이적 흉선 상피 세포(TEC)의 생성 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 환자로부터 세포를 단리하는 단계, 하나 이상의 인자를 상기 세포에 투여해 상기 세포를 재프로그래밍하고 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)를 생성하는 단계, 환자-특이적 iPSC를 분화 배지에서 9-14일 동안 배양하여 흉선 상피 전구(TEP) 세포를 생성하는 단계, 및 적어도 하나의 TEP를 수용자(recipient) 내로 전달하는 단계, 및 상기 TEP 세포를 TEC로 분화되게 하는 단계를 포함한다. 많은 구현예에서, 상기 iPSC는 조혈 줄기 세포(HSC) 또는 말초혈 단핵구 세포(PBMC)로부터 유래될 수 있고, 생성된 TEC는 성숙하고 기능적인 환자-특이적 흉선 상피 세포(TEC)일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 환자-유래의 T-세포를 TEC와 접촉시켜 기능적 T-세포를 생산하는 단계, 또는 환자-유래의 T-세포를 TEP와 접촉시켜 기능적 T-세포 및/또는 기능적 TEC를 생산하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 성숙한 T-세포는 CD69, CD25, CD5, CD7, CD4, CD8, CD3, CD45, RAG1, 및 RAG2 중 하나 이상을 발현한다. 많은 구현예에서, 말초 T-세포의 수는 환자-특이적 TEP를 수용하지 않은 수용자에서보다 더 많다. 많은 구현예에서, 상기 분화 배지는 액티빈(Activin) A, WNT3a, BMP4, SAG, TTNPB, FGF8b, Ly-364947, 및 Sant1 중 적어도 하나에 의해 영향을 받을 수 있는 경로 활성화제(activator) 및/또는 경로 억제제(inhibitor) 중 하나 이상, 예를 들면 액티빈, WNT, BMP, RA, TGFβ, SHH, 및 FGFβ 중 하나 이상을 포함한다. 일부 방법에서, 공동-배양 단계가 있을 수 있으며, 여기서 TEP 세포와 조혈 줄기 및 전구 세포(HPSC) 또는 HSC를 약 7일 동안 배양하면 TEC를 생성한다. 이들 방법 중 많은 경우, 상기 TEC는 KRT5, KRT8, AIRE, PSMB11, 및 PRSS16과 같이 전형적으로 피질(cortical) TEC 및 수질(medullary) TEC에 의해 발현되는 마커와 같은 FOXN1, AIRE, CK5, CK8, CXCL12, CCL25, DLL4, TP63, CBX4, 및 HLA-DR로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 마커를 발현할 수 있다.
또한, KRT5, KRT8, AIRE, PSMB11, 및 PRSS16 중 하나 이상을 발현하는 하나 이상의 흉선 상피 세포(TEC)를 포함하는 분화되고 성숙한 흉선 상피 세포의 개체군(population)이 개시되며, 여기서 상기 하나 이상의 TEC는 액티빈 A, Wnt3a, TTNPB, BMP4, LY364947, FGF8b, FGF8a, SAG, 및 SANT-1 중 하나 이상의 존재시에 시험관내에서 성장한 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 유래되는 흉선 상피 전구(TEP) 세포로부터 유래되고, 상기 TEP는 수용자 내로 이식된 후 생체내에서 TEC로 분화된다. 많은 구현예에서, 상기 분화되고 성숙한 흉선 상피 세포의 개체군, 상기 iPSC는 12 내지 14일 동안 시험관내에서 성장될 수 있고, 상기 수용자의 하나 이상의 세포로부터 유래될 수 있다. 생성된 TEC는 FOXN1, AIRE, CK5, CK8, CXCL12, CCL25, DLL4, 및 HLA-DR로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현할 수 있다.
또한, 대상체의 세포로부터 다능성 줄기 세포를 유도하기 위한 방법을 포함하는 성숙하고 기능적인 흉선 상피 세포를 생성하기 위한 시스템, 액티빈 A, Wnt3a, TTNPB, BMP4, LY364947, FGF8b, FGF8a, SAG, 및 SANT-1 중 하나 이상의 존재 또는 부재시에 12-14일 동안 유도 다능성 줄기 세포를 성장시켜 분화된 흉선 상피 전구 세포를 생산하기 위한 배양 장치, 대상체 내로 하나 이상의 흉선 상피 전구 세포를 이식하기 위한 장치가 개시된다.
또한, 면역 증상 또는 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 상기 및 본 명세서에 기술된 것과 같은 세포의 개체군의 용도가 기술되며, 여기서 상기 장애 또는 증상은 존재하지 않는 흉선, 손상된 흉선, 고장난(dysfunctional) 흉선, 질환이 있는 흉선, 노화된 흉선, 제1형 당뇨병, 자가-면역, 동종이식거부(allorejection), 암, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
또한, 청구항 19 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 따른 TEP 세포, 또는 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 증상 또는 장애를 앓거나 이의 위험성이 있는 대상체의 치료 방법이 개시된다; 여기서, 상기 장애 또는 증상은 존재하지 않는 흉선, 손상된 흉선, 고장난 흉선, 질환이 있는 흉선, 노화된 흉선, 제1형 당뇨병, 자가-면역, 동종이식거부, 암, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
또한, 액티빈 A, Wnt3a, TTNPB, BMP4, LY364947, FGF8b, FGF8a, SAG, 및 SANT-1 중 하나 이상의 존재시에 시험관내에서 성장한 환자 특이적 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 유래되는 하나 이상의 흉선 상피 전구(TEP) 세포를 투여하는 단계를 포함하는 흉선 장애를 갖는 환자의 치료 방법이 개시되며, 여기서 상기 TEP는 환자에게 투여된 후 생체내에서 흉선 상피 세포(TEC)로 분화되고, 상기 iPSC는 12 내지 14일 동안 시험관내에서 성장하며, 상기 성숙한 TEC는 FOXN1, AIRE, CK5, CK8, CXCL12, CCL25, DLL4, 및 HLA-DR로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현한다. 일부 구현예에서, 상기 iPSC는 환자의 피부, 자궁 조직, 신장, 간, 근육, 부신, 혈액 중 하나 이상으로부터 유래되거나, 및/또는 상기 선택된 마커는 투여된 TEP 세포 또는 iPSC와 비교하여 성숙한 iPSC-유래의 TEC에서 0.5배 내지 1,000배 발현된다.
도 1a는 iPSC로부터 TEP를 생성하기 위한 직접 분화 접근법의 개략도이다. 각각의 단계에 대한 마커 유전자가 표시되어 있다.
도 1b는 테스트된 분화 조건 및 인자들의 표이다. 테스트된 모든 6가지 조건을 d0 iPSC 및 신생아 인간 흉선 샘플(Thy)과 비교하였다.
도 1c 및 도 1d는 9일(도 1c) 및 14일(도 1d)에 제3 인두 파우치 마커인 HOXA3 및 EYA1, 및 TEP 마커 FOXN1에 대한 유전자 발현 분석 데이터를 보여준다. 나타낸 값은 d0 iPSC과 비교한 상대적 정량(RQ)이며, ACTB에 대해 표준화되었다(n=3, 2개의 iPSC 주(line), n=2, 원발성 인간 흉선). 데이터는 평균과 함께 평균의 표준 오차(SEM)를 나타내는 오차 막대를 보여준다. P-값은 ddCt 값을 이용하여 터키(Tukey) 다중 비교 테스트로 단방향(one-way) ANOVA에 의해 결정되었다: (도 1c) HOXA3: **** = p<0.0001. EYA1: *** = p<0.0007, ** = p<0.0016. (도 1d) HOXA3: † = 0.034, 및 ††††는 원발성 흉선 및 모든 6가지 조건 사이의 유의성이 p=<0.0001임을 나타낸다. ****는 d0 iPSC 및 모든 6가지 샘플 사이의 유의성이 p= <0.0001임을 나타낸다. EYA1: ***= p<0.001, ** = p<0.002. FOXN1: p=0.0024.
도 1e는 조건 4를 이용한 TEP 분화 9일에 FOXA2(적색) 및 HOXA3(녹색) 단백질 발현에 대한 면역형광 염색의 대표적인 현미경 사진이다. 핵은 DAPI로 대비염색(counterstain)된다. 축척 막대 = 20 ㎛.
도 1f는 조건 4를 이용한 TEP 분화 9일에 HOXA3 양성 세포를 정량한 그래프이다. 총 DAPI+ 세포에 대한 HOXA3 양성 세포의 평균 백분율로 그래프로 나타내었고, 오차 막대는 SEM을 나타낸다(n=3, 3가지 iPSC 주).
도 1g는 다중 iPSC 주(n=3, 3가지 iPSC 주)를 이용하여 조건 4(보충제 포함)를 이용한 TEP 분화 14일에 제3 인두 파우치 마커인 HOXA3 및 EYA1, 및 TEP 마커 FOXN1의 유전자 발현 분석 그래프이다. 데이터는 평균 상대 발현으로 그래프로 나타내었고, 오차 막대는 SEM을 나타낸다. P-값은 ddCt 값을 이용하여 언페어드(unpaired) t-테스트에 의해 결정되었다: HOXA3 = 0.0003, EYA1 = 0.0064.
도 2a는 iPSC-유래의 TEP를 TEC로 생체내 성숙시키기 위한 실험 디자인의 개략도이다.
도 2b는 20일에 조건 4를 이용하여 생성된 iPSC-유래의 TEP(n=2, 2가지 iPSC 주), 및 이식 14-17주 후 누드(nude) 마우스 수용자(n=8)로부터 회수된 이식편(graft)의 유전자 발현 분석의 데이터를 보여준다. 상대적 정량(RQ) 값의 그래프가 나타나 있다. 데이터는 평균과 함께 ACTB에 대해 표준화된 SEM을 보여주는 오차 막대를 보여주며, 실험적으로 맞춘 0일 iPSC에 대해 세팅되었다. P-값은 ddCt 값을 이용하여 터키 다중 비교 테스트로 단방향 ANOVA에 의해 결정되었다: FOXN1: **** p= <0.0001, *** p = 0.0001. KRT5: p = <0.0001. DLL4: p = 0.041.
도 2c는 각각 mTEC 및 cTEC 마커인 사이토케라틴 5(녹색) 및 사이토케라틴 8(적색)과 핵을 표시하기 위한 DAPI에 대해 염색된 TEP 이식편의 대표적인 현미경 사진 면역형광 이미지이다. 황색인 이중 양성 세포는 발달하는 TEC를 나타낸다. 축척 막대 = 20 ㎛.
도 2d는 각각 마우스 T-세포 마커인 Cd4(녹색) 및 Cd8(적색)과 핵을 표시하기 위한 DAPI에 대해 염색된 TEP 이식편의 대표적인 현미경 사진 면역형광 이미지이다. 황색인 이중 양성 세포는 발달하는 T-세포를 나타낸다.
도 3a는 20일 TEP, 생체내 생성된 TEC 이식편, 및 원발성 신생아 인간 흉선의 클러스터링(clustering)을 보여주는 대량(bulk) RNA-seq 샘플의 주성분 분석(PC)을 나타내는 그래프이다(TEP n=2, 이식편 n=4, 원발성 흉선 n=2).
도 3b는 대량 RNA-seq 샘플의 전체 게놈 계층 클러스터링을 보여주는 계통도(dendrogram)이다.
도 3c 내지 도 3e는 볼케이노 플롯(volcano plot)으로 나타낸 원발성 신생아 흉선, TEC 이식편 및 할당된 제3 인두 파우치 및 핵심 흉선 마커를 갖는 20일 TEP의 차등 유전자 발현의 유의성 분석에 대한 데이터를 제공한다. 유의한 P-값 <0.01, 최소 배수 변화(FC) 0.5 log. (도 3c) 이식편 대 20일 TEP. (도 3d) 원발성 신생아 흉선 대 20일 TEP. (도 3e) 원발성 신생아 흉선 대 이식편.
도 3f는 대조군 및 TEP 이식된 마우스 비장에 대하여 마우스 Cd3(갈색) 및 마우스 Cd45(적색)에 대한 면역조직화학 염색을 보여주는 대표적인 현미경 사진이다(n=2 모의(sham), 4 이식편).
도 3g는 대조군 및 TEP 이식된 누드 마우스에서 총 비장세포 카운트(count)의 막대 그래프를 보여준다(n=3 모의, 7 이식편).
도 3h는 대조군 및 TEP 이식된 누드 마우스의 비장 및 림프절로부터 단리된 시험관내 자극된 T-세포의 활성화 마커 Cd25 및 Cd69의 대표적인 플로우 플롯(flow plot)이다(CD25: n=5 모의, 9 이식편; CD69: n=4 모의, 9 이식편).
도 4a 내지 도 4c는 TEP 이식편 및 원발성 인간 신생아 흉선 샘플의 단일 세포 mRNA 시퀀싱(sequencing) 데이터(scRNAseq)의 t-분산 추정 이웃 임베딩(tSNE) 시각화를 보여준다. (이식편 n=2(17주), 원발성 흉선 n=1, 2가지 상이한 방법에 의해 제조됨). (도 4a) 클러스터 분석은 샘플 내에서 구별된 세포 개체군을 밝혔다. (도 4b) 클러스터의 종별(species-wise) 시각화는 도 4a에서 표시된 클러스터에 대응한다. (도 4c) scRNAseq 데이터의 샘플별(sample-wise) 시각화는 이식편 유래 및 원발성 흉선 유래 TEP/TEC의 중첩을 보여준다.
도 4d는 공통 면역 연관 유전자의 큐레이트된 히트맵(curated heatmap)이다.
도 4e는 핵심 흉선 마커의 클러스터 특이적 유전자 발현을 보여주는 바이올린 플롯(violin plot)이다.
도 4f는 T-세포 마커의 클러스터 특이적 유전자 발현을 보여주는 바이올린 플롯이다.
도 4g는 핵심 수지상 및 항원 제공 세포 마커의 클러스터 특이적 유전자 발현을 보여주는 바이올린 플롯이다.
도 5a는 획정된(demarcated) TEP 및 TEC 클러스터를 갖는 원래의 클러스터 하위개체군(subpopulation)의 tSNE 시각화이다.
도 5b는 TEP/TEC 개체군의 하위-클러스터 분석에 이어지는 tSNE 시각화이다.
도 5c는 TEC 개체군의 하위 클러스터의 샘플별 tSNE 시각화이다.
도 5d는 TEC 개체군의 예상된(projected) 발달 방향성을 보여주는 속력 분석이다.
도 5e는 샘플 특이적 발달 궤적(trajectory)을 보여주는 TEP 하위개체군의 의사(pseudo)-시간 분석이다.
도 5f는 의사-시간 분석의 분지화 점에서 차등 발현된 유전자를 보여주는 분지점(branch point) 히트 맵이다.
도 5g는 TEP/TEC 개체군 내에서 핵심 흉선 마커의 유전자 발현 분포를 보여주는 바이올린 플롯이다.
도 6a는 획정된 마우스 T-세포를 갖는 원래의 클러스터의 tSNE 시각화이다.
도 6b는 마우스 유래 T-세포의 하위-클러스터링을 보여주는 tSNE 분석이다.
도 6c는 마우스 유래 T-세포의 의사-시간 분석이다.
도 6d는 의사-시간 분석의 분지화 점에서 차등 발현된 유전자를 보여주는 분지점 히트 맵이다.
도 6e는 발달하는 T-세포의 핵심 마커의 유전자 특이적 의사-시간 궤적을 보여준다.
도 6f는 발달하는 T-세포의 핵심 전사 인자 및 세포 표면 마커의 유전자 발현 분포를 보여주는 바이올린 플롯이다. 패널 A-B는 STOC로서 6주 후 T-세포의 존재 예의 그래프이다.
도 7a는 말초혈 단핵구 세포(PBMC)를 환자-특이적 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)로 재프로그래밍하기 위한 작업 플로우의 개략도이다.
도 7b는 FOXN1 유전자 및 HA, P2A, 및 클로버(Clover) 서열을 삽입하기 위한 전략의 개략도이다.
도 7c는 도 7b에 개략적으로 나타낸 실험의 결과이다.
도 7d는 다능성 마커 단백질 OCT4(녹색), SOX2(적색), 및 NANOG(마젠타)의 면역형광 분석을 보여준다.
도 7e는 iPSC에서 다능성 마커 유전자인 OCT4, SOX2, 및 NANOG의 qPCR 분석이다. 데이터는 기술적 반복물의 평균으로 나타나 있다. 값들은 표준화되고, ACTB에 대해 세팅되었다. 인간 배아 줄기 세포는 양성 대조군으로 기능하였다.
도 7f는 확립된 iPSC 주의 핵형(karyotype) 분석을 보여준다.
도 8a는 iPSC에서 TEP로의 직접 분화 접근법의 개략도이다.
도 8b는 테스트된 분화 조건 및 사용된 인자의 표이다.
도 8c는 분화 16일에 제3 인두 파우치 마커인 HOXA3 및 EYA1, 및 TEP 마커인 FOXN1의 유전자 발현 분석을 보여준다. 데이터는 ACTB에 대해 표준화되고, 평균과 함께 평균의 표준 오차(SEM)를 나타내는 오차 막대로 보여주며, 실험적으로 맞춘 0일 iPSC에 대해 세팅되었다(n=5, T-6 n=1). P-값은 ddCt 값을 이용하여 터키 다중 비교 테스트로 단방향 ANOVA에 의해 결정되었다: HOXA3 = <0.0001; EYA1 **** = <0.0001, ** = 0.0047; FOXN1 **** = <0.0001, *** = <0.0004.
도 9a는 각각의 원발성 클러스터에서 발현되는 상위 10개 유전자의 히트맵 분석이다.
도 9b는 T-세포 발달의 핵심 마커 유전자의 큐레이트된 히트맵이다.
도 9c 내지 도 9e는 도 4의 유전자 특이적 바이올린 플롯에 대응하는 유전자 특이적 tSNE이다.
도 10a는 각각의 클러스터에 대해 상위 10개의 차등 발현된 유전자의 히트맵이다.
도 10b는 인간 및 마우스 세포에 대한 핵심 T-세포 마커의 큐레이트된 히트맵이다.
도 10c 및 도 10d는 도 5의 유전자 특이적 바이올린 플롯에 대응하는 핵심 흉선 마커에 대한 유전자 특이적 tSNE 시각화이다.
도 11은 흉선 유전자에 대한유전자 특이적 tSNE 시각화이다.
도 12a는 동일성 군(identity group) 0-9에서 상향 및 하향 조절된 상위 유전자들의 히트맵이다.
도 12b는 도 12a의 마커의 유전자 특이적 tSNE 시각화이다.
도 12c는 대조군 마우스 대비 iPSC-유래의 이식편 TEP 세포(이식물)를 받은 무흉선(athymic) 마우스에서 향상된 T-세포 수용체 서열 이질성(heterogeneity)을 개략적으로 나타낸 것이다.
다양한 상이한 iPSC(환자-특이적 유도 다능성 줄기 세포) 주로부터 흉선 상피 전구 세포(TEP)를 생성하는 범용적인(universal) 직접 분화 프로토콜(protocol)을 위한 조성물, 방법, 및 시스템이 본 명세서에 기술된다. 상기 iPSC는 인간 말초혈 단핵구 세포를 포함하는 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 수용자(예를 들면, 이러한 치료를 필요로 하는 인간과 같은 포유동물, 또는 무흉선 누드 마우스) 내로 이식시, 개시된 TEP는 흉선 상피 세포(TEC)로 추가로 분화된다. 이식된 TEC는 기능적이고, 발달하는 마우스 T-세포의 교육을 촉진할 수 있다.
본 개시된 방법 및 시스템은 인간 원발성 신생아 흉선 조직에 존재하는 TEC와 구분할 수 없는 iPSC-유래의 환자-특이적 TEC로 귀결된다. 단일 세포 RNA 시퀀싱 분석은 iPSC-유래의 TEP를 이식하면 원발성 흉선에서 발견되는 모든 성숙한 TEC 표현형(phenotype)의 생성으로 귀결됨을 설명한다.
출원인은 본 발명의 방법, 시스템, 및 조성물은 다양한 iPSC 주(도 1a에 개략적으로 기술됨)로부터 TEP를 생성하는 범용적인 직접 분화 프로토콜을 제공함을 보여준다. 본 개시된 세포, 방법, 및 시스템은 추가로 대상체에서 성숙한 기능적 흉선 상피를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 개시된 방법 및 시스템은 존재하지 않는, 손상된, 고장난, 질환이 있는, 또는 노화된 흉선을 앓고 있는 대상체에서 기능적인 자가성 흉선을 생성하는데 유용할 수 있다.
흉선
흉선은 발달하는 T-세포의 양성 및 음성 선택을 제공함으로써 기능적인 적응성 면역 시스템을 생성하는데 필수적인 샘기관이다. 흉선은 내배엽 유래의 조직이고, 배아 발달 동안에 제3 인두 파우치(TPP)로부터 기원한다. 상기 TPP 내의 흉선 상피 전구 세포(TEP)는 지지하는 중간엽 세포에 의해 둘러싸인 흉선 소질을 나타내는 마스터(master) 전사 인자인 FOXN1의 발현에 의해 확인될 수 있다. FOXN1은 TEP와, 이어지는 기능적 흉선의 발달을 위해 필요하다. 마우스 및 인간 모두에서, FOXN1의 파괴는 선천적 무흉선증을 초래한다. 성인 흉선에서 Foxn1의 소실은 노화된 개인에서 관찰되는 것과 유사한 흉선 위축으로 귀결된다. TEP의 사양은 Foxn1 발현과 무관하지만, Foxn1은 TEP로부터 기능적 흉선 상피 세포(TEC)로 분화하기 위해 필요하다. 또한, 기능적 흉선 상피 세포(TEC)로의 TEP의 분화는 발달하는 T-세포와의 상호작용에 의존한다. 기능적 TEC는 위치 및 기능에 기반하여 피질 및 수질 TEC(각각 cTEC 및 mTEC)의 2가지 구별된 서브타입(subtype)으로 나누어질 수 있고, 각각 사이토케라틴 8 및 5의 발현에 의해 확인될 수 있다. 양쪽 TEC 서브타입은 양쪽 케라틴의 공동-발현에 의해 표시되는 공통의 TEC 전구체로부터 기원한다. CD4 및 8의 공동-발현에 의해 표시되는 발달하는 T-세포는 단일 양성 CD4 또는 CD8 T-세포로서 흉선 수질로 이동하기 전에 TEC 상의 자가-펩티드 보유 인간 백혈구 항원(HLA) 복합체 단백질과의 성공적인 상호작용에 대해 먼저 양성적으로 선택된다. 상기 공정은 양성 선택이라 불리며, HLA/펩티드와 강하게 상호작용하는 T-세포만이 생존 신호를 받지만, 다수의 발달하는 T-세포는 방치에 의한 죽음을 겪는다. 흉선 수질에서, mTEC는 양성 선택된 T-세포에 자가-항원을 제공함으로써 음성 선택의 공정을 통한 중심 면역 내성을 확립하는데 필수적이다. 자가-항원과 상호작용하는 자가반응성 T-세포는 매우 강하게 제거되지만, 비-반응성인 기능적 T-세포는 말초 내로 이동한다. 음성 선택의 부재 또는 변경은 제1형 당뇨병(T1D)을 포함하는 자가면역 질환의 발달로 귀결된다. 흉선은 젊은 개인에서 매우 활성이지만, 상기 기관은 청소년 연령 근처에서 퇴축(involution)하기 시작하고, 나이브(naive) T-세포 생산량은 급격하게 감소된다. 흉선 퇴축은 화학치료법을 포함하는 소정의 임상 치료에 의해 가속화된다. 환자-특이적 인간 흉선의 생성 능력은 인간 흉선 생물학을 조사하고 다중 접근법을 위한 신규한 모델 시스템 및 치료 양상의 발달을 자극하기 위한 매력적인 플랫폼(platform)을 제공한다. 사실, 흉선 발달 및 기능에 대한 우리의 현재 지식의 다수는 동물 모델의 연구에 기반하고, 신규 치료의 발달을 가능하게 하는 더 나은 이해를 위해 인간 맥락에서 번역 및 확장될 필요가 있다.
흉선 상피 전구체(TEP)는 인간 배아 줄기 세포의 지향성(directed) 분화에 의해 생성될 수 있다. 이질적인 iPSC 주로부터 환자-특이적 TEP를 효과적으로 분화시키는 능력은 아직 상세하게 설명되어 있지 않다. 환자-특이적 iPSC로부터 TEP를 지향성 분화시키기 위한 범용적인 프로토콜의 발달에 있어서 핵심 신호전달 경로 취급의 시스템적 평가를 사용하는 것이 본 명세서에 개시된다. 환자-특이적 TEP는 기능적 TEC로 추가로 분화된다. 상기 기능적 TEC는 무흉선 누드 마우스에서 발달하는 T-세포를 교육하는 능력을 갖고 있는 것으로 나타났다. 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNAseq) 분석법은 상기 기능적인 iPSC-유래의 TEC가 원발성 신생아 흉선 조직에 존재하는 TEC와 구분할 수 없음을 밝혔고, 이는 개시된 TEC가 성숙한 표현형을 갖고 있음을 제시한다. 개시된 세포, 방법, 프로토콜 및 시스템은 환자-특이적 방식으로 흉선의 기능을 조사 및 모델링하기 위한 혁신적 기술 및 능력의 발달을 위한 결정적인 플랫폼을 제공한다. 개시된 세포, 방법, 및 시스템은 신규한 치료 양상의 발달을 제공할 것이다.
(테스트된 모든 세포주를 포함하는) 유도 다능성 줄기 세포로부터 흉선 상피 전구(TEP)를 생성하는데 사용하기 위한 범용적인 프로토콜, 방법, 및 시스템이 본 명세서에 개시된다. 예를 들면, 다양한 체세포 공급원으로부터 유래되고 다양한 재프로그래밍 양상에 의한 iPSC로부터 생성된 TEP로부터의 결과가 본 명세서에 개시된다. 무흉선 누드 마우스 내로 이식될 때, 개시된 TEP는 발달하는 마우스 T-세포를 교육할 능력을 갖는 기능적 흉선 상피 세포(TEC)를 생성한다. 본 개시된 iPSC-유래의 TEC는 원발성 조직, 예를 들면 신생아 인간 공여자 흉선에 존재하는 TEC와 (scRNAseq 분석에 의해) 구분할 수 없다. 상기 결과는 개시된 조성물, 방법, 및 시스템이 환자-특이적 흉선 세포를 생성하기 위한 뼈대를 제공함으로써 기초적이고 번역가능한 연구에 영향을 주게 되는 해당 흉선 세포를 생성할 수 있다는 추가적인 증거를 제공한다.
상기 유도 다능성 세포는 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 대부분의 구현예에서, 상기 iPSC는 환자-특이적 세포이며, 즉 세포는 환자로부터 수득되고 본 기술분야에 잘 알려진 방법에 의해 재프로그래밍되었다. 아래에 나타낸 것과 같이, 재프로그래밍되는 세포의 공급원은 다양한 조직, 기관, 시스템, 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 재프로그래밍되는 세포는 조혈 세포, 예를 들면 조혈 줄기 세포 또는 말초혈 단핵구 세포(PBMC)이다. 많은 구현예에서, 개시된 방법 및 시스템은 하나 이상의 제3 인두 마커, 예를 들면 HOXA3(예컨대, HOXA3 단백질), 및/또는 흉선 마커 FOXN1(예를 들면, FOXN1 mRNA)을 발현하는 고수율의 세포를 수득하는데 유용할 수 있다. 많은 구현예에서, 개시된 TEP 세포는 마커 DLK1 및/또는 INHBA 중 하나 이상을 발현할 수 있다. 많은 구현예에서, 개시된 마커 중 하나 이상의 발현은 인간 TEP를 확인하는데 유용하거나, 및/또는 신규할 수 있다. 대부분의 구현예에서, TEP를 생성하기 위한 개시된 프로토콜 및 시스템은 TEC의 추가적인 분화 및 생성에 유용할 수 있다.
개시된 세포, 방법, 및 시스템은 알려진 흉선 표현형을 갖는 환자- 및/또는 군-특이적 TEC를 사용함으로써 다양한 발달적 및 기능적 흉선 결함의 모델링 및 연구에 유용할 수 있다. 또한, 개시된 조성물, 방법, 및 시스템은 다양한 환자, 예를 들면 흉선의 선천적 태생 결함, 연령- 또는 임상적 개입-연관 퇴축을 갖는 환자에 대한 세포/조직 치료법을 위한 기능적 인간 흉선 상피를 생성하거나, 환자-특이적, 동질유전자 방식으로 기능적 T-세포를 생성하는데 유용할 수 있다.
개시된 분화된 흉선 상피 세포는 원발성 흉선 세포(즉, 기능적 흉선을 갖는 대상체로부터의 흉선 세포, 예를 들면 신생아 흉선 세포)에 전형적인 다양한 유전자 및 마커를 발현한다. 많은 구현예에서, 개시된 TEC는 하나 이상의 수질 TEC 마커, 예를 들면 KRT5, 및 하나 이상의 피질 TEC 마커, 예를 들면 KRT8를 상향조절한다. 개시된 TEC는 또한 FOXN1, HLA-Class II 분자, 예를 들면 HLA-DR4, 및 DLL4 중 하나 이상을 발현 및/또는 상향조절할 수 있다. 많은 구현예에서, 개시된 TEC는 원발성 인간 흉선에서 발견되는 것과 유사한 다양한 마커, 예를 들면 마커 FOXN1, KRT5, KRT8, TP63, CBX4의 발현을 보일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시된 iPSC-유래의 TEC는 원발성 인간 TEC와 단일 세포 RNA 시퀀싱 또는 다른 방법에 의해 구분할 수 없을 수 있다.
시험관내에서 흉선 세포를 생성하기 위한 본 개시된 직접 분화 공정 동안의 신호전달 경로 취급 효과에 대한 주의깊은 평가는 개시된 방법이 강력함을 보여준다. 예를 들면, 출원인은 놀랍게도 개시된 방법 및 시스템이 세포에 상이한 취급을 함에도 불구하고 5일에 전방화된 최종적 내배엽 세포 개체군을 확립하는데 유용함을 발견한다. 구체적으로, 도 1d에 나타낸 것과 같이, 개시된 방법 및 시스템은 제3 인두 마커를 높은 레벨로 발현하는 세포로 귀결되었다(도 1d). TPP 마커 HOXA3 단백질의 정량화는 개시된 방법으로 분화된 세포의 대략 40%가 상기 마커를 발현함을 밝혔다. 상기 결과는 2가지 측면을 보여준다: 첫번째는 표적 조직의 합리적인 유도를 보여주고, 두번째는 상기 분화 단계에서 더 높은 효율을 달성하기 위한 개시된 방법 및 시스템의 최적화 가능성을 강조한다(도 1e 및 도 1f).
2가지 독립적인 iPSC 주로부터 생산된 TEP가 무흉선 누드 마우스 내로 이식된 실험이 본 명세서에 개시된다. 상기 TEP는 마우스의 신장 피막(capsule) 아래에 두었고, 이후 다양한 파라미터에 의해 성숙에 대해 평가하였다. 본 기술분야에 잘 알려져 있는 것과 같이, 누드 마우스는 기능적 Foxn1 단백질의 부재로 인해 흉선이 없지만, 인간 또는 마우스의 기능적 흉선이 제공된다면 T-세포를 생성할 수 있는 HSC를 함유하고 있다. 다양한 구현예에서, 개시된 세포는 다양한 방식으로 수용자에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 TEP 세포는 수용자에서 다양한 위치로 이식될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 TEP 세포는 신장 피막, 예를 들면 넓적다리에 근육내, 피하, 복강내, 대망(omentum), (예를 들면, 예컨대 간문맥을 통한 관류에 의해) 간, 간 엽들 사이, 및/또는 가슴의 상부 전방, 흉골 아래에 이식될 수 있다.
iPSC-유래의 이식된 TEP를 함유하는 이식편을 케라틴 5 및 8의 존재에 대해 분석하였다. 상기 연구는 발달하는 인간 흉선 조직을 연상하는 이식편 내의 영역을 밝혔다. 구체적으로, 상기 이식편은 특징적인 이중 양성의 발달하는 TEC뿐만 아니라 보다 성숙한 단일 양성 TEC도 갖고 있었다. 마우스 CD4 및 CD8에 대해 이중 양성인 발달하는 T-세포는 또한 발달하는 흉선 구조에 인접해 발견되었는데, 이는 TEC가 기능적이고 마우스 T-세포를 교육할 수 있음을 설명한다. 대조군 누드 마우스와 비교하여 이러한 세포의 빈도가 증가되는 기능적 흉선과 일치하는 이식편-보유 마우스의 말초에서 더 많은 단일 양성 T-세포가 발견되었다.
개시된 세포는 성숙하고 분화된 TEC 세포에 전형적인 다양한 마커를 발현할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 발현되는 마커는 FOXN1, HOXA3, EYA1, AIRE, CK5, CK8, CXCL12, CCL25, DLL4, 및 HLA-DR 중 하나 이상일 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 마커는 유사한 조건 하에 참조 세포에서의 마커와 비교하여(예를 들면, 시험관내 배양된 TEP 세포는 생체내 이식된 TEC 세포와 비교될 수 있음) 약 1×, 2×, 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10×, 20×, 30×, 40×, 50×, 60×, 70×, 80×, 90×, 100×, 200×, 300×, 400×, 또는 500× 초과, 및 약 1,000×, 500×, 400×, 300×, 200×, 100×, 90×, 80×, 70×, 60×, 50×, 40×, 30×, 20×, 10×, 9×, 8×, 7×, 6×, 5×, 4×, 3×, 또는 2× 미만으로 차등 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 참조 또는 개시된 세포는 신생아 흉선 세포, 이식되지 않은 TEP 세포, 및 이식된 TEC로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 마커는 이식된 TEC 세포와 비교하여 TEP 세포에서 10× 더, 또는 TEP 세포와 비교하여 이식된 TEC 세포에서 10× 더 발현될 수 있다.
이식 전에 시험관내 생성된 iPSC-유래의 TEP, 2가지 상이한 iPSC 주 유래의 4가지 TEC 이식편, 및 2가지 원발성 인간 흉선의 비교 포괄적 전사체학 분석은 이식된 세포가 기능적 TEC로 분화되었음을 추가로 확인하였다. 예를 들면, 특이적 TEC 마커는 TEP와 비교하여 iPSC-유래의 TEC에서 현저하게 강화되었고, 발현 레벨은 원발성 인간 흉선의 경우와 유사하였다(도 3c 내지 도 3e). 한가지 예외는 발달하는 T-세포의 음성 선택을 위해 결정적인 흉선 유전자 AIRE인데, 이것은 상기 이식편에서 부재하였다. 이론에 의해 제한되길 원하지 않으면서, 출원인은 상기 부재가 인간 TEC와 마우스 T-세포의 이종이식 상호작용으로 인한 것일 수 있음을 주목한다. 특히, 이식을 위해 hES-유래의 TEP를 도입한 이전의 연구도 또한 AIRE 발현을 검출하는데 실패하였다. 전체 전사체학 분석을 위한 대량 RNA 시퀀싱은 시퀀싱의 심도를 증가시킴으로써 매우 낮게 발현되는 유전자의 검출도 허용하지만, 분석된 샘플 내에서 이질성을 디콘볼루션(de-convolution)할 수 없었다.
scRNAseq는 이식편 유래의 개별 세포에 도입되었고, 그 결과를 원발성 신생아 흉선과 비교하였다. 이것은 개별 세포의 수 천개 발현 프로필의 확인을 허용하고, 따라서 높은 신뢰도로 샘플 내의 상이한 세포 타입의 분류를 가능하게 한다. 비지도(unsupervised) 클러스터 분석을 사용하여 샘플 이식편 내의 특정 하위개체군을 정의하였고, 마커 발현 프로필을 사용하여 특정 기능적 세포 부류를 클러스터 하위개체군으로 할당하였다. 생물정보학 분석을 사용하여 높은 신뢰도로 인간 및 마우스 세포 사이를 추가로 구별하였다. 예상한 것과 같이, 마우스 및 인간 세포 모두 이종이식편 유래의 TEC 이식편에서 발견되었지만, 어떤 마우스 세포도 원발성 흉선에서 발견되지는 않았다. 다수의 마우스 세포는 지지하는 중간엽 세포를 닮은 전사체(transcriptome)를 제공하지만, 항원 제공 수지상 세포와, 가장 중요하게는, 발달하는 T-세포도 또한 확인되었다. 원발성 흉선으로부터 분석된 다수의 세포는 발달하는 T-세포였고, 특징적인 TEC가 함께 확인 및 클러스터되었다. 부가적으로, 흉선에서 존재하는 것으로 알려진 수지상 및 중간엽 세포를 포함하는 다른 하위개체군이 확인되었다. 상기 결과는 작지만 주목할만한 TEC 하위개체군이 iPSC-유래의 이식편에 존재하고, 상기 세포가 함께 원발성 TEC를 클러스터함을 설명하였다(도 5a 및 도 5c). 중요한 것은, iPSC-유래의 TEC는 FOXN1, AIRE, EPCAM, KRT5, KRT8, DLK1, PRSS16, PSMB11, CXCL12, 및 CCL25와 같은 성숙한 TEC의 핵심 마커를 원발성 흉선 조직에서 보이는 것과 유사한 레벨로 발현한다(도 5g). 따라서, 본 개시된 iPSC-유래의 TEC는 생물정보학 분석의 도입에 의해 원발성 TEC로부터 구분할 수 없고, 이는 개시된 방법 및 시스템이 기능적 TEC의 생성에 유용함을 설명한다.
상기 생성된 데이터 세트는 iPSC-유래 및 원발성 TEC 모두가 특징적인 마커 유전자를 발현하고, 하위부류로 추가로 나누어질 수 있음을 확인하는데 유용하였다. 상기 분석은 TEP에서 TEC로 분화하는데 액티빈 신호전달 경로가 관여됨을 제시한다(도 5g).
개시된 세포, 방법, 및 시스템은 환자-특이적 iPSC를 시험관내에서 기능적이고 성숙한 TEC로 추가로 분화될 수 있는 TEP 세포로 분화시키기 위한 범용적인 프로토콜을 제공한다. 2가지 지표가 본 개시된 TEC의 생성을 축진하는데 유용하다; 흉선 발달 및 (이후의) 발달하는 T-세포와의 상호작용을 위한 적절한 구조를 제공할 수 있는 3D 배양 조건의 제공. 일부 구현예에서, 이전에 기술된 것과 같이, 흉선 기관형 배양물의 재응집(RTOC)이 유용할 수 있다. 상기 시스템에서, 원발성 인간 흉선으로부터 상피 및 중간엽 구획(compartment)의 성장은 특정 배지 조성물에 의해 지원될 수 있다. 확장 후, 양쪽 세포 타입은 다양한 공급원(예를 들면, 제대혈)으로부터 단리된 CD34 양성 세포와 함께 재응집되어 RTOC를 생성할 수 있다. 상기 RTOC는 T-세포의 발달을 지원하는데 유용할 수 있고, 따라서 T-세포 교육의 측면을 연구하기 위한 뛰어난 시스템을 나타낸다. 그러나, RTOC를 사용하기 위한 불리한 점이 있다. 구체적으로, 동종이계(allogenic) 기원의 T-세포 전구체는 소정 실험, 특히 선택적인 환자-특이적 환경을 필요로 하는 실험을 방해할 수 있다.
유사한 3D 전략이 최근 인공 흉선 올가노이드(ATO)로서 기술되었다. ATO는 iPSC-유래의 배아 중배엽 전구체를 조합하고, 이것은 이후에 DLL4을 과발현하는 쥐과(murine)의 골수 유래 기질 세포주(MS5-hDLL4)와 공동-배양될 때 다양한 레퍼토리의 양성적으로 선택된 T-세포를 생성할 수 있다. 출원인은 본 명세서에서 다양한 연구 노력에 도움을 줄 수 있는 TEP를 생성하기 위한 본 개시된 범용적인 프로토콜의 용도를 기술한다. 일부 경우에 있어서, 개시된 프로토콜 및 시스템은 발달하는 T-세포의 양성 및 음성 선택 모두를 제공할 수 있는 동질유전자 배양 시스템을 확립하기 위한 진행 중인 연구 프로젝트의 측면들을 조합함에 있어서 유용할 수 있다. 다른 측면에서, 개시된 세포 및 프로토콜은 조절자(regulator) 세포를 포함하는 다양한 환자-특이적 T-세포의 생성뿐만 아니라 기능적 인간 흉선 세포 타입의 발달을 촉진하는데 유용할 수 있다. 개시된 세포, 프로토콜, 및 시스템은 다양한 세포 치료법의 발달을 가속화하는데 도움을 주고, 흉선 및 T-세포 생물학 모두를 이해하기 위한 기초적 및 번역적 연구 노력을 도울 수 있다.
정의
용어 "동종이식편"은 공여자로부터 유래되어 수용자 환자 또는 대상체에게 투여되는 세포를 나타낸다. 상기 공여자는 소정의 기준과 일치할 수 있지만, 투여되는 세포는 상기 수용자로부터 유래된 것은 아니다. 상기 경우에 있어서, 투여되는 세포는 공여자로부터 추출되고, 수용자에게 투여되기 전에 처리 및/또는 확장될 수 있다. 많은 구현예에서, 상기 이식편 세포는 투여되기 전에 외래의 생물학적 물질, 예를 들면 핵산 및/또는 단백질을 수용할 수 있다.
용어 "자가이식편"은 수용자로부터 유래되어 수용자에게 투여되는 세포를 나타낸다. 상기 경우에 있어서, 투여되는 세포는 수용자로부터 추출되고, 상기 환자에게 다시 투여되기 전에 처리 및/또는 확장될 수 있다. 많은 구현예에서, 상기 자가이식편 세포는 수용자에게 다시 투여되기 전에 외래의 생물학적 물질, 예를 들면 핵산 및/또는 단백질을 수용할 수 있다.
용어 "이종이식편"은 다른 종의 공여자로부터 유래되어 수용자에게 투여되는 세포를 나타낸다.
용어 "흉선 상피 세포" 또는 "TEC"는 흉선 기질 내의 흉선 상피에 위치하며 높은 정도의 해부학적, 표현형적 및 기능적 이질성을 갖는 전문화된 세포를 나타낸다. 원발성 림프계(lymphoid) 기관으로서, 흉선은 T-세포의 발달 및 성숙을 매개한다. TEC는 각각 흉선 피질 또는 수질 내에서의 위치에 기반하여 피질 및 수질 TEC(cTEC 및 mTEC)로 추가로 나누어진다.
용어 "흉선 상피 전구" 세포 또는 "TEP" 세포는 하나 이상 종류의 흉선 상피 세포를 형성하기 위해 분화될 수 있지만 무기한 분열 및 재생될 수 없는 줄기 세포의 초기 후손을 나타낸다.
용어 "조혈 줄기 세포", "HPSC" 또는 "HSC"는 혈액 및 면역 세포(예컨대, 백혈구, 적혈구, 및 혈소판)를 형성하는 줄기세포를 나타낸다.
용어 "다능성 줄기 세포" 또는 "PSC"는 적절한 조건 하에 모든 3종의 배엽(내배엽, 중배엽, 및 외배엽)의 유도체인 몇 가지 상이한 T-세포 타입의 자손을 생산하는 능력을 갖는 세포를 나타낸다. 다능성 줄기 세포의 예는 배아 줄기(ES) 세포, 배아 생식 줄기(EG) 세포, iPSC, 및 성체 줄기 세포이다. PSC는 영장류, 예컨대, 인간, 개, 고양이, 쥐과, 말, 돼지, 조류, 낙타, 소, 양, 등을 포함하는 임의의 관심있는 유기체로부터 유래될 수 있다.
용어 "인간 배아 줄기 세포" 또는 "hESC"는 a) 자가-재개할 수 있고, b) 유기체 내의 모든 타입의 세포를 생성하도록 분화될 수 있고, 및 c) 발달하는 유기체로부터 유래되거나 발달하는 유기체로부터 기원된 확립된 ES 세포주인 세포를 나타낸다. ES 세포는 발달하는 유기체의 포배의 내부 세포 덩어리로부터 유래될 수 있다. ES 세포는 발달하는 유기체의 8개 T-세포 단계로부터 단일 할구를 제거하는 것을 수반하는 단일 할구 생검(SBB)에 의해 생성된 할구로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, SBB는 내부 세포 덩어리 단리에 대한 비-파괴적 대체물을 제공한다. ES 세포는 유기체에서 모든 타입의 세포로 분화되는 능력을 유지하면서 장기간에 걸처 배양될 수 있다. 배양시, ES 세포는 전형적으로 큰 핵-세포질 비, 분명한 경계 및 두드러진 핵을 갖는 평평한 콜로니(colony)로 성장한다. 또한, ES 세포는 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, 및 알칼린 포스파타아제를 발현하지만, SSEA-1는 발현하지 않는다.
용어 "유도 다능성 줄기 세포" 또는 "iPSC"는 a) 자가-재개할 수 있고, b) 유기체 내의 모든 타입의 세포를 생성하도록 분화될 수 있고, 및 c) 체세포로부터 유래되는 세포를 나타낸다. iPSC는 ES 세포-유사 형태학을 갖고, 큰 핵-세포질 비, 분명한 경계 및 두드러진 핵을 갖는 평평한 콜로니로 성장한다. 또한, iPSC는 본 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 하나 이상의 핵심 다능성 마커를 발현한다. iPSC는 세포에 "재프로그램밍 인자", 즉 하나 이상의, 예컨대, 전사를 변경하도록 세포에 작용하는 생물학적 활성 인자의 칵테일을 제공하고, 이로 인해 세포를 다능성으로 재프로그래밍함으로써 생성될 수 있으며, 이는 본 기술분야의 기술자에게 잘 알려져 있다.
용어 "세포주"는 전형적으로 단일 선조 세포 또는 선조 세포의 정의된 및/또는 실질적으로 동일한 개체군으로부터 유래되는 대체로 또는 실질적으로 동일한 세포의 개체군을 나타낸다. 상기 세포주는 연장된 기간(예컨대, 수개월, 수년, 무제한적 기간) 동안 배양물에서 유지되었거나 유지될 수 있다.
용어 "내배엽"은 위장관, 기도, 내분비선 및 기관, 소정 구조의 청각 시스템, 및 소정 구조의 비뇨 시스템을 생성하는 동물 배아발생 동안 형성된 배엽을 나타낸다.
용어 "전환 성장 인자 베타", "TGF-β", 및 "TGFB"는 전환 성장 인자 β(TGFβ) 수퍼패밀리에 속하는 TGFB 분비 단백질을 나타낸다. TGFB(TGFB1, TGFB2, TGFB3)는 많은 세포 타입에서 증식, 분화, 부착, 및 이동을 조절하는 다기능성 펩티드이다. 성숙한 펩티드는 다른 TGFB 패밀리 구성원과의 호모다이머(homodimer) 또는 헤테로다이머(heterodimer)로 발견될 수 있다. TGFB는 세포 표면의 전환 성장 인자 베타 수용체(TGF-βR, 또는 TGFBR)와 상호작용하고, 그 결합은 MAP 키나아제-, Akt-, Rho- 및 Rac/cdc42-지향성 신호 전달 경로, 세포 아키텍처(architecture)의 재조직화 및 SMAD 단백질의 핵 위치화, 및 표적 유전자 전사의 조정을 활성화시킨다. 본 발명에서 특히 관심있는 것은 TGFB 신호전달의 억제제이며, 이것은 임의의 다수의 방법, 예를 들면 TGFB 또는 TGFB 수용체에 대한 결합을 위한 경쟁적 결합 분석법, 또는 기능적 분석법에 의해, 예컨대 본 기술분야에 잘 알려진 것과 같이 MAPK, Akt, Rho, Rac, 및 SMAD, 예컨대, AR-Smad, 등과 같은 하류 신호전달 단백질의 활성의 저해를 측정함으로써 본 기술분야의 기술자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
용어 "WNT"는 배아발생 및 성숙한 조직 모두에서 핵심 역할을 수행하는 매우 보존된 분비 신호전달 분자의 패밀리를 나타낸다. 인간 WNT 유전자 패밀리는 적어도 19개 구성원(Wnt-1, Wnt-2, Wnt-2B/Wnt-13, Wnt-3, Wnt3a, Wnt-4, Wnt-5A, Wnt-5B, Wnt-6, Wnt-7A, Wnt-7B, Wnt-8A, Wnt-8B, Wnt-9A/Wnt-14, Wnt-9B/Wnt-15, Wnt-10A, Wnt-10B, Wnt-11, Wnt-16)을 갖는다. Wnt 단백질은 Frizzled(Fz) 패밀리의 단백질 유래의 폴리펩티드 및 저밀도 지단백질 수용체(LDLR)-연관 단백질(LRP) 패밀리의 단백질의 폴리펩티드를 포함하는 Wnt 수용체 복합체에 결합함으로써 세포 활성을 조정한다. Wnt 결합에 의해 활성화되면, 상기 Wnt 수용체 복합체는 하나 이상의 세포내 신호전달 캐스케이드(cascade)를 활성화할 것이다. 이것은 정규(canonical) Wnt 신호전달 경로; Wnt/planar 세포 극성(Wnt/PCP) 경로; 및 Wnt-칼슘(Wnt/Ca2+) 경로를 포함한다.
용어 "치료", "치료하는" 등은 본 명세서에서 일반적으로 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미하기 위해 사용된다. 상기 효과는 질환 또는 그의 징후를 완전히 또는 부분적으로 방지하는 측면에서 예방적일 수 있고, 및/또는 질환 및/또는 상기 질환으로부터 기인하는 부작용에 대한 부분적인 또는 완전한 치유의 측면에서 치료적일 수 있다. 치료는 본 명세서에서 사용될 때 포유동물에서 질환의 임의의 치료를 포괄하고, (a) 질환의 성향이 있을 수 있지만 아직 질환을 갖는 것으로 진단되지는 않은 대상체에서 질환이 일어나는 것을 방지하거나; (b) 질환을 억제, 즉 그 발생을 저지하거나; 또는 (c) 질환을 완화, 즉 질환의 축소를 유발하는 것을 포함한다. 치료제는 질환 또는 부상의 개시 이전, 동안 또는 이후에 투여될 수 있다. 진행중인 질환의 치료는 특히 관심이 있으며, 상기 치료는 환자의 원하지 않는 임상 징후를 안정화 또는 감소시킨다. 이러한 치료는 발병된 조직에서 기능의 완전한 소실 이전에 수행되는 것이 바람직하다. 대상체의 치료법은 질환의 징후 단계 동안에, 그리고 일부 예에서는 질환의 징후 단계 후에 투여되는 것이 바람직할 것이다.
용어 "증상", "장애", 및 "질환"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 대부분의 경우에, 상기 용어들은 손상된, 고갈된, 노화된, 고장난, 또는 결손된 흉선 조직과 연관된 임의의 하나 이상의 증상, 및/또는 예를 들면 자가면역 장애, 및/또는 T-세포 발달 장애와 연관되는 T-세포 장애를 포함할 수 있는 면역 증상에 관한 것이다. 일부 경우에 있어서, 개시된 면역 장애는 제1형 당뇨병, 및/또는 자가-항원에 대한 내성의 유도 또는 재도입이 유익할 수 있는 다른 증상일 수 있다.
용어 "개인", "대상체", "숙주", 및 "환자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 진단, 치료, 또는 치료법이 요구되는 임의의 표유류 대상체, 특히 인간을 포함하는 포유동물을 나타낸다.
세포 배양의 문맥에서 용어 "배지" 또는 어구(phrase) "세포 배양 배지" 또는 "세포 배지"는 전술한 모든 세포, 예를 들면 PS 세포, DE 세포, AFE 세포, VPE 세포, TEP 세포를 포함하는 다양한 세포의 배양에 적합한 세포 성장 배지를 나타낸다. 세포 배양 배지의 예는 최소 필수 배지(MEM), 이글(Eagle) 배지, 둘베코(Dulbecco) 변형 이글 배지(DMEM), 둘베코 변형 이글 배지/영양분 혼합물 F-12(DMEM/F12), F10 영양분 혼합물, 햄(Ham) F10 영양분 혼합물, 햄 F12 영양분 혼합물, 배지 199, RPMI, RPMI 1640, 저감 혈청 배지, 기초 배지(BME), DMEM/F12(1:1) 등, 및 이들의 조합을 포함한다. 상기 배지 또는 세포 배양 배지는 하나 이상의 첨가제를 첨가함으로써 변형될 수 있다. 첨가제는 혈청, 예컨대 우태아혈청 및/또는 혈청 대체제, 예컨대 B27, N2, KSR, 및 이들의 조합, 및 분화 인자, 예컨대 RA 수용체, 노달, Act-A, Act-B, Wnt 패밀리 구성원의 활성화제, BMP 신호전달의 활성화제, TGF-β 신호전달의 억제제, FGF, 헤지호그(hedgehog) 신호전달의 억제제 등, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 마커(단백질, 유전자, 전사물, 등)의 문맥에서 "발현" 및 이의 문법적 등가물은 마커의 생산뿐만 아니라 마커의 레벨 또는 양을 나타낸다. 예를 들면, 세포에서 마커가 발현하거나 마커가 존재하는 것 또는 세포가 마커에 대해 양성인 것은 양성 대조군 레벨과 유사한 레벨로 상기 마커가 발현되는 것을 나타낸다. 상기 양성 대조군 레벨은 상기 마커와 연관된 세포 운명을 갖는 것으로 알려진 세포에 의해 발현되는 마커의 레벨에 의해 결정될 수 있다. 유사하게, 마커가 부재한 것 또는 세포가 마커에 대해 음성인 것은 음성 대조군 레벨과 유사한 레볼로 상기 마커가 발현되는 것을 나타낸다. 상기 음성 대조군 레벨은 상기 마커와 연관된 세포 운명을 갖지 않는 것으로 알려진 세포에 의해 발현되는 마커의 레벨에 의해 결정될 수 있다. 이와 같이, 마커의 부재는 단순히 상기 마커의 발현이 검출부가능한 레벨인 것을 의미하는 것은 아니며, 소정 경우에 있어서, 세포는 상기 마커를 발현할 수 있지만 상기 발현은 양성 대조군과 비교하여 낮을 수 있거나 음성 대조군의 경우와 유사한 레벨일 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, "마커"는 측정 또는 검출될 수 있는 임의의 분자를 나타낸다. 예를 들면, 마커는 유전자의 전사물과 같은 핵산, 유전자의 폴리펩티드 생성물, 당단백질, 탄수화물, 당지질, 지질, 지단백질, 탄수화물, 또는 소분자(예를 들면, 10 kDa 미만의 분자량을 갖는 분자)를 비제한적으로 포함할 수 있다.
흉선 발달 및 기능에서의 결함은 면역학적 결핍 및 자가면역 질환의 개시로 귀결될 수 있다. 따라서, 흉선의 올바른 발달은 개인이 외래 항원은 인식 및 반응하지만 자가-항원에는 내성인 능력을 보장하는데 결정적이다. 현재로서는 인간 흉선의 발달에 수반되는 메커니즘을 탐구하기 위한 매우 적은 연구가 행해졌다. 이것은 일차적으로 인간 흉선 발달을 위한 충분한 모델 시스템이 없기 때문이고, 인간 FOXN1에 대한 고품질 항체와 같은 신뢰할만한 연구 도구가 없는 것에 의해 추가로 악화된다. 전통적으로, 흉선 발달 및 자가면역성에 대한 연구는 대체로 마우스 모델로 제한되어 왔다. 이것은 대부분 발달하는 인간 흉선의 가용성의 부재, 및 충실한 시험관내 인간 흉선 모델의 부재로 인한 것이다. 인간 및 환자-특이적 방식으로 흉선 발달을 연구하기 위해 필요한 도구 및 모델이 본 명세서에 기술된다.
흉선은 각각 표현형적 및 형태학적으로 구별된 서브세트의 흉선 상피 세포인 cTEC 및 mTEC로 구성되는 2개의 구별된 구획인 피질과 수질로 나누어진다. cTEC 및 mTEC는 T-세포의 발달에 있어서 구별된 기능을 수행하며, cTEC는 CD3, CD4 및 CD8 표면 수용체의 발현에 대해 발달하는 T-세포의 양성 선택에 있어서 기능하고, mTEC는 자가반응성 T-세포의 음성 선택의 공정에 있어서 기능한다. 상기 서브세트는 cTEC의 경우 DLL4 및 K8, 및 mTEC의 경우 AIRE 및 K5와 같은 다양한 마커의 사용에 의해 분화될 수 있다. 일부 예에서, 상기 TEC 서브타입 특이적 마커의 존재는 STOC에서 검출될 수 있다.
지향성 분화 시스템은 생체내 이식 후 T-세포 교육을 지원하는 능력을 갖는 기능적 TEC로 추가로 성숙될 수 있는 hESC로부터 TEP 세포를 생성하기 위해 확립되었다. 그러나, iPSC에 적용할 때, 동일한 프로토콜은 시험관내에서 iPSC를 TEP 세포로 분화시키는데 충분하지 않았다. 따라서, 본 개시된 범용적인 지향성 분화 프로토콜은 다양한 공급원으루부터 유래되는 다양한 iPSC 주를 분화시키기에 충분하다.
본 개시는 iPSC로부터 TEP 세포를 유도하고 테스트된 모든 iPSC 주를 효율적으로 분화시키는 모델 시스템을 기술한다. 일부 구현예에서, TEP 세포는 환자-특이적 인간 iPSC로부터 유도될 수 있다. 또한, FOXN1 리포터(reporter) 주가 개시되며, 여기서 상기 리포터는 내인성(endogenous) FOXN1 유전자에 첨부된다. 일부 예에서, 상기 리포터는 내인성 FOXN1 발현에 의해 구동되는 형광 리포터 유전자일 수 있다. 상기 시스템은 다양한 목적을 위해 FOXN1의 시각화 및/또는 면역침전을 허용할 수 있다. 일부 구현예에서, FOXN1은 발달하는 TEP 세포에서 크로마틴 결합의 분석 및/또는 유전자 발현 분석을 위한 FOXN1+ 세포의 단리를 돕기 위해 태그될 수 있다.
개시된 분화 프로토콜 및 시스템은 동종이식편에 공여자-특이적 면역 내성을 부여함에 있어서 적용분야를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 단수 형태인 "한", "하나" 등은 그 내용이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 참조물을 갖는 구현예를 포괄한다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용될 때, 용어 "또는"은 일반적으로 그 내용이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 "및/또는"을 포함하는 의미로 도입된다.
실시예
본 개시를 실증하기 위하여, 다음의 실시예가 포함된다. 그러나, 하기 실시예는 본 개시를 제한하는 것은 아니며, 단지 본 개시를 실행하는 예시적인 방법을 제시하기 위한 의미임이 이해되어야 한다.
결과 - 환자-특이적 iPSC로부터 흉선 상피 전구체의 지향성 분화를 위한 범용적인 프로토콜의 생성
몇 가지 iPSC 주인 CB3, CB5, 및 CB74를 기술된 것과 같이 비-통합적 에피솜 벡터를 이용하여 제대혈 유래 말초혈 단핵구(PBMC)로부터 내부적으로 생성하였다(도 7a, 실시예 1의 재료 및 방법). 세포주 NHDF2.1은 RNA-기반의 재프로그래밍을 이용하는 인간 신생아 진피 섬유아세포로부터 생성하였고, 이전에 기술되어 있다. CRISPR/Cas9 기술과 접목된 상동성 재조합을 이용하여 P2A 자가-절단 펩티드에 의해 분리된 HA 에피토프 태그 및 핵 위치화 신호 결박 클로버 형광 리포터를 NHDF2.1에서 중지 코돈 직전에 위치한 내인성 FOXN1 좌(locus)에 표적화하여 딸세포주 NHDF2.2를 생성하였다(도 7b). 그러나, 상기 이식유전자(transgene)는 상기 부위에 올바르게 표적화되었지만(도 7c), 상기 형광 리포터는 내인성 FOXN1 발현을 모니터링하기에 신뢰할 수 없었다. 이론에 의해 제한되기 원하지 않지만, 이것은 선택된 표적화 전략으로부터 생성된 단백질 합성의 감소로 인한 것일 수 있다. 따라서, 상기 이식유전자는 여기서 분석하지 않았다. 대신에, 세포주 NHDF2.1 및 NHDF2.2를 상호교환적으로 사용하였다.
본 개시된 조성물, 방법, 및 시스템은 시험관내에서 iPSC를 기능적 TEP 세포로 분화시키는데 유용할 수 있다. 많은 구현예에서, 개시된 iPSC는 세포주, 자가성, 및 동종이계 공급원을 포함하는 다양한 공급원으로부터 수득되거나 유래될 수 있다. 많은 구현예에서, 상기 iPSC는 다양한 방법을 이용해 생성될 수 있다.
본 연구에 있어서 클론성 iPSC 주는 각각 qPCR 및 면역 형광 염색에 의해 다능성 마커 전사물 및 단백질, OCT4, SOX2, NANOG를 대조군 Mel1 hESC와 필적하는 레벨로 발현한다(도 7d, 도 7e). 분석된 iPSC 주 중 하나를 제외한 모두는 정상 핵형을 나타낸다(도 7f). 구체적으로, 세포주 NHDF2.2는 g-밴드 핵형분석(karyotyping)에 의해 분석될 때 모든 세포에서 삼염색체성(trisomy)의 14번 염색체(iPSC에서의 공통적 비정상)를 함유한다(도 7f).
지향성 분화를 통한 hESC-유래의 TEP의 생성이 보고되어 있다. 상기 발견에 더하여, TEP 단계에서 FOXN1 발현에 대한 최종적 내배엽(DE) 및/또는 제3 인두 파우치(TPP) 단계에서의 구별된 변화의 효과를 분석하였다. 다양하게 테스트된 조건은 분화 프로토콜의 9일까지 TPP 마커인 HOXA3 및 EYA1의 강력한 전사물 발현으로 귀결되는 것으로 나타났다(도 1a 내지 도 1c). 아울러, HOXA3 및 EYA1 발현은 모든 분화 프로토콜의 14일에 증가되었고 높게 유지되었다(도 1d).
테스트된 조건들(및 도 1b의 목록들) 중, 조건 4는 9일 및 14일에 모두 가장 높은 레벨의 FOXN1 전사물을 유도하는 것으로 확인되었다(도 1c 도 1d). 조건 4로 분화된 배양물의 9일의 면역형광 분석 및 정량화는 약 45% HOXA3+ 세포를 보여주었고, 이는 효율적인 TPP 생성을 나타낸다(도 1e, 도 1f).
본 명세서에 개시된 다른 조건들과 같이, 조건 4 분화는 iPSC를 플레이팅한 후 24시간에 시작되었다. 구체적으로, 분화는 X-VIVO10 배지(Lonza 04-743Q)에서 수행하였고, 다음의 인자들을 표시된 농도로 첨가하였다: 액티빈 A, 100 ng/㎖(0-4일); Wnt3a, 50 ng/㎖(d0, 및 d9-13); TTNPB(RAR 작용제) 6 nM(d4-13); BMP4, 20 ng/㎖(d5-13); LY364947, 5 μM(d5-13); FGF8b 또는 FGF8a, 50 ng/㎖(d9-13); SAG, 100 ng/㎖(d5-8); SANT-1, 0.25 μM(d9-13) 인슐린-트랜스페린(transferrin)-셀레늄, 1:5,000(d0) 또는 1;2,000(d1-4). 많은 구현예에서, 다양한 보충제 및/또는 인자가 생성된 세포 표현형을 개선 및/또는 안정화하는데 유용할 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 보충제는 트롤록스, 0.1 mM; 헤파린, 10 ㎍/㎖; 2-포스포-L-아스코르브산 트리나트륨 염, 50 ㎍/㎖; 히드로코르티손 0.5 ㎍/㎖; 인슐린-트랜스페린-셀레늄, 1:2000; 비필수 아미노산, 1×; EGF, 20 ng/㎖;로부터 선택될 수 있다. 보충제 및 인자는 다양한 공급원, 예를 들면 스템셀 테크놀로지스(액티빈 A, SAG, TTNPB), R&D 시스템스(BMP4 및 FGF8), 노부스 바이올로지컬스(Wnt3a), 페프로테크(FGF8a 및 FGF8b), VWR(TTNPB 및 LY364947), 셀렉 케미컬스(SANT-1), 집코(ITS 및 NEAA), 시그마-알드리치(2-포스포-L-아스코르브산 트리나트륨 염, 헤파린, 히드로코르티손), 밀리포어-시그마(트롤록스)로부터 이용가능할 수 있다.
조건 4의 개선된 TEP 분화 프로토콜을 2가지 부가적인 iPSC 주로 총 3가지 독립적인 iPSC 세포주(NHDF2.2, CB3, CB5)에 대해 테스트하였다. 14일 배양물의 qPCR 분석은 제3 인두 파우치(TPP) 마커인 HOXA3 및 EYA1, 및 TEP 마커인 FOXN1의 강력한 유도를 보여준다(도 1g). 요약하면, 상기 결과는 다양한 인간 iPSC로부터 TEP를 효율적으로 생성하기 위한 지향성 분화 프로토콜 - 범용적인 분화 프로토콜의 확립을 설명한다. 상기 실험에서, 범용성은 상이한 재프로그래밍 기술을 이용하여 다수의 공여자로부터 유래된 iPSC에 대한 효과적인 테스트를 통해 설명된다.
iPSC는 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 공급원은 피부, 자궁 조직, 신장, 간, 근육, 부신, 혈액, 등일 수 있고, 상기 세포는 뉴런 세포, 섬유아세포, 근육세포, 각질세포, 간세포, B 세포, 등일 수 있다.
이전에, TGFβ는 흉선 기관형성 및 기능화 과정과 연관되었다. 따라서, TEP 분화 프로토콜에 대한 TGFβ의 첨가가 iPSC로부터 TEP의 보다 효율적이고 강력한 생성으로 귀결될 것인지 여부를 결정하기 위한 실험을 수행하였다(도 8a, 도 8b). 본 데이터는 전방 전장 내배엽(AFG)으로부터 TEP 단계 동안 또는 TPP로부터 TEP 단계 동안 TGFβ를 첨가하는 것은 iPSC에서 TEP로의 분화 효율에 거의 영향을 미치지 않음을 나타낸다(도 8b 및 도 8c). 부가적으로, TGFβ 첨가는 TPP 마커인 HOXA3 및 EYA1의 유도에 영향을 미치지 않는다(도 8c).
실시예 1 - 재료 및 방법
세포 배양
미분화된 iPSC를 제조사의 설명서에 따라 mTeSR1(Stemcell Technologies), NutriStem(Biological Industries), 또는 mTeSR 플러스(Stemcell Technologies)에서 마트리겔(Corning) 상에 유지하였다. 분화를 위하여, iPSC를 3.15e5 세포/㎠로 마트리겔 상에 플레이팅하였다. 플레이팅 24시간 후 분화를 시작하였고, X-VIVO10(Lonza의 혈청 부재 조혈 세포 배지; 04-743Q)에서 수행하였다. 인자들을 다음의 농도로 첨가하였다: 액티빈 A, 100 ng/㎖(d0-4); Wnt3a, 50 ng/㎖(d0, 및 d9-13); TTNPB(RAR 작용제) 6 nM(d4-13); BMP4, 20 ng/㎖(d5-13); LY364947, 5 μM(d5-13); FGF8b 또는 FGF8a, 50 ng/㎖(d9-13); SAG, 100 ng/㎖(d5-8); SANT-1, 0.25 μM(d9-13) 인슐린-트랜스페린-셀레늄, 1:5,000(d0) 또는 1;2,000(d1-4). 일자의 수는 조건 4에 대해 사용된 시간을 반영하며, 인자들의 타이밍(timing)은 도 1b에 따른 다른 조건의 경우에 상이할 수 있다.
상기 분화 배지에서 인자들의 첨가 및 타이밍은 다양할 수 있다. 일부 구현예에서, Wnt3a는 d0에 존재한다; 액티빈 A는 0, 1, 2, 3, 4, 및/또는 5일에 존재한다; 레티노산(또는 그의 유사체)은 4 및/또는 5일에 존재한다; BMP4, 레티노산, LY364947, 및/또는 SAG는 5, 6, 7, 8, 및 9일 중 하나 이상에 존재한다; 및 BMP4, 레티노산, LY364947, Wnt3a, FGF8, FGF8a, 및 SANT-1 중 하나 이상은 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 및 14일 중 하나 이상에 존재한다. 많은 구현예에서, 배지에서 액티빈 A의 농도는 약 50-200 ng/㎖, 예를 들면 100 ng/㎖일 수 있고, 배지에서 Wnt3a의 농도는 약 10-100 ng/㎖, 예를 들면 50 ng/㎖일 수 있고, 배지에서 TTNPB(RAR 작용제)의 농도는 약 2-10 nM, 예를 들면 6 nM(d4-13)일 수 있고, 배지에서 BMP4의 농도는 약 5-50 ng/㎖, 예를 들면 20 ng/㎖일 수 있고, 배지에서 LY364947의 농도는 약 1-10 μM, 예를 들면 5 μM일 수 있고, 배지에서 FGF8b 또는 FGF8a의 농도는 약 10-200 ng/㎖, 예를 들면 50 ng/㎖일 수 있고, 배지에서 SAG의 농도는 약 50-200 ng/㎖, 예를 들면 100 ng/㎖일 수 있고, 배지에서 SANT-1의 농도는 약 0.05-0.5 ng/㎖, 예를 들면 0.25 μM일 수 있다.
개시된 분화 배지는 하나 이상의 보충제를 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 다음의 보충제가 도 1g에서 사용된 분화를 위해 d9-13에 첨가될 수 있다: 트롤록스, 0.1 mM; 헤파린, 10 ㎍/㎖; 2-포스포-L-아스코르브산 트리나트륨 염, 50 ㎍/㎖; 히드로코르티손 0.5 ㎍/㎖; 인슐린-트랜스페린-셀레늄, 1:2000; 비필수 아미노산, 1×; EGF, 20 ng/㎖. 보충제 및 인자들은 스템셀 테크놀로지스(액티빈 A, SAG, TTNPB), R&D 시스템스(BMP4 및 FGF8), 노부스 바이올로지컬스(Wnt3a), 페프로테크(FGF8a 및 FGF8b), VWR(TTNPB 및 LY364947), 셀렉 케미컬스(SANT-1), 집코(ITS 및 NEAA), 시그마-알드리치(2-포스포-L-아스코르브산 트리나트륨 염, 헤파린, 히드로코르티손), 밀리포어-시그마(트롤록스)로부터 구입하였다.
PBMCS의 수집 및 iPSC로의 재프로그래밍 및 신생아 흉선 조직의 수집
비식별된 제대혈을 콜로라도 대학교의 제대혈 은행으로부터 입수하였다(http://www.clinimmune.com/cordbloodbank/). 인간 대상체의 사용은 콜로라도 대학교 다중 기관생명윤리위원회에 의해 승인되었다(COMIRB #14-0842; 책임 연구자 AJ). 인간 말초혈 단핵구 세포(PBMC)를 단리하였고, 적혈구 확장 보충제(스템셀 테크놀로지스)를 갖는 StemSpan SFEM II 배지에서 6일 동안 확장시켰다. 적혈구 전구 세포를 이전에 기술된 것과 같이 P3 원발성 세포 4D 뉴클레오펙터 X Kit L(Lonza)를 이용하여 오키타(Okita) 인자로 형질도입하였다. 형질도입된 세포를 마트리겔 코팅된 6 웰 플레이트에 플레이팅하였고, 2일마다 배지를 교환하면서 ReproTeSR 배지(스템셀 테크놀로지스)에서 14일 동안 배양하였다. 이후, 매일 배지를 교환하면서 배양물에 mTESR1(스템셀 테크놀로지스)을 공급하였다. 개별 iPSC 콜로니를 12-18일 사이에 고른 후, 상기에 개략적으로 나타낸 것과 같이 확장 및 표현형 분석을 행하였다. 비-인간 대상체 연구로서 콜로라도 대학교 다중 기관생명윤리위원회에 의해 심의 및 승인받은 후 비식별 인간 신생아 흉선 조직을 입수하였다(COMIRB #18-0347; principal investigator HAR).
정량적 실시간 PCR
RNA를 hPSC 및 TEP 배양물로부터 추출하였고, RNeasy 마이크로 키트(QIAGEN)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 이식편을 절개하였다. iScript cDNA 합성 키트(Bio-Rad, 1708891BUN)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 RNA의 역전사를 수행하였다. 아래에 나열된 인간 특이적 Taqman 프로브(Bio-Rad 또는 ThermoFisher) 또는 인간 특이적 프라이머를 이용하여 CFX96 터치 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad)으로 실시간 정량적 PCR를 수행하였다. 샘플을 내인성 대조군 유전자 ACTB에 대해 표준화하였고, 미분화 iPSC와 대비하여 플롯팅하였다.
프로브 표적 공급자: 분석 ID 서열번호
ACTB ThermoFisher: Hs01060665_g1
ACTB ThermoFisher: Hs99999903_m1
AIRE Bio-Rad: qHsaCIP0029272
CCL25 ThermoFisher: Hs00608373_m1
CCXL12 ThermoFisher: Hs00171022_m1
DLL4 Bio-Rad: qHsaCEP0051500
EYA1 ThermoFisher: Hs00166804_m1
FOXN1 ThermoFisher: Hs00919266_m1
HLA-DRA Bio-Rad: qHsaCEP0040019
HOXA3 ThermoFisher: Hs00601076_m1
KRT5 Bio-Rad: qHsaCEP0055058
KRT8 Bio-Rad: qHsaCEP0041467
NANOG Bio-Rad: qHsaCEP0050656
OCT4 Bio-Rad: qHsaCEP0041056
SOX2 Bio-Rad: qHsaCEP0039595
표적 프라이머 서열 서열번호
ACTB F CATGTACGTTGCTATCCAGGC
ACTB R CTCCTTAATGTCACGCACGAT
NANOG F CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA
NANOG R CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC
OCT4 F CCGAAAGAGAAAGCGAACCAG
OCT4 R ATGTGGCTGATCTGCTGCAGT
SOX2 F CCATGACCAGCTCGCAGAC
SOX2 R GGACTTGACCACCGAACCC
면역형광
iPSC 배양물을 실온(RT)에서 15분 동안 PBS+4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정한 후, PBS로 3회 세척하였고, RT에서 30분 동안 및 CAS-블록(Invitrogen) + 0.2% Triton X-100으로 블록/투과시켰다. (아래에 나열된) 1차 항체를 CAS-block + 0.2% Triton X-100에 희석하였고, 샘플을 RT에서 1시간 동안 염색하였다. 슬라이드를 PBS+0.1% Tween으로 5분 동안 3회 세척하였고, PBS + 0.1% Tween에서 1:1,000으로 희석된 2차 항체(Alexa Fluor 태그된 2차 항체(Invitrogen))로 인큐베이션하였으며, RT에서 40분 동안 염색하였다. 슬라이드를 PBS + 0.1% Tween으로 3회 및 PBS로 1회 세척한 후, DAPI를 갖는 ProLong Gold 안티페이드 시약(Invitrogen)으로 마운팅하였다. 조직 박편(section)을 위하여, 파라핀-포매된 조직 블록으로부터 4-10 ㎛ 박편을 마이크로톰(microtome)을 이용해 절단하였고, 현미경 슬라이드 상에 두었다. 상기 슬라이드를 자일렌에서 5분 동안 3회, 100% ETOH에서 2분 동안 2회, 95% ETOH에서 2분 동안 2회, 70% ETOH에서 2분 동안 2회, 40% ETOH에서 2분 동안 1회, H2O(수돗물)에서 5분 동안 1회 세척함으로써 탈파라핀화 및 항원 검색(retrieval)을 수행하였다. Tris-EDTA 버퍼(10 mM Tris Base(Fisher BioReagents), 1 mM EDTA(KD Medical), 0.05% Tween 20, pH 9.0)에서 항원 검색을 수행하였다. Tris-EDTA 버퍼를 끓였고, 끓는 물과 함께 취반기 내에 두었다. 슬라이드를 상기 뜨거운 Tris-EDTA 버퍼에 20분 동안 넣은 후, 차가운 수돗물에서 10분 동안 세척하였다. 이후, 슬라이드를 상기 기술된 것과 같이 차단 및 염색하였다. Zeiss LSM 800 현미경을 이용해 Z-스택 이미지를 취하였다. 정량화 분석을 위하여, 각 웰로부터 1 시계(field of view)를 무작위로 이미지화하였고, 총 DAPI 양성 세포에 대한 총 HOXA3 양성 세포의 백분율을 ImageJ 소프트웨어를 이용해 수동으로 정량하였다. 항체는 다음과 같다: KRT5 Abcam(ab52635) 1:100, KRT8 Santa Cruz(sc-8020) 1:100, HOXA3 Santa Cruz(sc-374237) 1:100, FOXA2 Millipore(07-633) 1:300, OCT4 Santa Cruz(sc-5279) 1:100, SOX2 Abcam(ab97959) 1:500, NANOG Abcam(ab77095) 1:300. 마우스 CD에 대한 이식편 염색은 콜로라도 대학교 앤슈츠 메디컬 캠퍼스에서 인간 면역학 및 면역치료법 계획(Human Immunology and Immunotherapy Initiative, HI3)에 의해 수행하였다.
유세포분석
수집된 마우스 조직을 37℃에서 1.5시간 동안 1 ㎎/㎖ 콜라게나아제 IV(Worthington, Lakewood, NJ; Cat#LS004189)를 함유하는 DMEM에서 분리시켰다. 세포를 여과(40 ㎛)하였고, 적혈구를 ACK 버퍼(Life Technologies, Carlsbad, CA; Cat#A1049201)에 용해시킨 후, 분석을 위하여 2% FBS를 함유하는 PBS에 재현탁하였다. ACK 용해 및 원심분리에 의해 백혈구를 전혈로부터 분리하였다. 세포를 세척하였고, 1:10 농도의 마우스 항체 CD3, CD45(Biolegend, San Diego, CA; Cat#100235, 103105)로 염색하였다. CyAn ADP(Beckman Coulter, Fort Collins, CO)로 유세포 분석을 수행하였고, Summit V5.1(Beckman Coulter) 소프트웨어를 이용해 분석하였다.
면역조직화학
슬라이드를 점진적 농도의 알코올로 탈파라핀화 및 재수화시킨 후, 50℃에서 10분 동안 시트레이트 버퍼, pH 6(Dako, Carpinteria, CA; Cat#S1699)에서 항원 검색을 하였고, 세척 버퍼(Dako; Cat#K8007)로 세정하였다. 모든 염색은 다코 오토스테이너(Dako Autostainer)에서 행하였다. 슬라이드를 이중 내인성 효소 블록(Dako; Cat#S2003)에서 10분 동안, 단백질-부재 차단 용액(Dako; Cat#X0909)에서 20분 동안, 이후 1차 항체에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 1차 항체 및 희석: 마우스 CD45(Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA; Cat#550539), 1:400; 마우스 CD3(R&D Systems, Minneapolis, MN; Cat#MAB4841), 1:50. 다음과 같이 염색을 현상하였다: EnVision + Dual Link System HRP(Dako; Cat#K4061)로 30분 동안 및 기질-발색체(DAB+) 용액(Dako; Cat#K3468)으로 5분. 슬라이드를 헤마톡실린(Dako; Ct#S3301)으로 10분 동안 대비염색하였다. Zeiss Axio Imager A2 현미경 상의 적어도 3개의 비중첩 영역에서 염색을 계수함으로써 세포의 정량화를 수행하였다.
T-세포 활성화 분석법
적혈구를 용해시킴으로써 모의 및 TEP 이식편 마우스 유래의 비장세포/림프절 세포를 준비한 후, CD4 및 CD8(Pan T-세포 단리 키트 II 마우스, MACS #130-095-130)에 대한 음성 선택을 통해 이들을 정제하였다. 이후, 상기 세포를 플레이팅하였고, 플레이트-결합된 항-CD3(145-2C11, 10 ㎍/㎖) 및 가용성 항-CD28(35.11, 1 ㎍/㎖)으로 24시간 동안 자극시켰다. 24시간 후, 세포를 수확하였고, 다음의 세포 표면 마커(Thy1.2 APC(BD 553007), CD25 PE(BD 553075), CD69 PE(BD 553237), CD4 FITC(BD 553729), CD8a PacBlue(Biolegend 100725))에 대한 항체를 이용하여 유세포분석에 의해 그 활성화 상태를 분석하였다. 림프구를 Thy1.2로 게이트한 후 CD4 및 CD8에 의해 서브게이트하여 활성화 마커 CD69 및 CD25의 세포 표면 발현 레벨을 분석하였다. 발현 레벨을 상기 모의 및 TEP 이식편 세포 사이의 대조군으로서 Thy1- 개체군과 비교하였다.
단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 세포 제조
이식편을 절제된 신장으로부터 주의깊게 절개하였고, 4℃에서 2-2.5시간 동안 0.25% 트립신 내에 두었다. 이후, 이식편 및 트립신 혼합물을 37℃에서 5분 동안 두었고, 볼텍스(vortex)하였고, 35 ㎛ 필터를 통해 통과시켰고, 혈구계(hemocytometer)를 이용해 계수하였고, 100-2,000 세포/㎕의 농도로 희석하였다. 원발성 흉선 샘플의 경우, ∼1 ㎤ 박편의 작은 조직을 절개하였고, 레이저 칼날로 갈았고, 4℃에서 1.5시간 동안 0.25% 트립신 내에 인큐베이션하였다. 2번째 ∼1 ㎤ 박편의 조직을 절개하였고, 35 ㎛ 필터에 대해 으깨었다. 흉선세포의 샘플을 고갈시키고 상피 세포 구획을 강화하기 위한 시도로서 상기 조직 박편을 기계적 교반과 함께 PBS로 5회 세척하였다. 이후, 흉선세포가 고갈된 박편을 레이저 칼날로 갈았고, 4℃에서 1.5시간 동안 0.25% 트립신 내에 1.5시간 동안 두었다. 이후, 조직 및 트립신 혼합물을 37℃에서 5분 동안 두었고, 볼텍스하였고, 35 ㎛ 필터를 통해 통과시켰고, 혈구계를 이용해 계수하였고, 100-2,000 세포/㎕의 농도로 희석하였다. 이후, 박스 상에서 단일 세포 시퀀싱을 위하여 세포 현탁액을 UC 앤슈츠 메디컬 캠퍼스 게노믹스 및 마이크로어레이 코어를 위해 취하였다.
대량 시퀀싱을 위한 RNA 제조
d20 TEP의 경우, 24-웰 플레이트 중 한 웰을 수집하고, 350 ㎕ Qiagen RLT 용해 버퍼 내에 재현탁하였다. 이식편의 경우, TEP 이식편을 절제된 신장으로부터 절개하였고, 작은 부분을 350 ㎕ Qiagen RLT 용해 버퍼 내에 두었다. 이후, 이식편을 전자 펠렛 막자(Kimble)를 이용해 균질화하였다. 원발성 흉선의 경우, ∼1-2 ㎣ 박편의 작은 조직을 500 ㎕의 RLT 용해 버퍼 내에 두었다. 제조사의 설명서에 따라 QIAGEN RNeasy 미니 키트를 이용해 RNA를 단리하였다.
FOXN1 표적화 플라스미드 생성 및 iPSC 표적화
benchling.com을 이용해 sgRNA 서열을 디자인하였다: 5'-gCACAGCTCATGCCAGGGCCA-3'(서열번호) 및 5'-GCTGGGCACAGCTCATGCCA-3'(서열번호). 상기 sgRNA 서열을 PX459 플라스미드(Addgene, 플라스미드 #62988) 내로 클로닝하여 CRISPR 표적화 구조체(construct)를 생성하였다. FOXN1 상동성 암(HA)을 갖고 있는 공여자 플라스미드(리포터 카세트) 5'HA-3xHA-P2A-mClover-3'HA를 PUC57(701032-1)에서 합성하였다. 상기 표적화 구조체를 제한 소화 및 DNA 생어 시퀀싱에 의해 추가로 확인하였다. N2#1 iPSC를 TrypLE를 이용하여 37℃에서 7분 동안 단일 세포로 분리시켰다. 단일 세포를 Bio-Rad 유전자 펄서 Xcell 전기천공 시스템을 이용해 전기천공하였다. 8백만개 세포를 mTSER1 배지에서 20 ㎍의 CRISPR 표적화 구조체 및 40 ㎍의 공여자 플라스미드가 모두 첨가된 10 μM ROCKi와 혼합하였다. 세포를 mTSER1 및 10 μM ROCKi를 갖는 마트리겔-코팅된 10 ㎝ 플레이트에 플레이팅하였다. 24시간 후, 세포를 퓨로마이신(0.5 ㎍/㎖)으로 2일 동안 처리하였다. 2주 후, 클론성 콜로니를 골랐고, 확장시켰고, gDNA를 위해 준비하였다. 용해 버퍼(100 mM TrisHCl, 5 mM EDTA, 2% SDS 및 프로티나아제 K)를 이용해 gDNA를 단리하였고, 이어서 이소프로판올을 이용해 침전시켰다. 모든 콜로니를 프라이머(아래의 표 참조)를 이용한 PCR에 의해 유전자형 분석하여 상기 리포터 카세트의 통합(integration)을 검출하였다. 한 프라이머 쌍 1L 및 3R은 상기 리포터 카세트의 5' HR 및 3' HR 바깥의 영역을 증폭한다(예상되는 밴드: WT: 878 bp, 위치 특이적 통합: 1,706 bp). 다른 프라이머 세트 1L 및 2R은 상기 리포터 카세트의 5' HR 바깥 및 클로버 서열의 내부를 증폭한다(예상되는 밴드: WT: 밴드 없음, 위치 특이적 통합: 875 bp). gDNA의 PCR 및 PCR 생성물의 생어 시퀀싱에 의해 상기 이식유전자의 성공적인 위치 특이적 통합을 포함하는 한 콜로니를 발견하였고, NHDF2.2로 명명하였다.
프라이머의 이름 서열 (5'-3') 서열번호
1L AATCTACCTTCCTTGGGAGACTGG
2R TAAACGGCCACAAGTTCAGC
3R CCTCTCACACATTTCTGCCA
통계
GraphPad Prism 소프트웨어를 이용해 데이터를 분석하였다. 델타 델타 Ct 갑에 대해 단방향 ANOVA를 수행하였다. 막대 그래프 내의 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
단일 세포 시퀀싱
라이브러리를 제조하였고, 일루미나(Illumina)에 대해 구동하였으며, 모든 4개 샘플에 대해 250M 판독물을 포획하였다. 상기 판독물을 10X 게노믹스, 셀 레인저(Cell Ranger) 파이프라인을 이용해 정렬하여 특성-바코드 매트릭스를 생성하였다. 인간 및 마우스 참조물(GRCH38-and-mm10) 모두를 사용하여 개별 이종이식편 샘플 판독물을 정렬하였다. 흉선 샘플에 포획된 세포의 수는 8,515이었고, 이어서 흉선-고갈된 샘플에서는 5,500 세포였고, EEE1에서는 4,042 세포 및 HM74에서는1,602 세포였다. 세포 당 평균 판독물은 상기 샘플에 걸쳐서 151,767 내지 50,644 범위였다. 각각의 샘플의 미가공(raw) 특성-바코드 매트릭스를 R에서 조합하였고, 쇠라(Seurat) (3.1.0) 파이프라인을 이용해 분석하였다.
사전-공정: 각각의 세포 내의 특유의 유전자의 수 및 존재하는 미토콘드리아의 백분율에 기반하여 세포를 여과하였다. 250 유전자 미만 및 5,000 유전자 초과인 세포는 버렸다. 5% 초과의 인간 및 마우스 미토콘드리아 함량을 갖는 세포는 추가로 분석하지 않았는데, 그 이유는 더 높은 미토콘드리아 함량은 저품질 또는 세포의 죽음과 연관이 있기 때문이다. 로그 표준화 방법을 이용하여 데이터를 10,000의 환산 인자(scale factor)로 표준화하였다. 특성 선택의 경우, 스튜어트(Stuart) 등에 의해 상세히 나타낸 것과 같이 분산-안정화 변환(variation-stabilizing transformation)을 적용하여 데이터 세트 당 5,000개 특성을 되돌렸다. 다음으로, 선형 차원 축소(linear dimensionality reduction) 이전에 선형 변환(스케일링)을 수행하였다.
그 PCA 점수에 기반하여 세포를 클러스터하였고, PCA 공간 내의 유클리드 거리에 기반하여 제1 KNN(K-nearest neighbor) 그래프를 구축한 후, 루뱅(Louvain) 알고리즘을 적용함으로써 세포를 클러스터한다. 비-선형 차원 축소를 행하여 tSNE 플롯을 생성하였다. 세포를 확인하였고, 차등 발현된 유전자를 윌콕슨(Wilcoxon) 등급 합계 테스트를 이용해 발견하였다. 나머지 세포와 비교하여 각각의 클러스터에 대한 마커를 발견하기 위하여, 쇠라 함수 파인드올마커스(FindAllMarkers)를 사용하였으며, min.pct를 0.1로 세팅하고 및 logfc.threahold를 0.25로 세팅하였으며, 이는 상기 특성이 최소 10%의 세포에 의해 발현되여야 하고 0.25 이상의 로그-배 변화를 가져야 함을 의미한다.
의사시간(pseudotime) 분석
모노클(Monocle) 파이프라인을 이용해 의사시간 분석을 행하였다. 쇠라 객체(object)로부터 표현형 데이터 및 특성 데이터를 추출하였고, 모노클 셀 데이터세트 클래스를 생성하였다. 제1 저품질 세포를 여과해 내어 플레이트뿐만 아니라 더블렛(doublet) 및 트리플렛(triplet)에서 죽거나 비어있는 웰을 제거하였다. 이것은 최소 발현을 0.1로 하고 num_cells_expressed >= 10로 세팅함으로써 행하였다. 세포를 마커 유전자 없이 클러스터하였고, 차등 발현된 유전자를 발견해 내었다. 모노클은 세포가 생물학적 변화를 거칠 때 유전자 발현에서의 변화를 배우기 위한 알고리즘을 사용하고, 궤적을 따라 변화를 둔다. 차원은 축소되었고, 세포는 상기 클러스터뿐만 아니라 원래의 샘플에 기반하여 궤적을 따라 플롯팅하였다. 의사시간 의존성 유전자를 mT-세포 및 TEP + TEC에 대해 별도로 발견해 내었고, 히트맵 상에 플롯팅하였다.
속력 플롯
벨로사이토(Velocyto) 파이프라인을 이용해 속력 플롯을 구축하였다. 조합된 참조 게놈을 이용하여 셀 레인저 출력 상에서 상기 파이프라인을 구동하여 스플라이싱 정보를 갖는 룸 파일(loom file)을 생성하였다. R 상에 로딩된 쇠라 객체로부터 임베딩(embedding)을 취하였고, 세포들 사이의 거리를 추정하였다. 스플라이싱 및 비-스플라이싱된 객체의 유전자 상대 속력을 추정하였고, 상기 속력을 쇠라 tSNE 임베딩 상에 나타내었다.
대량 RNA 시퀀싱
일루미나 시퀀싱 플랫폼으로부터 RNA-seq 판독물을 생성하였다. FastQC v0.11.5. STAR(버전 2.6.0c)를 이용해 시퀀싱 품질 및 어댑터를 체크하여 상기 시퀀싱 판독물을 인간 참조 게놈(Homo_sapiens. GRCh38.91)과 비교 및 정렬하였다. 상기 판독물을 피처 카운트(Feature Count)를 이용해 계수하였고, RPKM(Reads Per Kilobase of transcript, per Million mapped reads) 값을 생성하였다. R 패키지 EdgeR(버전 3.14)를 이용해 하류 분석을 행하였다. 음이항 분포를 사용하여 생물학적 및 기술적 변동성을 계산하였다. 피셔(Fisher) 정확 테스트를 이용해 차등 유전자 발현을 결정하였다. 벤자미니-호크버그(Benjamini-Hochberg) 절차를 이용해 오류발견율(FDR)을 제어하였고, FDR < 0.05 의 컷-오프 기준을 적용하여 차등 발현된 유전자를 확인하였다. 차등 발현된 유전자는 배수-변화(>= |2|), 및 FDR 값(q<0.05)에 기반하여 선택되었다. R에서 ggplot2를 이용하여 (-log p 값) 대 (Log 배수 변화)에 기반한 PCA(Principal component analysis) 플롯 및 볼케이노 플롯을 생성하였다. 바이오컨덕터(Bioconductor)의 ComplexHeatmap v1.10.2 패키지를 사용하여 계층 클러스터링을 수행하고 히트맵을 생성하였다.
실시예 2 - iPSC-유래 TEP의 생체내 성숙
TEP는 기능적 흉선 상피 세포(TEC)로 성숙하기 위해 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)와의 상호작용이 필요한 것으로 알려져 있다. 따라서, iPSC-유래의 TEP가 기능적 TEC로 성숙하는 능력을 평가하기 위하여, 상기 조건 4를 이용해 분화된 d20 TEP를 이전이 기술된 것과 같이 무흉선 누드 마우스의 신장 피막 아래에 이식하였다(도 2a). 이식 14-16주 후에 마우스를 안락사시켰고, 다수의 하류 분석을 위해 이식편-보유 신장을 준비하였다. 시험관내 TEP와 비교하여 절개된 흉선 이식편의 qPCR 분석은 성숙한 TEC 마커인 FOXN1, AIRE, 사이토케라틴(KRT) 5 및 8, 사이토카인 CXCl12 및 CCL25, HLA-DR(MHC-II) 및 델타 유사 정규 노치 리간드 4(DLL4)의 강력한 유도를 나타내고(도 2b), 추가적인 생체내 분화를 제시한다.
개시된 방법 및 시스템은 성숙한 TEC를 위한 마커의 발현을 유도하는데 유용하다. 일부 구현예에서, FOXN1, AIRE, KRT5, KRT8, CXCl12, CCL25, MHC-II, 및 DLL4 중 하나 이상이 발현된다. 많은 구현예에서, 개시된 마커의 발현은 d20 TEP 세포 또는 iPSC에 비해 약 1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배 이상, 또는 약 1,000배, 600배, 500배, 400배, 300배, 200배, 100배, 50배, 40배, 30배, 20배, 10배, 9배, 8배, 7배, 6배, 5배, 4배, 3배, 2배, 1.5배, 또는 1배 이상 또는 이하로 향상될 수 있다. 많은 경우에 있어서, 배수 발현은 동일한 마커를 발현하는 표준 세포에 기반하여 결정될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 상기 표준 세포는 TEP 세포로의 분화를 겪지 않은 iPSC 세포일 수 있다.
KRT5 및 8를 탐색하는 이식편 박편의 면역형광 염색은 발달하는 및 성숙한 TEC를 나타내는 단일 및 이중 양성 세포를 보여준다(도 2c). 상기 데이터는 iPSC-유래의 TEP가 생체내 환경 내로 이식시에 환자-특이적 TEC로 추가로 분화할 능력을 갖고 있음을 나타낸다. 아울러, 마우스 CD4 및 CD8 T-세포 마커를 탐색하는 이식편 박편의 면역형광 분석은 이식편 내에서 발달하는 마우스 T-세포를 나타내는 TEC 유사 구조와 가까운 단일 및 이중 양성 세포를 보여준다(도 2d). 많은 구현예에서, 상기 생체내 환경은 이종이식편, 동종이식편, 또는 자가이식편일 수 있다.
이식을 위해 사용된 2가지 상이한 iPSC 주(CB74 및 NHDF2.2)로부터 분화된 20일 TEP의 2가지 상이한 샘플로부터 수득된 이식편 조직 (이식편 1-4), 각각의 iPSC 주를 위해 개별 마우스로부터 제거된 TEP 이식편로부터 수득된 2가지 TEP 샘플(TEP 1 및 2), 및 대조군으로 작용하는 2가지 원발성 신생아 흉선 샘플(Thy. 1 및 2) 유래의 4가지 분화된 샘플에 대해 대량 RNA-seq를 수행하였다. 차등 발현된 유전자에 기반한 주성분 분석은 샘플이 그 해당 기원을 반영하여 3가지 별개의 클러스터 내에 위치하고(즉, 흉선 샘플들은, 역시 함께 클러스터되는 TEP 샘플들과 분리되어, 함께 클러스터 됨), TEP 이식편 샘플들 중 하나(이식편 1)는 상기 클러스터들 사이에 위치함을 보여준다(도 3a). 유사하게, 모든 샘플의 전체 게놈 발현 데이터의 계통도 계층 클러스터링은 TEP 샘플, 원발성 흉선 및 이식편이 클러스터링되고, 한 이식편 샘플(이식편 1)이 다른 3가지 이식편 샘플보다 출발 TEP 개체군에 더 가깝게 클러스터링됨을 보여준다.
샘플 군들 사이의 차등 유전자 발현 분석이 또한 수행되었다. 이식편 대 20일 TEP의 비교는 각각 1,299 및 1,245 현저하게 상승 및 하향 조절됨을 보여준다. 특정 유전자들을 조사한 결과, TPP 마커인 HOXA3 및 EYA1은 이식편에서 현저하게 하향조절된다(도 3c). 성숙한 TEC 마커인 FOXN1, KRT5, TP63, 및 CBX4는 20일 TEP와 비교할 때 이식편에서 현저하게 상향조절되며, 이는 iPSC-유래의 TEP를 누드 마우스 내로 이식하면 환자-특이적 TEC로의 추가적인 분화로 귀결됨을 나타낸다(도 3c). 직감과 반대로, 피질 흉선 상피 세포(cTEC) 마커 KRT8의 mRNA 전사물 레벨은 TEP과 비교하여 이식편에서 하향조절되었다. KRT8는 주로 cTEC에서 발현되지만, 이전의 연구는 TEP가 cTEC 유사 표현형을 나타내는 것으로 알려졌다. 상기 관찰과 유사하게, KRT8 또한 20일 TEP와 비교할 때 원발성 흉선에서 현저하게 적게 발현되는데, 이는 상기 결과가 인간 TEP에서 TEC로 분화시의 정상적인 발현 변화를 반영할 수 있음을 나타낸다(도 3d). 원발성 인간 신생아 흉선 대 20일 TEP의 포괄적 차등 유전자 발현을 탐색한 결과 각각 932개 및 656개 유전자가 현저하게 상향 및 하향 조절되었음을 밝혔다(도 3c, 도 3d). 나타낸 것과 같이, 특정 TEC 마커인 FOXN1, KRT5, TP63, CBX4 및 AIRE는 원발성 흉선에서 더 높은 발현을 보인다. TEP 마커인 HOXA3 및 EYA1뿐만 아니라 KRT8는 20일 TEP와 비교하여 원발성 흉선에서 낮은 레벨로 발현된다. 흉선 대 이식편의 발현 레벨의 직접적인 비교는 각각 2,435개 및 1,737개 유전자가 현저하게 상향 및 하향 조절되었음을 보여준다(도 3e). 그러나, 핵심 TEC 마커인 FOXN1, KRT5, TP63, 및 CBX4는 양쪽 군 모두에서 유사한 레벨로 존재한다(도 3e). 수질에서 음성 T-세포 선택의 중요한 조절자인 다른 TEC 마커 유전자 AIRE는 이식편에서 낮은 레벨로 발현된다. 이종성 누드 마우스 모델 시스템에 도입되는 분화하는 인간 흉선 조직에 대한 발달하는 마우스 T-세포의 TCR-HLA 미스매치 상호작용을 고려하면, 상기 결과는 이전에 인식되지 않은 음성 선택의 손상을 반영한 것일 수 있다.
실시예 3 - iPSC-유래의 TEC는 기능적이고, 생체내에서 발달하는 마우스 T-세포를 지원할 수 있다.
iPSC-유래의 흉선 이식편이 기능적이고 마우스 T-세포의 발달을 지원할 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, 이식편 제거 시에 추가적인 분석을 위해 이식된 마우스 및 모의 대조군 마우스로부터 비장을 수확하였다. CD3 또는 CD45에 대한 마우스-특이적 항체를 이용한 2마리 대조군 및 4마리 이식편-보유 마우스 비장 박편의 면역조직화학 염색은 흉선 이식편-보유 마우스에서 더 높은 비율로 T-세포가 존재함을 보여주고(도 3f), 3마리 대조군 및 7마리 이식편 보유 마우스로부터 단리된 비장세포 내의 CD3/CD45 이중 양성 T-세포는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 상기 결과를 확인하였다(도 3g). 중요하게는, 이전의 보고는 기능적 흉선이 없음에도 불구하고, 무흉선 누드 마우스의 비장 및 림프절에서 성숙한 T-세포가 존재하는 것으로 나타났다. 시험관내 자극에 대한 반응시 활성화 마커인 CD69 및 CD25가 상향조절되는 것에 의해 나타낸 것과 같이, iPSC-유래의 TEP에 의해 교육된 마우스 T-세포는 기능적이다(도 3h). 요약하면, 상기 데이터는 iPSC-유래의 TEP가 생체내 이식될 때 원발성 인간 신생아 흉선과 전사적으로 유사한 기능적이고 환자-특이적인 TEC로 발달할 수 있음을 나타낸다. 아울러, iPSC-유래의 TEC는 무흉선 누드 마우스에서 T-세포 발달을 지원할 수 있다.
실시예 4 - 단일-세포 RNA 시퀀싱은 이식편 및 인간 원발성 신생아 흉선에서 흉선 세포 타입을 구분한다.
대량 RNA 시퀀싱에 더하여, 이식편 및 인간 원발성 신생아 흉선은 10xGenomics 기술을 이용한 단일-세포 RNA 시퀀싱 분석을 거쳤다. Thy7.1 및 Thy7.2로 나타낸 원발성 인간 신생아 흉선 샘플은 동일한 개인으로부터 유래되었다; 그러나, Thy7.2에서 유전자 발현 레벨을 잠재적으로 혼란시키는 동시에 TEC 분획을 강화할 수 있는 소화 시간을 감소시키기 위하여 2가지 상이한 방법에 의해 단일 세포 현탁액을 제조하였다(재료 및 방법 참조). 상기 접근법은 단일-세포 RNA 시퀀싱에 의해 검출되는 TEC의 백분율을 Thy7.1에서 2.50%으로부터 Thy7.2에서 4.58%로 약간 증가시켰지만, T-세포는 여전히 Thy7.2 단일 세포 분획의79.24%를 구성하여, Thy7.1에서의 87.27%로부터 약간 감소하였다(데이터는 나타내지 않음). TEP 이식편 및 인간 원발성 신생아 흉선 샘플에서 상이한 세포 타입을 구분하기 위하여, t-추정 이웃 임베딩(tSNE)을 포함하는 비지도 기계 학습을 도입하였다. 상기 방법론은 개별 세포를 조직 타입 및 종에 의해 루뱅 알고리즘 변이체에 기반한 13개의 구별된 클러스터로 효과적으로 분리한다(도 4a, 도 4b)(데이터는 나타내지 않음). 종합적이고 주석을 단 마커 유전자의 목록을 이용하여, 본 발명자들은 13개 원래의 클러스터를 인간 T-세포, 수지상 세포(DC), TEC, 및 TEP 및 마우스 T-세포 및 다른 숙주 세포로 이루어지는 6개 세포 타입-특이적 클러스터로 추가로 조합하였다(도 4a, 도 4d). 개별 인간 및 마우스 세포는 인간 및 마우스 데이터세트에 대한 셀 레인저(10X Genomics) 파이프라인을 이용하여 성공적으로 식별할 수 있었고, 그 종에 기반하여 6개 세포 타입 특이적 클러스터를 확인하였다(도 4b). 예상한 것과 같이, 종에 의한 tSNE 분석은 shows 마우스 유래 세포가 TEP 이식편 샘플에서만 존재하고, 인간 원발성 신생아 흉선 샘플에서는 마우스 세포가 확인되지 않았음을 보여준다(도 4b, 도 4c). 특히, TEP 이식편 유래 세포는TEP/TEC 클러스터에서 원발성 흉선 세포와 클러스터되었는데, 이는 생체내에서 iPSC-유래 TEP의 이식은 진정한 원발성 TEC를 닮은 환자-특이적 TEC의 생성으로 귀결됨을 나타낸다(도 4c).
다음으로, 바이올린 플롯을 사용하여 본 발명자들의 단일 세포 데이터 세트에서 개별 유전자의 발현 패턴을 시각화하고 세포 타입 특이적 클러스터링의 타당성을 확인하였다. 흉선 특이적 마커인 FOXN1, EPCAM, KRT5, 및 KRT8은 다른 모든 세포 타입과 비교하여 TEP 및 TEC 클러스터에서 가장 높게 발현된다(도 4e). 핵심 피질 TEC(cTEC) 마커인 PRSS16 및 PSMB11는 또한 TEC 클러스터에서 특이적으로 발현된다(도 4e). LY75(CD205)는 TEP 및 TEC에 존재한다고 알려져 있으며, 낮은 레벨이지만 TEP 및 TEC 클러스터에서 발현된다(도 4g). 부가적으로, 핵심 사이토카인인 CXCL12 및 CCl25는 조혈 줄기 세포를 끌어들이기 위해 흉선 세포에 의해 발현되는 것으로 알려져 있으며, TEC 클러스터의 세포에 의해 발현된다(도 4e). 액티빈 A는 최근 TEC 쪽으로 TEP 분화를 유도하데 연관된 것으로 나타났다. 사실, 액티빈 A의 서브유닛인 인히빈 베타 A(INHBA)는 낮은 레벨이지만 TEP 클러스터에서 특이적으로 발현되는데(도 4e), 이는 액티빈 A가 또한 인간 TEC 발달에 있어서 역할을 할 수 있음을 나타낸다. NOTCH 신호전달은 T-세포 확약 및 발달을 위해 결정적이다; 이러한 관념과 유사하게, 델타 유사 비-정규 Notch 리간드 1(DLK1)은 TEP 개체군에서만 높게 발현되는 것으로 나타난다(도 4e).
T-세포 구획 내에서, 전구체 및 발달하는 T-세포 마커인 CD5 및 CD7, RAG1 및 2, 및 CD3, 4, 및 8와 같은 발달하는 T-세포의 핵심 마커가 검출된다(도 4f). 마지막으로, 수지상 세포 마커는, 이들 중 일부가 TEC에 의해서도 발현된다고 알려져 있으며, T-세포, DC, 및 TEC 구획에서 강하게 발현된다(도 4g). 본 발명의 분석은 줄기 세포 유래 및 신생아 모두에서 구별된 인간 흉선 세포 타입에서의 발현 패턴 및 그 변화에 대한 신규한 통찰력을 제공한다. 모든 scRNAseq 데이터는 UCSC 셀 브라우저(cellbrowser.readthedocs.io)를 이용하여 러스(Russ) 실험실 서버(www.russlab.com/scRNA) 상에서 관리되고 있다.
실시예 5 - 원발성 신생아 인간 흉선 TEC를 갖는 iPSC-유래의 TEC 클러스터
TEP/TEC 클러스터 내에서 세포 타입을 추가로 구분하기 위하여, 본 발명자들은 TEP 및 TEC 클러스터를 함께 하위세팅 및 재분석하였다(도 5a, 도 5b). tSNE 분석은 조합된 TEP 및 TEC 세포 개체군 내에서 9개 클러스터를 확인하였다(도 5B). 샘플 특이적 tSNE 분석은 새롭게 생성된 클러스터 전반에 걸쳐 TEP/TEC 세포가 분포함을 보여준다(도 5c). 중요하게는, iPSC-유래의 TEC는 클러스터 0 및 4에서 원발성 흉선 TEC와 함께 클러스터하지만, 클러스터 1, 3, 7, 및 8은 iPSC-유래의 TEP 또는 TEC로 배타적으로 구성되는데, 이는 상기 클러스터가 출생 후의 원발성 흉선 샘플에서 용이하게 존재하지 않는 발달하는 흉선 세포를 함유할 수 있음을 제시한다(도 5b, 도 5c). 클러스터 3 내의 많은 세포에서 핵심 마커인 FOXN1, KRT5, KRT8, 및 DLK1의 공동-발현은 다수의 TEP가 상기 서브세트에 함유되어 있음을 나타낸다(도 5f). TEC 마커인 PSMB11, PRSS16, 및 CCL25뿐만 아니라 KRT5 또는 KRT8의 개별적인 발현은 보통 내지 높은 레벨로 클러스터 5의 세포 내에 존재하는데, 이는 성숙한 TEC 개체군을 나타낸다(도 5g). KRT5는 클러스터 7보다 클러스터 5에서 약간 더 높은 레벨로 더 많은 세포에 의해 발현되지만, 클러스터 5 내의 매우 낮은 수의 세포는 또한 자가면역 조절자(AIRE)도 발현한다(도 5g). 수질 TEC(mTEC)는 KRT5 및 AIRE11 모두의 발현에 의해 표시되기 때문에, 상기 데이터는 클러스터 5가 mTEC를 나타낼 수 있음을 제시한다. 그러나, cTEC 마커인 PSMB11 및 PRSS16이 또한 대부분 클러스터 5에서 발현되고, cTEC를 구분하는 KRT8은 대부분 클러스터 7에서 발현된다(도 5g). 단일-세포 RNA-seq 데이터에서 스플라이싱되지 않거나 스플라이싱된 mRNA를 구분함으로써, RNA 속력은 상기 데이터 세트 내에서 임의의 개별 세포의 가능한 미래 상태를 예측하기 위해 사용될 수 있다. RNA 속력 분석은 클러스터 1 및 8에서 클러스터 3 및 7 쪽으로 이동할 때 TEP 이식편 유래 세포의 방향성을 예측한다(도 5b, 5d). 모노클의 의사-시간 분석이 재-클러스터된 TEP/TEC 클러스터에 적용되었고, 한 분지점이 확인되었다(도 5e, 도 5f). 본 발명자들의 상세한 분석은 일부 iPSC-유래의 TEC 및 원발성 TEC가 중첩하는 발현 프로필을 나타내어 생물정보학 접근법의 도입에 의해 이들을 구분할 수 없게 함을 보이고, 이는 진정한 TEC 표현형임을 제시한다. 그러나, 여전히 TEC로 분화되는 iPSC-유래의 TEP는 2가지 상이한 발달 궤적을 따르는 것으로 보이고, 이들 중 하나만이 원발성 TEC 쪽으로 유도한다. 이론에 의해 제한되길 원하지 않으면서, 이것은 iPSC-유래의 TEP와 발달하는 마우스 T-세포의 이종이식편 상호작용의 결과일 수 있다.
실시예 6 - 마우스 T-세포는 iPSC-유래의 흉선 조직 내에서 발달한다.
본 발명자들의 이전의 분석에 의해 제시된 것과 같이 iPSC-유래의 흉선 이식편에서 새로운 T-세포 발달이 실제로 일어났는지 여부를 결정하기 위하여(도 3f-h), 본 발명자들은 마우스 T-세포 클러스터(mT-세포)를 개별적으로 하위세팅 및 재분석하였다(도 6a, 도6b). tSNE 분석은 mT-세포 개체군 내에서 10개 클러스터를 확인하였다(도 6b). 사실, 마우스 T-세포 발달에 수반되는 핵심 전사 인자는 많은 T-세포 하위 클러스터에 존재하며, 이는 TEP 이식편을 수용한 누드 마우스에서 마우스 T-세포의 발달이 진행됨을 나타낸다(도 6f, 도 12b). RNA 속력 분석은 많은 세포가 Cd3, 4, 및 8와 같은 T-세포 분화의 후기 마커를 발현하는 세포를 가장 많은 수로 함유하는 클러스터 3 쪽으로 이동함을 보여주며(도 12a, 도 6f, 도 12b), 이는 이식편 조직에서 마우스 T-세포 발달의 방향성을 나타낸다. 의사 시간 분석은 하나의 분지점만을 보이며, 세포는 2가지 세포 운명 쪽으로 발달한다(도 6c, 도 6d). 유전자-특이적 의사 시간 분석은 3가지 발달 상태를 보인다(도 6e). 핵심 T-세포 마커인 Cd3e, Cd3g, Cd4, Cd8a, 및 Ptprc(Cd45)는 단계 1 및 2 동안에 낮은 발현을 보이지만, 단계 3 동안에 증가하며, TEP 이식편에서 마우스 유래 T-세포의 발달 진행의 표시자이다(도 6e). 부가적으로, 본 발명자들은 단계 1 동안에 T-세포 발달과 연관되어 세포 증식의 표시자인 증식 마커 Mki67에서의 범프(bump)를 관찰한다(도 6e). 발달 과정 동안에, 세포는 그 발달 계통에 기반하여 상이한 궤적으로 분지된다. 모노클을 이용하여 분지점 히트맵을 만들었으며, 이것은 분지점에서 강화되는 유전자뿐만 아니라 각각의 세포으 운명을 보여준다. 세포 운명 2에서, 본 발명자들은 선천적 면역 세포 마커의 강화를 관찰한다(도 6d). 또한, 세포 운명 1은 Aif1 및 Tyrobp와 같은 T-세포 발달의 마커에 대한 강화를 보여준다(도 6d). 흥미롭게도, 클러스터 4 세포 운명 2는 B 세포 마커에 대한 강화를 보여주는데, B 세포도 또한 흉선에 존재하는 것으로 알려져 있다(도 6d).
이식편 보유 마우스에서 T-세포는 T-세포 수용체(TCR) 서열에 있어서 현저하게 향상된 다양성을 보여준다. 도 12c는 대조군 대 이식편 마우스에서 TCR 서열의 클러스터링을 보여준다. 대조군 또는 이식편 보유 누드 마우스의 혈액으로부터 FACS 단리된 CD45 및 CD3 이중 양성 T-세포에 대해 TCR 시퀀싱을 수행하였다. TCR 시퀀싱 및 분석은 iRepertoir 기술을 이용해 수행하였다. 도 12c에 나타낸 각각의 색상 방울은 확인된 개별 TCR 서열에 해당하고, 각각의 방울의 크기는 모든 판독물에 비해 그 특이적 서열의 풍부함을 나타낸다. 따라서, 많은 작은 TCR 방울은 더 높은 다양성/이질성을 나타낸다.
상기 명세서, 실시예, 및 데이터는 출원인의 발명 주제의 일부 예시적인 실행예의 특성 및 용도의 설명을 제공한다. 출원인의 주제의 많은 실행예는 그 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 행해질 수 있다. 아울러, 상이한 실행예의 다른 특성들이 인용된 청구항을 벗어나지 않으면서 또 다른 실행예에서 조합될 수 있다.

Claims (28)

  1. 환자로부터 세포를 단리하는 단계;
    하나 이상의 인자를 상기 세포에 투여해 상기 세포를 재프로그래밍하고 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)를 생성하는 단계;
    상기 환자-특이적 iPSC를 분화 배지에서 9-14일 동안 배양하여 흉선 상피 전구(TEP) 세포를 생성하는 단계; 및
    적어도 하나의 TEP를 수용자 내로 전달하는 단계; 및
    상기 TEP 세포를 흉선 상피 세포(TEC)로 분화되게 하는 단계;를 포함하는 환자-특이적 TEC의 생성 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 iPSC는 조혈 줄기 세포(HSC) 또는 말초혈 단핵구 세포(PBMC)로부터 유래되는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 TEC는 성숙하고 기능적인 환자-특이적 흉선 상피 세포(TEC)인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    환자-유래의 T-세포를 상기 TEC와 접촉시켜 기능적 T-세포를 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    환자-유래의 T-세포를 상기 TEP와 접촉시켜 기능적 T-세포 및/또는 기능적 TEC를 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 청구항 4 또는 청구항 5에 있어서,
    상기 성숙한 T-세포는 CD69, CD25, CD5, CD7, CD4, CD8, CD3, CD45, RAG1, 및 RAG2 중 하나 이상을 발현하는 방법.
  7. 청구항 4 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    말초 T-세포의 수는 환자-특이적 TEP를 수용하지 않은 수용자에서보다 더 많은 방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 분화 배지는 경로 활성화제 및/또는 경로 억제제 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 활성화 및/또는 억제된 경로는 액티빈, WNT, BMP, RA, TGFβ, SHH, 및 FGFβ 중 하나 이상인 방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 억제된 경로는 SHH, 및 TGFβ 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  11. 청구항 9에 있어서,
    상기 하나 이상의 활성화된 경로는 액티빈 A, WNT3a, BMP4, SAG, TTNPB, 및 FGF8b 중 적어도 하나에 의해 활성화되는 방법.
  12. 청구항 10에 있어서,
    상기 하나 이상의 억제된 경로는 Ly-364947 및 Sant1 중 적어도 하나에 의해 억제되는 방법.
  13. 청구항 1에 있어서,
    상기 TEC 세포는 FOXN1, AIRE, CK5, CK8, CXCL12, CCL25, DLL4, 및 HLA-DR로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현하는 방법.
  14. 청구항 1에 있어서,
    상기 분화 배지는 0-13일에 액티빈 A, Wnt3a, TTNPB, BMP4, LY364947, FGF8b, FGF8a, SAG, 및 SANT-1 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  15. 청구항 1에 있어서,
    상기 TEP 세포를 조혈 줄기 및 전구 세포(HPSC) 또는 HSC와 약 7일 동안 공동-배양하여 TEC를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 TEC는 FOXN1, AIRE, CK5, CK8, CXCL12, CCL25, DLL4, TP63, CBX4, 및 HLA-DR로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 마커를 발현하는 방법.
  17. 청구항 15에 있어서,
    상기 TEC는 피질 TEC 및 수질 TEC에 의해 전형적으로 발현되는 마커를 발현하는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 마커는 KRT5, KRT8, AIRE, PSMB11, 및 PRSS16으로부터 선택되는 방법.
  19. KRT5, KRT8, AIRE, PSMB11, 및 PRSS16 중 하나 이상을 발현하는 하나 이상의 흉선 상피 세포(TEC)를 포함하는 분화되고 성숙한 흉선 상피 세포의 개체군으로서,
    상기 하나 이상의 TEC는 액티빈 A, Wnt3a, TTNPB, BMP4, LY364947, FGF8b, FGF8a, SAG, 및 SANT-1 중 하나 이상의 존재시에 시험관내에서 성장한 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 유래된 흉선 상피 전구(TEP) 세포로부터 유래되고, 상기 TEP는 수용자 내에 이식된 후 생체내에서 TEC로 분화되는 분화되고 성숙한 흉선 상피 세포의 개체군.
  20. 청구항 19에 있어서,
    상기 iPSC는 12 내지 14일 동안 시험관내에서 성장하는 분화되고 성숙한 흉선 상피 세포의 개체군.
  21. 청구항 19 또는 청구항 20에 있어서,
    상기 iPSC는 상기 수용자의 하나 이상의 세포로부터 유래되는 분화되고 성숙한 흉선 상피 세포의 개체군.
  22. 청구항 19 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TEC는 FOXN1, AIRE, CK5, CK8, CXCL12, CCL25, DLL4, 및 HLA-DR로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현하는 분화되고 성숙한 흉선 상피 세포의 개체군.
  23. 대상체의 세포로부터 다능성 줄기 세포를 유도하기 위한 방법;
    유도 다능성 줄기 세포를 액티빈 A, Wnt3a, TTNPB, BMP4, LY364947, FGF8b, FGF8a, SAG, 및 SANT-1 중 하나 이상의 존재 및 부재시에 12-14일 동안 성장시켜 분화된 흉선 상피 전구 세포를 생산하기 위한 배양 장치;
    하나 이상의 흉선 상피 전구 세포를 대상체 내로 이식하기 위한 장치;를 포함하는 성숙하고 기능적인 흉선 상피 세포를 생성하기 위한 시스템.
  24. 면역 증상 또는 장애의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의 청구항 19 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 기술된 것과 같은 세포의 개체군, 또는 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 세포의 용도로서,
    상기 장애 또는 증상은 존재하지 않는 흉선, 손상된 흉선, 고장난 흉선, 질환이 있는 흉선, 노화된 흉선, 제1형 당뇨병, 자가-면역, 동종이식거부, 암, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 용도.
  25. 청구항 19 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 따른 TEP 세포, 또는 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 증상 또는 장애을 앓거나 그 위험성이 있는 대상체의 치료 방법으로서,
    상기 장애 또는 증상은 존재하지 않는 흉선, 손상된 흉선, 고장난 흉선, 질환이 있는 흉선, 노화된 흉선, 제1형 당뇨병, 자가-면역, 동종이식거부, 암, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 방법.
  26. 액티빈 A, Wnt3a, TTNPB, BMP4, LY364947, FGF8b, FGF8a, SAG, 및 SANT-1 중 하나 이상의 존재시에 시험관내에서 성장한 환자 특이적 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 유래되는 하나 이상의 흉선 상피 전구(TEP) 세포를 투여하는 단계를 포함하는 흉선 장애를 갖는 환자의 치료 방법으로서,
    상기 TEP는 상기 환자에게 투여 후 생체내에서 흉선 상피 세포(TEC)로 분화하고, 상기 iPSC는 시험관내에서 12 내지 14일 동안 성장하고, 상기 성숙한 TEC는 FOXN1, AIRE, CK5, CK8, CXCL12, CCL25, DLL4, 및 HLA-DR로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현하는 방법.
  27. 청구항 26에 있어서,
    상기 iPSC는 환자의 피부, 자궁 조직, 신장, 간, 근육, 부신, 및 혈액 중 하나 이상으로부터 유래되는 방법.
  28. 청구항 26 또는 청구항 27에 있어서,
    상기 선택된 마커는 투여된 TEP 세포 또는 iPSC에 비해 성숙한 iPSC-유래의 TEC에서 0.5배 내지 1,000배 발현되는 방법.
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