CN101438977A - 一种hsat h-t-s人鼠嵌合体模型的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种HSAT H－T－S人鼠嵌合体模型的构建方法及应用。首先选取6－8周的雌性Nod－SCID小鼠，并对SCID小鼠用放射线进行全身照射；其次是取人胚胎胸腺细胞。细胞来源于孕龄小于24周的自愿终止妊娠者胚胎的胸腺，细胞数量为1×10⁷个，其中胸腺细胞与胸腺上皮细胞及其它基质细胞的数量比例为1∶1，并用α－GalCer－CD1d四聚体特异性清除幼稚与成熟NKT细胞；第三是将得到的胚胎胸腺细胞皮下注射至SCID小鼠胸腺中，进行皮肤移植，得到一种HSAT H－T－S人鼠嵌合体模型。通过将人胚胎胸腺细胞植入重度联合免疫缺陷小鼠的胸腺中，将人胚躯干部全层皮肤移植至SCID小鼠胸腔上，再现了人体内皮肤移植反应的免疫耐受和排斥反应。本发明重复性好，效果显著，方法简单，具有良好的应用前景。

Description

一种HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及细胞免疫学和实验动物学技术领域，更具体地涉及一种HSATH-T-S人鼠嵌合体模型的构建方法，同时还涉及NKT细胞在HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型中再现的移植免疫耐受和排斥反应中的作用。

背景技术

近年来，陆续报道了有关动物实验模型的研究，如将人的胎儿胸腺、胎肝和胎骨甚至成人的外周血造血干细胞移植到患有严重联合免疫缺陷综合征(severecombined immunodeficiency syndrome，SCID)的小鼠体内，分别建成SCIDhyTHy/Liv、SCID huBone、SCID HPBL等几种人鼠嵌合模型。其中，人外周血淋巴细胞(HuPBL)具有来源方便，重建后的动物模型中T、B淋巴细胞都具有功能，并可以检测到人免疫球蛋白的存在等优点，因而更广受重视。但是，关于建立皮肤移植研究排斥反应的HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型在国内外还是空白。

1986年成功克隆了NKT细胞(natural killer T cell)的特征性抗原受体基因。将其命名为Vα14基因，与其它T细胞抗原受体(TCR)的基因不同，有其独特的结构特征。1987年美国国立卫生研究所的Fawlkes与瑞士的Budd分别领导的两个研究小组报告指出，胸腺细胞中的T细胞通常不能表达受体，仅有部分未成熟T细胞选择性表达V-β8.2受体。随后的研究证明这种细胞不是T细胞，原因V-β8.2受体是NK细胞的受体，这种细胞集的数量极少，生理意义不明。1994年，这两个研究小组的研究人员发现，他们报道的细胞为同一种细胞，从此NKT细胞的研究引起广泛关注。

与T细胞和NK细胞不同，NKT细胞是一种特殊类型的新型T淋巴细胞，同时表达NK细胞和T淋巴细胞标记，具有较为恒定的TCRα和独特的CD1d限制性。NKT细胞不但能分泌Th1和Th2细胞因子，同时还具有与CD8⁺杀伤性T细胞(CTL)相同的杀伤靶细胞作用，NKT细胞通过调节Th1和Th2细胞发育参与免疫调节。

随着器官移植手术的广泛开展，移植排斥反应的高发生率和高病死率已经成为异体器官移植发展的障碍。目前主要采用免疫抑制剂、去T细胞移植、组织配型相结合等方法防治移植排斥反应，但诱发肿瘤、机会性感染、移植物丧失功能等毒副作用日益显现，并且人白细胞抗原供应源不断减少，寻求新的途径防治移植排斥反应，已成为移植领域研究的重点。所以诱导移植器官的特异性免疫耐受是克服免疫排斥的主要发展方向，也是当前器官移植领域研究的热点问题。

NKT细胞在移植耐受中的作用亦不容忽视。在小鼠的肝移植、心脏移植、胰岛移植及前房相关免疫偏离(ACAID)模型中均证实了NKT细胞在移植耐受中的重要作用。在小鼠模型中，通过NKT细胞、树突状细胞、CD4⁺T细胞表达IL-10来维持皮肤移植的免疫耐受。NKT细胞在移植免疫中不仅参与免疫耐受的形成，相反在某些情况下对免疫排斥反应的产生起促进作用，这取决于移植物所处的微环境，Toyofuku A等研究发现，CD1d^-/-或V14NKT细胞缺乏的糖尿病小鼠在接受肝内胰岛移植后，移植物的存活率明显高于其野生型小鼠，而将胰岛移植到肾脏则没有多大差异，可能与NKT细胞在肝脏内存在富集现象及IFN-γ的分泌有关。

尽管有资料证明NKT细胞在移植反应中的重要作用，但是，还是需要更进一步去了解人NKT细胞是否参与和介导移植反应中的免疫耐受和排斥反应，以及这两种不同的移植反应的作用机制。

总之，随着对NKT细胞认识的不断深入及其在移植免疫中的作用机制的进一步研究，相信利用NKT细胞诱导移植器官的特异性免疫耐受不久将应用于临床，这将为预防器官移植术后免疫排斥反应的发生开辟一条新的途径。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种构建HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型的方法，其技术难点在于：按正确比例获取人胚胎胸腺细胞并注射至SCID小鼠胸腺中，确定人胚胎躯干部全厚层皮肤移植至小鼠胸腔的时间。该发明为具有人体免疫系统特征的人鼠嵌合体，作为模式系统，能够完全模拟人体免疫内环境，并对人类特有抗原做出正常人体免疫反应，且还具有方法简单、重复性好、效果显著等优点。

本发明的另一个目的是在于提供了一种HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型在移植免疫耐受和排斥反应中的应用。首先构建HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型，然后通过流式细胞仪等技术手段监测此模型SCID小鼠体内NKT细胞及其细胞因子、趋化因子在耐受模型和排斥模型中的表达变化，探索其在人体移植耐受和排斥反应中的调节机制，并证实NKT细胞参与了免疫移植反应，进一步丰富了NKT细胞在移植反应中的重要作用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术措施：

本发明所提供的HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型，是将人胚胎胸腺细胞植入SCID小鼠胸腺内，再分两个时间点(0周、4周)移植人胚躯干部全厚层皮肤至SICD小鼠胸腔，分别得到HSAT H-T-S人鼠嵌合体的耐受模型和排斥模型。一种HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型的构建方法，其步骤如下：

A.选取6-8周的雌性Nod-SCID小鼠(非肥胖型重度联合免疫缺陷，购置武汉大学动物实验中心)。在进行细胞移植前4个小时，对每只SCID小鼠用放射线进行全身照射，照射剂量为200-350cGy，优选为300cGy。

B.制备人胚胎胸腺细胞。人胚来源于孕龄小于24周的自愿终止妊娠者的胚胎，细胞HLA的分型为HLA-B8⁺/HLA-DQ5⁺。自人胚中剥离胸腺组织，去除被膜，生理盐水洗涤，剪至约1mm³的小碎块，RPMI-1640培养液(HyClone，USA)洗涤。在胸腺小碎块中加入RPMI-1640培养基，搅拌20min，研磨分散细胞(此过程在冰上进行)，在研磨过程中用RPMI-1640培养基冲洗，过200目筛网，收集筛下滤过物，再将滤过物用RPMI-1640培养基洗涤，离心收集细胞(1000r/min，10min，4℃)，即大部分为胸腺细胞，细胞计数，取1×10⁷个。再将筛网上的残余胸腺组织碎片收集，加入胶原酶-中性蛋白酶溶液(125μg/ml；Sigma)在37℃温箱中进行消化，三遍，每遍20min，再加入EDTA-胰酶(125μg/ml；Roche)于37℃温箱中继续消化三遍，每遍15min。再加入RPMI-1640培养基吹打，分散细胞，过200目筛网，再次收集筛下滤过物，大部分即为胸腺上皮细胞及其它基质细胞，洗涤，离心(1000r/min，10min，4℃)收集细胞，细胞计数，取1×10⁷个。按数量比例为1:1混合胸腺细胞和胸腺上皮细胞及其它基质细胞，最后用α-GalCer-CD1d四聚体(ProImmune Inc.，Bradenton，FL，USA)通过流式细胞仪将幼稚与成熟的NKT细胞特异性清除。

C.将步骤B中得到的人胚胎胸腺细胞用1×PBS缓冲液制成胸腺细胞单细胞悬液直接皮下注射至SCID小鼠的胸腺内。SCID小鼠取仰卧体位，在皮肤上作一个4-5mm的横切口，切口位于第二肋间隙处，垂直于胸骨，且位于SCID小鼠两前臂连接的遐想线上。注射针：1ml注射器，25-gauge注射针，且注射针经胸骨一旁的肋间隙进入到胸腺叶。进针角度：注射针针头与胸骨成30°-40°。进针深度：约3mm，大约为注射针针头斜面的长度。注射量：每次注射25ul。注射完毕，缝合，关闭创口。

D.制备人胚躯干部全厚层皮肤。皮肤来源于孕龄小于24周的自愿终止妊娠者的胚胎，HLA的分型为HLA-A2⁺/HLA-DRB1⁺。自妊娠者取出人胚，常规消毒，铺单，剪下人胚胎躯干部全厚层皮肤置于含1×PBS缓冲液的培养皿中，并将剪下的皮肤用镊子剥去脂肪组织，再放入含新鲜的1×PBS缓冲液培养皿中，此步骤至少重复2-5次，直到脂肪组织完全被剔除。最后将剪下的躯干部全厚层皮肤切成统一大小(0.8cm²/片)的移植片，置于4℃预冷的生理盐水中待移植。

E.将步骤D中制备好的人胚躯干部全厚层皮肤移植至步骤C中己注射了人胚胎胸腺细胞的SCID小鼠中，得到humanized skin-allograft-transplantedhuman-thymus-SCID chimera(简称HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型)。这种人鼠嵌合模型humanized skin-allograft-transplanted human-thymus-SCID chimera包括HSATH-T-S人鼠嵌合体模型的排斥模型和HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型的耐受模型。

两组SCID小鼠分两个时间点(0周、4周)进行皮肤移植，即一组在注射人胚胎胸腺细胞至SCID小鼠胸腺后立即进行人胚胎躯干部全厚层皮肤移植，得到HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型的耐受模型。另一组在注射人胚胎胸腺细胞至SCID小鼠胸腺后，待4周免疫重建以后再进行皮肤移植，得到HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型的排斥模型。

首先用速眠新(武汉华龙生物制药有限公司)麻醉良好后，胸腔部备皮，常规消毒、铺单。剪去与待移植人皮肤面积相同(0.8cm²/片)的全厚层皮肤，将步骤D中制备好的人胚皮躯干部全厚层皮肤植入SCID小鼠皮肤缺损处并与周围皮肤缝合，覆盖油纱后包扎，1周后去除油纱。

一种HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型应用过程如下：

A.在HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型的耐受模型中，皮肤移植与胸腺依赖的NKT细胞同时发生，出现免疫耐受现象。在无菌条件下，取SCID小鼠各个器官即胸腺、脾脏、肝脏及外周血液，先把器官剪碎，过200目不锈钢钢丝网，然后用Percoll分离液(Pharmacia，USA)分离淋巴细胞并收集。使用抗TCRβ单克隆抗体(R&D Systems Europe Ltd.Abingdon，UK)，α-GalCer-CD1d四聚体(ProImmune Inc.，Bradenton，FL，USA)，抗CD4⁺单克隆抗体(R&D Systems EuropeLtd.Abingdon，UK)，抗CD8⁺单克隆抗体(R&D Systems Europe Ltd.Abingdon，UK)，人趋化因子受体单克隆抗体(R&D Systems Europe Ltd.Abingdon，UK)，同型对照(DAKO)。

通过流式细胞仪检测得出，耐受模型中的各脏器(胸腺、脾脏、肝脏及外周血液)和移植的皮肤的NKT细胞出现频率呈增加趋势。而且，特别地，在此胸腺，脾脏，肝脏，外周血液以及耐受的移植皮片中出现的NKT细胞以CD4⁺NKT细胞为主。在HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型的耐受模型中CD4⁺NKT细胞诱导移植反应的免疫耐受，通过在NKT细胞高表达细胞因子IL-4、IL-10及IL-13，并且CD4⁺NKT细胞中的CXCR6基因表达增强。

B.在HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型的排斥模型中，此时的皮肤移植发生在胸腺依赖的NKT细胞成熟之后，出现了急性排斥反应。在无菌条件下，取SCID小鼠各个器官即胸腺、脾脏、肝脏及外周血液，先把器官剪碎，过200目不锈钢钢丝网，然后用Percoll分离液(Pharmacia，USA)分离淋巴细胞并收集。使用抗TCRβ单克隆抗体(R&D Systems Europe Ltd.Abingdon，UK)，α-GalCer-CD1d四聚体(ProImmune Inc.，Bradenton，FL，USA)，抗CD4⁺单克隆抗体(R&D Systems EuropeLtd.Abingdon，UK)，抗CD8⁺单克隆抗体(R&D Systems Europe Ltd.Abingdon，UK)，人趋化因子受体单克隆抗体(R&D Systems Europe Ltd.Abingdon，UK)，同型对照(DAKO)。

通过流式细胞仪检测得出，排斥模型中的各脏器和移植的皮肤中的NKT细胞出现频率呈增加趋势。而且，在各器官和被排斥的移植皮片中出现的大量NKT细胞中以CD8⁺NKT细胞为主。在HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型的排斥模型中，CD8⁺NKT细胞高表达IFN-γ和IL-2，并且CD8⁺NKT细胞中CCR9基因表达增强。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：本发明的HSATH-T-S人鼠嵌合体模型，用于研究NKT细胞参与和介导移植排斥反应和免疫耐受，以及NKT细胞在移植反应中的作用与表达。本发明的模型具有重复性好，效果显著，即耐受模型中以CD4⁺NKT细胞为主，并高表达了IL-4、IL-10和IL-13；排斥模型中以CD8⁺NKT细胞为主，并高表达了IFN-γ、IL-2，而且完全模拟了人体内免疫系统等优点，丰富了国内外对NKT细胞在皮肤移植排斥反应和免疫耐受中作用机制的认识。该模型将在免疫学基础研究，诱导移植性器官特异性免疫耐受等方面发挥十分重要的作用，具有良好的应用前景。

附图说明

图1：一种HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型的建立及其皮肤移植后的存活率示意图

A.为HSAT H-T-S嵌合体模型的建立，通过在SCID小鼠内注射配型为HLA-B8⁺/HLA-DQ5⁺人胚胎胸腺细胞使胸腺内免疫重建再进一步移植配型为HLA-A2⁺/HLA-DRB1⁺人胚胎躯干部全厚层皮肤。移植时间分为免疫系统重建后0周或4周后再进行移植，观察12周。

B.为在两个实验方案中皮肤移植后的幸存率。皮肤移植的受者为植入了配型为HLA-B8⁺/HLA-DQ5⁺人胚胎胸腺细胞的SCID小鼠，供者为配型HLA-A2⁺/HLA-DRB1⁺的人胚躯干部皮肤(同种异体皮肤移植)。而另一供者配型为HLA-B8⁺/HLA-DQ5⁺人胚胎皮肤作为同型皮肤移植的对照。横坐标为两组方案皮肤移植物存活时间

图2：HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型中CD4⁺CD8⁺NKT细胞数示意图

植入了配型为HLA-B8⁺/HLA-DQ5⁺人胚胎胸腺细胞的SCID小鼠植入配型为HLA-A2⁺/HLA-DRB1⁺的人胚胎躯干部全厚层皮肤，从而建立HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型。收集各脏器和组织的NKT细胞。统计其频率，用流式细胞仪确定了来自不同实验方案中的各组织器官中的CD4⁺NKT和CD8⁺NKT细胞数。

A.数据显示，在HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型中，分别来自于耐受模型(右上)和排斥模型(右下)中的总的NKT细胞出现的频率。

B-C.数据显示在HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型中分别来自耐受模型B和排斥模型C中的CD4⁺NKT细胞(右上)和CD8⁺NKT细胞(右下)出现的频率。

UD：为未检测到；ND：为无确切数据。平均值±SD(n＝5).P<0.001

图3：HSAT H-T-S人鼠嵌合体的不同模型中CD4⁺和CD8⁺NKT细胞中趋化因子CXCR6⁺和CCR⁺表达示意图

HSAT H-T-S人鼠嵌合体的耐受模型和排斥模型中的CD4⁺和CD8⁺NKT细胞中的CCR9⁺和CXCR6⁺的表达。收集胸腺、脾脏的NKT细胞。四色流式细胞仪收集CD4⁺和CD8⁺NKT细胞表达CCR9⁺和CXCR6⁺。通过流式得到的实验性及分析性数据显示在图的左边。

ND：为无确切数据。平均值±SD(n＝5).P<0.001

图4：HSAT H-T-S人鼠嵌合体的不同模型中CD4⁺NKT细胞和CD8⁺NKT细胞的细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10的表达示意图

在耐受和排斥的HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型中，通过细胞内流式细胞术检测CD4⁺和CD8⁺NKT细胞中的IFN-γ、IL-4和IL-10的表达。收集皮肤同种异体移植物，收集单细胞悬液。四色染色(胞内的细胞因子抗体、CD4/CD8抗体、CD1d四聚体抗体、TCRβ抗体)，通过流式来检测CD4⁺和CD8⁺NKT细胞中的IFN-γ、IL-4和IL-10的表达。实验分析数据在图的最左边。

ND：为无确切数据。平均值±SD(n＝5).P<0.001

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明：

实施例1 HSAT H-T-S人鼠嵌合体动物模型的建立，其步骤如下：

实验材料：

动物：CB-17SCID小鼠(购置武汉大学动物实验中心)二十只，年龄8周左右，性别雌，体重20g左右

饲养条件：在无菌条件下，饲养温度22℃，湿度55％，12小时白/昼节律，饮用水中给予适当的抗生素

麻醉剂：盐酸二甲苯胺噻嗪(0.3mg，辽宁卫星制药厂)、盐酸氯胺酮(1.5mg，辽宁卫星制药厂)、1×PBS缓冲液300μl

一种HSATH-T-S人鼠嵌合体动物模型的构建方法，包括以下步骤：

A.选取8周龄左右的的CB-17SCID小鼠(非肥胖性糖尿病小鼠，购置武汉大学动物实验中心)二十只，分为两组。在进行细胞移植前的4个小时，对每只SCID小鼠进行全身X线照射，照射剂量为250-350cGy，优选300cGy。

B.取人胚胎胸腺细胞：人胚来源于小于24周引产自愿终止妊娠志愿者，人胚胎胸腺细胞HLA的分型为HLA-B8⁺/HLA-DQ5⁺。具体步骤：1)自人胚胎中剥离胸腺组织，去除被膜，生理盐水洗涤，剪至约1mm³的小碎块，RPMI-1640培养液(HyClone，USA)洗涤。2)在胸腺小碎块中加入RPMI-1640培养基，搅拌20min，研磨分散细胞(此过程在冰上进行)，在研磨过程中用RPMI-1640培养基冲洗，过200目筛网，收集筛下滤过物，再将滤过物用RPMI-1640培养基洗涤，离心收集细胞(1000r/min，10min，4℃)，即为大部分的胸腺细胞，细胞计数，取1×10⁷个。3)将筛网上残余的胸腺组织碎片收集，加入胶原酶-中性蛋白酶溶液(125μg/ml；Sigma)在37℃温箱中进行消化三遍，每遍20min，再加入EDTA胰酶(125μg/ml；Roche)于37℃温箱中继续消化三遍，每遍15min。再加入RPMI-1640培养基吹打，分散细胞，过200目筛网，再次收集筛下滤过物，大部分即为胸腺上皮细胞及其它基质细胞，洗涤，离心(1000r/min，10min，4℃)收集细胞，细胞计数，取1×10⁷个。按数量比例为1:1收集胸腺细胞和胸腺上皮细胞及其它基质细胞。此制备方法可参见文献(Gotter J，Brors B，Hergenhahn M，Kyewski B.Medullary epithelial cells of the human thymus express a highly diverse selection oftissue-specific genes colocalized in chromosomal clusters.J Exp Med 2004；19：155-166)。4)将胸腺细胞及胸腺上皮细胞混合，加入α-GalCer-CD1d四聚体(ProImmune Inc.，Bradenton，FL，USA)在37℃温箱中孵育，30min，最后通过流式细胞仪将全部的幼稚及成熟的NKT细胞与这两种混合细胞分离。5)将最终获得的胸腺内的细胞冷冻保存在液氮中，备用。

C.将步骤B中得到的人胚胎胸腺细胞皮下注射至SCID小鼠胸腺内：具体步骤如下：1)分别麻醉两组SCID小鼠，首先将盐酸二甲苯胺噻嗪、盐酸氯胺酮混合1×PBS缓冲液制成麻醉剂，i.p麻醉小鼠。方法可参见文献(Uldrich AP.Berzins S P，Malin MA，et al.Antigen challenge inhibits thymic emigration.J Immunol 2006；176：4553-4561)2)将之前准备好备用的胸腺细胞用1×PBS缓冲液制成胸腺细胞单细胞悬液，待用。SCID小鼠体位：仰卧。在皮肤上作一个4-5mm的横切口：切口约在第二肋间隙处，垂直于胸骨，且位于SCID小鼠两前臂连接的遐想线上。注射针：1ml注射器，25-gauge，且注射针经胸骨一旁的肋间隙进入到胸腺叶。进针角度：注射针针头与胸骨成30°-40°。进针深度：约3mm，大约为注射针针头斜面的长度。注射量：每次注射25μl。注射完毕，缝合，关闭创口。方法可参见文献(de la Cueva T，Naranjo A，de la Cueva E，Rubio D.Refinement of intrathymicinjection in mice.Lab Anim(NY).2007May；36(5)：27-32.)。

D.取人胚胸腺躯干部皮肤：人胚来源于小于24周引产自愿终止妊娠志愿者，HLA的分型为HLA-A2⁺/HLA-DRB⁺。具体步骤如下：常规消毒，铺单，剪下人胚胎躯干部全厚层皮肤置于1×PBS缓冲液的培养皿中，将剪下的皮肤用镊子剥去脂肪组织，再放入新鲜的1×PBS缓冲液培养皿中，此步骤重复2或3或4或5次(或者更多次)，直到脂肪组织完全被剔除。最后将剪下的躯干部全层皮肤切成统一大小(0.8cm²/片)的移植片，置于4℃预冷的生理盐水中待移植。

E.将人胚胎躯干部皮肤移植至步骤C植入了人胚胎胸腺细胞的SCID小鼠胸腔：两组SCID小鼠，选其中一组先进行皮肤移植，即在传输了人胚胎胸腺内细胞后即0周，进行同种异体皮肤移植，得到HSAT H-T-S人鼠嵌合体动物模型的耐受模型。速眠新(武汉华龙生物制药有限公司)麻醉良好后，胸腔部备皮，常规消毒、铺单。剪去与待移植人皮肤面积相同的全厚皮肤，将步骤D中制备好的人胚皮躯干部全厚层皮肤植入SCID小鼠皮肤缺损处并与周围皮肤缝合，覆盖油纱后包扎，一周后去除油纱。而另一组SCID小鼠在人胚胎胸腺细胞传输后的第4周再进行同种异体皮肤移植，得到HSAT H-T-S人鼠嵌合体动物模型的排斥模型。

实施例2一种HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型其应用过程如下：(HSAT H-T-S人鼠嵌合体动物模型的检测)

实验材料：HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型建立后，在无菌条件下，分别于0周、4周、8周、12周从两组SCID小鼠的各个器官即胸腺、脾脏、肝脏及外周血液中收集淋巴细胞单细胞悬液。体外分离小鼠器官淋巴细胞的方法为：先把器官剪碎，过200目不锈钢钢丝网，然后用Percoll分离液(Pharmacia，USA)分离淋巴细胞，详细步骤可参考Mebius RE等论文(Transfer of primitive stem/progenitor bonemarrow cells from LT alpha-/- donors to wild-type hosts：implications for thegeneration of architectural events in lymphoid B cell domains.JImmunol.1998；161：3836-43)。

A.在HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型的耐受模型中，皮肤移植与胸腺依赖的NKT细胞同时发生，出现免疫耐受现象。

1)用常规的NKT细胞表面分子检测法，使用抗TCRβ单克隆抗体(R&DSystems Europe Ltd.Abingdon，UK)，α-GalCer-CD1d四聚体(ProImmune Inc.，Bradenton，FL，USA)，抗CD4⁺单克隆抗体(R&D Systems Europe Ltd.Abingdon，UK)，抗CD8⁺单克隆抗体(R&D Systems Europe Ltd.Abingdon，UK)。先将以上抗体同时加入此模型SCID小鼠组织器官中分离出来的淋巴细胞单细胞悬液中，4℃，孵育30min，再用1×PBS缓冲液洗涤两遍，最后通过流式细胞仪检测。在此耐受模型中，统计NKT细胞频率，用流式细胞仪确定了来自耐受模型中的的不同器官和组织中的CD4⁺和CD8⁺NKT细胞数。

随着检测时间的推移，0周、4周、8周、12周，各脏器中，即胸腺、脾脏、肝脏、外周血、以及移植的皮片中的NKT细胞数均逐渐增多。从最初第1周的不到0.5％到第12周均超过了1％，且均以胸腺中的NKT细胞量最多。

耐受模型中的CD4⁺NKT细胞和CD8⁺NKT细胞相比之下，CD4⁺NKT细胞几乎达总NKT细胞的百分之百，而CD8⁺NKT细胞仅在胸腺中出现了极少量，不到10％。因此，耐受模型中，出现的NKT细胞以CD4⁺NKT细胞为主。

2)检测耐受模型中CD4⁺NKT细胞和CD8⁺NKT细胞中趋化因子CXCR6⁺和CCR9⁺的表达。使用抗TCRβ单克隆抗体，α-GalCer-CD1d四聚体，抗CD4⁺单克隆抗体，抗CD8⁺单克隆抗体，抗人趋化因子受体单克隆抗体(R&D SystemsEurope Ltd.Abingdon，UK)。首先用含有2％的BSA及0.1％叠氮化钠的1×PBS缓冲液将收集好的淋巴细胞制成单细胞悬液，再将以上五种抗体一起加入淋巴细胞单细胞悬液中孵育，4℃，30min，最后再用1×PBS缓冲液洗涤两遍，流式细胞仪检测。

在耐受模型中，胸腺中的CD4⁺NKT细胞的趋化因子CXCR6⁺的表达为85％而CCR9⁺的表达<2％；脾脏中的CD4⁺NKT细胞的趋化因子CXCR6⁺的表达为88％而CCR9⁺的表达亦<2％。而胸腺与脾脏里的CD8⁺NKT细胞中均未发现趋化因子CXCR6⁺和CCR9⁺的表达。综上所述，在耐受模型中，CD4⁺NKT细胞的CXCR6⁺基因表达增强。

3)检测耐受模型中NKT细胞内细胞因子。操作步骤：将提取出来的NKT细胞用1×PBS缓冲液洗涤两遍，再使用Interprep(Coulter-ImmunoTech)根据产品说明书作固定和透化处理。使用小鼠抗人细胞因子单克隆抗体(R&D SystemsEurope Ltd.Abingdon，UK)，孵育，室温下(20-25℃)，15min。再将细胞用1×PBS缓冲液洗涤两遍后用羊抗鼠多克隆抗体(R&D Systems Europe Ltd.Abingdon，UK)，孵育，室温下(20-25℃)，15min。再将细胞用1×PBS缓冲液洗涤两遍，使用抗TCRβ单克隆抗体、α-GalCer-CD1d四聚体，孵育，4℃，15min。最后，再用1×PBS缓冲液洗涤细胞，用含0.5％(体积分数)甲醛的PBS固定，流式细胞仪检测。

在耐受模型中，CD4⁺NKT细胞表达的IFN-γ、IL-4、IL-10分别为4％、12％、14％；而CD8⁺NKT细胞中未发现IFN-γ、IL-4、IL-10的表达。因此，在耐受模型中，CD4⁺NKT细胞高表达IL-4、IL-10。

B.在HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型的排斥模型中，在注射人胚胎胸腺细胞后的第4周，进行皮肤移植，此时的皮肤移植发生在胸腺依赖的NKT细胞成熟之后，出现了急性排斥反应。

1)用常规的NKT细胞表面分子检测法，使用抗TCRβ单克隆抗体(R&DSystems Europe Ltd.Abingdon，UK)，α-GalCer-CD1d四聚体(ProImmune Inc.，Bradenton，FL，USA)，抗CD4⁺单克隆抗体(R&D Systems Europe Ltd.Abingdon，UK)，抗CD8⁺单克隆抗体(R&D Systems Europe Ltd.Abingdon，UK)。先将以上抗体同时加入此模型SCID小鼠组织器官中分离出来的淋巴细胞单细胞悬液中，4℃，孵育30min，再用1×PBS缓冲液洗涤两遍，最后通过流式细胞仪检测。在排斥模型中，收集各脏器组织中的NKT细胞，统计频率，用流式细胞仪确定了来自排斥模型中的不同器官和组织中的CD4⁺和CD8⁺NKT细胞数。

随着检测时间的推移，0周、4周、8周、12周，各脏器中，即胸腺、脾脏、肝脏、外周血、以及移植的皮片中的NKT细胞数均逐渐增多。从最初第一周的不到0.5％到第十二周时均超过了1％，且均以胸腺中的NKT细胞量最多。排斥模型中，移植皮片中没有检测到NKT细胞，除了第6周时，检测移植皮片的NKT细胞达到0.8％。

CD4⁺NKT细胞和CD8⁺NKT细胞相比之下，排斥模型中的CD8⁺NKT细胞明显增多，超过了总NKT细胞的50％。CD4⁺NKT细胞在第1周时达到80％，随着时间的推移，CD4⁺NKT细胞逐渐减少，到12周时还未达到总NKT细胞的50％。因此，排斥模型中，出现的NKT细胞以CD8⁺NKT细胞为主。

2)检测耐受模型中CD4⁺NKT细胞和CD8⁺NKT细胞中趋化因子CXCR6⁺和CCR9⁺的表达。使用抗TCRβ单克隆抗体，α-GalCer-CD1d四聚体，抗CD4⁺单克隆抗体，抗CD8⁺单克隆抗体，抗人趋化因子受体单克隆抗体(R&D SystemsEurope Ltd.Abingdon，UK)。首先用含有2％的BSA及0.1％叠氮化钠的1×PBS缓冲液将收集好的淋巴细胞制成单细胞悬液，再将以上五种抗体一起加入淋巴细胞单细胞悬液中孵育，4℃，30min，最后再用1×PBS缓冲液洗涤两遍，流式细胞仪检测。

排斥模型中，胸腺中的CD4⁺NKT细胞的趋化因子CXCR6⁺的表达73％而CCR9⁺的表达仅为5％，脾脏中的CD4⁺NKT细胞的趋化因子CXCR6⁺的表达为69％而CCR9⁺的表达为9％。胸腺中的CD8⁺NKT细胞CXCR6⁺的表达<2％而CCR9⁺的表达高达89％，脾脏中的CD8⁺NKT细胞CXCR6⁺的表达仅为6％而CCR9⁺的表达85％。因此，在排斥模型中，CD8⁺NKT细胞的CCR9⁺的基因表达增强。

3)检测排斥模型中NKT细胞内细胞因子。操作步骤：将提取出来的NKT细胞用1×PBS缓冲液洗涤两遍，再使用Interprep(Coulter-ImmunoTech)根据产品说明书作固定和透化处理。使用小鼠抗人细胞因子单克隆抗体(R&D SystemsEurope Ltd.Abingdon，UK)，孵育，室温下，15min。再将细胞用1×PBS缓冲液洗涤两遍后用羊抗鼠多克隆抗体(R&D Systems Europe Ltd.Abingdon，UK)，孵育，室温下，15min。再用1×PBS缓冲液洗涤细胞两遍，使用抗TCRβ单克隆抗体、α-GalCer-CD1d四聚体，孵育，4℃，15min。最后，再用1×PBS缓冲液洗涤细胞，用含0.5％(体积分数)甲醛的1×PBS缓冲液固定，流式细胞仪检测。

排斥模型中，CD4⁺NKT细胞表达的IFN-γ、IL-4、IL-10分别为3％、5％、4％；而CD8⁺NKT细胞表达的IFN-γ、IL-4、IL-10分别为15％、4％、3％。因此，在排斥模型中，CD8⁺NKT细胞高表达IFN-γ。

Claims (3)

1、一种HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型的构建方法，步骤如下：

A、选取6-8周的雌性Nod-SCID小鼠，在细胞移植前4个小时，对每只SCID小鼠进行放射线全身照射，照射剂量为200-350cGy；

B、制备人胚胎胸腺细胞：人胚胎来源于孕龄小于24周的自愿终止妊娠者的胚胎，细胞HLA分型为HLA-B8⁺/HLA-DQ5⁺，自胚胎中剥离胸腺组织，去除被膜，生理盐水洗涤，将组织剪成碎块，用RPMI-1640培养液洗涤，往胸腺碎块中加入RPMI-1640培养液，搅拌20min，研磨分散细胞，在研磨过程中用RPMI-1640培养基冲洗，过200目筛网，收集筛下滤过物，再将滤过物用RPMI-1640培养基洗涤，离心，收集此细胞为胸腺细胞，收集筛网上残余的胸腺组织碎片，加入胶原酶-中性蛋白酶溶液在37℃温箱中消化三遍，每遍20min，再加入EDTA-胰酶在37℃温箱中继续消化三遍，每遍15min，最后加入RPMI-1640培养基重悬细胞，过200目筛网，收集筛下滤过物，为胸腺上皮细胞及其它基质细胞，洗涤，离心，收集细胞，按数量比例为1：1混合胸腺细胞和胸腺上皮细胞并收集，最后用α-GalCer-CD1d四聚体通过流式细胞仪将成熟与未成熟NKT细胞特异性清除；

C、将步骤B中得到的人胚胎胸腺细胞用1×PBS缓冲液制成单细胞悬液直接皮下注射至SCID小鼠的胸腺内，SCID小鼠取仰卧体位，在皮肤上作一个4-5mm的横切口，切口位于第二肋间隙处，垂直于胸骨，位于SCID小鼠两前臂连接的遐想线上，注射针经胸骨一旁的肋间隙进入到胸腺叶，进针角度为注射针针头与胸骨成30°-40°，缝合，关闭创口；

D、制备人胚胎躯干部全厚层皮肤：皮肤来源于孕龄小于24周的自愿终止妊娠者的胚胎，HLA分型为HLA-A2⁺/HLA-DRB1⁺，自妊娠者取出人胚，消毒，铺单，剪下人胚胎躯干部全厚层皮肤置于含1×PBS缓冲液的培养皿中，并用镊子剥去皮肤上的脂肪组织，此步骤至少重复2-5次，直到脂肪组织完全被剔除，最后将剪下的躯干部全层皮肤切成统一大小的移植片，置于4℃预冷的生理盐水中待移植；

E、将步骤D中制备好的人胚躯干部全厚层皮肤移植至步骤C中己注射了人胚胎胸腺细胞的SCID小鼠中，得到人鼠嵌合模型humanizedskin-allograft-transplanted human-thymus-SCID chimera。

2、权利要求1中所述的一种HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型的耐受模型中的应用。

3、权利要求1中所述的一种HSAT H-T-S人鼠嵌合体模型的排斥模型中的应用。

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