JP2023502522A - ヒト多能性幹細胞からバイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイド - Google Patents

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Abstract

本書は、バイオエンジニアリングに関するものであり、バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドおよび関連するヒト化動物モデルに関するものである。胸腺オルガノイドおよび動物モデルは、ヒト化抗体の作製、抗原特異的ヒトＴ細胞の作製、移植耐性の誘導、胸腺機能の活性化、および、ヒト疾患のモデル化など、様々な商業的および臨床用途がある。【選択図】なし

Description

関連出願と優先権主張
本出願は、２０１９年１１月２５日に出願された米国仮出願第６２／９３９，９１８号に対する優先権を主張する。本出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
政府所有権
本発明は、国立衛生研究所が授与する助成金番号Ｒ２１ ＡＩ１２６３３５およびＲ０１ ＡＩ１２３３９２、ならびに国立科学財団が授与する助成金番号１８０４７２８の下、政府の支援を受けて行われたものである。政府は、本発明について一定の権利を有している。
発明の分野
この文書は、バイオエンジニアリングに関連し、バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイド、関連するヒト化動物モデル、および関連する使用に関するものである。
胸腺は、適応免疫系において極めて重要な免疫器官であり、免疫自己寛容を維持しつつ、侵入してくる病原体に効果的に反応できる多様なＴ細胞のレパートリーを作り出す役割を担っている。加齢、化学療法、放射線被曝、ウイルス感染、炎症など様々な要因が胸腺退縮を引き起こし、胸腺細胞の減少、間質性繊維症の増加、ナイーブＴ細胞の減少などの現象が現れる。胸腺の機能障害に起因する免疫監視の障害は、自己免疫から免疫不全および悪性腫瘍に至る様々な疾患を引き起こす。胸腺の欠陥によって低下した免疫機能を回復または改善することが求められている。
マウスなどの動物モデルで得られた実験的所見を臨床応用可能な治療法に結びつけるための大きな障害の一つは、マウスとヒトの間に種特異的な差異が存在することである。ヒト免疫細胞を免疫不全マウスに移植および増殖させたヒト化マウスは、ヒト免疫系の発達と応答をｉｎ ｖｉｖｏで研究するための強力なツールを提供する。ヒト免疫系をマウスで再現する際の大きな障害の一つは、ヒトＴ細胞の発達と選択のサポートにおけるマウス胸腺微小環境の制限による、ヒトＴ細胞の発達の欠陥である。ヒト骨髄－肝臓－胸腺（ＢＬＴ）マウスモデルに胎児肝臓と胸腺を共移植することにより、強力なＴ細胞の発達をサポートすることができるが、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が頻繁に発生するため、ホストの寿命が短く、長期の研究に使用することができない。また、倫理的な問題や、胎児組織でヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を選択できないことから、様々な薬理学的、生理学的、病理学的条件下でのヒト免疫応答のモデルにおけるＢＬＴマウスの使用はさらに制限されている。
本書は、上記のようなニーズに多面的に対応するものである。
一態様において、本書は、バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドを製造するための方法を提供する。この方法は、ヒト胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰＣ）もしくはヒト胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）またはその両方を有する細胞集団を得る工程と；前記細胞集団をヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）と規定比率で組み合わせ、組み合わせを形成する工程と；前記組み合わせを、脱細胞化した胸腺スキャフォールドの細胞外マトリックスに播種して、胸腺コンストラクトを生成する工程と、および、細胞外マトリックスへの細胞接着を可能にする条件下で前記胸腺コンストラクトを培養して、バイオエンジニアリング胸腺オルガノイドを作製する工程と、を有する。ＴＥＰＣ、ＴＥＣ、またはＨＳＣは、ドナーであるヒト個体に由来する可能性がある。ＨＳＣは、ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞を有することもできる。脱細胞化された胸腺スキャフォールドは、ヒト対象または非ヒトドナー動物から得ることができる。後述するように、様々な適切な動物をドナー動物として使用することができる。好ましい例としては、非ヒト哺乳類が含まれる。ＴＥＰＣまたはＴＥＣとＨＳＣとの比率は、１００：１～１：１００の範囲で、例えば約１０：１～１：１０、または約１：１０、１：１、２：１、または５：１の範囲とすることができる。
いくつかの実施形態では、細胞集団は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を単一の細胞に分離する懸濁液中にカプセル化する工程と、前記ｈＰＳＣの数を増加させるかまたは分化させずにその子孫細胞を得るために、前記ｈＰＳＣを増殖培地で培養する工程と、前記ｈＰＳＣまたは子孫細胞を分化させてカプセル化培地でＴＥＰＣまたはＴＥＣを生成する工程と、前記カプセル化培地から前記ＴＥＰＣまたはＴＥＣを遊離させる工程とを有するプロセスによって得ることができる。ｈＰＳＣの例としては、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含むことができる。
いくつかの例では、胸腺コンストラクトは、ヒト免疫細胞を産生するために、培地または栄養素およびヒト細胞を連続的に供給するｉｎ ｖｉｔｒｏのフローセルに配置され得る。胸腺コンストラクトは、Ｂ細胞やＴ細胞などの免疫細胞を有し得る。Ｂ細胞は、特定の抗原に特異的であってもよく、または抗原特異的抗体を産生することができる。一実施形態では、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするウイルスベクターで形質導入され得る。例えば、ウイルスベクターをフローセルに添加して、Ｔ細胞を形質導入することができる。胸腺コンストラクトは、薬剤候補の評価に用いることができる。その場合、胸腺コンストラクトを薬剤候補と接触させ、薬剤候補が免疫細胞の発達に及ぼす影響を試験することができる。
いくつかの他の例では、胸腺コンストラクトは、宿主動物に外科的に移植することができる。宿主動物は、前処理されたヒト化免疫不全動物、例えば前処理されたヒト化免疫不全ブタ、ラットまたはマウスとすることができる。胸腺コンストラクトは、宿主動物内の様々な適切な位置に配置することができ、好ましくは、腎臓被膜の下、首の胸部領域、または腋窩領域のような、豊富な血管網を有する解剖学的部位に配置することができる。得られた宿主動物はＨＳＣを提供され、ヒト免疫細胞を産生させることができる。例えば、宿主動物は、ヒトＶＤＪ抗体配列を発現するように操作された非ヒト動物（例えば、ＡＢＧＥＮＩＸまたはＭＥＤＡＲＥＸによって開発されたものなどのマウス）であり得る。そのような動物は、増加した量の完全ヒト免疫グロブリンＧおよび抗体を産生することができる。また、得られた宿主動物は、薬剤候補の評価に使用することもできる。その場合、宿主動物に薬剤候補を投与して、薬剤候補が免疫細胞の発達に与える影響を試験することができる。例えば、ＴＥＰＣ、ＴＥＣ、またはＨＳＣは、ドナー個体からのものであってもよく、ドナー個体に対する薬剤候補の影響を試験することができる。また、宿主動物には、ドナー個体からの細胞または組織を移植することができる。細胞または組織の例としては、がん細胞が含まれ得る。その場合、ドナー個体由来の細胞または組織に対する薬剤候補の効果を評価することができる。
上記の方法において、ドナー動物または宿主動物は、鳥類、両生類、爬虫類、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ）、または、他の顎を有する非哺乳類を含む脊椎動物、または非ヒト哺乳類であり得る。非ヒト哺乳類の例としては、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、および非ヒト霊長類からなる群から選択される１種を含む。
第２の態様において、本書は、（ｉ）ヒトＴＥＰＣ（ｈＴＥＰＣ）、ヒトＴＥＣ（ｈＴＥＣ）、またはヒトＨＳＣ（ｈＨＳＣ）、および（ｉｉ）脱細胞化され、および、細胞外マトリックスを有する胸腺スキャフォールドを有するバイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドであって、前記ｈＴＥＰＣ、ｈＴＥＣまたはｈＨＳＣは、前記細胞外マトリックスに付着している、バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドを提供する。バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドの例には、上記の方法に従って調製されたバイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドが含まれる。バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドは、免疫細胞を含んでいてもよい。胸腺スキャフォールドは、ｈＴＥＰＣ、ｈＴＥＣ、またはｈＨＳＣに対して異種または同種異系であることができる。２９．いくつかの例では、ｈＴＥＰＣまたはｈＴＥＣは、ｈＰＳＣに由来していてもよい。バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏであり得る。したがって、本書の範囲内には、上記のバイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドを有する非ヒト動物が含まれる。非ヒト動物は、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、および非ヒト霊長類からなる群より選択される哺乳動物であり得る。
さらなる態様において、本書は、薬物候補を評価するための方法を提供する。本方法は、（ａ）薬剤候補を上記のバイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドに接触させる工程と、および（ｂ）前記バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドに存在する細胞またはそこから遊走する細胞の発達に及ぼす前記薬剤候補の影響を検出する工程とを有する。本方法は、宿主動物においてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施することができる。一例では、バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドを宿主動物に移植し、薬物候補を宿主動物に投与することができる。
本明細書に記載された薬剤候補の評価のために、薬剤候補は、小分子、核酸、ペプチド、ポリペプチド、抗体、および抗体フラグメントからなる群から選択される１つであり得る。
さらに別の態様において、本明細書は、胸腺の前駆細胞を調製する方法を提供する。この方法は、（ａ）前駆細胞を、上記のバイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドまたは上記の非ヒト動物に導入する工程と、（ｂ）前記前駆細胞の分化を可能にする条件下で前記バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドまたは非ヒト動物を維持して、その子孫細胞を生成する工程と、（ｃ）前記バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドから子孫細胞を排出させて胸腺移住細胞を生成する工程と、および（ｄ）前記胸腺移住細胞を単離する工程とを含む。したがって、本明細書の範囲内には、本方法に従って調製された胸腺移住細胞が含まれる。胸腺移住細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの抗原受容体をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を有し得る。
胸腺移住細胞は、胸腺移住細胞および薬学的に許容される担体を有する医薬組成物に含まれ得る。胸腺移住細胞または医薬組成物は、それを必要とする対象の免疫機能を改善するための方法に用いることができる。したがって、本明細書は、対象の免疫機能を改善するための方法を提供する。本方法は、（ａ）有効量の胸腺移住細胞を対象に投与する工程と、または（ｂ）上記バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドを対象に移植する工程とを含む。いくつかの例において、対象は、がん、自己免疫疾患、および感染症からなる群から選択される状態を有し得る。
図１Ａ、および１Ｂは、３Ｄアルギン酸ヒドロゲルカプセルにおけるヒトｉＰＳＣのＴＥＰＣへの分化を示す図である。ａ．ＴＥＰＣ分化の異なる段階におけるｉＰＳＣ凝集体のサイズ分布。左パネルの開いた形状は、カプセル内の個々の凝集体の大きさを示している。実線は、各ステージ（左パネル）におけるＴＥＰＣ凝集体の全体的なサイズ分布を示し、これは右パネルで箱ひげ図としても表示されている。＃は、平均の間に有意性がないことを示す ｐ<０．０５（一元配置分散分析と事後テューキー検定）。ｂ．ＥｐＣＡＭ＋解離したＴＥＰＣｓのフローサイトメトリー解析の代表的なヒストグラム。 図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、および２Ｈは、ｉＰＳＣ由来ＴＥＣからの組織工学的機能的胸腺オルガノイドを示す図である。ａ．抗原提示機能に不可欠な遺伝子の発現のＲＴ－ｑＰＣＲ解析。少なくとも３回の独立した実験から得られたトリプリケートの結果を示す。＊ｐ<０．０５；＊＊ｐ<０．０１；＊＊＊ｐ<０．００５。ｂ．胸腺オルガノイド内（ｉＰＳＣオルガノイド）、またはオルガノイドから流出した細胞間（ｉＰＳＣ流出）のＴ細胞の発達を示す代表的なＦＣＭグラフ。Ｌ／Ｄ、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ 染色、死細胞は陽性に染色される。ｃ～ｈ．胸腺オルガノイドをｉＰＳＣ－ＴＥＣで構築し、無胸腺症Ｂ６ヌードマウスの腎臓被膜の下に移植した。移植後１８～３２週の胸腺オルガノイド移植マウスの脾臓およびリンパ節におけるＣＤ３＋ＣＤ４５＋細胞（ｃおよびｄ）、ＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（ｅ）、γδＴ細胞（ｆ）の存在を示す代表的なＦＣＭグラフである。Ｎｕ，Ｂ６．ヌードマウス対照；Ｔｈｙ，胸腺オルガノイド移植Ｂ６．ヌードマウス。ｇ．リンパ節におけるＣＤ４＋（左パネル）およびＣＤ８＋（右パネル）Ｔ細胞の活性化状態。ｈ．混合リンパ球反応（ＭＬＲ）。マイトマイシンＣ処理した同系（Ｂ６、上パネル）または同種異系（バルブ／Ｃ、下パネル）脾臓細胞で抗原投与した際の胸腺オルガノイド移植Ｂ６．ヌードマウスから単離されたＣＤ４＋（左パネル）およびＣＤ８＋（右パネル）Ｔ細胞の増殖反応を示す代表的ヒストグラムである。３つの独立した実験から得られたトリプリケートの代表的な結果を示している。＊ｐ<０．０５；＊＊ｐ<０．０１。 図３Ａおよび３Ｂは、ｉＰＳＣ由来ＴＥＣ胸腺オルガノイド移植造血ヒト化マウスの生成を示す図である。ａ．移植後のヒト化マウスのカプラン・マイヤー生存率分析。＊＊＊＊，ｐ<０．００１（ログランク検定）。ｂ．移植後１２週のヒト化マウス４群（Ｇ１～Ｇ４）の末梢血中のｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ。＊ｐ<０．０５；＊＊＊＊ｐ<０．００１（マン・ホイットニー検定）。 図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、および４Ｄは、ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスにおける複数の造血系統の発達を示す図である。Ｇ１～Ｇ４ヒト化マウス（移植後１８～４０週）の骨髄（ＢＭ）および脾臓（ＳＰＬ）から細胞を分離し、ヒト細胞キメラの全体的比率（総ＣＤ４５＋細胞におけるｈＣＤ４５の％）について（ａ～ｃ．）、および、さまざまな造血系統の存在と分布について（ｄ）ＦＣＭで分析した。ｄ．対照（Ｇ３）およびｈｕ．Ｔｈｏｒ（Ｇ４）マウスのヒト造血系統の分布を示す代表的な円グラフである。３つの独立した実験からの代表的な結果を示す。＊ｐ<０．０５；＊＊ｐ<０．０１（マン・ホイットニー検定）。 図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅおよび５Ｆは、ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスにおける機能的ヒトＴ細胞サブセットの発達を示す図である。ａ．ｈｕ．ＴｈｏｒマウスにおけるＴＣＲ Ｖβ遺伝子ファミリー発現の全体的多様性（ｎ＝３）。ＲＮＡはｈｕ．Ｔｈｏｒマウスの脾臓細胞（赤色列）と健常ドナーのＰＢＭＣ（青色列、ｎ＝３）から単離された。Ｖβ遺伝子発現はＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔ細胞パネルで解析した。各Ｖβファミリーの総ＴＣＲ Ｖβ遺伝子発現のパーセンテージを示す（平均±ＳＥＭ）。ｂ－ｄ．ｈｕ．Ｔｈｏｒ マウス（ｎ＝４）から移植後３１週で骨髄と脾臓を採取し、ＦＣＭによりヒトＴ細胞サブセットの特徴を調べた。すべての細胞は、特に指定がない限り、最初にｈＣＤ４５＋集団でゲートされた。ｂ－ｃ．ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ナイーブ、およびＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋メモリーＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（ｂ）、ならびにＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞のサブセット（ｃ）の発達を示す代表的なＦＣＭグラフ。ｄ．ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスから採取した脾臓細胞を、ＰＭＡ＋イオノマイシン（下パネル）または培地＋ＤＭＳＯ対照（上パネル）で刺激し、ｈＩＬ１７ＡおよびｈＩＦＮγ（右パネル）に対する抗体で細胞内染色した。ｅ．ＨＬＡ不一致ヒト臍帯血サンプル（表３のｈＣＢｓ６および１８）で抗原投与したＹ１ ｈｕ．ＴｈｏｒマウスのｈＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の増殖応答を示すＭＬＲ実験。２つの独立した実験からの３回の繰り返しの代表的なＦＣＭグラフを示す。ｆ．ｈｕ．ＴｈｏｒマウスのＴＣＲ Ｖα遺伝子ファミリーの全体的な多様性。ＲＮＡはｈｕ．Ｔｈｏｒマウスの脾臓細胞（ｎ＝３、赤色列）と健常ドナーのＰＢＭＣ（青色列、ｎ＝３）から単離された。Ｖα遺伝子の発現は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔ細胞パネルで解析した。各Ｖαファミリーの総ＴＣＲ Ｖα遺伝子発現のパーセンテージを示す（平均±ＳＤ）。 図６Ａおよび６Ｂは、Ｔ細胞機能に関連する遺伝子のパスウェイ解析が、ｈｕ．Ｔｈｏｒ免疫細胞とＰＢＭＣとの間で類似の発現プロファイリングを示していることを示す図である。ｈｕ．Ｔｈｏｒ（ｎ＝２）およびｈｕ．ＳＲＣマウス（ｎ＝４）の脾臓細胞、ならびに健康なドナー（ｎ＝２）のＰＢＭＣから、全ＲＮＡを単離した。Ｔ細胞関連遺伝子パネルの発現をｎＣｏｕｎｔｅｒの直接デジタル検出技術で調べた。パスウェイスコア解析は、各パスウェイに関連する遺伝子群の第一主成分としてスコアを算出し、その全体的な特性を反映させるものであった。パスウェイスコア解析のサマリープロットでは、Ｔ細胞に関連するパスウェイがｈｕ．ＴｈｏｒとＰＢＭＣ細胞で類似の傾向を示し、ｈｕ．ＳＲＣ細胞とは著しい対照をなしている。ＴＣＲシグナル伝達、多様性、Ｔヘルパーサブセット（ａ）、および活性化（ｂ）に関連する特定のパスウェイのパスウェイスコア解析。Ｔ細胞の枯渇に関連する遺伝子の全体的な発現レベル。 図７は、ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスにおける同種異系ｉＰＳＣ由来のテラトーマの有効な拒絶を、同種異系ＣＣ１系統（左パネル）およびＹ１系統（右パネル）由来の腫瘍の重量で示す一組の図である。 図８Ａおよび８Ｂは、ｉＰＳＣ－胸腺オルガノイド由来のヒトＴ細胞が、ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスにおける体液性免疫応答を調節できることを示す図である。ａ．ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスにおける主要なヒト免疫グロブリンクラスの生成。移植後１６～１８週のｈｕ．Ｔｈｏｒマウスから血清を採取した。ヒト免疫グロブリンクラスのアイソタイプは、ＬＵＭＩＮＥＸアイソタイピングキットを用いて定量化した。同様の移植後年齢の未処理のＭＳＧおよびｈｕ．ＳＲＣマウスからの血清を対照として使用した。ｂ．ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスに５０μｌの臨床グレードのジフテリアトキソイド（ＤＴ）ワクチンを筋肉内注射し、１週間後にブースター注射を行った。血清サンプルは、免疫前（出血前、Ｐｒｅ）、免疫後１週間（Ｐｏｓｔ）、および最初の免疫の４週間後（Ｂｏｏｓｔ）に採取した。ＤＴ反応性ＩｇＧ抗体はＥＬＩＳＡで測定した。Ｐｒｅサンプルと比較したＯＤ４５０値の倍増が示されている。ｎ＝３～５。＊，ｐ<０．０５。 図９Ａおよび９Ｂは、３Ｄアルギン酸ヒドロゲルカプセルにおけるヒトｈＥＳＣのＴＥＰＣへの分化およびＴＥＰＣ分化の異なる段階におけるｉＰＳＣ凝集体のサイズ分布を示す。ａ．開いた形状は、カプセル内の個々の凝集体のサイズを示す。ｂ．サイズ分布の箱ひげ図を示し、＃は平均値間に有意性がないことを示す ｐ<０．０５（一元配置分散分析と事後テューキー検定）。 図１０は、ｈＥＳＣ由来ＴＥＣからの組織工学的機能的胸腺オルガノイドを示す。ヒト胸腺オルガノイドは、Ｈ１ ｈＥＳＣ－ＴＥＣｓおよびＣＤ３４＋臍帯血を、脱細胞化したマウス胸腺スキャフォールドに共注入することによって構築した。胸腺オルガノイドは、トランスウェル培養システムのトップチャンバーで３週間培養された。胸腺オルガノイド内（Ｈ１オルガノイド）、またはオルガノイドから流出する細胞間（Ｈ１流出）のＴ細胞の発達を示す代表的なＦＣＭグラフである。Ｌ／Ｄ、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ 染色、死細胞は陽性に染色される。
本書は、バイオエンジニアリングに関するものであり、バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドおよび関連するヒト化動物モデルに関するものである。胸腺オルガノイドおよび動物モデル（マウスモデルなど）は、ヒト化抗体の作製、抗原特異的ヒトＴ細胞の作製、移植耐性の誘導、胸腺機能の活性化、ヒト疾患のモデル化など、様々な商業および臨床用途がある。
胸腺は、Ｔ細胞の発生に関与する主要なリンパ器官である。胸腺は、形態的にも機能的にも異なる２つの区画、皮質と髄質に分かれており、それぞれ皮質ＴＥＣ（ｃＴＥＣ）と髄質ＴＥＣ（ｍＴＥＣ）という２つの異なる胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）集団が存在する。胸腺間質細胞（ＴＳＣ）の他の集団には、胸腺線維芽細胞、内皮細胞、造血系由来のマクロファージおよび樹状細胞などが含まれる。このＴＳＣのネットワークは、骨髄（ＢＭ）由来の共通リンパ球前駆細胞（ＣＬＰ）の移動のためのホーミングシグナルと、胸腺細胞の分化と成熟およびＴリンパ球形成に必要な栄養因子の両方を提供している。
Ｔリンパ球の形成は、発達中の胸腺細胞とＴＥＣとの間の連続的なクロストークを含む、うまく調整されたプロセスである。Ｔ細胞発達の初期段階（例えば、系統決定、増殖、ＴＣＲ遺伝子組み換え、および正の選択（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ））は皮質領域で起こり、主にｃＴＥＣｓによって媒介される。得られたＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性（ＤＰ）細胞は、自己ペプチド提示ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）と相互作用できるＴＣＲを発現する。その後、ＤＰ細胞は髄質領域で負選択され、自己抗原に高い親和性を持つＴＣＲを発現する細胞は、造血由来のｍＴＥＣｓとＡＰＣｓによってアポトーシスを起こし、ＣＤ４＋ＣＤ８－またはＣＤ４－ＣＤ８＋単一陽性（ＳＰ）細胞に分化し、末梢で多様だが自己寛容なＴ細胞のレパートリーとなるべく循環に放出される。
胸腺間質の３Ｄ組織化は、その機能にとって重要である。胸腺間質コンパートメントの操作は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもｅｘ ｖｉｖｏでも、困難であることが証明されている。このボトルネックは主に、ＴＥＣの生存と機能にとって重要な胸腺間質の独特な構造に起因している。通常２Ｄシート状構造で形成される他の内臓器官の上皮細胞とは異なり、ＴＥＣはスポンジ状の３Ｄネットワークで組織化されている。２Ｄ培養のＴＥＣは、最終分化した老化上皮細胞のマーカーを発現し始め、さらには皮膚細胞へと分化転換する。ＴＥＣの分化と増殖に重要な遺伝子（ＦｏｘＮ１、ＤＬＬ－４、ＣＬＬ－２２、およびＴｂａｔａなど）の発現も、胸腺間質の３Ｄ組織に依存していることが示されている。
胸腺オルガノイドと作製方法
本書は、バイオエンジニアリングによる胸腺オルガノイドおよび胸腺オルガノイドのｉｎ ｖｉｔｒｏでの作製方法を提供するものである。オルガノイドとは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの臓器の３次元的なミニチュア版である。この方法によって製造された胸腺オルガノイドは、ヒト胸腺の生理および機能を模倣することができる。本明細書に記載の胸腺オルガノイドは、特に、ヒトドナー源に由来する胸腺細胞（例えば、ＴＥＰＣ）および異なるドナーまたは非ヒト動物に由来するスキャフォールドを有し得る。胸腺オルガノイドは、ヒト由来の他の細胞（例えば、前駆細胞）をさらに有することができ、これらは、宿主動物においてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで胸腺オルガノイド内で分化して、様々な目的に有用な細胞を産生することが可能である。
ＴＥＰＣ
本明細書に記載される胸腺オルガノイドは、特に、ヒト由来の胸腺細胞（例えば、ＴＥＰＣ）を有する。ＴＥＰＣを作製するために様々な方法を使用することができる。特定の実施形態において、本方法は、多能性幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＥＰＣに分化させることを含んでいてもよい。この点に関して、本方法は、多能性幹細胞をＴＥＰＣに分化させるのに十分な時間および条件下で、多能性幹細胞を培養することを有し得る。例えば、本方法は、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー（例えば、アクチビンＡ）、またはＷｎｔファミリーメンバー３Ａ（Ｗｎｔ３Ａ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、および線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の組み合わせの存在下で、異なる段階で多能性幹細胞を培養する工程を有し得る。
ＴＥＰＣの生成には、様々な多能性幹細胞を使用することができる。一般に、このような多能性幹細胞は、内胚葉、中胚葉、外胚葉の３つの胚葉のいずれかを発生させる能力を有している。多能性幹細胞は、例えば、幹細胞、例えば、胚性幹細胞、核移植由来胚性幹細胞、人工多能性幹細胞などを有し得る。多能性幹細胞、例えばｉＰＳＣは、様々な多能性関連遺伝子またはマーカーのうちのいずれか１つ以上を発現し得る。多能性関連遺伝子またはマーカーとしては、Ｏｃｔ－３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ｈＴＥＲＴ、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１～６０、ＴＲＡ－１～８１、ＴＲＡ－２～４９／６ＥおよびＮａｎｏｇが含まれるが、これらに限定されるものではない。
多能性幹細胞（例えばＥＳＣおよびｉＰＳＣ）をＴＥＰＣに分化させるために、多くのプロトコルを使用することができる。幹細胞由来のＴＥＰＣは胸腺上皮のマーカーを発現するが、Ｔリンパ球の造血機能を獲得するために、ｉｎ ｖｉｖｏでのさらなる成熟（例えば、無胸腺ヌードマウスの腎臓被膜の下に生着）を使用することが可能である。例えば、Parent, A. V. et al. Generation of functional thymic epithelium from human embryonic stem cells that supports host T cell development. Cell stem cell 13, 219-229, doi:10.1016/j.stem.2013.04.004 (2013), Sun, X. et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into thymic epithelial progenitor-like cells reconstitutes the thymic microenvironment in vivo. Cell stem cell 13, 230-236, doi:10.1016/j.stem.2013.06.014 (2013), and Chhatta, A. R. et al. De novo generation of a functional human thymus from induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol 144, 1416-1419 e1417, doi:10.1016/j.jaci.2019.05.042 (2019)を参照。しかし、これまでに作製されたｈＰＳＣ－ＴＥＰＣのいずれも、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＨＳＣのＴ細胞系統への分化を誘導する能力を示していない。注目すべきは、これらすべての方法において、従来の２Ｄ培養条件が使用されていたことである。
本書に記載の方法は、３Ｄ培養において、多能性幹細胞を分化させる工程を有し得、ここで、細胞は、ｃＴＥＣｓおよびｍＴＥＣｓを含むＴＥＰＣおよび／またはＴＥＣにさらに分化し得る。これらの細胞タイプは、ＥｐＣＡＭ１、ＣＫ５、ＣＫ８、ＣＫ１７、ＣＫ１８、ＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ２、ＨＯＸＡ３、ＥＹＡ１、ＰＡＸ９、ＦＯＸＮ１、ＰＲＡＳＳ１６、ＡＣＫＲ４、ＣＤ２０５、β５Ｔ、ＡＩＲＥおよびＣＳＮ２などの１、２、またはそれ以上の対応マーカーを用いて評価されうる。本明細書に開示されるように、３Ｄ培養は、２Ｄ培養、例えば、単層培養における胸腺間質細胞の２Ｄ培養と比較して、胸腺オルガノイドの発達を促進するためにより効果的であり得る。適切な３Ｄ培養システムは、アルギン酸カプセル中の懸濁液、ハンギングドロッププレート、および超低付着マルチウェルプレートなどの任意の３Ｄ培養システムを含み得る。
胸腺微小環境におけるＴＥＣの３Ｄ構成は、その胸腺上皮遺伝子シグネチャーを維持するために重要である。例えば、ＴＥＣのサイズと増殖を維持するための重要な転写制御因子であるＴｂａｔａの発現は、２Ｄ ＴＥＣ培養では急激に低下する。さらに、マウス胚から単離されたＴＥＣ前駆細胞は、２Ｄ接着培養では皮膚のケラチノサイトのマーカーを表示する。一方、生体適合性ハイドロゲル中で凝集体として培養したＴＥＣは、その分子特性を維持し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで最大７日間生存を延長することができる。本書のデータから、本研究で使用したアルギン酸ハイドロゲルカプセルは、ｉＰＳＣ由来ＴＥＰＣの生存に重要な３Ｄマトリックス支持を提供する可能性があることを示している。
例えば、２Ｄ ＴＥＰＣと比較して、後期胚および／または新生児の胸腺で初期転写されるｃＴＥＣ特異的遺伝子（例えば、ＰＲＳＳ１６、ＡＣＫＲ４、ＣＤ２０５およびβ５ｔ）の発現は、３Ｄ ｉＰＳＣ由来ＴＥＰＣで有意に増加した。同様の増加は、上皮マーカー（例えば、ＣＫ－５、ＣＫ－８、ＣＫ－１７、ＣＫ－１８）の発現で検出された。これらの知見は、３Ｄ ＴＥＰＣが２Ｄ培養のものよりもＴＥＣの発達の後期段階を表していることを示唆している。３Ｄ ｉＰＳＣ由来ＴＥＰＣを脱細胞胸腺スキャフォールドのＥＣＭ微小環境に曝露すると、抗原提示に関連する遺伝子（例えば、ＭＨＣ ＩＩおよびＣＤ７４）の発現が有意に増加したことから示唆されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＥＣの成熟がさらに促進された。実際、３Ｄ ｉＰＳＣ由来ＴＥＣで構築されたヒト胸腺オルガノイドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＣＤ３４＋ＨＳＣのＤＰおよびＳＰ Ｔ細胞の両方への分化をうまくサポートし、胸腺形成機能を強調した。したがって、実施形態において、本方法によって作製された胸腺オルガノイドは、上記マーカー、特に、ＣＫ－５、ＣＫ－８、ＣＫ－１７、ＣＫ－１８、ＥＹＡ１、ＰＡＸ９、ＦＯＸＮ１、ＰＲＡＳＳ１６、ＡＣＫＲ４、ＣＤ２０５、β５Ｔ、ＡＩＲＥおよびＣＳＮ２の１つ、２つ、それ以上、または全てについて高い発現レベルを有し得る。
胸腺スキャフォールド
上記のように、胸腺間質の独特な構造および微小環境は、ＴＥＣの生存および機能にとって重要である。本明細書に開示される胸腺オルガノイドは、胸腺からの細胞外マトリックスを有する胸腺スキャフォールドを含んでもよく、これは、ＴＥＣの再コロニー形成とＴリンパ球造血などの関連する胸腺機能のための微小環境を提供する。好ましい実施形態では、胸腺スキャフォールドは、ドナー動物からの脱細胞化胸腺組織または器官もしくは腺などの、脱細胞化胸腺スキャフォールドである。
スキャフォールドを作製するために様々な方法を用いることができる。その一例として、デタージェント灌流法に基づく方法を用いると、ＥＣＭ成分をほぼそのまま無傷に保ちながら、あらゆる規模のほぼすべての臓器の細胞区画をクリアランスすることが可能である。以下に示すのは、３Ｄ ＥＣＭ構造を保持したまま、胸腺のすべての細胞を除去するプロトコルの例である。このプロトコルでは、細胞溶解のためのデタージェント処理と同時に、細胞内の氷晶形成を誘導するために数回の凍結／解凍サイクルを行うことで脱細胞化が達成される。例示的なプロトコルは以下を含む：
（１） ３～２４週齢のマウスから胸腺を摘出し、発泡スチロールの箱に入れ、－８０℃で２５分間凍結させる。
（２） 凍結胸腺サンプルを、その後、３０℃のウォーターバスで３０分間解凍する。
（３） （１）と（２）を１～２回繰り返す。
（４） 胸腺サンプルは、０．５％ＳＤＳ溶液２ｍＬとともに１２ウェルプレートに移し、室温でシェーカー上のプレートに置く。胸腺サンプルの透明度を１時間ごとに観察し、０．５％ＳＤＳを１．５～２時間ごとに交換する。この工程を２～３回繰り返す。より大きな胸腺サンプルの場合、さらに１～２回の処理が必要な場合がある。
（５） ０．５％ＳＤＳを０．１％ＳＤＳに置き換え、サンプルを４℃（冷蔵室）で一晩、シェーカー上でさらに脱細胞化する。
（６） 残った胸腺マトリックスを、サンプルを収容するように取り付けられたセルストレーナーの上に置く。
（７） ２ｍＬのｄｄＨ２Ｏ ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２（５ｍＭ）、ＴＲＩＴＯＮ－Ｘ（１％）で１５分間の洗浄を３回行う。残りの胸腺マトリックスは、洗浄ごとに新しいウェルに移し替える。胸腺サンプルは、最初の洗浄でのみ不透明になる。もし、このまま濁り続けるようであれば、そのサンプルはスキャフォールドとして使用するには不適当である可能性がある。サンプルはほとんど透明のままである必要がある。
（８） ２ｍＬのＰＢＳで１５分間の洗浄を３回行う。再度、胸腺を洗浄ごとに新しいウェルに移す。
（９） 胸腺スキャフォールドを乾燥した円形の９６－ウェルプレートに入れ、保管する。プレートステッカーで覆い、４℃（冷蔵下）に置くか、または、胸腺スキャフォールドを２ｍＬ ＰＢＥ＋Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ中に保管する。４℃（冷蔵下）に置く。
胸腺オルガノイドを構築するために、ＴＥＰＣのような胸腺細胞を無細胞胸腺スキャフォールドに播種または注入し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することが可能である。細胞の生存率は、当技術分野で知られる技術で評価することができる。以下の例に示すように、細胞は胸腺スキャフォールドのＥＣＭに効果的にコロニーを形成し、最大で数週間生き続けることができる。ＴＥＣ特異的遺伝子のＲＴ－ＰＣＲ分析によって示されるように、胸腺間質の分子的特徴は、胸腺オルガノイドにおいてほぼ維持される。
本明細書に記載される胸腺オルガノイドは、様々な利点のうちの１つまたは複数を有する。例えば、本方法により作製されるヒトｉＰＳＣ由来胸腺オルガノイドは、哺乳動物における状態、例えば、がんを治療または予防するために有用なＴ細胞系統の細胞などの胸腺移住細胞を産生することができる。さらに、本方法は、胸腺で行われる正の選択過程を模倣することができるオルガノイドを提供し得る。正の選択処理とは、新しく形成された胸腺細胞がＭＨＣ（主要組織適合性複合体）を認識し、相互作用する能力のことである。ヒト胸腺における正の選択では、ＭＨＣと結合できる胸腺細胞のみが生き残り、髄質に移動し、成熟Ｔ細胞へと分化する。
いくつかの実施形態において、胸腺オルガノイドは、ヒト胸腺に類似した方法で、胸腺上皮細胞を３Ｄ組織で産生することを可能にする。実施形態において、本方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞を分化させることができるオルガノイドを製造することができる。実施形態において、本方法および胸腺オルガノイドは、自己Ｔ細胞を産生する方法を提供し得る。例えば、本明細書は、血液バンクおよび状態または欠損、例えば、貧血および他の細胞減少症の治療のための希少血液型のＴ細胞およびＮＫＴ細胞等の免疫細胞を生成する方法を開示する。いくつかの実施形態では、本方法は、免疫不全の患者のためにＴ細胞およびＮＫＴ細胞を生成し得る。
リンパ球造血
本方法により作製された胸腺オルガノイドは、養子細胞療法に用いるＴ細胞系統の細胞を含む様々な胸腺移住細胞の生成に有用であると考えられる。したがって、本明細書の一実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏで胸腺移住細胞を調製する方法を提供する。
本方法は、胸腺オルガノイドに適切な前駆細胞を播種または導入する工程を有し得る。例えば、Ｔ細胞系統に発達する可能性を有する任意の前駆細胞を胸腺オルガノイドに移動させることができる。好適な前駆細胞の例としては、原始中胚葉細胞、造血前駆細胞、多能性幹細胞由来細胞、造血幹細胞、Ｔ細胞前駆細胞、二重陽性Ｔ細胞、および未熟Ｔ細胞系統細胞などが含まれるが、これらに限定されるものではない。このような前駆細胞は、様々な方法で得ることができる。以下に、臍帯血サンプルからＣＤ３４＋ＨＳＣを取得するためのプロトコルの一例を示す：
（１） 臍帯血サンプル（～１００ｍＬ）はＶＩＴＡＬＡＮＴから入手する。ＣＤ３４＋ＨＳＣをＭＩＬＴＥＮＹＩ ＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞磁気ビーズを用いて、製造元のプロトコルに沿って分離する。
（２） ＣＤ３４＋ＨＳＣは、使用するまで液体窒素中でチューブあたり１ｘ１０５～２ｘ１０５個で凍結保存する。
（３）ＣＤ３４－細胞は、ＱＩＡＧＥＮの血液／細胞ＤＮＡ分離キット、または他の方法を用いて、ゲノムＤＮＡを単離するために使用される。ゲノムＤＮＡは、ＨＬＡタイピングサービスを利用して、ＨＬＡ検査を実施する。他の場所で説明されるｉＰＳＣ、ｈＥＳＣ系統のＤＮＡは、ＨＬＡタイピングを行う。後の工程で、ｉＰＳＣやｈＥＳＣ株と一致するＨＬＡ分子を持つＣＤ３４＋ＨＳＣを胸腺再構築に使用される。
（４） 胸腺オルガノイド構築の５～７日前に、ＣＤ３４＋ＨＳＣを回収し、６ウェル組織培養皿で、無血清造血幹細胞培養および増殖培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃまたはＳｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手できる）を用いて増殖させる。
Ｔ細胞作製のためのＣＤ３４＋ＨＳＣを含む胸腺オルガノイドを構築するための例示的なプロトコルを以下に示す：
（１）胸腺オルガノイドの構築。
（１．１） ヒトＴＥＰＣを回収するためにアルギン酸カプセルを脱カプセル化する。
（１．１．１） ２５０ｒｃｆで５分間、カプセルをスピンダウンし、培地を除去する。
（１．２．１） 液面がカプセルに近づいたら、チューブを少し横に傾けて、培地上清を吸引すると、カプセル表面より下にある培地を取り除くのに役立つ。
（１．３．１） アルギン酸カプセルに１００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を約７ｍＬ加え、室温で５分間ロッカー／シェーカーに上に置く。５分後、溶液中に小さな白色細胞の凝集体が見える。
（１．４．１） 溶液を２５０ｒｃｆで５分間スピンダウンし、細胞を回収する。目に見える残留アルギン酸カプセルがある場合は、工程１．２．１と１．３．１を繰り返す。
（１．５．１） 上清を吸引し、細胞をスキャフォールドへの播種に使用した培地に再懸濁させる。
（１．６．１） ＴＥＰＣのごく一部を品質管理に使用することができる。具体的には約５００，０００～１，０００，０００個の細胞を抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＴＥＣの特異的マーカー）で染色することができる。Ｋｒｔ１８のような他の上皮細胞マーカーに対する抗体も使用可能である）。良好なバッチでは、６０～７０％以上のＥｐＣＡＭ＋細胞が存在するはずである。
（１．２） 胸腺オルガノイドの構築。
（１．２．１） １～３ｘ１０５ ＣＤ３４＋ＨＳＣと１～１０ｘ１０５ ＴＥＰＣを混合し、遠心分離して吸引し、２０～５０μＬの注入液に再懸濁する。使用する造血幹細胞：ＴＥＰＣの比率は、１／１０～１０／１の範囲で変更可能である。
（１．２．２） ２０μＬハミルトンシリンジ（３３ゲージの針付き）、またはマイクロピペットから炎の上で新たに引っ張ったガラス針にセルミックスを装填する（ガラス針を使用する場合は、ガラス針の先端をゴムチューブに接続し、もう一方の端にシリンジを装着する）。
（１．２．３） 胸腺のスキャフォールドをシャーレのカバーに移し替える。片手に鉗子を使用して、胸腺のスキャフォールドを安定させる。針の先で胸腺のスキャフォールドの膜を突き刺し、１つの葉に約２０μＬの細胞をゆっくりと注入する。もう片方の葉でも注入を繰り返す。
（１．２．４） 注入した胸腺スキャフォールドを１２ウェルプレートのトップチャンバーに移し替える。２ｍＬのＴ細胞培養培地（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＢＳとその他の栄養補助剤、さらに１～１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７と１～１０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３－Ｌ）を添加する。移植前に、５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーターでスキャフォールドを１～１４日間培養する（胸腺オルガノイド再構成と同じ日に胸腺生着も可能である）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養時間は、ＴＥＰＣの細胞外マトリックスへの付着を可能にする。また、細菌や他の微生物による汚染がないことを確認するための監視も容易になる。
いくつかの実施形態において、前駆細胞を播種する工程は、胸腺オルガノイドに前駆細胞を注入する工程を含んでもよい。一例として、本方法は、脱細胞化したマウス胸腺スキャフォールドに、ｉＰＳＣ－ＴＥＣおよびＵＣＢから単離されたＣＤ３４＋ＨＳＣを共注入する工程を含み得る。得られた胸腺オルガノイドは、トランスウェル培養システムのトップチャンバーで一定期間、例えば最大４週間以上培養することができる。必要に応じて、他の細胞を胸腺オルガノイドに注入することができる。例としては、例えば、間葉系幹細胞、または胸腺に一般的に存在し、特に内皮細胞および樹状細胞などのＴＥＰＣから直接生成されない任意の他の細胞を挙げることができる。以下に示すのは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトＴ細胞の生成を支援するために、ヒト胸腺オルガノイドを流動性チップ（フローセル）内で培養するためのプロトコルの例である。
（１） これらの研究で使用されるマイクロ流体チップは、一般的なＡｌｉｎｅチップの設計に基づいて設計され、ＡＬＩＮＥ，Ｉｎｃ．（ランチョ・ドミンゲス，カリフォルニア州）により製造されたものである。簡単に説明すると、チップ（７５ｍｍＬｘ２５ｍｍＷ）は５層設計で構成され、８～１０μｍの多孔質膜を備えている。アクリル製の最上層には、培地の流入と流出用に設計された４つの直線バーブがある。多孔質膜で仕切られた２つのチャンバーシステムは、下のチャンバーでヒト胸腺オルガノイドの同時培養を可能にするとともに、同時に上のチャンバーに一定の培地フローを提供することができる。
（２） マイクロ流体チップ内の胸腺オルガノイドは、Ｔ細胞分化培地（ｈＩＬ－７－１ｎｇ／ｍＬ、ｈＦＬＴ３Ｌ－１００ｎｇ／ｍＬ、ＨＫＧＳ－（１００ｘ，ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）、ｈＳＣＦ－１００ｎｇ／ｍＬ、ｈＴＰＯ－５０ｎｇ／ｍＬを補充したＳＴＥＭＳＰＡＮ ＳＦＥＭ ＩＩベース培地）を装填したＭｕｌｔｉ－Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｐｕｍｐ（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，ＭＡから入手可能）を用いて実行した。実験は、研究の長さに応じた適切な容量と直径の培地入りシリンジを用い、８０μｌ／時の流速（２０～２００μｌ／時の流速も使用可能）で実施された。シリンジには、２３Ｇ ０．５インチ鈍針（ＳＡＩ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌａｋｅ Ｖｉｌｌａ，ＩＬから入手可能）を装着した。注射器とチップの入力ポート、およびチップと流出液採取フラスコの接続にはＴｙｇｏｎ ｔｕｂｉｎｇ（Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈａｍｄｅｎ ＣＴから入手可能）を使用した。さらに、チップの残りの２つのポートを閉じるために追加のチューブを使用し、効率的な流圧を維持した。
（３） 胸腺オルガノイドから流出した細胞は、同じフローセルに収容したコラーゲンＩマトリックスディスクか、Ｍｏｕｓｅ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）および組換えｍＩＬ－２（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡから入手可能）を補充したＲＰＭＩ培地３ｍＬを含むＴ－２５組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ，ＭＥから入手可能）に回収した。すべての実験は、３７℃、５％ ＣＯ２で行われた。
（４） 細胞は、特定の表面マーカーに結合する蛍光色素標識抗体で染色し、フローサイトメトリーで解析することで特徴付けた。
いくつかの実施形態では、胸腺オルガノイドからの細胞（すなわち、胸腺移住子細胞）を調製することは、胸腺オルガノイドから細胞を遊走させるかまたは分離して胸腺移住子細胞を得ることを含んでいてもよい。胸腺オルガノイドからの細胞の流出は、例えば、解剖顕微鏡を用いた直接の可視化下で観察することができる。胸腺オルガノイドから胸腺移住子細胞を分離することは、任意の適切な方法で実施することができる。例えば、本方法は、胸腺オルガノイドの培養物から培地を除去することにより、放出細胞を穏やかに除去することを含んでいてもよい。好ましくは、胸腺オルガノイドからの胸腺移住細胞の単離は、例えば解剖顕微鏡を用いた直接可視化下で実施されてもよい。好ましくは、胸腺移住細胞は、胸腺オルガノイドを吸引または破壊することなく、単離される。本方法は、胸腺オルガノイド培養物から除去された培地を新鮮な培地に交換する工程を含んでいてもよい。胸腺オルガノイドは、その後、さらなる胸腺移住細胞の排出を観察することができる。
胸腺移住細胞は、ＣＤ４－、ＣＤ８－、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４－／ＣＤ８－、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋、ＣＤ４＋／ＣＤ８－、ＣＤ４－／ＣＤ８＋、Ｄ４５－またはＣＤ４５＋であってもよい。代替的または追加的に、胸腺移住細胞は、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ６９－、ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ６９－、ＣＤ６２Ｌ－、ＣＤ６９＋、ＣＤ６２Ｌ－／ＣＤ６９＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ３＋ＣＤ４＋、および／またはＣＤ３＋ＣＤ８＋のいずれか１つ以上であってもよい。いくつかの実施形態では、胸腺移住細胞は、ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６－ Ｔｈ１、ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋ Ｔｈ１７、およびＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６－ Ｔｈ２細胞、並びに、免疫寛容の維持に責任を負うＣＤ４＋Ｔ細胞の重要な集団であるＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋ Ｔ－制御性細胞（Ｔｒｅｇｓ）を含むＴ－ヘルパー細胞およびそのサブセットであってもよいし、それらを含んでもよい。他の実施形態では、胸腺移住細胞は、ＣＤ４＋Ｔ－ヘルパー細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞、またはＣＲγδ＋Ｔ細胞であってもよく、またはそれらを含んでいてもよい。
本方法は、胸腺移住細胞を、Ｔ細胞系統の任意の所望のタイプの細胞に分化させることをさらに含んでもよい。胸腺移住細胞を分化させることによって調製され得る細胞型の例としては、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ幹細胞メモリー細胞、エフェクターＴ細胞、エフェクターメモリーＲＡ細胞（ＥＭＲＡ）、Ｔｈｌ細胞、Ｔｈ２細胞またはＴｈ１７細胞）などがあるが、それらに限定されるものではない。本発明の方法によって調製された胸腺移住細胞は、養子細胞療法に用いる細胞の調製に有用であると考えられる。
胸腺移住細胞の集団は、胸腺移住細胞以外の細胞、例えば、ＰＢＭＣ、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞等に加えて、胸腺移住細胞を含む異種集団であり得る。あるいは、細胞の集団は、実質的に均質な集団であり得、その集団は主に胸腺移住細胞を有する（例えば、本質的に胸腺移住細胞からなる。
ヒト化動物
本明細書に記載された胸腺オルガノイドは、ヒト化動物の作製に使用することができる。そのような動物は、ヒトの生理学および疾患を研究するためのモデルシステムとして使用することができる。また、この動物は、ヒトに使用するための治療用細胞を製造するために使用することができる。
動物モデルはヒトの生理学および疾患の理解に大きく貢献しているが、これらの知見を臨床に応用する際の主要なハードルのひとつが、ヒトと動物との種特異的な差の存在である。ＮＯＤ．ｓｃｉｄ．ＩＬ２ｒｇｎｕｌｌ（ＮＳＧ）または他の免疫不全ＩＬ２ｒｇｎｕｌｌマウス系統に造血系統のヒト細胞を移植したヒト化マウスは、これらの課題を克服するために広く利用されている強力なモデルである。造血ヒト化マウスは、移植されたヒト細胞の長期生存を可能にするだけでなく、ヒトの免疫応答を機能的に再現するため、感染症、がん、および自己免疫など、様々なヒトの病態を研究するための前臨床モデルとして使用することが可能である。ヒト造血細胞の他のヒト化マウスモデルとの比較は、その違いを示し、本明細書で提供される方法とモデルの利点を示している。
使用するヒト造血細胞のタイプと生着経路に基づいて、現在のヒト化マウスは一般的に３つのタイプに分類することができる。まず作製されたのは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＮＳＧマウスに静脈内（ｉ．ｖ．）注射するｈｕ．ＰＢＬモデルである。リンパ系細胞と骨髄系細胞の両方の移植は容易に確立される一方で、ｈｕ．ＰＢＬマウスは、宿主細胞反応性ヒトＴ細胞の存在により、数週間以内に致死的な異種移植片対宿主病（ｘＧＶＨＤ）を発症する。ｘＧＶＨＤの発症は、実験期間を３～４週間以内に制限し、実験結果の解釈が非常に複雑になる可能性がある。これらの欠点を克服するために、レシピエントマウスにＣＤ３４＋造血幹細胞を注入するｈｕ．ＳＲＣ（重症複合免疫不全－再増殖性細胞）モデルが開発された。このマウスでは、Ｔ細胞を除くほとんどの造血系統のヒト細胞が効率的に生成される。マウスとヒトの間には種に関連した差（例えば、成長因子やサイトカイン）があるため、ｈｕ．ＳＲＣマウスの内因性マウス胸腺は、機能的なヒトＴ細胞の発達を完全にサポートすることができない。強固なヒトＴ細胞の発達を達成するために、ｈｕ．ＢＬＴ（または、骨髄、肝臓、胸腺においてはＢＬＴ）モデルが開発された。このモデルでは、ヒト胎児の胸腺と肝臓の断片を、免疫不全ＩＬ２ｒｇｎｕｌｌレシピエントの腎臓被膜の下に共移植し、同じ胎児ドナーからのＣＤ３４＋造血幹細胞をｉ．ｖ．輸注している。しかし、ｈｕ．ＰＢＬモデル同様、ｈｕ．ＢＬＴマウスではｘＧＶＨＤの発生率が高く、長期間の研究には不向きである。ヒト胎児組織の使用に関する倫理的な問題は、前臨床試験への幅広い応用をさらに制限している。したがって、この分野では、長期的な適応免疫応答を媒介する自己寛容かつ機能的なヒトＴ細胞の開発を支援できる新しいマウスモデルが切実に求められている。
胸腺は自己複製能を持つＨＳＣを含まず、代わりに、骨髄からの共通リンパ球前駆細胞（ＣＬＰ）の動員に依存して、長期的な胸腺形成を維持する。胸腺に入ったＣＬＰは、系統決定や正負の選択などの一連の分化過程を経て、成熟Ｔ細胞になる。胸腺上皮細胞は、胸腺間質における主要な細胞集団であり、胸腺形成を通じて重要な制御的役割を担っている。皮質領域内のＴＥＣ（ｃＴＥＣ）は、Ｔ細胞の運命決定に重要なシグナルを与え、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と機能的に相互作用できるＴ細胞を正に選択する。一方、髄質領域内のＴＥＣ（ｍＴＥＣ）は、組織特異的自己抗原（ＴＳＡ）を発現し提示するという独特の特徴を持っている。これらのｍＴＥＣは、胸腺において自己反応性の高いＴ細胞を排除し、免疫学的自己寛容を維持するために重要である。
機能的胸腺オルガノイドは、脱細胞化した胸腺スキャフォールドに単離したマウスＴＥＣを再増殖させることによって構築することができる。例えば、Tajima, A., Pradhan, I., Geng, X., Trucco, M. & Fan, Y. Construction of Thymus Organoids from Decellularized Thymus Scaffolds. Methods in molecular biology 1576, 33-42, doi:10.1007/7651_2016_9 (2019)、および Hun, M. et al. Native thymic extracellular matrix improves in vivo thymic organoid T cell output, and drives in vitro thymic epithelial cell differentiationを参照。ネイティブ胸腺細胞外マトリクスは、ｉｎ ｖｉｖｏ胸腺オルガノイドＴ細胞の出力を改善し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胸腺細胞の分化を促進する。Biomaterials 118, 1-15, doi:10.1016/j.biomaterials.2016.11.054 (2017)。脱細胞化胸腺スキャフォールドにおける細胞外マトリックスの３次元ネットワークは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方でＴＥＣの長期生存と機能を維持することができる。無胸腺ヌードマウスの腎臓被膜の下に移植すると、組織工学によるマウス胸腺オルガノイドは、レシピエントマウスにおける多様で機能的なＴ細胞レパートリーの生成をサポートできる（Fan, Y. et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts.Mol Ther 23, 1262-1277, doi:10.1038/mt.2015.77 (2015))。このように、分離したＴＥＣでバイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドは、完全な生理的胸腺機能を提供することができる。しかしながら、倫理的な懸念とヒト胸腺ドナー組織の不足により、ヒト化マウスの胸腺機能を再構成するために単離ヒトＴＥＣを広く使用することは禁止されている。
一実施形態において、この文書は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の使用を通じてこれらの経験的および倫理的課題を回避するためのアプローチを開示している。ｉＰＳＣは、山中因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ）を一時的に過剰発現させることにより、体細胞から再プログラミングされた幹細胞である。Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676, doi:10.1016/j.cell.2006.07.024 (2006)を参照。多能性胚性幹細胞（ＥＳＣ）と同様に、ｉＰＳＣは、特定の細胞タイプ（膵島ベータ細胞、肝細胞、神経細胞、心筋細胞など）への分化誘導が可能で、再生医療研究において広く利用されている。ヒトｉＰＳＣ由来のＴＥＣは、機能的な胸腺オルガノイドを作製するための再生可能な細胞源として機能することができる。ヒト多能性幹細胞（胚性幹細胞と人工幹細胞の両方のｈＰＳＣ、）からＴＥＣを誘導することで、大きな進展があった。
ｈＰＳＣ由来のＴＥＰＣは、無胸腺のヌードマウスに移植すると、さらに成熟が進み、ポリクローナルマウスＴ細胞の発達をサポートする。同様のアプローチで、ヒトｉＰＳＣからＴＥＰＣへの分化も行われた。ｉＰＳＣからのＴＥＰＣ分化をさらに改善するために、Ｃｈｈａｔｔａらは分化中のｉＰＳＣに、ＴＥＣ発生のマスター転写調節因子であるＦｏｘＮ１をコードするレンチウイルスベクターを形質導入した(Chhatta, A. R. et al. De novo generation of a functional human thymus from induced pluripotent stem cells.)。J Allergy Clin Immunol 144, 1416-1419 e1417, doi:10.1016/j.jaci.2019.05.042 (2019))。ｈＥＳＣ由来ＴＥＰＣと同様に、ｉＰＳＣ－ＴＥＰＣはヌードマウスにおけるマウスＴ細胞のｄｅ ｎｏｖｏ生成をサポートすることができる。しかし、このｉＰＳＣ由来ＴＥＰＣがＨＳＣからヒトＴ細胞の分化をサポートできるかどうかは、これまで検討されていなかった。
本書では、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方でＣＤ３４＋ＨＳＣからヒトＴ細胞の発達をサポートできる、ヒトｉＰＳＣからの機能的ヒト胸腺オルガノイドの作製について説明する。例えば、以下の実施例に示すように、３Ｄハイドロゲルカプセルに埋め込まれたヒトｉＰＳＣは、最適化された多段階分化プロトコルにかけられ、ヒトＴＥＰＣ凝集体を生成した。ヒト胸腺オルガノイドは、脱細胞化したマウス胸腺スキャフォールドをｉＰＳＣ－ＴＥＰＣ凝集体とＣＤ３４＋ＨＳＣの組み合わせで再増殖することによって構築された。造血ヒト化マウス（ｈｕ．Ｔｈｏｒ）に移植すると、ｉＰＳＣ由来のヒト胸腺オルガノイドは、強固なアロ反応性応答と同種テラトーマを効果的に拒絶できる多様なＴ細胞集団の生成をサポートする。ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスの血清にはＩｇＧのサブセットが含まれており、Ｂ細胞におけるＴ細胞依存性免疫グロブリンのクラススイッチングの発達が示唆されている。さらに、ワクチン接種によりジフテリアトキソイドに対する抗原（Ａｇ）特異的なＩｇＧが生成される。これらのデータを総合すると、ｉＰＳＣ由来の胸腺オルガノイドは、ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスにおいて機能的なヒトＴ細胞コンパートメントの発達をサポートすることができることが示唆される。
本明細書で開示する機能性ヒト胸腺オルガノイドは、成体細胞由来の誘導性多能性幹細胞およびヒト胚性幹細胞を含む、任意の適切なヒト多能性幹細胞から組織工学的に作製することができる。臍帯血から分離したＣＤ３４＋ＨＳＣとともに、前処理した免疫不全マウスにｈＰＳＣ由来の胸腺オルガノイドを移植すると、いずれもマウスにおけるＨＳＣの生着をサポートし、体液性および細胞性の適応免疫応答を確立することができる。このアプローチは、個々の患者の適応免疫系を再現するためのカスタマイズされたヒト化マウスを作製するためのプラットフォームを提供する。
いくつかの例では、本書は、多様で機能的なＴ細胞応答と同時に完全な免疫コンパートメントをモデル化できる新規ヒト化マウスモデルの作製を開示する。このモデルの核心は、ＣＤ３４＋ＨＳＣから機能的なヒトＴ細胞の発達をサポートできる、ヒトｉＰＳＣ由来の胸腺オルガノイドである。したがって、ヒト化マウスモデルを使用して、胸腺機能の重度の欠陥および関連する生命を脅かす免疫不全状態、例えば原発性ディジョージ症候群および後天性免疫不全障害（ＡＩＤＳ）を特徴とする状態および不一致をモデル化することができる。
個別化医療
本書に記載された胸腺オルガノイドまたは動物モデルは、個別化医療に利用することができる。より具体的には、胸腺オルガノイドまたは動物モデルは、特定の障害を有する特定の患者の免疫モデルとして、その患者がその障害を治療するための特定の療法または薬剤にどのように反応し得るかを試験する際に使用することができる。その場合、本明細書に開示された方法で胸腺オルガノイドを生成するために特許からの細胞を使用することができ、胸腺オルガノイドはさらに適切な動物に移植することができる。次に、胸腺オルガノイドと動物の両方を使用して、治療法または薬剤を評価することができる。一例として、障害が腫瘍である場合、患者の腫瘍からのサンプルまたは細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏで動物モデルに移植するか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで胸腺オルガノイドと共培養することができる。動物または培養物中の腫瘍細胞の成長を調べることができる。適切な対照と比較して、移植または培養された腫瘍サンプルの細胞死の増加、成長の欠如、またはサイズの記載は、治療または薬剤が患者の治療に適していることを示す。
最近、がん研究で注目されているヒト化マウスモデルは、免疫不全マウスに同一患者のＰＢＭＣと腫瘍細胞を移植した個人化された異種移植ヒト化マウスである。これは薬物試験のための強力なツールであるが、他のｈｕ．ＰＢＭＣモデルと同様に、異種移植片対宿主病を発症するため、実験の時間枠が制限される。本書で紹介するヒト化マウスモデルはこれらの問題がないため、より適切なモデルの必要性に応えるものである。
薬物評価と創薬
上記の胸腺オルガノイドまたは非ヒト動物は、試験化合物または候補化合物（例えば、薬剤候補）を症状または障害の治療に用いることができるか否かの評価または判定に使用することができる。あるいは、胸腺オルガノイドまたは非ヒト動物を使用して、対象の疾患または病態の予後を決定することができる。
本明細書に記載の評価方法は、疾患または障害を調節（促進または抑制のいずれか）することができる薬剤を同定するのに有用である。例えば、評価方法は、対象が、薬剤に反応して免疫機能の低下に関連する疾患または障害（例えば、炎症、がん、自己免疫障害、または感染）を発症するリスクを有するかどうかを同定するために使用することができる。このアッセイは、対象が、そのような障害を治療するための薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、または他の薬剤候補）を投与されるのに適しているかどうかを決定するためにも使用することができる。上記アッセイの実施から得られる情報は、個人の健康状態に影響を及ぼす疾患および他の有害な状態の予後予測、進行の特定、および臨床管理において有用である。好ましい実施形態において、診断アッセイは、炎症、がん、自己免疫障害、または感染によって特徴付けられる状態の予後予測、進行の同定、および管理に有用な情報を提供する。この情報は、より具体的には、そのような状態を治療または予防するための治療レジームを設計する際に、臨床医を支援する。
テスト化合物の評価は、テスト化合物を含む試験液中で胸腺オルガノイドを一定期間培養し、胸腺オルガノイド内の細胞への影響や胸腺オルガノイドからの細胞の遊走を判定することにより行うことができる。テスト化合物は、非ヒト動物に投与することもできる。一定期間後、動物またはその細胞について、テスト化合物による影響を調べることができる。そのために、動物の胸腺オルガノイド、胸腺オルガノイドの細胞、または胸腺オルガノイドから遊走する細胞に対する化合物または組成物の影響を調べることができる。
一実施形態において、本方法は、胸腺オルガノイド内または胸腺オルガノイドからのＴ細胞の活性化を調べることを含み得る。Ｔ細胞活性化は、化合物と胸腺オルガノイドの共培養の間および／またはその後に決定することができる。Ｔ細胞活性化のための適切なアッセイは、ＤＮＡ複製アッセイ（例えば、３Ｈ－チミジン組込み）、細胞外および／またはサイトカイン生産アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー等）、およびＴ細胞活性化マーカーアッセイ（例えば、フローサイトメトリー）を含む。
いくつかの例では、Ｔ細胞の活性化は、細胞外または細胞内サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮγおよび／またはＩＬ－２産生等によって測定することができる。細胞外サイトカイン産生は、培養液中の１つまたは複数のサイトカインのレベルの変化を測定することによって測定することができる。典型的には、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、サンドイッチアッセイ、免疫沈降アッセイ、またはウェスタンブロッティング）が使用され得るが、他のアッセイもまた適切であり得る。(例えば、Harlow and Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1999)を参照）。細胞内サイトカインレベルについては、イムノアッセイ等を用いることができる。Ｔ細胞は、細胞内サイトカインレベルのアッセイに先立ち、（例えば、Ｔ細胞マーカーの発現に基づく収集によって）オルガノイドまたは動物から任意に分離することができる。（例えば、HarlowおよびLane、前掲書参照）。さらなる実施形態では、Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞活性化マーカーの調節によって決定され得る。そのようなマーカーには、例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ１２５などが含まれる。Ｔ細胞活性化マーカーの調節は、例えば、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルの変化を決定することによって測定することができる。タンパク質レベルの変化は、Ｔ細胞活性化マーカー、転写因子またはＴ細胞活性化に関連する他のタンパク質に対する標識抗体を用いたフローサイトメトリー、免疫測定法、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティング等によって決定することができる。ｍＲＮＡレベルの変化は、Ｔ細胞活性化マーカー、転写因子等をコードするメッセージについて決定することができる。ｍＲＮＡレベルは、例えば、ノーザンブロッティング、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）、他のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、プローブアレイ等を用いたアッセイ）、または他のアッセイにより決定することができる。(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Publish., Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley and Sons, New York (1999); 米国特許第５，４４５，９３４号；第５，５３２，１２８号；第５，５５６，７５２号；第５，２４２，９７４号；第５，３８４，２６１号；第５，４０５，７８３号；第５，４１２，０８７号；第５，４２４，１８６号；第５，４２９，８０７号；第５，４３６，３２７号；第５，４７２，６７２号；第５，５２７，６８１号；第５，５２９，７５６号；第５，５４５，５３１号；第５，５５４，５０１号；第５，５６１，０７１号；第５，５７１，６３９号；第５，５９３，８３９号；第５，５９９，６９５号；第５，６２４，７１１号；第５，６５８，７３４号；および第５，７００，６３７号を参照。
一例では、腫瘍サンプル／組織を胸腺オルガノイドと共培養するか、または非ヒト動物に移植することができる。試験化合物または試験組成物は、化合物／組成物を投与した後、腫瘍サンプルまたは組織における腫瘍細胞死のレベルまたは免疫細胞浸潤（例えば、Ｔ細胞浸潤）のレベルが対照レベルより高い場合、腫瘍の治療に適した候補化合物または候補組成物として同定され得る。あるいは、試験化合物または試験組成物は、化合物／組成物を投与した後、腫瘍増殖レベルが対照レベルよりも低い場合、腫瘍を治療するのに適していると同定され得る。
評価方法によって同定された候補化合物／組成物は、さらに試験を行って治療効果を確認したり、効果を最適化したり副作用を抑えるために改変したりして、治療薬として製剤化することが可能である。こうして同定された治療薬は、治療プロトコルに用いることで、以下のような疾患を治療することができる。
このような試験化合物の例としては、有機または無機小分子、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、多糖類、核酸、核酸類似体および誘導体、またはペプトイドが挙げられる。スクリーニングされる候補化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド、抗体、小分子、または他の薬剤）は、天然由来の物質から単離されるか、または当該技術分野で知られているコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることが可能である。そのようなライブラリとしては、ペプチドライブラリ、ペプトイドライブラリ（ペプチドの機能性を有するが、酵素分解に耐性のある新規の非ペプチド骨格を有する分子のライブラリ）、空間的にアドレス可能な並列固相または溶液相ライブラリ、デコンボリューションまたはアフィニティクロマトグラフィー選択によって得られた合成ライブラリ、および「ｏｎｅ－ｂｅａｄ ｏｎｅ－ｃｏｍｐｏｕｎｄ」ライブラリが挙げられる。例えば、Zuckermann et al. 1994, J. Med. Chem. 37:2678-2685; and Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145を参照。分子ライブラリの合成方法の例は、例えば、DeWitt et al., 1993, PNAS USA 90:6909; Erb et al., 1994, PNAS USA 91:11422; Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al., 1993, Science 261:1303; Carrell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061；およびGallop et al., 1994 J. Med. Chem. 37:1233を参照。化合物のライブラリは、溶液中（例えば、Houghten, 1992, Biotechniques13:412-421）、またはビーズ上（Lam, 1991, Nature 354:82-84）、チップ（Fodor, 1993, Nature 364:555-556）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、芽胞（米国特許第5，223，409号）、プラスミド（Cull et al,1992, PNAS USA 89:1865-1869）、またはファージ（Scott and Smith 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al., 1990, PNAS USA 87:6378-6382; Felici 1991, J. Mol.Biol. 222:301-310; および米国特許第５，２２３，４０９号)に存在する。
胸腺機能の回復
加齢に伴う胸腺の退縮は、Ｔ細胞の産生を低下させ、Ｔ細胞の多様性を狭め、適応免疫応答の低下をもたらす。また、胸腺は、化学療法、放射線照射、感染症などの外的刺激に対して非常に敏感であり、これらは不可逆的な損傷を与える可能性がある。このように、胸腺の機能を回復させることが臨床的に強く求められている。
胸腺の機能を回復することは、胸腺不全の治療に広く臨床的影響を与える。本明細書に記載の胸腺オルガノイドは、それを必要とする対象の胸腺機能を回復するために使用することができる。そのために、胸腺オルガノイドは、対象自身のＰＳＣ（自家）または適合したドナーからのＰＳＣ（同種）から生物工学的に作製され得る。本書では、機能的なヒト胸腺オルガノイドが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方でヒトＨＳＣからヒトＴ細胞の発達をサポートすることができることを、ヒトｉＰＳＣから組織工学的に行うことができることをここに示す。
いくつかの実施形態において、本明細書は、それを必要とする対象において胸腺機能を回復するための方法を提供する。本方法は、本明細書に記載の胸腺オルガノイドを対象に移植する工程を含む。胸腺オルガノイドは、同種異系であってもよく、好ましくは自己由来であってもよい。いくつかの実施形態では、免疫抑制治療もまた、必要に応じて投与され得る。
細胞性免疫療法
本書はまた、抗原特異的な遺伝子改変リンパ球サブセットを養子移入することによるような細胞免疫療法によって媒介される免疫応答を付与および／または増大させるための薬剤、方法および組成物に関するものである。このような養子細胞移植または養子細胞療法（ＡＣＴ）は、がん患者の治療のための有望な治療アプローチを表す。本書は、免疫系および自然免疫反応と適応免疫反応を調節する能力を有するキメラ抗原受容体を発現する遺伝子組換えリンパ球を含む組成物を提供する。開示された薬剤、方法および組成物は、抗腫瘍機能を強化した遺伝子組換えリンパ球、およびそのようなリンパ球の開発方法を提供する。
外来抗原受容体を発現するように遺伝子改変したＴ細胞やＮＫ細胞などの免疫機能細胞は、がんや感染症に対する有効な免疫療法である。Ｔ細胞のような自己抗原特異的な免疫細胞を治療用に単離するのは手間のかかる作業であり、そのような細胞が存在しないか希少である場合には不可能である。そこで、腫瘍やウイルスに特異的な免疫受容体を患者のＴ細胞に遺伝的に導入する戦略が開発されてきた。そこで、抗原（Ａｇ）認識ドメインとＴＣＲやＦｃ受容体のシグナル伝達ドメインが結合した抗原受容体が構築されている。このような抗原受容体を発現するＴ細胞は、導入した受容体が媒介する免疫特異的な反応を再現することができる。
キメラ抗原受容体（キメラ免疫受容体、キメラＴ細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体とも呼ばれる）は、Ｔ細胞に特定のタンパク質を標的とする新しい能力を与えるために操作された受容体タンパク質である。この受容体は、抗原結合機能とＴ細胞活性化機能を１つの受容体にまとめたもので、キメラ型と呼ばれている。ＣＡＲは、抗原結合部位に加えて、１つまたは複数の機能ドメインを持つことができる。
本明細書に記載の胸腺オルガノイドおよびヒト化動物は、ＣＡＲを発現するＴ細胞およびＮＫ細胞などの遺伝子改変免疫機能細胞を作製するために使用することができる。いくつかの実施形態では、例えば、特定のＴ細胞受容体（アルファ鎖およびベータ鎖の両方）をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を含むレンチまたはレトロウイルスベクターを使用して、ＣＤ３４＋骨髄前駆細胞を形質転換することができる。形質転換された細胞は、次に本明細書に記載の胸腺オルガノイドに播種し、さらにＴ細胞に分化させ、胸腺オルガノイドシステムをｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、流動性チップ）またはｉｎ ｖｉｖｏ（ヒト化マウス内）で使用して増大することが可能である。この方法により、感染症、がん、または腫瘍などの疾患の治療に十分な量のＣＡＲ－Ｔ細胞を作製することができる。
導入遺伝子は、様々な方法で標的細胞に導入することができる。このような方法としては、統合能力のあるガンマレトロウイルスやレンチウイルスを用いた細胞の形質導入、ＤＮＡ転移などがあるが、これらに限定されるものではない。
導入遺伝子の発現には、多種多様なベクターを使用することができる。特定のウイルスは、細胞に感染するか、または受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞に入る能力、および宿主細胞ゲノムに統合してウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現する能力により、外来核酸を細胞内に導入するための魅力的な候補となっている。したがって、特定の実施形態では、ウイルスベクターは、１つ以上の導入遺伝子またはその断片をコードするヌクレオチド配列を、発現のために宿主細胞内に導入するために使用される。ウイルスベクターは、１つ以上の制御配列、例えばプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の導入遺伝子またはその断片をコードするヌクレオチド配列を有し得る。あるいは、ウイルスベクターは制御配列を含まず、代わりに宿主細胞内の制御配列に依存して、導入遺伝子またはそのフラグメントの発現を駆動することになるであろう。核酸を送達するために使用され得るウイルスベクターの非限定的な例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、およびレトロウイルスベクターが含まれる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、微量注入、電気穿孔等が含まれる。外来性ベクターおよび／または核酸を含む細胞を製造する方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)を参照。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースのシステムなどのコロイド分散系を含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの放出ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
非ウイルス送達系が使用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏ）のために企図される。別の態様では、核酸は、脂質と会合していてもよい。脂質と会合した核酸は、リポソームの水性内部にカプセル化されてもよく、リポソームの脂質二重層内に点在してもよく、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に会合する結合分子を介してリポソームに結合していてもよく、リポソームまたはリポソームとの複合体に封入されてもよく、脂質を含む溶液中に分散してもよく、脂質と混合、または、脂質と結合してもよく、脂質、ミセルを含むまたはミセルとの複合体中に懸濁液として含まれてもよく、または脂質とその他の方法で結合してもよい。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクターに関連する組成物は、溶液中の特定の構造に限定されるものではない。例えば、それらは二重層構造で、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在することができる。また、溶液中に単に散在している場合もあり、サイズや形状が均一でない凝集体を形成している場合もある。脂質は、天然脂質でも合成脂質でもよい脂肪性の物質である。例えば、脂質には、細胞質内に自然に存在する脂肪滴のほか、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体を含む化合物のクラスが含まれる。
外来性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法にかかわらず、宿主細胞における組換えＤＮＡ配列の存在は、一連の試験により確認することができる。そのようなアッセイには、例えば、サザンおよびノーザンブロット、ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲのような当業者によく知られている分子生物学アッセイ；例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）による特定のペプチドの存在または不在の検出のような生化学アッセイまたは本書に記載したアッセイにより本書の範囲内にある薬剤を同定することが含まれる。
医薬組成物
上記の治療用細胞（例えば、胸腺移住細胞、ＣＡＴ－Ｔ細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞）は、医薬組成物などの組成物に配合することができる。このような医薬組成物は、本明細書に記載された細胞の集団のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、細胞の集団と、化学療法剤のような別の薬学的に活性な薬剤（複数可）または薬物（複数可）とを含むことができる。好ましくは、担体は、検討中の細胞の特定の集団に適した薬学的に許容される担体である。そのような薬学的に許容される担体は、当業者にはよく知られており、一般に容易に入手可能である。好適な製剤は、非経口、皮下、腫瘍内、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、または腹腔内投与のためのいずれかの製剤を含むことができる。
一例では、細胞の組成物は、注射、例えば、静脈内投与によって投与することができる。治療用細胞の集団が投与される場合、注射用の治療用細胞のための薬学的に許容される担体は、例えば、通常の生理食塩水（水中約０．９０％ｗ／ｖのＮａＣｌ、水中約３００ｍＯｓｍ／Ｌ ＮａＣｌ、または水１リットル当たり約９．０ｇ ＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬ Ｒ電解質溶液、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａ、水中約５％のデキストロース、または乳酸リンガーなどの任意の等張性の担体を含むことができる。実施形態では、薬学的に許容される担体は、ヒト血清アルブミンが補充されている。
投与される治療用細胞集団または医薬組成物の量または用量（例えば、細胞集団が投与されたときの細胞の数）は、妥当な時間枠にわたって患者において、十分に効果的、例えば、治療または予防の反応をもたらすのに十分であるべきである。例えば、細胞集団または医薬組成物の用量は、投与時から約２時間以上、例えば、１２時間から２４時間以上の期間において、状態を治療または予防するのに十分であるべきである。特定の実施形態では、その期間はさらに長くなり得る。用量は、投与される特定の細胞集団または医薬組成物の有効性、および患者の状態、ならびに治療される患者の体重によって決定され得る。用量を決定するためのアッセイは、当該技術分野において既知である。例えば、それぞれ異なる用量の細胞を与えられた一組の哺乳動物のうち、哺乳動物にかかる治療用細胞の所定用量を投与した際に標的細胞が溶解される程度を比較する工程を有するアッセイが、患者に投与すべき開始用量を決定するために使用され得る。特定の用量の投与によって標的細胞が溶解される程度は、当技術分野で知られた方法によってアッセイすることができる。
細胞の集団または医薬組成物の用量はまた、特定の細胞の集団または医薬組成物の投与に伴うかもしれないあらゆる有害な副作用の存在、性質および程度によって決定されるであろう。典型的には、主治医は、年齢、体重、一般的な健康状態、食事、性別、投与される細胞または医薬組成物の集団、投与経路、および治療される状態の重さなどの様々な要因を考慮して、個々の患者を治療するための細胞または医薬組成物の集団の投与量を決定する。
本書はまた、哺乳動物における状態を治療または予防する方法を提供する。本方法は、哺乳動物における状態を治療または予防するのに有効な量の上記の治療用細胞を哺乳動物に投与する工程を有する。本明細書の一実施形態において、前記状態は、がん、免疫不全、自己免疫状態、感染症、または血液状態である。
がんの例は、急性リンパ性がん、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、骨がん、脳腫瘍、乳がん、肛門、肛門管または肛門直腸のがん、眼球がん、肝内胆管がん、関節がん、頸部、胆嚢、または胸膜のがん、鼻、鼻腔、または、中耳のがん、口腔がん、外陰部がん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、消化管カルチノイド、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、腹膜、軟骨および腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん（例えば、腎細胞がん（ＲＣＣ））、小腸がん、軟部組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん、膀胱がんのいずれかを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
免疫不全の例としては、外部の病原体に対して自己防衛する身体の能力が損なわれている状態であれば、どのような状態であってもよい。免疫不全は、放射線照射または化学療法による免疫脱落の後に、患者の免疫系が損なわれ、再構成を必要とする任意の状態であってもよい。免疫不全は、例えば、高齢者集団における適応免疫系の枯渇を含んでもよい。そのため、本書に記載の胸腺オルガノイドは、原発性および二次性免疫不全の両方の治療に有用である治療用細胞を産生することができる。治療または予防され得る免疫不全の例としては、Ｘ連鎖性アガマグロブリン血症（ＸＬＡ）、可変免疫不全症（ＣＶＩＤ）、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ＡＩＤＳ、および肝炎が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
自己免疫疾患は、身体の免疫系が健康な細胞を攻撃する任意の状態であってよい。本書に記載された胸腺オルガノイドは、自己免疫疾患の治療に有用な治療用細胞を産生することができる。治療または予防され得る自己免疫状態の例としては、関節リウマチ、ループス、１型糖尿病、多発性硬化症、セリアック病、側頭動脈炎、血管炎、円形脱毛症、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、およびリウマチ性多発筋痛が含まれるが、これらに限定されるものではない。
感染症は、例えば、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、または原虫感染症のような感染疾患であってもよい。本明細書で使用される場合、「ウイルス感染症」は、人から人へまたは生物から生物へ感染し得る状態であって、ウイルスによって引き起こされる状態を意味する。本明細書の実施形態では、ウイルス疾患は、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、フラビウイルス、およびカリシウイルスからなる群より選択されるウイルスによって引き起こされ得る。例えば、ウイルス疾患は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン－バーウイルス、水痘ウイルス、サイトメガロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴリンパ向性ウイルス、カリシウイルス、アデノウイルス、およびアレナウイルスからなる群より選ばれるウイルスによって引き起こされ得る。ウイルス感染症は、例えば、インフルエンザ、肺炎、ヘルペス、肝炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、慢性疲労症候群、突然急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、胃腸炎、腸炎、心炎、脳炎、気管支炎、気道乳頭状疾患、髄膜炎、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、単核症等であり得る。
血液の状態は、血液に影響を与える任意の非がん性の状態であってよい。血液の状態は、例えば、細胞減少症（例えば、貧血、白血球減少症、好中球減少症）、血友病などの出血性疾患、および血栓であってもよい。
定義
本明細書で使用される「抗原受容体」または「抗原認識受容体」という用語は、抗原結合に応答して免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を活性化することができる受容体を意味する。特に、「抗原受容体」という用語には、Ｔ細胞のような免疫エフェクター細胞に任意の特異性を付与する人工受容体も含まれる。本明細書による抗原受容体は、例えばＴ細胞自身のＴ細胞受容体の代わりに、またはそれに加えて、Ｔ細胞上に存在することができる。このようなＴ細胞は、標的細胞の認識のために必ずしも抗原の処理および提示を必要とせず、むしろ標的細胞上に存在する任意の抗原を好ましくは特異的に認識することができる。好ましくは、前記抗原受容体が細胞表面に発現していることである。具体的には、標的細胞上の標的構造（例えば、抗原）を認識、すなわち結合し（例えば、標的細胞表面に発現する抗原に抗原結合部位または抗原結合ドメインが結合することにより）、細胞表面に前記抗原受容体を発現するＴ細胞などの免疫エフェクター細胞に特異性を付与し得る、単一分子または分子の複合体を有する人工または組み換え受容体が該当する。好ましくは、抗原受容体による標的構造の認識は、当該抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞の活性化をもたらす。抗原受容体は、本明細書に記載されるような１つ以上のドメインを有する１つ以上のタンパク質単位を有し得る。用語「抗原受容体」は、好ましくは、天然に存在するＴ細胞受容体を含まない。本明細書によれば、用語「抗原受容体」は、好ましくは、用語「キメラ抗原受容体」、「キメラＴ細胞受容体」、および「人工Ｔ細胞受容体」と同義である。例示的な抗原認識受容体は、ネイティブまたは遺伝子工学的ＴＣＲ、または遺伝子工学的ＴＣＲ様ｍＡｂｓ（Hoydahl et al. Antibodies 2019 8:32）、または腫瘍抗原結合ドメインが免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を活性化できる細胞内シグナル伝達ドメインに融合されたＣＡＲであり得る。
用語「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、ポリペプチドのセット、最も単純な実施形態では通常２つ、免疫エフェクター細胞内にあるとき、細胞に標的細胞に対する特異性および細胞内シグナル生成を提供するものをいう。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および以下に定義する刺激分子および／または共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを有する細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称する）を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのセットは、同じポリペプチド鎖にあり、例えば、キメラ融合タンパク質を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのセットは、互いに連続しておらず、例えば、異なるポリペプチド鎖にある。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのセットは、二量体化分子の存在時に、ポリペプチドを互いに結合させることができ、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合させることができる二量体化スイッチを含む。一態様において、ＣＡＲの刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に関連するゼータ鎖（例えば、ＣＤ３ゼータ）である。一態様では、細胞質シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３－ゼータの一次シグナル伝達ドメイン）を有する。一態様では、細胞質シグナル伝達ドメインは、以下に定義される少なくとも１つのコスティミュレイトリー分子由来の１つまたは複数の機能的シグナル伝達ドメインをさらに有する。一態様において、共刺激分子は、本明細書に記載される共刺激分子、例えば、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、および／またはＣＤ２８から選択される。
用語「免疫細胞」は、造血系由来の細胞で、抗原の特異的な認識に関与する細胞を指す。免疫細胞には、樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ－９２細胞などのＮＫ細胞などが含まれる。Ｔ細胞は、Ｔｅｆｆ細胞やＴｒｅｇ細胞を含む。
本明細書で使用される「リンパ球」という用語は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞を含み得る。ＮＫ細胞は、細胞傷害性（細胞毒性）リンパ球の一種であり、固有の免疫系の主要な構成要素を代表するものである。ＮＫ細胞は、アポトーシスまたはプログラムされた細胞死のプロセスを通じて、腫瘍およびウイルスに感染した細胞を拒絶する。Ｔ細胞は、細胞媒介性免疫（抗体が関与しない）において主要な役割を担っている。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）により、他のリンパ球と区別される。免疫系の特殊な器官である胸腺は、Ｔ細胞の成熟を主に担っている。Ｔ細胞には、次のようないくつかの種類：ヘルパーＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋細胞、エフェクターＴＥＦＦ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ、細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＴＬ、Ｔキラー細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、キラーＴ細胞としても知られている）、メモリーＴ細胞（（ｉ）ナイーブ細胞と同様に、幹メモリーＴｓｃｍ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ－セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、およびＩＬ－７Ｒα＋だが、ＣＤ９５、ＩＬ－２Ｒβ、ＣＸＣＲ３、およびＬＦＡ－１を大量に発現し、メモリー細胞に特有の多くの機能特性を示す）；（ｉｉ）セントラルメモリーＴＣＭ細胞は、Ｌ－セレクチンを発現し、ＣＣＲ７＋およびＣＤ４５ＲＯ＋であり、ＩＬ－２を分泌するが、ＩＦＮγやＩＬ－４は分泌しない、および、（ｉｉｉ）エフェクターメモリーＴＥＭ細胞、しかし、Ｌ－セレクチンやＣＣＲ７を発現しないが、ＣＤ４５ＲＯを発現し、ＩＦＮγやＩＬ－４などのエフェクターサイトカインを産生する）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、サプレッサーＴ細胞、またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）およびガンマデルタＴ細胞がある。腫瘍内に存在するＴ細胞は、「腫瘍浸潤リンパ球」または「ＴＩＬ」と呼ばれる。一方、Ｂ細胞は体液性免疫（抗体が関与する）の主要な役割を担っている。抗体や抗原を作り、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の役割を果たし、抗原との相互作用による活性化後にメモリーＢ細胞に変化する。哺乳類では、未熟なＢ細胞が骨髄で形成され、それが名称の由来となっている。
用語「幹細胞」は、自己複製能力、および、多能性または多面性を持つ細胞のことである。典型的には、幹細胞は、損傷した組織を再生させることができる。本明細書における幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹細胞、または組織幹細胞（組織特異的幹細胞、または体性幹細胞とも呼ばれる）であってよいが、これらに限定されるものではない。
「人工多能性幹細胞」とは、一般にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略され、非多能性細胞、通常は成人の体細胞、あるいは線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、神経細胞、表皮細胞などの終末分化細胞から、初期化因子と呼ばれる特定の因子を導入して人為的に調製される多能性幹細胞の一種を指す。
「多能性」とは、１つ以上の組織や器官を構成するすべての細胞、特に内胚葉（胃内壁、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿器）、外胚葉（表皮組織および神経系）のいずれかに分化する可能性を持つ幹細胞のことである。本明細書で使用される「多能性幹細胞」は、３つの胚葉のいずれかに由来する細胞、例えば、全能性細胞の直系子孫または人工多能性細胞に分化できる細胞を指す。
「末梢血細胞」とは、血液の循環プール内に見いだされる、赤血球、白血球、および血小板を含む、血液の細胞成分を指す。
「造血幹細胞および前駆細胞」または「造血前駆細胞」とは、造血系に関与しているが、さらに造血系に分化できる細胞を指し、造血幹細胞、多能性造血幹細胞（造血芽細胞）、骨髄系前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球系前駆細胞およびリンパ系前駆細胞が含まれる。「造血幹細胞（ＨＳＣ）」とは、骨髄系（単球、および、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）および、リンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含むすべての血球細胞タイプを生み出す多能性幹細胞である。
本明細書で使用される「対象」および「患者」という用語は、対象が何らかの治療を受けているか、または現在受けているかに関係なく、互換的に使用される。本明細書で使用される「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」および「対象（ｓｕｂｊｅｃｔｓ）」という用語は、哺乳類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ヒト以外の霊長類（例えば、カニクイザル、チンパンジーなどのサル）およびヒト）を含むが、それだけに限らない任意の脊椎動物を指すことができる。対象は、ヒトであってもよいし、非ヒトであってもよい。より例示的な態様では、哺乳類は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、がんを有する。いくつかの実施形態では、対象は、免疫不全である。
本明細書で使用される「治療する」または「治療」は、障害、障害の症状、障害に続発する疾患状態、または障害に対する素因を治癒、緩和、軽減、改善、発症を遅延、予防、または改善する目的で、障害を有する対象への化合物または薬剤を投与することを指す。
用語「治療する」および「予防する」は、必ずしも１００％または完全な治療または予防を意味するものではない。むしろ、当業者が潜在的な利益または治療効果を有すると認識する治療または予防の程度は様々である。この点で、本発明方法は、患者における状態の任意のレベルの治療または予防を任意の量だけ提供することができる。さらに、本発明方法によって提供される治療または予防は、治療または予防される状態の１つまたは複数の状態または症状の治療または予防を含むことができる。例えば、治療または予防は、腫瘍の退縮を促進することを含むことができる。また、本明細書において、「予防」は、状態の再発を防止すること、状態の発症を遅らせること、またはその症状もしくは状態を包含することができる。
「有効量」または「治療上有効量」とは、治療対象において医学的に望ましい結果をもたらすことができる化合物または薬剤（例えば、Ｔ細胞またはＤＣ細胞）の量を意味する。治療方法は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、単独で、または他の薬剤や治療と併用して行うことができる。治療上有効量は、１つまたは複数の投与、適用または投与量で投与することができ、特定の製剤または投与経路に限定することを意図するものではない。Ｔ細胞またはＤＣ細胞が疾患の退行を促進する能力は、臨床試験中のヒト対象、ヒトにおける有効性を予測する動物モデル系、またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける薬剤の活性のアッセイなど、当業者に知られた様々な方法を用いて評価することができる。
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、組成物の生物学的活性または特性を損なわず、比較的無毒である、すなわち、材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含まれる組成物の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく個体に投与され得る、担体または希釈剤などの材料を意味する。用語「薬学的に許容される担体」は、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される材料、組成物または担体、例えば液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶剤またはカプセル化材料など、治療剤または細胞を対象内または対象に運搬または輸送し、その意図する機能を果たすのに関与するものを含む。
用語「自己」は、後に再導入される同一の対象または個体に由来する任意の材料を指す。例えば、本明細書に記載の自己細胞治療方法は、ドナー、例えば、患者からリンパ球、免疫細胞、またはその前駆細胞を収集し、次いで、例えば、ＣＡＲコンストラクトを発現するように操作し、次いで、同じドナー、例えば、患者に再投与されることを含む。
用語「異種」は、異なる対象または個体に由来する任意の材料（例えば、細胞または組織スキャフォールド）を指す。本明細書で使用される「異種」または「非内在性」または「外来性」はまた、宿主細胞または宿主対象にネイティブではない任意の材料（例えば、遺伝子、タンパク質、化合物、分子、細胞、または組織もしくは組織成分）または活性、もしくは、宿主または宿主細胞にネイティブであるが、ネイティブと変異バージョンの間で構造、活性またはその両方が異なるように変更または変異された任意の遺伝子、タンパク質、化合物、分子、細胞、組織もしくは組織成分、または活性を指す。
用語「同種異系」は、ある個体から得られた材料（例えば、細胞または組織スキャフォールド）を、次に同じ種の別の個体に導入すること、例えば、同種異系細胞移植を指す。例えば、細胞は、第１の対象から得られ、本明細書に記載の方法に従って生体外で改変され、その後、疾患を治療するために第２の対象に投与されてもよい。このような実施形態では、対象に投与される細胞は、同種異系および異種細胞である。
「ベクター」は、別の核酸を輸送することができる核酸分子または粒子である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、またはファージであってもよい。また、この用語は、核酸の細胞内への移動を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。「発現ベクター」は、適切な環境に存在するときに、ベクターによって運ばれる１つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を指示することが可能なベクターである。特定の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない。「レトロウイルス」とは、ＲＮＡゲノムを有するウイルスのことである。「ガンマレトロウイルス」とは、レトロウイルス科の属を指す。ガンマレトロウイルスの例としては、マウス幹細胞ウイルス、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、および、トリ細網内皮症ウイルスが含まれる。「レンチウイルス」は、分裂細胞および非分裂細胞に感染する能力を有するレトロウイルスの属を指す。レンチウイルスの例としては、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含むヒト免疫不全ウイルス）、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（Ｈｙ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびシミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）などが含まれるが、それらに限定されるものではない。他の実施形態では、ベクターは非ウイルスベクターである。非ウイルスベクターの例は、脂質ベースのＤＮＡベクター、修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）、自己増幅ｍＲＮＡ、クローズドエンド線形二重鎖（ＣＥＬｉＤ）ＤＮＡ、およびトランスポゾン媒介遺伝子導入（ＰｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）を含む。非ウイルス送達システムが使用される場合、送達ビヒクルはリポソームであり得る。脂質製剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで宿主細胞に核酸を導入するために使用することができる。核酸は、リポソームの内部にカプセル化されてもよく、リポソームの脂質二重層内に散在してもよく、リポソームと核酸の両方に関連する連結分子を介してリポソームに付着し、ミセルを含むかまたは複合体を形成してもよく、そうでなければ脂質と関連付けてもよい。
実施例
実施例１ 材料と方法
本実施例は、後述の実施例２～８で使用した材料と方法を説明するものである。
マウス
すべての動物処置はＡｌｌｅｇｈｅｎｙ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌの動物管理使用委員会の承認を得た。ＮＯＤ．Ｃｇ．Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス（系統＃００５５５７）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バー・ハーバー、メイン州）から購入した。マウスは、移植の日に８～１２週齢であった。ＮＳＧマウスは、病原体のない施設に収容された。４～８週齢のＦＶＢマウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、国立衛生研究所および国際実験動物管理協会の評価および認定に従って飼育および世話をした。
ｉＰＳ由来胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）の作製
ｈＥＳＣの胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰ）分化のための段階別誘導プロトコルは、以前の研究（Parent, A. V. et al. Cell stem cell 13, 219-229, doi:10.1016/j.stem.2013.04.004 (2013)）から採用された。胚体内胚葉（ＤＥ）のステージ１は、メルトンベータ細胞分化プロトコルを用いて実施した。前腸内胚葉（ＡＦＥ）のステージ２は、０．５％ Ｂ２７（ＧＩＢＣＯ，ゲーサーズバーグ、メリーランド州)を添加したＲＰＭＩ培地で実施された。ステージ２（ＡＦＥ）については、以下の因子を用いた：５日目に１００ｎｇ／ｍｌ アクチビンＡ、５～７日目に０．２５μＭ レチノイン酸、６～７日目に５０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４（ＭＩＬＴＥＮＹＩ ＢＩＯＴＥＣ，オーバーン、カリフォルニア州）、および、６～７日目に５μＭ ＬＹ３６４９４７（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ＳＩＧＭＡ，バーリントン、マサチューセッツ州)。腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）およびＴＥＰのステージ３および４は、０．５％Ｂ２７を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ）で実施した。ステージ３（ＶＰＥ）およびステージ４（ＴＥＰ）については、以下の因子を用いた：８～１１日目に５０ｎｇ／ｍｌ Ｗｎｔ３Ａ、８～１１日目に０．１μＭ レチノイン酸、８～１１日目に５０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４、８～９日目に５μＭ ＬＹ３６４９４７、８～１１日目に５０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ８ｂ（ＭＩＬＴＥＮＹＩ ＢＩＯＴＥＣ）および８～１１日目に０．５μＭ ＫＡＡＤ－シクロパミン（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）。
ヒト化マウスの条件付けと細胞調製
Ｈｕ．ＳＲＣマウスは、条件付けされたＮＳＧマウスにヒト臍帯由来ＣＤ３４＋細胞を移植することで作製された。簡単に説明すると、特定のレシピエントＮＳＧマウスに、移植の１週間前に、２５０μＬの２ｍｇ／ｍＬ抗マウスＣＤ１１７（ｃ－ｋｉｔ）抗体（ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ、サンノゼ、カリフォルニア州）を腹腔内投与した。ヒト臍帯血細胞を注入する４８時間前および２４時間前に、この研究に関与するすべてのＮＳＧマウスに３０μｇ／ｇのブスルファンを腹腔内投与した（ＳＡＧＥＮＴ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ，シャンバーグ、イリノイ州）。
ヒト臍帯血はＶＩＴＡＬＡＮＴ（ピッツバーグ、フィラデルフィア州）から購入した。フィコール分離を利用して血液からリンパ球集団を分離し、ヒトＣＤ３４ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄ Ｋｉｔ ＵＬＴＲＡＰＵＲＥ（ＭＩＬＴＥＮＹＩ ＢＩＯＴＥＣ）を介してＣＤ３４＋細胞集団を分離し、ヒトＣＤ４５－ＡＰＣ（ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）とヒトＣＤ３４－ＶＩＯＢＬＵＥ（ＭＩＬＴＥＮＹＩ ＢＩＯＴＥＣ）のフローサイトメーター染色を用いて確認をした。その後、細胞は移植まで凍結または培養された。移植当日、１ｘ１０５～１ｘ１０６ＣＤ３４＋細胞をレシピエントマウスに眼窩後方から注入した。
ヒト胸腺オルガノイドの作製と移植
マウスの胸腺の脱細胞化は、以前に記載されたように化学洗剤洗浄を用いて行った（Tajima, A., Pradhan, I., Geng, X., Trucco, M. & Fan, Y. Construction of Thymus Organoids from Decellularized Thymus Scaffolds. Methods in molecular biology 1576, 33-42, 2019）。簡単に説明すると、３～４週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ．ＣＤ４５．１マウスからの胸腺を、組織が半透明で白色になるまで（～２４時間）、連続回転（ＬＡＢ ＬＩＮＥ，ＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，ウォルサム、マサチューセッツ州）させながら脱イオン水中の０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ，グランド・アイランド、ニューヨーク州）中で採取した。その後、器官をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、続いて１％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ，セント・ルイス、ミズーリ州）中でインキュベートした。さらに３回のＰＢＳ洗浄後、器官をＰＢＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）で最終洗浄し、さらに４８時間回転させた。脱細胞化した胸腺スキャフォールドは、ＰＢＳ中で４℃、最大１ヶ月間保存し、使用の２４時間前に１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍｍｏｌ／ｌ ｌ－グルタミン、および１０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳを添加したロスウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）－１０培養培地に切り替えた。
脱細胞化したスキャフォールドは、分離したＣＤ３４＋臍帯血細胞と脱カプセル化した胸腺上皮細胞で再構成された。ＴＥＣを脱カプセル化するために、アルギン酸カプセルを穏やかにペレット化し、１００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液中で室温にて５分間インキュベートした。ＰＢＥで洗浄後、細胞をペレット化し、計数した。ＣＤ３４＋細胞と～１：１０（ＴＥＣ：ＣＤ３４＋）の割合で結合させた後で結合した後、ペレット化し、ヒトＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＦＬＴ３Ｌ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍＬ）（ＭＩＬＴＥＮＹＩ）およびヒトケラチノサイト成長因子サプリメント（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ，ウォルサム、マサチューセッツ州）を加えた４０μＬのＳＴＥＭＳＰＡＮ ＳＦＥＭ ＩＩ基本培地に再懸濁した。その後、胸腺スキャフォールドの両葉に引き抜いたガラス針で細胞を注入し、移植前にトランスウェルシステムで５～７日間培養した。移植の日、スキャフォールドは手術の前に生理食塩水で３回穏やかに洗浄された。レシピエントのｈｕ．Ｔｈｏｒマウスはイソフルオランで麻酔され、スキャフォールドは左腎臓被膜下に移植された。
フローサイトメトリー解析
脱カプセル化した胸腺上皮細胞を以下の抗体で染色し、その表面タンパク質発現を測定した：抗ヒトＣＤ４５－ＡＰＣ、ＭＨＣクラスＩＩ－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）、ＥｐＣＡＭ－ＰＥ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）。すべてのサンプルは、蛍光色素が一致するＩｇＧ対照と比較された。
ヒト化およびＴ細胞生成の両方を決定するために、様々な時点でｈｕ．Ｔｈｏｒマウスから血液を採取した。血液を以下のモノクローナル抗体で染色した：抗ヒトＣＤ４５－ＡＰＣ、ＣＤ３－ＰＥ、ＣＤ４－Ｖ４５０、ＣＤ８－ＦＩＴＣ、および抗マウスＣＤ４５－ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ，サンノゼ、カリフォルニア州）、および、赤血球を溶解した。残りの細胞集団は２％パラホルムアルデヒドで固定し、ＦＡＣＳ Ｉｎｆｌｕｘシステム（ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）で分析した。動物の犠牲および組織採集の日に、マウス骨髄および脾臓細胞を以下の追加抗体で染色した：抗ヒトＣＤ２０－Ｖ４５０、ＣＤ１４－ＰＥ、ＣＤ３３－Ｖ４５０、ＣＤ４５ＲＡ－ＰＥ、ＣＤ４５ＲＯ－ＦＩＴＣ、ＣＤ２５－Ｖ４５０、ＣＤ１１ｃ－ＦＩＴＣ、ＣＤ５６－ＦＩＴＣ、ＣＤ１１７－ＰＥ、ＴＣＲαβ－ＰＥ、ＴＣＲγδ－ＦＩＴＣ、ＣＣＲ６－ＢＶ４２１およびＣＸＣＲ３－ＢＶ５１０（ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）。また、抗ヒトＦＯＸＰ３－ＰＥは、ＦＯＸＰ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒセットで、製造元のプロトコルに従って細胞内を染色した（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ）。使用した染色に関する追加情報は、表１に記載されている。死細胞は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｖｉｏｌｅｔ Ｆｉｘａｂｌｅ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ ｓｔａｉｎ ｋｉｔ（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ）を用いて解析から除外した。対応するすべてのフローサイトメトリー解析は、ＦＬＯＷＪＯ １０（Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．５．３）ソフトウェア（アシュランド、オレゴン州）で実施した。
Figure 2023502522000001
ＲＮＡ単離と遺伝子発現解析
ＴＲＩＺＯＬ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ，ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いて総ＲＮＡを抽出し、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いてｃＤＮＡを合成した。定量的リアルタイムＰＣＲは、Ａｌｌ－ｉｎ－Ｏｎｅ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＧＥＮＥＣＯＰＯＥＩＡ， ロックビル、メリーランド州）を用いて、ＲＯＣＨＥ ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ ４８０ ｓｙｓｔｅｍ（ＲＯＣＨＥ ＡＰＰＬＩＥＤ ＳＣＩＥＮＣＥ，インディアナポリス、インディアナ州）で実施された。本研究で使用した定量的リアルタイムＰＣＲプライマー配列を表２に示す。ＰＣＲ反応は、少なくとも３つの別々の実験においてトリプリケートで行った。相対的な遺伝子発現は、ＧＡＰＤＨに対して正規化された。
Figure 2023502522000002
遺伝子発現プロファイリング解析のために、ＴＲＩｚｏｌ（商標）法（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いて、ｈｕ．Ｔｈｏｒおよびｈｕ．ＳＲＣヒト化マウスの脾臓細胞からＲＮＡを製造者のプロトコルにしたがって抽出した。各ＲＮＡサンプルの濃度、品質、完全性は、まずＮａｎｏｄｒｏｐ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒで、次にＢＩＯＬＡＮＡＬＹＺＥＲ ２１００（ＲＮＡ Ｐｉｃｏ ｋｉｔ，ＡＧＩＬＥＮＴ）で検査した。ＤＶ２００値が７０％以上のサンプルのみが研究に使用された。１５０～５００ｎｇの総ＲＮＡを、Ｔ細胞機能の様々な経路に特異的な７７１の遺伝子（ユニークバーコード付き）のレポータープローブを捕捉できるＣＡＲ－Ｔ細胞遺伝子プロファイリングハイブリダイゼーションカートリッジにロードし、ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｍａｘ Ｇｅｎ ２ Ｓｙｓｔｅｍ（ＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，シアトル、ワシントン州）で特性評価した。ＮＳＧマウスから分離した脾臓細胞は、遺伝子の１５％未満がバックグラウンド以上である陰性対照として使用し、解析から除外した。すべてのリードは、ＮＳＯＬＶＥＲ ４．０ Ａｄｖａｎｃｅｄ解析ソフトウェアで解析した。具体的には、各サンプルの遺伝子発現プロファイルをパスウェイスコアの小さな集合に凝縮するパスウェイスコア解析を行った。パスウェイスコアは、各遺伝子セットのデータの第一主成分を用いて適合させたものである。スコアの増加は発現の増加に対応するように方向づけられる（具体的には、各パスウェイスコアは少なくとも半分の遺伝子に対して正の重みを持つ）。サマリープロットはパスウェイの結合挙動を探索し、共変量プロットはパスウェイのスコアと共変量を比較する。
ＴＣＲ Ｖβ遺伝子ファミリーの使用を特徴付けるために、Ｔ細胞遺伝子パネルからＶβ遺伝子の総リード数を算出し、個々のＶβファミリー発現のパーセンテージを算出した。同じ方法でＶα遺伝子ファミリーの使用も算出した。
Ｔ細胞サブセット表現型
脾臓細胞は、ｈｕ．Ｔｈｏｒ マウスから採取した。１ｘ１０６細胞／ｍＬをＲＰＭＩ－１０に入れ、非組織培養処理した６－ｗｅｌｌプレートにプレーティングした。細胞は、ヒトＴＨ１／ＴＨ１７ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ） に記載されているように、イオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）とＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍＬ）の両方で刺激し、ゴルジブロックで処理した。対照ウェルは刺激せず、ブロックもしないままとした。細胞は３７℃で５時間インキュベートした後、ポリプロピレン製ＦＡＣＳチューブに回収し、ペレット化した。その後、細胞を冷えたＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘバッファーに再懸濁し、室温でインキュベートした。細胞をペレット化し、ＰＢＥで洗浄した後、１ｘＢＤ Ｐｅｒｍ／洗浄バッファーに再懸濁し、室温でインキュベートした。最終遠心分離後、細胞を以下の抗体カクテルで染色した：抗ヒトＣＤ４－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、ＩＬ－１７Ａ－ＰＥ、ＩＦＮγ－ＦＩＴＣ、ＣＤ４５－ＡＰＣ、および抗マウスＡＰＣ／Ｃｙ７（ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）。細胞はＦＡＣＳ解析の前に２％パラホルムアルデヒドで固定した。
混合リンパ球反応
ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスを犠牲にし、脾臓と骨髄を採取した。同じ動物からの脾臓細胞および骨髄細胞を組み合わせ、計数し、陰性対照として非標識として取り置いたごく一部を除き、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）で標識した。簡単に説明すると、１ｘ１０７～１ｘ１０８ ｈｕ．Ｔｈｏｒキラー細胞をＰＢＳ中のＣＦＳＥの１０μＭワーキング溶液に再懸濁した。細胞を光から保護しながら３７℃でインキュベートし、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１０の添加により染色をクエンチした。その後、細胞をペレット化し、ＲＰＭＩ－１０に再懸濁し、そして１０分間インキュベートするために放置した。これらの標識細胞のごく一部を、次に、陽性対照として作用する以下の抗体でＦｃブロック（ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）染色した：抗ヒトＣＤ４５－ＡＰＣ、ＣＤ３－ＰＥ、ＣＤ４－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、ＣＤ８－ＢＵＶ３９５、およびＶｉｏｌｅｔ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）。残った細胞を数え、これらの標識されたレスポンダー細胞の１－２ｘ１０５を９６ウェルの丸底プレートにトリプリケートでプレーティングした。
ヒト臍帯血サンプルからマイトマイシンＣ処理により同種異系刺激細胞を調製した。簡単に言えば、臍帯血から分離したＣＤ３４＋細胞を培養し、計数した。細胞懸濁液は、ＰＢＳ中で５ｘ１０７細胞／ｍＬとした。マイトマイシンＣ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ）を５０μｇ／ｍＬ添加し、遮光しながら３７℃でインキュベートした。過剰の完全なＲＰＭＩ－１０培地を加えることによって反応をクエンチした。次に、細胞を３００ｘｇ、１０分間の遠心分離によって３回徹底的に洗浄し、細胞からマイトマイシン－ｃの痕跡をすべて除去し、反応への刺激細胞の添加による増殖反応の可能性を減少させた。その後、細胞を完全なＲＰＭＩ－１０に再懸濁し、計数した。細胞は、レスポンダー細胞のプレーティング密度に応じて、２～５ｘ１０５刺激剤細胞／ウェルでプレーティングされた。刺激細胞は、１：３（レスポンダー：刺激細胞）の比率でプレーティングした。プレートは、遮光しながら３７℃で７日間培養した。７日目に、ウェルを以下の抗体パネルで染色した：抗ヒトＣＤ４５－ＡＰＣ、ＣＤ３－ＰＥ、ＣＤ４－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、ＣＤ８－ＢＵＶ３９５、およびＶｉｏｌｅｔ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ （ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）。その後、サンプルをＢＤ Ｉｎｆｌｕｘ ＦＡＣＳシステムで実行し、ＦＬＯＷＪＯ １０ソフトウェアでデータを解析した。
テラトーマ解析
ＣＣ１ ｉＰＳ株（ＣＷ７０２９６ＣＣ１）はＣＥＬＬＵＬＡＲ ＤＹＮＡＭＩＣＳより購入した。Ｙ１ ｉＰＳ株は、健康なドナーの皮膚線維芽細胞から自家樹立され、（プロ）インスリン産生膵臓β細胞様細胞、胸腺上皮前駆細胞、線維芽細胞様細胞への分化誘導に成功した。両系統とも、ｍＴｅＳＲ ｐｌｕｓ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，０５８２５）で維持されてきた。コンフルエントになったところで、ＲＥＬＥＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，０５８７２）で細胞を凝集体として解離させた。回収した細胞を２５μＬあたり１ｘ１０６の濃度で培養液に再懸濁し、等量のＧＦＲ（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＣＯＲＮＩＮＧ，３５６２３１，氷上解凍）と混合し、インシュリン注射器にゆっくりと引き込み筋肉内注入を行った。１ｘ１０６ ｉＰＳＣ凝集体を仰向けに寝かせたｈｕ．Ｔｈｏｒおよびｈｕ．ＳＲＣレシピエントの腓腹筋に、ＣＣ１細胞が左側、Ｙ１が右側になるようにゆっくりと注入した。注射後２６日目にマウスを犠牲にし、テラトーマ切除を行った。切除したテラトーマは、画像解析に進む前に計測し、重量を測定した。テラトーマ形成の陰性対照として免疫不全ＦＶＢマウスを、陽性対照として免疫不全ＮＳＧマウスをそれぞれ使用した。
テラトーマの組織学的解析
テラトーマ組織は、免疫蛍光法（ＩＦ）およびＨ&Ｅ組織学的分析のために採取された。ＩＦ染色に使用する組織は、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（ＥＬＥＣＴＲＯＮ ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＹ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，ハットフィールド、ペンシルバニア州）中で３時間冷蔵し、ＰＢＳで洗浄後、３０％スクロース溶液中で４℃、少なくとも３日間静置した。切断の準備ができたら、組織をＰＢＳで簡単に洗浄し、ドライアイス上でＴｉｓｓｕｅ Ｐｌｕｓ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｃｌｅａｒ包埋媒体（ＦＩＳＨＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ，ヒューストン、テキサス州）に埋め込み、ＬＥＩＣＡ ＣＭ１９５０ ｃｒｙｏｓｔａｔ（ＬＥＩＣＡ，ヴェッツラー、ドイツ）を使用して８μｍの切片に凍結採取した。染色する準備ができたら、スライドを－２０℃から取り出し、ＰＢＳで再水和した。次に組織を４％ ＰＦＡでスライドに固定し、ＰＢＳで洗浄し、０．５％ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００ （ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ，セント・ルイス、ミズーリ州）で透析した。スライドを再度洗浄し、ＰＢＳ中の１％ ウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ，セント・ルイス、ミズーリ州）で１時間ブロッキングした。ブロッキング後、組織を洗浄し、以下の一次抗体（ＡＢＣＡＭ，ケンブリッジ、イギリス）を１：１００希釈で加え、４℃で一晩インキュベートした：ヒト抗ＣＤ３ （ａｂ１１０８９）および抗ＨＬＡ－Ａ（ａｂ５２９２２）。一次抗体を吸引し、組織をＰＢＳで洗浄した後、以下の二次抗体（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ， ウォルサム、マサチューセッツ州）を１：１０００希釈で添加し、室温で１時間インキュベーションした：ＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａ１１０３４）およびＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ ５５５ ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ａ２１４３４）。二次抗体を吸引し、組織をＰＢＳで洗浄した。核は、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｌａｓｓ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ ｗｉｔｈ ＮＵＣＢＬＵＥ （ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ，ユージーン、オレゴン州）を用いて染色された。スライドは，ＯＬＹＭＰＵＳ ＦＬＵＯＶＩＥＷ ＦＶ１０００共焦点顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ，新宿、東京、日本）を用いて画像化された。
Ｈ&Ｅ染色に使用するテラトーマ組織を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン（ＲＩＣＨＡＲＤ－ＡＬＬＥＮ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、カラマズー、ミシガン州）に入れた。組織はその後、Ａｌｌｅｇｈｅｎｙ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ病理部内で処理され、染色された。染色されたスライドは、適切な解釈と分析のために、複数の認定病理医によってレビューされた。
免疫グロブリンのクラススイッチングを検出する血清分析
血清は、ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスの血液から顔面静脈または心臓穿刺により採取した。Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ７－Ｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ ＰＲＯＣＡＲＴＡＰＬＥＸ Ｐａｎｅｌ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を使用して、ｈｕ．Ｔｈｏｒ血清内のＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥレベルを検査することにより、正常クラススイッチ機能を検出した。アッセイは製造者のプロトコルに従って実行され、ＬＵＭＩＮＥＸ ＦＬＥＸＭＡＰ ３Ｄ ｓｙｓｔｅｍ（ＬＵＭＩＮＥＸ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，オースティン、テキサス州）を用いて分析された。Ｈｕ．Ｔｈｏｒサンプルは、アッセイ内での偽陽性の発達を減らすために、対照の未処置ＮＳＧマウスと比較された。
統計解析
すべての値は、特に指定がない限り、平均値±標準偏差で表される。統計解析および比較は、特に指定がない限り、ＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭ Ｖｅｒｓｉｏｎ ８．０を用いて、対応のないスチューデントのｔ－検定（ＧＲＡＰＨＰＡＤ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて実施した。ｐ値の有意性に用いた反復は以下の通りである。＊<０．０５，＊＊<０．０１，＊＊＊<０．００１。すべての実験は、統計的な有意性を得るために最低ｎ＝３で実行された。
実施例２ ３Ｄアルギン酸微小環境によるヒト多能性幹細胞の胸腺上皮前駆細胞への分化促進
ｈＥＳＣを３Ｄアルギン酸カプセル内にカプセル化することで、多能性状態での細胞の増殖が促進されるとともに、段階的な系統特異的誘導により膵島様細胞への効率的な分化が起こることが示された（Richardson, T., Kumta, P. N. & Banerjee, I. Alginate encapsulation of human embryonic stem cells to enhance directed differentiation to pancreatic islet-like cells. Tissue Eng Part A 20, 3198-3211, 2014）。３Ｄ凝集培養における化学的および生物物理的な相乗的誘導により、２Ｄ培養と比較して、ｈＥＳＣの膵島仕様を著しく促進することができた。ｉＰＳＣのＴＥＰＣへの分化を促進するために同様のアプローチを採用した。
簡単に言うと、iPSCをアルギン酸カプセルに埋め込み、Parent, A. V. et al. Generation of functional thymic epithelium from human embryonic stem cells that supports host T cell development. Cell stem cell 13, 219-229, doi:10.1016/j.stem.2013.04.004 (2013), Sun, X. et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into thymic epithelial progenitor-like cells reconstitutes the thymic microenvironment in vivo. Cell stem cell 13, 230-236, doi:10.1016/j.stem.2013.06.014 (2013) および Richardson, T., Kumta, P. N. & Banerjee, I. Alginate encapsulation of human embryonic stem cells to enhance directed differentiation to pancreatic islet-like cells. Tissue Eng Part A 20, 3198-3211, 2014で報告されているものを改変して、４段階の分化プロトコルに従わせた。アルギン酸カプセルの３Ｄ環境は、単細胞としてカプセル化されたｉＰＳＣの生存を維持し、培養４～６日後に直径約５０ｕｍの小さな凝集体に増殖した（図１ａ）。カプセル化した凝集体は、最終的な内胚葉（Ｄ１～Ｄ４）に向かってさらに化学的に誘導され、平均凝集体サイズが増大し（箱ひげ図、図１ａ）、分布がより高い凝集体サイズへとシフトした（図１ａ、左パネルの実線）。ＴＥＰＣ系へのさらなる分化は、凝集体サイズのわずかな変化から判断して、さらなる増殖を誘発しなかったが、細胞の表現型は有意に変化した（図１ａおよび１ｂ）。ｉＰＳＣからＴＥＰＣへの分化の全体的な効率は、ＴＥＣの重要なマーカーであるＥｐＣＡＭの表面発現をフローサイトメトリー（ＦＣＭ）で調べることによって評価した（図１ｂ）。ｉＰＳＣ由来ＴＥＰＣの約８４．６±１３％（ｎ＝５）はＥｐＣＡＭ＋であった。ｈＥＳＣからＴＥＰＣへの分化誘導においても、ＴＥＰＣ凝集体の形成と分化効率の同様のパターンが観察された（図１ｂおよび図９）。これらの結果は、ｈＰＳＣからＴＥＰＣの誘導を促進するための３Ｄカプセル化の有効性を強調するものである。
ｉＰＳＣ由来のＴＥＰＣをさらに特徴付けるために、ＴＥＣ特異的マーカーの発現をＲＴ－ｑＰＣＲ分析で解析した。胸腺上皮の特異的サイトケラチンマーカーの発現が、２Ｄ培養から得られたものと比較して、３Ｄアルギン酸カプセルで生成されたＴＥＰＣで顕著に増加することが確認された。具体的には、ＣＫ８は２倍、ＣＫ１７とＣＫ１８はそれぞれ約６倍、５倍の発現増加が見られた。逆に、２Ｄと３Ｄの両方のＴＥＰＣは、幹細胞（ＯＣＴ４とＳＯＸ２）と胚体内胚葉（ＳＯＸ１７）のマーカーが著しく失われた。さらに、腹側咽頭内胚葉（ＶＰＥ）およびＴＥＣ前駆マーカーの発現が有意に増加し、ＴＥＰＣ系統へのｉＰＳＣ分化誘導が成功したことがさらに示唆された。特に、ＴＥＣ系統の発達の主要制御因子であるＦＯＸＮ１の発現が、２ＤのＴＥＰＣに比べて５倍以上増加し、３Ｄアルギン酸カプセル化条件下でのＴＥＰＣ分化の効率が高いことが強く確認された。
上皮前駆細胞から成熟ＴＥＣサブセット（ｃＴＥＣとｍＴＥＣ）への分化は、胸腺器官の形成と機能に極めて重要である。ＴＥＣ分化の進行をさらに検討するために、ＴＥＣサブセットに特異的な遺伝子の発現を調べた。自己抗原のプロセッシングとポジティブセレクション機能に重要なｃＴＥＣサブセットに特異的な遺伝子（例えば、ＰＲＳＳ１６、ＡＣＫＲ４およびβ５ｔ）は、２Ｄ ＴＥＣのものよりも３Ｄ ＴＥＣで有意に高いレベルで発現していた）。具体的には、ＰＲＳＳ１６は２倍、ＡＣＫＲ４は１０倍の発現量増加をそれぞれ示した。同様に、免疫学的自己寛容の確立に重要なｍＴＥＣのＴＳＡ発現の重要な転写調節因子であるＡＩＲＥの発現は、３Ｄ ＴＥＣでのみ促進された。同様の発現パターンは、ＡＩＲＥによってｍＴＥＣでの発現が制御されているＴＳＡであるＣＳＮ２でも見られた。まとめると、これらのデータは、３Ｄ培養は、従来の接着性の２Ｄ培養よりも、ｉＰＳ細胞からのＴＥＣ系統の分化および成熟を効率的に促進することが強く示唆された。また、ｈＥＳＣをＴＥＰＣに分化させた場合にも、同様の遺伝子発現パターンが観察された。
実施例３ 脱細胞化胸腺スキャフォールドの微小環境はｉＰＳＣ由来ＴＥＰＣのさらなる分化および成熟をサポートする
脱細胞化した胸腺スキャフォールドに単離したマウス成体ＴＥＣを再増殖させることにより、機能的胸腺オルガノイドを組織工学的に作製できることが明らかにされている。胸腺スキャフォールドの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、成体ＴＥＣの生存と増殖を効果的にサポートすることができる。胸腺ＥＣＭがｉＰＳＣ由来のＴＥＣの成熟と機能をさらにサポートできるかどうかを調べるために、ＴＥＣを、ヒト臍帯血（ＵＣＢ）から分離したＣＤ３４＋ＨＳＣとともに、脱細胞化マウス胸腺スキャフォールドに注入した。再構成されたヒト胸腺オルガノイドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスウェル培養システムのトップチャンバーで培養された。胸腺オルガノイド内の胸腺細胞は、長期間の培養で生存することができた。ＲＴ－ｑＰＣＲ解析の結果、ＭＨＣ ＩＩとＣＤ７４の両方の発現が有意に増加した。これらの遺伝子は、ＴＥＣが自己抗原を提示し、発達中のＴ細胞のポジティブおよびネガティブセレクションを媒介するために不可欠である（図２ａ）。
ｉＰＳＣ由来ＴＥＣがＨＳＣからヒトＴ細胞のｄｅ ｎｏｖｏ生成をサポートできることを実証するために、ヒト胸腺オルガノイドから２１日間のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養で細胞を分離し、ＦＣＭでＴ細胞発達マーカーの表面発現を検討した。ＣＤ４－ＣＤ８－二重陰性（ＤＮ）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性（ＤＰ）、ＣＤ４＋ＣＤ８－またはＣＤ４－ＣＤ８＋単一陽性（ＳＰ）細胞を含む様々な発達段階の胸腺細胞が検出され、ｉＰＳＣ－ＴＥＣから組織工学的に作製したヒト胸腺オルガノイドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴリンパ造血機能を再現することを示唆した（図２ｂおよび図１０）。
そのＴリンパ球形成機能をさらに実証するため、ｉＰＳＣ由来ＴＥＣ（単独、ヒトＨＳＣなし）を脱細胞化胸腺スキャフォールドに注入し、無胸腺ヌードマウスの腎臓被膜の下に移植した。ｉＰＳＣ由来ＴＥＣ生着マウスは１８～３２週目に犠牲にし、脾臓とリンパ節のＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞をＦＣＭでさらに特徴付けた（図２ｃおよび図２ｄ）。ＣＤ４＋Ｔ－ヘルパー細胞とＣＤ８＋細胞傷害性ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の両方が、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞と同様に検出された（図２ｅおよび２ｆ）。胸腺移植したヌードマウスの以前の知見と同様に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の大部分はナイーブ表現型（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ６９－）を示したが、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞はＣＤ６２Ｌ－ＣＤ６９＋メモリーＴ細胞表現型を示し（図２ｇ）、おそらくリンパ球減少環境下でＣＤ４＋ヘルパー細胞が拡大したためと思われた。さらに、胸腺オルガノイドを移植したヌードマウスから分離したＴ細胞は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイでアロ抗原に抗原投与すると、強固な増殖反応を起こした。これは、ｉＰＳＣ由来のＴＥＣ胸腺オルガノイドが、内在性マウス骨髄前駆細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの機能的成熟Ｔ細胞への分化をサポートすることを示唆している（図２ｈ）。
実施例４ ｉＰＳＣ由来胸腺オルガノイドを移植したヒト化ＮＳＧマウスにおけるヒト造血系細胞生着の促進
ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣを移植したＮＳＧマウス（通称：ｈｕ．ＳＲＣ）でヒト適応免疫応答を再現するための大きなハードルの一つは、ヒトＴ細胞の発達をサポートできるヒト胸腺が存在しないことである。この課題を克服するために、ｉＰＳＣ由来の胸腺オルガノイドをｈｕ．ＳＲＣマウスの腎被膜の下に移植し、ヒト化胸腺オルガノイド移植マウス（ｈｕ．Ｔｈｏｒ）を作製した。このマウスを４グループに分け、下表に示すような治療を施した：
Figure 2023502522000003
ＨＳＣおよび胸腺オルガノイド移植の前に、骨髄破壊アルキル化剤ブスルファンを用いてＮＳＧレシピエントを化学的に前処理した（グループ２、グループ１を対照とする）。抗ｃ－ｋｉｔ抗体でマウスを処理すると、骨髄内の内因性マウスＨＳＣが枯渇し、ドナー幹細胞の生着が促進されることが示されているので、ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスの作製にもｃ－ｋｉｔ枯渇レジメンを評価した（グループ４、グループ３を対照とする）。ｉＰＳＣ由来胸腺オルガノイドから作製したヒトＴ細胞がＨＳＣ由来ＡＰＣ（例えば、樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞）と機能的に適合するように、特に明記されていない限り、ｉＰＳＣと部分的に一致するＨＬＡ対立遺伝子を有する臍帯血（ＵＣＢ）サンプルから分離したＣＤ３４＋ＨＳＣのみを試験に使用した（表３）。
Figure 2023502522000004
４グループのマウス（Ｇ１～Ｇ４）のうち、対照グループ（Ｇ１、Ｇ３）はいずれも胸腺オルガノイドを移植したｈｕ．Ｔｈｏｒグループ（Ｇ２、Ｇ４）より全生存率が有意に悪かった（図３ａ）。Ｇ１（ｎ＝１６／３１）の５６．１％、Ｇ３（ｎ＝１１／１９）の５７．９％のマウスがＣＤ３４＋ＨＳＣ注入後３０日以内に死亡している。逆に、移植後３０日以内に死亡したのは３匹のｈｕ．Ｔｈｏｒマウス（Ｇ２，ｎ＝０／８；Ｇ４，ｎ＝３／３９）だけであった。これらの知見は、移植されたヒト胸腺オルガノイドが、条件付けレジメンに関連する有害な影響からレシピエントを保護することを示唆している。
Ｇ１およびＧ３マウスの生存率を向上させ、研究に十分な対照を得られるようにするため、これらのマウスではＣＤ３４＋ＨＳＣの細胞移植を５倍に増やして約１ｘ１０６細胞／マウスとした。注目すべきは、体重減少、脱毛、臓器や組織へのリンパ球浸潤などのＧＶＨＤの徴候が、試験開始から３５０日後のｈｕ．Ｔｈｏｒマウスでは観察されず、生着したｈＣＤ３４＋ヒト造血系細胞とＮＳＧレシピエントの細胞の間の相互寛容性が示唆された点である。移植されたＣＤ３４＋ＨＳＣの数が少なくても、移植後１２週目のｈｕ．Ｔｈｏｒマウスの末梢血には、対照と比較して高いレベルのｈＣＤ４５＋細胞が認められた（図３ｂ）。例えば、Ｇ４ ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスは、循環血液中に平均５５％のｈＣＤ４５＋細胞を示し、対照のＧ３マウスで見られた４％より有意に大きかった（図３ｂ）。
末梢血解析の結果と同様に、ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスの一次（骨髄）および二次（脾臓）リンパ器官では、より高いレベルのヒト細胞キメラが観察された（図４ａ～ｂ）。特に、Ｇ４マウスでは、骨髄と脾臓でそれぞれ８０％と７６％のｈＣＤ４５＋細胞が発現し、両組織で２０％のｈＣＤ４５＋発現しか示さなかった対照Ｇ３マウスと比較して、有意に増加した（図４ａおよび図４ｂ）。ｈｕ．Ｔｈｏｒマウス（Ｇ２＋Ｇ４）では、骨髄（２．４倍）と脾臓（２．３倍）において、ｈｕ．ＳＲＣマウス（Ｇ１＋Ｇ３）の２倍以上のｈＣＤ４５＋細胞の増加が見られた（図４ｃ）。ＦＣＭを用いたｈｕ．Ｔｈｏｒマウスのさらなる特徴づけにより、ヒトの造血区画にリンパ系と骨髄系の両方の細胞が発達することが明らかになった（図４ｄ）。Ｇ４マウスでは、より強固なヒト細胞の生着とＴ細胞の発達が観察されたため、ヒトＴ細胞の発達に対するｉＰＳＣ由来胸腺オルガノイド移植の影響をさらに明らかにするために、Ｇ４ ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスに焦点を当てるよう努力した。
実施例５ ｉＰＳＣ由来胸腺オルガノイドは、ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスにおいて機能的なヒトＴヘルパー細胞サブセットの発達をサポートすることができる
多様なＴＣＲレパートリーは、効果的な適応免疫反応に不可欠である。ｈｕ．ＴｈｏｒマウスのＴ細胞集団の全体的な多様性を評価するため、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ ＴＣＲ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ａｓｓａｙパネルでＶβおよびＶα遺伝子ファミリーの発現を調べた（図５ａおよび図５ｆ）。各ＶβおよびＶαファミリーについて、ｈｕ．Ｔｈｏｒ脾臓細胞および健康なヒトドナーのＰＢＭＣ間で同様のレベルのリードが検出され、ｈｕ．ＴｈｏｒマウスのＴ細胞レパートリーの複雑さが実証された。注目すべきは、脾臓のＣＤ４＋Ｔ－ヘルパー細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のかなりの集団が、ネイティブなＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－表現型を示したことである（図５ｂ）。Ｔ－ヘルパー細胞のさらなる特徴付けは、ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６－Ｔｈ１、ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋Ｔｈ１７、およびＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６－Ｔｈ２細胞を含む複数のサブセットの発達、ならびに免疫寛容の維持に責任を負うＣＤ４＋Ｔ細胞の重要な集団であるＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ－調節細胞（Ｔｒｅｇ）の存在を示した（図５Ｃ）。
ｈｕ．Ｔｈｏｒの主要なＴ細胞サブセットの機能性をさらに実証するために、ｈｕ．Ｔｈｏｒ Ｔ細胞を１２－ミリスチン酸ホルボール１３－酢酸（ＰＭＡ）／イオノマイシンで刺激し、抗ＩＦＮ抗体と抗ＩＬ－１７ａ抗体で細胞内染色し、ＦＣＭで分析した。ＩＦＮ産生Ｔｈ１細胞とＩＬ－１７ａ産生Ｔｈ１７細胞の両方が容易に検出され、ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスで複数の機能的Ｔヘルパー系統がうまく発達したことが示された（図５ｄ）。また、移植したＣＤ３４＋ＨＳＣやｉＰＳＣ胸腺オルガノイドのＨＬＡ遺伝子と全く異なるＨＬＡ遺伝子を持つ同種異系ヒト臍帯血細胞で刺激すると、ｈｕ．Ｔｈｏｒ Ｔ細胞が増殖した（表３）（図５ｅ）。これらの結果は、ｉＰＳＣ由来の胸腺オルガノイドが、ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスにおいて、ヒトＴ細胞の多様で機能的なレパートリーの発達をサポートできることを示すものである。
実施例６ Ｈｕ．Ｔｈｏｒ免疫細胞は、ヒトＰＢＭＣと同様の遺伝子発現プロファイリングを示す
ｈｕ．Ｔｈｏｒ免疫細胞の特性をさらに明らかにするため、Ｔ細胞の多様性、活性化、ＴＣＲシグナル伝達、代謝、消耗といったＴ細胞生物学に不可欠な経路に着目し、遺伝子発現プロファイリング解析を実施した。Ｈｕ．Ｔｈｏｒ免疫細胞は、ｈＰＢＭＣと同様のＴ細胞遺伝子発現プロファイリングを全体的に示したが、ｈｕ．ＳＲＣ細胞とは大きく異なっていた。特に、ｈｕ．ＴｈｏｒとＰＢＭＣの両細胞は、ｈｕ．ＳＲＣ細胞よりも高いレベルのＴＣＲ多様性を示し、より多様で複雑なＴＣＲレパートリーを示唆していた（図６ａ）。また、ｈｕ．ＴｈｏｒとＰＢＭＣの両細胞は、より高いＴＣＲシグナル表現型を示した。一貫して、Ｔｈ２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、およびＴｒｅｇ細胞を含むＴヘルパーサブセットのパスウェイスコアは、ｈｕ．Ｔｈｏｒ細胞とＰＢＭＣ細胞の間で同等であり、ｈｕ．ＳＲＣ細胞よりも顕著に高かった（図６ａ）。興味深いことに、活性化マーカーの発現もｈｕ．ＴｈｏｒとＰＢＭＣ細胞で高く、一方、ｈｕ．ＳＲＣ細胞ではＴ細胞の疲弊マーカーの発現が高かった（図６ｂ）。実際、Ｔ細胞疲弊関連遺伝子（例えば、ＰＤＣＤ１、ＴＮＦＲＳＦ９／ＣＤ１３７、ＣＤ２４４、ＨＡＶＣＲ２／ＴＩＭ３、およびＬＡＧ３）の転写リード数が多く、終末分化型メモリーエフェクターマーカーＫＬＲＧ１のリード数はｈｕ．ＳＲＣ細胞で低く検出された。遺伝子発現プロファイリングとパスウェイ解析の結果から、ヒトＴ細胞を介した免疫パスウェイの分子特性を再現するには、ｈｕ．ＳＲＣマウスよりもｈｕ．Ｔｈｏｒマウスが優位であることがさらに示された。
実施例７ ｈｕ．ＴｈｏｒマウスにおいてＤｅ ｎｏｖｏ生成したヒトＴ細胞は、同種異系腫瘍移植片を効果的に拒絶することができる
ｈｕ．ＢＬＴマウスもｈｕ．ＳＲＣマウスも幹細胞由来の同種移植片やテラトーマを効果的に拒絶できないことが示されているが、これは主にヒトＴ細胞が抑制性受容体の発現増加とエフェクター機能の低下を特徴とする「枯渇」状態への分化が進行するためである（Koorman，N． G. et al. Alloimmune Responses of Humanized Mice to Human Pluripotent Stem Cell Therapeutics.Cell Reports 20, 1978-1990, 2017）。一方、ｈｕ．Ｔｈｏｒ Ｔ細胞は、抗原特異的刺激（図５ｅ）または非特異的刺激（図５ｄ）のいずれかで活性化すると有効な応答を獲得し、増加したＴ細胞活性化パスウェイプロファイルを示した（図６ｂ）。
このモデルをさらに発展させ、ｈｕ．Ｔｈｏｒ Ｔ細胞の機能をｉｎ ｖｉｖｏで検証するために、同種異系のＣＣ１ ｉＰＳ細胞株から得たテラトーマをｈｕ．Ｔｈｏｒマウスにおいて作製した。胸腺オルガノイドを作製して移植したＹ１ ｉＰＳ細胞由来のテラトーマは、同系対照として使用した。同系Ｙ１幹細胞および同種異系ＣＣ１幹細胞の解離した小クラスターを、それぞれｈｕ．Ｔｈｏｒマウスの左右後肢に筋肉内注射した。テラトーマは接種後３週間目に採取し、計測および重量を測定した（図７）。ＮＳＧおよびｈｕ．ＳＲＣマウスでは同種異系ＣＣ１テラトーマの強固な増殖が認められたが、ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスでは著しく小さな腫瘍が認められた（図７、左パネル）。組織学的検査では、ｈｕ．ＳＲＣおよびｈｕ．Ｔｈｏｒマウスの両方でＣＣ１腫瘍にリンパ球浸潤が認められ、これは以前の報告と一致している。テラトーマ切片の免疫蛍光分析では、ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスから採取したＣＣ１腫瘍において、ヒト（ＨＬＡ－Ａ＋）ＣＤ３＋Ｔ細胞の浸潤が増加していることが確認された。これらの結果から、ｈｕ．Ｔｈｏｒ Ｔ細胞は、ｈｕ．ＳＲＣ Ｔ細胞が実現できない同種異系ｉＰＳＣ由来腫瘍を拒絶するアロ反応性免疫応答を効果的に起こすことができることが示唆された。なお、ＮＳＧ、ｈｕ．ＳＲＣ、およびｈｕ．Ｔｈｏｒマウスの間で、同系Ｙ１腫瘍の成長に有意差は認められなかった（図７、右パネル）ことから、Ｙ１胸腺オルガノイドはｈｕ，Ｔｈｏｒマウスの同種統移植片の免疫寛容を誘導する可能性が示唆された。
実施例８ ｉＰＳＣ－胸腺オルガノイドからＤｅ ｎｏｖｏ生成されたヒトＴ細胞は、ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスの体液性応答を媒介することができる
Ｂ細胞のＴ細胞依存活性化は、一次および二次液性適応免疫反応において重要な役割を担っている。初回抗原曝露後、ＴＨ２細胞から分泌されるサイトカインにより、形質細胞はＩｇＭからＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥへと免疫グロブリンのクラススイッチが行われる。抗原に再び曝されると、メモリーＢ細胞はさらに成熟し、免疫グロブリン遺伝子座でＶ（Ｄ）Ｊ体細胞突然変異を起こし、標的抗原に対してより高い親和性を有するＩｇＧを生成する。
ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスの血清中の免疫グロブリンクラスとサブクラスのレベルを調べるために、ヒト抗体アイソタイピングマルチプレックスアッセイを実施し、ｈｕ．ＳＲＣ対照と比較した。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥを含む主要なヒト免疫グロブリンクラスがｈｕ．Ｔｈｏｒ血清中に検出された（図８ａ）。特に、ＩｇＭとＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１とＩｇＧ３）のレベルが、ｈｕ．ＳＲＣサンプルと比較して有意に高いことが観察された。これらの結果は、移植されたｉＰＳＣ由来胸腺オルガノイドから生成されたヒトＴ細胞は、Ｂ細胞の成熟とアイソタイプスイッチング機能を促進することができることを示唆している。
さらに、特定の抗原に対して効果的な体液性応答を獲得する能力を評価するために、ｈｕ．Ｔｈｏｒ マウスにジフテリアトキソイド（ＤＴ）に対するワクチンを接種した。ＤＴに特異的なＩｇＧは、初回免疫後に生成され、ブースター投与後に有意に増加した（図８ｂ）。これらの結果は、ｈｕ．ＴｈｏｒマウスのｉＰＳＣ由来胸腺オルガノイドから作製したＴヘルパー細胞が、ヒトＢ細胞の成熟を促進し、ヒト適応免疫系の体液性応答のモデルとして使用できることをさらに証明するものである。
造血系ヒト化マウスは、ヒトの免疫系を研究するための強力な小動物モデルである。多系統の免疫細胞の生着と分化を改善するためにかなりの進歩があったが、機能的なヒトＴ細胞コンパートメントの開発は依然として大きな課題であり、ヒト適応免疫応答のモデリングの成功を大きく妨げている。長年にわたり、これらのマウスにおけるヒトＴ細胞の作製を改善するために、多くの努力が払われてきた。ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスにヒトＳＣＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－３を遺伝子導入すると、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ３３＋骨髄系細胞などの多様な造血系細胞の安定な生着が促進される。最近作製されたＲＧ ＳＫＩ ｈＩＬ－６マウス（Ｒａｇ２－／－Ｉｌ２ｒｇ－／－ＳＩＲＰａｈ／ｍＩＬ－６ｈ／ｈ）は、ヒトＩＬ－６を発現しており、リンパ系細胞の生存をよりよくサポートしていることがわかる。これらのマウスは胸腺が大きくなり、Ｔ細胞の数も多いことから、ｈＩＬ－６が胸腺形成を促進することが示唆される。また、抗体産生Ｂ細胞ではＩｇＧクラススイッチの成功が認められ、Ｔヘルパー機能の有効性が示唆されている。ヒトのサイトカインや因子を遺伝子導入して発現させると、ヒトＴ細胞の増殖や生存が促進されるが、Ｔ細胞の教育にはマウスの胸腺微小環境とマウスのＭＨＣに依存することに変わりはない。マウスＴＥＣによってポジティブに選択されたヒトＴ細胞は、マウスＭＨＣ発現ＡＰＣとの相互作用に大きく制限され、ヒト免疫応答をモデル化する能力が損なわれることになる。ヒトＨＬＡ分子をマウス細胞に遺伝子導入して発現させることにより興味深い効果が得られているが、ヒトＨＬＡ遺伝子の構成はマウスのそれよりも複雑である（例えば、マウスでは２つのＭＨＣ Ｉと１つのＭＨＣ ＩＩの遺伝子であるのに対し、ヒトでは３つのＭＨＣ Ｉと３つのＭＨＣ ＩＩの遺伝子である）。さらに、機能的な免疫学的シナプスの形成は、ヒトＴ細胞上のヒト共刺激分子（例えば、ＣＤ２８およびＣＤ４０）とマウスＡＰＣ上のそのリガンド（例えば、ＣＤ８０／８６およびＣＤ４０Ｌなど）の相互作用に依存し、ヒト化マウスがヒト免疫応答を再現する能力はさらに損なわれてしまうことになる。これに対して、本書に記載したｈｕ．Ｔｈｏｒマウスの胸腺オルガノイドにおけるｉＰＳＣ由来のＴＥＣは、ヒト胸腺微小環境内でヒトＴ細胞を選択することをサポートする。本データは、ＩＦＮγおよびＩＬ１７Ａをそれぞれ産生できるＴｈ１およびＴｈ１７細胞などのＴヘルパーサブセットの発達と機能性を実証している。また、ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスの血清には、低いが検出可能なレベルのヒトインターロイキン－６（ＩＬ－６）が含まれており、ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスがヒトの免疫応答を再現することに長けていることがさらに示唆された。
内因性のマウスの胸腺の存在は、変性しているとはいえ、ＨＳＣホーミングのために移植された胸腺オルガノイドと競合する可能性がある。その影響を抑えるために、ＮＳＧマウスの低形成胸腺は不可逆的な加齢に伴う線維化を起こすことが示されているので、８～１２週齢のＮＳＧマウスをレシピエントとして使用することができる。実際、調べたどのｈｕ．Ｔｈｏｒマウスでも、内因性マウス胸腺の回復の兆候は、本明細書に記載された研究では観察されなかった。化学療法を受ける患者の状態をモデル化するために、ＮＳＧマウスの前処理として、全身致死照射の代わりに化学的に誘導された骨髄破壊レジメンを用いた。この研究で用いられたレシピエントの年齢と化学的レジメンは、ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスで達成されたヒト細胞キメラのレベルにマイナスの影響を与える可能性がある。興味深いことに、ｈｕ．ＳＲＣ対照と比較してｈｕ．Ｔｈｏｒマウスで高い生存率が観察され、ヒト胸腺オルガノイドから産生されるヒトサイトカインまたは因子がブスルファンの化学毒性を軽減する可能性が示唆された。
実施例に示すように、部分的にＨＬＡが一致したＨＳＣをｉＰＳＣ－胸腺として使用することができるが、胸腺オルガノイドと移植ＨＳＣ間のＨＬＡが完全に一致すれば、ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスにおけるヒト適応免疫の再現をより促進することができる。したがって、１人の患者から採取したＴＥＰＣとＨＳＣの両方を用いたヒト化マウスは、患者の適応免疫系のモデリングをさらに向上させることができる。なお、ｈｕ．Ｔｈｏｒマウスの寿命は、移植後１２カ月以上生きたものもあり、ＧＶＨＤの臨床症状は観察されなかった。
本書では、自己寛容を維持し、外来抗原の抗原投与時に強固な免疫応答を行うことができるＴ細胞マルチサブセットの膨大な集団を生成することができるｈｕ．Ｔｈｏｒマウスの開発について開示する。ｉＰＳＣ株から構築したヒト胸腺オルガノイドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で、ＣＤ３４＋ヒトＨＳＣを機能的で多様なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞へ分化させることが可能である。この研究は、個別化医療のために、個々の患者からのＴ細胞媒介性のヒト適応免疫応答を小動物モデルで再現することの実現可能性を強調している。
好ましい実施形態の前述の例および説明は、特許請求の範囲によって定義されるように本書を限定するのではなく、例示するものとして受け取られるべきである。容易に理解されるように、特許請求の範囲に規定された本書から逸脱することなく、上記に規定された特徴の多数の変形および組合せを利用することができる。そのような変形は、本書の範囲から逸脱するものとはみなされず、すべてのそのような変形は、以下の請求項の範囲に含まれることが意図されている。本明細書で引用された全ての文献は、その全体が参照により組み込まれる。

Claims (42)

  1. バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドを作製するための方法であって、前記方法は、
    ヒト胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰＣ）もしくはヒト胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）またはその両方を有する細胞集団を得る工程と、
    前記細胞集団をヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）と規定比率で組み合わせ、組み合わせを形成する工程と、
    前記組み合わせを、脱細胞化した胸腺スキャフォールドの細胞外マトリックスに播種して、胸腺コンストラクトを生成する工程と、および、
    前記細胞外マトリックスへの細胞接着を可能にする条件下で前記胸腺コンストラクトを培養して、バイオエンジニアリング胸腺オルガノイドを作製する工程と、
    を有する、方法。
  2. 請求項１記載の方法において、前記ＴＥＰＣ、前記ＴＥＣ、または前記ＨＳＣは、ドナー個体に由来するものである、方法。
  3. 請求項１記載の方法において、前記ＨＳＣはヒトＣＤ３４＋造血幹細胞を有する、方法。
  4. 請求項１記載の方法において、前記脱細胞化胸腺スキャフォールドはドナー動物からのものである、方法。
  5. 請求項１記載の方法において、前記細胞集団は、
    ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を懸濁液中にカプセル化して、前記ｈＰＳＣを単一の細胞に分離する工程と、
    前記ｈＰＳＣを分化させずにその数を増加させるために増殖培地で培養する工程と、
    前記ｈＰＳＣを分化させてカプセル化培地でＴＥＰＣまたはＴＥＣを生成する工程と、および、
    前記カプセル化培地から前記ＴＥＰＣまたはＴＥＣを遊離させる工程と
    を有するプロセスによって得られるものである、方法。
  6. 請求項５記載の方法において、前記ｈＰＳＣは、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を有する、方法。
  7. 請求項１～６のいずれか１つに記載の方法において、前記胸腺コンストラクトは、ヒト免疫細胞を産生するために、栄養素およびヒト細胞の連続的な供給をするフローセルに配置される、方法。
  8. 請求項７記載の方法において、前記胸腺コンストラクトは免疫細胞を有する、方法。
  9. 請求項８記載の方法において、前記免疫細胞はＢ細胞およびＴ細胞を有する、方法。
  10. 請求項８記載の方法において、前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするウイルスベクターで形質導入される、方法。
  11. 請求項１０記載の方法において、前記ウイルスベクターは、フローセルに添加されて、前記Ｔ細胞を形質導入する、方法。
  12. 請求項７～１１のいずれか１つに記載の方法において、前記胸腺コンストラクトは薬剤候補に接触されて、前記薬剤候補の免疫細胞発達への影響を試験する、方法。
  13. 請求項１～６のいずれか１つに記載の方法において、前記胸腺コンストラクトは宿主動物に外科的に移植されるものである、方法。
  14. 請求項１３記載の方法において、前記宿主動物は前処理されたヒト化免疫不全動物である、方法。
  15. 請求項１４記載の方法において、前記宿主動物は前処理されたヒト化免疫不全マウスである、方法。
  16. 請求項１５記載の方法において、前記胸腺コンストラクトは、腎臓被膜下に配置されるものである、方法。
  17. 請求項１３～１６のいずれか１つに記載の方法において、得られた宿主動物に造血幹細胞を与え、ヒト免疫細胞を産生させる、方法。
  18. 請求項１７記載の方法において、前記得られた宿主動物は増加した量の完全ヒト免疫グロブリンＧを産生する、方法。
  19. 請求項１３～１８のいずれか１つに記載の方法において、前記宿主動物は薬剤候補を投与されて、前記薬剤候補の免疫細胞発達への影響を試験する、方法。
  20. 請求項１９記載の方法において、ドナー個体に対する前記薬剤候補の影響を試験するために、前記ＴＥＰＣ、前記ＴＥＣ、または前記ＨＳＣは前記ドナー個体からのものである、方法。
  21. 請求項２０記載の方法において、前記宿主動物は前記ドナー個体から細胞または組織を移植されるものである、方法。
  22. 請求項２１記載の方法において、前記細胞または前記組織はがん細胞を有する、方法。
  23. 請求項４または１３の方法において、前記ドナー動物または前記宿主動物は、非ヒト哺乳類である、方法。
  24. 請求項２３記載の方法において、前記非ヒト哺乳類は、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、および非ヒト霊長類からなる群から選択される、方法。
  25. バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドであって、
    （ｉ）ヒトＴＥＰＣ（ｈＴＥＰＣ）、ヒトＴＥＣ（ｈＴＥＣ）、またはヒトＨＳＣ（ｈＨＳＣ）、および、
    （ｉｉ）脱細胞化され、細胞外マトリックスを有する胸腺スキャフォールドであって、前記ｈＴＥＰＣ、ｈＴＥＣ、またはｈＨＳＣが、前記細胞外マトリックスに付着する、胸腺スキャフォールド、
    を有する、バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイド。
  26. 請求項１～２４のいずれか１つに記載の方法によって調製されたバイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイド。
  27. 請求項２５または２６記載のバイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドにおいて、前記バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドは免疫細胞を有する、バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイド。
  28. 請求項２５または２６記載のバイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドにおいて、前記胸腺スキャフォールドは、前記ｈＴＥＰＣ、ｈＴＥＣ、またはｈＨＳＣに対して異種または同種異系である、バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイド。
  29. 請求項２５または２６記載のバイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドにおいて、前記ｈＴＥＰＣまたはｈＴＥＣは、ｈＰＳＣに由来する、バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイド。
  30. 請求項２５～２９のいずれか１つに記載のバイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドを有する非ヒト動物。
  31. 請求項３０記載の非ヒト動物であって、前記非ヒト動物は、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、および非ヒト霊長類からなる群から選択される哺乳類である、非ヒト動物。
  32. 請求項３１記載の非ヒト動物であって、前記非ヒト動物はマウスである、非ヒト動物。
  33. 薬剤候補を評価するための方法であって、前記方法は、
    （ａ）薬剤候補を、請求項２５～２９のいずれか１つに記載のバイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドと接触させる工程と、および、
    （ｂ）前記バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドに存在する細胞またはそこから遊走する細胞の発達に及ぼす前記薬剤候補の影響を検出する工程と
    を有する、方法。
  34. 請求項３３記載の方法において、前記バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドは宿主動物に移植されるものであり、前記薬剤候補が前記宿主動物に投与されるものである、方法。
  35. 請求項１２、１９および３３～３４のいずれか１つに記載の方法において、前記薬剤候補は、小分子、核酸、ペプチド、ポリペプチド、抗体、および抗体フラグメントからなる群から選択される、方法。
  36. 胸腺移住細胞を調製するための方法であって、前記方法は、
    （ａ）請求項２５～２９のいずれか１つに記載のバイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドまたは請求項３０～３２のいずれか１つに記載の非ヒト動物に、前駆細胞を導入する工程と、
    （ｂ）前記バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドまたは前記非ヒト動物を、その子孫細胞を生成するために前記前駆細胞の分化を可能にする条件下で維持する工程と、
    （ｃ）前記バイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドから前記子孫細胞を排出させて、胸腺移住細胞を生成する工程と、および、
    （ｄ）前記胸腺移住細胞を単離する工程と
    を有する方法。
  37. 請求項３６記載の方法によって調製された胸腺移住細胞。
  38. 請求項３７記載の胸腺移住細胞であって、抗原受容体をコードする１つ以上の導入遺伝子を有する、胸腺移住細胞。
  39. 請求項３８記載の胸腺移住細胞において、前記抗原受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、胸腺移住細胞。
  40. 請求項３６～３９のいずれか１つに記載の胸腺移住細胞および薬学的に許容される担体を有する医薬組成物。
  41. それを必要とする対象における免疫機能を改善するための方法であって、前記方法は、
    （ａ）請求項３７～３９のいずれか１つに記載の胸腺移住細胞の有効量を前記対象に投与する工程、または
    （ｂ）請求項２５～２９のいずれか１つに記載のバイオエンジニアリングされた胸腺オルガノイドを前記対象に移植する工程
    を有する、方法。
  42. 請求項４１記載の方法において、前記対象は、がん、自己免疫疾患、および感染症からなる群から選択される状態を有する、方法。
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