JP5896457B2 - 多能性幹細胞から分化誘導された細胞の生産方法 - Google Patents
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Description
(1) 哺乳動物個体に由来する多能性幹細胞を、非ヒト哺乳動物に移植する工程と、
前記非ヒト哺乳動物に、目的細胞への分化誘導剤を投与する工程と、
移植した多能性幹細胞が前記非ヒト哺乳動物の生体内でテラトーマを形成するために十分な時間、当該動物を生育させ、前記多能性幹細胞を目的細胞へ分化誘導させる工程と、
前記非ヒト哺乳動物から、前記哺乳動物個体に由来する目的細胞を回収する工程と、
を含む、多能性幹細胞から分化誘導された目的細胞の生産方法。
(2) 前記多能性幹細胞が、前記哺乳動物個体の体細胞を用いて調製された人工多能性幹(iPS)細胞である(1)に記載の方法。
(3) 前記多能性幹細胞が、前記哺乳動物に由来する受精卵から調製された胚性幹(ES)細胞である(1)に記載の方法。
(4) 前記多能性幹細胞が、前記非ヒト哺乳動物の皮下、精巣、及び腎皮膜からなる群より選択される少なくとも一の組織に移植される(1)〜(3)のうちのいずれかに記載の方法。
(5) 前記目的細胞が肝細胞又は膵臓細胞であり、当該目的細胞を前記非ヒト哺乳動物に形成されたテラトーマから回収する(1)〜(4)のうちのいずれかに記載の方法。
(6) 前記膵臓細胞が膵臓のランゲルハンス氏島細胞である、(5)に記載の方法。
(7) 前記目的細胞が造血系細胞であり、当該造血系細胞を前記非ヒト哺乳動物の骨髄から回収する(1)〜(4)のうちのいずれかに記載の方法。
(8) 前記多能性幹細胞がLnk欠損細胞である、(7)に記載の方法。
(9) 前記多能性幹細胞を目的細胞へ分化誘導させる工程において、共培養細胞の存在下で行う、(1)〜(8)に記載の方法。
(10) 前記共培養細胞がOP−9細胞である(9)に記載の方法。
(11) 前記分化誘導剤を前記非ヒト哺乳動物の皮下に所定の期間連続的に投与する、(1)〜(10)のうちのいずれか一項に記載の方法。
(12) 前記非ヒト哺乳動物が、目的細胞の形成能を欠損している(1)〜(11)のうちのいずれかに記載の方法。
(13) 前記非ヒト哺乳動物が、免疫不全動物である(1)〜(12)のうちのいずれかに記載の方法。
(14) 前記動物個体に由来する多能性幹細胞を目的細胞へ分化誘導させる工程において、混入する目的細胞以外の細胞を除去する操作を施す、(1)〜(13)のうちのいずれに記載の方法。
(15) 前記目的細胞以外の細胞が、未分化状態のままである多能性幹細胞である、(14)に記載の方法。
(16) 前記除去する操作が、所望の時期に自殺遺伝子を働かせることにより達成される、(14)又は(15)に記載の方法。
(17) (1)〜(16)のうちのいずれかに記載の方法により得られる、目的細胞。
(a)哺乳動物個体に由来する多能性幹細胞を、非ヒト哺乳動物に移植する工程と、
(b)前記非ヒト哺乳動物に、目的細胞への分化誘導剤を投与する工程と、
(c)移植した多能性幹細胞が前記非ヒト哺乳動物の生体内でテラトーマを形成するために十分な時間、当該動物を生育させ、前記多能性幹細胞を目的細胞へ分化誘導させる工程と、
(d)前記非ヒト哺乳動物から、前記哺乳動物個体に由来する目的細胞を回収する工程と、
を含む、多能性幹細胞から分化誘導された目的細胞の生産方法である。
マウスiPS細胞としては、Kusabira Orangeトランスジェニックマウス(129/Svマウス由来)の尾端線維芽細胞(TTF、tail tip fibroblast)にOct3/4、Sox2、Klf4の3遺伝子をレトロウイルスベクターにより導入して樹立したもの、およびLnkノックアウトマウス(C57BL/6マウス由来)のTTFに上記3遺伝子をレンチウイルスベクターにより導入して樹立したものを使用した。なお、両細胞株ともに、野生型マウスの胚盤胞宿主としてキメラマウスを作製できることを実験前に確認した。
マウスiPS細胞は、マイトマイシンCで処理したマウス胎仔線維芽細胞(MEF)との共培養によってE14.1KSR培地にて培養した。E14.1KSR培地の組成は以下の通りである。
ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Invitrogen社製)、添加物として15% ノックアウト血清代替物(KSR、Invitrogen社製)、2mM L−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン(Invitrogen社製)、1×非必須アミノ酸(Invitrogen社製)、1mM HEPES(Invitrogen社製),0.1mM 2−メルカプトエタノール(Gibco社製)、1000IU/ml 白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor、LIF)。
KSN/Slc−nu/nuマウス及びC57BL/6マウスは、日本SLC株式会社より購入した。
5×106個のiPS細胞を前記ヌードマウスの皮下に投与した。なお血球細胞・造血幹細胞への分化実験においては、同時に1×106個のOP9細胞も投与した。
マウスiPS細胞は、トリプシン処理により細胞をディッシュから剥がし、5×106cells/50μL程度 PBSに懸濁したものを、KSN/Slc−nu/nuマウスの皮下に注入した。iPS細胞の注入と同日を「day1」とし、同日にサイトカイン投与を始めた。サイトカインは総量 100μLをalzet micro−osmotic pump model 1002(DURECT Corporation社製)に入れ、ポンプをマウスの皮下に埋め込んだ。肝細胞(Hepatocyte cell)と膵臓細胞(Islet cell、膵臓のランゲルハンス氏島細胞)に関しては、day14とday28に空のポンプをマウス皮下より除去し、新しいサイトカインの入ったポンプを埋め込んだ。サイトカインの種類、投与量、投与のタイミングの例を図1に示す。なお図1中、「KSN/Slc−nu/nu」はKSNバックグラウンドのヌードマウスを示し、またマウスに注入したサイトカイン等の名称は下記の通りである。
RA:Retinoic Acid(レチノイン酸)
FGF1:Fibroblast Growth Factor 1(繊維芽細胞増殖因子1)
FGF4:Fibroblast Growth Factor 4(繊維芽細胞増殖因子4)
HGF:Hepatcyte Growth Factor(肝細胞増殖因子)OsM:Oncostatin M(オンコスタチンM、白血病抑制因子に属するサイトカイン、多面的な作用を持つ)
Activin A(アクチビンA)
EGF:Epidermal Growth Factor(上皮細胞増殖因子)
bFGF:basic FGF(塩基性繊維芽細胞増殖因子)
Nicotinamide(ニコチン酸アミド)
IGF−2:Inslin Like Growth Factor−2(インスリン様増殖因子−2)
OP9:マウス骨髄ストロマ細胞株
SCF:Stem Cell Factor(幹細胞因子)
TPO:Thrombopoietin(トロンボポエチン、血小板の前駆細胞の増殖および分化に関与する造血因子)。
作製したテラトーマ及び、野生型マウスの肝臓、膵臓を、切除後液体窒素で凍結し、O.C.T.コンパウンド(Tissue−TeK社製)で包埋して凍結切片を作製した。切片は、4%パラホルムアルデヒド(PFA)にて固定後、アセトン処理し、MAXBlock Blocking Medium(登録商標、Active motif社製)にて室温1時間ブロッキング後、PBSで2回洗浄し一次抗体をかけて4℃で1晩反応させた。一次抗体は、goat anti−mouse ALB Ab、Rabbit anti−mouse CK19 Ab(Invitrogen社製)、Rat anti−mouse CYP7A1 Ab(Santa Cruz社製)、mouse anti−mouse Insulin Ab(Cell signaling社製)を用いた。次いで、PBSで3回洗浄後、二次抗体にて室温1時間反応させた。二次抗体には、donkey anti−goat IgG Alexa 647、goat anti−rabbit IgG Alexa 488、goat anti−rat IgG Alexa 488、goat anti−mouse IgG Alexa 488(Invitrogen社製)を使用した。
インドシアニングリーン(Indocyanine green、Sigma社製)は、5mg/ml DMSO(Sigma社製)に溶解し、1mg/mlになるようPBSで調製した。この溶液をマウスに500μL静注し、30分後にテラトーマ及び肝臓を切除して呈色を観察した。または、マウスから切除したテラトーマ及び肝臓をインドシアニングリーン溶液に浸し、37℃で30分インキュベート後に呈色を観察した。
血球分化能の判定には末梢血及び骨髄細胞をフローサイトメトリー(FACS Aria)にて解析した。使用した抗体は、anti−mouse CD45− APC、anti−mouse CD4,CD8,Gr−1,Mac−1,B220,IL−7R−Biotin、anti−Streptavidin−APC/Cy7、anti−mouse Sca−1−Pacific Blue、anti−mouse c−Kit−APC、anti−mouse CD3−PE/Cy5、anti−mouse B220−Pacific Blue、anti−mouse Gr−1−APC、anti−mouse Mac−1−APC(BioLegend社製)を用いた。末梢血は、マウスの眼下静脈より採取し、溶血反応後、抗体と反応させ解析した。骨髄細胞は、マウスの大腿骨及び脛骨から採取し、抗体と反応させ解析した。
<肝臓への分化>
前述の通り、肝細胞へ分化させたテラトーマより凍結切片を作製し、肝細胞マーカーである、アルブミン、CK19、CYP7A1の免疫染色を行った。得られた結果を図2及び図3に示す。図2及び図3に示した結果から明らかなように、サイトカインによる分化誘導を受けたテラトーマのみ、肝細胞と同様のマーカーの発現が確認された。
<膵臓への分化>
前述の通り、膵臓細胞へ分化させたテラトーマより凍結切片を作製し、膵臓ランゲルハンス島細胞マーカーである、インスリンの免疫染色を行った。得られた結果を図5に示す。図5に示した結果から明らかなように、サイトカインによる分化誘導を受けたテラトーマのみ、膵臓細胞と同様のインスリンの発現が確認された。
<血球細胞・造血幹細胞への分化>
前述の通り、テラトーマを作製したマウスの末梢血をフローサイトメーターにより解析した結果、ヌードマウス血中に、Lnk−/−iPS細胞由来の血球が確認された(図6 参照)。また、SCF+TPOよりもSCF+TPO+OP9の条件において、iPS細胞由来の血球の割合が高かった。さらに、テラトーマを作製したヌードマウスの骨髄細胞を解析した結果、骨髄中にiPS細胞由来の造血前駆細胞 Lineage−c−Kit+Sca−1+(KSL)が確認された(図7 参照)。また、この骨髄細胞を野生型C57/BL6マウスに移植し、4週後の末梢血を解析したところ、ほぼ100%の血液がiPS細胞由来であり、各種細胞に分化していることを確認した(図8 参照)。つまり、iPS細胞はヌードマウス体内で造血幹細胞に分化し、骨髄へホーミングしたことが示唆された。さらに造血幹細胞および前駆細胞機能を負に制御する蛋白質Lnkを欠損したES細胞、iPS細胞を用いることで、正常なES細胞iPS細胞に比し造血幹細胞・前駆細胞のより多量の増幅が認められた。
<混入する未分化細胞の除去ならびに目的の細胞以外を除去する方法>
前述のような、多能性幹細胞の効率的な分化誘導をin vivoの環境下で行う場合、多能性ゆえの腫瘍形成という問題が生じ得る。また、in vitroにおいて分化誘導した細胞を移植する際にも、混入した未分化細胞が腫瘍を形成する危険性が存在する。従って、目的となる分化細胞だけを生存させるようなスクリーニングの系を本発明においては併用することが好ましい。
C57BL/6(B6)マウス、KSN/Slcヌードマウス、及び緑色蛍光タンパク質(GFP)トランスジェニックマウスは、日本SLC株式会社より購入した。Lnk−/−GFPトランスジェニックマウスは、東京大学 医科学研究所 実験動物研究施設にて、繁殖、維持した。また、B6を遺伝的背景とするX−SCIDマウスの作製及び評価は「Ohbo,Kら、Blood、1996年、87巻、956−967ページ」の記載に沿って行った。さらに、NOD/SCIDマウスは日本クレア株式会社より購入した。また、NOD/SCID/JAK3欠損マウスは三協ラボサービス株式会社より購入した。なお、これらマウスのケアは、東京大学の組み換えDNA実験及び実験動物に関するガイダンスに従って行った。
マウスiPS細胞としては、Lnk−/−GFPトランスジェニックC57BL/6(B6)マウス、又はGFPトランスジェニックB6マウス由来の尾端線維芽細胞(TTF、tail tip fibroblast)にOct3/4、Sox2、及びKlf4の3遺伝子をレンチウィルスall−in−oneベクターにより導入することにより、再プログラミングして樹立したものを使用した。なお、得られたiPS細胞の特性については、後述の図11〜16に示す通りに確認した。
ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、GIBCO社製)、添加物として、15% ノックアウト血清代替物(Knockout SR、GIBCO社製)、20mM HEPES緩衝溶液(Invitrogen社製)、0.1mM MEM非必須アミノ酸溶液(Invitrogen社製)、0.1mM L−グルタミン(Invitrogen社製)、100U/mlペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシン(Sigma−Aldrich社製)、0.1mM 2−メルカプトエタノール(GIBCO社製)、及び1000U/ml ESGRO(GIBCO社製)。そして、培地は毎日交換し、細胞は異常増殖と分化とを避けるため、2〜3日毎に継代した。
ダルベッコ変法イーグル培地−F12(Sigma−Aldrich社製)、添加物として、20% Knockout SR(GIBCO社製)、0.1mM MEM非必須アミノ酸溶液(Invitrogen社製)、0.2mM L−グルタミン(Invitrogen社製)、0.1mM 2−メルカプトエタノール(GIBCO社製)、及び5ng/ml bFGF(Peprotech社製)。そして、培地は毎日交換し、細胞は7日毎に継代した。
組織切片は、テラトーマ組織をパラフィン包埋し、へマトキシリン・エオシン(H&E)染色することによって評価した。
iPS細胞は0.25% トリプシン−EDTA溶液(GIBCO社製)によりトリプシン処理した。トリプシン処理したiPS細胞及びMEFを非コ―ティングディッシュに播き直し、MEFを除去するために30分間インキュベーションした。キメラマウスを作製するために、iPS細胞10個をICRマウス由来の胚盤胞に注入し、そして、iPS細胞が注入された胚盤胞を偽妊娠マウスの子宮に移植した。
マウスiPS細胞からHSCへの分化誘導は下記の通りである。すなわち、5×106個のマウスiPS細胞をKSN/Slc マウス(4〜5週齢)の皮下に注入した。そして、HSCへの分化誘導は下記条件にて行った。
1)対照として、iPS細胞のみを注入した。
2)200ng幹細胞因子(SCF、Peprotech社製)及び200ngトロンボポエチン(TPO、Peprotech社製)を含有する造血サイトカインをマイクロ浸透圧ポンプ(ALZET社製)に入れ、そのポンプを皮下に2週間埋め込んだ。
3)1×106個のOP9間質細胞とともにiPS細胞を移植した。
4)前記造血サイトカインと前記OP9間質細胞とを投与した。
マウスiPS細胞由来の血球細胞に関して、造血幹細胞(HSC)は下記の通り、フローサイトメトリーを用いて分析した。
iPS細胞由来の精製したCD34−KSL細胞を、単一クローンにすべく、各ウェルに200μLの培地を含む96ウェルプレートに播いた。なお、用いた培地の組成は、以下の通りである。
S−clone SF−O3培地(三光純薬株式会社製)、添加物として、1%ウシ血清アルブミン(BSA)、マウスSCF(50ng/mL)、マウスTPO(50ng/mL)、マウスIL−3(10ng/mL)、及びマウスEPO(1U/mL)(全てPeproTech社製)。
細胞は、37℃、加湿雰囲気、5%CO2環境下で培養した。そして、培養開始10日後、細胞をスライドグラス上にサイトスピンを用いて付着させ、ヘマカラー(登録商標、MERCK社製)を用いた血液塗抹染色に供した。
Lnk−/− GFP iPS細胞由来HSCに関して、テラトーマが形成されたマウスの1×107個のBM細胞を、致死的に放射線処理(9.5Gy)した野生型B6レシピエントマウスに移植した。そして、移植後4週間及び12週間後に、レシピエントマウスのPB細胞をフローサイトメトリーにて分析した。
<Lnk−/− GFP iPS細胞を用いたHSC誘導方法>
前述の通り、先ずLnk−/− GFP トランスジェニックマウスからiPS細胞を樹立した。すなわち、図11に示す通り、3因子(Oct3/4、Klf4、及びSox2)をレンチウィルスall−in−oneベクターを用いて導入することにより、Lnk−/− GFP トランスジェニックマウスのTTFを再プログラムした。また、得られたiPS細胞(Lnk−/− GFP iPS細胞)は、免疫蛍光分析によって、GFP、Nanog、及びSSEA−1が発現していることが確認された(図12 参照)。さらに、Lnk−/− GFP iPS細胞は、ヌードマウスにおけるテラトーマ形成能を有し、胚盤胞に注入することによてキメラマウスに寄与できることから、多分化能を有していることが確認された(図13〜16 参照)。
条件1:対照として、iPS細胞をヌードマウスに注入した。
条件2:造血サイトカイン(SCF及びTPO)をマイクロ浸透圧ポンプに入れ、2週間連続して投与した。
条件3:OP9間質細胞株をiPS細胞とともに移植した。
条件4:前記造血サイトカイン及び前記OP9間質細胞株を投与した。
図18に示した結果から明らかなように、テラトーマ形成マウスの殆どの末梢血において、Lnk−/− GFP iPS細胞由来のCD45+細胞は検出された。また、テラトーマの成長(サイズ)に沿って、Lnk−/− GFP iPS細胞由来の CD45+細胞の割合は徐々に増加していくことが明らかになった(図19 参照)。そして、図18〜20に示した結果から明らかなように、前記割合は、サイトカイン及びOP9細胞を投与した際に最も高くなった(iPS細胞導入12週間後の平均値は、条件1:0.002±0.01%、条件2:1.02±1.15%、条件3:0.87±0.79%、条件4:4.26±3.79%)。
すなわち、これらの結果から、骨髄原始細胞(BM primitive cell)集団を含む、免疫表現型に定義された造血細胞の誘導は、実施例3に記載した結果同様、テラトーマ形成を介してLnk−/−GFP iPS細胞から行うことはでき、さらに造血サイトカイン及び共培養細胞(例えば、OP9細胞)は、この誘導を促進するということも明らかになった。
<Lnk変異を有さないGFP iPS細胞からの機能的なHSCの作製>
次に、Lnk欠損を伴わないiPS細胞においても機能的なHSCが誘導できるかどうかを評価するため、図11に示す通り、GFPトランスジェニックマウスからiPS細胞(GFP iPS細胞)を樹立した。そして、Lnk−/− GFP iPS細胞を用いた時と同様の条件にてテラトーマ形成を介したHSC誘導を調べた。得られた結果を図28〜35に示す。
<X−SCIDマウスにおけるiPS細胞を介した遺伝子治療>
X連鎖重症複合免疫不全症(X−SCID)は、T細胞及びB細胞の免疫における重度の障害を特徴とする重症複合免疫不全症(SCID)の一つである。羅患者は、免疫系において重要な機能を担う多数のサイトカインの受容体が共有している、共通ガンマ鎖(common gamma chain(γc))をコードする遺伝子に変異を有していることが知られている(Buckley,R.H.ら、Journal of Pediatrics、1997年、130巻、378〜387ページ 参照)。
<テラトーマ形成を介した、ヒトiPS細胞からの生着可能なHSCへの誘導>
次に、テラトーマ形成を介して、ヒトiPS細胞からも機能的なHSCが誘導できるかどうかを調べるため、図41に示す通り、ヒトiPS細胞をNOD/SCIDマウスの皮下に注入してテラトーマを作製し、マウスHSC誘導と同様の方法にてHSCを誘導した。そして、ヒトiPS細胞を注入してから12週間後に、テラトーマ形成マウスの末梢血及び骨髄を分析した。得られた結果を図42、及び表2に示す。
<胚葉系前駆細胞を用いた、マウス個体内での器官形成>
前述のようなES細胞やiPS細胞をマウス個体に直接移植して器官形成を行う方法において、
1.多能性幹細胞は様々な細胞系譜の分化能を保持するため、目的細胞以外の細胞が形成される可能性がある。
2.移殖した多能性幹細胞のテラトーマ形成能が高過ぎる場合に、目的細胞が形成されるより先にテラトーマの増大により宿主の健康状態が害される可能性がある。
といった点が問題に成り得る。
MEF非依存性ES細胞株であるE14tg2aを0.1%ゼラチンコートの培養皿で以下の組成の培地で培養した。
グラスゴー改変イーグル培地(Glasgow Modified Eagle Medium、GMEM)、添加物として、10%FCS、1%L−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン 溶液(SIGMA社製)、0.1mM 非必須アミノ酸(GIBCO社製)、1mM ピルビン酸ナトリウム、0.1mM 2−メルカプトエタノール、白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor、LIF)(1000U/ml)。
Collagen−Type4をコートした培養皿に1×104細胞数/mlの密度でE14tg2aを播種した。SFO3無血清培地(三光純薬株式会社製)に20ng/ml ヒト アクチビンA(Peprotech社製)、10ng/ml ヒト BMP4(Peprotech社製)を添加して2日間培養した。2日後からは培地を、SFO3培地に20ng/ml ヒト アクチビンA(Peprotech社製)、20ng/ml マウス EGF(Peprotech社製)、10ng/ml FGF4(SIGMA社製)を添加したものへと変え、更に5日間培養を続けた。
未分化なES細胞、及びES細胞から分化誘導して得られた内胚葉系前駆細胞を、8週齢のKSNヌードマウスの腎皮膜へ各々2×106細胞数移植した。移植の際には、各細胞を100μlの氷冷したDMEM無血清培地とマトリゲル(BD Biosciences社製)とを等量に混合した液体に懸濁し、マウス腎皮膜下へと移植した。
KSNヌードマウスの腎皮膜下に形成されたテラトーマは適当な大きさに切り分け4%PFA中で一晩振とうした後、10%スクロース溶液で一日、30%スクロース溶液中で2日間振とうした。クリオモルド2号(Sakura Finetek Japan社製)を用いて、O.C.T.コンパウンド(Sakura Finetek Japan社製)中にブロック状に包埋して、ドライアイス上で凍結した。そして、ブロックを、Cryostat CM 3050SIV (Leica社製)を用いて、厚さ7μmに切断し、MASコートを施してあるスライドグラスに張り付けて組織標本を作成した。組織標本はPBSにより洗浄を2回行い、−20℃に氷冷したメタノール(MtOH)に10分間浸した。PBSによりMtOHの洗浄を2回行った後に、5% ロバ血清(SIGMA社製)/PBSでブロッキングを室温で30分間行った。ブロッキングバッファーに希釈した一次抗体(抗−FoxA2およびCK19 抗体)を加えて一晩4℃で反応させた。一次抗体を反応させた後にPBSで3度洗浄を行い、二次抗体としてロバ由来 抗−ヤギ Alexa 546抗体(invitrogen社製)、及びロバ由来 抗−ウサギ Alexa 488抗体(invitrogen社製)をブロッキングバッファーに各々500倍希釈して室温で45分間反応させた。最後に2回PBSで洗浄を行い、4’,6−diamidino−2−phenylindole(DAPI、Roche社製)を10分間反応させた。DAPIを反応させた後に、PBSによる洗浄を一度行った。その後、PBSを除き、Dako Fluorescent Mounting Medium(Dako社製)で包埋し、観察した。
Claims (12)
- 哺乳動物個体に由来する、テラトーマ形成能を有する多能性幹細胞を、非ヒト哺乳動物(前記多能性幹細胞がサル由来である場合には、ヒツジを除く)に移植する工程と、
前記非ヒト哺乳動物に、目的細胞への分化誘導剤を連続的に投与する工程と、
移植した多能性幹細胞が前記非ヒト哺乳動物の生体内でテラトーマを形成するために十分な時間、当該動物を生育させ、前記多能性幹細胞を目的細胞へ分化誘導させる工程と、
前記非ヒト哺乳動物から、前記哺乳動物個体に由来する目的細胞を回収する工程と、
を含む、多能性幹細胞から分化誘導された目的細胞の生産方法。 - 前記多能性幹細胞が、前記哺乳動物個体の体細胞を用いて調製された人工多能性幹(iPS)細胞である請求項1に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、前記非ヒト哺乳動物の皮下、精巣、及び腎皮膜からなる群より選択される少なくとも一の組織に移植される請求項1または2に記載の方法。
- 前記目的細胞が肝細胞又は膵臓細胞であり、当該目的細胞を前記非ヒト哺乳動物に形成されたテラトーマから回収する請求項1〜3のうちのいずれか一項に記載の方法。
- 前記膵臓細胞が膵臓のランゲルハンス氏島細胞である、請求項4に記載の方法。
- 前記目的細胞が造血系細胞であり、当該造血系細胞を前記非ヒト哺乳動物の骨髄から回収する請求項1〜3のうちのいずれか一項に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞がLnk欠損細胞である、請求項6に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞を目的細胞へ分化誘導させる工程において、共培養細胞の存在下で行う、請求項1〜7のうちのいずれか一項に記載の方法。
- 前記共培養細胞がOP−9細胞である請求項8に記載の方法。
- 前記分化誘導剤を前記非ヒト哺乳動物の皮下に所定の期間連続的に投与する、請求項1〜9のうちのいずれか一項に記載の方法。
- 前記非ヒト哺乳動物が、目的細胞の形成能を欠損している請求項1〜10のうちのいずれか一項に記載の方法。
- 前記非ヒト哺乳動物が、免疫不全動物である請求項1〜11のうちのいずれか一項に記載の方法。
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