CN115287262B - 一种胸腺类器官微球及其制备方法与应用 - Google Patents

一种胸腺类器官微球及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胸腺类器官微球及其制备方法与应用，向加有透明质酸钠凝胶的Transwell小室内接种胸腺混合细胞，放入DMEM/F12‑B27培养基孔板，37℃、5％CO2培养；所述胸腺混合细胞是由Tβ15b1基因编辑的永生化胸腺上皮细胞与胸腺细胞混合而成；在Transwell小室中加入透明质酸酶水溶液，37℃静置培养，收集沉淀并用含免疫球蛋白和海藻酸钠的PBS重悬，滴入氯化钙水溶液中，得所述胸腺类器官微球。本发明制备的胸腺类器官微球能在体外模拟胸腺微环境，具有诱导、维持T细胞定型和分化的能力，并在体内模拟正常小鼠胸腺生成，改善免疫缺陷，有效激发毛囊，使毛囊再生的生物工程策略成为可能。

Description

一种胸腺类器官微球及其制备方法与应用
(一)技术领域
本发明涉及一种胸腺类器官微球及其制备方法与应用。
(二)背景技术
现阶段人工胸腺类器官的构建方式未能形成稳定的体系，研究者使用的方法各异，主要分为支架型和非支架型。支架型胸腺类器官主要以脱细胞胸腺骨架、生物相容性骨架材料等为支架，而非支架型胸腺类器官的构建主要依靠特定的培养基或特殊培养方式使胸腺相关细胞以三维形式发育增殖，这些形成的胸腺类器官功能及结构稳定性差异较大，重现性较低。而其中涉及的基因修饰等方式所需的技术水平较高，且成本费用高昂，难以做到短期内大批量制备，其规模和费用都限制了T细胞及类胸腺组织的产量。
但由于水凝胶内细胞密度的增加以及自身厚度等原因，影响了细胞养分及氧气的供给，三维培养21天后导致凝胶内的细胞开始大量死亡。而且，目前关于胸腺类器官的保存并无明确的方法。常规采用体外冻存等方法保存类器官，但是细胞冻存和复苏分别涉及到细胞内外液体结晶和细胞内外晶体化为液体的过程，会不可避免地造成细胞损伤，鉴于类器官的多细胞构成，这种损伤更甚，因此会使得冻存复苏后的活性无法估计。本发明采用透明质酸酶37℃消化胸腺类器官，依然保持胸腺类器官的特征性三维结构。通过添加免疫球蛋白可增加对胸腺类器官细胞的保护作用，同时，采用微流控技术分装胸腺类器官三维细胞团，可以保证类器官在4℃下维持最长时间的活性，其类器官的生长活性和形态不受影响。
诱发脱发的因素多种多样，目前尚无一种公认的细胞源可以作为毛囊再生的种子细胞，组织工程也还未实现毛囊再生。药物、物理治疗依然是脱发治疗的重要手段，但其单一疗法的效果不理想。本发明在体外通过3D胸腺类器官微球制备，使毛囊再生的生物工程策略成为可能。在这些系统中，基于胸腺细胞和胸腺上皮细胞的器官胚芽被创造出来，移植到裸鼠体内后对于促进裸鼠毛囊修复以及促进毛发再生中的至少一者具有显著的效果，有助于改善毛发生长状态。
本发明属于支架型胸腺类器官，操作简单、结构稳定、制作成本低。其中使用的永生化小鼠胸腺上皮细胞株(iTECs)，保持了TECs细胞独特的分子性质，而生物相容性骨架材料为交联透明质酸钠。该材料在透光性和易操作性上占有很大优势，具有良好生物相容性，适合大规模的胸腺类器官的三维立体培养。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种胸腺类器官微球及其制备方法与在制备毛发生长促进剂中的应用，所述胸腺类器官微球能在体外模拟胸腺微环境，具有诱导、维持T细胞定型和分化的能力，并在体内模拟正常小鼠胸腺生成，改善免疫缺陷。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种胸腺类器官微球，所述胸腺类器官微球按如下方法制备：(1) 将透明质酸钠水凝胶加入Transwell小室中，加热至室温或放入37℃培养箱复温半小时使其软化覆盖小室底膜，再将Transwell小室放入加有DMEM/F12-B27培养基的培养孔板中；(2)向步骤(1)Transwell小室内接种胸腺混合细胞，37℃、5％CO2培养5-10天；所述胸腺混合细胞是由敲低/过表达Tβ15b1基因的永生化胸腺上皮细胞与新鲜离体的敲低/过表达Tβ15b1基因的原代胸腺细胞混合而成；(3)在步骤(2)的 Transwell小室中加入透明质酸酶水溶液，37℃静置培养酶解凝胶释放胸腺混合细胞 (优选培养16h)，离心，收集沉淀并用含1μg/mL免疫球蛋白的PBS重悬，加入海藻酸钠，混匀，获得混合液；(4)将步骤(3)混合液滴入氯化钙水溶液中，获得所述的胸腺类器官微球。
优选的，步骤(1)Transwell小室底部为带孔的透明聚酯(PE)膜，所述透明聚酯膜的孔径为5-10μm，优选8μm。
优选的，步骤(1)所述胸腺混合细胞是由永生化胸腺上皮细胞与新鲜离体的原代胸腺细胞以细胞数量比10-50:1混合而成，优选20:1。所述永生化胸腺上皮细胞 (iTECs)参照文献(Shen JM,Ma L,He K,et al.Identification and functional study ofimmortalized mouse thymic epithelial cells.Biochem Biophys Res Commun.2020；525(2):440-446.)制备获得。所述永生化胸腺上皮细胞与新鲜离体的原代胸腺细胞敲低/过表达Tβ15b1基因的方法采用本领域通用病毒转染方法既可，优选采用 Tβ15b1 OX病毒液或者Tβ15b1 shRNA病毒液通过瞬时转染构建。
优选的，步骤(1)所述敲低Tβ15b1基因的方法为：将永生化胸腺上皮细胞用含体积浓度10％FBS的DMEM完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，37℃培养48h至对数生长期，弃原培养液，PBS润洗一次，加入胰酶-EDTA消化液(0.25％胰酶+0.02％ EDTA，含酚红)消化1min后，加入DMEM完全培养基终止消化，800rpm离心5min，收集细胞，用10％FBS的DMEM完全培养基重悬，接种于24孔板(优选2.0×104个/孔)，37℃、5％CO2培养箱培养24h，弃去培养液；加入Tβ15b1 shRNA慢病毒 (购自山东维真生物科技有限公司，基因序列号：NM_001081983.1，滴度为3.4×108PFU/mL)、含10％FBS的DMEM完全培养基和溴化己二甲铵(polybrene)以促进感染，轻吹混匀，在37℃、5％CO2培养箱中病毒感染24h后，用新鲜的含体积浓度 10％FBS的DMEM完全培养基替换含有病毒的培养基，继续培养72h后，换用含5 μg/mL嘌呤霉素和10％FBS的DMEM完全培养基，每1-2d换新鲜的含有5μg/mL 嘌呤霉素和10％FBS的DMEM培养基，以替换含大量死细胞的培养基，直至感染病毒的组再无细胞出现死亡，剩下的细胞即为敲低Tβ15b1基因的稳定细胞株iTECs；所述Tβ15b1 shRNA慢病毒、含10％FBS的DMEM完全培养基和polybrene体积比为15:485:2。所述胸腺细胞敲低Tβ15b1基因的方法同永生化胸腺上皮细胞，不同之处在于将含体积浓度10％FBS的DMEM完全培养基改成含体积浓度10％FBS的 DMEM/F12-B27培养基。
优选的，步骤(1)所述过表达Tβ15b1基因的方法为：将永生化胸腺上皮细胞(iTECs)用含体积浓度10％FBS的DMEM完全培养基重悬，接种至24孔板，37℃培养1天至对数生长期，弃去原培养液；按重复感染度(MOI)(MOI＝100)，向24 孔板中加入Tβ15b1 OX病毒液(购自山东维真生物科技有限公司，基因序列号： NM_001081983.1，滴度为2×1010vp/mL)、含体积浓度10％FBS的DMEM完全培养基，同时加入溴化己二甲铵(polybrene，购自Sigma-Aldrich)以促进感染，将24孔板放入37℃、湿度饱和及5％CO2的恒温培养箱中培养病毒感染24h后，弃去培养液，用新鲜的含体积浓度10％FBS的DMEM完全培养基替换含有病毒的培养基，获得Tβ15b1基因过表达的细胞；所述Tβ15b1 OX病毒液、含体积浓度10％FBS的DMEM完全培养基与溴化己二甲铵体积比为0.25:499.75:2。所述胸腺细胞过表达 Tβ15b1基因的方法同永生化胸腺上皮细胞，不同之处在于将含体积浓度10％FBS的 DMEM完全培养基改成含体积浓度10％FBS的DMEM/F12-B27培养基。
优选的，步骤(2)所述培养是在37℃、5％CO2培养7天使得混合细胞直径均超过50μm，且每隔2-3天更换新鲜的D/F12-B27培养基。
优选的，步骤(2)DMEM/F12-B27培养基组成为：在DMEM/F12培养液中加入体积浓度2％的2mM的B27，体积浓度0.1％的30mM的L-抗坏血酸2-磷酸倍半镁盐水合物、体积浓度1％的青霉素/链霉素，体积浓度1％的添加剂Glutamax，体积浓度0.01％的5ng/mL的rmFLT3L(FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)重组蛋白)，体积浓度0.01％的5ng/mL的rmIL-7(白细胞介素7)，体积浓度0.02％的10ng/mL rmSCF (干细胞因子)(仅在培养的第一周添加SCF)和体积浓度0.1％的0.05mM的β巯基乙醇(0.05mM)，体积浓度10％的胎牛血清。
优选的，步骤(3)透明质酸酶水溶液浓度为200-500μg/mL，优选300μg/mL；所述透明质酸酶的酶活为400-800U/mg，优选608U/mg；每个Transwell小室内所述透明质酸酶水溶液体积用量为200-1000μL，优选500μL。所述海藻酸钠加入量以PBS 体积计为0.005-0.025g/mL，优选0.01g/mL。
优选的，步骤(4)氯化钙水溶液浓度为50-200mM，优选100mM；所述氯化钙水溶液与混合液体积比为5:1-10：1，优选8：1。
优选的，步骤(4)采用Elveflow微流控灌注套装，通过压力泵将储液器中100mM 氯化钙水溶液加入芯片中，接着用微量移液管将步骤(3)细胞混合液以流速300μL/min 通入芯片，获得胸腺类器官微球。
步骤(4)还可用无菌注射器将细胞混合液逐滴滴入100mM氯化钙水溶液中，获得胸腺类器官微球。
本发明还提供一种所述胸腺类器官微球在制备毛发生长促进剂中的应用，所述促进剂为胸腺类器官微球的PBS悬液；每100μL促进剂含200w敲低/过表达Tβ15b1基因的原代胸腺细胞以及10w敲低/过表达Tβ15b1基因的永生化胸腺上皮细胞；所述的应用是将胸腺类器官微球皮下注射的方式使用，注射剂量为左右两侧前肢腋下接种 100μL胸腺类器官微球的PBS悬液；每100μL胸腺类器官微球悬液含200w敲低/过表达Tβ15b1基因的原代胸腺细胞以及10w敲低/过表达Tβ15b1基因的永生化胸腺上皮细胞。
本发明基于交联透明质酸的3D凝胶系统，将经过Tβ15b1基因编辑的永生化胸腺上皮细胞、原代胸腺细胞包裹在凝胶中并保留其表型；采用透明质酸酶消化胸腺类器官，维持其特征性三维结构。同时，通过添加免疫球蛋白并采用微流控技术分装备成胸腺类器官微球。本发明制备的胸腺类器官微球能在体外模拟胸腺微环境，具有诱导、维持T细胞定型和分化的能力，并在体内模拟正常小鼠胸腺生成，改善免疫缺陷，有效激发毛囊，使毛囊再生的生物工程策略成为可能。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
(1)本发明属于支架型胸腺类器官，其中使用的iTECs为永生化小鼠胸腺上皮细胞株，胸腺上皮细胞是胸腺基质细胞的主要群体，它们对于调节T细胞淋巴细胞生成中的关键事件至关重要(参照文献：Wang HX,Pan W,Zheng L,et al.Thymic Epithelial CellsContribute to Thymopoiesis and T Cell Development.Front Immunol.2020；10:3099.)。本发明使用的iTECs保持了TECs细胞独特的分子性质，不仅有利于和新鲜离体的原代胸腺细胞进行重建，而且可以有效地支持T淋巴细胞生成并恢复胸腺功能。发育中的胸腺细胞具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能，与iTEC之间的串扰确保了适当的T细胞分化和发育，而来自T细胞的信号又能调节iTECs的分化和成熟，从而影响胸腺生成。通过敲低/过表达Tβ15b1基因，使得胸腺类器官具有促进毛发生长的活性，两种细胞结合构建的类器官有助于模拟胸腺微环境恢复免疫功能。
(2)为了重建TEC功能和存活的3D微环境，将iTECs/原代胸腺细胞混合物与生物相容性骨架材料交联透明质酸凝胶混合，以形成胸腺类器官。通常在共培养胸腺上皮细胞等基质细胞与胸腺细胞之前使用γ辐射或抗癌剂抑制基质细胞生长，这些处理可以增强胸腺细胞的扩增，但它们的缺点是需要专门的γ辐照设备，并且存在任何残留剂会抑制胸腺细胞生长的风险。(参照文献：Miyoshi H,Sato C,Shimizu Y,et al. Expansion of mousehematopoietic stem/progenitor cells in three-dimensional cocultures ongrowth-suppressed stromal cell layer.Int J Artif Organs.2019Jul；42(7):374-379.)。另外在二维共培养iTECs/原代胸腺细胞时，添加和组合刺激因子，例如干细胞因子(SCF)、白介素-7(IL-7)和FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3)仅能维持短期的有效扩增。而交联透明质酸钠水凝胶作为一种分布在多种组织细胞外基质中的蛋白多糖在透光性和易操作性上占有很大优势，该水凝胶呈半凝固的胶体状态，具有良好生物相容性，可以使细胞能够自由地移动，便于细胞球生成或细胞球之间的融合，可实现细胞的三维立体培养。基于交联透明质酸的3D凝胶系统，将永生化胸腺上皮细胞包裹在凝胶中并保留其表型，用于诱导胸腺细胞，分化为成熟T细胞，为整个分化和成熟提供了正确的辅助信号和环境，克服了原代胸腺细胞离体后活性大幅降低的弊端。
(3)本发明方法制备的胸腺类器官是直径超过50μm的三维结构细胞团，包裹于透明质酸凝胶中，然后采用透明质酸酶37℃消化，不仅能够保持胸腺类器官的特征性三维结构，且能够避免将细胞消化为单细胞，得到单个胸腺类器官，减少了对细胞的损伤。
(4)通过添加免疫球蛋白可对这种三维结构的细胞团提供更好的保护作用，同时加入1％海藻酸钠作为微球制备的介质，用无菌注射器或者Elveflow微流控灌注套装将含三维细胞团以及海藻酸钠的细胞悬液逐滴滴入100mM氯化钙水溶液中，获得所述的胸腺类器官微球。采用微流控技术制备胸腺类器官三维细胞团，可以保证类器官在4℃下维持最长时间的活性，其类器官的生长活性和形态不受影响，且操作简单，为后续大规模长时间保存胸腺类器官提供了便利条件，解决了由于水凝胶内细胞密度的增加以及自身厚度等原因导致细胞养分及氧气的供给不足引起的细胞死亡。
(5)另外，将胸腺类器官嵌入裸鼠的腋窝血管附近够提高移植的胸腺类器官的功效，有效激发毛囊，促进裸鼠的毛发再生，处理14天后，毛发覆盖面积达到40％，新生毛发长度达到1.47mm。该胸腺类器官使毛囊再生的生物工程策略成为可能，并为脱发治疗提供更多有效的辅助免疫治疗方案。
(四)附图说明
图1为胸腺类器官微球制作示意图，所述流动相即为氯化钙水溶液。
图2为胸腺类器官微球的照片及倒置式生物显微镜图片，A为胸腺类器官微球的照片；B为胸腺类器官微球的倒置式生物显微镜图片，比例尺：20μm；C为胸腺类器官微球的倒置式生物显微镜图片，比例尺：100μm；D为与C不同视野的胸腺类器官微球的倒置式生物显微镜图片，比例尺：100μm。
图3为胸腺类器官微球的共培养方法以及皮下移植BALB/c裸鼠模型的示意图，比例尺：100μM。
图4为实施例3中培养不同时间的胸腺类器官微球的倒置式生物显微镜图；A为培养7天、B为培养14天、C为培养21天，比例尺：20μm。
图5为实施例4中BALB/c裸鼠腋下移植胸腺类器官微球后的照片。A-C分别为移植7天、14天、21天后的裸鼠的再生毛发的图像。
图6为实施例4中BALB/c裸鼠腋下移植胸腺类器官后的示意图。箭头表示左右两侧前肢腋下接种部位。
图7为对比例1倒置式生物显微镜下观察到的胸腺细胞二维共培养或单独培养48h后的代表性图像。A为胸腺细胞/iTECs二维共培养48h后的图像；B为胸腺细胞单独培养48h后的图像，比例尺：100μm。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本实施例采用的小鼠为BALB/c小鼠，雌性，7-10d，购自上海斯莱克公司。所述室温为25-30℃。所述DMEM-F12完全培养液购自Gbico。
所述永生化胸腺上皮细胞(iTECs)，通过逆转录病毒转导猴病毒(SV)40大T 抗原构建永生化细胞株，来源BALB/C小鼠，参照Shen JM,Ma L,He K,et al. Identificationand functional study of immortalized mouse thymic epithelial cells.BiochemBiophys Res Commun.2020；525(2):440-446.
Transwell小室底部为带孔的透明聚酯(PE)膜，所述透明聚酯膜的孔径为8μm。
实施例1、新鲜离体的原代胸腺细胞的分离
脱颈处死BALB/c小鼠(7-10d，雌)，置于体积浓度75％乙醇水溶液中，室温浸泡5min后，打开胸腔，取出胸腺，置于含有PBS的10cm培养皿内，剥离其表面的血管及结缔组织，PBS反复多次洗涤，用注射器软塞挤压胸腺组织，溢出来的细胞即为胸腺细胞，将挤压出的胸腺细胞置于50mL离心管中，加入适量PBS，1000rpm 离心5min，洗涤3遍，沉淀即胸腺细胞。向胸腺细胞沉淀中加入5mL含体积浓度10％ FBS的DMEM/F12-B27完全培养液，调整细胞浓度2.0×106/mL，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养2天，获得原代胸腺细胞，后续直接用于瞬转或构建稳定细胞株。
实施例2、iTECs细胞、原代胸腺细胞的体外基因转染及稳定细胞株筛选
1、利用腺病毒包装的胸腺素过表达Tβ15b1基因
(1)永生化胸腺上皮细胞
永生化胸腺上皮细胞(iTECs)中Tβ15b1基因过表达：将永生化胸腺上皮细胞(iTECs)用含体积浓度10％FBS的DMEM完全培养基重悬，接种至T25培养瓶(购自Thermo)，37℃培养48h至对数生长期，弃原培养液，PBS润洗一次，加入胰酶 -EDTA消化液(0.25％胰酶+0.02％EDTA，含酚红，购自浙江吉诺生物医药技术有限公司)消化1min后，加入DMEM完全培养基终止消化，800rpm离心5min，收集细胞，用含体积浓度10％FBS的DMEM完全培养基重悬，接种至24孔板(购自Thermo)， 2.0×104个/孔，37℃培养1天至对数生长期，弃去原培养液。按重复感染度(MOI) (MOI＝100)，向24孔板中加入0.25μL的Tβ15b1 OX病毒液(购自山东维真生物科技有限公司，基因序列号：NM_001081983.1，滴度为2×1010vp/mL)、499.75μL的含体积浓度10％FBS的DMEM完全培养基，同时加入2μL的溴化己二甲铵 (polybrene，购自Sigma-Aldrich)以促进感染，轻吹混匀，将24孔板放入37℃、湿度饱和及5％CO2的恒温培养箱中培养病毒感染24h后，弃去培养液，用新鲜的含体积浓度10％FBS的DMEM完全培养基替换含有病毒的培养基，获得腺病毒感染的 Tβ15b1基因过表达iTECs细胞，记为Tβ15b1 OX-iTECs细胞。
同时用表达GFP的空载腺病毒(购自山东维真生物科技有限公司，产品货号：CV0001，滴度为2×1010vp/mL)代替Tβ15b1 OX病毒液作为对照，记为pAD-Amp OX -iTECs细胞。
(2)原代胸腺细胞
将原代胸腺细胞用含体积浓度10％FBS的DMEM/F12-B27培养基重悬，接种至 24孔板(购自Thermo)，5.0×105个/孔，1000rpm离心5min，弃去原培养液。按重复感染度(MOI)(MOI＝80)，向24孔板中加入2.5μL的Tβ15b1 OX病毒液(购自山东维真生物科技有限公司，基因序列号：NM_001081983.1，滴度为2×1010vp/mL)、 495.5μL的含体积浓度10％FBS的DMEM/F12-B27培养基，同时加入2μL的溴化己二甲铵(polybrene，购自Sigma-Aldrich)以促进感染，混匀，将24孔板放入37℃、湿度饱和及5％CO2的恒温培养箱中培养病毒感染24h后，1000rpm离心5min，PBS 洗涤1遍，沉淀即胸腺细胞。向胸腺细胞沉淀中加入500μL含体积浓度10％FBS的 DMEM/F12-B27培养基，获得腺病毒感染的Tβ15b1基因过表达胸腺细胞，记为Tβ15b1 OX-胸腺细胞。
同时用表达GFP的空载腺病毒(购自山东维真生物科技有限公司，产品货号：CV0001，滴度为2×1010vp/mL)代替Tβ15b1 OX病毒液作为对照，记为pAD-Amp OX -胸腺细胞。
2、利用慢病毒感染敲低Tβ15b1基因
A、iTECs细胞
(1)嘌呤霉素用药浓度筛选
将iTECs细胞用含体积浓度10％FBS的DMEM完全培养基重悬，接种至T25 培养瓶(购自Thermo)，37℃培养48h至对数生长期，弃原培养液，PBS润洗一次，加入胰酶-EDTA消化液(0.25％胰酶+0.02％EDTA，含酚红，购自浙江吉诺生物医药技术有限公司)消化1min后，加入DMEM完全培养基终止消化，800rpm离心5min，收集细胞，用含体积浓度10％FBS的DMEM完全培养基重悬，接种于6孔板，3.0×105个/孔。设置对照组、嘌呤霉素给药组(1、2、5、10、15μg/mL)。将6孔板在37℃、湿度饱和及5％CO2的恒温培养箱条件下培养，待细胞生长至融合度达80％左右时，对照组加入10％FBS的DMEM完全培养基2mL，嘌呤霉素给药组分别给予含不同浓度(1、2、5、10、15μg/mL)嘌呤霉素的10％FBS的DMEM完全培养基2mL，继续培养，以2-3d内杀死全部细胞的最低浓度确定为最佳药物浓度，结果最佳嘌呤霉素浓度为5μg/mL。
(2)敲低Tβ15b1基因及稳定细胞株筛选
iTECs细胞：将iTECs细胞用含体积浓度10％FBS的DMEM完全培养基重悬，接种至T25培养瓶(购自Thermo)，37℃培养48h至对数生长期，弃原培养液，PBS 润洗一次，加入胰酶-EDTA消化液(0.25％胰酶+0.02％EDTA，含酚红，购自浙江吉诺生物医药技术有限公司)消化1min后，加入DMEM完全培养基终止消化，800rpm 离心5min，收集细胞，用10％FBS的DMEM完全培养基重悬，接种于24孔板，2.0×104个/孔，37℃、5％CO2培养箱培养24h，弃去培养液，分为空白组、GFP慢病毒对照组、Tβ15b1 shRNA组。空白组的每孔中加入500μL含10％FBS的DMEM完全培养基和2μL的polybrene以促进感染；对照组的每孔中加入15μL的shRNA空载慢病毒对照(带GFP)(即表达GFP的空载慢病毒，购自山东维真生物科技有限公司，产品货号：LV100003-KD，滴度为2.2×108PFU/mL)、485μL含10％FBS的DMEM完全培养基和2μL的polybrene以促进感染；Tβ15b1 shRNA组的每孔中加入15μL的 Tβ15b1 shRNA慢病毒(购自山东维真生物科技有限公司，基因序列号： NM_001081983.1，滴度为3.4×108PFU/mL)、485μL含10％FBS的DMEM完全培养基和2μL的polybrene以促进感染。每组轻吹混匀，在37℃、5％CO2培养箱中病毒感染24h后，用含体积浓度10％FBS的DMEM完全培养基替换含有病毒的培养基，继续培养72h。72h后换用含5μg/mL嘌呤霉素和10％FBS的DMEM完全培养基。根据细胞敏感性不同(根据每天死亡的细胞量以及存活细胞状态来判断换液时间)，每1-2d换新鲜的含有5μg/mL嘌呤霉素和10％FBS的DMEM培养基，以替换含大量死细胞的培养基，直至感染病毒的组再无细胞出现死亡，剩下的细胞即为敲低 Tβ15b1的稳定细胞株iTECs；空白组记为正常iTECs细胞，对照组记为 pLent-U6-GFP-Puro shRNA-iTECs细胞，Tβ15b1 shRNA组记为Tβ15b1 shRNA-iTECs细胞。
B、原代胸腺细胞：
(1)嘌呤霉素用药浓度筛选
将原代胸腺细胞用含体积浓度10％FBS的DMEM/F12-B27培养基重悬，接种至 6孔板(购自Thermo)，1.0×106个/孔。设置对照组、嘌呤霉素给药组(2、3.5、5μg/mL)。对照组加入10％FBS的DMEM/F12-B27培养基2mL，嘌呤霉素给药组分别给予含不同浓度(2、3.5、5μg/mL)嘌呤霉素的10％FBS的DMEM/F12-B27完全培养基2mL，继续培养，以2-3d内杀死全部细胞的最低浓度确定为最佳药物浓度，结果最佳嘌呤霉素浓度为3.5μg/mL。
(2)敲低Tβ15b1基因及稳定细胞株筛选
胸腺细胞：将原代胸腺细胞用含体积浓度10％FBS的DMEM/F12-B27培养基重悬，接种至24孔板(购自Thermo)，5.0×105个/孔，1000rpm离心5min，弃去原培养液。分为空白组、GFP慢病毒对照组、Tβ15b1 shRNA组。空白组的每孔中加入500μL 含10％FBS的DMEM/F12-B27培养基和2μL的polybrene以促进感染；对照组的每孔中加入15μL的shRNA空载慢病毒对照(带GFP)(即表达GFP的空载慢病毒，购自山东维真生物科技有限公司，产品货号：LV100003-KD，滴度为2.2×108PFU/mL)、 485μL含10％FBS的DMEM/F12-B27完全培养基和2μL的polybrene以促进感染； Tβ15b1 shRNA组的每孔中加入15μL的Tβ15b1 shRNA慢病毒(购自山东维真生物科技有限公司，基因序列号：NM_001081983.1，滴度为3.4×108PFU/mL)、485μL含 10％FBS的DMEM/F12-B27完全培养基和2μL的polybrene以促进感染。每组轻吹混匀，在37℃、5％CO2培养箱中病毒感染24h后，用新鲜的含10％FBS的 DMEM/F12-B27培养基替换含有病毒的培养基，继续培养72h。72h后换用含3.5μg/mL 嘌呤霉素和10％FBS的DMEM/F12-B27培养基。根据细胞敏感性不同(根据每天死亡的细胞量以及存活细胞状态来判断换液时间)，每1-2d换新鲜的含有3.5μg/mL 嘌呤霉素和10％FBS的DMEM/F12-B27培养基，以替换含大量死细胞的培养基，直至感染病毒的组再无细胞出现死亡，剩下的细胞即为敲低Tβ15b1的稳定细胞株 iTECs；空白组记为正常iTECs细胞，对照组记为pLent-U6-GFP-PuroshRNA-iTECs 细胞，Tβ15b1 shRNA组记为Tβ15b1 shRNA-iTECs细胞。
实施例3、胸腺类器官微球的构建
1、DMEM/F12-B27培养基
D/F12-B27培养基为含生长因子的DMEM/F12培养液，其配方体积浓度组成为：在DMEM/F12培养液中加入2％的2mM的B27，0.1％的30mM的L-抗坏血酸2- 磷酸倍半镁盐水合物、1％的青霉素/链霉素，1％Glutamax，0.01％的5ng/mL的 rmFLT3L(FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)重组蛋白)，0.01％的5ng/mL的rmIL-7 (白细胞介素7)，0.02％的10ng/mL rmSCF(干细胞因子)(仅在培养的第一周添加SCF)和0.1％的0.05mM的β巯基乙醇(0.05mM)，10％的胎牛血清，每周新鲜制作。
表1.D/F12-B27培养基的配制
2、胸腺类器官微球的制备
(1)将固化透明质酸钠凝胶(购自杭州基智生物科技有限公司)加热至室温或放置在培养箱升温至37℃复温半小时使其软化，向每个Transwell小室中添加100μL 复温的交联透明质酸钠凝胶，轻轻摇动以确保凝胶均匀地涂覆在Transwell小室底部的膜表面。向24孔板的每孔中加入150μL的DMEM/F12-B27培养基，使用镊子，将涂覆凝胶的Transwell小室放入每个孔中，使Transwell小室的底部与培养基表面接触。
(2)从永生化胸腺上皮细胞、实施例1制备的原代胸腺细胞、实施例2方法制备的敲低/过表达Tβ15b1基因及空载体的胸腺细胞与敲低/过表达Tβ15b1基因及空载体的iTECs中选择一种永生化胸腺上皮细胞和一种胸腺细胞作为一组，其中各组细胞以悬浮于含10％FBS的DMEM/F12-B27培养基的形式加入，共分为9组：胸腺细胞 /iTECs、Tβ15b1 shRNA-胸腺细胞/iTECs、pLent-U6-GFP-Puro shRNA-胸腺细胞/iTECs、 Tβ15b1 OX-胸腺细胞/iTECs、pAD-Amp OX-胸腺细胞/iTECs、胸腺细胞/Tβ15b1 shRNA-iTECs、胸腺细胞/pLent-U6-GFP-Puro shRNA-iTECs、胸腺细胞/Tβ15b1 OX-iTECs、胸腺细胞/pAD-Amp OX-iTECs。各组按胸腺细胞与iTECs细胞数量比20： 1的比例进行混合(即胸腺细胞：iTECs＝100w：5w)。各组分别加入微离心管中，使用摆动桶式离心机在1000rpm离心5min。后用枪头小心地抽吸上清液，用 DMEM/F12-B27培养基将细胞浆的体积调整到5μL。用10μL的枪头，向步骤(1)每个涂覆凝胶的Transwell小室添加5μL的细胞浆，每组3个平行。各组放置于37℃、 5％CO2孵箱培养7d，期间每2-3天加入100μL的DMEM/F12-B27培养基，得到直接大于50μm的胸腺类器官，用于造模。造模前，分别在第7、14和21天采用倒置式生物显微镜(德国蔡司，型号：AxioObserver.A1)下观察包埋于交联透明质酸中的胸腺细胞/iTECs三维共培养后形成的胸腺类器官的图像，结果见图4，A-C分别为培养7天、14天、21天的胸腺类器官，比例尺：20μm。图4表明胸腺上皮细胞在3D 类器官培养中支持T细胞发育的能力。用蔡司ZEISS软件(ZEN BlueLite2_3)测量类器官直径，交联透明质酸水凝胶中制备的胸腺类器官在第七天的时候直径均超过50 μm(根据之前实验这样直径的类器官后期都能正常增殖下去)，能够用于制备微球。
(3)100mg透明质酸酶干粉(购自索莱宝，酶活608units/mg)用10mL去离子水溶解，制成浓度为10mg/mL透明质酸酶母液，用去离子水将母液稀释至300μg/mL，即为工作液，-20℃避光保存。向步骤(2)培养7d后的每个Transwell小室内添加500 μL工作液，然后置于5％CO2、37℃细胞培养箱内培养16h，降解凝胶。待凝胶降解完全后，胸腺细胞和iTECs从凝胶内释放，分别收集各个Transwell小室内降解的细胞混合液，用PBS洗涤，并将细胞沉淀重悬至1ml含1μg/mL免疫球蛋白和0.01g/mL 海藻酸钠的PBS中，混匀，每个Transwell小室获得细胞混合液1ml。
(4)微流控技术制备微球及低温保存
胸腺类器官微球的制备及低温保存采用Elveflow微流控灌注套装(PerfusionPack，购自泰初科技(天津)有限公司，包含AF1 Pump-精密微流体压力泵、Elveflow 的流量控制和自动化软件、1个250mL储液器)以及微流控芯片Microslides(购自ALine Inc)。
先用体积浓度70％乙醇水溶液冲洗Elveflow微流控灌注套装的微流控芯片MicroSlide，储液器以及所有导管和接头以确保无菌，4℃，低温保存。然后通过压力泵将储液器中100mM氯化钙水溶液200mL加入芯片中。接着用微量移液管将步骤 (3)制备的30μL的细胞混合液以流速300μL/min通入芯片，获得胸腺类器官微球。制备好的微球无菌分装于玻璃瓶中，4℃保存，类器官的活性可维持15-30天。
实施例4、胸腺类器官的皮下移植BALB/c裸鼠实验
1、BALB/c裸鼠及分组
选取健康3-4周龄雌性BALB/c裸鼠36只，体重14-16g。所有裸鼠采用无菌、恒温环境饲养，每日给予无菌饮水和食物，垫料经灭菌处理，3-4天更换，在动物中心饲养一周后进行随机分成12组，每组3只，其中，C组-K组分别注射实施例3制备的微球于PBS的悬液100μL，微球含量为200w敲低/过表达Tβ15b1基因的原代胸腺细胞以及10w敲低/过表达Tβ15b1基因的永生化胸腺上皮细胞。
A组：iTECs，即注射永生化胸腺上皮细胞(iTECs)于PBS的悬液100μL，细胞浓度1×106/mL；
B组：原代胸腺细胞，即实施例1制备的原代胸腺细胞于PBS的悬液100μL，细胞浓度2×107/mL；
C组：胸腺细胞/iTECs；
D组：Tβ15b1 shRNA-胸腺细胞/iTECs；
E组：pLent-U6-GFP-Puro shRNA-胸腺细胞/iTECs；
F组：Tβ15b1 OX-胸腺细胞/iTECs；
G组：pAD-Amp OX-胸腺细胞/iTECs；
H组：胸腺细胞/Tβ15b1 shRNA-iTECs；
I组：胸腺细胞/pLent-U6-GFP-Puro shRNA-iTECs；
J组：胸腺细胞/Tβ15b1 OX-iTECs；
K组：胸腺细胞/pAD-Amp OX-iTECs；
L组：正常组，为不进行胸腺移植组。
除正常组外，每只裸鼠均于左右两侧前肢腋下接种100μL不同处理的胸腺类器官，制备胸腺类器官——裸鼠嵌合模型。SPF级饲养室，分笼饲养，自然饮食，每日记录观察小鼠生长状况。
结果见图5所示，A-C分别为移植7天、14天、21天后的裸鼠的再生毛发的图像。结果表明腋下移植胸腺类器官能模拟正常小鼠胸腺生成，有效激发毛囊，促进裸鼠的毛发再生。
对照例1、二维共培养(不含凝胶)
将iTECs细胞用含体积浓度10％FBS的DMEM完全培养基重悬，接种至T25 培养瓶(购自Thermo)，37℃培养48h至对数生长期，弃原培养液，PBS润洗一次，加入胰酶-EDTA消化液(0.25％胰酶+0.02％EDTA，含酚红，购自浙江吉诺生物医药技术有限公司)消化1min后，加入DMEM完全培养基终止消化，800rpm离心5min，收集细胞，用10％FBS的DMEM完全培养基重悬，调整细胞浓度为5×105/mL待用。并用10％FBS的DMEM/F12-B27培养基重悬原代胸腺细胞，调整细胞浓度为1×107/mL待用。各取100μL细胞悬液混合，分别加入微离心管中，使用摆动桶式离心机在1000rpm离心5min，弃上清，用500μL 10％FBS的DMEM/F12-B27培养基培养基重悬两种细胞混合沉淀，并加入到24孔板中，37℃、5％CO2孵箱培养7d，期间每2-3天加入100μL的10％FBS的DMEM/F12-B27培养基培养基，得到胸腺类器官。显微图见图7所示，实验结果：两种细胞不能聚集成团，iTECs细胞贴壁生长，原代胸腺细胞72h大量凋亡。

Claims (6)

1.一种胸腺类器官微球，其特征在于，所述胸腺类器官微球按如下方法制备：（1）将透明质酸钠凝胶加入Transwell小室中，加热至室温或放入37℃培养箱复温半小时使其软化覆盖小室底膜，再将Transwell小室放入加有DMEM/F12-B27培养基的培养孔板中；DMEM/F12-B27培养基组成为：在DMEM/F12培养液中加入2 % 的B27，0.1%的L-抗坏血酸2-磷酸倍半镁盐水合物、1%的青霉素/链霉素，1% 的添加剂Glutamax，0.01%的rmFLT3L，0.01%的rmIL-7，0.1%的β巯基乙醇，体积浓度10%的胎牛血清，在培养第一周添加0.02%的rmSCF；所述L-抗坏血酸2-磷酸倍半镁盐水合物终浓度为30µM，所述青霉素/链霉素终浓度为1 ×；所述Glutamax终浓度为1 ×；所述rmFLT3L终浓度5ng/mL；所述rmIL-7终浓度5 ng/mL；所述rmSCF终浓度10 ng/mL；所述β巯基乙醇终浓度0.05mM；（2）向步骤（1）Transwell小室内接种胸腺混合细胞，37℃、5%CO2培养5-10天；所述胸腺混合细胞是由敲低或过表达Tβ15b1基因的永生化胸腺上皮细胞与新鲜离体的敲低或过表达Tβ15b1基因的原代胸腺细胞混合而成；（3）在步骤（2）的 Transwell小室中加入透明质酸酶水溶液，37℃静置培养16 h，离心，收集沉淀并用含1 μg/mL 免疫球蛋白的PBS重悬，加入海藻酸钠，混匀，获得混合液；（4）将步骤（3）混合液滴入氯化钙水溶液中，获得所述的胸腺类器官微球。
2.如权利要求1所述的胸腺类器官微球，其特征在于，步骤（1）Transwell小室底部为带孔的透明聚酯膜，所述透明聚酯膜的孔径为5-10μm。
3.如权利要求1所述的胸腺类器官微球，其特征在于，步骤（1）所述胸腺混合细胞是由永生化胸腺上皮细胞与新鲜离体的原代胸腺细胞以细胞数量比10-50:1混合而成。
4.如权利要求1所述的胸腺类器官微球，其特征在于，步骤（3）透明质酸酶水溶液浓度为200-500 μg/mL；所述海藻酸钠加入量以PBS体积计为0.005-0.025g/mL。
5.如权利要求1所述的胸腺类器官微球，其特征在于，步骤（4）氯化钙水溶液浓度为50-200 mM；所述氯化钙水溶液与混合液体积比为5:1-10：1。
6.如权利要求1所述的胸腺类器官微球，其特征在于，步骤（4）采用Elveflow微流控灌注套装，通过压力泵将储液器中100mM 氯化钙水溶液加入芯片中，接着用微量移液管将步骤（3）细胞混合液以流速300μL/min通入芯片，获得胸腺类器官微球。
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