CN114340644A - 确定培养的胸腺组织用于植入至人中的适合性的方法及其相关使用方法 - Google Patents

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Abstract

用于促进接受者对实体器官移植物的供体特异性耐受性和免疫能力的方法和组合物，其通过以下进行：在需要实体器官移植的接受者中植入同种异体实体器官，并且还包括在来自供体的实体器官的接受者中手术植入组织工程化的同种异体培养的出生后胸腺组织产品。产生适于植入至人中的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的方法；培养适于植入至人中的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的方法；以及通过植入人受试者中来使用同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的方法。

Description

确定培养的胸腺组织用于植入至人中的适合性的方法及其相 关使用方法
技术领域
可用于确定T细胞耗尽的培养的小儿胸腺组织(也称为同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品(或有时为“CTT”))，其用于在患有胸腺障碍的受试者中植入和T细胞重建的活力和适合性的生物标志物，所述胸腺障碍包括先天性无胸腺症和由于胸腺障碍引起的其他免疫系统功能障碍。用于在接受来自供体的同种异体实体器官移植物的接受者中促进对同种异体实体器官移植物的供体特异性耐受性的方法和组合物。
背景技术
器官移植需要从供体制备并收获人实体器官且移植至接受者中。实体器官移植的主要问题是接受者对供体不耐受。接受者T细胞将排斥器官，且接受者B细胞将对器官产生抗体，从而导致器官最终衰竭。实体器官移植的精髓是产生接受者对移植的人体器官的耐受性。据估计，美国每年进行超过36000例器官移植，且欧洲和其他主要国家的器官移植数量更多。进一步估计，美国在器官移植的等待名单上有超过120000名患者。对健康器官的需求大大超过合适器官的供应。在2018年，鉴定了约10000名供体。见https://optn.transplant.hrsa.gov。
移植排斥是实体器官移植中的重大挑战。T细胞和B细胞两者的移植排斥都可能导致器官功能的严重并发症，或甚至导致移植失败。例如，5年移植存活率对于心脏移植为77.7％，对于肾脏移植为78.6％，对于肝脏移植为72.8％且对于肺移植为53.4％。通常，已通过供体和接受者的主要组织相容性复合物(MHC)抗原匹配以及通过避免对接受者组织类型具有抗体的接受者来部分解决了此问题。此外，使用免疫抑制方案来管理移植排斥背后的免疫学应答也得到了改善。然而，尚未实现耐受性，并且许多器官的平均存活期仅为10年。
在植入程序之前和期间保持器官活力是第二个重大挑战。器官的移除、储存和移植可能深刻影响器官的内部结构和功能，并且可能显著影响移植完成后延迟或阻止正常器官功能恢复的程度。
实体人体器官可以被有效保存的时间段因器官而异，其中肾脏在24-36小时的范围内，胰腺在12-18小时的范围内，肝脏在8-12小时的范围内且心脏和肺在4-6小时的范围内。见https://unos.org/transplantation/matching-organs。
器官损伤主要由于局部缺血和体温过低而发生，但也可能与离体或植入期间器官的再灌注相关。
用于器官保存的技术(包括离体灌注)在本领域中是已知的，并且用于使器官损伤最小化并促进最佳的移植物存活和功能。
已经成为移植程序的主题的主要实体器官包括肾脏、肝脏、心脏和肺。在成功地移植这些实体器官方面取得了不同程度的成功。主要的可变性在于用于干扰免疫介导的移植排斥的技术。经验已显示，没有一种单一的免疫抑制剂或技术可用于涉及实体器官移植的所有环境。限制因素通常在于与每种单独的免疫抑制剂相关联的毒性。与给定的免疫抑制剂相关联的毒性可能经常阻碍移植的实体器官或其他器官(诸如肾脏)的正常功能，当使用钙调神经磷酸酶抑制剂预防排斥时，这些器官可能衰竭。
通常用于预防实体器官移植物中的移植排斥的已知免疫抑制剂相关联的毒性缺点提出了寻找新的方法来预防实体器官移植物的移植排斥的需要。
区分自身和非自身抗原的能力是免疫应答的关键。这种区分导致自身耐受性。当失去自身耐受性时，就会产生自身免疫。在移植程序中存在诱导对实体器官移植物的耐受性的尚未满足的需要。
对于患有胸腺障碍(包括先天性无胸腺症和由于胸腺障碍引起的其他免疫系统功能障碍)的受试者中的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，在植入程序之前和期间保持胸腺组织的活力是实践本公开的各个方面和实施方式中的重要因素。
胸腺是产生可以对外来抗原和病原体适当地做出应答，同时避免损害自反应性的T细胞所必需的。
胸腺在婴儿期中很大(由于其需要建立初始的T细胞组库)，但很快变为稳态，之后是在整个成年期持续退化的缓慢过程。在过去二十至三十年内的工作已确立，虽然成人胸腺的总产量减少，但所述器官对产生具有新颖特异性的T细胞仍然至关重要，所述T细胞可以保护免受感染性疾病或癌症，并且在免疫侵害(诸如放射、化学疗法)和一些感染(诸如人免疫缺陷病毒(HIV))后再增殖组库(Gruver等人，2007；Palmer等人，2018；Sun等人，2016；Wickemeyer和Sekhsaria 2014)。因此，最近的关注已集中于在成人中鉴定管控年龄相关胸腺退化的机制和在免疫损伤后促进胸腺再生的方法。
人的年龄相关胸腺退化的特征在于产生胸腺细胞的丧失和胸腺上皮细胞数量的减少，其中胸腺实质被脂肪组织置换。确定驱动这些变化的机制是胸腺内在的还是胸腺外在的难以使用动物模型来解决(由于向和从胸腺的恒定运输)，并且通常不可能在活人中解决这些问题。
来源于更年轻供体的胸腺组织的器官培养物可用于评价这些问题，因为人胸腺切片的体外培养物导致胸腺细胞的耗尽，同时基本上保持胸腺上皮细胞和基质细胞的活力和功能。这通过这些切片生长出单层(Markert等人，1997b)并在植入至先天性无胸腺接受者中时促进T细胞重建(Davies等人，2017；Davis等人，1997；Markert等人，2004；Markert等人，1999；Markert等人，2007；Markert等人，2010；Markert等人，1997a；Markert等人，2011；Markert等人，2003)的能力得到证明。我们假设在胸腺器官培养过程中发生的胸腺细胞的丧失可以模拟急性和慢性退化，并且有助于鉴定在衰老期间驱动胸腺微环境变化的机制。
已经显示，同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品可用于治疗由先天性无胸腺症引起的T细胞免疫缺陷(原发性免疫缺陷)，例如可用于治疗与22q11.2缺失相关联的完全DiGeorge异常(cDGA)和与chd7(染色质结构域-解旋酶-DNA结合蛋白7)基因中的突变相关联的CHARGE(缺损、心脏缺陷、鼻后孔闭锁、生长或智力迟钝、生殖器发育不全和耳朵异常或耳聋)综合征以及患有叉头盒蛋白N1(FOXN1)缺乏的无胸腺患者。先天性无胸腺症是一种罕见的致命病症，并且目前尚无利用监管批准的药物产品进行的药物治疗选择。
保留胸腺上皮细胞(TEC)的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的实验性植入已成功应用于治疗患有先天性无胸腺症的小儿患者(Markert ML,Devlin BH,McCarthyEA,2010,“Thymus transplantation,”Clin Immunol.,135(2):236-46；Markert ML等人,2004,“Postnatal thymus transplantation with immunosuppression as treatmentfor DiGeorge syndrome,”Blood 104(8):2574-2581；Markert ML等人,1999,“Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge syndrome,”N c J Med341(16):1180-1189 27)。
在该参考文献中，DiGeorge综合征被定义为在心脏、胸腺和甲状旁腺中存在可变缺陷的病症。大约1％的患有DiGeorge综合征的婴儿患有无胸腺症，并因此无法产生成熟且抵抗感染的幼稚T细胞。据说这些婴儿患有完全DiGeorge综合征。不旨在为包含性的，存在满足完全DiGeorge综合征、22q11.2缺失综合征CHARGE、糖尿病母亲的婴儿以及无症状或无遗传缺陷的婴儿的标准的儿童亚组。先天性无胸腺症还可能与TBX1或TBX2基因中的突变相关联。
将同种异体的培养的出生后胸腺组织来源的产品是组织工程化的产品，将其制备、培养并储存至多21天(例如，约6至约21天的培养方案)以产生部分T细胞耗尽的胸腺组织切片，并且所述产品通过调理过程与天然胸腺有所区别。调理方案从培养的胸腺组织切片中部分耗尽供体胸腺细胞。基于体外数据(免疫组织化学)，在6与21天之间的培养时段保存上皮网络，如使用细胞角蛋白抗体评估的。优选地在37℃下在5％CO2培养箱中进行培养。
培养过程按以下方式显著改变供体胸腺组织和其中包含的组成细胞的生物学特征，以优化同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品切片的有效治疗特性。培养过程确保以适于手术植入至受试者体内以使得能够重建受试者的免疫系统的方式获得具有先决生物学特征的培养细胞/组织的确定组成。
培养过程导致胸腺细胞的丧失以及供体胸腺组织切片中TEC和其他基质细胞的相对富集。培养过程进一步导致胸腺细胞耗尽并维持TEC以使得能够重建接受者的免疫系统，并且允许在接受者中对供体胸腺中的HLA抗原产生耐受性。总的来说，培养过程被设计成从供体胸腺组织中耗尽许多胸腺细胞并保存胸腺基质(胸腺上皮细胞和成纤维细胞)的功能结构。从干细胞发育的常见淋巴样祖细胞迁移至胸腺并且作为胸腺定居祖细胞进入胸腺。
培养过程描述于WO2019/165197A1,Cultured Thymus Tissue TransplantationPromotes Donor-Specific Tolerance to Allogeneic Solid Organ Transplants,Markert,M.L.中，所述文献据此通过引用整体并入。对同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品切片的合适性的分析描述于PCT/US2019/040275中，所述文献通过引用整体并入本文。
在无胸腺患者中手术施用同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品(例如，也称为“RVT-802”)导致一系列事件，从而导致功能性免疫系统的发育。将同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品手术放置在接受者中后，T细胞由供体TEC和接受者树突状细胞(DC)驯化。供体TEC与接受者DC结合使得能够耐受作为培养的胸腺组织切片而植入的植入供体胸腺组织。这与正常胸腺中的耐受性诱导相同。供体TEC与接受者DC结合导致对自身的耐受性。
通过同种异体移植物活检和外围中存在接受者幼稚T细胞已证明了植入供体胸腺组织中的胸腺生成(thymopoiesis)(Markert ML,2010；Markert ML等人,2008,“Use ofallograft biopsies to assess thymopoiesis after thymus transplantation,”JImmunol 180(9):6354-6364；Markert ML等人,2007,“Review of 54patients withcomplete DiGeorge anomaly enrolled in protocols for thymus transplantation:outcome of 44 consecutive transplants,”Blood 109(10):4539-454728)，所述文献通过引用并入本文。
对用研究性同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品治疗的儿童的研究显示，混合淋巴细胞反应对供体主要组织相容性复合物(MHC)显示出耐受性(Chinn IK,Devlin BH,Li YJ和Markert ML,2008,“Long-term tolerance to allogeneic thymus transplantsin complete DiGeorge anomaly,”Clin Immunol 126(3):277-281)。此外，在同种异体培养的出生后胸腺组织来源移植后，患有先天性无胸腺症的婴儿能够控制感染，诸如爱泼斯坦-巴尔病毒(Markert ML,2014,Thymus Transplantation.Stiehm’s ImmuneDeficiencies,Sullivan KE和Stiehm ER编辑(Academic Press),第1版,第1059-1067页。
在历史上，同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品放行标准包括了对在生产过程的中间点(其在后面精修为培养期的第6-21天)的H&E和免疫染色组织切片的组织病理学评价。此组织病理学评价充当了效力测定，并且已经由委员会认证的病理学家作为定性分析进行。通过冷冻或福尔马林固定，然后将在组织切片进行切片且然后固定至载玻片上来制备样品用于评价。以此方式制备的样品在长时间段内是稳定的，从而允许进行重新分析。
可以将从20多年的发展史获得的历史样品与阳性临床结果关联，并且由此为开发用于评价产品质量的定量组织学测定提供强大的数据集。
使用来自同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的先前临床批次和来自其实验性批次的扫描图像开发新型数字组织学测定。分析这些图像以便开发为定量测定。数字组织学测定更完整地描述于PCT/US2019/040275中。
响应于化学引诱剂细胞因子(趋化因子)和其他可溶性分子的细胞迁移是调控胸腺功能的至关重要但不太直观的机制(Hu等人，2015)。早期胸腺细胞祖细胞在趋化因子梯度的影响下从骨髓迁移至胸腺。趋化因子梯度也影响其在胸腺内的迁移。早期胸腺细胞祖细胞及其CD4-/CD8-双重阴性(DN)子代与皮质胸腺上皮细胞相互作用，分化为CD4+/CD8+双重阳性(DP)胸腺细胞，并且然后对其进行阳性选择以分化为迁移至胸腺髓质的CD4+或CD8+单阳性胸腺细胞(Lancaster，2018)。通过阴性选择缺失自反应性细胞之后，将所得的幼稚成熟T细胞释放至外周中。
虽然有将同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品植入在患有先天性无胸腺症的儿童中的前述成功，但仍需要鉴定可存活、有功能性且适于植入以便实现免疫重建的培养的胸腺组织。
发明内容
实现供体特异性免疫耐受性仍然是移植中的最终免疫学目标。当前大多数方法集中于通过耗尽(例如阿仑单抗(alemtuzumab)、胸腺球蛋白等)或抑制(例如钙调神经磷酸酶抑制剂、巴利昔单抗等)来控制外周成熟供体反应性T细胞，而不靶向胸腺中的同种反应性T细胞的产生。然而，即使免疫抑制药物和新型免疫调节方案取得了巨大进步，移植耐受性仍未一致地实现。
本发明人已显示，可以通过以下方式实现对实体器官移植物的耐受性：在切除胸腺的接受者中植入同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品(在本文中也称为“CTT”或“RVT-802”)，以缩短移植后免疫抑制剂的使用时间，从而防止移植器官的排斥。移除接受者的胸腺并替换同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品使得重建实体器官接受者的免疫系统，并且对接受者自身以及移植的同种异体实体器官产生耐受性。
通过同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的手术插入的耐受性诱导类似于造血干细胞移植中经由供体树突状细胞(“DC”)进行的耐受性诱导(Sharabi Y和Sachs DH,1989,“Mixed chimerism and permanent specific transplantation toleranceinduced by a nonlethal preparative regimen,”J Exp Med 169(2):493-502；ManilayJO,Pearson DA,Sergio JJ,Swensonkg和Sykes M,1998,“Intrathymic deletion ofalloreactive T cells in mixed bone marrow chimeras prepared with anonmyeloablative conditioning regimen,”Transplantation 66(1):96-102.)。由移植生物学研究中心(Transplantation Biology Research Center)(TBRC，波士顿，马萨诸塞州)进行的一系列研究显示出胸腺在耐受性诱导中的关键作用(Yamada K等人,1997,“Roleof the thymus in transplantation tolerance in miniature swine.I.Requirementof the thymus for rapid and stable induction of tolerance to class I-mismatched renal allografts,”J Exp Med 186(4):497-506)，并且在大型动物模型中测试了具有耐受性诱导的胸腺移植(Yamada K等人,2000,“Thymic transplantation inminiature swine.II.Induction of tolerance by transplantation of compositethymokidneys to thymectomized recipients,”J Immunol 164(6):3079-3086；5；YamadaK等人,2003,“Thymic transplantation in miniature swine:III.Induction oftolerance by transplantation of composite thymokidneys across fully majorhistocompatibility complex-mismatched barriers,”Transplantation 76(3):530-536；Nobori S等人,2006,“Thymic rejuvenation and the induction of tolerance byadult thymic grafts,”Proc Natl Acad Sci U S A 103(50):19081-19086。在他们的一系列研究中，该小组成功地使用了HLA II类匹配/I类错配的供体(胸腺和肾脏或心脏)作为胸腺复合组织(胸腺肾和胸腺心脏)，其中12天的环孢霉素(“CsA”)用于移植物耐受性诱导。他们声称未血管化胸腺在其模型中未诱导耐受性。然而，更准确地说，未培养的非血管化胸腺不能长期移植。正如他们所指出的那样，未培养的胸腺的移植失败可能是由于同种免疫力以外的缺血性损伤所致(Yamada K等人,2000)。在不使用异种移植的情况下，这种在移植前产生血管化胸腺以诱导耐受性的巧妙概念将难转化为临床。(Kwun,Jean,Li,Jie,Rouse,Clay,Park,Jae Berm,Farris,Alton B.,Kuchibhatla,Maragatha,Turek,JosephW.Knechtle,Stuart J.Kirk,Allan D.和Markert,M Louise,Cultured thymus tissueimplantation promotes donor-specific tolerance to allogeneic hearttransplants,JCI Insight.2020年6月4日；5(11):e129983.doi:10.1172/jci.insight.129983)。
可以通过培养系统以及T细胞耗尽来克服非血管化胸腺移植的局限性。保留TEC的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品(CTT)的实验性移植已成功应用于治疗患有先天性无胸腺症的小儿患者(Markert ML,Devlin BH,McCarthy EA,2010,“Thymustransplantation,”Clin Immunol.,135(2):236-46；Markert ML等人,2004,“Postnatalthymus transplantation with immunosuppression as treatment for DiGeorgesyndrome,”Blood 104(8):2574-2581；Markert ML等人,1999,“Transplantation ofthymus tissue in complete DiGeorge syndrome,”N Engl J Med 341(16):1180-118927)。
在前述参考文献中，DiGeorge综合征被定义为在心脏、胸腺和甲状旁腺中存在可变缺陷的病症。大约1％的患有DiGeorge综合征的婴儿患有无胸腺症，并且因此没有T细胞来抵抗感染。据说这些婴儿患有完全DiGeorge综合征。存在满足完全DiGeorge综合征、22q11.2缺失综合征CHARGE、糖尿病母亲的婴儿以及无症状或无遗传缺陷的婴儿的标准的4个儿童亚组。在所有四个组中，患有无胸腺症的婴儿仅占很小的一组，可能占携带诊断(诸如22q11.2缺失综合征的诊断)的儿童总数的1％。
通过同种异体移植物活检和外围中存在接受者幼稚T细胞已经证明了胸腺生成(Markert ML,2010；Markert ML等人,2008,“Use of allograft biopsies to assessthymopoiesis after thymus transplantation,”J Immunol 180(9):6354-6364；MarkertML等人,2007,“Review of 54patients with complete DiGeorge anomaly enrolled inprotocols for thymus transplantation:outcome of 44 consecutive transplants,”Blood 109(10):4539-454728)。对用研究性CTT治疗的儿童的研究显示，混合淋巴细胞反应对供体MHC显示出耐受性(Chinn IK,Devlin BH,Li YJ和Markert ML,2008,“Long-termtolerance to allogeneic thymus transplants in complete DiGeorge anomaly,”ClinImmunol 126(3):277-281)。此外，在CTT植入后，患有先天性无胸腺症的婴儿能够控制感染，诸如爱泼斯坦-巴尔病毒(Markert ML,2014,Thymus Transplantation.Stiehm’sImmune Deficiences,Sullivan KE和Stiehm ER编辑(Academic Press),第1版,第1059-1067页)。基于在患有先天性无胸腺症的人中的这些数据，确定在手术插入在接受者中之后，表达实体器官供体的MHC的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品将对自身和供体两者均产生耐受性，同时产生将保护接受者免受感染的功能性T细胞。
胸腺和胸腺细胞的驯化。(Kwun,Jean,Li,Jie,Rouse,Clay,Park,Jae Berm,Farris,Alton B.,Kuchibhatla,Maragatha,Turek,Joseph W.Knechtle,Stuart J.Kirk,Allan D.和Markert,M Louise,Cultured thymus tissue implantation promotesdonor-specific tolerance to allogeneic heart transplants,JCI Insight.2020年6月4日；5(11):e129983.doi:10.1172/jci.insight.129983。
胸腺通常位于心脏的顶部。胸腺为T细胞发育提供了必要的微环境，并且对于建立和维持适应性免疫系统至关重要(Boehm T和Takahama Y,2014,Thymic Development andSelection of T Lymphocytes.Heidelberg:Springer-Verlag)。在出生后的发育过程中，胸腺驯化造血干细胞从骨髓迁移至胸腺。祖干细胞定植于胸腺，从而形成胸腺细胞。此后，胸腺细胞经历一系列成熟步骤。这通过胸腺细胞上显现的多种可观察到的细胞表面标志物的表达来证明。
T细胞对于保护身体免受感染至关重要。在正常起作用的胸腺中发育的T细胞发育出多种多样的T细胞受体(通常是细胞表面上的蛋白质)，这使得成熟的T细胞能够抵抗广泛多种的感染。在这种驯化过程中，胸腺指示发育中的T细胞不要攻击身体的正常蛋白质，诸如胰岛素或甲状旁腺激素(二者调节血液中的葡萄糖和钙的水平)。这些指示是在自身免疫调控基因(“AIRE基因”)的影响下进行的。
简而言之，驯化过程发生在正常起作用的胸腺中。胸腺中存在的胸腺细胞是由骨髓干细胞形成的。被位于胸腺内的胸腺上皮细胞(“TEC”)和树突状细胞(“DC”)教导不要攻击接受者的主要组织相容性复合物(MHC)蛋白(抗原)，诸如HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DQA1、HLA-DPB1、HLA-DPA1抗原。HLA抗原具有将自身肽保持在槽中的2种蛋白质。自身肽可以来自甲状腺蛋白或胰岛素肽或体内表达的几乎任何其他蛋白。在胸腺中发育的胸腺细胞形成由两种跨膜的蛋白质构成的T细胞受体(TCR)。TCR在T细胞的细胞表面上表达。每个T细胞表达其独特TCR的许多拷贝。如果TCR与树突状细胞上的自身肽:MHC结合过于紧密，则树突状细胞提供信号以使T细胞经历细胞凋亡并死亡。这种机制阻止了对自身产生自身免疫。TEC还可以向胸腺细胞提供它们结合过于紧密的信号。最后，DC可以从TEC捕获膜的一部分，并且将TEC自身肽:MHC呈递给发育中的胸腺细胞。如果胸腺细胞结合得太紧，则DC会发送信号，使胸腺细胞发生凋亡并死亡。通过这些机制，离开胸腺的T细胞不是自身反应性的。离开胸腺的T细胞变化很大，并且可以识别感染，但其不攻击身体的蛋白质。
胸腺的两个主要成分是上皮细胞和以下列方式在胸腺中产生的胸腺细胞。来源于骨髓干细胞的细胞(常见的淋巴样祖细胞(“CLP”))迁移至胸腺以作为早期胸腺祖细胞。CLP响应由胸腺上皮细胞和内皮细胞产生的信号(趋化因子)而进入胸腺。在胸腺中，CLP分化为胸腺细胞并增殖。胸腺细胞产生在细胞表面上表达的独特的T细胞受体(“TCR”)。胸腺细胞还开始表达T细胞分子CD3、CD4和CD8。广大多样性的T细胞产生，从而使得细胞能够在接受者的整个生命中对感染做出应答。混合淋巴细胞反应显示出在用培养的胸腺组织(RVT-802)治疗的儿童中接受者T细胞对胸腺供体的MHC的耐受性。
自身反应性接受者胸腺细胞在离开胸腺之前被删除。这是通过接受者胸腺细胞与迁移至胸腺的接受者DC的相互作用而发生的。作为保护身体免受自身免疫性疾病的措施，在与DC结合过于紧密的接受者胸腺细胞中诱导细胞凋亡。在该过程完成后，胸腺细胞离开胸腺。新的循环性T细胞(即胸腺新迁出细胞)表达标志物CD31、CD45RA和CD62L。在数周后，不再表达CD31标志物。表达CD45RA和CD62L的T细胞称为幼稚T细胞。这些接受者T细胞响应于有丝分裂原而正常增殖。其可以保护接受者免受感染，而不会对自身产生自反应性。
同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品。
已经显示，同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品可用于治疗由先天性无胸腺症引起的T细胞免疫缺陷(原发性免疫缺陷)。由无胸腺症引起的T细胞免疫缺陷与阻止功能性胸腺发育的先天性障碍相关联，所述先天性障碍诸如与22q11.2缺失相关联的完全DiGeorge异常(cDGA)和与chd7(染色质结构域-解旋酶-DNA结合蛋白7)基因中的突变相关联的CHARGE(缺损、心脏缺陷、鼻后孔闭锁、生长或智力迟钝、生殖器发育不全和耳朵异常或耳聋)综合征以及患有叉头盒蛋白N1(FOXN1)缺乏的无胸腺患者。引起无胸腺症的其他基因缺陷包括TBX1、TBX2、PAX1和脑信号蛋白3E(SEMA3E)，以及Bernstock,Joshua D,Totten,AH和Atkinson,T.Prescott,“Recurrent microdeletions at chromosome 2p11.2,”Bernstock,Joshua D,Totten,AH和Atkinson,T.Prescott,JACI 145:358-367。先天性无胸腺症是一种罕见的致命病症，并且目前尚无利用监管批准的药物产品进行的药物治疗选择。如果不治疗，并且不对儿童的免疫系统进行治疗性重建，则由于先天性无胸腺症所引起的主要免疫缺陷是致命的，几乎所有婴儿都在三岁之前死亡，多数常常是由于严重感染而死亡。
同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是组织工程化产品。基于本说明书和实施例中的公开，预期CTT可用于在接受移植的实体器官的接受者中产生耐受性。
如在本说明书和实施例中更充分描述的，在无胸腺患者中手术施用同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品(例如，“RVT-802”)导致一系列事件，从而导致功能性免疫系统的发育。将同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品(例如，RVT-802)手术放置在接受者中后，T细胞由供体TEC和接受者DC驯化。供体TEC与接受者DC结合使得能够耐受作为培养的胸腺组织切片而植入的植入供体胸腺组织。这与正常胸腺中的耐受性诱导相同。如本说明书中所述，接受者TEC与接受者DC结合导致对自身的耐受性。
这种复杂的过程已经临床上显示出导致接受同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品(例如，RVT-802)的患有先天性无胸腺症的患者的存活率>70％(Markert ML,DevlinBH,Alexieff MJ,Li J,McCarthy EA,Gupton SE等人,2007,“Review of 54patients withcomplete DiGeorge anomaly enrolled in protocols for thymus transplantation:outcome of 44 consecutive transplants,”Blood,109(10):4539-47；Markert ML,Devlin BH,McCarthy EA.Thymus transplantation.2010,Clin.Immunol.135(2):236-46)。接受者能够控制在CTT之前可能致命的病毒感染，诸如爱泼斯坦-巴尔病毒(Chinn IK,Devlin BH,Li YJ和Markert ML,2008)。
实体器官移植物中的耐受性诱导与CTT植入的组合的概述
根据本说明书的描述、附图、实施例和权利要求，诸位发明人已经证明，CTT在大鼠心脏移植模型中诱导供体特异性耐受性。本文报告的实验使用了可比较的CTT移植方法，所述方法已经在患有先天性无胸腺症的受试者(诸如受cDGA困扰的受试者)中临床使用。在术放置CTT之前，cDGA婴儿基本上没有幼稚T细胞。在手术放置CTT后，婴儿在手术程序后大约6个月发育出幼稚T细胞。(Markert ML等人,2004,“Postnatal thymus transplantationwith immunosuppression as treatment for DiGeorge syndrome,”Blood 104(8):2574-2581；Markert ML,Devlin BH和McCarthy EA,2010,“Thymus transplantation,”ClinImmunol 135(2):236-246)。在大鼠模型中诱导耐受性的研究是基于对1993年至2017年在患有完全DiGeorge异常的无胸腺婴儿中移植同种异体出生后培养的胸腺组织来源产品(CTT)的研究的结果。在患有先天性无胸腺症的婴儿中手术放置CTT的报道研究中获得了有利结果。已发表的结果显示，在此原本致命的情况下，总体存活率为71％(61/86)(在此评估时基本上所有死亡发生在前9-12个月；中值11.7年，范围为1.2年至25年)(Markert,ML等人，2010)。植入的培养的胸腺组织的活检已经在免疫组织化学上证明了胸腺生成(Markert,ML等人,2008)。流式细胞术和光谱分型已经显示出多样化的T细胞组库的发育。混合淋巴细胞反应显示出接受者T细胞对胸腺供体的抗原呈递细胞的耐受性(Chinn IK,Devlin BH,Li YJ和Markert ML,2008)。
重要的是，CTT的接受者能够控制在CTT之前可能致命的病毒感染，诸如爱泼斯坦-巴尔病毒(Markert,ML,2014,Thymus Transplantation.Stiehm’s Immune DeficiencesSullivan KE和Stiehm ER编辑(Academic Press),第1版第1059-1067页)。基于显示出对不匹配的胸腺MHC抗原的耐受性的这些人数据，针对CTT在大鼠心脏移植模型中诱导供体特异性耐受性的能力，使用临床上使用的相同方法评价了CTT在大鼠模型中的植入。这些研究显示，将不匹配的心脏与表达心脏供体的MHC I类和II类抗原的供体CTT一起移植(通过最初用抗CD5耗尽T细胞并用环孢素进行免疫抑制)诱导对供体心脏的抗原的耐受性，同时保持对其他MHC抗原的同种异体反应性。
本发明证实了供体胸腺与实体器官的共移植作为针对接受者中移植的实体器官的耐受性诱导的方法。将从程序中受益最大的患者群体是患有心力衰竭的成年人以及需要心脏移植的婴儿。由于存在出生后胸腺组织，并且可以将其从死亡婴儿中移除，并且从经历心脏移植的婴儿中常规移除接受者胸腺，因此除了培养的胸腺组织移植(CTT)外，不需要另外的程序来将该方法转移至临床。类似的移植也可以在成人中进行。
同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的制备的概述
将同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品制备、培养并且储存至多21天(例如，约6天至约21天的培养方案)，并且在植入当天，将其放置在单独的无菌杯中以运输至手术室，如本文中更详细描述的。
在现行良好生产规范(current Good Manufacturing Practices)(“cGMP”)(例如，由美国食品药品监督管理局(current Good Manufacturing Practices)(“FDA”)建立的cGMP)下对CTT(培养的胸腺组织)进行无菌处理和培养，以产生部分T细胞耗尽的胸腺组织切片。通过下文详细描述的调理过程，CTT与天然胸腺有所区别。CTT影响植入后胸腺中发育中T细胞的正常阳性选择和阴性选择过程，从而使T细胞能够对供体胸腺和供体实体器官移植物以及接受者组织均具有耐受性。此外，这些T细胞可以在接受者主要组织相容性(MHC)蛋白的背景下识别外来抗原，以便抵抗感染。
施用途径是通过按下文所述的方式手术植入CTT。单次施用通常为每m2接受者体表面积(“BSA”)1000至22000mm2 CTT。所述表面积是所有培养的组织切片的所有表面积的总和。在单次施用手术程序中植入单独的CTT切片。
在无胸腺患者中手术植入同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品导致一系列事件，从而导致功能性免疫系统的发育。(Markert ML,2007；Markert ML等人,2010；Markert ML,Devlin BH,McCarthy EA.Chapter 84 Thymic reconstitution.2013.In:Fleisher TA,Shearer WT,Schroeder HW,Frew AJ,Weyand CM,editors.ClinicalImmunology(第四版).London；第1032-8页)。
接受者的骨髓CLP迁移至供体胸腺移植物、作为早期胸腺祖细胞进入并且在那里发育成接受者T细胞。供体胸腺移植物提供了微环境，其中接受者胸腺细胞产生了能够识别病原体的广泛的TCR组库。
接受者DC迁移至供体胸腺耗尽自身反应性接受者胸腺细胞，在新的T细胞离开胸腺并进入循环后，所述自身反应性接受者胸腺细胞会攻击接受者的组织。遗传上接受的幼稚T细胞在施用后大约5-12个月可在循环系统中容易检测出。这些接受者T细胞具有多样化TCR组库，并且响应于有丝分裂原而正常增殖。其可以保护接受者免受感染，而不会对自身产生自反应性。
接受者骨髓CLP迁移至胸腺同种异体移植物，在其中它们发育成接受者T细胞。已经迁移至供体胸腺的接受者DC的阴性选择导致对接受者MHC抗原的耐受性。在移植后大约2-3个月内获取的植入的培养的胸腺组织的活检中观察到胸腺生成的免疫组织化学迹象。胸腺生成反映了T细胞防御和控制感染以及预防自身免疫性疾病的能力。
在移植后5-12个月的循环中检测到幼稚T细胞，从而产生防御和控制感染以及预防自身免疫性疾病的能力。
首先显示出培养的胸腺组织的植入在治疗由先天性无胸腺症引起的原发性免疫缺陷方面是有益的，所述先天性无胸腺症与诸如完全DiGeorge异常(cDGA)或叉头盒蛋白N1(FOXN1)缺乏的病症相关联。发现，用培养后的正常胸腺组织(例如CTT和RVT-802)置换有缺陷的胸腺组织还可以消除在移植的实体器官接受者中观察到的耐受性缺乏。
通过放置培养的胸腺组织来治疗先天性无胸腺症的基础的非临床和临床工作导致以下认识：在患者中放置CTT(例如，RVT-802)可能允许对移植的实体器官产生耐受性。具体地，如果在植入表达供体器官的MHC的CTT之前首先对受试者进行胸腺切除和免疫抑制，则CTT的放置将重建免疫系统并诱导对供体器官的耐受性。
对与胸腺的细胞组分相关联的某些标志物的表达和分布的测量建立了离体培养胸腺组织后的表型。本说明书和实施例中描述的培养条件支持在无胸腺受试者中放置CTT后观察到体内胸腺生成。
重要的是，在将CTT手术放置在无胸腺接受者中之后，幼稚T细胞的发育以及广泛的TCR可变区的存在提供了胸腺组织的培养可以促进功能性内源性T细胞群体的发育的明确证据。此外，在培养过程中在胸腺组织中注意到关键调控基因和结构基因的表达。通过手术插入CTT后3-5个月可以首次检测到循环性幼稚(CD45RA+CD62L+)T细胞。在患有完全DiGeorge异常的患者的治疗中已经注意到这些观察结果(Markert ML,2010；MarkertML.2013)。
文献中关于胸腺组织植入描述的非临床数据与植入同种异体培养的出生后胸腺组织的稳健临床功效相一致，并且支持其在人中的使用。(Markert ML,Watson TJ,KaplanI,Hale LP,Haynes BF,1997,“The human thymic microenvironment during organculture,”Clin Immunol Immunopathol.1月；82(1):26-36；Hong R,Schulte-WissermannH,Jarrett-Toth E,Horowitz SD,Manning DD,1979,“Transplantation of culturedthymic fragments.II.Results in nude mice,”J Exp Med.,149(2):398-415.Li B,LiJ,Hsieh CS,Hale LP,Li YJ,Devlin BH,Markert ML,2009,“Characterization ofcultured thymus tissue used for transplantation with emphasis on promiscuousexpression of thyroid tissue-specific genes,”Immunol Res.2009；44(1-3):71-83；Li B,Li J,Devlin BH,Markert ML,2011,“Thymic microenvironment reconstitutionafter postnatal human thymus transplantation,”Clin Immunol.,9月；140(3):244-59)。
完全DiGeorge异常患者在三个腺体中有缺陷，所述腺体发育在幼胚的颈部、心脏、胸腺和甲状旁腺中。通常地，心脏和胸腺下行至胸部中，并且甲状旁腺调控钙水平，并留在颈部中。用CTT治疗cDGA受试者导致两岁时的存活率为75％，而通过其他方式治疗的受试者的存活率为6％(未发表的数据)。如上所指出，几乎所有死亡都在发育幼稚T细胞前的一年内。(Markert等人,2010)。值得注意的是，CTT植入不影响必须单独管理的心脏和甲状旁腺的问题。
本公开的一个方面提供了用于将同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品手术放置在接受者中以在免疫学正常接受者中诱导对实体器官移植物的耐受性的方法。此类方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：移除具有免疫能力的接受者中的胸腺，随后用诱导免疫抑制方案耗尽所述接受者的T细胞，所述诱导免疫抑制方案包括一种或多种免疫抑制剂，诸如一种或多种抗体和/或一种或多种钙调神经磷酸酶抑制剂。以治疗有效量施用所述诱导免疫抑制方案，从而耗尽受试者中的成熟T细胞和/或抑制所述接受者的T细胞排斥所移植的实体器官。从死亡供体获得合适的实体人体器官和胸腺，并且将所述实体器官移植至所述接受者中。施用维持性免疫抑制方案持续一段时间，以抑制移植排斥。对来自所述死亡供体的胸腺进行调理方案持续至多21天的时段(例如，约6天至约21天的调理方案)，以在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片，从而包含所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品。所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片显示出散布在整个组织中的对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域、至少一个哈索尔小体(Hassall body)的存在、散布在整个组织中的CK14染色以及完整核的存在。然后将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品手术放置在所述接受者中，通常放置在大腿的四头肌中。所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品使所述接受者能够在植入后发育出幼稚T细胞。所有发育的新T细胞都是遗传上接受的，并且对接受者和供体均具有耐受性。胸腺组织切片的剂量为约1000-22000mm2胸腺组织表面积/m2接受者体表面积。植入后，所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述受试者中诱导胸腺生成和耐受性。
以心脏移植为例，所述供体将是死亡供体。在移除心脏的同时将胸腺从供体中移除。立即进行心脏移植，并进行诱导免疫抑制，以减少T细胞数量并抑制剩余的接受者T细胞，从而防止其攻击所述供体心脏。处理所述供体胸腺以形成人同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，在至少约6天至约21天的时段的调理之后，所述产品可用于植入以诱导耐受性。作为预防措施，可以在调理之后将大约一半的所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品冷冻保存，使得如果后面出现心脏排斥问题，需要施用高剂量的类固醇或其他免疫抑制剂来治疗排斥，并且由此非常高剂量的类固醇损害所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，则可以在控制住排斥发作之后，植入所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品。
重要的是，在植入同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品之后，即使存在感染也可以维持免疫耐受性。使用诸如共刺激性阻断的其他方法，病毒感染可以导致耐受性丧失，因为大约三分之一的CD8 T细胞具有同种异体反应性。当激活免疫系统以抵抗感染时，同种异体反应性CD8 T细胞开始排斥实体器官移植物。相比之下，当使用被处理成同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的胸腺组织诱导耐受性时，针对供体的潜在同种异体反应性T细胞通过胸腺中的阴性选择过程被删除。
在一个实施方式中，所述供体胸腺组织与所述接受者中不存在的所述供体器官中的HLA等位基因匹配。所有发育的新T细胞都是遗传上接受的，并且对接受者和供体均具有耐受性。
在本公开的另一个方面，提供了一种用于在需要实体器官移植的接受者中促进对获自死亡供体的同种异体实体器官移植物的供体特异性耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)移除所述接受者的胸腺；
(b)用包括一种或多种免疫抑制剂的诱导免疫抑制方案治疗所述接受者，以耗尽所述接受者的T细胞和/或抑制所述接受者的T细胞排斥所移植的实体器官；
(c)提供来自死亡供体的合适的实体人体器官和胸腺；
(d)将所述实体人体器官移植至所述接受者中；
(e)用维持性免疫抑制方案治疗所述接受者；
(f)提供同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，其中从所述实体器官供体的合适的胸腺组织中获得所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；其中对所述供体胸腺组织进行调理方案持续至多21天的时段(例如，约6天至约21天的调理方案)，以产生同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；进一步地，其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；其中所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片显示出散布在整个组织中的对细胞角蛋白(CK)(使用抗体AE1/AE3)呈阳性的区域、至少一个哈索尔小体的存在、散布在整个组织中的CK14染色以及完整核的存在；以及
(g)在调理方案的约6至约21天后，将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品植入至所述接受者中，其中胸腺组织切片的剂量为约1000-22000mm2胸腺组织表面积/m2接受者体表面积，并且进一步地，其中所述植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述接受者中诱导胸腺生成和耐受性。
在一个实施方式中，提供了在需要死亡供体心脏的接受者中促进对同种异体心脏移植物的供体特异性耐受性的方法。所述方法包括以下步骤：
(a)从所述死亡供体获得合适的人心脏进行移植；
(b)在获得心脏同时移除死亡供体胸腺
以用于调理成同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；其中所述供体胸腺与所述供体移植器官中的HLA等位基因匹配；
(c)用包括一种或多种免疫抑制剂的诱导免疫抑制方案治疗所述接受者以耗尽和/或抑制所述接受者的T细胞，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括在麻醉诱导时和再灌注后施用的糖皮质激素；
(d)将所述心脏移植至所述接受者中；
(e)用包括一种或多种免疫抑制剂的维持性免疫抑制方案治疗所述接受者，持续一段足以防止或抑制所述心脏的移植排斥的时间段，所述一种或多种免疫抑制剂选自由以下组成的组：钙调神经磷酸酶抑制剂、肌苷单磷酸脱氢酶抑制剂和抗胸腺细胞球蛋白；
(f)在第6天至第21天之间，提供同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，其中从所述供体胸腺组织中获得所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；其中对所述供体胸腺组织进行调理方案持续约6天至约21天的时段，以产生同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；进一步地，其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；其中所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片显示出散布在整个组织中的对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域、至少一个哈索尔小体的存在、散布在整个组织中的CK14染色以及完整核的存在；
(g)将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的一部分植入至所述接受者中，其中胸腺组织切片的剂量为约1000-22000mm2胸腺组织表面积/m2接受者体表面积，并且进一步地，其中所述植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述接受者中诱导胸腺生成和耐受性；以及
(h)将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的一部分冷冻保存，以便在以下事件中在所述接受者中使用：出现早期排斥发作，从而需要高剂量的类固醇，所述高剂量的类固醇将损害在步骤(g)中植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的所述部分。
在一个实施方式中，提供了在需要死亡供体心脏的接受者中促进对同种异体心脏移植物的供体特异性耐受性的方法。所述方法包括以下步骤：
(a)从所述死亡供体获得合适的实体人心脏进行移植；
(b)在获得心脏同时移除死亡供体胸腺以用于调理成同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；其中所述供体胸腺与所述供体移植器官中的HLA等位基因匹配；
(c)用包括一种或多种免疫抑制剂的诱导免疫抑制方案治疗所述接受者以耗尽和/或抑制所述接受者的T细胞，其中所述一种或多种免疫抑制剂包括在麻醉诱导时和再灌注后施用的糖皮质激素；
(d)手术移除所述接受者的心脏和胸腺；
(e)将所述供体人心脏移植至所述接受者中；
(f)用包括一种或多种免疫抑制剂的维持性免疫抑制方案治疗所述接受者，持续一段足以防止或抑制所述心脏的移植排斥的时间段，所述一种或多种免疫抑制剂选自由以下组成的组：钙调神经磷酸酶抑制剂、肌苷单磷酸脱氢酶抑制剂和抗胸腺细胞球蛋白；
其中，如果所述接受者的术后状况过于不稳定以至于无法舍弃糖皮质激素并且不能安全地将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品植入在所述接受者中，则将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品冷冻保存以在所述接受者稳定的后面时间处进行植入，其中对所述供体胸腺组织进行调理方案持续约6天到约21天的时段，以产生同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；进一步地，其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；其中所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片显示出散布在整个组织中的对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域、至少一个哈索尔小体的存在、散布在整个组织中的CK14染色以及完整核的存在；
(h)在所述患者稳定之后将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的一部分植入至所述接受者中，其中胸腺组织切片的剂量为约1000-22000mm2胸腺组织表面积/m2接受者体表面积，并且进一步地，其中所述植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述接受者中诱导胸腺生成和耐受性；以及(i)将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的一部分冷冻保存，以便在以下事件中在所述接受者中使用：出现排斥发作，从而需要高剂量的类固醇，所述高剂量的类固醇将损害在步骤(h)中植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的所述部分。
在本公开的另一个方面，提供了一种用于在需要实体器官移植的人接受者中促进对获自活人供体的同种异体实体器官移植物的供体特异性耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)移除所述接受者的胸腺；
(b)用包括一种或多种免疫抑制剂的诱导免疫抑制方案治疗所述接受者，以耗尽所述接受者的T细胞和/或抑制所述接受者的T细胞排斥所移植的实体器官；
(c)提供来自活人供体的合适的实体器官；
(d)将所述实体器官移植至所述接受者中；
(e)用维持性免疫抑制方案治疗所述接受者；
(f)提供保持在冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品库中的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是由来自胸腺供体的胸腺组织处理的，所述胸腺供体表达所述实体器官移植物中不存在的与所述接受者中的HLA等位基因匹配的HLA等位基因；其中对所述供体胸腺组织进行调理方案持续约6天至约21天的时段；进一步地，其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的胸腺组织切片，其中在完成所述调理方案之后，所述胸腺组织切片显示出散布在整个组织中的对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域、至少一个哈索尔小体的存在、散布在整个组织中的CK14染色以及完整核的存在；
(g)解冻所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；以及
(h)将所解冻的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品植入至所述接受者中，其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的剂量为约1000-22000mm2胸腺组织表面积/m2接受者体表面积，并且进一步地，其中所述植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述接受者中诱导胸腺生成和耐受性。
本公开的第四方面提供了一种用于在需要实体器官移植的人接受者中促进对获自死亡人供体的同种异体实体器官移植物的供体特异性耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)移除所述接受者的胸腺；
(b)用包括一种或多种免疫抑制剂的诱导免疫抑制方案治疗所述接受者，以耗尽所述接受者的T细胞和/或抑制所述接受者的T细胞排斥所移植的实体器官；
(c)提供来自活人供体的合适的实体器官；
(d)将所述实体器官移植至所述接受者中；
(e)用维持性免疫抑制方案治疗所述接受者；
(f)提供保持在冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品库中的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是由来自胸腺供体的胸腺组织处理的，所述胸腺供体表达所述实体器官移植物中不存在的与所述接受者中的HLA等位基因匹配的HLA等位基因；其中对所述供体胸腺组织进行调理方案持续约6天至约21天的时段；进一步地，其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的胸腺组织切片，其中在完成所述调理方案之后，所述胸腺组织切片显示出散布在整个组织中的对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域、至少一个哈索尔小体的存在、散布在整个组织中的CK14染色以及完整核的存在；
(g)解冻所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；以及
(h)将所解冻的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品植入至所述接受者中，其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的剂量为约1000-22000mm2胸腺组织表面积/m2接受者体表面积，并且进一步地，其中所述植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述接受者中诱导胸腺生成和耐受性。
在本公开的前述方面的一个实施方式中，同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，其中所述胸腺在收获当天展示>50％的区域对为花边状染色图案的角蛋白呈阳性、存在哈索尔小体、CK14染色为花边状图案并且>90％的核是完整的。
在本公开的一个方面，提供了一种用于植入至经历实体器官移植的受试者中的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，所述产品通过以下方式来制备：从供体获得合适的胸腺组织，其中对所述供体胸腺组织进行调理方案持续至多21天的时段(例如，约6天至约21天的调理方案)；进一步地，其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；其中所述供体胸腺组织切片在收获后第5天至第9天之间显示出散布在整个组织中的对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域、至少一个哈索尔小体的存在、散布在整个组织中的CK14染色以及完整核的存在；回收所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片以作为同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品。
在本公开的前述方面的一个实施方式中，所述胸腺在从所述供体收获当天展示>50％的区域对为花边状染色图案的角蛋白呈阳性、存在哈索尔小体、CK14染色为花边状图案并且>90％的核是完整的。
在本公开的前述方面的一个实施方式中，将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品冷冻保存。
在一个实施方式中，将所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品保持在液氮中以供将来使用。
在另一个实施方式中，将所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品保持在冷冻保存的组织库中。
在一个实施方式中，所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是由来自供体的合适的胸腺组织制备的，所述供体包含与所述实体器官移植物中不存在的拟议接受者中的HLA等位基因匹配的HLA等位基因。
在一个实施方式中，所述HLA等位基因是：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DPB1和HLA-DPA1。
在本公开的一个方面，提供了一种冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，其通过包括以下步骤的方法制备：
(a)从供体获得合适的胸腺组织；
(b)对以下HLA等位基因进行分型：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DPB1、HLA-DPA1；
(c)对所述胸腺组织进行调理方案持续约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；进一步地，其中在完成所述调理方案之后，所述供体胸腺组织切片在第6天到第21天显示出散布在整个组织中的对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域、至少一个哈索尔小体的存在、散布在整个组织中的CK14染色以及完整核的存在；
(d)收获所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片以作为同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；
(e)将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在液氮中冷冻保存；以及
(f)将液氮中的所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品保持在冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品库中。
在一个实施方式中，所述胸腺在收获当天展示>50％的区域对为花边状染色图案的角蛋白呈阳性、存在哈索尔小体、CK14染色为花边状图案并且>90％的核是完整的。
在一个实施方式中，保存液氮中的所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品以供所述接受者将来使用。
在本公开的一个方面，提供了一种制备用于植入至接受者受试者中的供体胸腺的方法。此类方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：将所述供体胸腺培养至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、至多约10天、至多约11天、至多约12天、至多约13天、至多约14天、至多约15天、至多约16天、至多约17天、至多约18天、至多约19天、至多约20天或至多约21天，并且然后将所述培养的胸腺组织手术放置在所述接受者中，如本文进一步所述。在约6天与约21天之间的培养期导致良好的功能。为了成功地移植冷冻保存的胸腺组织，通常将组织培养约6天至约21天，并且然后冷冻保存。
在本公开的一个方面，提供了一种用于植入至经历实体器官移植的受试者中的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品(CTT；RVT-802)，所述产品通过以下方法来生产：对来自合适的供体的胸腺组织进行调理方案持续至多21天的时段(例如，约6天至约21天的调理方案)；其中用于所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的胸腺组织切片，其中所述胸腺组织切片显示出散布在整个组织中的对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域、至少一个哈索尔小体的存在、散布在整个组织中的CK14染色以及完整核的存在。
在一个实施方式中，所述供体胸腺在收获当天展示>50％的区域对为花边状染色图案的角蛋白呈阳性、存在哈索尔小体、CK14染色为花边状图案并且>90％的核是完整的。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述受试者的胸腺通过手术获得。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述受试者的胸腺通过机器人手术获得。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述受试者的胸腺通过胸腔镜手术获得。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述实体器官是整个器官的一部分。
在前述方面的一个或多个实施方式中，第一至第四方面的方法还包括以下步骤：冷冻保存来自所述死亡供体的外周血单核细胞以供将来在用于展示出细胞耐受性的混合淋巴细胞反应中使用。
在前述方面的一个或多个实施方式中，在根据本说明书中CTT的植入程序植入同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品后，使用来自所述接受者的外周血单核细胞和来自所述供体的冷冻保存的外周血单核细胞进行所述用于展示出细胞耐受性的混合淋巴细胞反应。
在前述方面的一个或多个实施方式中，在植入同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品后约6至12个月，用来自所述接受者的外周血单核细胞和来自所述供体的冷冻保存的外周血单核细胞进行所述用于展示出细胞耐受性的混合淋巴细胞反应。
在前述方面的一个或多个实施方式中，在幼稚T细胞构成所述接受者中总T细胞的约10％之后，用来自所述接受者的外周血单核细胞和来自所述供体的冷冻保存的外周血单核细胞进行所述用于展示出细胞耐受性的混合淋巴细胞反应。
在前述方面的一个或多个实施方式中，在植入同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品后12个月内，所述植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述受试者中诱导胸腺生成。
在前述方面的一个或多个实施方式中，通过用来自所述死亡供体的冷冻保存的外周血单核细胞和来自所述接受者的幼稚T细胞进行的混合淋巴细胞反应来确定耐受性的产生。
在前述方面的一个或多个实施方式中，通过体液免疫的产生和供体反应性抗体的不存在来确定体液耐受性。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述实体器官移植物是心脏移植物、肾脏移植物、肝脏移植物、肺移植物、心脏/肺移植物、胰腺移植物、肠移植物、胃移植物、腹壁移植物、颅面移植物、头皮移植物、阴茎移植物、子宫移植物、单侧或双侧上肢移植物、单侧血管化复合同种异体移植物或其组合。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述方法还包括在移植所述实体器官之前，评价所述接受者的HLA I类或HLA II类面板反应性抗体(“PRA”)评分。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述实体器官移植物是心脏移植物。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述实体器官移植物是小儿心脏移植物。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述实体器官移植物是成人心脏移植物。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述方法还包括在移植所述实体器官之前，评价所述接受者的HLA I类或HLA II类面板反应性抗体(“PRA”)评分。
在前述方面的一个或多个实施方式中，具有HLA抗体的接受者与潜在的供体交叉匹配。
在前述方面的一个或多个实施方式中，具有HLA抗体的接受者虚拟地与UNET交叉匹配。
在前述方面的一个或多个实施方式中，如果记录了PRA评分>20％的虚拟交叉匹配，则所述方法将还包括以下步骤：在所述接受者中进行实体器官移植时在手术室中进行血浆置换术。
在前述方面的一个或多个实施方式中，如果记录了PRA评分>70％的虚拟交叉匹配，则所述方法将还包括以下步骤：进行实际的预期供体交叉匹配，并且在所述接受者中进行实体器官移植时在手术室中进行血浆置换术。通常，由于成功率低，在这种情况下不进行移植。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：通过与UNET虚拟地交叉匹配来评价具有HLA抗体的接受者。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述方法还包括：如果HLA面板反应性抗体的评分>20％，则在所述接受者中进行实体器官移植时在手术室中进行血浆置换术。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述方法还包括：如果HLA面板反应性抗体的评分>70％，则进行实际的预期供体交叉匹配，并且在所述接受者中进行实体器官移植时在手术室中进行血浆置换术。
在前述方面的一个或多个实施方式中，例如在出肾脏移植物、部分肝脏移植物和部分肠移植物的生命相关供体至接受者中，所述实体器官是HLA匹配的。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述实体器官是HLA错配的。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述实体器官是HLA匹配的。在另一个实施方式中，通过在所述供体和所述接受者中对以下HLA等位基因进行分型来确定HLA匹配：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DPB1、HLA-DPA1。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述实体器官移植物是ABO相容的。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述实体器官是HLA错配的。在一个实施方式中，通过在所述供体和所述接受者中对HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DQA1、HLA-DPB1、HLA-DPA1进行分型来确定HLA错配。
在前述方面的一个或多个实施方式中，将培养的胸腺组织切片手术植入至所述受试者的股四头肌大腿肌肉中。
在前述方面的一个或多个实施方式中，将培养的胸腺组织切片手术植入至所述受试者体内除股四头肌以外的区域中。
在前述方面的一个或多个实施方式中，将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的一部分手术植入至所述接受者的股四头肌大腿肌肉中。
在前述方面的一个或多个实施方式中，其中将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的剩余部分冷冻保存在液氮中以供将来移植。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述调理方案持续约6天到约21天的时段。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述供体胸腺组织的调理期为约5天至约21天、或约5天、或约6天、或约7天、或约8天、或约9天、或约10天、或约11天、或约12天、或约13天、或约14天、或约15天、或约16天、或约17天、或约18天、或约19天、或约20天或约21天。
本领域普通技术人员将理解，存在本领域已知的许多潜在的诱导免疫抑制方案和维持性免疫抑制方案，并且本领域技术人员可以选择合适的诱导免疫抑制剂和维持性免疫抑制剂，而不会造成过多负担。以下示例性的诱导免疫抑制方案和维持性免疫抑制方案是本发明的第一至第四方面的方法的实践实例，并且支持所要求保护的发明。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述诱导免疫抑制方案包括选自由以下组成的组的诱导免疫抑制剂：糖皮质激素、抗胸腺细胞球蛋白(兔)、抗胸腺细胞球蛋白(马)和阿仑单抗。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述ATG是抗胸腺细胞球蛋白(兔)。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述诱导免疫抑制方案包括施用糖皮质激素。在一个实施方式中，所述糖皮质激素包括甲基泼尼松龙。在另一个实施方式中，所述糖皮质激素是甲基泼尼松龙琥珀酸钠。在另外的实施方式中，以不大于4mg/kg/天静脉内施用甲基泼尼松龙琥珀酸钠。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述诱导免疫抑制方案包括兔来源的抗胸腺细胞球蛋白。在另一个实施方式中，以约1.5mg/kg的剂量静脉内施用所述兔来源的抗胸腺细胞球蛋白。在另外的实施方式中，每日施用所述抗胸腺细胞球蛋白，持续四天。在另一个实施方式中，所述ATG是马来源的ATG。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述诱导免疫抑制方案包括巴利昔单抗。在另一个实施方式中，对于体重小于35kg的接受者，以10mg的剂量静脉内施用巴利昔单抗。在另一个实施方式中，对于体重超过35kg的接受者，以20mg的剂量静脉内施用巴利昔单抗。
在前述方面的一个或多个实施方式中，第二免疫抑制方案包括一种或多种选自由以下组成的组的免疫抑制剂：糖皮质激素、钙调神经磷酸酶抑制剂、肌苷单磷酸脱氢酶抑制剂、硫唑嘌呤和抗胸腺细胞球蛋白(“ATG”)。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述维持性免疫抑制方案的免疫抑制剂是抗胸腺细胞球蛋白(ATG)。
在前述方面的一个或多个实施方式中，从在手术室中施用开始，以约1.5mg/kg的剂量静脉内施用所述ATG，持续3-14天的时段。
在前述方面的一个或多个实施方式中，通过静脉内施用以约15mg/kg/天每日施用所述抗胸腺细胞球蛋白，持续3-14天。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述第一免疫抑制方案包括阿伦单抗。
在前述方面的一个或多个实施方式中，对于体重小于35kg的接受者，以约0.25mg/kg的剂量静脉内施用阿仑单抗，持续4天。在另一个实施方式中，对于体重超过35kg的接受者，以约3至20mg的剂量静脉内施用阿仑单抗，持续4天。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述第二免疫抑制方案包括一种或多种选自由以下组成的组的免疫抑制剂：钙调神经磷酸酶抑制剂和肌苷单磷酸脱氢酶抑制剂或硫唑嘌呤。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述维持性免疫抑制方案的免疫抑制剂是钙调神经磷酸酶抑制剂。
在一个实施方式中，所述维持性免疫抑制方案的免疫抑制剂是肌苷单磷酸脱氢酶抑制剂。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述免疫抑制方案包括肌苷单磷酸脱氢酶抑制剂，例如吗替麦考酚酯。在一个实施方式中，以约15至约25mg/kg的剂量静脉内施用吗替麦考酚酯。在一个实施方式中，每天两至三次静脉内施用吗替麦考酚酯。
在前述方面的一个或多个实施方式中，肌苷单磷酸脱氢酶抑制剂是麦考酚酸。在另一个实施方式中，以约25至约50mg/kg的剂量按2个或3个分剂量施用麦考酚酸。
在前述方面的一个或多个实施方式中，将麦考酚酸对于儿童以约400mg/m2/剂的剂量每日两次施用，最大剂量为720mg；或对于BSA为1.19至1.59m2，施用约540mg，每日两次；或对于BSA>1.58m2，施用约720mg，每日两次。
在前述方面的一个或多个实施方式中，将吗替麦考酚酯对于儿童以约15至约25mg/kg/剂的剂量每天两次施用，或者对于成人以约1500mg的剂量每天两次口服或静脉内施用，并且针对WBC>3500进行了调整。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述第二免疫抑制方案可以还包括糖皮质激素，所述糖皮质激素选自由甲基泼尼松龙、泼尼松和泼尼松龙组成的组。在一个实施方式中，糖皮质激素的剂量保持低于4mg/kg/天。
在前述方面的一个或多个实施方式中，如本公开中其他地方所述，以逐渐减少的剂量降低施用糖皮质激素。
在前述方面的一个或多个实施方式中，所述钙调神经磷酸酶抑制剂是他克莫司。在另一个实施方式中，所述钙调神经磷酸酶抑制剂是环孢霉素A。
在前述方面的一个或多个实施方式中，在幼稚T细胞达到总T细胞的10％之后，舍弃所述第二免疫抑制方案的施用。在又另一个实施方式中，在植入同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品之后，舍弃所述第二免疫抑制方案。
为了评价在制备用于CTT的供体胸腺组织期间耗尽胸腺细胞时胸腺产生和/或趋化因子和其他可溶性分子的释放如何调控这些细胞迁移变化的过程，我们使用抗体微阵列针对200种可溶性分子的存在从人胸腺器官培养物中筛选了条件培养基。
使用另外的胸腺器官培养物验证了选择的潜在机制上重要的候选分子的表达，并且将其与侧在5日龄至78岁范围内的供体获得的一组充分表征的人胸腺组织进行比较。通过该分析，我们鉴定了胸腺细胞含量的某些潜在重要的生物标志物。
培养的胸腺切片的胸腺细胞含量的潜在重要的生物标志物是L-选择素。胸腺上皮细胞活力和功能的另一个重要生物标志物依赖于趋化因子CCL21 6Ckine的分泌。
多种另外的潜在生物标志物示出于图50和56中。特别受关注的是示出于图50上的生物标志物，即CCL21、CXCL16、M-CSF、半乳凝素-7、CCL11、IL-16和CXCL12。另外，特别受关注的是示出于图56上的生物标志物，特别是具有小于0.05的P值的生物标志物。这些生物标志物将包括：L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、CCL20(MIP-3a)、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR(CD87)、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1。
实施例中和文献中报告的数据支持以下生物标志物指示TEC功能：CCL21(6Ckine)、CXCL16、骨调素(OPN)、CCL11、uPAR(CD87)和CXCL12。CXCL16：已经显示此趋化因子由TEC产生(Bunting 2011)。
骨调素(OPN；由SPP1基因编码)：此细胞因子在胸腺应激期间增加，并且增加的水平与胸腺萎缩(胸腺细胞数量的减少)相关联，减少胸腺细胞数量是培养的胸腺的希望状态(Wang 2009；Gridley 2013)。OPN是产生皮质类固醇所需的，已经充分确立皮质类固醇诱导胸腺细胞凋亡。
CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子)：此趋化因子由髓质TE产生(Bunting 2011)。它最初因其引诱嗜酸性粒细胞的能力而得名，并且我们已经显示嗜酸性粒细胞浸润可能在具有活跃胸腺生成的胸腺组织中是突出的(Flores 1999)。然而，也已经显示嗜酸性粒细胞趋化因子充当双阳性(DP)和单阳性(SP)人胸腺细胞的化学引诱剂(Bunting 2011)。
uPAR(CD87；由PLAUR基因编码)：尿激酶受体(也称为尿激酶纤溶酶原激活物受体)基于选择性剪接以可溶性形式和膜结合形式表达。它有助于细胞外基质的局部降解。已经显示它在人胸腺中表达，并且有趣的是，通过迁移伤口边缘处的表皮角质形成细胞(EK)表达(Loughner 2016)。此后种特征是最有趣的，因为TE细胞在许多基因的表达方面与EK十分相似(Patel 1995)。在培养的胸腺切片的分泌中的逐渐增加可能反映了TE的激活，并且因此是植入后TE生长的标志物。
CXCL12(SDF-1a)：此趋化因子具有与其他分析物不同的表达模式，因为它仅在培养期的最后1/3期间检测到。在第13-15天可首次检测到，它在培养的下一周内线性上升(在ln图中)至高得多的水平。已经证明CXCL12由被膜下皮质和髓质TE产生(Bunting 2011；Hernandez-Lopez 2002；Zaitseva 2002)，但也可以由胸腺内存在的胸腺成纤维细胞和内皮细胞产生。已经显示CXCL12将B细胞和抗原呈递细胞(APC)募集至胸腺(Weiss 2003)，预期这对于产生完全的胸腺功能是重要的。它还参与胸腺细胞亚群在胸腺内的定位，并且它增强针对IL-7的胸腺细胞增殖(Hernandez-Lopez 2002)。值得注意的是，已显示中和CXCL12的抗体减少体外人胸腺器官培养物中的胸腺生成，并且添加CXCL12增加这些培养物中的胸腺生成(Hernandez-Lopez 2002)。
可以反映胸腺细胞存在的其他生物标志物包括L-选择素。此分子以高水平表达于发育中和幼稚T细胞上。当培养胸腺细胞时，它从细胞表面释放。通常在被体内健康细胞脱落时迅速重新表达(Fitzhugh 2008)，逐降低低的脱落水平可能反映了胸腺细胞活力的逐渐丧失，因为它们在培养过程中通常不在其表面上重新表达此分子(A.Macintyre，未发表的数据)。
另一种可能反映胸腺细胞存在的生物标志物是IL-16。此细胞因子被包括是因为其模式(如下所述)与对于胸腺细胞假设的模式一致。已知此生物标志物由淋巴细胞产生。
又另一种可能反映胸腺细胞存在的生物标志物是MIF。此趋化因子被包括是因为其模式与对于胸腺细胞假设的模式一致。
还另一种可能反映胸腺细胞存在的生物标志物是CCL20(MIP-3a)：此趋化因子被包括是因为其模式与对于胸腺细胞假设的模式一致。
另一种可能反映胸腺细胞存在的生物标志物是IGFBP-1。已知IGFBP2-6由不表达IGFBP-1的胸腺上皮表达(Gosteli-Peter 1994；Ketcha 1999)。
基于实施例和文献中的数据与活的胸腺细胞的存在相关联的最初显示高水平、然后随时间减少(胸腺细胞来源的生物标志物的假设特征)的其他生物标志物：L选择素、IL-16、MIF、CCL20(MIP-3a)和IGFBP-1。这些生物标志物随时间的减少与我们更定性的观察结果，即在培养胸腺组织切片时T细胞耗尽一致。
已经显示CCL21由胸腺上皮细胞表达(Lkhagvasuren等人，2013)，并且由于其对胸腺细胞前体(Liu等人，2005)以及对胸腺内的胸腺细胞迁移(Hu等人，2015)的趋化活性而在功能上是重要的。胸腺细胞的此趋化特性可能是在植入如本文所述的培养的胸腺组织后接受者的成功免疫重建的至关重要决定因素。
在此报告的结果也应广泛适用于理解年龄相关胸腺退化的机制，以及理解参与经由植入培养的胸腺组织对无胸腺接受者的免疫重建的机制。
在实施例中和在图56上，报告了可以在从培养的人胸腺组织切片获得的废/条件培养基中可以检测到至少127种不同的分析物，并且这些分析物中的42种显示出随培养时间的逐渐增加或减少。在这些分析物中，释放的可溶性L-选择素的量被验证为培养的胸腺中活的胸腺细胞残余含量的非破坏性标志物。在体外胸腺器官培养过程中和在体内在整个生命周期中从健康供体获得的未经操纵的胸腺组织中，胸腺上皮对趋化因子CCL21、CXCL16、CXCL12和CCL11的表达和/或分泌均展示出随着胸腺细胞的减少而增加。类似地，在培养过程期间，观察到胸腺器官培养基中L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7和IL-16的表达或分泌减少。这些发现与理解年龄相关胸腺退化的机制以及促进免疫重建的人胸腺组织的质量直接相关。在婴儿胸腺培养过程中观察到的变化与跟衰老相关联的变化之间的对比表明，培养的人婴儿胸腺也提供了可用于研究介导年龄相关联胸腺退化的机制的模型。
据我们所知，这是对在胸腺细胞耗尽时由人胸腺产生和释放或分泌的可溶性分子的首次大型筛选。发现随着培养的进行向培养基中的释放显著增加或减少的42种分析物中的许多是先前已经显示是由胸腺内存在的细胞类型产生的细胞因子和/或趋化因子。其他分析物在此方面是新颖的。虽然实验工作主要集中于作为胸腺细胞含量的标志物的L-选择素的释放和作为TEC活力和功能的标志物的CCL21上，但从抗体微阵列筛选报告的数据可用于从图56中鉴定可以标识控制体内人胸腺的急性萎缩、慢性退化和/或再生的新颖途径的另外分析物。这些将特别包括图50中列出的生物标志物。例如，一些满足预先指定的选择标准的分析物没有被进一步考虑，因为已知它们在细胞损伤和/或缺氧应激期间表达或释放，并且它们的水平可能反映培养相关组织损伤和炎症应答，而不是胸腺特异性生物学。在来自培养的胸腺组织切片的培养上清液中注意到的另外的生物标志物包括CC25(TECK)、骨调素(OPN)、uPAR(CD87)、MIF、CCL20(MIP-3a)和IGFBP-1。对释放可能反映人胸腺中至关重要细胞类型的活力和/或激活的另外分析物的研究可能导致临床和机制上重要的见解，特别是关于对胸腺细胞丧失的应答。
CCL25(TECK)：尽管在所检查的3种胸腺培养物中的2种的培养期后期，仅在少数上清液样品中存在可检测水平的TECK，但由于已经显示此趋化因子对胸腺细胞具有趋化性，因此其受到关注(Liu 2005)。已知它由胸腺树突状细胞(DC)以及FoxN1+和FoxN1-TE两者细胞表达(Bunting 2011)。然而，基于对小鼠的研究，其活性显现为对胸腺发育并不至关重要，在所述小鼠中，此趋化因子的唯一受体CCR9被删除(Wurbel 2001)。
基于微阵列研究，确定条件培养基中的可溶性L-选择素水平可充当培养的胸腺切片中胸腺细胞存在和活力的潜在生物标志物。这非常合理，因为L-选择素的表达限于造血细胞，且组成性地以及在迁移过程中脱落(Hafezi-Moghadam等人，2001)，然后通常在体内由健康细胞快速重新表达(Fitzhugh等人，2008)。
实验结果显示，L-选择素释放的丧失与胸腺细胞死亡在时间上相关联，如通过经由组织学和CD3免疫组织化学测得的胸腺细胞膜完整性的丧失以及通过Ki-67免疫组织化学测得的特征性胸腺细胞增殖的缺乏所指示的。
能够非破坏性地监测培养的人胸腺切片的胸腺细胞含量对于鉴定用于实验研究的最适当的收获时间点是重要的。这也可以提供临床上重要的信息，因为据信通过耗尽供体胸腺细胞为接受者胸腺细胞的定植打开发育生态位对于经由胸腺植入对无胸腺患者的成功免疫重建是至关重要的。总之，实施例中呈现的研究表明减少的L-选择素释放是用于监测培养的胸腺切片中的胸腺细胞耗尽的有用生物标志物。
反映胸腺上皮的存在和功能的生物标志物也可以提供至关重要的机制信息。实施例中阐述的研究集中于CCL21，因为微阵列筛选表明此趋化因子在培养开始后不久就开始以高水平分泌至培养基中。先前显示CCL21由胸腺上皮表达并且对胸腺细胞及其前体具有趋化性(Liu等人，2005)。我们的研究显示，CCL21的表达也可以很容易地通过酶免疫测定进行定量。免疫组织化学确认了在培养的胸腺和非培养的胸腺中TEC的CCL21表达，在髓质和被膜下皮质胸腺上皮中具有最强表达。
同样重要的是要注意胸腺切片的CCL21免疫反应性不一定随着CCL21分泌在培养过程中的增加而增加。这可能反映了产生的另外CCL21是分泌的，而不是保留在其可以通过免疫组织化学检测到的细胞质中。CCL21是一种转录调控的高周转分子，具有短的半衰期(Dudal等人，2015)，因此观察到的阳性免疫组织化学反应性代表正在活跃地产生此趋化因子的细胞。在培养的胸腺和未经操纵的衰老胸腺两者中该CCL21的产生随着胸腺细胞的减少而显著增加表明胸腺上皮细胞可以感测胸腺细胞含量并且在稳态尝试中做出反应以对抗胸腺细胞丧失。
将CCL21鉴定为反映TEC的活力和功能的分泌性生物标志物在临床上对于胸腺移植也是重要的。可以评估待植入的组织质量的大多数确立方法(例如流式细胞术、免疫组织化学、基因表达分析)在分析过程中破坏样品。除了减少可用于最终植入的组织的量外，此类结果还受到采样误差的影响，因为测试的切片不是最终植入的切片的一部分。如图53C中所示，CCL21的合并用过培养基的测定可以跨来源于任何给定胸腺供体的批次中的所有切片整合，从而提供总体批次质量的非破坏性图片。
趋化因子CXCL12(SDF-1α)与筛选中的大多数其他分析物不同，因为它在培养期期间相对较晚变得在条件培养基中可检测到(图50H)。在第13-15天可首次检测到，它在培养的下一周内线性上升(在ln图中)至高得多的水平。已经证明CXCL12由被膜下皮质和髓质TE产生，但也可以由胸腺内操作的胸腺成纤维细胞和内皮细胞产生(Bunting等人，2011；Hernandez-Lopez等人，2002；Zaitseva等人，2002)。CXCL12将B细胞和抗原呈递细胞募集至胸腺(Weiss等人，2013)，预期这对于产生完全的胸腺功能是重要的。CXCL12还参与胸腺细胞亚群在胸腺内的定位，并且它增强针对IL-7的胸腺细胞增殖(Hernandez-Lopez等人，2002)。值得注意的是，已经显示中和CXCL12的抗体减少体外人胸腺器官培养物中的胸腺生成，并且添加CXCL12增加这些培养物中的胸腺生成(Hernandez-Lopez等人，2002)。在此示出的体外胸腺器官培养过程中CXCL12分泌的较晚时间选择结合与更年轻供体相比其在来源于>18岁的供体的胸腺中的体内表达增加表明此趋化因子的表达是由与诱导CCL21分泌所需的相比更长期存在的胸腺细胞耗尽诱导的。
筛选数据表明，其他趋化因子(包括CXCL16和CCL11)可能是用于评估培养的胸腺的活力和功能的生物标志物，因为它们也在胸腺器官培养过程中随着胸腺细胞的丧失而增加。先前已经显示CXCL16和CCL11两者是由TEC产生的(Bunting等人，2011)。
CCL11最初因其引诱嗜酸性粒细胞的能力而被命名为嗜酸性粒细胞趋化因子。我们先前显示嗜酸性粒细胞浸润可能相邻于具有活跃胸腺生成的胸腺组织突出(Flores等人，1999)，尽管在这些研究中没有直接测量CCL11水平。然而，随后也显示CCL11充当双阳性和单阳性人胸腺细胞的化学引诱剂(Bunting等人，2011)。CXCL16在胸腺生成中的具体作用的证据不太清楚。
实施例中呈现的研究验证了使用L-选择素作为活的胸腺细胞存在生物标志物和使用CCL21作为TEC活力的生物标志物，如果胸腺细胞前体变为可用的，所述TEC活力也可以预测高效的免疫重建。在来自更年长成人的培养的胸腺切片和非培养的胸腺组织两者中，CCL21的产生在胸腺生成稳健时通常较低，并且在胸腺生成受到损害时明显被诱导。有趣的是，在针对TEC区域或活动皮层区域归一化之后，与来自更年长成人的胸腺相比，来自更年轻供体(≤18岁)的胸腺组织继续表达更多的CD3ε和CD1A mRNA和更少的角蛋白8(KRT8)和角蛋白14(KRT14)mRNA。这表明胸腺生成和TEC保持在这些更年轻供体中可能更高效。此外，对于这两种归一化方法，与更年轻供体相比，CCL21和CXCL12的产生对于来源于>18岁(TEC含量和活跃胸腺生成减少的时间范围)的供体的组织明显增加。在体外在胸腺器官培养中和在体内在衰老过程中CCL21和CXCL12两者的该表达随着胸腺细胞数量的减少而增加，这提高了这些趋化因子的诱导是试图通过增强T细胞前体募集来对抗胸腺细胞数量减少的稳态机制的一部分的可能性。预期胸腺细胞耗尽的培养的胸腺切片对胸腺细胞引诱趋化因子的分泌增加增强它们的定植和产生免疫重建的能力，正如当将此类切片植入至无胸腺婴儿接受者中时观察到的那样(Markert等人，2008)。相比之下，如果胸腺细胞前体或胸腺微环境的其他至关重要方面的可用性受到限制，则CCL21和CXCL12的大量分泌可能在衰老过程中提供的较少益处。
总之，这些研究显示来源于小儿供体的胸腺的器官培养物可用于模型化人中年龄相关胸腺退化的至少一些方面，特别是与胸腺细胞丧失更直接相关的那些方面。然而，很明显，T细胞耗尽的培养的小儿胸腺在其他方面一定与衰老成人胸腺有很大不同，因为将T细胞耗尽的培养的小儿胸腺植入至无胸腺接受者中导致免疫重建和免受感染，而与具有更稳健胸腺功能的更年轻成人相比，具有退化胸腺的衰老成人更易受感染。Palmer,S,Albergante L,Blackburn CC,Newman TJ.Thymic involution and rising diseaseincidence with age.Proc Natl Acad Sci USA 11colk:1883-1888,2018。
在此在图56中呈现的结果提供了作为潜在生物标志物来使用培养的婴儿胸腺模型化在体外衰老的人胸腺的一些方面的另外的分子和途径的丰富来源。这是重要的，因为鉴于对于心脏矫正手术需要从大多数婴儿移除一部分胸腺以适当地暴露手术区，婴儿胸腺通常更容易获得用于研究。成人胸腺组织通常不太容易获得，因为对于成人中常见的许多类型的心脏手术通常不需要移除胸腺组织来允许接近。此外，任何移除的成人胸腺组织通常不可用于研究，因为它显现为不太器官样并且与脂肪非常相似。然而，如果在成人实体器官接受者中需要耐受性，则成人胸腺组织可能会被培养并用于与实体器官一起共同移植。生物标志物还可用于确定来源于成人供体的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的合适性、功能性和活力。
胸腺细胞趋化因子CCL21、CXCL16、CXCL12和CCL11的胸腺产生随着胸腺细胞含量的减少而增加。这表明胸腺细胞丧失可能激活试图对抗潜在萎缩的稳态机制，尽管最终在衰老的环境下没有成功，但更全面阐明这些机制的未来研究将可用于理解和可能逆转驱动年龄相关胸腺退化的机制并且可以有助于增强所有年龄段的胸腺驱动的免疫重建。
在本公开的一个方面，提供了一种产生适于植入至人中的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的方法，所述方法包括以下步骤：对供体胸腺进行调理方案持续约6至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；还包括在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中CCL21的增加水平；以及回收所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片以作为适于植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述方法还包括将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品冷冻保存在液氮中以供将来植入的步骤。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述方法还包括在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中L-选择素的降低水平。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述方法包括在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11中的一种或多种。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述方法包括在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中CXCL12、CXCL16或CCL11中的一种或多种的增加水平。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述方法包括在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中CXCL12的增加水平。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述方法包括在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中的渐增CXCL16。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述方法包括在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中CCL11的增加水平。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述方法包括在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中M-CSF、半乳凝素-7或IL-16中的一种或多种。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述方法包括在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中M-CSF、半乳凝素-7或IL-16中的一种或多种的降低水平。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述方法包括在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中M-CSF的降低水平。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述方法包括在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中半乳凝素-7的降低水平。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述方法包括在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中IL-16的降低水平。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述调理方案持续五天、或六天、或七天、或八天、或九天、或10天、或11天、或12天、或13天、或14天、或15天、或16天、或17天、或18天或19天、或20天、或21天的时段；或持续5-6天、或5-7天、或5-8天、或5-9天、或5-10天、或6至7天、或6至8天、或6至9天、或6至10天、或6至11天、或6至12天、或6至21天、或7至21天、或8至21天、或9至21天、或10至21天、或11至21天、或12至21天、13至21天或14至21天、或15至21天、或16至21天或17至21天或18至21天、或19至21天、或20至21天的时段。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，CCL21的水平近似图50E中的所述水平，和/或L-选择素的水平近似图50A中的所述水平，和/或M-CSF的水平近似图50B中的所述水平，和/或半乳凝素-7的水平近似图50C中的所述水平，和/或IL-16的水平近似图50D中的所述水平，和/或CXCL16的水平近似图50F中的所述水平，和/或其中CCL11的水平近似图50G中的所述水平，和/或CXL21的水平近似图50H中的所述水平。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：在所述调理方案的第6天至第21天之间、优选地在第6天至第9天之间在所述供体胸腺组织切片中确定散布在整个所述供体胸腺组织切片中的对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域、至少一个哈索尔小体的存在、散布在整个所述供体胸腺组织切片中的CK14染色以及完整核的存在。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述方法还包括在所述培养方案期间检测所述胸腺器官培养基中至少一种标志物的水平，或者在所述调理方案期间检测所述胸腺器官培养基中的选自以下的至少两种、或至少三种、或至少四种、或至少五种、或至少六种、或至少七种、或至少八种标志物：L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16和CCL11。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述方法还包括在所述培养方案期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGFR、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1。
在本公开的一个方面，提供了一种用于确定同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是否适于植入至人中的方法，所述方法包括以下步骤：将供体胸腺组织切片在胸腺器官培养基中调理约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；以及检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16和CCL11。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述至少一种标志物是L-选择素，并且其中所述胸腺器官培养基中L-选择素的水平随时间，即在所述调理方案的过程期间降低。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述至少一种标志物是M-CSF，并且其中所述胸腺器官培养基中M-CSF的水平在所述调理方案的过程期间降低。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述至少一种标志物是半乳凝素-7，并且其中所述胸腺器官培养基中半乳凝素-7的水平在所述调理方案的过程期间降低。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述至少一种标志物是IL-16，并且其中所述胸腺器官培养基中IL-16的水平在所述调理方案的过程期间降低。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述至少一种标志物是CCL21，并且其中所述胸腺器官培养基中CCL21的水平在所述调理方案的过程期间增加。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述至少一种标志物是CXCL12，并且其中所述胸腺器官培养基中CXCL12的水平在所述调理方案的过程期间增加。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述至少一种标志物是CXCL16，并且其中所述胸腺器官培养基中CXCL16的水平在所述调理方案的过程期间增加。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述至少一种标志物是CCL11，并且其中所述胸腺器官培养基中CCL11的水平在所述调理方案的过程期间增加。
在本公开的一个方面，提供了一种用于确定同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是否适于植入至人中的方法，所述方法包括以下步骤：将供体胸腺组织切片在胸腺器官培养基中调理约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；以及在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：在所述调理方案的第6天至第21天之间在所述供体胸腺组织切片中确定散布在整个所述供体胸腺组织切片中的对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域、至少一个哈索尔小体的存在、散布在整个所述供体胸腺组织切片中的CK14染色以及完整核的存在。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述调理方案持续五天、或六天、或七天、或八天、或九天、或10天、或11天、或12天、或13天、或14天、或15天、或16天、或17天、或18天或19天、或20天、或21天的时段；或持续5-6天、或5-7天、或5-8天、或5-9天、或5-10天、或6至7天、或6至8天、或6至9天、或6至10天、或6至11天、或6至12天、或6至21天、或7至21天、或8至21天、或9至21天、或10至21天、或11至21天、或12至21天、13至21天或14至21天、或15至21天、或16至21天或17至21天或18至21天、或19至21天、或20至21天的时段。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，CCL21的水平近似图50E中的所述水平，和/或L-选择素的水平近似图50A中的所述水平，和/或M-CSF的水平近似图50B中的所述水平，和/或半乳凝素-7的水平近似图50C中的所述水平，和/或IL-16的水平近似图50D中的所述水平，和/或CXCL16的水平近似图50F中的所述水平，和/或其中CCL11的水平近似图50G中的所述水平，和/或CXL21的水平近似图50H中的所述水平。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述方法还包括在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中至少一种标志物的水平，或者检测选自以下的至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或至少八种标志物：L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16和CCL11，并且其中L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16的水平在所述调理方案的过程期间在所述胸腺器官培养基中降低，并且进一步其中CCL21、CXCL12、CXCL16和CCL11在所述调理方案的过程期间在所述胸腺器官培养基中增加。
在本发明的一个方面，提供了一种用于确定同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是否适于植入至人中的方法，所述方法包括以下步骤：将供体胸腺组织切片在胸腺器官培养基中调理约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；以及检测所述胸腺器官培养基中选自图56中的所述标志物的至少一种标志物的水平。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，提供了一种用于确定同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是否适于植入至人中的方法，所述方法包括以下步骤：将供体胸腺组织切片在胸腺器官培养基中调理约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；以及在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1。
在本公开的一个方面，提供了一种治疗胸腺障碍的方法，所述改善包括向患有胸腺障碍的受试者中植入同种异体培养的出生后胸腺组织来源切片，在胸腺器官培养基中对所述切片进行调理方案持续约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；以及检测选自以下的至少一种标志物的水平：L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16和CCL11。
在本公开的另一个方面，提供了一种治疗胸腺障碍的方法，所述改善包括向患有胸腺障碍的受试者中植入同种异体培养的出生后胸腺组织来源切片，在胸腺器官培养基中对所述切片进行调理方案持续约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；以及在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，至少一种标志物是L-选择素，并且其中所述胸腺器官培养基中L-选择素的水平在所述调理方案的过程期间降低。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，至少一种标志物是M-CSF，并且其中所述胸腺器官培养基中M-CSF的水平在所述调理方案的过程期间降低。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，至少一种标志物是半乳凝素-7，并且其中所述胸腺器官培养基中半乳凝素-7的水平在所述调理方案的过程期间降低。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，至少一种标志物是IL-16，并且其中所述胸腺器官培养基中IL-16的水平在所述调理方案的过程期间降低。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，至少一种标志物是CCL21，并且其中所述胸腺器官培养基中CCL21的水平在所述调理方案的过程期间增加。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，至少一种标志物是CXCL12，并且其中所述胸腺器官培养基中CXCL12的水平在所述调理方案的过程期间增加。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，至少一种标志物是CXCL16，并且其中所述胸腺器官培养基中CXCL16的水平在所述调理方案的过程期间增加。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，至少一种标志物是CCL11，并且其中所述胸腺器官培养基中CCL11的水平在所述调理方案的过程期间增加。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：在所述调理方案期间在所述供体胸腺组织切片中确定散布在整个所述供体胸腺组织切片中的对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域、至少一个哈索尔小体的存在、散布在整个所述供体胸腺组织切片中的CK14染色以及完整核的存在。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述胸腺障碍是与完全DiGeorge综合征、22q11.2缺失、CHARGE(缺损、心脏缺陷、鼻后孔闭锁、生长或智力迟钝、生殖器发育不全和耳朵异常或耳聋)、CHD7(染色质结构域-解旋酶-DNA结合蛋白7)基因中的突变或叉头盒蛋白N1(FOXN1)缺乏相关联的先天性无胸腺症。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述胸腺障碍是胸腺退化。在另一个实施方式中，胸腺障碍是与TBX-1或TBX-2基因中的突变相关联的先天性无胸腺症。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述胸腺障碍与成对盒1(PAX1)、脑信号蛋白3E(SEMA3E)和染色体2p11.2处的反复性微缺失相关。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述胸腺障碍与胸腺瘤相关联。在还进一步实施方式中，所述胸腺瘤是非恶性的或恶性的。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述胸腺障碍与重症肌无力(MG)、纯红细胞再生障碍和低丙球蛋白血症相关联。
在本公开的一个方面，提供了一种用于在人受试者中提供免疫能力的方法，所述改善包括以下步骤：将供体胸腺组织切片在胸腺器官培养基中调理约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：标志物L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中如果所述标志物是L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7或IL-1，则所述水平是降低的，或者如果所述标志物是CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，则所述水平是增加的；以及将所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片植入至所述人受试者中。
在本公开的一个方面，提供了一种用于在人受试者中提供免疫能力的方法，所述改善包括以下步骤：将供体胸腺组织切片在胸腺器官培养基中调理约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自来自以下的标志物的至少一种标志物的水平：L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1；以及将所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片植入至所述人受试者中。
在本公开的一个方面，提供了一种用于在经历实体器官移植物的人受试者中提供免疫能力的方法，所述方法包括以下步骤：移除所述人受试者的胸腺；从与所述实体器官中的HLA-I类和HLA-II类等位基因匹配的供体获得胸腺组织；将所述供体胸腺切片；将所述供体胸腺组织切片在胸腺器官培养基中调理约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：标志物L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中如果所述标志物是L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7或IL-1，则所述水平是降低的，或者如果所述标志物是CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，则所述水平是增加的；植入所述实体器官；以及将所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片植入至所述人受试者中。
为了更好地理解此模型中耐受性的产生，可以参考图38，其具有此程序的灵长类动物模型，所述模型将提供数据以支持关于产生供体特异性耐受性的人研究。图38中的实验具有3只猴。一只是胸腺和心脏供体(左侧栏中的信息)。第二只是胸腺和心脏接受者(第2页上中间栏中的信息。此列具有实验的阶段)。第三只是对照(第3页上右侧栏中的信息)。请注意，原始电子表格具有一页宽×多页长的关于所有三只动物的程序。因为电子表格宽于允许宽度，所以电子表格的每一行都分为3页。该表以3个小图为一组持续许多周和若干个阶段。
在本公开的一个方面，提供了一种用于在经历实体器官移植物的人受试者中提供免疫能力的方法，所述方法包括以下步骤：移除所述人受试者的胸腺；从与所述实体器官中的HLA-I和II类等位基因匹配的供体获得胸腺组织；将所述供体胸腺切片；将所述供体胸腺组织切片在胸腺器官培养基中调理约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：标志物L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1；植入所述实体器官；以及将所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片植入至所述人受试者中。
在本公开的一个方面，提供了一种用于在经历实体器官移植物的人受试者中提供免疫能力的方法，所述方法包括以下步骤：移除所述人受试者的胸腺；从与所述实体器官中的HLA-I类和HLA-II类两者等位基因匹配的供体获得胸腺组织；将所述供体胸腺切片；将所述供体胸腺组织切片在胸腺器官培养基中调理约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：标志物L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中如果所述标志物是L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7或IL-1，则所述水平是降低的，或者如果所述标志物是CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，则所述水平是增加的；植入所述实体器官；以及将所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片植入至所述人受试者中。
在本公开的一个方面，提供了一种用于在经历实体器官移植物的人受试者中提供免疫能力的方法，所述方法包括以下步骤：移除所述人受试者的胸腺；从与所述实体器官中的HLA-I类和HLA-II类两者等位基因匹配的供体获得胸腺组织；将所述供体胸腺切片；将所述供体胸腺组织切片在胸腺器官培养基中调理约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：标志物L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1；植入所述实体器官；以及将所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片植入至所述人受试者中。
在本公开的一个方面，提供了一种在需要实体器官移植的接受者中促进对获自死亡供体的同种异体实体器官移植物的供体特异性耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)移除所述接受者的胸腺；
(b)用包括一种或多种免疫抑制剂的诱导免疫抑制方案治疗所述接受者，以耗尽所述接受者的T细胞和/或抑制所述接受者的T细胞排斥所移植的实体器官；
(c)提供来自死亡供体的合适的实体人体器官和胸腺；
(d)将所述实体人体器官移植至所述接受者中；
(e)用维持性免疫抑制方案治疗所述接受者；
(f)提供同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，其中对所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在胸腺器官培养基中进行调理方案持续约6天至约21天的时段，以产生同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品切片；进一步，其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：标志物L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中如果所述标志物是L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7或IL-1，则所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平是降低的，或者如果所述标志物是CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，则所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平是增加的；以及
(g)调理方案的约6天至约21天后，将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品植入至所述接受者中，其中胸腺组织切片的剂量为约1000-22000mm2胸腺组织表面积/m2接受者体表面积，并且进一步地，其中所述植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述接受者中诱导胸腺生成和耐受性。
在本公开的一个方面，提供了一种在需要实体器官移植的接受者中促进对获自死亡供体的同种异体实体器官移植物的供体特异性耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)移除所述接受者的胸腺；
(b)用包括一种或多种免疫抑制剂的诱导免疫抑制方案治疗所述接受者，以耗尽所述接受者的T细胞和/或抑制所述接受者的T细胞排斥所移植的实体器官；
(c)提供来自死亡供体的合适的实体人体器官和胸腺；
(d)将所述实体人体器官移植至所述接受者中；
(e)用维持性免疫抑制方案治疗所述接受者；
(f)提供同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，其中对所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在胸腺器官培养基中进行调理方案持续约6天至约21天的时段，以产生同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品切片；进一步，其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：标志物L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1；以及
(g)调理方案的约6天至约21天后，将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品植入至所述接受者中，其中胸腺组织切片的剂量为约1000-22000mm2胸腺组织表面积/m2接受者体表面积，并且进一步地，其中所述植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述接受者中诱导胸腺生成和耐受性。
在本公开的一个方面，提供了一种用于在需要实体器官移植的人接受者中促进对获自活人供体的同种异体实体器官移植物的供体特异性耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)移除所述接受者的胸腺；
(b)用包括一种或多种免疫抑制剂的诱导免疫抑制方案治疗所述接受者，以耗尽所述接受者的T细胞和/或抑制所述接受者的T细胞排斥所移植的实体器官；
(c)提供来自活人供体的合适的实体器官；
(d)将所述实体器官移植至所述接受者中；
(e)用维持性免疫抑制方案治疗所述接受者；
(f)提供保持在冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品库中的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是由来自胸腺供体的胸腺组织处理的，所述胸腺供体表达所述实体器官移植物中不存在的与所述接受者中的HLA-I类和HLA-II类等位基因匹配的HLA等位基因；其中对所述供体胸腺组织进行调理方案持续约6天至约21天的时段；进一步，其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的胸腺组织切片；在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：标志物L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中如果所述标志物是L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7或IL-1，则所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平是降低的，或者如果所述标志物是CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，则所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平是增加的；
(g)解冻所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；以及
(h)将所解冻的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品植入至所述接受者中，其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的剂量为约1000-22000mm2胸腺组织表面积/m2接受者体表面积，并且进一步地，其中所述植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述接受者中诱导胸腺生成和耐受性
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，可以允许HLA-DP的允许性错配(Pidala J等人，2014 Blood 124:2596-2606)。此外，如果存在足够数值的功能性距离，则可以允许HLA-DPB1的非允许性错配(Crivello P等人，2016 Blood 128:120-129)。
在本发明的一个方面，提供了一种用于在需要实体器官移植的人接受者中促进对获自活人供体的同种异体实体器官移植物的供体特异性耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)移除所述接受者的胸腺；
(b)用包括一种或多种免疫抑制剂的诱导免疫抑制方案治疗所述接受者，以耗尽所述接受者的T细胞和/或抑制所述接受者的T细胞排斥所移植的实体器官；
(c)提供来自活人供体的合适的实体器官；
(d)将所述实体器官移植至所述接受者中；
(e)用维持性免疫抑制方案治疗所述接受者；
(f)提供保持在冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品库中的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是由来自胸腺供体的胸腺组织处理的，所述胸腺供体表达所述实体器官移植物中不存在的与所述接受者中的HLA-I类和HLA-II类等位基因匹配的HLA等位基因；其中对所述供体胸腺组织进行调理方案持续约6天至约21天的时段；进一步，其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的胸腺组织切片；在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：所述胸腺器官培养基中的标志物L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1；其中所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平根据图56中所述标志物的水平增加或降低；
(g)解冻所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；以及
(h)将所解冻的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品植入至所述接受者中，其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的剂量为约1000-22000mm2胸腺组织表面积/m2接受者体表面积，并且进一步地，其中所述植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述接受者中诱导胸腺生成和耐受性
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，将约一半的所解冻的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品移植至所述接受者中并且将其余部分冷冻保存以供将来使用。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，在移植所述实体器官后约一个月或更长时间进行步骤(h)。
在本公开的一个方面，提供了一种用于在需要实体器官移植的人接受者中促进对获自死亡人供体的同种异体实体器官移植物的供体特异性耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)移除所述接受者的胸腺；
(b)用包括一种或多种免疫抑制剂的诱导免疫抑制方案治疗所述接受者，以耗尽所述接受者的T细胞和/或抑制所述接受者的T细胞排斥所移植的实体器官；
(c)提供来自活人供体的合适的实体器官；
(d)将所述实体器官移植至所述接受者中；
(e)用维持性免疫抑制方案治疗所述接受者；
(f)提供保持在冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品库中的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是由来自胸腺供体的胸腺组织处理的，所述胸腺供体表达所述实体器官移植物中不存在的与所述接受者中的HLA等位基因匹配的HLA等位基因；其中对所述供体胸腺组织进行调理方案持续约6天至约21天的时段；进一步，其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的胸腺组织切片，在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：标志物L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中如果所述标志物是L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7或IL-1，则所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平是降低的，或者如果所述标志物是CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，则所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平是增加的；
(g)解冻所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；以及
(h)将所解冻的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品植入至所述接受者中，其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的剂量为约1000-22000mm2胸腺组织表面积/m2接受者体表面积，并且进一步地，其中所述植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述接受者中诱导胸腺生成和耐受性。
在本公开的一个方面，提供了一种用于在需要实体器官移植的人接受者中促进对获自死亡人供体的同种异体实体器官移植物的供体特异性耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)移除所述接受者的胸腺；
(b)用包括一种或多种免疫抑制剂的诱导免疫抑制方案治疗所述接受者，以耗尽所述接受者的T细胞和/或抑制所述接受者的T细胞排斥所移植的实体器官；
(c)提供来自活人供体的合适的实体器官；
(d)将所述实体器官移植至所述接受者中；
(e)用维持性免疫抑制方案治疗所述接受者；
(f)提供保持在冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品库中的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是由来自胸腺供体的胸腺组织处理的，所述胸腺供体表达所述实体器官移植物中不存在的与所述接受者中的HLA等位基因匹配的HLA等位基因；其中对所述供体胸腺组织进行调理方案持续约6天至约21天的时段；进一步，其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的胸腺组织切片，在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：标志物L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1；其中所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平根据图7中的所述水平增加或降低；
(g)解冻所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；以及
(h)将所解冻的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品植入至所述接受者中，其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的剂量为约1000-22000mm2胸腺组织表面积/m2接受者体表面积，并且进一步地，其中所述植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述接受者中诱导胸腺生成和耐受性。
在本公开的一个方面，提供了一种冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，其通过包括以下步骤的方法制备：
(a)从供体获得合适的胸腺组织；
(b)对以下HLA等位基因进行分型：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB 1、HLA-DQB 1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DPB1、HLA-DPA1；
(c)对所述胸腺组织进行调理方案持续约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；
(d)在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：标志物L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中如果所述标志物是L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7或IL-1，则所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平是降低的，或者如果所述标志物是CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，则所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平是增加的；
(e)收回所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片以作为同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；
(f)将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在液氮中冷冻保存；以及
(g)将液氮中的所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品保持在冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品库中。
在本公开的一个方面，提供了一种冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，其通过包括以下步骤的方法制备：
(a)从供体获得合适的胸腺组织；
(b)对以下HLA等位基因进行分型：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB 1、HLA-DQB 1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DPB1、HLA-DPA1；
(c)对所述胸腺组织进行调理方案持续约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；
(d)在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：标志物L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1；其中所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平根据图7中的所述水平增加或降低；
(e)收回所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片以作为同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；
(f)将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在液氮中冷冻保存；以及
(g)将液氮中的所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品保持在冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品库中。
在本公开的一个方面，提供了一种用于在需要实体器官移植的人接受者中促进对获自死亡人供体的同种异体实体器官移植物的供体特异性耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)移除所述接受者的胸腺；
(b)用包括一种或多种免疫抑制剂的诱导免疫抑制方案治疗所述接受者，以耗尽所述接受者的T细胞和/或抑制所述接受者的T细胞排斥所移植的实体器官；
(c)提供来自活人供体的合适的实体器官；
(d)将所述实体器官移植至所述接受者中；
(e)用维持性免疫抑制方案治疗所述接受者；
(f)提供保持在冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品库中的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是由来自胸腺供体的胸腺组织处理的，所述胸腺供体表达所述实体器官移植物中不存在的与所述接受者中的HLA等位基因匹配的HLA等位基因；其中对所述供体胸腺组织进行调理方案持续约6天至约21天的时段；进一步，其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的胸腺组织切片，在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：所述胸腺器官培养基中的标志物L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中如果所述标志物是L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7或IL-1，则所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平是降低的，或者如果所述标志物是CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，则所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平是增加的；
(g)解冻所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；以及
(h)将所解冻的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品植入至所述接受者中，其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的剂量为约1000-22000mm2胸腺组织表面积/m2接受者体表面积，并且进一步地，其中所述植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述接受者中诱导胸腺生成和耐受性。
在本公开的一个方面，提供了一种冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，其通过包括以下步骤的方法制备：
(a)从供体获得合适的胸腺组织；
(b)对以下HLA等位基因进行分型：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB 1、HLA-DQB 1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DPB1、HLA-DPA1；
(c)对所述胸腺组织进行调理方案持续约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；
(d)在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：所述胸腺器官培养基中的标志物L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中如果所述标志物是L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7或IL-1，则所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平是降低的，或者如果所述标志物是CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，则所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平是增加的；
(e)收回所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片以作为同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；
(f)将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在液氮中冷冻保存；以及
(g)将液氮中的所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品保持在冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品库中。
在本公开的一个方面，提供了一种用于在需要实体器官移植的人接受者中促进对获自死亡人供体的同种异体实体器官移植物的供体特异性耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)移除所述接受者的胸腺；
(b)用包括一种或多种免疫抑制剂的诱导免疫抑制方案治疗所述接受者，以耗尽所述接受者的T细胞和/或抑制所述接受者的T细胞排斥所移植的实体器官；
(c)提供来自活人供体的合适的实体器官；
(d)将所述实体器官移植至所述接受者中；
(e)用维持性免疫抑制方案治疗所述接受者；
(f)提供保持在冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品库中的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是由来自胸腺供体的胸腺组织处理的，所述胸腺供体表达所述实体器官移植物中不存在的与所述接受者中的HLA等位基因匹配的HLA等位基因；其中对所述供体胸腺组织进行调理方案持续约6天至约21天的时段；进一步，其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的胸腺组织切片，在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：标志物L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1；其中所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平根据图56中所述标志物的水平增加或降低；
(g)解冻所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；以及
(h)将所解冻的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品植入至所述接受者中，其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的剂量为约1000-22000mm2胸腺组织表面积/m2接受者体表面积，并且进一步地，其中所述植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述接受者中诱导胸腺生成和耐受性
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述实体器官移植物是心脏移植物、肾脏移植物、肝脏移植物、肺移植物、心脏/肺移植物、胰腺移植物、肠移植物、胃移植物、腹壁移植物、颅面移植物、头皮移植物、阴茎移植物、子宫移植物、单侧或双侧上肢移植物、单侧血管化复合同种异体移植物或其组合。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述实体器官移植物是心脏移植物、或小儿心脏移植物、或成人心脏移植物。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述调理方案持续五天、或六天、或七天、或八天、或九天、或10天、或11天、或12天、或13天、或14天、或15天、或16天、或17天、或18天或19天、或20天、或21天的时段；或持续5-6天、或5-7天、或5-8天、或5-9天、或5-10天、或6至7天、或6至8天、或6至9天、或6至10天、或6至11天、或6至12天、或6至21天、或7至21天、或8至21天、或9至21天、或10至21天、或11至21天、或12至21天、13至21天或14至21天、或15至21天、或16至21天或17至21天或18至21天、或19至21天、或20至21天的时段。
在本公开的一个方面，提供了一种适于植入至人中的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，其包括以下步骤：
(a)从人供体获得合适的胸腺组织；
(b)对所述胸腺组织进行调理方案持续约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的胸腺组织切片；其中所述胸腺器官培养基中L-选择素和/或M-CSF和/或半乳凝素-7和/或IL-16的水平在所述调理方案的过程期间降低；进一步，其中所述胸腺器官培养基中CCL21和/或CXCL12和/或CXCL16和/或CCL11的水平在所述调理方案的过程期间增加；
(c)收获所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片以作为同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；
(d)将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在液氮中冷冻保存；以及
(e)将液氮中的所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品保持在冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品库中。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述胸腺器官培养基中CCL21的水平在所述调理方案的过程期间增加。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述胸腺器官培养基中L-选择素的水平在所述调理方案的过程期间降低。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述胸腺器官培养基中M-CSF、半乳凝素-7和IL-16中的一种或多种的水平在所述调理方案的过程期间降低。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述胸腺器官培养基中CCL21、CXCL12、CXCL16和CCL11中的一种或多种的水平在所述调理方案的过程期间增加。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：在所述调理方案期间在所述供体胸腺组织切片中确定散布在整个所述供体胸腺组织切片中的对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域、至少一个哈索尔小体的存在、散布在整个所述供体胸腺组织切片中的CK14染色以及完整核的存在。
在本公开的一个方面，提供了一种用于进行前述方面和实施方式中的任一种的方法的试剂盒，其连同确定同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是否适于植入至人中的使用说明书一起。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述试剂盒包括特异性结合标志物L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11的至少一种抗体。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述试剂盒包括特异性结合图56中所示的标志物的一种或多种抗体。
在本公开的一个方面，提供了一种用于确定根据前述方面和实施方式中任一项培养的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是否适于植入至人中的试剂盒，其连同使用说明书一起。
在本公开的方面的一个或多个实施方式中，所述试剂盒包括特异性结合标志物L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11的至少一种抗体。
应进一步了解，为清楚起见在本公开的不同方面的上下文中和/或分开实施方式中描述的本文所述的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为简洁起见在本公开的单个方面的上下文中和/或单个实施方式描述的各种特征也可以分开地或以任何合适的子组合提供。
附图说明
为了更完整地理解本文所公开的原理及其优点，参考结合附图进行的以下描述，在附图中：
图1描述了同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品(例如CTT、RVT-802)在植入后在先天性无胸腺症中提供免疫重建的方式。
图2示出了如实施例5中其他地方所述的用于通过以下方式在大鼠中重建免疫系统的步骤的示意图：在免疫正常的Lewis大鼠中移除胸腺、施用抗体以杀伤接受者大鼠的T细胞、将来自供体大鼠的培养的新生胸腺组织植入至接受者大鼠中、施用免疫抑制剂持续约4个月以及评价接受者大鼠中的T细胞发育。值得注意的是，治疗组中的所有大鼠在停止环孢霉素之前都具有超过10％的幼稚T细胞。
图3示出了实施例5的两只实验接受者大鼠(右侧的上升线)与未接受胸腺组织植入物的两只对照大鼠(基线处的粗线)的幼稚T细胞的发育。
图4示出了用于从供体收获胸腺、将用手动切片机制得的供体胸腺组织的薄切片培养至多21天并且将培养的胸腺组织植入至接受者的股四头肌中的生产过程的示意图。
图5A示出了示意图，所述示意图示出了用于表征测试的胸腺组织的切片，如在[00766]节中所讨论的。图5B是在如用于培养胸腺的组织培养皿中的手术海绵上的纤维素滤膜上的胸腺组织切片的图。
图6A-H描绘了从供体收获胸腺后的第5天、第9天、第12天和第21天，来自培养的胸腺组织的批次(MFG-056)的胸腺组织切片的组织学测试。在第5天(图6A、图6B)、第9天(图6C、图6D)、第12天(图6E、图6F)和第21天(图6G、图6H)分别示出了苏木精和曙红染色的切片(左小图)及其与抗细胞角蛋白抗体AE1/AE3的混合物的相应反应性(右小图；棕色表示阳性反应性)。每个小图的左下方的条表示100μm。具有H&E的小图示出了T细胞随时间的耗尽。图6E和图6F主要是上皮细胞。被膜下皮质上皮的凝缩随着胸腺细胞随时间耗尽发生。在胸腺的髓质区域中发生类似的凝缩。由杜克大学病理学系医学博士哲学博士(MD,PhD,Department of Pathology,Duke University)Laura P.Hale拍摄。
图7A和图7B分别以5mm(图9A)和100μm(图7B)的比例尺描绘了时程的第0天的胸腺组织切片的组织学。这示出了第0天的低倍(标尺5mm)和高倍(标尺100um)的胸腺和胸腺细胞。这是正常的胸腺。此时，皮质和髓质两者都具有大量的胸腺细胞，其中深蓝色的核有助于组织的整体深蓝色外观。由杜克大学病理学系医学博士哲学博士拍摄。
图8A和图8B是来自H&E染色载玻片的图像，其分别以5mm(图8A)和100μm(图8B)的比例尺描绘了时程的第5天的胸腺组织切片的组织学。胸腺细胞耗尽的进展导致组织的更多嗜酸性粒细胞(粉红色)外观。由杜克大学病理学系医学博士哲学博士拍摄。
图9A和图9B分别以5mm(图9A)和100μm(图9B)的比例尺描绘了时程的第12天的胸腺组织切片的H&E染色。我们看到胸腺细胞的进行性耗尽。较高的放大倍数显示出许多缺乏核的嗜酸性细胞体，所述嗜酸性细胞体可诊断已经经历了核溶解(核的溶解)的坏死细胞。这种程度的坏死是此时在培养中预期的。由杜克大学病理学系医学博士哲学博士拍摄。
图10A和图10B分别以5mm(图10A)和100μm(图10B)的比例尺描绘了时程的第21天的胸腺组织切片的H&E染色。注意保存了组织的整体结构，在图10B中包含了含有大量哈索尔小体的被膜下皮质、皮质区和髓质区。较小的深色细胞大部分是尚未经历溶核解的坏死胸腺细胞。由杜克大学病理学系医学博士哲学博士拍摄。
图11A-E描绘了用抗细胞角蛋白抗体(AE1/AE3)的混合物进行免疫染色的代表性胸腺切片。图11A.第0天；图11B.第5天；图11C.第9天；图11D.第12天；以及图11E.第21天。随着培养的进行，胸腺上皮网络的结构保持完整。标尺表示400μm。由杜克大学病理学系医学博士哲学博士拍摄。
图12A和12B描绘了暴露于10X PBS的强制降解条件之后的胸腺组织载玻片的组织学。图12A描绘了暴露于强制降解条件之后第9天的皮质。图12B描绘了暴露于强制降解条件之后第21天的皮质。在图12A中，蓝色的涂片是从细胞释放的DNA。尽管可以鉴定出具有完整核的细胞的小焦点，但大多数细胞显示出降解的迹象。由杜克大学病理学系医学博士哲学博士拍摄。
图13描绘了临床样品MLM247的H&E染色的组织学切片。这是培养的第0天。标尺是200um。这是来自第0天的冷冻切片。由于此切片已冷冻，因此组织看起来至第0天的石蜡包埋的福尔马林固定组织不同。由杜克大学病理学系医学博士哲学博士拍摄。
图14临床样品MLM219的冷冻切片，即H&E染色的组织学切片。这是一个冷冻切片，因此组织看起来与上文培养和呈现的石蜡包埋的福尔马林固定组织不同。然而，胸腺细胞耗尽的重要组织学特征和TEC的稳健活力已得到很好的体现。由杜克大学病理学系医学博士哲学博士拍摄。
图15是新鲜收获的胸腺组织的照片。
图16是描述如实施例5中所呈现的在大鼠肾被膜下的CTT的收获、培养、植入和植入活检的示意图。
图17A-D呈现了如实施例5中所述的从3日龄的F1(LWxDA)大鼠收获胸腺组织的照片，所述胸腺组织被切成四块(图17A)。如实施例5中所述，在37℃CO2培养箱中在具有胸腺器官培养基的无菌混合纤维素酯滤膜上培养5-7天的胸腺片的照片(图17B)。图17C是被植入在LW大鼠的肾被膜下的CTT的照片。图17D是在植入后6个月收获的胸腺移植物的照片。箭头指示肾被膜下的CTT。
图18A-D是描绘新鲜胸腺组织(顶部框架)和CTT(底部框架)在100x放大倍数下的组织学外观的照片。图18A示出了如实施例5中所述的H&E染色的新鲜胸腺组织(顶部框架)和培养5天的CTT(底部框架)中的髓质分化的比较。图18B示出了如实施例5中所述的当针对细胞角蛋白进行染色时与新鲜胸腺组织(顶部框架)相比可在培养5天的CTT(底部框架)中观察到的典型花边状图案。图18C示出了当针对Ki-67进行染色时，新鲜的胸腺组织(顶部框架)和耗尽T细胞的CTT(底部框架)。图18D示出了针对CD3进行染色的新鲜胸腺组织(顶部框架)和培养5天然后针对CD3进行染色的CTT胸腺组织(底部框架)。CD3染色的CTT(图18D，底部框架)中注意到的棕色染色可能表示某些活细胞以及尚未从组织中洗出的死T细胞的碎屑。
图19A-D是描绘新鲜胸腺组织(顶部框架)和CTT(底部框架)在600x放大倍数下的组织学外观的照片。图19A示出了如实施例5中所述的H&E染色的新鲜胸腺组织(顶部框架)和培养5天的CTT(底部框架)中的髓质分化的比较。图19B示出了如实施例5中所述的当针对细胞角蛋白进行染色时与新鲜胸腺组织(顶部框架)相比可在培养5天的CTT(底部框架)中观察到的典型花边状图案。图19C示出了当针对Ki-67进行染色时，新鲜的胸腺组织(顶部框架)和耗尽T细胞的CTT(底部框架)。图19D示出了针对DC3进行染色的新鲜胸腺组织(顶部框架)和培养5天然后针对CD3进行染色的CTT胸腺组织(底部框架)。CD3染色的CTT(图19D，底部框架)中注意到的棕色染色可能表示某些活细胞以及尚未从组织中洗出的死T细胞的碎屑。
图20是实施例5中报告的实验的实验设计示意图。此图发表于Kwun,J.等人,JCIInsight(2020)1月4日；5(11)中。
图21显示，在CTT同种异体植入后在右下象限中看到了再增殖的接受者型T细胞。此图发表于Kwun,J.等人,JCI Insight(2020)1月4日；5(11)中。
图22A和图22B示出了在植入后8.5个月移出的植入胸腺，其显示出阳性细胞角蛋白染色(图22A)以及与天然胸腺相似的T细胞染色(图22B)。原始放大倍数x 400。此图发表于Kwun,J.等人,JCI Insight(2020)1月4日；5(11)中。
图23示出了与未植入CTT的对照动物相比，循环性CD4和CD8 T细胞数量显著增加的图。所述图还显示，与未接受培养的胸腺组织植入(CTT)的对照组相比，CTT组中的幼稚CD4和幼稚CD8 T细胞数量显著增加，并且与未接受培养的胸腺组织植入(CTT)的对照组相比，CTT组中的CD4和CD8胸腺新迁出细胞(RTE)的数量显著增加。此图发表于Kwun,J.等人,JCI Insight(2020)1月4日；5(11)中。
图24示出了对在第180天移出的植入CTT的免疫组织学分析，所述分析示出了肾被膜下的正常胸腺组织学(图24A的右手侧)。图24B示出了在H&E上的移出的移植物。示出了针对活T细胞(CD3)、T细胞增殖(Ki67)和细胞角蛋白(通过兔多克隆抗体检测)的染色。在针对细胞角蛋白进行染色的小图中，观察到花边状图案，TEC上有哈索尔小体形成(箭头)。此图发表于Kwun,J.等人,JCI Insight(2020)1月4日；5(11)中。
图25示出了在具有CTT(实心三角形，蓝线)和没有CTT(倒置三角形，红线)的移植物(CTT)的情况下，在胸腺切除术和免疫抑制之后，进行DA心脏移植的LW大鼠的存活百分比。具有CTT的LW大鼠是耐受的；没有CTT的LW大鼠是免疫缺陷的且因此不排斥DA心脏。对照示出了LW未经操纵的大鼠中的DA心脏移植物的完全排斥(空心方块)。LW对照动物也不排斥LW心脏移植物(带水平线的空心圆)(n＝9)。此图发表于Kwun,J.等人,JCI Insight(2020)1月4日；5(11)中。
图26A和26B是来自植入有CTT的动物(26A)和未植入CTT的动物(26B)的移植同种异体移植物(DA心脏)的照片，所述照片示出了单核细胞浸润，图26C中没有描绘2004年国际心肺移植协会(International Society for Heart&Lung Transplantation)(ISHLT)的排斥迹象(蓝色实心和红色实心三角形)。此图发表于Kwun,J.等人,JCI Insight(2020)1月4日；5(11)中。
图27是在插入CTT的LW大鼠(其具有免疫能力并排斥宫颈同种异体BN心脏)和未插入CTT的对照LW动物(其由于胸腺缺乏而是免疫缺陷的并且不能排斥宫颈BN心脏)以及BN对照(排斥宫颈BN心脏的LW大鼠)和同基因对照(LW大鼠不排斥宫颈LW心脏)中，呈颈部百分比动物存活率形式的BN心脏移植物存活率相对于移植物存活天数的图。此图发表于Kwun,J.等人,JCI Insight(2020)1月4日；5(11)中。
图28A和图28B分别是在插入(图28A)和未插入(图28B)CTT的情况下BN心脏组织在第11天和第46天的照片。这些图片是图27和图29中的数据的基础。由于耐受性，图28A中的心脏未被排斥。由于胸腺缺乏所导致的免疫缺陷，图28B中的心脏未被排斥。此图发表于Kwun,J.等人,JCI Insight(2020)1月4日；5(11)中。
图29示出了宫颈BN心脏的排斥等级。放入LW大鼠中的同基因LW心脏(空心圆)未被排斥。放入LW大鼠中的BN心脏(实心圆圈)被排斥。放置在接受了CTT的LW大鼠中的BN心脏被排斥(实心方块)。放置在未接受CTT的LW大鼠中的BN心脏在2只大鼠中被微弱排斥(阴影三角形)，而未被其他三只大鼠排斥。这些数据显示，即使具有CTT的大鼠接受DA心脏(图26C)作为CTT表达的DA，其也能够强烈排斥第3方的心脏。没有CTT的大鼠是免疫缺陷的，并且既不排斥DA心脏(图26C)也不排斥BN心脏。此图发表于Kwun,J.等人,JCI Insight(2020)1月4日；5(11)中。
图30A和图30B分别是与LW和DA心脏相比，接受了或未接受CTT插入的大鼠的BN心脏的照片。在图30A中，在去除免疫抑制并移植BN心脏之后，由于所有的炎症，BN心脏被迅速排斥并且因此非常大。LW心脏的大小正常，用于心脏通过身体泵送血液。DA心脏很小，因为其放置在腹部，并且不需要泵送血液。在图30B中，大鼠是免疫缺陷的，并且在去除免疫抑制之后无法排斥心脏BN或DA心脏。此图发表于Kwun,J.等人,JCI Insight(2020)1月4日；5(11)中。
图31A和图31B是来自插入和未插入CTT的大鼠以及BN对照和同基因对照大鼠的移出宫颈BN心脏的排斥等级的图。图31A描绘了初次腹部DA心脏同种异体移植物中炎性细胞的定量。同基因对照显示，LW大鼠不排斥LW心脏。DA对照显示，LW大鼠确实排斥DA心脏。由于耐受性，CTT组不排斥DA心脏。由于胸腺缺乏所导致的免疫缺陷，没有CTT的组不排斥DA心脏。图31B描绘了在二次宫颈BN心脏同种异体移植物中炎性细胞的定量。同基因对照显示，LW大鼠不排斥LW心脏。BN对照显示，LW大鼠确实排斥BN心脏。CTT组由于其具有免疫能力而排斥BN心脏。由于胸腺缺乏所导致的免疫缺陷，没有CTT的组不排斥BN心脏。图31C示出了在宫颈BN心脏排斥时与天然LW心脏一起从LW接受者收获的DA和BN心脏大鼠。右下小图示出了BN心脏中导致其排斥的T细胞(棕色)。图31D示出了来自未插入CTT的对照动物的LW心脏、DA心脏和BN心脏中的T细胞浸润。由于动物是免疫缺陷的，因此不存在T细胞浸润。此图发表于Kwun,J.等人,JCI Insight(2020)1月4日；5(11)中。
图32A至图32C：CTT之后的体液耐受性。图32A示出了通过T细胞流式交叉匹配测量的移植后供体特异性同种异体抗体(抗DA抗体和抗BN抗体)的代表性直方图。图32A的左上小图(DA对照)示出了接受异位腹部DA心脏移植之后正常LW大鼠中抗DA抗体的产生(粗线)。图32A的中上小图显示，在接受了CTT的LW大鼠中缺乏抗DA抗体；这指示了耐受性。右上图显示，没有CTT的LW大鼠无应答；这反映了在胸腺切除术和T细胞耗尽之后未接收供体胸腺的大鼠的免疫缺陷。图32A的左下小图示出了由接受宫颈BN心脏的正常LW大鼠形成的正常抗BN抗体。图32A的中下小图示出了接受宫颈BN心脏移植之后，具有CTT的LW大鼠对BN的正常应答，这显示出免疫能力和排斥第3方的能力。图32A的右下小图显示，接受了宫颈BN心脏移植之后，没有CTT的LW大鼠对BN无应答，这显示出免疫能力不足和缺乏排斥第3方的能力。图32B示出了在初次DA心脏移植之后抗DA抗体的水平。具有来自LWxDA胸腺供体的CTT的LW大鼠在DA心脏移植之后不产生抗DA抗体，因为它们对DA具有耐受性。没有CTT的LW大鼠在DA心脏移植之后不产生抗DA抗体，因为它们具有免疫缺陷。图32C示出了在二次宫颈BN心脏移植后抗BN抗体的水平。具有来自LWxDA供体的CTT的LW大鼠产生针对BN的抗体，这显示出针对第3方的免疫能力。没有CTT的LW大鼠不产生针对BN的抗体，这显示出免疫能力不足。此图发表于Kwun,J.等人,JCI Insight(2020)1月4日；5(11)中。
图33A-J呈现了对来自8月龄非人灵长类动物(NHP)的新鲜且培养的NHP胸腺组织的免疫组织化学评估的显微照片。顶部行是收获当天的NHP胸腺，并且底部行是培养12天后的NHP胸腺。将组织用苏木精和曙红(图33A和图33F)、CD3(图33B和图33G)、泛细胞角蛋白(CK)抗体AE1/AE3(图33C和图33H)、Ki-67(图33D和图33I)和CK14(图33E和图33J)染色。所有图片是在20X放大倍数下。
图34A-P呈现了对培养12天后的来自8月龄非人灵长类动物(NHP)的冷冻保存的培养胸腺组织的分析。顶部行是在收获时(图34A)、在培养的第6天(图34B)、在培养的第12天(图34C)以及在培养12天后进行35天冷冻保存然后解冻用于拍拍摄(图34D)的细胞角蛋白。图34D中的细胞角蛋白(AE1/AE3)与图34C中的细胞角蛋白相似。第二行分别以相同时间点在图34E(收获)、图34F(培养的第6天)、图34G(培养的第12天)和图34H(在培养12天后进行35天冷冻保存然后解冻)中示出了CK14染色。图34H中的CK14与小图图34G中的CK14非常相似。第三行在图34I、图34J、图34K和图34L示出了相同时间点下的CD3染色，其具有经历时间的活T细胞的预期损失。小图图34L与小图图34K类似地具有非常少的T细胞。第四行图34M、图34N、图34O和图34P示出了相同时间点下的增殖T细胞的Ki-67染色。到第6天缺少用Ki-67的染色(图34N)，因为T细胞已经大部分死亡。此图示出了类似于将为患者冷冻保存培养的胸腺组织的方式冷冻保存非人灵长类动物胸腺的能力。所有图片是在40X放大倍数下。
图35呈现了使用最大MHC失配的无CMV恒河猴的实验移植策略的示意图。接受者动物(Y)经历完全胸腺切除术。供体动物(X)捐献培养的胸腺组织和在异位位置中放入接受者Y中的心脏两者(第一个Tx和第二Tx)。然后撤除免疫抑制药物，并且通过以下证明供体特异性耐受性：i)供体心脏的持续搏动，ii)在nMLR中对供体的耐受性与对第三方的反应性，以及iii)对来自第3方供体动物Z的皮肤移植物(第三Tx)的排斥。
图36示出了来自流式细胞术实验的结果图，其描述了鉴定胸腺新迁出细胞(RTE)的一般门控策略。收集非人灵长类动物外周血单核细胞并且使用多色流式细胞术分析。第一步是顶部行第一小图中的单细胞的鉴定。使用“单细胞群(Singlet)”来鉴定顶部行中第二小图中的淋巴细胞(低SSC、侧向散射和高CD45)。淋巴细胞中的CD3 T细胞在顶部行中的第3小图中鉴定出。将CD4和CD8细胞与CD3细胞门控分开，如顶部行的第4小图中所示。在底行第1小图中，使用CD4门，使用CD28和CD95来鉴定CD4+幼稚子集、中央记忆子集和效应记忆子集。在底行的第2小图中，使用CD31来显示作为RTE的CD4+幼稚细胞的百分比。底行的第3和第4小图显示出了与RTE相同的方法，但针对CD8幼稚T细胞。如可以看出的，RTE占CD4和CD8幼稚子集的99.6％和95.2％。
图37呈现了在培养的婴儿胸腺中CCL21评估的显微照片图像和图。CCL21由培养的婴儿胸腺以高水平产生。在培养的第16天与CCL21抗体(Ab)(棕色染色)的免疫组织化学反应性示出于左小图中(左上小图，2X放大倍数；左下小图，20X放大倍数)。在右侧示出了测量3种婴儿胸腺培养物的每日向培养基中的CCL21分泌的相应时程(R&D Systems Duo-SetELISA)。因此，培养的胸腺组织可以产生功能上重要的生物分子CCL21(负责将未成熟胸腺细胞前体引诱至胸腺的趋化因子)。
图38呈现了实施例8的实验设计的概要，所述实验设计涉及在无CMV的NHP模型中评估培养的胸腺组织的成功移植，之后对匹配心脏的耐受性和对不匹配的皮肤的排斥。特别是，在对接受者进行胸腺切除术(第2阶段的第1周)并确认完全胸腺切除术之后，对接受者进行T细胞耗尽并开始用他克莫司进行免疫抑制。在第3阶段的第3周，将来自无关NHP的未匹配培养的供体胸腺组织移植至接受者中。在第3阶段的第10周对胸腺移植物进行活检以评价胸腺生成。在几个月后幼稚T细胞发育之后，接受者应对供体具有耐受性。然后向接受者给予来自胸腺供体的异位心脏移植(第4阶段的第4周)。舍弃免疫抑制。跟踪心脏的搏动(证明耐受性)。另外，在第4阶段的第10周进行混合淋巴细胞反应，以显示对冷冻保存的供体细胞的耐受性和对第三方细胞的排斥。如果幼稚T细胞发育需要更多时间，则使用第5阶段。如果没有产生耐受性，则使用第6阶段。接受者胸腺将被移植至接受者NHP中，以证明胸腺组织移植程序在NHP中有效。
了解图38如何格式化是有帮助的。实验具有3只猴。请注意，原始电子表格在一页宽×多页长的文档中具有关于所有三只动物的程序。因为电子表格宽于本申请中允许的宽度，所以电子表格的每一行都分为3页。第一只猴是胸腺和心脏供体；此猴上的程序在第1、4、7等页的左侧栏中。第二只猴是胸腺和心脏接受者；中间栏中的信息是第2、5、8等页)。第三只猴是对照；右侧栏中的信息位于第3、6、9等页上)。
图39呈现了实施例9的实验设计的概要，除了添加另外的免疫抑制药物吗替麦考酚酯(MMF)之外，其与实施例8中的实验设计的概要相同。药物MMF通常用于心脏移植。本研究将评估MMF是否对培养的胸腺组织移植物有任何不利影响。
图40A-D呈现了培养d0的新鲜胸腺切片的显微照片，其显示出胸腺结构。在图40A-B中，苏木精和伊红(H&E)染色显示出清晰的皮质区域和较浅染色的髓质区域，正如正常小儿胸腺所预期的那样。图40C显示，用共同检测所有类型的上皮细胞的泛细胞角蛋白抗体(AE1/AE3)混合物的免疫组织化学证明胸腺上皮细胞存在于被膜下方以及皮质和髓质中的浅花边状网络中(棕色染色显示阳性抗体反应)。图40B和图40C中的箭头指向哈索尔小体。图40D示出了细胞角蛋白14(CK14)抗体染色(棕色)。CK14抗体与被膜下皮质中和髓质中的胸腺上皮细胞以及皮质中散布的胸腺上皮细胞发生反应。虚线突出显示被皮质包围的髓质区域。SCC表示被膜下皮质，Cor表示皮质，并且M表示髓质。图40A中的比例尺表示1mm；图40B-D中的比例尺表示500μm。
图41A-D呈现了显示培养的胸腺切片中哈索尔小体的实例的显微照片。哈索尔小体的组织学外观在培养的第0天(图41A-B)和第9天(图41C-D)显示出。图41A和图41C示出了苏木精和伊红(H&E)染色；图41B和图41D示出了与泛细胞角蛋白(AE1/AE3)抗体的反应性(棕色指示阳性反应)。图41A-D中的箭头状物指出了代表性的哈索尔小体，其由于周围胸腺细胞的耗尽和坏死而在培养的胸腺的H&E染色切片上显现为不太突出。然而，通过仔细检查或通过使用免疫组织化学，仍然可以容易地鉴定出哈索尔小体。图41A-D中的比例尺表示100μm。
图42A-D呈现了显示第7天培养的胸腺的结构的显微照片。图42A-B中的苏木精和伊红(H&E)染色显示出胸腺细胞的显著耗尽，但一些皮质区域(Cor)仍然含有大量具有保留核的胸腺细胞。图42C中的泛细胞角蛋白(AE1/AE3)和图42D中的细胞角蛋白14(CK14)免疫组织化学显示出被膜下皮质(SCC)中和髓质(M)中胸腺上皮的凝缩。图42C-D中的棕色指示与抗体的阳性反应。比例尺在图42A中表示1mm，并且在图42B-D中表示500μm。
图43A-D呈现了示出第9天培养的胸腺的结构的显微照片。图43A-B示出了苏木精和曙红(H&E)染色。在图43A中由虚线包围的淡白染色区域中存在很少活T细胞或胸腺上皮细胞(如果有的话)，其几乎完全坏死(Necr)。原来存在于此区域的大多数核已经由核溶解降解。来自残余胸腺细胞的核未完全降解的其他区域继续被苏木精染色为深蓝色。图43B中的箭头指向哈索尔小体。图43C示出了泛细胞角蛋白(AE1/AE3)免疫反应性(棕色)；图43D示出了细胞角蛋白14(CK14)免疫反应性(棕色)。比例尺在图43A中表示1mm，并且在图43B-D中表示500μm。
图44A-D呈现了显示第12天培养的胸腺的结构的显微照片。图44A-B示出了苏木精和曙红(H&E)染色。在此时间点，许多胸腺细胞已经从组织中丧失或者已经死亡，并且它们的核已经溶解，从而使组织更加嗜酸性(粉红色)。一些区域保留了正常未培养的胸腺的结构特征，其具有染色更加嗜碱性(蓝色)的皮质样区域(Cor)和髓质样区域(M)，但具有大大减少的胸腺细胞细胞构成。图44C示出了泛细胞角蛋白(AE1/AE3)免疫反应性(棕色)；图44D示出了细胞角蛋白14(CK14)免疫反应性(棕色)。此时，被膜下皮质(SCC)已经增厚并且上皮细胞显现为更加突出，这是由于存在的胸腺细胞数量减少。箭头指向代表性哈索尔小体。标尺在图44A中表示1mm，且在图44B-D中表示500μm。
图45A-D呈现了显示第20天培养的胸腺的结构的显微照片。图45A-B示出了苏木精和曙红(H&E)染色。在此时间点，大多数胸腺细胞已经从组织中丧失或者已经死亡，并且它们的核已经溶解，从而使组织更加嗜酸性(粉红色)。大群残余胸腺细胞很少见，但具有胸腺细胞的核特征的散布细胞是明显的。图45C示出了泛细胞角蛋白(AE1/AE3)免疫反应性(棕色)。由于髓质胸腺细胞的丧失，原来存在于髓质区域(M)中的许多上皮被凝缩，但散布的上皮细胞指示胸腺上皮细胞的残留浅花边状三维网络仍保持。在图45D中，细胞角蛋白14(CK14)免疫组织化学(棕色)突出显示了前髓质区域和被膜下皮质。箭头指向代表性哈索尔小体。比例尺在图45A中表示1mm，并且在图45B-D中表示500μm。
图46A-B呈现了显示胸腺切片中完整核的实例的显微照片。完整胸腺上皮细胞核(箭头)的实例显示在第9天的被膜下皮层中(图46A)和第21天的髓质中(图46B)。苏木精和伊红染色；比例尺表示50μm。
图47A-E呈现了显示在不同时间点培养的胸腺组织的胸腺上皮网络的比较的显微照片。图47A示出了第0天，图47B示出了第5天，图47C示出了第9天，图47D示出了第12天，并且图47E示出了第21天。虽然在胸腺细胞耗尽和坏死量方面存在时间点相关差异，使得组织随着时间的变得不太嗜碱性(蓝色)，但随着培养的进行，胸腺上皮网络(棕色)的结构仍保持完整。随着居间的胸腺细胞耗尽，皮质上皮和髓质上皮两者都可能凝缩。棕色指示与抗细胞角蛋白抗体(AE1/AE3)的混合物的阳性反应；苏木精复染。比例尺表示400μm。
图48A-K呈现了显示胸腺切片中CD3免疫组织化学随培养时间的实例的显微照片。图48A-B显示，在第0天，皮质中基本上所有未成熟T细胞和髓质中更成熟的细胞与CD3抗体强烈反应。更高的放大倍数(图48B)示出了被棕色免疫反应环包围的淡蓝色核，这与CD3的膜表达一致。在图48C-E中，组织在第7天仍显示出与CD3抗体的广泛反应性。然而，图48D-E显示，当在更高放大倍数下观察时，大多数免疫反应(棕色)与来自死胸腺细胞的碎片相关联，因为大多数棕色焦点缺乏核的迹象(图48D)。仍然可以在远离碎片的区域鉴定出展示完整核和膜染色(箭头)的细胞的小焦点(图49E)。随着培养进行至第9天(图48F-G)、第12天(图48H-I)和第21天(图48J-K)，与胸腺细胞碎片的反应性保持强烈，从而难以可靠地检测碎片之中可能完整的细胞。所示切片全部来自代表在这些时间点检查的多个批次的单一批次。比例尺在图48A、图48C、图48F、图48H和图48J中表示500μm，并且在图48B、图48D、图48E、图48G、图48I和图48K中表示50μm。
图49A-K呈现了显示胸腺切片中Ki-67免疫组织化学随培养时间变化的实例的显微照片。所示切片全部来自代表在相似的时间点检查的多个批次的单一批次。图49A-B显示，在第0天，皮质(Cor)中的大多数未成熟T细胞的核与对Ki-67具有特异性的抗体强烈反应。更高的放大倍数(图49B)示出了与皮质胸腺细胞(棕色)的核的强烈阳性反应，而髓质(M)中只有少见的淋巴细胞与Ki-67抗体反应。图49C-E显示，到第7天，残留在皮质区域的大多数胸腺细胞的核很小，其中不清楚的核边界与细胞凋亡一致，并且它们不能与Ki-67特异性抗体反应。与抗体反应的细胞(图49E，箭头)具有较大的核，这表明它们是胸腺上皮细胞。在第9天(图49F-G)、第12天(图49H-I)和第21天(图49J-K)观察到残余胸腺细胞核的Ki-67标记的类似缺乏。比例尺在图49A、图49C、图49E、图49G和图49I中表示500μm，并且在图49B、图49D、图49F、图49H和图49J中表示50μm。
图50A至图50H示出了在来自人胸腺器官培养物的条件培养基中检测到的选择可溶性分子的图。图50A是L-选择素(Ln/pg)相对于培养天数的图；图50B是M-CSF(Ln/pg)相对于培养天数的图；图50C是半乳凝素-7(Ln/pg)相对于培养天数的图；图1D是IL-16(Ln/pg)相对于培养天数的图；图50E是CCL21(Ln/pg)相对于培养天数的图；图50F是CXCL16(Ln/pg)相对于培养天数的图；图50G是CCL11(Ln/pg)相对于培养天数的图；并且图50H是CXCL12(Ln/pg)相对于培养天数的图。
图51示出了从培养过程的第1天至第21天评估人胸腺的培养切片中的胸腺细胞含量(pg/ml)的图。
图52示出了人胸腺组织的培养切片中活的胸腺细胞随时间变化的免疫组织化学评估照片。图52A是用抗CD3抗体鉴定作为T谱系的细胞和用抗Ki-67抗体鉴定增殖细胞的免疫组织化学照片，展示出于培养早期胸腺细胞活力的迅速丧失。图52B是第0天的照片，其描绘了皮质和髓质中基本上所有未成熟T细胞的质膜显现为以膜模式与抗CD3强烈反应。图52C描绘使用对Ki-67增殖标志物具有特异性的抗体的免疫组织化学在第0天显示出与皮质胸腺细胞的丰富反应性。图52D示出了在第9天培养的胸腺的组织学，其使用苏木精和伊红染色。减少的嗜碱性粒细胞(蓝色)指示在培养过程中供体胸腺细胞的丧失；图52E描绘了在培养数天后，大多数棕色是由于在死胸腺细胞经历核溶解/核的溶解之后残留的无核但仍具有免疫反应性的碎片。图52F描绘了在器官培养过程中发生的胸腺细胞死亡，从而在培养过程中的后期时间点仅与在形态学上与TE细胞一致的较大细胞产生Ki-67免疫反应性。
图53A示出了来自培养的胸腺组织的条件培养基的CCL21水平(pg/ml)相对于培养天数的图。图53B是对胸腺组织进行调理的切片程序的图解。图53C是胸腺器官组织培养物的切片的CCL21分泌随时间变化的图。
图54A至图54D是描绘了培养的和非培养的胸腺组织中的免疫反应性的照片。图54A是在培养的第0天髓质区域的照片，但还包括散布在整个皮质中的TECS；图54B是在培养的第16天髓质区域的照片，但还包括散布在整个图像中的TECS；图54C是在培养的第0天髓质区域中的TEC以及皮质区域中散布的TEC的照片。图54D是在培养的第16天髓质区域中的TEC以及皮质区域中散布的TEC的照片。
图55A至图55F是在整个生命周期中胸腺组织中选择mRNA的表达图。根据制造商的说明，使用QuantiGene测定(Thermo Fisher)定量存在于胸腺组织的FFPE切片中的靶mRNA的相对量。每种靶mRNA的数据均呈现为针对GAPDH归一化(“未经调整”)，然后进一步针对含有胸腺上皮的面积％(“按TE调整”)或包含CD1a阳性皮质胸腺细胞的面积％(“按Cor调整”)归一化。所示的数据获自47个胸腺样品，所述样品来源于年龄范围为从5天至78岁的供体。图55A和55B分别是：从≤18岁的供体(n＝25)获得的胸腺组织当与18岁以上的供体相比时显示出编码T细胞标志物CD3ε和皮质胸腺细胞标志物CD1a的mRNA相对于GAPDH的更高表达(图55A、B)。图55C和55D是分别描绘了与更年长成人相比，在≤18岁的供体中编码细胞角蛋白8(KRT8)和14(KRT14)的mRNA相对于GAPDH减少的照片(图55C、D)。图55E是描绘了未经调整的CCL21基因表达的照片，所述CCL21基因表达在来自≤18岁的供体的胸腺中相对于GAPDH始终较低。图55F是描绘了未经调整的CXCL21基因表达的照片，所述CXCL21基因表达在来自≤18岁的供体的胸腺中相对于GAPDH始终较低。
图56是存在于胸腺器官培养物的用过培养基中的蛋白质的表，如由多重抗体阵列确定的。
图57A至57C是胸腺组织的形态学测量的照片。根据制造商的说明，使用ImageScope软件(Aperio Technologies,Leica Biosystems imaging,Inc.)提供的“笔形工具”勾勒出每个测量中包括的区域。图57A示出了以绿色勾勒的H&E染色载玻片上的胸腺组织的总区域。进一步以浅绿色勾勒出此区域中含有淋巴细胞的部分。图57B是示出了切片上以黄色勾勒出的含有胸腺上皮的区域(“TE区域”)的照片，所述胸腺上皮与AE1/AE3混合物反应以鉴定泛细胞角蛋白。图57C是示出了切片上以红色勾勒出的含有未成熟胸腺细胞的区域(“皮质区域”)的照片，所述未成熟胸腺细胞与CD1a抗体反应。所示胸腺来源于在主动脉瓣置换手术时的32岁女性。每个小图的比例尺＝4mm。在图57B和57C的小图中，棕色指示与抗体的阳性反应。
图58A至58C是描绘了培养21天的胸腺组织切片中的少数活的胸腺细胞的照片。图58A是描绘了如由H&E切片中明显缺乏嗜碱性粒细胞(蓝色)所指示的，在培养第21天含有少数完整胸腺细胞的胸腺切片的照片。图58B是描绘了培养的胸腺组织切片的照片，其中用CD3免疫组织化学看到的大部分强烈棕色免疫反应与无核细胞碎片相关联，但表现出尚未经历核溶解的坏死细胞特征性的核和细胞质染色(插图)的死胸腺细胞并不少见。图58C是描绘了在第21天的Ki-67免疫反应性限于具有胸腺上皮细胞特征性的较大核的细胞的照片。标尺在主小图中表示300μm并且在插图中表示50μm。
图59A至59C是示出了用于基因表达分析的人胸腺组织的特征的图。图59A描绘了所研究的胸腺组织的年龄和性别分布，其中下方黑色实心圆圈指示女性，上方空心圆圈指示男性，并且中间灰色圆圈指示一名未知性别的供体。图59B绘制了含有胸腺上皮细胞的面积％随此组胸腺组织的年龄的变化。图59C绘制了如由CD1a阳性胸腺细胞定义的具有活跃胸腺生成的面积％随此组胸腺组织的年龄的变化。
图60是新鲜收获的胸腺组织的照片。
图61A和61B描绘了暴露于10X PBS的强制降解条件之后的胸腺组织载玻片的组织学。图61A描绘了暴露于强制降解条件之后第9天的皮质。图61B描绘了暴露于强制降解条件之后第21天的皮质。在图61A中，蓝色的涂片是从细胞释放的DNA。尽管可以鉴定出具有完整核的细胞的小焦点，但大多数细胞显示出降解的迹象。由杜克大学病理学系医学博士哲学博士拍摄。
图62A示出了示意图，所述示意图示出了用于表征测试的胸腺组织的切片，如在[00520]节中所讨论的。图62B是在如用于培养胸腺的组织培养皿中的手术海绵上的纤维素滤膜上的胸腺组织切片的图。
图63A至63H描绘了从供体收获胸腺后的第5天、第9天、第12天和第21天，来自培养的胸腺组织的批次(MFG-056)的胸腺组织切片的组织学测试。在第5天(图63A、图63B)、第9天(图63C、图63D)、第12天(图63E、图63F)和第21天(图63G、图63H)分别示出了苏木精和曙红染色的切片(左小图)及其与抗细胞角蛋白抗体AE1/AE3的混合物的相应反应性(右小图；棕色表示阳性反应性)。每个小图的左下方的条表示100μm。具有H&E的小图示出了T细胞随时间的耗尽。图14E和图63F主要是上皮细胞。被膜下皮质上皮的凝缩随着胸腺细胞随时间耗尽发生。在胸腺的髓质区域中发生类似的凝缩。由杜克大学病理学系医学博士哲学博士拍摄。
图64A和图64B分别以5mm(图64A)和100μm(图64B)的比例尺描绘了时程的第0天的胸腺组织切片的组织学。这示出了第0天的低倍(标尺5mm)和高倍(标尺100um)的胸腺和胸腺细胞。这是正常的胸腺。此时，皮质和髓质两者都具有大量的胸腺细胞，其中深蓝色的核有助于组织的整体深蓝色外观。由杜克大学病理学系医学博士哲学博士拍摄。
图65A和图65B是来自H&E染色载玻片的图像，其分别以5mm(图65A)和100μm(图65B)的比例尺描绘了时程的第5天的胸腺组织切片的组织学。胸腺细胞耗尽的进展导致组织的更加嗜酸性(粉红色)外观。由杜克大学病理学系医学博士哲学博士拍摄。
图66A和图66B分别以5mm(图66A)和100μm(图66B)的比例尺描绘了时程的第12天的胸腺组织切片的H&E染色。我们看到胸腺细胞的进行性耗尽。较高的放大倍数显示出许多缺乏核的嗜酸性细胞体，所述嗜酸性细胞体可诊断已经经历了核溶解(核的溶解)的坏死细胞。这种程度的坏死是此时在培养中预期的。由杜克大学病理学系医学博士哲学博士拍摄。
图67A和图67B分别以5mm(图67A)和100μm(图67B)的比例尺描绘了时程的第21天的胸腺组织切片的H&E染色。注意保存了组织的整体结构，在图67B中包含了含有大量哈索尔小体的被膜下皮质、皮质区和髓质区。较小的深色细胞大部分是尚未经历溶核解的坏死胸腺细胞。由杜克大学病理学系医学博士哲学博士拍摄。
图68A-E描绘了用抗细胞角蛋白抗体(AE1/AE3)的混合物进行免疫染色的代表性胸腺切片。图68A.第0天；图68B.第5天；图68C.第9天；图68D.第12天；以及图68E.第21天。随着培养的进行，胸腺上皮网络的结构保持完整。标尺表示400μm。由杜克大学病理学系医学博士哲学博士拍摄。
图69呈现了在培养的婴儿胸腺中CCL21评估的显微照片图像和图。CCL21由培养的婴儿胸腺以高水平产生。在培养的第16天与CCL21抗体(Ab)(棕色染色)的免疫组织化学反应性示出于左小图中(左上小图，2X放大倍数；左下小图，20X放大倍数)。在右侧示出了测量3种婴儿胸腺培养物的每日向培养基中的CCL21分泌的相应时程(R&D Systems Duo-SetELISA)。因此，培养的胸腺组织可以产生功能上重要的生物分子CCL21(负责将未成熟胸腺细胞前体引诱至胸腺的趋化因子)。
图70A至70D呈现了培养d0的新鲜胸腺切片的显微照片，其显示出胸腺结构。在图70A-B中，苏木精和伊红(H&E)染色显示出清晰的皮质区域和较浅染色的髓质区域，正如正常小儿胸腺所预期的那样。图70C显示，用共同检测所有类型的上皮细胞的泛细胞角蛋白抗体(AE1/AE3)混合物的免疫组织化学证明胸腺上皮细胞存在于被膜下方以及皮质和髓质中的浅花边状网络中(棕色染色显示阳性抗体反应)。图70B和图70C中的箭头指向哈索尔小体。图70D示出了细胞角蛋白14(CK14)抗体染色(棕色)。CK14抗体与被膜下皮质中和髓质中的胸腺上皮细胞以及皮质中散布的胸腺上皮细胞发生反应。虚线突出显示被皮质包围的髓质区域。SCC表示被膜下皮质，Cor表示皮质，并且M表示髓质。图70A中的比例尺表示1mm；图70B-D中的比例尺表示500μm。
图71A至71D呈现了显示培养的胸腺切片中哈索尔小体的实例的显微照片。哈索尔小体的组织学外观在培养的第0天(图71A-B)和第9天(图71C-D)显示出。图71A和图71C示出了苏木精和伊红(H&E)染色；图71B和图71D示出了与泛细胞角蛋白(AE1/AE3)抗体的反应性(棕色指示阳性反应)。图71A-D中的箭头状物指出了代表性的哈索尔小体，其由于周围胸腺细胞的耗尽和坏死而在培养的胸腺的H&E染色切片上得不太突出。然而，通过仔细检查或通过使用免疫组织化学，仍然可以容易地鉴定出哈索尔小体。图71A-D中的比例尺表示100μm。
图72A至72D呈现了显示第7天培养的胸腺的结构的显微照片。图72A-B中的苏木精和伊红(H&E)染色显示出胸腺细胞的显著耗尽，但一些皮质区域(Cor)仍然含有大量具有保留核的胸腺细胞。图72C中的泛细胞角蛋白(AE1/AE3)和图72D中的细胞角蛋白14(CK14)免疫组织化学显示出被膜下皮质(SCC)中和髓质(M)中胸腺上皮的凝缩。图72C-D中的棕色指示与抗体的阳性反应。比例尺在图23中表示1mm，并且在图72B-D中表示500μm。
图73A至73D呈现了示出第9天培养的胸腺的结构的显微照片。图73A-B示出了苏木精和曙红(H&E)染色。在图73A中由虚线包围的淡白染色区域中存在很少活T细胞或胸腺上皮细胞(如果有的话)，其几乎完全坏死(Necr)。原来存在于此区域的大多数核已经由核溶解降解。来自残余胸腺细胞的核未完全降解的其他区域继续被苏木精染色为深蓝色。图73B中的箭头指向哈索尔体。图73C示出了泛细胞角蛋白(AE1/AE3)免疫反应性(棕色)；图73D示出了细胞角蛋白14(CK14)免疫反应性(棕色)。比例尺在图73A中表示1mm，并且在图73B-D中表示500μm。
图74A至74D呈现了示出第12天培养的胸腺的结构的显微照片。图74A-B示出了苏木精和曙红(H&E)染色。在此时间点，许多胸腺细胞已经从组织中丧失或者已经死亡，并且它们的核已经溶解，从而使组织更加嗜酸性(粉红色)。一些区域保留了正常未培养的胸腺的结构特征，其具有染色更加嗜碱性(蓝色)的皮质样区域(Cor)和髓质样区域(M)，但具有大大减少的胸腺细胞细胞构成。图74C示出了泛细胞角蛋白(AE1/AE3)免疫反应性(棕色)；图74D示出了细胞角蛋白14(CK14)免疫反应性(棕色)。此时，被膜下皮质(SCC)已经增厚并且上皮细胞显现为更加突出，这是由于存在的胸腺细胞数量减少。箭头指向代表性哈索尔小体。标尺在图74A中表示1mm，且在图74B-D中表示500μm。
图75A-B示出了苏木精和曙红(H&E)染色。在此时间点，大多数胸腺细胞已经从组织中丧失或者已经死亡，并且它们的核已经溶解，从而使组织更加嗜酸性(粉红色)。大群残余胸腺细胞很少见，但具有胸腺细胞的核特征的散布细胞是明显的。图75C示出了泛细胞角蛋白(AE1/AE3)免疫反应性(棕色)。由于髓质胸腺细胞的丧失，原来存在于髓质区域(M)中的许多上皮被凝缩，但散布的上皮细胞指示胸腺上皮细胞的残留浅花边状三维网络仍保持。在图75D中，细胞角蛋白14(CK14)免疫组织化学(棕色)突出显示了前髓质区域和被膜下皮质。箭头指向代表性哈索尔小体。比例尺在图75A中表示1mm，并且在图75B-D中表示500μm。
图76A-B呈现了显示胸腺切片中完整核的实例的显微照片。完整胸腺上皮细胞核(箭头)的实例显示在第9天的被膜下皮层中(图76A)和第21天的髓质中(图76B)。苏木精和伊红染色；比例尺表示50μm。
图77A至77E呈现了显示在不同时间点培养的胸腺组织的胸腺上皮网络的比较的显微照片。图77A示出了第0天，图77B示出了第5天，图77C示出了第9天，图77D示出了第12天，并且图77E示出了第21天。虽然在胸腺细胞耗尽和坏死量方面存在时间点相关差异，使得组织随着时间的变得不太嗜碱性(蓝色)，但随着培养的进行，胸腺上皮网络(棕色)的结构仍保持完整。随着居间的胸腺细胞耗尽，皮质上皮和髓质上皮两者都可能凝缩。棕色指示与抗细胞角蛋白抗体(AE1/AE3)的混合物的阳性反应；苏木精复染。比例尺表示400μm。
图78A-K呈现了显示胸腺切片中CD3免疫组织化学随培养时间的实例的显微照片。图78A-B显示，在第0天，皮质中基本上所有未成熟T细胞和髓质中更成熟的细胞与CD3抗体强烈反应。更高的放大倍数(图78B)示出了被棕色免疫反应环包围的淡蓝色核，这与CD3的膜表达一致。在图78C-E中，组织在第7天仍显示出与CD3抗体的广泛反应性。然而，图78D-E显示，当在更高放大倍数下观察时，大多数免疫反应(棕色)与来自死胸腺细胞的碎片相关联，因为大多数棕色焦点缺乏核的迹象(图78D)。仍然可以在远离碎片的区域鉴定出展示完整核和膜染色(箭头)的细胞的小焦点(图78E)。随着培养进行至第9天(图78F-G)、第12天(图78H-I)和第21天(图78J-K)，与胸腺细胞碎片的反应性保持强烈，从而难以可靠地检测碎片之中可能完整的细胞。所示切片全部来自代表在这些时间点检查的多个批次的单一批次。比例尺在图78A、图78C、图78F、图78H和图78J中表示500μm，并且在图78B、图78D、图78E、图78G、图78I和图78K中表示50μm。
图79A-K呈现了显示胸腺切片中Ki-67免疫组织化学随培养时间变化的实例的显微照片。所示切片全部来自代表在相似的时间点检查的多个批次的单一批次。图79A-B显示，在第0天，皮质(Cor)中的大多数未成熟T细胞的核与对Ki-67具有特异性的抗体强烈反应。更高的放大倍数(图79B)示出了与皮质胸腺细胞(棕色)的核的强烈阳性反应，而髓质(M)中只有少见的淋巴细胞与Ki-67抗体反应。图79C-E显示，到第7天，残留在皮质区域的大多数胸腺细胞的核很小，其中不清楚的核边界与细胞凋亡一致，并且它们不能与Ki-67特异性抗体反应。与抗体反应的细胞(图79E，箭头)具有较大的核，这表明它们是胸腺上皮细胞。在第9天(图79F-G)、第12天(图79H-I)和第21天(图79J-K)观察到残余胸腺细胞核的Ki-67标记的类似缺乏。比例尺在图79A、图79C、图79E、图79G和图79I中表示500μm，并且在图79B、图79D、图79F、图79H和图79J中表示50μm。
图80是在来自人胸腺器官培养物的条件培养基中检测到的uPAR的图。
图81是在来自人胸腺器官培养物的条件培养基中检测到的OPN的图。
图82是在来自人胸腺器官培养物的条件培养基中检测到的MIP3a的图。
图83是在来自人胸腺器官培养物的条件培养基中检测到的IGFBP-1的图。
图84是在来自人胸腺器官培养物的条件培养基中检测到的MIF的图。
图85是用过培养基中的CCL21浓度相对于天数的散布图。
图86是用过培养基中的CCL21浓度相对于天数的箱形图。
图87是图4的图：强制降解研究-批次MFG-053和批次-054中的CCL21水平(pg/mL)。
图88是强制降解研究-批次MFG-066中的CCL21水平(pg/mL)的图。
图89是用过培养基中的CXCL16浓度相对于天数的散布图。
图90是用过培养基中的CXCL16浓度相对于天数的箱形图。
图91是强制降解研究-批次MFG-053和批次MFG-054中的CXCL16水平(pg/mL)的散布图。
图92是强制降解研究-批次MFG-066中的CXCL21水平的散布图。
图93是用过培养基中的L-选择素浓度相对于天数的散布图。
图94是用过培养基中的L-选择素浓度相对于天数的箱形图。
图95是强制降解研究-批次MFG-053和批次MFG-054中的L-选择素水平(pg/mL)的散布图。
图96是强制降解研究-批次MFG-066中的L-选择素水平的散布图。
图97是用过培养基中的uPAR浓度相对于天数的散布图。
图98是用过培养基中的uPAR浓度相对于天数的箱形图。
图99是强制降解研究-批次MFG-053和批次MFG-054中的uPAR水平(pg/mL)的散布图。
图100是强制降解研究-批次MFG-066中的uPAR水平的散布图。
图101是CXCL16相对于CCL21的散布图。
图102是CCL21相对于uPAR的二次回归模型。
图103是CXCL16相对于uPAR的二次回归模型。
图104是用过培养基中的CCL11浓度相对于天数的散布图。
图105是用过培养基中的CCL11浓度相对于天数的箱形图。
图106是用过培养基中的CCL11浓度相对于天数的线性回归模型。
图107是强制降解研究-批次MFG-053和批次MFG-054中的CCL11水平(pg/mL)的图。
图108是强制降解研究-批次MFG-066中的CCL11水平的图。
图109是用过培养基中的OPN浓度相对于天数的散布图。
图110是用过培养基中的OPN浓度相对于天数的箱形图。
图111是用过培养基中的OPN浓度相对于天数的二次回归模型。
图112是强制降解研究-批次MFG-053和批次MFC-054中的OPN水平(pg/mL)的图。
图113是强制降解研究-批次MFG-066中的OPN水平的图。
图114是用过培养基中的CXCL12浓度相对于天数的散布图。
图115是用过培养基中的CXCL12浓度相对于天数的箱形图。
图116是用过培养基中的CXCL12浓度相对于天数的拟合线图。
图117是强制降解研究-批次MFG-053和批次MFG-054中的CXCL12水平(pg/mL)的散布图。
图118是强制降解研究-批次MFG-066中的CXCL12水平的散布图。
图119是用过培养基中的CCL20浓度相对于天数的散布图。
图120是用过培养基中的CCL20浓度相对于天数的箱形图。
图121是用过培养基中的CCL20浓度相对于天数的三次回归模型。
图122是强制降解研究-批次MFG-053和批次MFG-054中的CCL20水平(pg/mL)的散布图。
图123是强制降解研究-批次MFG-066中的CCL20水平的散布图。
图124是用过培养基中的IL-16浓度相对于天数的散布图。
图125是用过培养基中的IL-16浓度相对于天数的箱形图。
图126是用过培养基中的IL-16浓度相对于天数的拟合线图。
图127是强制降解研究-批次MFG-053和批次MFG-054中的IL-16水平(pg/mL)的散布图。
图128是强制降解研究-批次MFG-066中的IL-16水平的散布图。
图129是用过培养基中的IGFBP-1浓度相对于天数的散布图。
图130是用过培养基中的IGFBP-1浓度相对于天数的箱形图。
图131是用过培养基中的IGFBP-1浓度相对于天数的拟合线图。
图132是强制降解研究-批次MFG-053中的IGFBP-1水平(pg/mL)的散布图。
图133是强制降解研究-批次MFG-066中的OGFBP-1水平的散布图。
图134是用过培养基中的MIF浓度相对于天数的散布图。
图135是用过培养基中的MIF浓度相对于天数的箱形图。
图136是用过培养基中的MIF浓度相对于天数的线性回归模型。
图137是强制降解研究-批次-MFG-053和批次MFG-054中的MIF水平(pg/mL)的散布图。
图138是强制降解研究-批次MFG-066中的MIF水平的散布图。
图139是用过培养基中的CCL25浓度相对于天数的散布图。
图140是用过培养基中的CCL25浓度相对于天数的箱形图。
图141是用过培养基中的MIF浓度相对于天数的线性回归模型图。
图142是强制降解研究-批次-053和批次-054中的CCL25水平(pg/mL)的散布图。
图143是强制降解研究-批次MFG-066中的CCL25水平的散布图。
具体实施方式
本文提供的名称、标题和子标题不应被解释为限制本公开的各个方面。因此，通过从整体上参考说明书，可以更全面地定义下文定义的术语。本文中引用的所有参考文献均通过引用整体并入。
除非另有定义，否则本文使用的科学和技术术语将具有由本领域普通技术人员通常所理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。在本申请中，除非另有陈述，否则“或”的使用意指“和/或”。在多个从属权利要求的上下文中，“或”的使用仅是指替代方案中的超过一个的独立于先前的权利要求或从属的权利要求。
还应注意的是，如本说明书和所附权利要求所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”以及任何词语的任何单数使用包括复数个指示物，除非明确地并且清楚地限于一个/种指示物。如本文所用，术语“包括”及其语法变体旨在是非限制性的，使得列表中项目的叙述不排除可以取代或添加至所列项目的其他类似项目。
参考以下定义，最清楚地理解本发明：
术语“约”在本文中用于意指大约、在某一范围内、大致上或周围。在术语“约”结合数字范围使用时，其通过扩展所阐述数值上下的边界来修饰该范围。一般来讲，术语“约”在本文中用于以高于及低于所述值+/-10％的变化来修饰数值。如本文所用，术语约是指数值，包含例如整数、分数和百分比，无论是否明确指出。术语约通常是指本领域普通技术人员认为等同于所叙述值(例如，具有相同的功能或结果)的数值范围(例如，所述范围的+/-5％至10％)。当诸如至少和约的术语在数值或范围列表之前时，所述术语修饰列表中提供的所有值或范围。在一些情况下，所述术语约可以包括四舍五入至最接近的有效数字的数值。
如本文所用，术语“动物”包括但不限于人和非人脊椎动物，诸如野生动物、家畜和农场动物。动物也可以被称为“受试者”。
如本文所用，术语“生物标志物”是指图56中列出的物质。应进一步理解，关于胸腺器官培养基中生物标志物的出现对“降低”和“增加”水平的提及是指特定生物标志物在调理方案的时程内的增加测量或降低测量。
如本文所用，“生物相容性”是指当植入在哺乳动物中时不在哺乳动物中引起不良应答的任何材料。
“慢性移植排斥”通常在移植后数月至数年之内发生在人中，即使存在对急性排斥的成功免疫抑制也是如此。纤维化是所有类型器官移植物的慢性排斥的常见因素。
如本文所用，术语“包含(comprising)”(以及包含的任何形式，诸如“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised)”)、“具有(having)”(以及具有的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及包括的任何形式，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及含有的任何形式，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包含性的或开放式的并且不排除另外的、未被叙述的要素或方法步骤。另外，与术语“包含”结合使用的术语也被理解为能够与术语“由……组成”或“基本上由……组成”结合使用。
如本文所用，“移植物”是指被植入至个体中通常以置换、纠正或以其他方式克服缺陷的组织或器官。所述组织或器官可以由起源于同一个体的细胞组成；此移植物在本文中通过以下可互换的术语提及：“自体移植物(autograft、autologous transplant、autologous implant和autologous graft)”。来自同一物种的遗传差异个体的移植物在本文中通过以下可互换的术语提及：“同种异体移植物(allograft、allogeneic transplant、allogeneic implant和allogeneic graft)”。从个体到其同卵双胞胎的移植物在本文中称为“同基因移植物(isograft、syngeneic transplant、syngeneic implant或syngeneicgraft)”。“异种移植物(xenograft、xenogeneic transplant或xenogeneic implant)”是指从一个个体到不同物种的另一个体的移植物。
如本文所用，术语“HLA匹配”是指供体接受者对，其中在供体与接受者之间没有任何HLA抗原错配。在本发明的方法中的HLA匹配包括：HLA等位基因：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DQA1、HLA-DPB1和HLA-DPA1。
如本文所用，术语“HLA错配”是指供体和接受者HLA抗原中的匹配，通常关于HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DQA1、HLA-DPB1和HLA-DPA1，其中供体与接受者之间发生HLA错配。在一些情况下，一个单倍型是匹配的，而另一个是错配的。此情况经常在活着的或死亡的供体的器官中发现。相对于HLA匹配对，供体-接受者对中的HLA错配导致移植排斥的风险增加。
作为前述定义的背景，HLA抗原对应于“人白细胞抗原”，其是在细胞表面上表达的蛋白质分子，所述蛋白质分子赋予这些细胞独特的抗原身份。所述抗原也被称为“主要组织相容性复合抗原”。因此，MHC或HLA抗原是被T细胞识别为“自身”或“非自身”的靶分子。如果HLA抗原与免疫效应细胞来源于相同的造血干细胞来源，则将其视为“自身”。如果HLA抗原来源于造血重建细胞的另一种来源，则将其视为“非自身”。
识别了两类主要的HLA抗原：HLA-I类和HLA-II类。HLA-I类抗原(人中的A、B和C)使每个细胞都可识别为“自身”。HLA-II类抗原(人中的DRB1、DPB1、DPA1、DQB1和DQA1)参与淋巴细胞与抗原呈递细胞之间的反应。两类HLA抗原均已被暗示为移植器官排斥的靶标。
HLA基因聚集在人染色体6p21位上。此基因簇编码六个经典的移植HLA基因。6p21的区段还编码基因，所述基因编码在免疫系统调控以及其他基本分子和细胞过程方面具有重要作用的蛋白质。整个簇测量为约3.6Mb，带有至少224个基因座。作为聚集的结果，出现了某些“单倍型”(单一染色体上存在的等位基因集)。从一个亲本继承的单倍型往往作为群体继承。从每个亲本继承的等位基因集形成一个单倍型，其中一些等位基因往往缔合在一起。使用HLA匹配来鉴定接受者的单倍型，并帮助鉴定合适的匹配供体。某些单倍型比其他单倍型更为普遍，并且在不同种族和族裔群体中的频率有所不同。
如本文所用，短语“有需要的”是指受试者已经被鉴定为需要特定方法或治疗。在一些实施方式中，鉴定可以通过任何诊断手段。在本文所述的任何方法和治疗中，受试者可能是有需要的。
如本文所用，短语“从X至Y的整数”意指包括端点的任何整数。例如，短语“从X至Y的整数”表示1、2、3、4或5。
如本文所用，术语“哺乳动物”意指啮齿动物(即小鼠、大鼠或豚鼠)、猴、猫、狗、牛、马、猪或人。在一些实施方式中，哺乳动物是人。
如本文所用，术语“器官”是指在生物体内执行特定功能或功能组的实体血管化器官。术语器官包含但不限于心脏、肺、肾脏、肝脏、胰腺、皮肤、子宫、骨骼、软骨、小肠或大肠、膀胱、大脑、乳腺、血管、食道、输卵管、胆囊、卵巢、胰腺、前列腺、胎盘、脊髓、肢体(包括上肢和下肢)、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、输尿管、尿道、子宫。
如本文所用，术语“预防(prevent、preventing和prevention)”是指对可能最终表现出疾病、障碍或病症的至少一种症状但尚未表现出所述症状的个体施用疗法，以减少所述个体在给定时间段内产生所述疾病、障碍或病症的症状的机会。这种减少可以反映为例如患者的疾病、障碍或病症的至少一种症状延迟发作。
如本文所用，可互换使用的术语“受试者”、“个体”或“患者”意指任何动物，包括哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、其他啮齿类动物、兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、马或灵长类动物，诸如人。
如本文所用，短语“治疗有效量”意指引起研究人员、兽医、医师或其他临床医生在组织、系统、动物、个体或人中寻求的生物学或医学应答的活性化合物或药剂的量。治疗效果取决于所治疗的障碍或所期望的生物学效果。因此，治疗效果可以是降低与障碍相关联的症状的严重程度和/或抑制障碍的进展(部分或完全)、或改善治疗、治愈、预防或消除障碍或副作用。可以基于受试者的年龄、健康状况、体型和性别来确定引起治疗性应答所需的量。还可以基于监测受试者对治疗的应答来确定最佳量。
如本文所用，术语“组织”是指人或动物中的任何类型的组织，并且包含但不限于血管组织、皮肤组织、肝脏组织、胰腺组织、神经组织、泌尿生殖器组织、胃肠道组织、骨骼组织(包括骨骼和软骨)、脂肪组织、结缔组织(包括肌腱和韧带)、羊膜组织、绒毛膜组织、硬脑膜、心包膜、肌肉组织、腺体组织、面部组织、眼科组织。
在本公开的上下文中，“组织库”是指储存在液氮下的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的长期储存。建立同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品储存库的一般指南可从可在https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Tissue/UCM285223.pdf获得的工业指南.现行良好组织规范(CGTP)和对人细胞、组织以及基于细胞和组织的产品(HCT/P)制造商的附加要求(Guidance for Industry.Current Good Tissue Practice(CGTP)andAdditional Requirements for Manufacturers of Human Cells,Tissues,and Cellularand Tissue-Based Products(HCT/Ps))中引取。
“组织工程化”是指离体产生组织用于在组织置换或重建的过程。组织工程化是“再生医学”的一个实例，其涵盖通过掺入细胞、基因或其他生物构件来修复或置换组织和器官的方法连同生物工程材料和技术。
术语“移植排斥”涵盖急性植排斥和慢性移植排斥两者。“急性排斥”是当移植的组织在免疫学上是外来时，组织移植接受者的免疫系统进行的排斥。急性排斥的特征在于接受者的免疫细胞对移植组织的浸润，所述免疫细胞执行其效应子功能并破坏移植组织。急性排斥的发作很快，并且通常在移植手术后几周内发生在人中。一般来讲，可以用诸如雷帕霉素、环孢霉素A、抗CD40L单克隆抗体等免疫抑制药物抑制或阻止急性排斥。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treated)”或“治疗(treating)”意指治疗性治疗和预防性措施两者，其中目的是减缓(减轻)不期望的生理病症、障碍或疾病，或获得有益或期望的临床结果。例如，有益或期望的临床结果包括但不限于症状减轻；减少病症、障碍或疾病的程度；稳定(即不恶化)病症、障碍或疾病的状态；延迟病症、障碍或疾病进展的发作或减缓病症、障碍或疾病进展；改善病症、障碍或疾病状态或缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的；改善至少一个可测量的物理参数，不一定是患者可辨别的；或促进或改善病症、障碍或疾病。
如本文所述，除非另有指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所叙述范围内的任何整数的值，并且在适当时包括它们的分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。范围是近似值，并且可能相差超过一个整数。
单位、前缀和符号以其国际单位制(SI)公认的形式来表示。数值范围包括限定所述范围的数字。考虑到有效数字和与测量相关联的误差，应将测量值理解为近似值。
应进一步了解，出于清楚的目的而在分开实施方式的上下文中描述的本文所述的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为简洁起见而在单个实施方式的上下文中描述的不同特征也可以分开地或以任何适合的子组合提供。
供体胸腺组织的收获。
可以在出生后心脏手术期间丢弃供体胸腺组织，并且可以在供体家人的知情同意下将其用于CTT。可能需要移除一些胸腺以露出手术部位。因此，由于手术程序的性质，在出生后心脏手术中，可以在心脏手术期间移除一部分胸腺。
在出生后心脏手术期间，可以在手术程序过程中丢弃一部分胸腺组织。对于所有心脏手术，无论是否筛选胸腺以进行移植，外科医生都将已丢弃的胸腺组织放入无菌容器中。
用于患有完全DiGeorge综合征的婴儿中的胸腺组织移植的胸腺组织供体是年龄在九个月以下的婴儿。如本文所述，通过处理和培养丢弃的胸腺组织来生产原料药同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品。
可以在收获胸腺之前或之后获得在培养的胸腺组织移植中使用胸腺的同意。然而，允许在经历旁路手术之前从婴儿获得血液的同意是必须的，并且始终在手术前获得。此血液样品用于供体筛选。
将丢弃的胸腺组织放入无菌容器中。根据FDA的组织移植指南，对供体和捐供体的生母进行常规测试。在本文所述的手术程序中不需要组织类型匹配，但是可以在某些情况下进行这种组织类型匹配。
可以立即处理组织或将其冷藏储存过夜以用于第二天处理。如果将胸腺组织储存过夜，则将组织无菌地添加至足以完全覆盖原始容器中的胸腺组织的胸腺器官培养基(下文所述的“TOM”培养基)。将具有胸腺的容器放置在冷藏机中，直到准备好第二天处理。
胸腺组织的调理的概述
调理方案从培养的胸腺组织切片中耗尽供体胸腺细胞。基于体外数据(免疫组织化学)，在12与21天之间的培养时段保存上皮网络，如使用细胞角蛋白抗体评估的。优选地在37℃下在5％CO2培养箱中进行培养。
为了成功地培养，优选地将胸腺组织切片并且放置在
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纤维素或等效滤膜上，并且置于组织培养皿中的手术海绵上。培养基包括胸腺器官培养基(TOM)，并且每日更换。
通过病理学评估接收时的胸腺。身份测试必须显示出>50％的对为花边状染色图案的角蛋白呈阳性的区域。效力测试必须显示出哈索尔小体；其也必须示出为花边状图案的CK14染色。活力测试必须显示出切片中观察到的>90％的完整核。组织的批次放行在第5天至第21天之间的一天(包含端值)完成，并且通过病理学进行。对于身份，第5天至第21天之间的组织上的区域必须对角蛋白AE1/AE3呈阳性。对于效力，第5天至第21天之间的培养的胸腺组织必须显示出散布在各处的细胞角蛋白CK14染色，并且必须鉴定出至少一个哈索尔小体。对于活力，第5天至第21天之间的培养的胸腺组织必须显示出完整的核。
在一个实施方式中，将胸腺组织切片调理约12天，且然后冷冻保存。在另一个实施方式中，将所有胸腺组织切片调理约12天，然后将约一半胸腺组织切片植入在接受者中，并且将剩余的胸腺组织切片冷冻保存以供将来使用。
在收获的24小时内，将胸腺切成切片。将切片培养12-21天。如下文详细描述的，此培养过程耗尽活的供体T细胞，并且最终使手术植入的组织切片能够重建无胸腺受试者的免疫系统，尽管在免疫学有效水平下，但大多数受试者将具有低于针对年龄的第10百分位的T细胞计数。如下所概述的培养过程按以下方式显著改变供体胸腺组织和其中包含的组成细胞的生物学特征，以优化CTT切片的有效治疗特性。
培养过程确保以适于手术植入至受试者体内以使得能够重建受试者的免疫系统的方式获得具有先决生物学特征的培养细胞/组织的确定组成。
培养过程导致胸腺细胞的丧失以及供体胸腺组织切片中胸腺上皮细胞和其他基质细胞的相对富集。
培养过程进一步导致胸腺细胞耗尽并维持TEC以使得能够重建接受者的免疫系统，并且允许在接受者中对供体胸腺中的HLA抗原产生耐受性。
总的来说，生产过程被设计成从供体胸腺组织中耗尽胸腺细胞并保存胸腺基质(胸腺上皮细胞和成纤维细胞)的功能结构。
在一个实施方式中，处理的供体胸腺组织是能够在手术植入程序后在有需要的受试者中诱导对胸腺组织类型(HLA抗原)的耐受性的工程化胸腺组织产品。
为了保持切片的胸腺组织有活力，将胸腺切片放置在Millipore纤维素滤膜上，并且将手术海绵插入至含有培养基的组织培养皿中。从供体收获之日至植入日(第12天至第21天)，每日置换每个组织培养皿中的培养基。
供体胸腺组织的培养耗尽了这种处理的组织中的胸腺细胞，这使移植物抗宿主疾病(“GvHD”)的风险最小化，所述疾病在胸腺切除术后严重免疫缺陷的受试者中可能是很大的问题。
在培养的最初几天中，许多胸腺细胞从组织切片中“掉出”到培养基中，并且在培养基更换过程中被丢弃。随着在培养期期间继续培养，供体胸腺细胞继续死亡，但其细胞残余物保留在CTT切片内。
不受理论的束缚，据推测，这些非活的胸腺细胞及其缺乏核的残余物的存在对于组织工程化产品的预期功能很重要，因为它们有助于保存胸腺上皮细胞三维网络中的开放口袋，所述开放口袋对于治疗后的接受者骨髓干细胞的进入是必不可少的。Markert,1999(参见下文参考文献列表)中的患者DIG003的经验支持了具有“空间”对于使骨髓干细胞进入的重要性。在CTT移植后35天向前述参考文献中描述的患者给予了非常大剂量的类固醇(40mg/kg/天x甲基泼尼松龙3天)，这导致胸腺细胞凋亡和上皮凝缩。没有幼稚T细胞产生，并且患者死于感染。尸检时，插入的胸腺为一团活的上皮，在上皮细胞之间没有空间供胸腺细胞进入。
在培养期期间，进行HLA分型以查看患者(接受者)与供体组织是否共享任何HLA等位基因。在接受者中进行抗HLA抗体测试，以确定接受者是否具有针对胸腺中的HLA抗原的任何抗体。如果接受者具有靶向供体MHC的抗体，则将寻求另一种胸腺。根据FDA指南文件“工业指南.人细胞、组织以及基于细胞和组织的产品(HCT/P)的供体的资格确定(Guidancefor Industry.Eligibility Determination for Donors of Human Cells,Tissues andCellular and Tissue-Based Products(HCT/P))”和更新近的指南文件检查供体以及供体的母亲是否感染。根据联邦法规(CFR)1271小节D“现行良好组织规范”对组织进行无菌处理。
在回顾批记录和QC测试后，将组织从生产中放行并提供至手术团队进行移植，如本说明中所述，将组织手术植入至接受者中。
在下文以及在本说明书中阐述的实施例中更完全描述的过程中产生培养的胸腺组织。
总之，所收获的胸腺组织的培养过程按以下方式显著改变供体组织和其中包含的组成细胞的生物学特征：供体胸腺细胞的丧失以及胸腺上皮细胞和其他基质细胞的富集，并且供体胸腺细胞的耗尽改变组织的生理功能(例如，细胞因子和生长因子的分泌)及其结构特性。
在培养的最初几天中，许多胸腺细胞从组织切片中“掉出”到培养基中，并且在培养基更换过程中被丢弃。
与从供体获得的来源或原材料相比，在生产过程中发生的操纵导致最终产品中包含的所得细胞的总体和组织学外观的变化。
由于在组织上和组织内的残余血液，在培养的最初几天中胸腺组织显现为红色。参见例如图15。
在第5至第21天之间观察到活的组织，减去在第1天明显的血液污染。
在剩余的培养天数中，随着胸腺细胞的耗尽，组织的深度减小。通过免疫组织化学证明了组织中胸腺细胞密度的降低，并且在下文中进行了详细描述。
在收获丢弃的胸腺组织后的第0天，组织中密集地群集有活的胸腺细胞，所述胸腺细胞包埋在含有胸腺上皮细胞和成纤维细胞的基质中。AE1/AE3和CK14染色确认了正常胸腺特征性的细胞角蛋白(CK)阳性胸腺上皮细胞的存在。胸腺上皮细胞形成花边状三维网络，其具有环绕邻近的胸腺细胞的精细工艺。
在培养过程期间，如下所述培养胸腺切片。大量的胸腺细胞被洗出组织，尤其是在前3天内。这种耗尽最早可在第2天通过H&E染色在组织学上鉴定出，所述H&E染色显示胸腺细胞密度降低，特别是在髓质区域中。保留在组织中的大多数胸腺细胞显示出与凋亡和/或坏死一致的核变化，或出核溶解(核完全丧失)。许多这些死胸腺细胞及其细胞残留物仍然存在于整个胸腺组织中，并且据信其防止上皮细胞之间的空间完全塌陷。
在其中胸腺细胞的丧失导致上皮细胞网络塌陷的外部区域中(诸如在被膜下皮质中)，可以看到一些上皮凝缩。这些凝缩的被膜下皮质上皮细胞可以形成若干细胞层厚度的线性阵列，其可以增加切片的机械强度。一些髓质上皮也可能凝缩形成连续上皮细胞的斑块。
随着培养的进行，胸腺细胞的死亡继续，组织内保留有坏死的胸腺细胞碎片。在培养的大约第7天至第19天之间，髓质上皮和被膜下皮质上皮的进一步凝缩是极少的。
在使用AE1/AE3染色的每个胸腺的培养后期，仍然可以观察到具有类似于正常胸腺的上皮结构的区域。对于培养时间较长的组织，皮质和髓质的上皮结构仍然可以很容易地辨别；例如，哈索尔小体保持在髓质区域中。然而，在第0天后的时间点，与正常胸腺相比，胸腺细胞耗尽程度导致显著不同的H&E的总体组织学外观。
胸腺组织的详细培养。
制备同种异体培养的胸腺组织来源产品的一般程序是，如先前所述，从经历心脏手术的9月龄以下的婴儿作为丢弃组织获得用于患有完全DiGeorge综合征的婴儿的胸腺组织。对于实体器官移植，将从不超过50岁的个体获得丢弃的胸腺。胸腺组织的使用将取决于其是否满足本说明书中阐述的使用标准。
在cGMP条件下对胸腺组织进行无菌处理和培养，以产生部分T细胞耗尽的胸腺组织切片。
培养的胸腺组织(CTT)的生产由以下一般步骤组成：接收和处理传入的胸腺组织、切片、培养、更换培养基、计算剂量、包装胸腺并将其运输至手术室。此外，对传入的胸腺组织进行可接受性测试和过程中测试，并且对胸腺组织切片进行批准放行测试。
在一个实施方式中，胸腺组织切片过程需要使用无菌的一次性剪刀和镊子切下一块胸腺组织。操作员用镊子和剪刀取下胸腺的被膜，并且将被膜放在板的盖子上，以便后面处理。
使用镊子将一块胸腺组织放置在一次性组织切片机中。将切片机的顶部(例如，Stadie-Riggs手动切片机(Thomas Scientific,Swedesboro,NJ))放置在切片机的中间部分上并拧紧到位。操作员将刀片移动穿过组织块以切下切片。切片为大约0.5至1mm厚。大约50％-90％的滤膜空间被填充，而组织切片没有重叠。
通常，在切片开始时从组织上切下三份过程中块，所有所述块为约3x3mm。发送一份进行组织学检查，并保留两份。胸腺切片时，胸腺细胞自由地流动至培养基中。
在一个实施方式中，将滤膜和胸腺切片转移至在组织培养皿中用TOM饱和的明胶手术海绵中。TOM向上芯吸，润湿Millipore滤膜，从而保持组织湿润。每个海绵放置两个滤膜，并且每个组织培养皿使用2个海绵。重复对胸腺块切片的过程，直到准备了所需数量的切片为止。对培养皿标有操作编号、培养皿编号和ISBT条形码标签。将完成的培养皿放置于37℃下、具有5％CO2的加湿培养箱中。
组织工程化原料药包括已经如下所述放置于培养基中的培养皿中并且培养约6至约21天后的胸腺组织切片。组织工程化成品药包括转移至成品药容器中的胸腺组织切片。没有进行从原料药产生成品药的其他处理；对用于产生成品药的原料药的唯一处理是将切片转移至防漏容器中，并进行相应的培养基更换。
在以下段落中更具体地阐述了胸腺组织切片的培养。
在一个实施方式中，作为来自9月龄并经历心脏手术的婴儿的丢弃组织从手术室获得胸腺组织。然后，由手术团队将组织放置在带有螺旋盖顶部的无菌标本杯中，并且在环境条件下运输至GMP设施进行处理。对容纳了胸腺的无菌标本容器标有供体的姓名和病历号，包括条形码。供体筛选组为胸腺给予唯一的标识符(对胸腺连续编号)和唯一的病历号。为了生产，每个组织都有一个操作号和唯一的标签。所有标识符都记录在“机密的胸腺供体表”上，所述表与批记录分开保存，并且保密。
在一个实施方式中，原料药容器封闭系统可以是具有盖子的细胞培养皿。将胸腺组织的一个切片放置在滤膜上，并且将两个滤膜放置在培养皿中的胸腺器官培养基中的每个明胶海绵上。在每个培养皿中放置四个切片，并且将培养皿储存在培养箱中，每日更换培养基，直至准备好放行。
在一个实施方式中，培养皿可以获自Corning。培养皿可以是无菌、无热原的
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100mm聚苯乙烯细胞培养皿(产品号353003)。通过真空气体等离子体处理清洁培养皿，并且通过伽马辐照灭菌。培养皿的尺寸为89.43mm O.D.x 19.18m。
在示例性实施方式中，
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海绵可以由Ethicon生产，并且其满足USP可吸收明胶海绵的要求。合适的海绵是无菌的、不溶于水的、可延展的、可吸收猪明胶的海绵，其旨在用于止血用途。混合纤维素酯滤膜的说明性实例由Millipore生产(产品号SMWP02500)。25mm亲水性膜具有5.0μm孔径。其由醋酸纤维素和硝酸纤维素的生物惰性混合物制成。使用前，将滤膜用环氧乙烷灭菌。
在将供体胸腺放行并接收至处理实验室中之后，将胸腺切成薄切片，将其放置在无菌滤纸上，所述滤纸放置在无菌培养皿中的手术海绵上。如果未立即处理组织，则如下所述，在从供体收获后在2-8℃下将其在胸腺器官培养基(TOM)中储存至多24小时，然后开始处理。TOM由Ham的F-12培养基、HEPES缓冲液、L-谷氨酰胺和热灭活的胎牛血清(FBS)组成。
在一个实施方式中，在ISO 7生产洁净室中的生物安全柜(BSC)的ISO 5空间中进行处理。在任何时候，在BSC中都只处理来自单一胸腺的胸腺组织的一个批次。使用前必须清洁BSC。通过视觉检查测试胸腺的外观并称重。然后将胸腺放置在TOM中的150-mm组织培养皿中。用无菌的一次性镊子和剪刀移除胸腺的被膜。取组织块进行测试并作为保留样品。通过组织学测试传入的胸腺组织的身份。供体资格也得到确认。在收到组织学结果和所有供体筛选结果之前，将继续进行处理。
供体筛选的接受标准是必须满足所有供体资格要求。根据21CFR 1271，需要进行供体筛查，以保护胸腺组织植入接受者的安全。此筛选使疾病从供体传播至接受者的风险最小化。
胸腺器官培养基(TOM)
培养基由被批准用于人中的成分制成，每当此类试剂可用，所述成分就不太可能引起过敏反应。
必须跟踪所有试剂，使得如果出现任何问题，则可以在植入之后鉴定所有成分。
由于担心克雅病(Creutzfeldt-Jakob Disease)，必须使用美国材料生产胎牛血清(FBS)。在使用前，必须将每个批次的信息发送给FDA。
在使用前，必须测试培养基的细菌、真菌和支原体污染。
在一个实施方式中，使用以下材料制备TOM：
HAMS F12，Gibco#11765-054(或事例11765-062)，500ml瓶或等效来源。
HEPES，Gibco#15630-080或等效物，1M溶液，100ml瓶。最终浓度25mM。
L-谷氨酰胺，Gibco#25030-081或等效来源(原液200mM)。
胎牛血清，Gibco，#16140(热灭活的)或#10082-147(热灭活的，已认证的)。
在一个实施方式中，可以按以下方式使用作为HI的FBS：
必须在56℃下将FBS热灭活30min。
为了减少培养基污染的可能性，必须将培养基分成等分试样，并且等分试样不得使用超过一次。
可以将剩余的FBS等分试样以25ml等分试样的形式冷冻(-20℃)储存，以供研究使用。
在一个实施方式中，可以按以下方式制备TOM。
过夜解冻冷藏机中的胎儿牛血清，或者在37℃下在频繁轻轻涡旋下解冻。
如果使用非热灭活的胎牛血清，则在56℃下热灭活30分钟。
如果一次制备4升，则将所有培养基组分一起放入4升烧瓶中，以中速(不起泡沫)在磁力搅拌板上用搅拌棒搅拌3-5分钟。
使用0.2微米的过滤单元进行灭菌。
在一个实施方式中，可以按以下方式对TOM制剂进行灭菌。将1升TOM分配至一升烧瓶中。在一次性无菌量筒中测量80ml TOM。将80ml TOM倒入至150ml Corning滤膜灭菌单元中。将室内真空装置附接至滤膜上，并且根据制造商的说明对滤膜进行灭菌。从容器中移除过滤单元并丢弃。用无菌盖子(随单元提供)盖上收集瓶。用TOM批号进行标记。测试一份等分试样的厌氧菌下的细菌培养；真菌培养、其他；和支原体培养。测试一份等分试样的内毒素。将所有TOM等分试样储存在-20℃立式冷冻机中。
在以下情况下可以放行TOM培养基以供使用：对于测试稀释20倍的样品，LAL结果必须等于或小于2EU/ml；对于测试稀释10倍的样品，LAL结果必须等于或小于1EU/ml；所有培养结果必须对生长呈阴性。
必须使用BSC来过滤和分配培养基。
在放行之前，测试TOM的无菌性和内毒素。在已经满足14天无菌测试接受标准之前，不会放行TOM用于培养供体胸腺。制备后，将TOM在-20℃下储存直至解冻，这时可以在冷藏机中储存至多两周。
在一个实施方式中，可以例如使用BacT/ALERT培养系统进行14天无菌测试。BacT/ALERT(BioMerieux,Durham,NC)是可商购获得的培养系统，其可用于使用自动化微生物检测系统测试样品。
将所有过程中和原料药培养物孵育14天，或者如果产品变为阳性则立即报告。对于阳性测试，可以鉴定一个或多个生物体并确定其抗生素敏感性。在第1天、第7天和放行当天，将含有用于有氧生长的培养基的培养瓶和含有用于无氧生长的培养基的瓶子与待测样品一起接种。将所有瓶子在35-37℃下孵育14天。
FBS可以从Life Technologies的GIBCO品牌获得。FBS是通过无菌且经过验证的过程制备的。FBS满足USDA对屠宰场来源动物、可追溯性和原产国的要求。所有胎儿血液均从来源于通过验尸前和验尸后已认证的兽医检查的健康母体的胎儿收集。所有FBS均可按收集日期和位置进行追溯。在美国收集和加工的FBS来自USDA批准和检查的屠宰企业。美国被USDA认可为无口蹄疫和牛瘟的国家。为了使供应商合格，在使用前必须测试FBS的pH、渗透压、内毒素、总蛋白和身份
将完成的培养皿放置于37℃下、具有5％CO2的加湿培养箱中。每一批胸腺组织都储存在单独的培养箱中。在已经将胸腺切片放置在培养箱中之后，进行颗粒取样和人员监测。
将胸腺切片培养至多21天(例如约6天至约21天的调理方案)，并且在培养过程中每日更换培养基。这些胸腺切片被认为是原料药。在培养期期间，许多胸腺细胞从胸腺组织切片中洗出，或者胸腺细胞经历细胞凋亡，而保存了胸腺基质。所有生产步骤均使用无菌的一次性设备和用品进行。用移液管从培养皿中吸出培养基，并且合并至无菌收集容器中进行过程中测试。然后将十(10)mL新鲜的胸腺器官培养基以冲洗的方式轻轻地分配至每个培养皿的组织切片上。培养基更换完成之后，如果需要，从合并的培养基中取样以用于无菌性和组织学。完成颗粒取样和人员监测并且进行管线清洁。
每日更换培养基。
将胸腺切片培养至多21天(例如约6天至约21天的调理方案)。
进行过程中测试以提供对过程和产品质量的洞察，并且帮助确保最终成品药的安全性和质量。
过程中测试
在第1天和第7天收集样品用于无菌性过程中测试。在第7天收集样品用于支原体过程中测试。在第5天至第9天之间收集样品用于过程中组织学测试。在放行前一天确定剂量。在放行当天测试革兰氏染色、BacT、支原体和内毒素。
革兰氏染色是一种细菌学实验室技术，其用于将细菌物种区分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两组。在来自培养皿的合并用过培养基上测试革兰氏染色。所述方法使用染色技术基于细胞壁的物理特性确定分类。此方法用于进行初步的形态学鉴定或确定临床标本中是否存在大量细菌。可以手动地或者使用自动染色机进行染色。已经证明两种不同的染色方法没有显示出会影响培养结果的定性差异。
组织学测试在植入之前进行，并且在一个实施方式中至少包括：(1)确定对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域散布在整个组织中；(2)以显微镜方式鉴定出至少1个哈索尔小体；(3)组织切片的CK14染色散布在整个胸腺组织中；以及(4)以显微镜方式观察到完整核。在一个实施方式中，组织学测试在约6至约21天之间进行。哈索尔小体和完整核的存在以及成功的CK14染色指示已经培养出正常健康的胸腺组织。
培养时间是重要的过程参数。如所指出的，培养进行至多21天。
在植入之前测试培养中的胸腺样品，以确认在培养中产生的组织学结果是否代表培养的胸腺组织的历史样本的组织学测试。基于病理学家对实施例中所讨论的样品的观察结果，组织切片在第5天的组织学外观反映了在培养的每个后面时间点(第9天、第12天和第21天)观察到的组织学外观。在一个实施方式中，可以在培养的第5天至第21天之间以不同的定时周期和间隔进行胸腺组织的测试。例如，可以在调理方案期间进行测试，所述调理方案持续五天、或六天、或七天、或八天、或九天、或10天、或11天、或12天、或13天、或14天、或15天、或16天、或17天、或18天或19天、或20天、或21天的时段；或持续5-6天、或5-7天、或5-8天、或5-9天、或5-10天、或6至7天、或6至8天、或6至9天、或6至10天、或6至11天、或6至12天、或6至21天、或7至21天、或8至21天、或9至21天、或10至21天、或11至21天、或12至21天、13至21天或14至21天、或15至21天、或16至21天或17至21天或18至21天、或19至21天、或20至21天的时段。在一个实施方式中，调理方案可以是在植入培养的胸腺组织前约6天与约21天之间的任何时间。
对任何一个切片的组织学检查证实了关于整个批次的可接受性的结论。来自胸腺的任何一个切片的相关特征都反映了整个胸腺的特征，这支持继续使用单个组织切片进行组织学测试。
如图12A和12B中所指示的强制降解测试证明，培养的胸腺组织产品不容易降解并且对冷冻/解冻以及渗透压变化最敏感。在强制降解过程中测试的其他条件显示对培养的胸腺组织产品几乎没有影响。
培养的胸腺产品原料药的控制
传入的胸腺组织产品的接受标准包括下表1中鉴定的测试。
表1.传入的胸腺组织
Figure BDA0003507144800000991
缩写：CK，细胞角蛋白；EU，内毒素单位；USP，美国药典。在获得所有供体筛选结果之前，处理胸腺组织。
一般来讲，重量的接受标准大于或等于3克。这是可接受的最小胸腺重量，以确保有足够的材料可用于正确配量最终产品。接受标准基于处理胸腺组织的经验。
下表2中鉴定了过程中测试的接受标准。
表2.过程中测试：
Figure BDA0003507144800000992
Figure BDA0003507144800001001
下表3中鉴定了培养的胸腺组织原料药测试的接受标准。
表3.培养的胸腺组织原料药测试
Figure BDA0003507144800001002
Figure BDA0003507144800001011
身份的接受标准是，在第1天和中点(第5-9天)通过组织学确认胸腺组织身份。条形码用于在整个处理过程中追踪组织，并且在放行时确认条形码以证实产品的正确身份。
免疫化学组织学
组织学方法是医院用于所有组织类型的标准方法，如本领域技术人员已知的。
将产品样品固定在10％福尔马林中，并且运输至实验室。为了保护患者的隐私，对容器标有编码的标识符而不是患者的名字，以及病历号。进入病理科后，将为标本分配唯一的病理学登录号，并条形码化。随后的块、载玻片和文书全部用带有此病理登录号条形码化。
在实验室中接收标本之后，对福尔马林固定的组织进行粗略检查，并且准备了材料的书面粗略描述，其将成为最终报告的一部分。然后通过标准方法在自动化处理器上处理福尔马林固定的组织并将其包埋至石蜡块中。从石蜡块上切下切片，并且由ASCP认证的组织技术人员进行以下染色：
苏木精和曙红。
细胞角蛋白AE1/AE3免疫组织化学。
细胞角蛋白14免疫组织化学。
CD3免疫组织化学。
Ki-67免疫组织化学。
在进行前述免疫组织化学测试期间，还测试并查看了适当的对照载玻片。所有对照载玻片和内部对照均展示出预期的免疫反应模式。当作为效力测试的一部分测试样品时，传入的胸腺样品还充当已经培养约6天至约21天的组织切片的对照。传入的胸腺样品显现为典型的胸腺样品，并且然后在培养的时候在组织切片上发生变化，然后在培养约6天至约21天后对其进行测试。在培养约6天至约21天后，样品必须显示出散布在整个组织中的对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域、至少一个哈索尔小体的存在、散布在整个组织中的CK14染色以及完整核的存在。
载玻片由经解剖病理学认证的病理学家解释，所述病理学家在胸腺组织的组织学评价中具有额外的经验。最终报告由病理学家发布，并且所述报告记录结果。
下表4中鉴定了培养的胸腺组织原料药测试的接受标准。
表4.培养的胸腺组织原料药放行测试
Figure BDA0003507144800001021
培养的胸腺组织必须不含微生物。在第1天和第7天进行的无菌性测试中，不应生长微生物。在第7天的测试时，支原体应为阴性。无菌性测试应为革兰氏染色阴性。
使用包括无菌技术的适当控制来保持产品无菌性；采用培训计划并证实操作人员的资格；利用适当的洁净室鉴定程序；采用既定的清洁培养基填充程序，并利用即用型灭菌设备或使用经过验证的灭菌周期进行灭菌的设备。
视觉检查处理的胸腺组织的容器是否损坏。组织切片通常表现出黄色至红棕色的外观，具有变化的厚度和形状。
在第1天和在中点(第5-9天)通过组织学确认胸腺组织身份。
条形码用于在整个处理过程中追踪组织，并且在放行时确认条形码。
剂量(面积)为1000-22000mm2胸腺组织/m2接受者体表面积。剂量由放行至手术室的切片的表面积控制，以适合患者的体表面积。
可接受的剂量范围定义为1000-22000mm2胸腺组织/m2接受者体表面积(BSA)。通过使用软件分析(PAX-it图像分析软件)的照片确定胸腺组织的面积。B使用患者的身高(cm)和体重(kg)确定BSA。使用DuBois和DuBois公式计算BSA：
BSA＝0.007184×[高度(cm)]0.725×[体重(kg)]0.425。
测试培养的胸腺组织的内毒素。规格≤5EU/kg体重/小时。
可以例如通过使用Endosafe PTS系统进行内毒素测试。与Endosafe PTS一起使用的药筒使用显色动力学鲎变形细胞裂解物(LAL)测试。每个药筒均含有精确量的LAL试剂、显色底物和对照标准内毒素。将测试样品吸移至四个样品贮存器中。仪器在两个通道(样品通道)中抽取样品并将其与LAL试剂混合，并且在另外两个通道(加样通道)中与LAL试剂和阳性产品对照混合。将样品孵育，然后与显色底物合并。混合之后，测量孔的光密度，并且将其与仪器中存档的标准曲线进行比较。仪器测量每个通道中的反应时间。使用反应时间的对数与内毒素标准浓度的对数，构建每批药筒特有的存档标准曲线。通过使用反应时间从标准曲线内插来计算样品和峰值。此测试满足美国药典(USP)的要求。
可以按下方式进行支原体的测试。在第7天从板中移除合并的培养基的样品，并且在产品放行前进行测试。
在生产过程中出现阳性培养的情况下，将丢弃批次并且将不对其进行管理。在临床产品施用后出现阳性培养的情况下，患者的主治医师和赞助者将适当地治疗患者。阳性培养需要鉴定污染生物的物种并确定其抗生素敏感性。如果有指示，主治医师将对胸腺接受者制定抗生素疗法。
成品药在使用之前经历类似的视觉检查和组织学测试。
在将胸腺组织切片已经培养至多21天后，将切片转移至成品药容器中以便运输至操作室。在手术室中接收到切片后，将其插入至接受者患者的大腿肌肉中
容器应是完好的而没有可见损坏，并且胸腺组织切片应显现为黄色至红棕色组织切片，具有变化的厚度和形状。视觉检查组织切片以确认满足这些接受标准。
同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的冷冻保存和解冻
可以按以下方式进行同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的冷冻保存。
一种冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，其通过包括以下步骤的方法制备：
(a)从供体获得合适的胸腺组织；
(b)对以下HLA等位基因进行分型：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DPB1、HLA-DPA1；
(c)对所述胸腺组织进行调理方案持续约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；进一步地，其中在完成所述调理方案之后，所述供体胸腺组织切片在约6天到约21天显示出散布在整个组织中的对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域、至少一个哈索尔小体的存在、散布在整个组织中的CK14染色以及完整核的存在；
(d)收获所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片以作为同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；
(e)将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在液氮中冷冻保存；以及
(f)将液氮中的所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品保持在冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品库中。在一个实施方式中，如权利要求66所述的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，其中所述胸腺在收获当天展示>50％的区域对为花边状染色图案的角蛋白呈阳性、存在哈索尔小体、CK14染色为花边状图案并且>90％的核是完整的。
在一个实施方式中，将供体胸腺切片并将其分成大致相等的两个部分，将每个带有纤维素滤膜的切片置于单独的冷冻小瓶(Nunc管)中。将滤膜对折以将其插入至管中。在室温下添加约1至约1.5ml的冷冻培养基[无菌过滤的90％热灭活的胎牛血清(FBS)和10％二甲基亚砜(DMSO)]，以覆盖组织。将冷冻小瓶的无菌盖替换在管上。将所有管放入室温下的Biocision Cool Cell或等效容器中。CoolCell中的所有空插槽都应填充有具有1ml冷冻培养基的管。将管在-80℃冷冻机中放置过夜。可替代地，将每个组织加滤膜放入5mlCryoELITE组织小瓶(Wheaton)中。在室温下放入3至5ml冷冻培养基，以覆盖组织。放入聚苯乙烯泡沫塑料盒中，并且将其放入-80℃冷冻机中过夜。然后将小瓶转移至液氮冷冻机的气相中。可替代地，可以使用受控速率的冷冻机以将冷冻小瓶的温度升至液氮温度。
为了恢复组织，从液氮冷冻机中移除冷冻小瓶或CryoELITE组织小瓶。在37℃水浴中以涡旋运动快速解冻小瓶中的胸腺块。用70％乙醇喷雾管，并且然后将其放置在生物安全柜(BSC)中。使用镊子从Nunc冷冻小瓶或CryoELITE组织小瓶中移除胸腺组织和滤膜。将组织和滤膜放置在含有20ml 4℃TOM的50ml锥形管中。每个含有20ml 4℃TOM的50ml锥形管中最多可放置5个滤膜。立即将具有组织的5个滤膜转移至具有20ml 4℃TOM培养基的新鲜锥形管，并且在4℃下放置15分钟。重复洗涤3次。将组织保持在4℃下，将每块转移至其自身的具有5ml 4°TOM的120ml Starplex容器中。将所有容器在其中具有冷藏袋的温度可控容器中送入手术间。将具有组织的Starplex容器送入手术室中。将滤膜上的组织转移至无菌区到具有大约2ml无菌盐水的组织培养皿中。手术助理护士通过用镊子刮擦或拉动从滤纸上移除组织。手术助理护士将呈无定形堆的组织放回滤纸上。将带有大约4个滤膜的组织培养皿以及组织转移至手术部位，在此处外科医生可以轻松地获取组织。与关于CTT(RVT-802)的程序类似地将组织放置在股四头肌中。冷冻CTT与CTT的相似之处在于其是部分T细胞耗尽的，胸腺组织切片显示出散布在整个组织中的对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域，切片含有至少一个哈索尔小体、CK14染色散布在整个组织中并且存在完整核。
CTT的移植
在一个实施方式中，将来自供体的不匹配的胸腺组织切片培养约6天至约21天。在实体器官移植的当天，通常在诱导麻醉时给予类固醇。对于心脏或肺移植，应在实体器官移植时手术移除接受者的胸腺。对于其他器官移植，可以在移植之前或移植当天进行胸腺切除术。胸腺切除术方法将是手术的、胸腔镜的或机器人的。在再灌注后的手术结束时，在3至7天内接受马抗胸腺细胞球蛋白(例如，兔抗胸腺细胞球蛋白)之前，向接受者给予更多的类固醇以杀伤接受者中大部分残余的T细胞(和NK细胞)，或在4天内给予阿仑单抗以杀伤T细胞、B细胞和NK细胞。然后开始施用免疫抑制剂(诸如环孢霉素或他克莫司)和麦考酚酯，直到T细胞发育并显示出大于10％的幼稚T细胞。幼稚T细胞可能需要6至12个月才能增加到这个数目。将培养的胸腺组织处理为实体器官供体的胸腺。在约6天至约21天之间，可以将一半的CTT植入至四肢肌肉中。另一半胸腺将被冷冻保存，以供将来接受者使用。免疫抑制方案将抑制任何剩余的T细胞，直到植入在接受者中的培养的胸腺组织切片释放出幼稚T细胞并且接受者满足舍弃维持性免疫抑制方案的标准为止。(需要超过10％的幼稚T细胞才能舍弃免疫抑制。)
胸腺切除术方案
将患者带到手术室，并且通过气管内导管将其置于全身麻醉下。
以无菌方式将胸部和腹部准备好并用布帘覆盖。
通过大约4cm的皮肤切口对患者进行完全胸骨切开术。
进入两个胸膜腔以确保完全切除。
膈神经在两侧均可视化，并且注意不要使其受损。
识别出胸腺并仔细地将其与肺的胸膜覆盖物切开，从下角开始并一直延伸到上角。
进行完全胸腺切除术。
在纵隔内实现止血。
胸管放置。始终将一根胸管插入(纵隔中)。如果在手术期间进入单个胸膜腔，则胸管从纵隔继续进入该胸膜腔。如果进入两个胸膜腔，则以类似的方式使用第二根胸管，从纵隔到另一个胸膜腔。
引流管尺寸。#15Blake引流管用于2岁以下的婴儿。#19Blake引流管用于2岁及以上的儿童。
胸骨闭合：在新生儿或婴儿中，使用0-Ticron缝合线闭合胸骨。在约1-2岁时，使用#1胸骨线。在约2-5岁时，使用#4胸骨线。
用连续的可吸收缝合线闭合筋膜、皮下组织和皮肤。
将皮肤伤口真空装置放置在胸骨上。
患者在手术室中拔管。
对海绵、器械和针进行计数，并且在手术结束时必须正确。
同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的手术植入。
同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品应根据以下说明植入。将胸腺组织植入至大腿中需要健康的肌肉组织床。
为植入程序进行的准备
应当针对每个个体患者计算计划植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的最大剂量和最小剂量。在施用之前正确鉴定预期的接受者。
在层流通风橱内的无菌条件下，将培养基中手术海绵上的滤纸上的组织切片从组织培养皿中移除，并且放置在具有20ml培养基的120ml无菌杯中，进行包装以保持无菌性，并且递送至手术室，或者进行包装以便装运。在准备使用之前，不要从各个容器中移除组织切片。证实产品的到期日期和时间。
始终使用严格的无菌技术处理同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品(组织切片)。检查每个容器是否有泄漏或损坏的迹象。如果有污染迹象，请勿使用。在无菌区外，从装运箱中卸下同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的容器。从外袋中移除含有聚丙烯容器的机架。准备就绪后，在无菌区外但与无菌准备工作台相邻的团队成员将打开并从每个容器移除盖子，一次一个。然后，通过以下方式来保持每个打开的容器：无菌区外的团队成员在不接触无菌区的情况下将他/她的手臂延伸到无菌区上。
无菌区的团队成员将使用一对镊子从容器中移除带有其滤纸的单独组织切片，并且将其放置在无菌准备工作台上的无菌组织培养皿中，所述培养皿含有大约2ml不含防腐剂的盐水。将从四个容器中移除四个带有滤纸的组织切片放置在一个无菌组织培养皿中，所述培养皿在无菌区团队成员面前的无菌区上。使用无菌镊子，无菌区团队成员然后使用两对镊子将组织切片从滤纸上剥离，其中一对镊子将滤膜固定在原位，而另一对镊子将组织拉出或将组织刮成一堆。然后将从每张滤纸上移除的组织成堆放在该滤纸上，在滤纸的中间。然后将无菌组织培养皿转移至无菌区。然后，在外科医生植入前4个切片时，将以相同的方式处理下一组四个同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品容器。当外科医生完成植入前四个切片时，将下一个具有4片组织的培养皿放入手术区中，并且将最初的组织培养皿返回到无菌区团队成员面前的无菌区，以装载第3组四个组织切片。继续此循环，直到所有期望的组织都被植入为止。开始时不转移所有组织切片，以避免手术室中的空气污染。
手术程序
步骤1.皮肤开口。
在全身麻醉诱导之后，在大腿前部隔室之一上做一个垂直的皮肤切口(通常长约5cm)。注意：切口的大小以及植入程序使用一条腿或两条腿由患者的体型、计划的移植组织量以及他/她的肌肉质量决定。如果可以将全部或大部分组织植入至一只腿中，则仅应使用一只腿。
步骤2.打开筋膜以暴露前部隔室肌肉。
步骤3.肌肉扩散和植入。
使用扁桃体钳或类似的器械沿着股四头肌的天然沟分开肌肉。应在不切割肌肉组织的情况下植入同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的单独胸腺切片。将单独的组织切片沿天然沟放置在股四头肌内间隔大约1cm且深度大约1cm的“口袋”中。根据患者的体型，外科医生可以沿每个沟将大约6-7个切片放置至6至7个口袋中。根据每个滤膜上组织的质量，可以在植入之前将同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品切片切成两半。应将完全覆盖了滤纸的厚组织切片切成两半，以使每个组织的血管化最佳。在每个前部隔室内植入尽可能多的所需组织，直至最大计划剂量。
步骤4.肌肉闭合。
用单根缝合线在植入胸腺组织的部位上闭合肌肉，以防止肌肉重新张开和移植物从肌肉中掉出。在闭合切口之前，请确保植入的组织被肌肉组织完全覆盖，而没有暴露的胸腺组织。
步骤5.对于每个同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的组织切片，重复步骤3-4，直至最大预期剂量。
步骤6.切口闭合。
确认止血。用两层可吸收的缝合线闭合皮肤切口，并且应用标准敷料，诸如伤口闭合带或皮肤胶。保持筋膜开放，以便为肌肉隔室肿胀留出空间。可以使用闭塞敷料来防止污染。
术后外科/医疗管理。
根据需要使用温和的止痛药。监测感染或裂开的征象。
如果供体是关于肺、肾脏、肠或部分肝脏的活体相关供体，则该实体器官供体的胸腺的一部分可能足以进行培养和植入。需要满足上文关于收获当天和直到植入列出的病理学标准。
可从第3方供体获得冷冻保存的胸腺组织。然而，第3方供体必须表达实体器官供体未表达的所有接受者HLA等位基因。此包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DQA1、HLA-DPB1和HLA-DPA1。如果错配是“允许性的”，则HLA-DP等位基因中的错配是可以接受的。在其他等位基因中，允许较小的错配，例如，HLA-A*01:02进入携带HLA-A*01:01的接受者，换句话说，第二个字段(在冒号之后)可以不同，第一个字段(在冒号之前)必须相同。
人心脏移植程序
基于许多标准来确定受试者的资格，所述标准包含：尽管目前有最大的支持性疗法，但不进行心脏移植会具有不良的12至24个月预后；如UNOS标准所定义的，具有先天性或后天性心脏病，无法茁壮成长；在药物疗法难以治疗的先天性或获得性心脏病的环境下出现晚期心力衰竭的症状；血液动力学异常或肺血管阻力增加；无法手术的结构性心脏病；不适合药物治疗或设备疗法的症状性心律不齐或运动耐力差。
评估了心脏移植手术的许多绝对和相对禁忌症，包括例如：可逆性肾功能不全，除非受试者是心脏/肾脏移植的候选者；不可逆性肝脏疾病，除非是心脏/肝脏移植的候选者；不可逆性肺功能障碍，使用非常规的机械呼吸机支持(即高频呼吸机，CMV的最大设置)或固定的肺动脉高压(TPG>15)，除非受试者是心肺移植的候选者；伴有微血管疾病的糖尿病；或活动性不受控的癫痫发作障碍。
其他禁忌症可以包括心脏移植后限制长期存活和康复的其他疾病；药物滥用、病态肥胖、恶性肿瘤；活动性精神障碍；以及其他原因，诸如已记录的药物非顺应性。
相对禁忌症包括活动性感染；认知功能障碍；血管通路不足和明显的同种致敏作用。
还考虑了供体和接受者的组织相容性管理。针对接受者可能响应于“致敏事件”(诸如先前的输血或使用旁路/血液产品或同种异体移植材料的大手术)而形成的预先形成的HLA抗体，评价患者的面板反应性抗体(“PRA”)。
评估接受者的过敏前史，例如：先前的输血；次数、日期；先前的手术；先前的怀孕；免疫史和IVIG施用(带日期)。
具有过高的I类或II类HLA PRA的患者或经历重复移植的患者可以作为脱敏策略的候选者。具体策略将针对潜在接受者进行个性化，并且可以包括血浆置换术、IVIG、利妥昔单抗和/或硼替佐米的使用。重要的抗体是在1：16稀释后仍然存在的抗体。
预先致敏的患者可能需要与潜在供体进行实际预期交叉匹配。有HLA抗体史的患者在考虑移植时将在UNET中进行虚拟交叉匹配。
预先致敏的患者可能需要经由以下一般准则与潜在供体进行实际预期交叉匹配。有HLA抗体史的所有患者在考虑捐献时都将在UNET中进行虚拟交叉匹配。
如果cPRA<20％：UNET中的虚拟交叉匹配，则不需要肋纹的措施；进行常规回顾性供体交叉匹配和常规免疫抑制。
如果cPRA>20％：UNET中的虚拟交叉匹配，则接受者在移植时在手术室(“OR”)中接受血浆置换术。
如果cPRA >70％：虚拟交叉匹配，则在时间允许的情况下考虑获得实际预期供体交叉匹配；在OR中施用血浆置换术。考虑在OR中放置置换术导管，以便在手术后继续进行置换术。
持续的抗体减少干预是通过供体交叉匹配、DSA和临床过程来确定的。
对于所有预先致敏的患者，将在移植后的前两周内将血液发送用于供体特异性抗体，并按照临床指示进行重复。至少在移植后每6个月对所有移植后患者进行DSA常规检查，并且如果有临床问题，则需要进行常规检查。
在移植前和移植后均遵循标准的血液制品输注方案。
免疫抑制管理
基于待移植的实体器官来确定免疫抑制管理。
小儿心脏移植
所有患者将基于其临床情况和危险因素接受用巴利昔单抗或抗胸腺细胞球蛋白的诱导疗法。将在移植前确定所使用的诱导疗法的类型(第一免疫抑制方案药物疗法)。
在一个实施方式中，移植前/诱导疗法通常包括以下药物的施用：
在手术室之前的吗替麦考酚酯
Figure BDA0003507144800001111
25mg/kg IV。
在诱导时甲基泼尼松龙10mg/kg IV(最大剂量500mg)。
在释放x-钳位时甲基泼尼松龙10mg/kg IV(最大剂量500mg)。
在释放x-钳位时ATG(抗胸腺细胞球蛋白)1.5mg/kg IV。
可替代地使用巴西利昔单抗
Figure BDA0003507144800001112
按接受者的重量配量。
<35kg时，在释放x-钳位时10mg，并且4天后施用第2剂量。
>35kg时，在释放x-钳位时20mg，并且4天后施用第2剂量。
在一个实施方式中，用于心脏和CTT移植物候选者的移植前诱导免疫抑制疗法可以包括：
巴西昔单抗
Figure BDA0003507144800001121
—(如果不能给予ATG)。
配量：
<35kg：初始剂量：在麻醉诱导时通过麻醉术术前IV施用10mg(在稳定并给予甲基泼尼松龙之后)。
第二剂量：在移植之后4天IV施用10mg；如果发生并发症(包含严重的超敏反应或移植物丧失)，则保持第二剂量
>35kg：初始剂量：在稳定时在麻醉诱导时通过麻醉术术前IV施用20mg。
第二剂量：在移植之后4天IV施用20mg；如果发生并发症(包含严重的超敏反应或移植物丧失，则保持第二剂量。
施用：在20-30分钟内进行IV输注。半衰期：1-11岁儿童：9.5天，12-16岁青少年：9.1天，成人：7.2天。
在一个实施方式中，可以根据以下心脏移植受试者的配量方案施用抗胸腺细胞球蛋白(ATG，兔来源，
Figure BDA0003507144800001122
基于淋巴细胞计数以及标志物和血小板计数，1.5mg/kg/天，持续3至7天。在第二剂类固醇之后，在器官再灌注后在释放交叉钳时给予第一剂量(术中)。
基于上述参数，每日持续进行，将通过移植MD确定。
施用：对于第一剂量，在6小时内缓慢IV输注，耐受后可以在4小时内给予后续剂量。
在一个实施方式中，除了用于CPB/泵事例的常规术前/术中甲基泼尼松龙外，患者还可以接受一剂10mg/kg(最大剂量500mg)IV甲基泼尼松龙(SoluMedrol)，其在麻醉诱导时通过麻醉术在巴利昔单抗之前施用，且然后在再灌注时施用10mg/kg(最大500mg)的第二剂量(在ATG之前)。
术后维持性免疫抑制(维持性免疫抑制方案)
在一个实施方式中，移植后免疫抑制包括：
ATG
Figure BDA0003507144800001131
1.5mg/kg IV，共5-7剂。
如果WBC<2000或血小板计数<50000，则保持。
如果WBC为2000-3000或血小板计数为50000-75000，则使用1/2剂量。
每12小时IV/PO施用15-25mg/kg麦考酚酯。
针对GI不耐受或白细胞减少症/嗜中性粒细胞减少症调整。
如果GI不耐受，则可以替代为硫唑嘌呤。
如果GI不耐受，则可以替代为麦考酚酸
Figure BDA0003507144800001132
他克莫司在tx后24-48小时开始，这取决于肾功能和口服耐受性。
起始剂量为每12小时约0.05mg PO，并且基于水平进行调整。
前6个月，约10-15；6个月-3年，8-12；>3年，4-8。
如果需要IV药物治疗或对他克莫司不耐受，则可以替代为环孢霉素。
每8小时IV 5mg/kg甲基泼尼松龙x 6剂(最大剂量125mg)。
然后，1mg/kg/剂每12小时IV/PO(最大30mg/剂)。
基于活检结果，在接下来的2-3个月内舍弃。
在一个实施方式中，可以施用他克莫司
Figure BDA0003507144800001133
通常的剂型包括0.5mg/ml的静脉内溶液以及每胶囊0.5mg、1mg和5mg的口服胶囊。
当接受者为PO/NG/SL时，每12小时给予约0.05mg/kg/剂的起始剂量(最大5mg/剂)，如果肾功能可接受，则通常在术后约24小时开始。
每日监测他克莫司谷值水平，直至实现治疗性给药。如有必要，增加施用至每8小时一次，以实现治疗性谷值水平。如果药物是舌下给予，则将胶囊内容物撒在舌头下(可能导致更高的水平)。口服剂量和舌下剂量不同。一般来讲，有必要施用待通过舌下给予的口服剂量的约1/2。
可以在最后一个剂量后10-14小时(如果每8小时给药，则为7-9小时)基于通过质谱法测量的血清全血水平来施用他克莫司给药。
在管理患者的他克莫司水平时，肾和肝功能、药物不良反应、感染和排斥史全部被考虑。如果患者的临床状况良好，如果水平在期望范围内的+/-1范围内，则无需进行剂量调整。在这些情况下，决定权取决于主治移植医师。
在一个实施方式中，向不能耐受他克莫司的患者施用环孢霉素。起始剂量：每12小时口服2mg/kg/剂。如果无法实现治疗性水平(尤其是婴儿和幼儿)，则将给药频率增加至每8小时一次。
常规给药是基于在最后一个剂量后10-14小时(如果每8小时给药，则为7-9小时)通过质谱法测量的以下血清全血水平。
在管理患者的环孢霉素水平时，肾和肝功能、药物不良反应、感染和排斥史全部被考虑。如果患者的临床状况良好，如果水平在期望范围内的+/-10-20范围内，则无需进行剂量调整。在这些情况下，决定权取决于移植主治医师。应该尽一切努力在图表中记录患者的目标环孢素水平。IV剂量通常等于口服剂量的1/3。
在一个实施方式中，可以施用吗替麦考酚酯
Figure BDA0003507144800001141
(200mg/ml、250mg或500mg片剂)：
以两个分剂量开始30-50mg/kg/天(儿童最大剂量为2g/天，成人为3g/天)。
IV剂量＝PO剂量。
不需要治疗性药物监测，但是如果担心毒性，可以进行监测。
麦考酚酯可能引起骨髓抑制和嗜中性粒细胞减少症。
当ANC<500或WBC<1000时，可以保持剂量；在降低ANC(<1000)或WBC(<3000)的环境下，可能需要减少剂量。在实践中，Cellcept的剂量为500mg＝Myfortic(麦考酚酯)360mg。
在一个实施方式中，根据以下剂量参数，可以施用麦考酚酯(
Figure BDA0003507144800001142
剂型180mg片剂、360mg片剂)代替吗替麦考酚酯：
开始延迟释放的片剂：400mg/m2/剂每日两次；最大剂量：720mg或BSA1.19-1.58m2时：540mg每日两次，BSA>1.58m2时：720mg每日两次。
无IV或混悬液可用。如果需要IV或混悬液，则将药物转换为Cellcept。(Cellcept500mg＝Myfortic 360mg)。麦考酚酯可能引起与吗替麦考酚酯相同的骨髓抑制。
在一个实施方式中，如果不能耐受吗替麦考酚酯，则可以按以下方式施用硫唑嘌呤：
开始2-4mg/kg/天，每日给予一次
硫唑嘌呤引起骨髓抑制，并且基于WBC/ANC，可能需要降低剂量。IV剂量等于口服剂量。
在一个实施方式中，类固醇可以作为甲基泼尼松龙
Figure BDA0003507144800001151
泼尼松或泼尼松龙施用。
术中开始静脉内类固醇(作为诱导免疫抑制疗法)，并且术后每8小时以5mg/kg/剂(最大125mg/剂)IV x 6剂继续进行。
此后口服类固醇可以作为泼尼松片或泼尼松龙混悬液以3mg/ml开始。如果移植接受者不能耐受口服免疫抑制治疗方案，则继续静脉内甲基泼尼松龙。如果接受者可以耐受口服药物治疗，则转换为口服疗法。类固醇的示例性剂量范围是：
0-10kg，以2mg/kg/天开始，分开的BID，每2天舍弃一次，保持在每日6mg
0-30kg，以2mg/kg/天开始，分开的BID(最大单剂量为30mg，见下文)，以5mg/天每两天舍弃一次，然后保持在每日10mg。
>30kg，30mg BID x 4剂，25mg BID x 4剂，20mg BID x 4剂，15mg BID x 4剂，10mg BID x 4剂，然后开始每日15mg，以进一步由移植心脏病专家舍弃
基于活检结果，在移植后的第一个月内继续舍弃类固醇。如果产生排斥，则将由移植心脏病专家决定重新使用类固醇，并且根据进一步的活检结果和患者的临床状况无限期继续使用类固醇。
第二免疫抑制方案中的其他药物包括以下：
西罗莫司
Figure BDA0003507144800001152
(0.5mg、1mg、2mg胶囊)：在诊断为同种异体冠状动脉血管病后或由移植心脏病专家另外临床指示后开始。
起始剂量：1mg/m2(最大剂量：3mg)每日一次，或者如果难以实现足够的水平，则分为2个日剂量。
治疗水平目标是4-8，如果在两种药物上，则接受较低的他克莫司水平(相同的4-8范围)。
如果每12小时给药一次，则在最后一个剂量后23-25小时或在最后一个剂量后11-13小时得出谷值水平。
当开始西罗莫司时，停用麦考酚酯
Figure BDA0003507144800001161
硫唑嘌呤。
开始新诺明(Bactrim)预防：可能引起麻烦的口腔溃疡，并且延迟伤口愈合。
普伐他汀
Figure BDA0003507144800001162
-用于青少年/大龄儿童和患有CAV的患者
开始以每日一次0.2mg/kg/天施用(呈片剂形式，每天晚上可以给予1/4、1/2或至多1-2片。
随着体重变化滴定剂量(最大剂量20mg/天)。
每8周监测一次LFT，CK。
如果产生关节或肌肉疼痛，则停用药物。
更昔洛韦IV-如果接受者或供体为CMV IgG阳性，则给予用于预防CMV。
诱导疗法：每12小时5mg/kg IV x 7-14天。
维持性疗法：每日5mg/kg IV。
监测WBC和肾功能。
当可耐受时，过渡至口服缬更昔洛韦。
缬更昔洛韦
Figure BDA0003507144800001163
-用于在所有CMV+接受者或供体中预防CMV。
450mg片剂或50mg/ml混悬液。
4个月-16年：每日总口服剂量(mg)＝[7 x BSA x Cr清除率]。
>16年：900mg每日口服。
在每次访视时监测CMV PCR。
甲氧苄啶-磺胺甲基噁唑
Figure BDA0003507144800001171
单强度片剂80mg/400mg，双倍强度片剂160mg/800mg，混悬液每5ml40mg/200mg。
为了预防PCP/Toxo，在出院前也在口服进餐时开始。
1个月-12年：5-10mg/kg/天TMP分开的BID 3x/周，连续几天。
>12年：80-160mg TMP每日口服或160mg TMP口服3x/周。
如本领域普通技术人员已知的，监测可能增加或降低他克莫司和环孢素水平的药物。
还监测与他克莫司和环孢霉素具有协同肾毒性的药物。
急性移植排斥的治疗
在一个实施方式中，在注意到移植排斥的情况下按以下方式治疗受试者。
在一个实施方式中，如果移植接受者为0、1R级而无血流动力学损害：不需要治疗并且可以考虑舍弃类固醇。
如果患者表现出2R级细胞排斥而没有血流动力学损害，则遵循以下治疗方案：
优化维持性免疫抑制。
15mg/kg/天IV x 3天施用甲基泼尼松龙(最大1000mg)，可以分为每12小时给药一次或每24小时给予一次。
在1至2周内重复活检，对于难治性细胞排斥，重复甲基泼尼松龙和任选的
Figure BDA0003507144800001172
如果排斥得到解决，则在1个月后(排斥后6周)重复活检，并且如果成功治疗了排斥，则恢复先前定义的活检方案。
对于难治性细胞排斥，重复甲基泼尼松龙并考虑胸腺球蛋白。
如果患者表现出2R级细胞排斥而没有血流动力学损害或表现出更高等级的排斥。
以更高的水平优化免疫抑制(10-15)。
15mg/kg/天IV x 3天施用甲基泼尼松龙(最大1000mg)。
施用
Figure BDA0003507144800001181
如果有迹象表明或担心抗体介导的排斥，则进行血浆置换术。
如果患者在有或没有血流动力学损害的情况下表现出抗体介导的排斥：
15mg/kg/天IV x 3天施用甲基泼尼松龙(最大1000mg)。
进行血浆置换术x 5次(每日或隔天一次)。
1-2gm/kg IV每月x 6个月施用IVIG。
移植物功能障碍或血液动力学损害的证据需要针对细胞排斥和抗体介导的排斥进行活检(当患者稳定时)，包括C4d染色。在等待活检结果的同时开始甲基泼尼松龙(SoluMedrol)，考虑开始胸腺球蛋白和血浆置换术。
将3R级活检或血液动力学损害视为高等级的排斥发作。
甲基泼尼松龙(SoluMedrol)15mg/kg/天IV x 3天(最大1000mg)。考虑正性肌力药(inotrope)疗法、胸腺球蛋白；和/或血浆置换术。
有或没有血液动力学损害的抗体介导的排斥。诊断：在外周血清样品中存在供体特异性抗体的情况下，鉴定心肌组织中的C4d沉积。针对AMR考虑类固醇、ATG置换术。
肾脏和胰腺免疫抑制管理
用于肾脏和胰腺移植程序的示例性诱导免疫抑制方案和维持性免疫抑制方案如下所呈现。在一个实施方式中，移植接受者接受贝拉西普作为维持性疗法，以作为第二免疫抑制方案的一部分。当接受者是爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)Ig+，未表现出DSA(供体特异性同种异体抗体)时，通常采用此方案；不论绝对或计算的面板反应性抗体(PRA)如何，移植均涉及阴性交叉匹配，并且接受者<70岁，BMI≤35。另外的考虑因素包括接受者耐受诱导的能力(如果接受者不耐受，则以其他方式接受胸腺球蛋白)。接受者应该不具有特发性局灶性节段性肾小球硬化病(FSGS)的病史，并且先前没有进行过非肾脏实体器官移植。所述方案仅适用于肾脏移植。
在一个实施方式中，诱导免疫抑制方案包括术中静脉内施用500mg甲基泼尼松龙。在三个小时的时段内(施用类固醇后2小时)通过静脉输注施用30mg阿仑单抗。在先前的药物施用之后，施用贝拉西普10mg/kg(TBW)(四舍五入至最接近的12.5mg)。
在一个实施方式中，维持性免疫抑制方案包括在POD 4时和第2周、第4周、第8周和第12周结束时的贝拉西普10mg/kg TBW；然后每月5mg/kg(四舍五入至12.5mg)。每日施用2mg西罗莫司，2周后达到第一谷值水平(目标8-10ng/ml)。通常不需要类固醇维持疗法。
在接受者不是贝拉西普候选者的低风险肾移植的实施方式中，诱导免疫抑制方案可不包括诱导免疫抑制方案，即，诱导免疫抑制方案是任选的。维持性免疫抑制方案可以包括每12小时施用1000mg麦考酚酸和每12小时以0.1mg/kg/天的剂量施用他克莫司(最大5mg)。
在一个实施方式中，当接受者是高风险的并且ATG禁忌的、体弱、年龄>70并且具有近期感染和近期癌症活性的证据时，诱导免疫抑制剂可以包括巴利昔单抗20mg，以在手术室中并在术后天数(POD)4开始。维持性免疫抑制方案可包括每12小时1000mg麦考酚酸和每12小时0.1mg/kg/天的他克莫司(最大5mg)，其中类固醇剂量逐渐减少。
在涉及高风险肾移植物或肾脏和胰腺移植物的实施方式中，考虑以下参数。具有历史峰值PRA>30、历史供体特异性抗体(DSA，不考虑绝对或计算的PRA)的接受者，由于推测的免疫学原因而导致早期移植物丧失的第2次移植，第3次或更多次移植，小儿整群(成人)接受者，肾脏/胰腺，单独胰腺以及是否DGF高危或高危活检。在这种移植中，诱导免疫抑制方案(诱导疗法)可以包括在手术室中开始的胸腺球蛋白1.5mg/kg IBW(四舍五入至最接近的25mg)x 4剂。
在一个实施方式中，在接受者具有零PRA、无自身免疫疾病和高BMI的情况下，诱导免疫抑制方案可以包括在手术室中开始的胸腺球蛋白1.5mg/kg IBW(四舍五入至最接近的25mg)x 4剂。第二免疫抑制方案(维持性疗法)可以包括逐渐减少类固醇剂量，诸如OR中的500mg，240mg POD 1、125mg POD 2、125mg POD 3、90mg POD 4，以及从POD 4开始每12小时1000mg麦考酚酸和他克莫司每12小时0.1mg/kg/天(最大5mg)。
在肾脏移植后进行胰腺移植的实施方式中，诱导免疫抑制方案可以包括在手术室中开始的胸腺球蛋白1.5mg/kg IBW(四舍五入至最接近的25mg)x 4剂。第二免疫抑制方案可包括类固醇逐渐减少至最低每日5mg，从POD 4开始每12小时施用1000mg麦考酚酸和每12小时0.8mg/kg/天施用他克莫司(最大4mg)。
对于涉及施用麦考酚酸的所有免疫抑制方案，可以基于对患者和移植因素的评估来选择初始剂量。
成人心脏移植免疫抑制管理
在一个实施方式中，通常施用诱导免疫抑制方案。当诱导疗法的风险被认为超过了这种疗法的益处时，可能会出现例外情况(即，诱导免疫抑制方案是任选的)。
在一个实施方式中，当施用诱导免疫抑制方案时，所述方案可以包括
Figure BDA0003507144800001201
(巴利昔单抗)：在再灌注(交叉钳移除)之后在OR中IV给予20mg，并且在术后第4天重复。在接受诱导免疫抑制疗法的患者中，应在术后48小时开始第二免疫抑制方案中施用的钙调神经磷酸酶抑制剂(CNI)，但根据患者的肾脏状况可以进一步延迟。可以在围手术期内施用类固醇，通常在全身麻醉诱导时静脉内施用500mg甲基泼尼松龙，并且在再灌注(交叉钳移除)之前IV施用500mg。
在一个实施方式中，维持性免疫抑制方案(术后维持性免疫抑制治疗)，所述方案可以包括类固醇，例如，每8小时IV 125mg甲基泼尼松龙x 3剂(再灌注后8小时开始)，之后是泼尼松：0.5mg/kg每日两次，从术后第2天开始；剂量每2天按5mg每日两次减至10mg每日两次(或每日20mg)，并维持此剂量至移植后30天。第二免疫抑制方案还可以包括钙调神经磷酸酶抑制剂(CNI)，例如，他克莫司
Figure BDA0003507144800001202
(优选药剂)：每12小时口服1mg。将剂量滴定至10-15ng/ml的谷值目标水平。在5剂钙调神经磷酸酶抑制剂之后，进行典型的剂量调整，以建立稳态。最初监测CNI的每日水平，以评价CNI毒性。
在替代性实施方式中，每12小时以100mg(1.5至5mg/kg)的剂量口服施用环孢霉素
Figure BDA0003507144800001203
通常将剂量滴定至33ng/ml的谷值目标水平。维持性免疫抑制方案还可以包括抗增殖剂，诸如吗替麦考酚酯
Figure BDA0003507144800001204
1000至1500mg口服，并调整剂量以维持WBC计数>3000。在替代性方案中，抗增殖剂可为麦考酚酯
Figure BDA0003507144800001211
360mg-720mg，每天口服施用两次，并调整剂量以维持WBC计数>3000。在另一个实施方式中，抗增殖剂是硫唑嘌呤
Figure BDA0003507144800001212
其以每日2mg/kg的剂量口服施用，并调整剂量以维持WBC计数>3000。
在一个实施方式中，维持性免疫抑制方案可以包括西罗莫司
Figure BDA0003507144800001213
(TOR-I)，其以每日2mg的剂量口服施用。通常将剂量滴定以维持4-12μg/ml的谷值。
在一个实施方式中，维持性免疫抑制方案可以包括逐渐减少类固醇的剂量，例如，第1个月，将剂量减少至每日15.0mg PO；第2个月，将剂量减少至每日12.5mg PO；第3个月，将剂量减少至每日10.0mg PO；第4个月，将剂量减少至每日7.5mg PO；第5个月，将剂量减少至每日5.0mg PO；第6个月，将剂量减少至每日2.5mg PO。≥ISHLT 1R级且具有心肌细胞坏死迹象时，应重新评价类固醇逐渐减少。在改善组织学排斥指标后可以恢复逐渐减少。
在一个实施方式中，维持性免疫抑制方案可以包括以下另外的/辅助剂：甲氨蝶呤(MTX)，每周两次以2.5至5mg施用，用于细胞介导的排斥。对于≥1R/2级的3次或更多次连续活检或对于2R/3A级的2次连续活检，应考虑MTX。
成人肝脏和肠道免疫抑制管理
在一个实施方式中，可以在没有任何诱导免疫抑制方案的情况下进行没有肾功能障碍的肝脏移植，即，这种诱导免疫抑制方案是任选的。维持性免疫抑制方案可以包括，每12小时施用1g麦考酚酯以及每12小时施用2-3mg他克莫司，连同逐渐减少类固醇的剂量。类固醇的典型的逐渐减少剂量为：术中IV 500mg甲基泼尼松龙；术后6小时IV一次甲基泼尼松龙250mg；POD 1 IV一次甲基泼尼松龙180mg；POD 2 IV一次甲基泼尼松龙90mg；POD 3 IV一次甲基泼尼松龙60mg；POD 4 IV一次甲基泼尼松龙30mg；POD 5-14每日PO 20mg泼尼松；每2周减少2.5mg。在一个实施方式中，可以按以下方式施用泼尼松龙的逐渐减少剂量：在前2周内每日20mg；在2-4周内每日17.5mg；在4-6周内每日15m；在6-8周内每日12.5mg；在8-10周内每日10mg；在10-12周内每日7.5mg；在12-14周内每日5mg；在14-16周内每日2.5mg。停止在第16周。在某些情况下，将泼尼松龙舍弃至每日5mg，并保持一年。
在一个实施方式中，在存在需要HD或CVVHD/F的术前功能障碍的情况下进行保留肾的肝脏移植。在另一个实施方式中，在存在术后肾功能障碍的情况下进行保留肾的肝脏移植，其中POD 0-1时的血清肌酐水平>2mg/dL。
在一个实施方式中，诱导免疫抑制方案包括每48小时胸腺球蛋白1.5mg/kg(四舍五入至最接近的25mg)，共4剂。在一个实施方式中，针对各类细胞减少症或嗜中性粒细胞减少症减少剂量。如果WBC计数为2-3或血小板为30-50，则给予1/2剂量。如果WBC<2或血小板<30，则保持剂量。
在一个实施方式中，当指示前驱用药时，可以在ATG输注前30-60分钟进行前驱用药，VT或口服650mg对乙酰氨基酚、25-50mg苯海拉明；以及IV 40mg甲基泼尼松龙(或可以使用上述逐渐减少)。
在一个实施方式中，移植物是肠移植物或多内脏移植物(诸如肝脏移植物、肠移植物、胰腺移植物)，其中接受者具有高免疫学风险(PRA>0、先前怀孕或移植过分离小肠)，或者其中免疫风险低但感染风险高，诱导免疫抑制方案可以包括如上所述的前驱用药，并且也可以包括每24小时胸腺球蛋白1.5mg/kg(四舍五入至最接近的25mg)，总共6mg/kg以及POD 0和4中的20mg巴利昔单抗。维持性免疫抑制方案可包括上述的类固醇的逐渐减少剂量以及每12小时1g麦考酚酯和每12小时1mg SL他克莫司(目标12-16mg/ml)。
在某些实施方式中，在患者接受吗替麦考酚酯(Cellcept)时，他克莫司的施用剂量应实现5-8(肝脏)或12-17(肠、肝脏-肠)的目标水平。如果患者正在参加药物研究试验、出现排斥、肾受损或年龄增长，则可能改变目标。
在施用吗替麦考酚酯(MMF，Cellcept)的某些实施方式中，成人的标准剂量是每12小时1000mg。在患有各类细胞减少症或嗜中性粒细胞减少症的患者中可以按照以下进行剂量降低：WBC 2-3或血小板30-50，考虑给予1/2剂量；对于WBC<2或血小板<30，考虑保持剂量。
在涉及急性肝脏同种异体移植排斥治疗的某些实施方式中，可以施用以下治疗：每日IV甲基泼尼松龙500mg，共3剂。如果肝功能测试未改善，则可以再给予两剂(每日IV500mg，总共5剂)，并在POD 3前夕或POD 4早晨进行重复的肝活检。
在某些实施方式中，用
Figure BDA0003507144800001232
或
Figure BDA0003507144800001233
治疗的先前CMV IgG为阴性的患者应在治疗开始时重新检查CMV IgG。
肺移植物中的免疫抑制管理
在某些实施方式中，肺植入物中的免疫抑制管理遵循以下诱导和维持性免疫抑制方案。诱导免疫抑制方案可以遵循先前描述的诱导免疫抑制方案。维持性免疫抑制方案可以包括以下：
钙调神经磷酸酶抑制剂：每12小时的他克莫司，并调整剂量以维持谷值他克莫司水平。参见下表5。
表5：他克莫司谷值水平
Figure BDA0003507144800001231
每12小时施用环孢霉素，并调整剂量以维持根据下表6的谷值CyA水平。
表6：环孢霉素谷值水平
Figure BDA0003507144800001241
移植后0-3个月的类固醇逐渐减少剂量，每日口服施用20mg；移植后3-6个月，每日口服施用15mg；移植后6-9个月，每日口服施用10mg；以及移植后>9个月，每日口服施用5mg。
可以每日口服施用2mg/kg硫唑嘌呤。重要的是确保开始前正常的TMPT酶水平并遵循LFT/CBC。如果观察到白细胞减少症，则可以考虑调整剂量。
可以以1000mg每日两次的常用剂量施用吗替麦考酚酯
Figure BDA0003507144800001242
心脏和肺移植的常用剂量为每日口服施用1500mg。应遵循CBC，并且如果观察到白细胞减少症，则应考虑调整剂量。
由于对吻合口裂开的担忧，西罗莫司通常在移植后的前3个月内是禁忌的。如果施用，则西罗莫司通常每日通过口服施用来施用1mg，这基于谷值水平进行调整。例如，作为第3药剂施用或微粒保留CNI，目标谷值为4-8ng/ml；并且作为CNI替代方案，谷值水平为10-15ng/ml。
实施例
实施例1：胸腺内变异性研究。
研究胸腺内变异性以确定来自胸腺的一部分的组织学测试结果是否可以被认为代表同一胸腺的任何其他部分的组织学测试结果。此测试的结果用于确定在常规放行测试和过程验证测试过程中应测试多少个样品。
建立了组织学接受标准，如先前所述，包括以下方面的评估：在第5-9天对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域散布在整个组织中；鉴定出至少1个哈索尔小体；CK14染色散布在整个组织中；以及观察到完整核。
对于此研究，以定向方式将三个胸腺切片，并且跟踪每个胸腺内的切片的位置。将切片在6孔板中培养，以允许追踪每个切片。如图5A所示进行切片。
对于研究中的每个胸腺，切片专用于在以下每个时间点进行分析：基线(第0天)、第5天、第9天、第12天和第21天。
针对每个胸腺在每个时间点培养5-11个切片。根据上述方法培养切片，每日更换培养基。将切片提交用于在病理实验室中进行H&E染色，并且分析其身份、效力和活力。此研究中的所有切片均满足如上指定的组织学测试的放行接受标准，即：在第5-9天对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域散布在整个组织中；鉴定出至少1个哈索尔小体；CK14染色散布在整个组织中；以及观察到完整核。
除了评估每个切片是否满足放行接受标准外，病理学家还对每个H&E和AE1/AE3载玻片进行了更详细的综述。培养的胸腺组织批次MFG-056的这些载玻片中的一些的图像示出于图6A-H中。注意到以下观察结果。
来源于相同供体胸腺的所有切片在每个时间点均满足接受标准。在不同的切片中，皮质区域彼此相似，并且髓质区域彼此相似。但是，观察到切片之间皮质和髓质的相对比例存在不同。
随培养时间变化在来自相同胸腺的不同切片之间观察到的差异主要与主要是胸腺细胞的坏死量(其随着培养时间的增加而增加)和残余胸腺细胞的数量(其随着培养时间的增加而减少)相关。
基于这些观察结果，来自胸腺的任何一个切片都代表整个胸腺。此外，组织切片在第5天的组织学外观反映了在每个后面时间点(第9天、第12天和第21天)观察到的组织学外观。
实施例2：整个胸腺的时程研究。
对于此研究，根据SOP将五个胸腺切片并且培养。在切片的当天，准备第一切片、中间切片和最后切片用于免疫组织化学。将每个胸腺的其余部分切片并且在6孔板中培养。将每个胸腺针对以下时间点之一进行指定：基线(第0天)、第5天、第9天、第12天和第21天。有关第0天胸腺切片，参见图7；有关第5天胸腺切片，参见图8；有关第12天胸腺切片，参见图9；并且有关第21天胸腺切片，参见图10。
来自每个胸腺的切片的总数在21至62个切片的范围内。根据上文所概述的程序培养切片，每日更换培养基。将切片提交用于在病理实验室中进行H&E染色，并且分析其身份、效力和活力。此研究中的所有切片均满足组织学测试的放行接受标准，即：在第5-9天对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域散布在整个组织中；鉴定出至少1个哈索尔小体；CK14染色散布在整个组织中；以及观察到完整核。
除了评估每个切片是否满足放行接受标准外，病理学家还对每个H&E和AE1/AE3载玻片进行了更详细的综述。注意到以下观察结果。
如上所述，来源于相同供体胸腺的并且在相同时间点测试的所有切片都类似地满足该时间点的接受标准，其中在皮质和髓质的相对量、残余胸腺细胞和/或坏死方面有所变化。
注意到的差异是相对大小、形状、胸腺皮质相对于髓质的相对含量、坏死量、胸腺上皮的凝缩和残余胸腺细胞的数量。
此外，在不同时间点测试的来自不同供体的批次也在质量上彼此相似。观察到的差异与坏死量(其随着培养时间的增加而增加)和残余胸腺细胞的数量(随着培养时间的增加而减少)相关。
对任何一个切片的组织学检查产生关于整个批次的可接受性的相同结论。基于这些观察结果，来自胸腺的任何一个切片的相关特征都反映了整个胸腺的特征。此外，组织切片在第5天的组织学外观反映了在每个后面时间点(第9天、第12天和第21天)观察到的组织学外观，但在后面时间点观察到更多的坏死。图11是一个很好的实例，其示出了从第0天至第21天，如通过抗体AE1/AE3评估的上皮网络的相似性。
实施例3：胸腺组织的强制降解研究。
在此研究中，对胸腺组织切片进行处理以产生被认为是降解的或非活的组织切片。将三个胸腺用于这些实验。从每个胸腺获取对照样品。测试了表7中呈现的处理条件。
表7：强制降解处理条件
Figure BDA0003507144800001271
通过将含有切片的10cm培养皿放入Ziploc袋中，并且放置于55℃水浴中来完成热冲击。将板搁在支撑物上并且没有被浸没。通过将10cm培养皿放置于-20℃冷冻机中4小时，之后在环境下解冻来完成冷冻/解冻。
在培养的第5天和第9天测试样品的组织学。在第21天也对一些样品进行了测试。此研究中的所有切片均满足组织学测试的放行接受标准，即：在第5-9天对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域散布在整个组织中；鉴定出至少1个哈索尔小体；CK14染色散布在整个组织中；以及观察到完整核。
除了评估每个切片是否满足放行接受标准外，病理学家还对每个载玻片进行了更详细的综述。注意到以下观察结果。
暴露于冷冻/解冻或10X PBS的样品显示出最多的坏死，但是一些细胞仍显现为完整的并且满足活力的组织学标准。有关暴露于10X PBS的实例，参见图12。
保持在室温下、经过脱水、在生理盐水或1％DMSO中孵育或经历热冲击的切片显示出较少程度的组织学变化。
对于对照样品，病理学家注意到以下观察结果。
随着胸腺组织的培养，胸腺细胞逐渐丧失。然而，由于无法募集吞噬细胞来清除死亡细胞，所述死亡细胞可能在培养的胸腺中长期存在。经历凋亡性细胞死亡的细胞核最初凝缩，并且被苏木精染料染色更深(蓝色)。在这些细胞耗尽其能量但未被吞噬时，它们丧失其膜完整性并变为坏死的。核溶解(核在坏死细胞中的溶解)通常在体内2-3天内发生，但在胸腺培养过程中显现为更缓慢地发生。因此，在胸腺细胞核已经经历核溶解的坏死细胞碎片中看见大片嗜酸性(粉红色)宽阔区域并不少见。与活细胞相比，一些死胸腺细胞保留了其核，所述核具有参差不齐的边缘和改变的染色特征。
随着胸腺细胞从组织中耗尽，胸腺上皮细胞变得更加可见。三维胸腺上皮(TE)网络通常经由连接的上皮细胞和/或(看似)散布的TE细胞(其连接在所检查的切片中不明显)的浅色和花边状排列在切片中展示出。随着胸腺细胞在培养过程中的丧失，三维网络收缩。这导致残余的上皮细胞凝缩，使得被膜下皮质上皮层变厚并且髓质TE细胞变得更紧密地堆积。活的TE细胞的核通常呈椭圆形，大于胸腺细胞的核，并且具有由苏木精(蓝色)染色勾勒的清晰界定的核膜以及一个或多个核仁。这些TE核通常看起来是“开放的”，这意味着其不会被苏木精染色成深色。这符合它们是活的且具有代谢活性的解释，因为活性染色质(“常染色质”)不能结合苏木精染料。在许多TE细胞中作为核糖体合成的位点的核仁的存在进一步确认了它们是活的并具有代谢活性。来自第5天、第12天和第21天的对照切片的典型组织学外观分别示出于图8、9和10中。
对于包括室温、脱水、1％DMSO和热冲击的处理条件，病理学家指明切片的外观与对照的外观没有显著差异。对于热冲击样品，病理学家指出，热处理可能通过凝结阻止进一步降解的蛋白质来“固定”细胞。热处理已经被用作包括胸腺在内的组织的固定剂。
图12A和12B描绘了暴露于强制降解条件之后的胸腺组织载玻片的组织学。图10描绘了对照胸腺组织切片在第21天的组织学外观。
在这些时间点处，强制降解组织的总体组织学外观相似，但是在第21天具有较少的残余胸腺细胞(图12B)。髓质区域中的代表性哈索尔小体由图12B中的箭头状物指示。代表性的显现为活的胸腺上皮细胞由图12A和12B中的箭头指示。在第21天图12B中所示的皮质区域几乎完全由坏死淋巴细胞组成。左下角的标尺表示100μm。
实施例4：胸腺组织原料药批次分析
10批胸腺组织的批次分析数据示出于下表8中。
表8
Figure BDA0003507144800001291
Figure BDA0003507144800001301
符号说明：
(a)根据在产生时适当的规格对这些批次进行测试。此表中呈现出的原料药测试结果也代表最终的成品药测试结果。
(b)外观规格没有篡改或损坏容器的迹象。
(c)使用组织学测定来鉴定身份和效力两者。组织学规格(在5-9天之间进行测试)如下：
(d)对角蛋白呈阳性的区域散布在整个组织中。
i.鉴定出至少1个哈索尔小体
ii.CK14染色散布在整个组织中
iii.观察到完整核
iv.在第1天、第7天和第14天收集无菌性样品和支原体样品。
使用针对56个临床胸腺，用于胸腺内变异性、胸腺间变异性和时程测试的8个胸腺以及经历强制降解的3个胸腺的数据来产生当前的对照文库。文库中的强制降解样品(阴性对照)是通过暴露于冷冻/解冻或10X PBS而经历过降解的样品。全数据集产生14个不同的集群。将所有强制降解样品聚集在一起，并且没有将临床样品或特征样品与强制降解样品聚集。
实施例5.
实施例5的总体实验设计描绘于图20中。呈现了手术程序和治疗方案的示意图。图和下面的大部分文字来自准备提交发表的手稿：Kwun,J.等人,JCI Insight.2020年6月4日；5(11)。
实验设计的示意图描绘了通过手术插入CTT诱导的幼稚T细胞重构、胸腺生成和供体特异性耐受性。在心脏移植和手术插入CTT前，对所有Lewis(LW)大鼠进行胸腺切除并经由抗CD5 mAb耗尽T细胞。将来自F1(LWxDA)大鼠的CTT和来自DA大鼠的心脏移植至胸腺切除的LW接受者中。经由渗透泵进行移植之后，给予环孢霉素(CsA)，持续四个月。CsA停用后2至3个月，将第三方BN心脏移植至颈部中。对照大鼠经历相同的程序，不同的是它们没有接受CTT的手术插入
实施例5证明，如下所述的植入在免疫功能不足大鼠模型中的CTT可以诱导对移植的实体器官的耐受性。我们进行单倍体匹配F1(Lewis x Dark Agouti，LWxDA)CTT(如下所述培养)与血管化的错配DA心脏移植物向Lewis大鼠中的植入。
在植入CTT前，对接受者进行胸腺切除和T细胞耗尽。
从心脏移植当天开始，施用环孢菌素4个月。对照组未接受CTT的植入。停用免疫抑制后两个月，植入有CTT的接受者在外周血中显示出幼稚CD4(CD62L+CD45RC+)T细胞的再增殖；对照大鼠则没有(图23)。即使在发育出胸腺新迁出细胞CD4(CD90+CD45RC+)T细胞之后，移植有CTT的接受者也未排斥DA心脏同种异体移植物(图25)。由于缺乏功能性T细胞，对照未排斥DA移植物(图25)。
为了确认供体特异性无应答性，在最初错配的DA心脏移植后的第180天，移植了MHC错配的Brown Norway(BN)心脏。具有CTT移植物F1(LWxDA)的LW大鼠迅速排斥第三方BN心脏(平均排斥时间10d；n＝5)(图27)。对照未排斥第三方心脏(n＝5)。CTT的接受者能够产生针对第三方BN供体的抗体，但未针对DA胸腺供体产生抗体，这证明了体液供体特异性耐受性(图32A)。尸检时移植的CTT的免疫组织化学显示出功能性胸腺组织(图24)。总之，给予至Lewis大鼠的F1(LWxDA)CTT导致对供体胸腺中表达的同种异体DA MHC的特异性耐受性，从而导致在撤除所有免疫抑制之后DA心脏移植物仍长期存活。
材料和方法。
动物模型
在此实施例5中，如先前所述，从3日龄的F1(Lewis x Dark Agouti大鼠幼崽)收获并培养同种异体CTT(图17A和17B)，并且然后将其以与如先前所述的对患有无胸腺cDGA的人类婴儿的治疗相当的方式植入至胸腺切除的Lewis(RT-1l)接受者大鼠中。(Markert,ML等人,2008；Market,ML等人,2010)。
Lewis(RT-1l)和BN(RT-1n)大鼠购自Charles River。DA(RT-1av1)大鼠购自Envigo。F1(LEW/DA；RT-1l/av1)由实验动物资源设施的杜克育种核心部(Duke BreedingCore Division of Laboratory Animal Resources facility)的规程工作人员繁殖。Lewis接受者接受了胸腺切除术，如以下文献中所述：Rendell VR,Giamberardino C,Li J,Markert ML和Brennan TV,2014,“Complete thymectomy in adult rats with non-invasive endotracheal intubation.”J Vis Exp(94)。
简而言之，用平头镊子分离颌下腺和胸骨舌骨肌，以使覆盖气管的组织暴露。在胸骨柄中产生1至1.5cm的切口。使用7cm的手摇式牵开器牵开所述柄和两半胸骨舌骨肌，以露出胸腺。用平头镊子抓住胸腺并拔出。用3至4-0单丝缝合线闭合胸骨的切边。将两滴2.5mg/ml布比卡因施加在切口上，并且用三个或四个9-mm伤口夹具闭合皮肤外层。
使所有胸腺切除的大鼠维持含有复方新诺明(Septra)(PPMI NutritionInternational,LLC)的饮食。为了在体内诱导T细胞耗尽，在胸腺切除术后第0天、第5天和第10天腹膜内施用1mg抗CD5 mAb(OX19；BioXCell,NH)，并且相对于心脏移植，从第0天(心脏移植物和CTT时间点)至4个月给予用0.25mg/kg/d的环孢霉素泵的抑制。所有大鼠均按照杜克机构动物研究伦理委员会(Duke Institutional Animal Research EthicsCommittee)的指南和顺应性来使用和维护。
体外胸腺培养和CTT
从三日龄新生F1(LEW/DA)大鼠幼崽无菌收获胸腺，沿纵向自然接缝切成四块，并且转移到具有TOM培养基的组织培养皿中的无菌硝化纤维素滤膜(MF-Millipore，Millipore Sigma)上(图17B)。在具有5％CO2的CO2培养箱中在37℃下培养胸腺组织，持续期望的时间长度(5至7天)。每天更换培养基。胸腺器官培养基(TOM)由以下构成：HAMS F12(Life Technologies)，86.5％；Hepes(Life Technologies)，25mM；L-谷氨酰胺LifeTechnologies)，2mM；胎牛血清(Life Technologies)，10％；以及Pen-strep(LifeTechnologies)，1x。移植当天，用新鲜培养基冲洗胸腺块，并且用一根牢固的缝合线(10-0单丝)将其移植在Lewis大鼠的肾被膜下。参见图17C。所有操作均在生物安全柜中在无菌条件下进行。
腹部和宫颈的心脏移植
将完全MHC错配的DA(RT-1av1)供体心脏移植至胸腺切除的Lewis(RT-1l)接受者中。使用以下描述的方法的修改技术进行腹部心脏移植：Schmid C,Binder J,Heemann U和Tilney NL,1994,“Successful heterotopic heart transplantation in rat,”Microsurgery 15(4):279-281。
简而言之，在Euro-Collins溶液中短时段的冷缺血之后，将供体心脏移植至接受者的腹腔中。使用连续的9/0不可吸收单丝缝合线，以端侧方式将供体肺动脉和主动脉与接受者下腔静脉和降主动脉吻合，以作为用于循环的流入和流出血管。经由渗透泵(型号2ML4，Alzet)给予环孢霉素A(CsA)。接受者在胸腺移植之后使用渗透泵接受环孢霉素(CsA)，大约2.5mg/kg/天。在胸腺移植后4个月，当测试组的幼稚T细胞超过10％时，停用CsA。将泵无菌装载，并且手术皮下插入至接受者的背部中央区域。每月替换渗透泵，持续4个月。对于将完全MHC错配的BN(RT-1n)第三方心脏移植至带有DA心脏的Lewis接受者，以修改的方式使用由Heron等人描述的宫颈血管化心脏移植方法(Heron I.,1971,“Atechnique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats,”Acta Pathol Microbiol Scand A 79(4):366-372)。
在6至7个月，将第3方BN心脏移植在颈部中。简而言之，经由从下颌至剑突的纵向切口，将第三方心脏移植至宫颈区域的右侧中。将供体肺动脉和颈外静脉端到端吻合，并且通过套囊技术将主动脉吻合至右颈总动脉。通过每日触诊监测移植物，并且后面在处死时通过剖腹术确认移植物。在排斥(停止搏动)当天或指定时间点处死动物。
流式细胞仪分析和监测DSA
从颅腔静脉获得外周血，并且用抗体染色。为了分析幼稚和胸腺新迁出细胞，使用了以下的组合：抗大鼠CD3 APC(BD Biosciences)；抗大鼠CD4 APC-Cy7(Biolegend)；抗大鼠CD8a V450(BD)；抗大鼠CD45 PE-Cy7(BD)；抗大鼠CD45RC-PE(BD)；抗大鼠CD62L FITC(BD)；和抗大鼠CD90 BV 510(Biolegend)。为了评估T细胞、B细胞和NK细胞的百分比，使用了以下的组合：抗大鼠TCR FITC(BD)；抗大鼠CD4 APC-Cy7(Biolegend)；抗大鼠CD8a V450(BD)；抗大鼠CD45 PE-Cy7(BD)；抗大鼠CD45RA PE(Invitrogen)；抗大鼠NKR-P1A-APC(Invitrogen)。为了区分宿主与供体，使用了以下的组合：抗大鼠TCR APC(Biolegend)、抗大鼠CD45 PE-Cy7(BD)；MHC I类RT1Aa(Santa Cruz Biotechnology)。还针对非偶联的MHCI类RT1Aa使用了山羊抗小鼠IgG二抗(Invitrogen)。通过连续收集的接受者血清样品与DA供体或BN第三方大鼠的流式交叉匹配，评估供体特异性同种异体抗体(DSA)。将FITC缀合的泛大鼠免疫球蛋白抗体添加至样品，并且在洗涤后孵育。用APC缀合的抗CD3将T细胞染色。在LSR fortessa(Beckman Coulter)上分析样品。
尸检
当测试组排斥宫颈BN心脏时，在CTT后8个月在尸检时评价胸腺移植物和所有心脏。如所预测的，不表达DA MHC的接受者来源的T细胞显现在胸腺移植接受者的外周血中(图21)。
组织学、免疫组织化学(IHC)和形态学分析
将来自肾被膜下面的所有培养的胸腺和CTT样品冷冻在OCT(最佳切割化合物；Tissue Tek)中。对照胸腺组织从新生儿至5日龄的大鼠幼崽获得。对四至五mm的切片针对CD3(多克隆；Dako)、Ki-67(克隆：SP6；Thermo)、CK(多克隆；Invitrogen)进行染色。使用Olympus DP-70数码相机系统的Olympus Vanox AH-3显微镜获得IHC图像。对移出的心脏从心室中层至基底进行连续切片(5μm)。进行H&E染色以进行常规检查并对排斥排级。用多克隆抗CD3(Dako)染色评价移植物浸润性T细胞。用Aperio ScanScope XT(AperioTechnologies,Inc.,Vista,CA)扫描移植物的整个载玻片。
统计分析
通过GraphPad Prism(GraphPad软件7.0，San Diego,CA)分析实验结果。将用于移植物存活差异的对数秩检验和学生t检验或Mann-Whitney U检验用于其他数据。所有数据表示为平均值±SD。p值小于0.05被认为在统计学上显著。
结果
组织学分析(图18C和18D(100x放大倍数)和图19C和19D(600x放大倍数)显示，在培养之后胸腺中Ki67+、CD3+细胞减少，这类似于在培养用于患者的胸腺组织之后看到的变化(Markert ML等人,2008),“Use of allograft biopsies to assess thymopoiesisafter thymus transplantation.”J Immunol 180(9):6354-6364)。与培养的人胸腺相同，基于细胞角蛋白(CK)染色，胸腺上皮细胞(TEC)网络在大鼠的培养的胸腺组织中得以保存(图18B(100x放大倍数)和图19B(600x放大倍数)。
如所预测，不表达DA MHC的接受者来源的T细胞显现在胸腺植入接受者的外周血中(图21)。在CTT植入之后，在第26天、第55天、第97天和第253天，在图21的右下象限中看到了不断再增殖的接受者型T细胞。
移植的同种异体胸腺组织的免疫组织化学分析。
在T细胞耗尽以及胸腺和心脏移植之后的循环性T细胞再增殖描绘于图23中。所有动物在T细胞耗尽之后均显示出循环性T细胞的显著减少。插入了CTT的心脏同种异体移植物接受者(蓝色/虚线)显示出循环性T细胞的逐渐再增殖。没有插入CTT的动物也显示出一定程度的循环性T细胞(红色/虚线)。然而，在插入了CTT的动物中，幼稚和胸腺新迁出细胞CD4和CD8 T细胞显著增加(p<0.01)，而对照动物未显示出循环性幼稚或RTE CD4和CD8 T细胞。
在植入后8.5个月移出的植入胸腺显示出阳性细胞角蛋白染色(图22A)以及与天然胸腺相似的T细胞染色(图22B)。原始放大倍数×400。
插入了CTT的动物显示，外周血中的幼稚(CD62L+CD45RC+)CD4和CD8 T细胞以及胸腺新迁出(RTE)T细胞的再增殖显著增加，而没有胸腺植入的对照组显示出低水平的循环性幼稚CD4和CD8 T细胞并且未显示循环性RTE CD4和CD8 T细胞(图23)。植入前各组之间的总循环性CD3 T细胞数量无明显不同。如预期的那样，与未植入CTT的对照动物相比，具有CTT植入物的LW接受者显示循环性CD4和CD8 T细胞数量显著增加(图23)。
在第180天，在心脏同种异体移植物接受者的接受者中，在肾被膜下移植的培养的胸腺组织描绘于图24中。
组织学显示出与肾组织分开的不同结构(原始放大倍数，x20)。移植的培养的胸腺组织显示出正常的胸腺结构(H&E)、活的T细胞(CD3)、T细胞增殖(Ki67)以及上皮细胞上的哈索尔小体形成(黑色箭头)和花边状图案(细胞角蛋白)，这确认了胸腺的活力与胸腺生成(图24B)。原始放大倍数，x 200。(数据表示为平均值±SD；每组n＝8-9只动物；学生t检验，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，****P<0.0001；NS，不显著(p>0.05)。
此外，从手术插入CTT开始，在第180天移出的植入CTT的免疫组织学分析显示出正常的胸腺组织学、活的T细胞(CD3)、T细胞增殖(Ki67)以及TEC上的CK花边状图案和哈索尔小体形成(箭头)(图24B)。这些观察结果确认了在接受同种异体心脏移植的动物中，移植胸腺的活力和功能(胸腺生成)。
总之，移植有CTT的大鼠在心脏同种异体移植物接受者中展示出胸腺生成和幼稚T细胞发育。
预期由于在表达CTT的DA和LW中T细胞发育，因此与DA供体反应的T细胞不会发育。
评价DA心脏的排斥迹象。图25显示，具有DA心脏移植物并且未经任何免疫抑制治疗的LW大鼠在10天内排斥DA心脏移植(DA对照，空心方块)。然而，即使在发育RTE(CD90+CD45RC+)T细胞之后，具有手术插入的CTT的LW接受者也没有排斥(不停止搏动)DA心脏同种异体移植物(n＝8，实心三角形)。出乎意料的是，没有插入CTT的LW对照动物也未排斥DA心脏移植物(n＝9，上下颠倒的实心三角形)。两组在整个研究期(第180天)内均显示出良好的搏动质量。由于连续的移植物搏动并不一定意味着没有排斥，因此在停止免疫抑制后两个月(即，在第3方BN宫颈心脏移植前)处死两只接受者大鼠，以确认没有排斥。两只动物的心脏同种异体移植物(DA心脏)均显示出极小的单核细胞浸润(图26A，插入了CTT；和图26B，没有插入CTT)，没有2004年国际心肺移植协会(ISHLT)分级的排斥征象(图26C)。
Kaplan-Meier存活曲线(图25)显示，与具有DA心脏移植物而没有免疫抑制的LW大鼠(DA对照)相比，来自具有或没有CTT的动物和同基因对照(LW心脏进入LW大鼠中)的移植物存活期显著延长。在第180天从具有或没有CTT的动物中移出的移植物的代表性扫描图像示出于图26A和26B中。图像改编自整个载玻片扫描。
ISHLT分级显示，来自具有CTT的接受者与没有CTT的接受者的心脏同种异体移植物的排斥等级之间没有差异(每组n＝3-4)(图26C)。Mann-Whiney U检验，*P<0.05；NS，不显著(p>0.05)。
基于CTT后幼稚T细胞的重建，我们认为具有CTT的动物丧失了其供体反应性T细胞组库，而没有胸腺植入的动物并未完全重构其T细胞群(一般的低应答性)。
对第三方血管化心脏移植的同种异体反应性
为了确认与一般的低应答性不同实现了供体特异性的无应答性(耐受性)，在DA心脏移植后6至7个月(第180天到第210天)在两组动物中均进行了另外的完全MHC失配的BN心脏移植。
插入有CTT的LW大鼠(实心三角形，图27)迅速排斥(移植物博动停止)第三方BN心脏(n＝5，中值存活时间(MST)＝10±1.0天)。然而，未插入CTT的对照LW动物未排斥第三方心脏(n＝6，MST≤38.5±8.9天)，这可能是由于缺乏任何同种异体反应性T细胞所致。
根据对第三方心脏的此排斥缺乏，组织学分析确认，插入了CTT的动物(倒置的实心三角形，图27)显示出心脏同种异体移植物中单核细胞浸润的增加(图28A)，而未插入CTT的动物显示出原始的BN心脏同种异体移植物(图28B)。具有CTT的接受者迅速排斥BN心脏(MST＝10±1.0天)(实心正方形，图29)，而没有CTT的接受者未排斥第三方BN心脏(虚线三角形，图29)。BN对照(实心圆圈，图29)显示出LW大鼠对BN心脏的排斥。同基因对照(空心圆圈，图29)显示出LW大鼠对LW心脏的排斥缺乏。Kaplan-Meier存活曲线(图27)显示出移植物存活的显著差异。移出的BN心脏移植物在排斥时或移植后46天的代表性扫描图像分别显示于图28A和28B中。来自插入了CTT的动物的BN心脏移植物显示出严重的单核细胞浸润(图28A)，而来自未插入CTT的动物的BN心脏移植物未显示出排斥征象(图28B)。图像改编自整个载玻片扫描。
与同基因对照或未插入CTT的大鼠相比，来自插入了CTT的大鼠(实心正方形，图29)的移出BN心脏的组织学分析(ISHLT分级)显示出3R级排斥，其中炎性细胞浸润显著增加(阴影三角形，图29)。ISHLT分级显示，与来自没有CTT的动物的BN心脏相比，来自具有CTT的动物的BN心脏的排斥分级显著更高(每组n＝3-5)。Mann-Whiney U检验，*P<0.05；**P<0.01；NS，不显著(p>0.05)。
还应注意的是，插入了CTT的接受者中的宫颈BN心脏大大增大(图30A)，而腹部DA心脏比天然心脏小(图30A)。与来自具有CTT的接受者的BN心脏相比，来自未插入CTT的接受者的BN心脏的大小未显示出任何增加(图30B)。
第三方心脏中的选择性T细胞浸润，但在共享CTT的DA MHC的DA心脏中没有。
在此大鼠心脏移植模型中，使用两种常规方式来定义移植排斥：心脏博动/停止测量和ISHLT人类分级系统。前者对低等级的排斥不敏感，而后者对高等级的排斥不敏感。结果，在第180天在来自3只大鼠的DA心脏中测量了炎性细胞浸润，并且在7-8个月处死时在5只大鼠中的BN心脏中测量了炎性细胞浸润。因此在第180天在来自3只大鼠的DA心脏中测量了炎性细胞浸润，并且在7-8个月处死时在5只大鼠中的BN心脏中测量了炎性细胞浸润。
用T细胞耗尽、手术插入CTT和施用四个月的CsA治疗大鼠在T细胞再增殖之后未显示DA心脏中炎性细胞浸润的水平增加(图31A)。与具有CTT的大鼠或没有CTT的大鼠相比，DA对照移植物(在无免疫抑制的LW大鼠中)显示DA心脏中免疫细胞的移植物浸润显著增加。插入有CTT的动物在第三方心脏同种异体移植物(BN心脏)中显示出大量炎性细胞浸润(图31B)。与来自没有CTT的动物的BN移植物中的相比，BN对照移植物(在无免疫抑制的LW大鼠中)和来自具有CTT的接受者的BN移植物显示出明显升高的炎性细胞浸润。未插入CTT的大鼠由于其免疫能力不足，在BN心脏中未显示出浸润(图31B，阴影三角形)。
用免疫组织化学评价T细胞浸润，并且确认了在插入了CTT的动物的BN(右侧小图，图31C)心脏中存在选择性T细胞浸润而在DA(中间小图，图31C)心脏中不存在选择性T细胞浸润，并且在未插入CTT的动物的两个心脏中均缺乏T细胞浸润(图31D)。在BN心脏排斥时，收获来自DA大鼠和BN大鼠的心脏同种异体移植物以及天然心脏。总体而言，在插入了CTT的接受者中，天然心脏和DA心脏(POD 196)未显示出T细胞的显著增加，而BN心脏(POD14)显示出大量T细胞。图像改编自整个载玻片扫描。每组共3-5只动物被分析；学生t检验，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，****P<0.0001；NS，不显著(p>0.05)。
这些数据确认，对于接受CTT的组，T细胞浸润仅发生在第三方BN移植物中，而不发生在与所植入胸腺共享MHC的(DA)移植物中，这可能是由于缺乏针对(DA心脏)供体抗原的T细胞组库(通过阴性选择)。
胸腺移植后针对供体抗原的体液应答
评价抗供体抗体应答，以确定在胸腺切除之后进行LWxDA移植和CTT的手术插入的LW大鼠中注意到同种异体T细胞无应答性是否与针对供体DA MHC的体液耐受性相关联。收集连续收集的接受者血清样品，并且将其与来自DA和BN大鼠的PBMC进行流式交叉匹配。接受DA或BN心脏移植物的无免疫抑制的动物产生了针对其供体(分别为DA或BN)的抗体。如图32A中所报告，具有同基因心脏同种异体移植物的动物未产生针对DA或BN MHC的抗体(左侧栏中的水平阴影峰，DA在顶部并且BN在底部)。通过T细胞流式交叉匹配测量的移植后供体特异性同种异体抗体(抗DA抗体和抗BN抗体)的代表性直方图示出于图32A中。具有或不具有CTT的接受者未产生任何针对DA抗原的抗体(图32A中的顶部行、中间和右侧栏)，而具有CTT的动物能够产生针对BN抗原的抗体(下面行、中间小图，图32A)。来自无免疫抑制的DA心脏移植接受者的血清样品和来自无免疫抑制的BN心脏移植LW接受者的血清样品分别用作抗DA抗体(顶部行，左小图，粗线)或抗BN抗体(底部行，左小图，虚线)的阳性对照(DA对照和BN对照)。
有趣的是，与T细胞低应答性类似，在具有或不具有CTT的动物中未检测到抗DA Ab(图32B)。在插入了CTT的LWxDA动物中很容易检测到抗BN Ab，但在未插入CTT的动物中却没有检测到，p<0.01(图32C)。没有CTT的动物通常是免疫缺陷的。具有CTT的动物对DA具有特异性耐受性。
总之，胸腺共移植导致对供体胸腺中表达的同种异体DA MHC的特异性耐受性，并且因此经由防止供体特异性抗DA T细胞组库的发育以及防止供体(DA)特异性体液应答，导致DA心脏移植物长期存活。通过对第三方BN心脏的快速排斥以及针对BN供体细胞的同种异体抗体应答，在这些大鼠中展示出免疫能力。
可以从DiGeorge异常患者的临床经验中得出对上述治疗的进一步支持。
患者1是出生时患有完全DiGeorge异常的儿童。所述患者出生时没有T细胞。患者1的主要问题是严重的甲状旁腺功能减退，从而导致因低钙血症而多次住院治疗。在同一天向患者1给予培养的胸腺组织移植物(CTT)和亲本甲状旁腺移植物。在一项小型临床试验中，向另外三名患者给予胸腺加亲本甲状旁腺。患者1在生命的4个月内接受了两个移植物。尽管患者1没有T细胞，但根据方案在移植前向患者1给予RATGAM以进行免疫抑制。未给予其他免疫抑制。患者1产生了幼稚T细胞和正常增殖性T细胞对有丝分裂原的应答。在试验中所有接受胸腺和甲状旁腺两者的四名患者产生了正常的甲状旁腺激素水平。患者1是唯一能够长期(10年)停止补钙的受试者。在其他三名患者中，一名患者在一年前死于肺部疾病，并且另外两名患有完全DiGeorge异常的患者必须在大约一年后恢复补钙。患者1是唯一在所有时间点对亲本甲状旁腺供体具有阴性混合淋巴细胞反应(MLR)的受试者。从第一个测定开始，其他三名受试者具有阳性MLR。
患者1维持甲状旁腺功能的可能解释是，患者1的甲状旁腺供体具有与接受者HLA-II类等位基因(下表9中的“*”)或胸腺供体HLA-II类等位基因(下表9中的
Figure BDA0003507144800001412
)匹配的HLA-II类等位基因。
患者1中的CLP发育成胸腺中的胸腺细胞。
来自患者1的树突状细胞迁移至胸腺并删除与患者1DC上的MHC紧密结合的T细胞。存在对下表9中标记为“*”的等位基因的耐受性。参见表9。
胸腺供体的胸腺上皮细胞也删除与其紧密结合的胸腺细胞(下表9中标记为
Figure BDA0003507144800001413
)。这是对下表9中标记为
Figure BDA0003507144800001414
的等位基因耐受的机制。
表9
Figure BDA0003507144800001411
值得注意的是，可以看到甲状旁腺供体中有一个HLA-B等位基因和一个HLA-C等位基因与接受者或胸腺供体都不匹配。我们不明白为什么不排斥甲状旁腺。然而，经过10年后，向儿童给予了活麻疹/腮腺炎/风疹疫苗。甲状旁腺功能在两周内被破坏，并且患者1恢复补钙。
我们得出结论，活疫苗激活了患者1中的CD8 T细胞。三分之一的CD8 T细胞具有固有的同种异体反应性。同种反应性CD8 T细胞对甲状旁腺供体中错配的HLA-B和C等位基因起反应(表9中的放大粗体HLA-B和HLA-C等位基因)。
利用来自此患者的数据，很明显，需要匹配HLA-I类和HLA-II类两者以诱导长期耐受性。接受者对甲状旁腺供体中的DPB1*04:02等位基因具有耐受性，因为患者表达DPB1*0402。患者的树突状细胞移动至胸腺并删除与DPB1*0402紧密结合的任何细胞。接受者未排斥甲状旁腺，因为DQA1等位基因DQA1*05:05/08表达于胸腺中。DQA1*01:02等位基因可能由患者遗传自母体，并且因此儿童对该特异性耐受。儿童不对甲状腺旁供体中的DRB！*11:04等位基因起反应，因为其与母体中的111:01等位基因紧密相关。关于I类B*35:03和C*04:01等位基因，胸腺没有删除与这些等位基因有反应性的胸腺细胞，因为它们在接受者中、在胸腺供体中均不表达。在接受植入物后十年，儿童接受MMR疫苗。麻疹是非常强的刺激物。大约三分之一的循环性T细胞具有固有的同种异体反应性。当接受者CD8 T细胞暴露于麻疹疫苗时，它们对甲状旁腺起反应并且将其迅速破坏。此患者疗程显示，实体器官接受者中的I类和II类等位基因两者必须在接受者或在胸腺供体中表达以便实现其对实体器官的耐受性。此儿童茁壮成长，具有良好的T细胞数量和功能以及正常的免疫球蛋白水平。然而，由于亲本甲状旁腺被排斥，患者1保持补钙。
实施例6.新鲜培养的NHP胸腺组织的结构和活力的评价
为了在非人灵长类动物(NHP)中开发培养的胸腺组织植入(CTT)平台，将NHP供体胸腺切除并培养，并且针对正常的组织外观和结构进行评价。
方法
通过有限的上胸骨切开术从恒河猴NHP手术切除胸腺，将其与上文所述的已确立小儿技术相同地切片并培养。已经开发两种抗体面板用于实验和组织评估目的。使用包括CD3、CD4、CD8、CD28、CD31、CD45RA和CD197的一种面板来经由流式细胞术评估血液中胸腺新迁出细胞(RTE)和幼稚T细胞的存在(图36)。使用包括AE1/AE3(泛细胞角蛋白)、细胞角蛋白(CK)14、Ki-67(增殖)、CD3(T细胞含量)和CCL21(趋化因子产生)的第二抗体面板用于组织学(IHC)评估收获的新鲜胸腺、培养的胸腺以及如上文和下文实施例8和9中所述获得的胸腺移植物活检。对新鲜NHP胸腺进行IHC抗体面板以证明组织的适当性。在植入在大腿肌肉中前将如上文所述为临床样品建立的批次放行标准用于培养的胸腺组织。如图33A-J中所示的移植胸腺组织的活检的评价也使用为临床样品建立的标准。
结果
如图33A-E中所示，新鲜的NHP胸腺切片与新鲜的人胸腺切片高度相似。图33A示出了正常的NHP胸腺形态：看到密集堆积的皮质胸腺细胞，而中央髓质较不密集地堆积，在中心具有哈索尔小体。图33B示出了在整个胸腺T细胞上的CD3染色。活的T细胞显现为棕色环。图33C示出了主要在髓质中作为花边状延伸部看到的细胞角蛋白和哈索尔小体。在新鲜胸腺的皮质中看不到细胞角蛋白，因为有太多胸腺细胞。图33D示出了反映皮质中的Ki-67抗原的棕色染色。Ki-67分子指示核增殖。此面板示出了在皮质中复制胸腺细胞而在髓质中几乎没有的经典外观。图33E示出了在皮质中而在髓质中较少的CK14。图33F-J中培养12天后的染色与图33A-E中的显著不同，并且与体外培养后人体样品中的发现非常相似。图33F示出了胸腺细胞的显著丧失，保留有活的胸腺上皮细胞。图33G展示了T细胞(CD3+)的显著耗尽。靶向的抗原是CD3ε，其即使在T细胞死亡后仍保持相当稳定。死T细胞到处都具有CD3染色，而不仅仅是在细胞表面上(其在图像中显现为环)。切片中有一些活的T细胞，但与收获当天相比非常少。图33H用AE1/AE3细胞角蛋白抗体染色。细胞角蛋白阳性上皮细胞是活的，具有正常核。它们是部分凝缩的，因为胸腺中剩下非常少的T细胞。图33I用Ki-67染色。此切片中基本上没有增殖的胸腺细胞。皮质胸腺细胞大部分已经死亡。图33J具有活的CK14阳性上皮细胞。这些上皮细胞在其之间具有空间以包围将在CTT后从骨髓到达的早期胸腺祖细胞。培养12天在用于临床CTT的范围(12-21天)内。
实施例7.对冷冻保存的NHP胸腺组织的结构和活力的评价。
诱导对培养的胸腺组织的耐受性的临床应用需要冷冻保存，以便提供备用胸腺组织。将大约一半的培养的胸腺冷冻保存以供将来在移植后排斥或用于逆转心脏排斥发作的高剂量类固醇对CTT造成损伤的情况下使用。
方法
对于冷冻保存，如实施例6中所述培养NHP胸腺组织。在培养12天后，根据本领域的标准方法将NHP胸腺组织冷冻保存。在图34A-P中所示的实验中，将组织冷冻保存35天，然而，冷冻保存的时间可以延长至数年。在此实验中，然后将冷冻保存的组织解冻、福尔马林固定且石蜡包埋。使用与实施例6中相同的抗体面板进行免疫组织化学。
结果
图34A-P中所示的数据突出显示了培养12天的组织(根据方案允许的最少天数；如图34C、图34G、图34K和图34O中所示)与培养12天且然后冷冻保存35天的组织(如图34D、图34H、图34L和图34P中所示)之间的重要比较。将图34C中的细胞角蛋白与图34D中的细胞角蛋白比较显示，图34C展示出比图34D更花边状的图案，并且图34D中的细胞角蛋白略微凝缩。图34G和34H中的CK14细胞角蛋白染色非常相似。图34K和图34L中的CD3染色也非常相似。在图34O和图34P中都不存在Ki-67染色，这与图33I中的发现一致。培养12天的胸腺组织和冷冻保存的胸腺组织两者均满足临床样品的批次放行标准。
实施例8.培养的胸腺组织在无CMV的NHP模型中的成功移植的评估
这些实验涉及在NHP(恒河猴)模型中进行心脏移植和CTT，其目标为建立对移植心脏的耐受性以及在不需要持续免疫抑制药物的情况下实现长期无排斥的移植物存活。将使动物最大程度地错配。
方法
作为实验的概述，使用了最大程度地MHC错配的无CMV的恒河猴。接受者动物(Y)经历完全胸腺切除术。供体动物(X)捐献培养的胸腺组织和在异位位置中放入接受者Y中的心脏两者(第一个Tx和第二Tx)。然后撤除免疫抑制药物，并且通过以下证明供体特异性耐受性：i)供体心脏的持续搏动，ii)在MLR中对供体的耐受性与对第三方的反应性，以及iii)对来自第3方供体动物Z的皮肤移植物(第三Tx)的排斥。
所有实验性NHP是雄性的。鉴于常用的抗病毒预防药物可能干扰胸腺生成，因此使用了在加州大学戴维斯分校(University of California at Davis)的特定无病原体集落中饲养的CMV血清阴性NHP。基于杜克大学其他参与非人灵长类动物移植研究的研究人员的经验，有意义的分析可以来自3只接受者动物。此低数字是因为每只接受者动物中都应该存在耐受性(技术困难除外)。
大约在移植前一个月，接受者动物经历经由部分胸骨切开术进行的完全胸腺切除术，以为最终的供体胸腺移植做准备。将接受者的T细胞用恒河猴特异性抗胸腺细胞球蛋白(rhATG)耗尽。使动物完全康复并且每周经历流式细胞术，直到在外周血中不可再检测到RTE(估计2-3周)，由此表明完全天然胸腺切除术。流式细胞术面板鉴定作为CD3+、CD4+CD45+CD28+CD95-和CD31+的CD4+RTE。参见如图36中所示的门控策略。有关示例性实验方案参见以下参考文献：Markert ML,Sarzotti M,Ozaki DA,Sempowski GD,Rhein ME,Hale LP等人，Thymic transplantation in complete DiGeorge syndrome:Immunologic andsafety evaluation in twelve patients.Blood.2003；102:1121-1130；Markert ML,Alexieff MJ,Li J,Sarzotti M,Ozaki DA,Devlin BH等人，Postnatal thymustransplantation with immunosuppression as treatment for DiGeorgesyndrome.Blood.2004；104:2574-2581；Markert ML,Devlin BH,McCarthy EA.Thymustransplantation.Clin Immunol.2010；135:236-246.
选择携带MAMU A01的接受者动物，这是因为存在针对该等位基因的抗体用于流式细胞术，从而易于区分接受者来源的RTE。供体不表达MAMU A01，除非接受者中的初始胸腺切除术不是完全的情况；则原始的接受者将变为供体，而原始的供体将变为接受者。
第1阶段：有关对于实施例8中进行的实验的详细概述和时间线，请参见图38。
通过流式细胞术、CBC微分(CBC diff)、血液化学和CMV水平测试来自供体NHP(MAMU-A:01阴性和接受者NHP(MAMU-A:01阳性)的血液。将在对照NHP中进行类似的测试。在确认供体和接受者在第1阶段中彼此有阳性混合淋巴细胞反应(MLR)之后，供体NHP将胸腺组织和后面的心脏捐献至单一接受者(参见下文所述的第4阶段)。
第2阶段：如本说明书中其他地方所述，在第2阶段的第1周第3天对接受者NHP进行胸腺切除术，并且将接受者NHP胸腺培养12天。然后在培养的第12天冷冻保存接受者CTT。
在第2阶段期间，每周确定接受者的CMV水平。在第2周获取DSA(2ml)血液样品进行储存。在第3周的第1天在接受者NHP中测量CBC diff。每周在供体NHP中进行流式细胞术，直到接受者没有显示RTE。在第2阶段的第3周的第1天进行接受者NHP中的流式细胞术，以显示接受者NHP中没有RTE 3。如果RTE呈阳性，如果需要，将在第4周和第5周继续进行流式细胞术。同时确定供体NHP中的CBC、CMV水平。还每周监测CBC微分、CMC水平和流式细胞术，直到接受者NHP没有RTE。当没有发现RTE时，实验进入第3阶段。
如果由于接受者继续展示出胸腺新迁出细胞(RTE)而胸腺切除术不充分，则将NHP视为具有不完全胸腺切除术。然后将切换接受者和供体，其中供体为MAMU-A:01阳性并且接受者为MAMU-A:01阴性。在第2阶段中在对照NHP中监测CMV水平。
第3阶段：第3阶段从以下开始：在第3阶段的第1周第1天开始每十二小时向接受者NHP施用他克莫司。在第3天，对供体进行胸腺切除术。如说明书和先前实施例中所述，将移除的供体胸腺培养12天的时段，此时将一半冷冻保存。可以将另一半培养至第21天，并且在第3阶段中培养的第12至21天中的任一天植入在接受者的股四头肌中。
总而言之，在将培养的供体胸腺组织植入在股四头肌(以及随后的心脏移植)前大约一至两个月，接受者经历天然胸腺切除术。胸腺切除术必须通过外周血中胸腺新迁出细胞(RTE)的缺乏来确认为完全。将接受者的免疫抑制药物最终(在CD4幼稚T细胞为15％或更高之后)完全撤除，并且使用第三方MLR和皮肤移植证明供体特异性耐受性，所述MLR和皮肤移植应均在对来自胸腺和心脏供体动物的组织的特异性耐受性的环境下展示出对第三方供体组织的免疫能力。
在整个第3阶段中测量供体NHP中的化学、CMV水平，直到在第4阶段中进行非存活心脏移植。在第3阶段的第1周在接受者NHP中进行CBC diff、CMC水平和血液化学。抽取血液样品进行储存。在第2周的第4天进行流式细胞术以记录T细胞耗尽。在第3阶段的第2周测量CBC diff、他克莫司水平和CMV水平。
在整个第3阶段和第4阶段中在对照NHP中定期监测流式细胞术、CBC diff和CMV水平，直到在第4阶段的第10周获得皮肤移植物。
在第3阶段，第3周的第1天，然后将大约一半的CTT植入至接受者NHP的股四头肌中，并且将剩余部分冷冻保存。程序根据人方案进行。Markert ML,Devlin BH.Thymicreconstitution.In:Rich RR,Shearer WT,Fleischer T,Schroeder HW,Weyand CM,FrewA,editors.Clinical Immunology第3版Edinburgh:Elsevier；pp.2008.第1253-1261页。还进行皮肤活检。在第3阶段，在第10周的第3天，对CTT植入物进行活检，并且然后在第一次CTT植入后大约7周将冷冻CTT植入至另一条腿的股四头肌中，以增加移植的机会，从而评估冷冻保存的CTT效力。对新鲜培养的和冷冻保存的植入胸腺组织在植入后大约6周进行活检，以证实活力和正常组织结构。
从第1周的第1天开始，向接受者NHP施用他克莫司BID。
在第3阶段，在第2周的第1天，在接受者中开始ATG。在第2周的第3天，进行流式细胞术以显示T细胞耗尽。在第2周的第5天(即在CTT植入之前停药2天)将最后一剂的ATG施用至接受者。他克莫司在整个第3阶段中继续，直到观察到幼稚T细胞<15％。如果T细胞包含>15％的幼稚T细胞，则实验进入第4阶段。如果幼稚T细胞<15％，则实验进入第5阶段。在整个第3阶段中监测他克莫司水平、CMV水平、CBC diff，并且保存血液样本以供将来分析。在第3阶段期间，在接受者和对照NHP中每周测量他克莫司水平、CMV水平、CMC diff、肌酐和ALT水平。
第4阶段：在第4阶段的第4周的第1天对供体NHP进行非存活心脏捐献(如先前所提及)。在第4阶段的第4周的第1天进行来自供体NHP的异位心脏移植。如果需要，将供体血液用于输注至接受者NHP中。在整个第4阶段中通过ECHO心电图每周两次持续两周监测且然后每周监测接受者中的心搏。如果心脏停止搏动，则将接受者NHP处死。
在第1周的第1、2、5和7天，对接受者NHP进行称重并且检查胸腺活检。
在第4阶段，第4周的第1天，在心脏移植时对冷冻CTT进行活检。在整个第4阶段中，在接受者NHP中每周进行他克莫司水平、CMV水平和CBC diff。
在第4阶段的第10周，使用来自心脏供体的冷冻保存的血液、接受者血液和第三方血液进行MLR。接受者应对供体和自身具有耐受性，并且拒绝第三方皮肤组织。将第三方新鲜NHP皮肤组织和接受者NHP皮肤组织移植在接受者上。此举在第4阶段的第10周进行。每月继续通过流式细胞术、CBC diff和CMV水平监测接受者NHP(其中对照NHP作为测定对照。
可以在心脏移植后180天处死接受者NHP。将对接受者中的移植心脏和天然心脏进行病理学。将通过IHC分析供体培养的和冷冻培养的胸腺移植物，并且也将通过IHC分析胸部组织。值得注意的是，如果供体心脏正在搏动，PI可以选择让动物活得更久，以查看供体心脏将继续搏动多久。
第5阶段：如先前所指出，如果接受者中的幼稚T细胞在第3阶段中未达到15％，他克莫司将在整个第4和第5阶段中继续使用。一旦幼稚T细胞达到>15％，实验将进入第4阶段。在第5阶段期间，监测CBC diff、他克莫司水平、血液化学和CMV水平。
第6阶段：如果第5阶段中的幼稚T细胞<10％，则实验进入第6阶段。在第6阶段期间，他克莫司经4周的时段在接受者NHP中舍弃。在此时段期间，获得流式细胞术、CBC diff、CMV水平和血液化学测量值并且保存血液样品。移植来自接受者的冷冻CTT，并且在第6阶段的第9周中，对冷冻CTT进行活检，并且处死NHP并收获其器官。目的是显示天然胸腺可以在接受者中成功起作用(因此，技术问题不是供体胸腺组织移植失败的原因。在对照NHP中继续监测流式细胞术、CBC diff和CMV水平。
图35示出了总体实验设计的示意图。
实施例9.CTT诱导对相同供体心脏移植物的耐受性的能力的评估。
在NHP中进行的此实施例与如本说明书中其他地方所公开的关于人受试者中的小儿心脏移植阐述的公开手术程序和治疗相似。
方法
第1阶段：有关对于实施例9中进行的实验的详细概述和时间线，请参见图39。
在第1阶段中进行接受者和供体NHP血液测试。通过流式细胞术、CBC微分(CBCdiff)、血液化学和CMV水平测试来自供体NHP(MAMU-A:01阴性)和接受者NHP(MAMU-A:01阳性)的血液。将在对照NHP中进行类似的测试。在确认供体和接受者在第1阶段中彼此有阳性混合淋巴细胞反应(MLR)之后，供体NHP将胸腺组织和后面的心脏捐献至单一接受者(参见下文所述的第4阶段)。
第2阶段：在第2阶段中的第1周的第3天，在接受者Mamu-A:01阳性接受者NHP中手术进行胸腺切除术和皮肤活检。从第1周第3天至第3周第1天培养接受者胸腺。将来自皮肤活检的皮肤在第1周的第3天冷冻保存。每周对接受者NHP进行流式细胞术，直到没有显示RTE。在第2阶段的第2周的第1天，如果RTE为阴性，则实验进入第3阶段。每两周监测CMV水平，并且在第2阶段的第2周服用DSA(5ml)。
第3阶段：在第1周的第3天在供体NHP中进行胸腺切除术和皮肤活检。将供体胸腺培养12天(从第1周的第3天至第3周的第1天)。将一半培养的胸腺植入，并且将剩余的一半冷冻保存。在第4阶段之前，不对供体NHP进行任何其他程序。
对接受者NHP进行的程序包括在第3周的第1天将培养的胸腺从供体植入至接受者。那时在第3周的第1天开始他克莫司和MMF。他克莫司和MMF在整个第3阶段中继续。也在第3周的第1天施用ATG，持续五天，以耗尽T细胞。另外，在第3阶段期间，定期进行接受者血液测试。每周监测他克莫司水平以及CMV水平，在第3、7和16周测试DSA。CBC diff每两周与交替周中的肌酐和ALT交替进行。
他克莫司和MMF在第3阶段中继续，直到幼稚T细胞>15％，然后实验进入第4阶段。可替代地，如果幼稚T细胞未达到15％，则实验进入第5阶段(下文所述)。
第4阶段需要在第1周和第6周中对供体、接受者和对照NHP进行MLR确定。如果MLR显示出对供体的耐受性和对第三方(对照)的应答，则实验进入第2周。如果未显示出耐受性，则实验进入第6阶段。目的是显示接受者对供体具有耐受性，并且供体仍然对接受者有反应(即使供体中没有胸腺也应该是这种情况)。
在第2周进行流式细胞术以观察胸腺排斥，并且每周重复。然后继续他克莫司，直到在第9周中开始经4周舍弃。
如果实验进入第2周，则继续他克莫司，并且将MMF降低至BID施用且然后在第2周和第3周内每日施用，然后停止。
在第7周，在供体NHP中进行非存活心脏捐献和皮肤活检，并且如果需要，保存血液用于输注至接受者NHP中。在第7周的第1天在接受者NHP中进行异位心脏移植。在移植当天，在全身麻醉诱导和气管插管之后，经由正中胸骨切开术取得供体心脏。同时，准备好接受者NHP并且进行全身麻醉诱导和气管插管。准备好腹部并且经由正中剖腹术进入。向NHP施用使用静脉内甲基泼尼松龙的诱导免疫疗法，所述甲基泼尼松龙作为单次推注给予，剂量为20mg/kg。将腹主动脉和下腔静脉固定在肾动脉下方，并且为供体同种异体移植物的吻合术做好准备。然后夹住主动脉和下腔静脉并且施用5000单位肝素静脉内推注。将来自同种异体移植物的肺动脉以端对侧方式与下腔静脉吻合，并且以类似方式将来自同种异体移植物的降主动脉与肾下腹主动脉吻合。在排气并且确保窦性节律之后，闭合腹部。根据需要使用内部垫利用心脏复律。
在术后期间，通过定期触诊和每周超声心动图针对任何排斥征象(收缩性降低、心律失常等)评估移植心脏的移植功能。两种免疫抑制药物(他克莫司和吗替麦考酚酯)均经4至8周的时段舍弃。基于前述实施例中描述的啮齿动物模型工作，在免疫抑制撤除后预期正常的移植物功能，这指示对移植心脏的耐受性。在完全撤除免疫抑制数周后，接受者经历来自也是最大程度地MHC错配的第三方NHP的皮肤移植。大约在同一时间，使用来自胸腺和心脏两者供体以及来自第三方(对照)NHP的细胞对接受者进行MLR测试。这些测试用于证明准确的耐受性而不是简单的功能耐受性：接受者动物应将通过MLR测量的免疫应答组织至第三方供体而不是其胸腺组织和心脏供体。同样，预期对供体心脏的持续耐受性以及对第三方皮肤移植物的排斥。在实验结束时(无免疫抑制或死亡的6个月)，或在具有显著移植物排斥的征象(完全停止活动)的情况下，取得同种异体移植物、天然心脏和来自其他器官(肝脏、肺、脾脏、腰肌)的样品。也收获培养的胸腺组织移植的部位用于分析。进行组织组织学以鉴定细胞或抗体介导的排斥的迹象。通过免疫组织化学评估移植胸腺组织的结构和活力。最后，使用流式细胞术来表征脾脏、淋巴结、骨髓和外周血中的淋巴细胞表型。
在第10周的第3天，此时对冷冻CTT进行活检。在第8至12周中监测移植心脏的搏动。如果心脏停止搏动，则将接受者NHP处死。
在第12周中，对来自供体、接受者和对照NHP的皮肤活检的皮肤移植物进行MLR。如果心脏仍在搏动，则在第12周中由新鲜的接受者皮肤、冷冻保存的接受者皮肤、冷冻保存的供体皮肤以及新鲜和冷冻保存的第三方(对照)皮肤组成皮肤图。
在第4阶段期间，定期监测他克莫司水平。每两周与流式细胞术测量和CBC diff测量交替测量CMV水平。还定期监测ALT、肌酐和DSA。在异位心脏移植后180天终止实验，并且将接受者NHP处死并收获心脏用于病理学。将接受者和供体胸腺发送用于IHC，并且也取得胸部组织并且通过IHC分析。
第5阶段：如果因为幼稚T细胞未>15％而需要继续免疫抑制，则返回至第4阶段(尽管MMF已经舍弃)。继续使用他克莫司，直到幼稚T细胞>15％。如果幼稚T细胞>10％，则返回至第4阶段。如果幼稚T细胞<10％，则返回至第6阶段。在第5阶段期间，每周监测他克莫司水平，并且每两周交替监测CMV水平和CBC diff、肌酐和ALT水平。在对照NHP中每两周监测流式细胞术和CBC diff。
第6阶段：在第1周的第1天将来自接受者的冷冻CTT移植至接受者，以显示胸腺植入物可以在NHP中制得。当将NHP处死时，在接受者冷冻CTT移植物中进行活检。在第6阶段期间，每两周在对照NHP中测量流式细胞术和CBC diff水平。
与前一阶段流式细胞术中一样，每两周与CMC水平、肌酐和ALT水平的确定交替监测DSA和CBC diff水平。
实施例10.评估跨多个年龄范围的培养的人胸腺组织的结构、活力和功能性以定义跨多个年龄范围的人胸腺组织的可培养性。
开发用于扩展人胸腺供体库的合理纳入标准需要确定供体人胸腺组织跨潜在心脏供体的广泛年龄范围的可培养性以及功能和分子特征。
人胸腺的大小在婴儿期稳步增大、稳定并且最终开始退化。尽管有此熟知的年龄相关退化过程，但已经显示，更年长儿童和成人的胸腺可以继续保留可观的T细胞产生能力到第8个十年，Hong R,Moore,AL.1996,“Organ culture for thymus transplantation,”Transplantation,61:444-448；Rice HE,Skinner MA,Mahaffey SM,Oldham KT,Ing RJ,Hale LP等人,2004,“Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome:medical and surgical considerations,”J Pediatr Surg.2004；39:1607-1615。这些实验的基本原理是确定可能提供适于移植的胸腺组织的供体年龄范围。迄今为止植入的人胸腺来自≤9月龄的供体。在该年龄，胸腺几乎完全由在胸腺生成中活跃的皮质和髓质组织构成。然而，因为很少婴儿供体可用，大多数心脏移植接受者接受来自更年长供体的心脏。尽管成人胸腺继续保留可观的T细胞产生能力，但来源于更年长供体的胸腺通常具有较少在胸腺生成中有活性的面积(同上；Taub DD,Longo DL,2009,“Insights into thymic agingand regeneration,”Trends Immunol.30(7):366-373)，并因此在外周血中具有较少数量的新产生的幼稚T细胞。Hong R,Moore,AL.,1996,“Organ culture for thymustransplantation,”Transplantation,61:444-448；Rice HE等人,2004,J PediatrSurg.2004；39:1607-1615；Taub DD,Longo DL,2009,Trends Immunol.30(7):366-373。因此，这些研究对于确定胸腺保留适当功能特征以便在培养然后共同移植至心脏同种异体移植接受者内是安全且有效的供体年龄范围是必需的。
方法
在知情同意后，前瞻性地从跨以下三个不同年龄组的心脏手术患者收集胸腺组织：9个月至9岁；10岁至25岁；和26岁至49岁，总共30个样品。作为此项目初步研究的一部分，开发了用于对脂肪组织进行切片的新型定制器械。使用Stadie-Riggs切片机对来自较年长胸腺的脂肪组织进行传统切片未产生可通过免疫组织化学评估的切片。因此，对于脂肪胸腺，将单刃剃须刀片(大约10个)绑在一起并进行灭菌。刀片之间的距离为大约1mm。将大约1cm x 1cm x 1cm的胸腺组织块放入无菌组织培养皿的底部中。将绑定的剃须刀片压入胸腺组织中。从剃须刀片之间移除单独切片并用于染色。如前述实施例中所述进行人胸腺组织的切片和持续21天的培养。将来自第1、5、12和21天的组织切片和用过培养基冷冻以供进一步分析。也将来自第0天和第21天的组织切片处理成福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)的块，以促进如下所述的免疫组织学研究。
分析以来自第0天和第21天的FFPE块开始，使用苏木精和伊红(H&E)染色切片以及针对细胞角蛋白(AE1/AE3混合物)、细胞角蛋白(CK)14、增殖(Ki-67)、T细胞含量(CD3)和趋化因子(CCL21)产生的免疫组织化学。在第0天可接受的供体胸腺的组织学特征包括有组织的胸腺上皮(TE)网络、表达CK14(作为再增殖潜力的标志物)的TE细胞的存在、未成熟胸腺细胞和哈索尔小体(作为取得时胸腺生成的标志物)的存在以及>90％的完整核(作为组织活力的指标)。培养的胸腺切片应类似地展示出胸腺上皮细胞活力、TE结构的维持、活的胸腺细胞的显著耗尽以及功能上重要的生物分子的产生，包括CCL21(负责将未成熟胸腺细胞前体引诱至胸腺的趋化因子)的高产生。经由FFPE切片的IHC以及用过培养基的酶免疫测定评估胸腺切片的CCL21产生(图37)。
因为使用的胸腺组织可能表现出不同程度的年龄相关萎缩，所以确定基线胸腺功能是必不可少的。如先前所述，基线胸腺功能通过来自第0天的扫描组织切片的图像分析来确定(Hale LP,Markert ML,2004.“Corticosteroids regulate epithelial celldifferentiation and Hassall body formation in the human thymus,”JImmunol.2004；172:617-624)。此外，使用供体外周血确定幼稚T细胞的胸腺输出。将外周血单核细胞纯化并保存；通过10色流式细胞术使用以下标志物确定T细胞表型：活力、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16+CD56、CD45RA、CD57和CD197。外周血T细胞中存在的信号结合T细胞受体重排切除环(sjTREC)被定量为胸腺来源的标志物(Lee EN,Park JK,Lee J-R,Oh S-O,Baek S-Y,Kim B-S等人,2011,“Characterization of the expression of cytokeratins5,8,and 14 in mouse thymic epithelial cells during 2011；44:14-24.thymusregeneration following acute thymic involution,”Anat Cell Biol.)。
实施例11.培养的人胸腺的组织病理学评估
进行这些实验以评估和描述当根据用于植入组织的方案培养时在人胸腺切片中发生的组织病理学变化。了解这些变化可能导致组织病理学标准的开发和验证，以基于在先前接受者中成功产生免疫重建的组织特征在植入前对培养的胸腺切片的质量进行前瞻性评估Markert ML,Devlin BH,McCarthy EA.,2010,“Thymus transplantation,”ClinImmunol.2010；135:236-246。总之，这些结果可以用于开发基于可经由苏木精和伊红染色和细胞角蛋白免疫组织化学鉴定的组织结构特征的诊断标准，所述诊断标准可以潜在地用来评价用于植入的切片的质量。
材料和方法
胸腺组织从<9月龄的有免疫能力的婴儿供体获得，所述婴儿供体正在经历心脏矫正手术，其中常规地需要移除一部分胸腺以促进心脏修复。每名供体的父母都提供了书面知情同意书，以允许移除和以其他方式将被丢弃的任何胸腺组织用于植入或研究。这些研究得到了杜克大学医学中心机构审查委员会(Institutional Review Board of DukeUniversity Medical Center)的批准。将供体胸腺在符合良好生产工艺(GMP)的细胞生产实验室中切片并且培养至多21天，然后放行至手术室以手术植入至接受者的肌肉。供体资格、培养和手术植入过程的细节已在其他地方得到描述Markert ML,Sarzotti M,OzakiDA,Sempowski GD,Rhein ME,Hale LP等人,2003,“Thymic transplantation in completeDiGeorge syndrome:Immunologic and safety evaluation in twelve patients,”Blood,102:1121-1130；Markert ML,Alexieff MJ,Li J,Sarzotti M,Ozaki DA,Devlin BH等人,2004,“Postnatal thymus transplantation with immunosuppression astreatment for DiGeorge syndrome,”Blood,104:2574-2581；Markert ML,Devlin BH,Alexieff MJ,Li J,McCarthy EA,Gupton SE等人,2007,“Review of 54patients withcomplete DiGeorge anomaly enrolled in protocols for thymus transplantation:Outcome of 44 consecutive transplants,”Blood,109:4539-4547；Hong R等人,1996；Rice HE,eSkinner MA,Mahaffey SM,Oldham KT,Ing RJ,Hale LP等人,2004,“Thymictransplantation for complete DiGeorge syndrome:medical and surgicalconsiderations,”J Pediatr Surg.,39:1607-1615。在培养过程中的特定时间点，将来自每个供体胸腺的一个或多个切片固定在10％中性缓冲福尔马林中，然后处理并嵌入至福尔马林固定的石蜡包埋块中以进行组织病理学评价。针对每个组织块获得苏木精和伊红(H&E)染色切片和免疫组织化学面板。使用的抗体包括泛细胞角蛋白(克隆AE1/AE3；Leica)、细胞角蛋白(CK)14(克隆LL02；Leica)、CD3(克隆LN10；Leica)和Ki-67(克隆MIB-1；Dako)。使用标准免疫过氧化物酶方法和3,3'-二氨基联苯胺(棕色)底物以及苏木精复染进行自动免疫组织化学。为了评估胸腺样品内随培养时间的变异性，通常在以下范围内的≥3个时间点对批次进行组织学检查：第0天(接收日)、第5-9天和第12-21天。
结果和讨论
随着胸腺器官培养从第0天进行至第21天，切片产生渐增的坏死量、渐增的胸腺上皮凝缩和渐减的残余T细胞数量。在整个21天的培养中，胸腺上皮网络的结构保持为基本上完好保存，具有细胞角蛋白14(具有长期器官再增殖潜力的胸腺上皮细胞的推定生物标志物)的焦点表达。来源于相同供体胸腺的所有器官切片彼此高度相似，在大小、形状和皮质与髓质的相对含量方面存在微小差异。类似地，来自不同供体的切片在相同培养时间点检查时显示出相似的组织病理学特征。
对作为胸腺的组织的初始鉴定
胸腺具有薄的结缔组织被膜，其通常在实验室处理过程中被去除。然而，在胸腺切片中仍可以观察到被膜(小梁)和相关血管、纤维组织、脂肪组织和可变数量的成熟造血细胞的延伸部。小梁将胸腺组织分成小叶，小叶由胸腺上皮细胞的显现为花边状的三维网络构成，所述三维网络具有含有发育中T细胞的中间空间(胸腺细胞)。小叶通常展示出外皮质和内髓质，它们的组织学外观以及它们所含细胞的表型和功能有所相同。由于密集堆积的未成熟胸腺细胞，胸腺皮质非常嗜碱性(蓝色)，从而被苏木精染色得很深。胸腺髓质中存在的更成熟胸腺细胞的密度低于皮质中的密度，因此髓质往往显现为更加嗜酸性(粉红色)。胸腺髓质还含有称为哈索尔小体的含有示病性嗜酸性细胞角蛋白的结构。胸腺内存在的巨噬细胞可以形成“可染小体”，其在深色染色胸腺细胞的背景下显现为浅色圆形区域(“满天星”图案)。大量可染小体是应激性退化的特征，所述应激性退化可能由于严重心脏缺陷、手术和/或皮质类固醇治疗的应激而发生在正常胸腺供体中，并且不会使胸腺失去植入的资格。培养前(第0天)切片的正常胸腺的典型组织学特征示出于图40A-D中。
哈索尔小体的评估
胸腺髓质含有称为哈索尔小体的特征结构，其由与单克隆抗体反应的终末分化胸腺上皮细胞构成，所述单克隆抗体也与上皮的终末分化上层反应。Hale LP等人,2004；172:617-624。
哈索尔小体可以充当组织身份的标志物，因为它们仅在胸腺中发现。它们也可以反映输入供体组织的质量，因为终末分化过程通常由胸腺细胞-胸腺上皮细胞相互作用触发。同上。哈索尔小体通常很容易通过其在H&E染色的载玻片上作为上皮细胞的嗜酸性螺环的外观鉴定出(图41A-D)。最中心的层通常缺乏核。可变数量的细胞碎片也可能存在于哈索尔小体的中心。哈索尔小体被泛细胞角蛋白AE1/AE3抗体非常强烈地染色，如果在苏木精和伊红(H&E)染色载玻片中未明确鉴定出，则这可以用作这些结构身份的二次确认。
培养过程中的一般胸腺细胞变化
随着胸腺组织的培养，胸腺细胞逐渐丧失，所述丧失是由于在培养基更换过程中冲洗掉或者由于胸腺细胞死亡然后在组织内降解(图42-图45)。然而，与体内发生的不同，由于无法募集吞噬细胞来清除死亡细胞，所述死亡细胞可能在培养的胸腺中长期存在。经历细胞死亡的胸腺细胞核可能显示出固缩(染色质凝缩)和核碎裂(核碎裂)，但通常，由于这些细胞耗尽其能量但未被吞噬，它们显示出参差不齐的核边缘，伴有核膜完整性的丧失。核溶解(核在坏死细胞中的完全溶解)通常在体内2-3天内发生，但在胸腺培养过程中显现为更缓慢地发生。在培养5-9天后，大多数胸腺细胞保留了核，但核膜不完整，这指示出早期坏死(图43)。这些改变的核特征有利于即使在保留核时区分活的胸腺细胞和非活的胸腺细胞。还可以看到嗜酸性坏死细胞碎片的大焦点，其中胸腺细胞核已经经历核溶解(图43A)。
细胞完整性和组织结构的组织学评估
当要植入培养的胸腺组织时，能够准确区分具有广泛胸腺细胞坏死但胸腺上皮细胞旺盛的切片(用于植入的最佳组织)与具有相似的坏死量、胸腺上皮细胞也受损的切片是至关重要的。虽然不能直接评估活力，但H&E载玻片的组织学检查可以评估正常结构的保存程度以及细胞死亡指标的存在或不存在。如上所述，预期胸腺细胞在培养过程中被耗尽。在每日更换培养基过程中，许多胸腺细胞被从切片中被洗出。许多其他胸腺细胞将原位死亡，其中它们的核和细胞体可能在延长的时间段内保留。然而，死胸腺细胞的膜完整性受损，并且它们的核表现出“参差不齐”的边缘。胸腺细胞碎片可能团聚在一起，从而无法辨别单独细胞边界。胸腺细胞死亡和耗尽是培养的预期且理想的结果，并且完整胸腺细胞核的相对缺乏潜在地反映切片质量。
随着胸腺细胞从组织中耗尽，胸腺上皮细胞更容易可视化。活的胸腺上皮细胞的核通常呈椭圆形，大于胸腺细胞的核，并且具有由苏木精染色勾勒的清晰界定的核膜以及一个或多个核仁。这些胸腺上皮核通常看起来是“开放的”，这意味着其不会被苏木精染色成深色。这符合它们是活的且具有代谢活性的解释，因为活性染色质(“常染色质”)不结合苏木精染料。在许多胸腺上皮细胞中作为核糖体合成的位点的核仁的存在进一步确认了它们在固定时是活的并具有代谢活性。显现为完整且活的胸腺上皮细胞的实例示出于图46A-B中。
在第0-21天的任何给定时间点对多个胸腺切片的仔细显微镜检查显示，来自于相同供体胸腺的所有切片彼此高度相似。随培养时间变化在来自相同胸腺的不同切片之间观察到的差异主要与坏死量(随着培养时间的增加而增加)和残余胸腺细胞的数量(随着培养时间的增加而减少)相关。当在相同时间点检查时，来自不同供体的切片在质量上也相似。不同供体组织之间的差异包括相对大小、形状、胸腺相对于髓质的相对含量(但两者始终存在于检查的每个切片上)、坏死量、胸腺上皮的凝缩和残留T细胞的数量。组织学外观的大多数变化到培养的第5天已经发生，随着培养的进行，通常只有胸腺细胞的另外耗尽。
胸腺相对于髓质的胸腺上皮结构的评估
含有抗细胞角蛋白抗体AE1和AE3(AE1/AE3)的混合物检测基本上所有的胸腺上皮细胞。相比之下，与CK14反应的抗体检测存在于被膜下皮质中并且似乎散布在整个皮质和髓质的其余部分中的胸腺上皮细胞子集。已经表明这些CK14+细胞中的一些具有分化为皮质上皮细胞和髓质上皮细胞两者的潜力(Lee EN,Park JK,Lee J-R,Oh S-O,Baek S-Y,KimB-S等人,2011,“Characterization of the expression of cytokeratins 5,8,and 14in mouse thymic epithelial cells during thymus regeneration following acutethymic involution,”Anat Cell Biol.44:14-24)，并且因此表示长期再增殖细胞。随着胸腺细胞从组织中耗尽，胸腺上皮细胞变得更加可见。三维胸腺上皮网络通常经由连接的上皮细胞和/或看似散布的胸腺上皮细胞(其连接在所检查的切片中不明显)的浅色和花边状排列在切片中展示出。随着胸腺细胞在培养过程中的丧失，三维胸腺上皮网络不同程度地收缩。这可能导致残余的上皮凝缩，使得被膜下皮质上皮层变厚并且髓质胸腺上皮细胞变得更紧密地堆积。对于在第0天(接收日)、第7、9、12和20天检查的单一胸腺批次，这些变化的实例示出于图40和图42-45中。尽管有许多胸腺细胞的丧失和含有坏死碎片的潜在大区域，但胸腺上皮细胞网络的总体结构到培养的至少21天保持为基本上完好保存(图47A-E)。
残余T细胞的评估
如上所述，旨在用于植入的供体胸腺组织的培养的主要目的是部分耗尽T细胞以促进植入切片定植有接受者胸腺细胞前体并降低移植物抗宿主病的风险。未成熟T细胞(胸腺细胞)和成熟T细胞可以在组织切片中通过其形态以及通过检测由这些细胞类型特异性表达的蛋白质的免疫组织化学染色来鉴定。CD3是针对抗原的T细胞受体的组分，存在于>95％的皮质和髓质胸腺细胞上以及所有成熟T细胞上。在第0天，皮质和髓质中基本上所有未成熟T细胞的质膜显现为以膜模式与CD3抗体强烈反应(图48A-B)。随着培养的继续，活的胸腺细胞/T细胞继续以膜模式与CD3抗体反应。然而，CD3抗体也与死的胸腺细胞(包括在死胸腺细胞经历核溶解之后残留的无核碎片)起强烈反应(图48D、图48G和图48I-K)。如此多的胸腺细胞碎片保持当在低放大倍数下观察时切片仍可以显现为强烈且均匀的棕色(图48C、图48F、图48H、图48J)，但在较高倍率(例如40X物镜)下检查载玻片确认在这些时间点存在相对较少的完整的潜在活的胸腺细胞。非活的细胞和细胞碎片在植入后将被接受者吞噬细胞清除，且因此不会带来移植物抗宿主病的风险。通常不可能准确鉴定组织区域中的CD3+膜免疫反应性，在所述组织区域中，相当大量的强染色碎片妨碍对相邻细胞的细胞膜的评估。然而，即使在培养过程中的后面时间点，CD3免疫组织化学通常突出显示至少一些具有完整质膜的胸腺细胞/T细胞，这表明它们可能仍是活的(图48E、图48G、图48I-K)。
细胞增殖的评估
Ki-67抗原在所有正在增殖的细胞的核中(即，不在细胞周期的G0期中)表达。在第0天，胸腺皮质内存在的大多数未成熟胸腺细胞正在增殖，并且它们的核与对Ki-67增殖抗原具有特异性的抗体强烈反应。相比之下，只有少见的更成熟的髓质胸腺细胞和/或上皮或基质细胞与此抗体反应(图49A-B)。在培养的第1-2天后观察到的免疫反应性的模式是散布的少见阳性细胞的，几乎所有所述细胞都具有胸腺上皮细胞特征性的较大核(图49C-K)。因此，Ki-67染色可能是用于证明切片内胸腺上皮细胞的活力的一种有用辅助染色。
讨论
这些实验描述了当将出生后人胸腺培养至多21天时发生的组织病理学变化，并且证明使用H&E和细胞角蛋白免疫反应性进行的组织病理学检查可用于评估旨在用于植入的培养的胸腺切片的质量。随着胸腺培养的进行，切片产生渐增的坏死量、渐增的胸腺上皮凝缩和渐减的残余T细胞数量。在整个21天的培养中，胸腺上皮网络的结构保持完整，具有细胞角蛋白14(具有长期器官再增殖潜力的胸腺上皮细胞的推定生物标志物)的继续表达。来自相同胸腺的切片在质量上相似，使得单一切片可以充分代表整个胸腺。在任何给定时间点，来源于不同供体的培养的胸腺切片的组织学外观的变异性也极小。在培养过程中早期(例如，第5-9天)观察到的组织组织学密切反映了在培养后期(例如，第12-21天)观察到的组织组织学，但是在后面时间点观察到更多的胸腺细胞耗尽和坏死。
识别CK14或所有类型的细胞角蛋白(AE1/AE3)的抗体的免疫组织化学可用于评价培养的胸腺切片。细胞角蛋白中间丝是所有上皮细胞的细胞骨架的重要组分。泛细胞角蛋白AE1/AE3染色展示出检查的胸腺切片内的上皮网络，其在后面的时间点使用单独的H&E染色可能不容易辨别。已经显示由特定胸腺上皮细胞表达的细胞角蛋白的具体类型取决于其发育和分化阶段以及功能状态。在小鼠中，与CK5、CK8和CK14反应的抗体已经最常用于鉴定胸腺上皮细胞亚型(Lee EN等人,2011,Anat Cell Biol.,44:14-24)。基于先前研究在本研究中确定了CK14的表达，在所述先前研究中假设CK14表达是具有向皮质或髓质谱系分化的潜力的胸腺上皮细胞特征性的，Li B,Li J,Devlin BH,Markert ML.,2011,“Thymicmicroenvironment reconstitution after postnatal human thymustransplantation,”Clin Immunol.140:244-259。虽然长期免疫重建的临床结果(MarkertML等人,Blood,109:4539-4547)表明胸腺上皮祖细胞可能存在于植入的胸腺切片中，但此类祖细胞的精确表型尚未在人类中明确鉴定。小鼠中的胸腺上皮祖细胞的表型仍是有争议的(Bennett AR,Farley A,Blair NF,Gordon J,Sharp L,Blackburn CC.,2002,“Identification and characterization of thymic epithelial progenitor cells,”Immunity 16:803–814；Wong K,Lister NL,Barsanti M,Lim JMC,Hammett MV,Khong DM等人,2014,“Multilineage potential and self-renewal define an epithelialprogenitor cell population in the adult thymus,”Cell Rep.8:1198-1209；Ucar A,Ucar O,Klug P,Matt S,Brunk F,Hofmann TG等人,2014,“Adult thymus contains FoxN1(-)epithelial stem cells that are bipotent for medullary and cortical thymicepithelial lineages,”Immunity,41:257-269；Ulyanchenko S,O'Neill KE,Medley T,Farley AM,Vaidya HJ,Cook AM,2016,“Identification of a bipotent epithelialprogenitor population in the adult thymus,”Cell Rep.,14:2819-2832)，并且使用多种抗体和多色流式细胞术仅已经检测到低数量。因此，目前在人组织切片中直接检测胸腺上皮祖细胞是不可行的。
这些实验鉴定了在培养第12-21天(可以植入组织的时间点)胸腺切片内残留的大量坏死细胞物质。植入后数月的活检检查未显示出此坏死物质的迹象(Markert ML等人,2008,180:6354-6364)。虽然不希望受任何特定理论的束缚，但申请人提出，在植入时此坏死碎片及其下面的细胞外基质的初始存在可用于保存切片的功能结构，包括用于发育胸腺细胞的皮质和髓质生态位。保存细胞外基质以再产生可以支持上皮细胞和造血前体两者的细胞分化的鼠类胸腺“类器官”的胸腺去细胞化方法的最近使用(Hun M,Barsanti M,WongK,Ramshaw J,Werkmeister J,Chidgey AP,2017,“Native thymic extracellular matriximproves in vivo thymic organoid T cell output,and drives in vitro thymicepithelial cell differentiation,”Biomaterials,118:1-15)支持此假设。
先前研究证明，在所使用的培养条件下胸腺上皮细胞的生长潜力得以稳健保持，使得可以由在器官培养开始后至多12周的切片建立细胞角蛋白阳性上皮单层(Markert ML等人,1997,Clinical Immunol Immunopathol.,82:26-36)。此实施例中描述的实验没有直接评估上皮细胞活力，而是使用完整核的存在作为替代标志物。
对于以下涉及培养的胸腺组织的生物标志物的实施例，遵循以下程序。
实施例12：人胸腺组织的来源。
胸腺组织从有免疫能力的人供体获得，所述人供体正在经历医学上需要的手术，其中需要移除一部分胸腺以促进手术区的暴露。没有特别地出于本研究的目的获得组织。所研究的大部分组织是作为原本将丢弃的组织从婴儿、小儿和成人供体匿名获得的，仅保留年龄、性别和手术指征。此使用由杜克大学医学中心机构审查委员会(IRB)确定为不构成人受试者研究并且免于IRB审查。然而，由一些婴儿的父母提供了书面知情同意书，以允许移除和以其他方式将被丢弃的任何胸腺组织潜在地用于植入研究。这些知情同意的组织被编码，因此研究小组无法获取除年龄和性别以外的识别信息。知情同意的丢弃组织的此使用得到了杜克大学医学中心IRB(Pro00103028)的批准。
胸腺处理和培养
将每个胸腺的代表性部分固定在10％中性缓冲福尔马林中，然后处理并且嵌入至石蜡块(FFPE)中以进行组织病理学评价。针对每个组织块获得苏木精和伊红(H&E)染色切片和免疫组织化学面板。潜在使用的抗体识别泛细胞角蛋白(克隆AE1/AE3；Leica)、细胞角蛋白(CK)14(克隆LL02；Leica)、CD3(克隆LN10；Leica)、Ki-67(克隆MIB-1；Dako)、CD1a(克隆；供应商)和CCL21(克隆；供应商)。使用标准免疫过氧化物酶方法和3,3'-二氨基联苯胺(棕色)底物以及苏木精复染进行自动或手段免疫组织化学。
对于来自<9月龄的婴儿供体的一些样本，将胸腺组织切片为约0.5mm厚并且培养至多21天，如在其他地方详细描述的(Hong和Moore 1996)(Markert等人，2003)。简而言之，将胸腺切片放置在由可吸收明胶海绵筏支撑的滤膜上，并且在Ham F12培养基+10％胎牛血清中的培养基/空气界面处培养至多21天。每日(24±4小时)替换培养基，并在每个组织切片上分配新鲜材料。将从单独切片收集或从来自给定供体胸腺的所有切片(每片2.5ml)合并的用过/条件培养基的等分试样在-20℃下冷冻直到分析。在通常在以下范围内的≥3个时间点将培养的胸腺切片的代表性切片在10％中性缓冲福尔马林中固定，并且处理至石蜡块中：第0天(接收日，切片但未培养)、第5-9天和第12-21天。
多重抗体微阵列和酶免疫测定
根据制造商的方案，使用多重抗体微阵列(RayBiotech)确定在第1-21天从三个独立的胸腺培养物中获得的条件培养基等分试样中存在的200种分析物的水平。对至少一个胸腺(n＝127)具有至少两个测量值高于检测下限的分析物进行自然对数(ln)变换，并且进行曲线下面积和回归分析(图56)。
鉴定分析物以用于进一步研究的选择标准包括持续增加的最初低的水平(胸腺上皮(TE)来源的生物标志物的假设特征)或持续降低的最初高的水平(胸腺细胞来源的生物标志物的假设特征)、在分析的所有三种胸腺培养物中类似的表达模式以及分析物与假设的来源细胞和/或胸腺生物学的功能相关性的发表证据。优先考虑那些高度表达(如由曲线下面积所指示的)和在针对假发现率进行或未进行校正的情况下具有在统计学上显著(p≤0.05)的变化的分析物。通过如上所述的抗体微阵列或基于LuminexTM珠的免疫测定(R&DSystems)对条件培养基中L-选择素的水平进行定量，对于每个样品，其定量下限(LLOQ)为3952pg/mL并且定量上限为4,656,306pg/mL，考虑了稀释因子。基于使用S形最佳拟合值和对数标度(r2＝0.9986)的标准曲线，使用DuoSet人CCL21 ELISA试剂盒(R&D Systems)确定CCL21分泌(pg/mL)。
多重基因表达测定
根据制造商的说明书，使用QuantiGene Plex测定(Thermo-Fisher)在来源于人胸腺组织的FFPE块上测量多重基因表达。简而言之，从10μm厚的FFPE切片中宏观解剖6-8mm3胸腺组织，将其放入测定管中，并且裂解以释放靶RNA。将荧光LuminexTM珠与捕获扩展分子、标记扩展分子、阻断探针和组织裂解物一起孵育，以将特定mRNA捕获至具有确定荧光谱的珠。使用分枝DNA技术来放大与每种结合的mRNA之后与链霉亲和素-藻红蛋白杂交相关联的信号。使用Bio-Plex 200仪器(Bio-Rad)测量每个珠的荧光及其相关的藻红蛋白信号。将每种目标分析物的背景校正荧光信号针对每个胸腺样品的GAPDH信号归一化，然后如下所述基于组织组成进一步归一化。
组织形态测量学
使用Leica SCN载玻片扫描仪(Leica Microsystems)以40X放大倍数对H&E、泛细胞角蛋白(CK)(AE1/AE3)和CD1a免疫组织化学载玻片进行数字扫描，并且由病理学家(LPH)使用虚拟显微镜(ImageScope软件；Leica Biosystems)检查。如先前所述(Ito等人，2017)，如由H&E染色限定的载玻片上胸腺组织的总面积(“总面积”)、含有胸腺上皮的区域(“TE面积”，如由CK免疫组织化学限定)以及含有未成熟胸腺细胞的区域(“皮质面积”，如由CD1a免疫组织化学限定)通过使用由ImageScope软件提供的“笔形工具”勾勒它们来确定(图57A至57C)。将针对每个组织鉴定的单独面积(μm2)导入至Microsoft Excel中进行求和，然后四舍五入至最接近的mm2用于数据呈现。为了针对每个载玻片上胸腺组织量的差异进行调整，将TE和皮质面积通过除以检查的胸腺组织的总面积转换为总面积的％。将发育中胸腺细胞的组织含量定义为皮质面积％，即含有CD1a+未成熟胸腺细胞的组织百分比。
统计分析
200种分析物中共有127种对至少一个胸腺具有在至少两天高于测定检测限的测量值。总计，在来自1个胸腺的培养基中测量出14种分析物，在来自2个胸腺的培养基中测量出17种分析物，并且在来自3个胸腺的培养基中测量出96种分析物。将单独的分层线性回归模型针对每种分析物进行拟合，从而用由胸腺聚集的应答按天预测ln(pg/mL)。报告了来自每个模型的斜率参数(反映了ln(ng/mL)的平均变化/天)以及指数斜率(反映了平均每日乘法变化(pg/mL))。使用Benjamini-Hochberg程序报告了针对假发现率进行和不进行调整的P值。还报告了模型结果以及每种分析物的梯形曲线下面积(AUC)的估计值，所述估计值基于21天培养期内的ln(pg/mL)计算。
由于QuantiGene表达分析是对跨广泛范围的年龄的整个胸腺组织进行的，因此所研究的组织中含有胸腺上皮和/或在胸腺生成中具有活性的百分比是变化的。为了解决此问题，将初始QuantiGene结果另外针对如通过形态测量法确定的具有胸腺上皮细胞的面积百分比或具有活性皮质的面积百分比归一化。
结果
由培养的人胸腺产生的可溶性分子
将在培养的第1-21天从来自不同供体的三种连续胸腺培养物中获得的条件培养基样品经由多重抗体微阵列针对200种分子进行筛选。将对至少一个胸腺具有至少两个测量值高于检测下限的127种分析物通过曲线下面积和回归分析进一步分析(图56)。42种分析物显示随着培养的进行向培养基中的释放显著增加(n＝15)或减少(n＝27)，如由未校正的p值<0.05所指示的(图56)。这些分析物中的五种(L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine和半乳凝素-7)在所有三种胸腺培养物中显示出相似的表达模式，并且当应用了假检率(FDR)校正时针对与培养时间的相干性继续具有p<0.05(图56)。
半乳凝素-7、M-CSF和L-选择素的水平随时间降低，从而满足可能胸腺细胞产生可溶性分子的预先指定标准(图50A、50B和50C)。
尽管据报道半乳凝素-7(由LGAGS7基因编码)由存在于哈索尔小体中的终末分化TE细胞表达(Kuwabara等人，2002)，但其在培养基中的水平随着培养而降低，如对于胸腺细胞的生物标志物所预期的。由于半乳凝素-7是在多种细胞类型中触发细胞凋亡的p53诱导的蛋白质(Biron-Pain等人，2013)，因此它也可能与培养过程中的胸腺细胞丧失相关，但不太可能对胸腺细胞具有特异性。同样，已经显示M-CSF由TE细胞产生(Le等人，1988)，并且其也可能由胸腺内存在的多种其他细胞类型产生。相比之下，L-选择素的表达限于造血细胞，并且熟知其在胸腺细胞上表达。虽然本身不分泌，但L-选择素是在白细胞粘附和迁移过程中持续脱落的(Hafezi-Moghadam等人，2001；Ivetic等人，2019)，然后迅速重新表达(Fitzhugh等人，2008)的I型跨膜糖蛋白。因此，选择条件培养基中的可溶性L-选择素作为可能潜在地与胸腺培养物中存在的活的胸腺细胞数量相关的可溶性生物标志物进行进一步验证。
分泌至培养基中的CCL21、CXCL16和CXCL12的水平随着时间增加，从而满足可能TE产生可溶性分子的预先指定标准(图50D、50E和50F)。先前已经显示所有这三种趋化因子在TE细胞中表达(Bunting等人，2011；Liu等人，2005)。还已经显示CCL21由于其对早期胸腺细胞祖细胞和胸腺细胞两者的趋化作用而在胸腺中在功能上是重要的(Hu等人，2015；Kozai等人，2017)。因此，我们选择作为可以反映培养的胸腺切片内胸腺上皮的含量和功能的潜在生物标志物进一步验证CCL21。
L-选择素的条件培养基水平在人胸腺器官培养过程中降低并且与活的胸腺细胞相关联。
通过以下方式来鉴定L-选择向器官培养基中的释放模式：使用抗体微阵列和基于cc珠的多重免疫测定确定来自先前分析的一种(MFG-026)和三种另外的胸腺器官培养物的条件培养基中存在的可溶性L-选择素的水平随培养时间的变化。如由初始筛选阵列所表明的，条件培养基中L-选择素的水平最初通常非常高(例如第1天)，但到第5天迅速下降低至在21天培养期的剩余时间内保持的低水平(图51A、51B)。L-选择素水平的这些变化与培养过程中发生的在活的胸腺细胞中观察到的变化相似。用抗CD3抗体鉴定作为T谱系的细胞和用抗Ki-67抗体鉴定增殖细胞的免疫组织化学展示出在培养早期胸腺细胞活力的迅速丧失(图52)。在第0天，皮质和髓质中基本上所有未成熟T细胞的质膜显现为以膜模式与抗CD3强烈反应(图52B)。在培养数天后，大部分棕色是由于在死胸腺细胞经历核溶解/核的溶解但其碎片残留在组织切片中的之后残留的无核但仍具有免疫反应性的碎片(图52E)。然而，即使在培养约3周后，可以潜在地通过CD3免疫组织化学鉴定出显现为具有完整质膜的少见胸腺细胞/T细胞[未示出；(Hale 2020)(Markert等人，1997a)。类似地，使用对Ki-67增殖标志物具有特异性的抗体的免疫组织化学在第0天显示出与皮质胸腺细胞的丰富反应性(图52C)，这与皮质中发生的显著增殖/克隆扩增一致。然而，在器官培养过程中发生的胸腺细胞死亡导致在培养过程中的后期时间点仅与在形态学上与TE细胞一致的较大细胞产生Ki-67免疫反应性(图52F)。
CCL21分泌在器官培养过程中增加
通过使用酶免疫测定对另外的胸腺器官培养物中的CCL21进行定量来验证通过筛选微阵列(图50E)鉴定的CCL21随时间向器官培养基中的释放增加的模式。将胸腺样本如图53B中所示连续切片，然后培养至多21天，其中对每日从来自每个胸腺样品的所有切片或从根据预先指定的取样计划的单独切片合并的用过培养基进行分析。用过培养基的每日合并样品的CCL21含量显示出随培养时间增加至稳态水平的模式，所述稳态水平相比于基线显著增加(图53A；n＝8种培养物)。单独切片的分泌在数量上变化，但总体分泌模式对于来源于给定胸腺的所有切片是相似的，其中最初低的CCL21分泌随着培养的继续增加至持续高得多的水平(图53C)。
CCL21主要由人胸腺切片中的TE细胞产生
接下来，使来自新鲜和培养的人胸腺组织的FFPE切片与CCL21特异性抗体反应以确定造成随着培养进行观察到的此趋化因子分泌增加的细胞类型。新鲜切片的未培养胸腺中的TE细胞(第0天)显示出与CCL21抗体的中等反应性，其模式在髓质区域中最强(图54A、54B)，但也包括散布在皮质中的TE细胞。在培养的胸腺中看到类似的反应模式，其中对髓质区域中的TE细胞以及在皮质区域中散布的TE细胞中具有中度至强烈的免疫反应性(图54C、54D)。
跨生命周期确定胸腺基因表达
为了确定来自T细胞耗尽的培养的人婴儿胸腺的这些结果与衰老人胸腺的变化如何相关，使用QuantiGene多重基因表达测定研究了跨生命周期来源于47名供体的FFPE胸腺组织。所研究的队列包括19名5日龄至70岁的男性、27名5日龄至78岁的女性以及一个来自29岁供体(其性别未记录)的样本。这些样本的年龄和性别分布如图59A中所示。
当与18岁以上的供体相比(n＝XX；p＝0.yy)时，从≤18岁的供体(n＝XX)获得的胸腺组织显示出相对于GAPDH更高的编码T细胞标志物CD3ε和皮质胸腺细胞标志物CD1a(图55A、55B)的mRNA表达，这与通过CD1a免疫组织化学在年轻组织中观察到的活跃胸腺生成中所涉及的皮质面积增加一致(图59C)。与更年长成人相比(p＝0.zz)，在≤18岁的供体中含有胸腺上皮的胸腺组织切片的百分比也更高。然而，与更年长成人相比，在≤18岁的供体中编码细胞角蛋白8(KRT8)和14(KRT14)的mRNA相对于GAPDH减少(图55C、55D)，鉴于在更年轻供体中含有胸腺上皮的面积百分比更高，这一观察结果是出乎意料的(图59B)。
为了解决此问题，还另外将基因表达结果基于其如通过泛细胞角蛋白免疫组织化学所指示的含有胸腺上皮的面积百分比和其如通过CD1a免疫组织化学所指示的具有活跃胸腺生成的皮质面积百分比进行归一化(图59)。如图55中所示，这两种归一化方法基本上消除了在未经调整的数据中看到的异常值，并且产生非常相似的比率。有趣的是，在两种归一化方法之后，与来自更年长成人的胸腺相比，来自≤18岁的供体的胸腺组织继续表达更多的CD3E和CD1A mRNA和更少的KRT8和KRT14 mRNA。
CCL21和CXCL12的整个胸腺表达随着胸腺细胞因衰老减少而增加
未经调整的CCL21基因表达在来自≤18岁的供体的胸腺中相对于GAPDH始终较低(图6E)。相比之下，未经调整的CCL21表达在更年长成人组中更高且变化更大，具有许多异常值。基于TE的归一化。
CCL21和CXCL12的整个胸腺表达随着胸腺细胞因衰老减少而增加。
未经调整的CCL21基因表达在来自≤18岁的供体的胸腺中相对于GAPDH始终较低(图55E)。相比之下，未经调整的CCL21表达在更年长成人组中更高且变化更大，具有许多异常值。基于TE面积或皮质面积的归一化消除了异常值，并且导致两个供体年龄组之间的分离增加(图55E)。对于趋化因子CXCL12看到类似的结果(图55F)。
实施例13
研究胸腺内变异性以确定来自胸腺的一部分的组织学测试结果是否可以被认为代表同一胸腺的任何其他部分的组织学测试结果。此测试的结果用于确定在常规放行测试和过程验证测试过程中应测试多少个样品。
建立了组织学接受标准，如先前所述，包括以下方面的评估：在第5-9天对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域散布在整个组织中；鉴定出至少1个哈索尔小体；CK14染色散布在整个组织中；以及观察到完整核。
对于此研究，以定向方式将三个胸腺切片，并且跟踪每个胸腺内的切片的位置。将切片在6孔板中培养，以允许追踪每个切片。如图62A所示进行切片。
对于研究中的每个胸腺，切片专用于在以下每个时间点进行分析：基线(第0天)、第5天、第9天、第12天和第21天。
针对每个胸腺在每个时间点培养5-11个切片。根据上述方法培养切片，每日更换培养基。将切片提交用于在病理实验室中进行H&E染色，并且分析其身份、效力和活力。此研究中的所有切片均满足如上指定的组织学测试的放行接受标准，即：在第5-9天对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域散布在整个组织中；鉴定出至少1个哈索尔小体；CK14染色散布在整个组织中；以及观察到完整核。
除了评估每个切片是否满足放行接受标准外，病理学家还对每个H&E和AE1/AE3载玻片进行了更详细的综述。培养的胸腺组织批次MFG-056的这些载玻片中的一些的图像示出于图63A-H中。注意到以下观察结果。
来源于相同供体胸腺的所有切片在每个时间点均满足接受标准。在不同的切片中，皮质区域彼此相似，并且髓质区域彼此相似。但是，观察到切片之间皮质和髓质的相对比例存在不同。
随培养时间变化在来自相同胸腺的不同切片之间观察到的差异主要与主要是胸腺细胞的坏死量(其随着培养时间的增加而增加)和残余胸腺细胞的数量(其随着培养时间的增加而减少)相关。
基于这些观察结果，来自胸腺的任何一个切片都代表整个胸腺。此外，组织切片在第5天的组织学外观反映了在每个后面时间点(第9天、第12天和第21天)观察到的组织学外观。
实施例14：整个胸腺的时程研究。
对于此研究，根据SOP将五个胸腺切片并且培养。在切片的当天，准备第一切片、中间切片和最后切片用于免疫组织化学。将每个胸腺的其余部分切片并且在6孔板中培养。将每个胸腺针对以下时间点之一进行指定：基线(第0天)、第5天、第9天、第12天和第21天。有关第0天胸腺切片，参见图64A；有关第5天胸腺切片，参见图65A；有关第12天胸腺切片，参见图66A；并且有关第21天胸腺切片，参见图67A。
来自每个胸腺的切片的总数在21至62个切片的范围内。根据上文所概述的程序培养切片，每日更换培养基。将切片提交用于在病理实验室中进行H&E染色，并且分析其身份、效力和活力。此研究中的所有切片均满足组织学测试的放行接受标准，即：在第5-9天对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域散布在整个组织中；鉴定出至少1个哈索尔小体；CK14染色散布在整个组织中；以及观察到完整核。
除了评估每个切片是否满足放行接受标准外，病理学家还对每个H&E和AE1/AE3载玻片进行了更详细的综述。注意到以下观察结果。
如上所述，来源于相同供体胸腺的并且在相同时间点测试的所有切片都类似地满足该时间点的接受标准，其中在皮质和髓质的相对量、残余胸腺细胞和/或坏死方面有所变化。
注意到的差异是相对大小、形状、胸腺皮质相对于髓质的相对含量、坏死量、胸腺上皮的凝缩和残余胸腺细胞的数量。
此外，在不同时间点测试的来自不同供体的批次也在质量上彼此相似。观察到的差异与坏死量(其随着培养时间的增加而增加)和残余胸腺细胞的数量(随着培养时间的增加而减少)相关。
对任何一个切片的组织学检查产生关于整个批次的可接受性的相同结论。基于这些观察结果，来自胸腺的任何一个切片的相关特征都反映了整个胸腺的特征。此外，组织切片在第5天的组织学外观反映了在每个后面时间点(第9天、第12天和第21天)观察到的组织学外观，但在后面时间点观察到更多的坏死。图68是一个很好的实例，其示出了从第0天至第21天，如通过抗体AE1/AE3评估的上皮网络的相似性。
实施例15：胸腺组织的强制降解研究。
在此研究中，对胸腺组织切片进行处理以产生被认为是降解的或非活的组织切片。将三个胸腺用于这些实验。从每个胸腺获取对照样品。测试了表10中呈现的处理条件。
实施例16：胸腺组织的强制降解研究。
在此研究中，对胸腺组织切片进行处理以产生被认为是降解的或非活的组织切片。将三个胸腺用于这些实验。从每个胸腺获取对照样品。测试了表5中呈现的处理条件。
表10：强制降解处理条件
Figure BDA0003507144800001691
Figure BDA0003507144800001701
通过将含有切片的10cm培养皿放入Ziploc袋中，并且放置于55℃水浴中来完成热冲击。将板搁在支撑物上并且没有被浸没。通过将10cm培养皿放置于-20℃冷冻机中4小时，之后在环境温度下解冻来完成冷冻/解冻。
在培养的第5天和第9天测试样品的组织学。在第21天也对一些样品进行了测试。此研究中的所有切片均满足组织学测试的放行接受标准，即：在第5-9天对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域散布在整个组织中；鉴定出至少1个哈索尔小体；CK14染色散布在整个组织中；以及观察到完整核。
除了评估每个切片是否满足放行接受标准外，病理学家还对每个载玻片进行了更详细的综述。注意到以下观察结果。
暴露于冷冻/解冻或10X PBS的样品显示出最多的坏死，但是一些细胞仍显现为完整的并且满足活力的组织学标准。有关暴露于10X PBS的实例，参见图61。
保持在室温下、经过脱水、在生理盐水或1％DMSO中孵育或经历热冲击的切片显示出较少程度的组织学变化。
对于对照样品，病理学家注意到以下观察结果。
随着胸腺组织的培养，胸腺细胞逐渐丧失。然而，由于无法募集吞噬细胞来清除死亡细胞，所述死亡细胞可能在培养的胸腺中长期存在。经历凋亡性细胞死亡的细胞核最初凝缩，并且被苏木精染料染色更深(蓝色)。在这些细胞耗尽其能量但未被吞噬时，它们丧失其膜完整性并变为坏死的。核溶解(核在坏死细胞中的溶解)通常在体内2-3天内发生，但在胸腺培养过程中显现为更缓慢地发生。因此，在胸腺细胞核已经经历核溶解的坏死细胞碎片中看见大片嗜酸性(粉红色)宽阔区域并不少见。与活细胞相比，一些死胸腺细胞保留了其核，所述核具有参差不齐的边缘和改变的染色特征。
随着胸腺细胞从组织中耗尽，胸腺上皮细胞变得更加可见。三维胸腺上皮(TE)网络通常经由连接的上皮细胞和/或(看似)散布的TE细胞(其连接在所检查的切片中不明显)的浅色和花边状排列在切片中展示出。随着胸腺细胞在培养过程中的丧失，三维网络收缩。这导致残余的上皮细胞凝缩，使得被膜下皮质上皮层变厚并且髓质TE细胞变得更紧密地堆积。活的TE细胞的核通常呈椭圆形，大于胸腺细胞的核，并且具有由苏木精(蓝色)染色勾勒的清晰界定的核膜以及一个或多个核仁。这些TE核通常看起来是“开放的”，这意味着其不会被苏木精染色成深色。这符合它们是活的且具有代谢活性的解释，因为活性染色质(“常染色质”)不能结合苏木精染料。在许多TE细胞中作为核糖体合成的位点的核仁的存在进一步确认了它们是活的并具有代谢活性。来自第5天、第12天和第21天的对照切片的典型组织学外观分别示出于图65、66和67中。
对于包括室温、脱水、1％DMSO和热冲击的处理条件，病理学家指明切片的外观与对照的外观没有显著差异。对于热冲击样品，病理学家指出，热处理可能通过凝结阻止进一步降解的蛋白质来“固定”细胞。热处理已经被用作包括胸腺在内的组织的固定剂。
图12A和12B描绘了暴露于强制降解条件之后的胸腺组织载玻片的组织学。图10A和10B描绘了对照胸腺组织切片在第21天的组织学外观。
在这些时间点处，强制降解组织的总体组织学外观相似，但是在第21天具有较少的残余胸腺细胞(图12B)。髓质区域中的代表性哈索尔小体由图12B中的箭头状物指示。代表性的显现为活的胸腺上皮细胞由图12A和12B中的箭头指示。在第21天图12B中所示的皮质区域几乎完全由坏死淋巴细胞组成。左下角的标尺表示100μm。
实施例17：胸腺组织原料药批次分析
10批胸腺组织的批次分析数据示出于下表11中。
表11
Figure BDA0003507144800001721
Figure BDA0003507144800001731
符号说明：
(e)根据在产生时适当的规格对这些批次进行测试。此表中呈现出的原料药测试结果也代表最终的成品药测试结果。
(f)外观规格没有篡改或损坏容器的迹象。
(g)使用组织学测定来鉴定身份和效力两者。组织学规格(在5-9天之间进行测试)如下：
(h)对角蛋白呈阳性的区域散布在整个组织中。
i.鉴定出至少1个哈索尔小体
ii.CK14染色散布在整个组织中
iii.观察到完整核
iv.在第1天、第7天和第14天收集无菌性样品和支原体样品。
使用针对56个临床胸腺，用于胸腺内变异性、胸腺间变异性和时程测试的8个胸腺以及经历强制降解的3个胸腺的数据来产生当前的对照文库。文库中的强制降解样品(阴性对照)是通过暴露于冷冻/解冻或10X PBS而经历过降解的样品。全数据集产生14个不同的集群。将所有强制降解样品聚集在一起，并且没有将临床样品或特征样品与强制降解样品聚集。
实施例18.
方法
在知情同意后，前瞻性地从跨以下三个不同年龄组的心脏手术患者收集胸腺组织：9个月至9岁；10岁至25岁；和26岁至49岁，总共30个样品。作为此项目初步研究的一部分，开发了用于对脂肪组织进行切片的新型定制器械。使用Stadie-Riggs切片机对来自较年长胸腺的脂肪组织进行传统切片未产生可通过免疫组织化学评估的切片。因此，对于脂肪胸腺，将单刃剃须刀片(大约10个)绑在一起并进行灭菌。刀片之间的距离为大约1mm。将大约1cm x 1cm x 1cm的胸腺组织块放入无菌组织培养皿的底部中。将绑定的剃须刀片压入胸腺组织中。
从剃须刀片之间移除单独切片并用于染色。如前述实施例中所述进行人胸腺组织的切片和持续21天的培养。将来自第1、5、12和21天的组织切片和用过培养基冷冻以供进一步分析。也将来自第0天和第21天的组织切片处理成福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)的块，以促进如下所述的免疫组织学研究。
分析以来自第0天和第21天的FFPE块开始，使用苏木精和伊红(H&E)染色切片以及针对细胞角蛋白(AE1/AE3混合物)、细胞角蛋白(CK)14、增殖(Ki-67)、T细胞含量(CD3)和趋化因子(CCL21)产生的免疫组织化学。在第0天可接受的供体胸腺的组织学特征包括有组织的胸腺上皮(TE)网络、表达CK14(作为再增殖潜力的标志物)的TE细胞的存在、未成熟胸腺细胞和哈索尔小体(作为取得时胸腺生成的标志物)的存在以及>90％的完整核(作为组织活力的指标)。培养的胸腺切片应类似地展示出胸腺上皮细胞活力、TE结构的维持、活的胸腺细胞的显著耗尽以及功能上重要的生物分子的产生，包括CCL21(负责将未成熟胸腺细胞前体引诱至胸腺的趋化因子)的高产生。经由FFPE切片的IHC以及用过培养基的酶免疫测定评估胸腺切片的CCL21产生(图69)。
因为使用的胸腺组织可能表现出不同程度的年龄相关萎缩，所以确定基线胸腺功能是必不可少的。如先前所述，基线胸腺功能通过来自第0天的扫描组织切片的图像分析来确定(Ito,R.,Hale,L.P.,Geyer,S.M.,Li,J.,Sornberger,A.,Kajimura,J.,Kusunoki,Y.,Yoshida,K.,van den Brink,M.R.M.,Kyoizumi,S.,Manley,N.R.,Nakachi,K.,Sempowski,G.D.:Effects of age and exposure to ionizing radiation on human thymusmorphology and function.Radiation Res.,187:589-598,2017。此外，使用供体外周血确定幼稚T细胞的胸腺输出。将外周血单核细胞纯化并保存；通过10色流式细胞术使用以下标志物确定T细胞表型：活力、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16+CD56、CD45RA、CD57和CD197。外周血T细胞中存在的信号结合T细胞受体重排切除环(sjTREC)被定量为胸腺来源的标志物(LeeEN,Park JK,Lee J-R,Oh S-O,Baek S-Y,Kim B-S等人,2011,“Characterization of theexpression of cytokeratins 5,8,and 14 in mouse thymic epithelial cells during2011；44:14-24.thymus regeneration following acute thymic involution,”AnatCell Biol.)。
实施例19.培养的人胸腺的组织病理学评估
进行这些实验以评估和描述当根据用于植入组织的方案培养时在人胸腺切片中发生的组织病理学变化。了解这些变化可能导致组织病理学标准的开发和验证，以基于在先前接受者中成功产生免疫重建的组织特征在植入前对培养的胸腺切片的质量进行前瞻性评估Markert ML,Devlin BH,McCarthy EA.,2010,“Thymus transplantation,”ClinImmunol.2010；135:236-246。总之，这些结果可以用于开发基于可经由苏木精和伊红染色和细胞角蛋白免疫组织化学鉴定的组织结构特征的诊断标准，所述诊断标准可以潜在地用来评价用于植入的切片的质量。
材料和方法
胸腺组织从<9月龄的有免疫能力的婴儿供体获得，所述婴儿供体正在经历心脏矫正手术，其中常规地需要移除一部分胸腺以促进心脏修复。每名供体的父母都提供了书面知情同意书，以允许移除和以其他方式将被丢弃的任何胸腺组织用于植入或研究。这些研究得到了杜克大学医学中心机构审查委员会的批准。将供体胸腺在符合良好生产工艺(GMP)的细胞生产实验室中切片并且培养至多21天，然后放行至手术室以手术植入至接受者的肌肉中。供体资格、培养和手术植入过程的细节已经在其他地方得到描述(MarkertML,Sarzotti M,Ozaki DA,Sempowski GD,Rhein ME,Hale LP等人,2003,“Thymictransplantation in complete DiGeorge syndrome:Immunologic and safetyevaluation in twelve patients,”Blood,102:1121-1130；Markert ML,Alexieff MJ,LiJ,Sarzotti M,Ozaki DA,Devlin BH等人,2004,“Postnatal thymus transplantationwith immunosuppression as treatment for DiGeorge syndrome,”Blood,104:2574-2581；Markert ML,Devlin BH,Alexieff MJ,Li J,McCarthy EA,Gupton SE等人,2007,“Review of 54patients with complete DiGeorge anomaly enrolled in protocolsfor thymus transplantation:Outcome of 44 consecutive transplants,”Blood,109:4539-4547；Hong R等人,1996；Rice HE,eSkinner MA,Mahaffey SM,Oldham KT,Ing RJ,Hale LP等人,2004,“Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome:medical and surgical considerations,”J Pediatr Surg.,39:1607-1615)。在培养过程中的特定时间点，将来自每个供体胸腺的一个或多个切片固定在10％中性缓冲福尔马林中，然后处理并嵌入至福尔马林固定的石蜡包埋块中以进行组织病理学评价。针对每个组织块获得苏木精和伊红(H&E)染色切片和免疫组织化学面板。使用的抗体包括泛细胞角蛋白(克隆AE1/AE3；Leica)、细胞角蛋白(CK)14(克隆LL02；Leica)、CD3(克隆LN10；Leica)和Ki-67(克隆MIB-1；Dako)。使用标准免疫过氧化物酶方法和3,3'-二氨基联苯胺(棕色)底物以及苏木精复染进行自动免疫组织化学。为了评估胸腺样品内随培养时间的变异性，通常在以下范围内的≥3个时间点对批次进行组织学检查：第0天(接收日)、第5-9天和第12-21天。
结果和讨论。
随着胸腺器官培养从第0天进行至第21天，切片产生渐增的坏死量、渐增的胸腺上皮凝缩和渐减的残余T细胞数量。在整个21天的培养中，胸腺上皮网络的结构保持为基本上完好保存，具有细胞角蛋白14(具有长期器官再增殖潜力的胸腺上皮细胞的推定生物标志物)的焦点表达。来源于相同供体胸腺的所有器官切片彼此高度相似，在大小、形状和皮质与髓质的相对含量方面存在微小差异。类似地，来自不同供体的切片在相同培养时间点检查时显示出相似的组织病理学特征。
对作为胸腺的组织的初始鉴定。
胸腺具有薄的结缔组织被膜，其通常在实验室处理过程中被去除。然而，在胸腺切片中仍可以观察到被膜(小梁)和相关血管、纤维组织、脂肪组织和可变数量的成熟造血细胞的延伸部。小梁将胸腺组织分成小叶，小叶由胸腺上皮细胞的显现为花边状的三维网络构成，所述三维网络具有含有发育中T细胞的中间空间(胸腺细胞)。小叶通常展示出外皮质和内髓质，它们的组织学外观以及它们所含细胞的表型和功能有所相同。由于密集堆积的未成熟胸腺细胞，胸腺皮质非常嗜碱性(蓝色)，从而被苏木精染色得很深。胸腺髓质中存在的更成熟胸腺细胞的密度低于皮质中的密度，因此髓质往往显现为更加嗜酸性(粉红色)。胸腺髓质还含有称为哈索尔小体的含有示病性嗜酸性细胞角蛋白的结构。胸腺内存在的巨噬细胞可以形成“可染小体”，其在深色染色胸腺细胞的背景下显现为浅色圆形区域(“满天星”图案)。大量可染小体是应激性退化的特征，所述应激性退化可能由于严重心脏缺陷、手术和/或皮质类固醇治疗的应激而发生在正常胸腺供体中，并且不会使胸腺失去植入的资格。培养前(第0天)切片的正常胸腺的典型组织学特征示出于图71-D中。
哈索尔小体的评估
胸腺髓质含有称为哈索尔小体的特征结构，其由与单克隆抗体反应的终末分化胸腺上皮细胞构成，所述单克隆抗体也与上皮的终末分化上层反应。Hale LP等人,2004；172:617-624。
哈索尔小体可以充当组织身份的标志物，因为它们仅在胸腺中发现。它们也可以反映输入供体组织的质量，因为终末分化过程通常由胸腺细胞-胸腺上皮细胞相互作用触发。同上。哈索尔小体通常很容易通过其在H&E染色的载玻片上作为上皮细胞的嗜酸性螺环的外观鉴定出(图72A-D)。最中心的层通常缺乏核。可变数量的细胞碎片也可能存在于哈索尔小体的中心。哈索尔小体被泛细胞角蛋白AE1/AE3抗体非常强烈地染色，如果在苏木精和伊红(H&E)染色载玻片中未明确鉴定出，则这可以用作这些结构身份的二次确认。
培养过程中的一般胸腺细胞变化
随着胸腺组织的培养，胸腺细胞逐渐丧失，所述丧失是由于在培养基更换过程中冲洗掉或者由于胸腺细胞死亡然后在组织内降解(图72-图75)。然而，与体内发生的不同，由于无法募集吞噬细胞来清除死亡细胞，所述死亡细胞可能在培养的胸腺中长期存在。经历细胞死亡的胸腺细胞核可能显示出固缩(染色质凝缩)和核碎裂(核碎裂)，但通常，由于这些细胞耗尽其能量但未被吞噬，它们显示出参差不齐的核边缘，伴有核膜完整性的丧失。核溶解(核在坏死细胞中的完全溶解)通常在体内2-3天内发生，但在胸腺培养过程中显现为更缓慢地发生。在培养5-9天后，大多数胸腺细胞保留了核，但核膜不完整，这指示出早期坏死(图24)。这些改变的核特征有利于即使在保留核时区分活的胸腺细胞和非活的胸腺细胞。还可以看到嗜酸性坏死细胞碎片的大焦点，其中胸腺细胞核已经经历核溶解(图73)。
细胞完整性和组织结构的组织学评估。
当要植入培养的胸腺组织时，能够准确区分具有广泛胸腺细胞坏死但胸腺上皮细胞旺盛的切片(用于植入的最佳组织)与具有相似的坏死量、胸腺上皮细胞也受损的切片是至关重要的。虽然不能直接评估活力，但H&E载玻片的组织学检查可以评估正常结构的保存程度以及细胞死亡指标的存在或不存在。如上所述，预期胸腺细胞在培养过程中被耗尽。在每日更换培养基过程中，许多胸腺细胞被从切片中被洗出。许多其他胸腺细胞将原位死亡，其中它们的核和细胞体可能在延长的时间段内保留。然而，死胸腺细胞的膜完整性受损，并且它们的核表现出“参差不齐”的边缘。胸腺细胞碎片可能团聚在一起，从而无法辨别单独细胞边界。胸腺细胞死亡和耗尽是培养的预期且理想的结果，并且完整胸腺细胞核的相对缺乏潜在地反映切片质量。
随着胸腺细胞从组织中耗尽，胸腺上皮细胞更容易可视化。活的胸腺上皮细胞的核通常呈椭圆形，大于胸腺细胞的核，并且具有由苏木精染色勾勒的清晰界定的核膜以及一个或多个核仁。这些胸腺上皮核通常看起来是“开放的”，这意味着其不会被苏木精染色成深色。这符合它们是活的且具有代谢活性的解释，因为活性染色质(“常染色质”)不结合苏木精染料。在许多胸腺上皮细胞中作为核糖体合成的位点的核仁的存在进一步确认了它们在固定时是活的并具有代谢活性。显现为完整且活的胸腺上皮细胞的实例示出于图77A-B中。
在第0-21天的任何给定时间点对多个胸腺切片的仔细显微镜检查显示，来自于相同供体胸腺的所有切片彼此高度相似。随培养时间变化在来自相同胸腺的不同切片之间观察到的差异主要与坏死量(随着培养时间的增加而增加)和残余胸腺细胞的数量(随着培养时间的增加而减少)相关。当在相同时间点检查时，来自不同供体的切片在质量上也相似。不同供体组织之间的差异包括相对大小、形状、胸腺相对于髓质的相对含量(但两者始终存在于检查的每个切片上)、坏死量、胸腺上皮的凝缩和残留T细胞的数量。组织学外观的大多数变化到培养的第5天已经发生，随着培养的进行，通常只有胸腺细胞的另外耗尽。
胸腺相对于髓质的胸腺上皮结构的评估。
含有抗细胞角蛋白抗体AE1和AE3(AE1/AE3)的混合物检测基本上所有的胸腺上皮细胞。相比之下，与CK14反应的抗体检测存在于被膜下皮质中并且似乎散布在整个皮质和髓质的其余部分中的胸腺上皮细胞子集。已经表明这些CK14+细胞中的一些具有分化为皮质上皮细胞和髓质上皮细胞两者的潜力(Lee EN,Park JK,Lee J-R,Oh S-O,Baek S-Y,KimB-S等人,2011,“Characterization of the expression of cytokeratins 5,8,and 14in mouse thymic epithelial cells during thymus regeneration following acutethymic involution,”Anat Cell Biol.44:14-24)，并且因此表示长期再增殖细胞。随着胸腺细胞从组织中耗尽，胸腺上皮细胞变得更加可见。三维胸腺上皮网络通常经由连接的上皮细胞和/或看似散布的胸腺上皮细胞(其连接在所检查的切片中不明显)的浅色和花边状排列在切片中展示出。随着胸腺细胞在培养过程中的丧失，三维胸腺上皮网络不同程度地收缩。这可能导致残余的上皮凝缩，使得被膜下皮质上皮层变厚并且髓质胸腺上皮细胞变得更紧密地堆积。对于在第0天(接收日)、第7、9、12和20天检查的单一胸腺批次，这些变化的实例示出于图70A-D和图73-图75中。尽管有许多胸腺细胞的丧失和含有坏死碎片的潜在大区域，但胸腺上皮细胞网络的总体结构到培养的至少21天保持为基本上完好保存(图78A-E)。
残余T细胞的评估
如上所述，旨在用于植入的供体胸腺组织的培养的主要目的是部分耗尽T细胞以促进植入切片定植有接受者胸腺细胞前体并降低移植物抗宿主病的风险。未成熟T细胞(胸腺细胞)和成熟T细胞可以在组织切片中通过其形态以及通过检测由这些细胞类型特异性表达的蛋白质的免疫组织化学染色来鉴定。CD3是针对抗原的T细胞受体的组分，存在于>95％的皮质和髓质胸腺细胞上以及所有成熟T细胞上。在第0天，皮质和髓质中基本上所有未成熟T细胞的质膜显现为以膜模式与CD3抗体强烈反应(图79A-B)。随着培养的继续，活的胸腺细胞/T细胞继续以膜模式与CD3抗体反应。然而，CD3抗体也与死的胸腺细胞(包括在死胸腺细胞经历核溶解之后残留的无核碎片)起强烈反应(图79D、图79G和图79I-K)。如此多的胸腺细胞碎片保持当在低放大倍数下观察时切片仍可以显现为强烈且均匀的棕色(图79C、图79F、图79H、图79J)，但在较高倍率(例如40X物镜)下检查载玻片确认在这些时间点存在相对较少的完整的潜在活的胸腺细胞。非活的细胞和细胞碎片在植入后将被接受者吞噬细胞清除，且因此不会带来移植物抗宿主病的风险。通常不可能准确鉴定组织区域中的CD3+膜免疫反应性，在所述组织区域中，相当大量的强染色碎片妨碍对相邻细胞的细胞膜的评估。然而，即使在培养过程中的后面时间点，CD3免疫组织化学通常突出显示至少一些具有完整质膜的胸腺细胞/T细胞，这表明它们可能仍是活的(图79E、图79G、图79I-K)。
细胞增殖的评估
Ki-67抗原在所有正在增殖的细胞的核中(即，不在细胞周期的G0期中)表达。在第0天，胸腺皮质内存在的大多数未成熟胸腺细胞正在增殖，并且它们的核与对Ki-67增殖抗原具有特异性的抗体强烈反应。相比之下，只有少见的更成熟的髓质胸腺细胞和/或上皮或基质细胞与此抗体反应(图66A-B)。在培养的第1-2天后观察到的免疫反应性的模式是散布的少见阳性细胞的，几乎所有所述细胞都具有胸腺上皮细胞特征性的较大核。因此，Ki-67染色可能是用于证明切片内胸腺上皮细胞的活力的一种有用辅助染色。
讨论
这些实验描述了当将出生后人胸腺培养至多21天时发生的组织病理学变化，并且证明使用H&E和细胞角蛋白免疫反应性进行的组织病理学检查可用于评估旨在用于植入的培养的胸腺切片的质量。随着胸腺培养的进行，切片产生渐增的坏死量、渐增的胸腺上皮凝缩和渐减的残余T细胞数量。在整个21天的培养中，胸腺上皮网络的结构保持完整，具有细胞角蛋白14(具有长期器官再增殖潜力的胸腺上皮细胞的推定生物标志物)的继续表达。来自相同胸腺的切片在质量上相似，使得单一切片可以充分代表整个胸腺。在任何给定时间点，来源于不同供体的培养的胸腺切片的组织学外观的变异性也极小。在培养过程中早期(例如，第5-9天)观察到的组织组织学密切反映了在培养后期(例如，第12-21天)观察到的组织组织学，但是在后面时间点观察到更多的胸腺细胞耗尽和坏死。
识别CK14或所有类型的细胞角蛋白(AE1/AE3)的抗体的免疫组织化学可用于评价培养的胸腺切片。细胞角蛋白中间丝是所有上皮细胞的细胞骨架的重要组分。泛细胞角蛋白AE1/AE3染色展示出检查的胸腺切片内的上皮网络，其在后面的时间点使用单独的H&E染色可能不容易辨别。已经显示由特定胸腺上皮细胞表达的细胞角蛋白的具体类型取决于其发育和分化阶段以及功能状态。在小鼠中，与CK5、CK8和CK14反应的抗体已经最常用于鉴定胸腺上皮细胞亚型，Lee EN等人,2011,Anat Cell Biol.,44:14-24。基于先前研究在本研究中确定了CK14的表达，在所述先前研究中假设CK14表达是具有向皮质或髓质谱系分化的潜力的胸腺上皮细胞特征性的，Li B,Li J,Devlin BH,Markert ML.,2011,“Thymicmicroenvironment reconstitution after postnatal human thymustransplantation,”Clin Immunol.140:244-259。虽然长期免疫重建的临床结果(MarkertML等人,Blood,109:4539-4547)表明胸腺上皮祖细胞可能存在于植入的胸腺切片中，但此类祖细胞的精确表型尚未在人类中明确鉴定。小鼠中的胸腺上皮祖细胞的表型仍是有争议的(Bennett AR,Farley A,Blair NF,Gordon J,Sharp L,Blackburn CC.,2002,“Identification and characterization of thymic epithelial progenitor cells,”Immunity 16:803–814；Wong K,Lister NL,Barsanti M,Lim JMC,Hammett MV,Khong DM等人,2014,“Multilineage potential and self-renewal define an epithelialprogenitor cell population in the adult thymus,”Cell Rep.8:1198-1209；Ucar A,Ucar O,Klug P,Matt S,Brunk F,Hofmann TG等人,2014,“Adult thymus contains FoxN1(-)epithelial stem cells that are bipotent for medullary and cortical thymicepithelial lineages,”Immunity,41:257-269；Ulyanchenko S,O'Neill KE,Medley T,Farley AM,Vaidya HJ,Cook AM,2016,“Identification of a bipotent epithelialprogenitor population in the adult thymus,”Cell Rep.,14:2819-2832)，并且使用多种抗体和多色流式细胞术仅已经检测到低数量。因此，目前在人组织切片中直接检测胸腺上皮祖细胞是不可行的。
这些实验鉴定了在培养第12-21天(可以植入组织的时间点)胸腺切片内残留的大量坏死细胞物质。植入后数月的活检检查未显示出此坏死物质的迹象(Markert ML,Li J,Devlin BH,Hoehner JC,Rice HE,Skinner MA,2008,“Use of allograft biopsies toassess thymopoiesis after thymus transplantation,”J Immunol,180:6354-6364)。虽然不希望受任何特定理论的束缚，但申请人提出，在植入时此坏死碎片及其下面的细胞外基质的初始存在可用于保存切片的功能结构，包括用于发育胸腺细胞的皮质和髓质生态位。保存细胞外基质以再产生可以支持上皮细胞和造血前体两者的细胞分化的鼠类胸腺“类器官”的胸腺去细胞化方法的最近使用(Hun M,Barsanti M,Wong K,Ramshaw J,Werkmeister J,Chidgey AP,2017,“Native thymic extracellular matrix improves invivo thymic organoid T cell output,and drives in vitro thymic epithelial celldifferentiation,”Biomaterials,118:1-15)支持此假设。
先前研究证明，在所使用的培养条件下胸腺上皮细胞的生长潜力得以稳健保持，使得可以由在器官培养开始后至多12周的切片建立细胞角蛋白阳性上皮单层(Markert ML等人,1997,Clinical Immunol Immunopathol.,82:26-36)。此实施例中描述的实验没有直接评估上皮细胞活力，而是使用完整核的存在作为替代标志物。
实施例20
用过培养基中细胞因子和趋化因子的检测
将来自各种胸腺培养条件的用过培养基样品发送至RayBio,Norcross,Georgia，用于细胞因子和趋化因子的面板分析。使用荧光检测，使用Quantibody阵列进行测试。Quantibody阵列是基于夹心的载玻片多重ELISA(针对非定制试剂盒的产品号QAH-CAA-4000)。使用RayBio程序SOP-TF-QAH-001和SOP-TF-QAH-003进行所有测试发送三个不同组的样品并且通过RayBio以2倍稀释液测试。第一组样品包括根据测试方案060717 QAH-CAA-4000 SA31 Duke U的生产批号MFG-025、MFG-026和MFG-027。第二组样品包括根据测试方案091117 Cust-H120 SA31 Duke U的MFG-035、MFG-036和MFG-038。最后组样品包括根据测试方案050118 QAH-CAA-4000 SA113 Duke U的MFG-053、MFG-054和MFG-066。用利用不同抗体批次的等同试剂盒测试第一组和第三组的样品。用定制试剂盒测试第二组，所述定制试剂盒具有不同抗体浓度下的不同抗体混合物以仅靶向某些分析物。用于第二组测试的定制试剂盒与其他试剂盒的基础相同，但是仅测试选择的细胞因子和趋化因子而不是更广泛的靶标阵列。此举导致针对每个样品组不同的检测上限和下限，因为它们由平均背景定义。跨所有三种样品呈递的趋势应是代表性的，但数据尚未进行归一化。
在21天培养过程中的表征
在常规21天培养的第1、5、7、9、11、13、15、17、19和21天获取来自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036和MFG-038的用过培养基的样品。
批次MFG-053
处理1：对照
在MC3设施中接收胸腺之后，将胸腺组织根据如本说明书中其他地方所述的可适用SOP切片，并且培养9天。将胸腺切片在10-cm圆形组织培养板中培养，每板具有4个切片。在第5、7和9天获取用过培养基的样品以如根据方案所需确定每个时间点下的生物标志物水平。
处理3：-20℃，4小时
在MC3设施中接收胸腺之后，将胸腺组织根据如本说明书中其他地方所述的可适用SOP切片，并且培养。将胸腺切片在10-cm圆形组织培养板中培养，每板具有4个切片。根据程序将胸腺切片放置在滤膜的顶部上。在第2天，使测试胸腺切片经受-20℃的温度，持续4小时。将切片放回至具有TOM的10-cm培养皿中并且培养总共9天。在第5、7和9天获取用过培养基的样品以确定每个时间点下的生物标志物水平。
处理5：55℃，4小时
在MC3设施中接收胸腺之后，将胸腺组织根据可适用SOP切片，并且培养。将胸腺切片在10-cm圆形组织培养板中培养，每板具有4个切片。根据程序将胸腺切片放置在滤膜的顶部上。在第2天，使测试胸腺切片经受55℃的温度，持续4小时。将切片放回至具有TOM的10-cm培养皿中并且培养总共9天。在第5、7和9天获取用过培养基的样品以确定每个时间点下的生物标志物水平。
批次MFG-054
处理1：对照。
处理2：室温，24小时
在MC3设施中接收胸腺之后，将胸腺组织根据可适用SOP切片，并且培养。将胸腺切片在10-cm圆形组织培养板中培养，每板具有4个切片。根据程序将胸腺切片放置在滤膜的顶部上。在第2天，使测试胸腺切片经受室温，持续24小时。将切片放回至具有TOM的10-cm培养皿中并且培养总共9天。在第5、7和9天获取用过培养基的样品以确定每个时间点下的生物标志物水平。
处理3：脱水，24小时
在MC3设施中接收胸腺之后，将胸腺组织根据可适用SOP切片，并且培养。将胸腺切片在10-cm圆形组织培养板中培养，每板具有4个切片。根据程序将胸腺切片放置在滤膜的顶部上。在第2天，使测试胸腺切片经受脱水，持续24小时。将切片放回至具有TOM的10-cm培养皿中并且培养总共9天。在第5、7和9天获取用过培养基的样品以确定每个时间点下的生物标志物水平。
处理4：脱水，48小时
在MC3设施中接收胸腺之后，将胸腺组织根据如本说明书中其他地方所述的可适用SOP切片，并且培养。将胸腺切片在10-cm圆形组织培养板中培养，每板具有4个切片。根据程序将胸腺切片放置在滤膜的顶部上。在第2天，使测试胸腺切片经受-20℃的温度，持续4小时。将切片放回至具有TOM的10-cm培养皿中并且培养总共9天。在第5、7和9天获取用过培养基的样品以确定每个时间点下的生物标志物水平。
处理4：生理盐水，24小时
在MC3设施中接收胸腺之后，将胸腺组织根据可适用SOP切片，并且培养。将胸腺切片在10-cm圆形组织培养板中培养，每板具有4个切片。根据程序将胸腺切片放置在滤膜的顶部上。在第2天，使测试胸腺切片经受脱水，持续48小时。将TOM添加回至培养皿并且将切片培养总共9天。在第5、7和9天获取用过培养基的样品以确定每个时间点下的生物标志物水平。
处理5：生理盐水，24小时
在MC3设施中接收胸腺之后，将胸腺组织根据可适用SOP切片，并且培养。将胸腺切片在10-cm圆形组织培养板中培养，每板具有4个切片。根据程序将胸腺切片放置在滤膜的顶部上。在第2天，代替TOM将测试胸腺切片在生理盐水中培养24小时。在处理后，移除盐水并且根据正常程序添加TOM，并且将切片培养总共9天。在第5、7和9天获取用过培养基的样品以确定每个时间点下的生物标志物水平。
处理6：生理盐水，48小时
在MC3设施中接收胸腺之后，将胸腺组织根据可适用SOP切片，并且培养。将胸腺切片在10-cm圆形组织培养板中培养，每板具有4个切片。根据程序将胸腺切片放置在滤膜的顶部上。在第2天，使测试胸腺切片经受55℃的温度，持续4小时。将切片放回至具有TOM的10-cm培养皿中并且培养总共9天。在第5、7和9天获取用过培养基的样品以确定每个时间点下的生物标志物水平。
处理7：10X PBS，24小时
在MC3设施中接收胸腺之后，将胸腺组织根据可适用SOP切片，并且培养。将胸腺切片在10-cm圆形组织培养板中培养，每板具有4个切片。根据程序将胸腺切片放置在滤膜的顶部上。在第2天，代替TOM将测试胸腺切片在10X PBS中培养24小时。在处理后，移除10XPBS并且根据正常程序添加TOM，并且将切片培养总共9天。在第5、7和9天获取用过培养基的样品以确定每个时间点下的生物标志物水平。
处理8：1％DMSO，24小时
在MC3设施中接收胸腺之后，将胸腺组织根据可适用SOP切片，并且培养。将胸腺切片在10-cm圆形组织培养板中培养，每板具有4个切片。根据程序将胸腺切片放置在滤膜的顶部上。在第2天，使测试胸腺切片经受1％DMSO，持续24小时。将切片放回至TOM中并且培养总共9天。在第5、7和9天获取用过培养基的样品以确定每个时间点下的生物标志物水平。
批次MFG-066
处理4：对照
在MC3设施中接收胸腺之后，将胸腺组织根据可适用SOP切片，并且培养21天。将胸腺切片在10-cm圆形组织培养板中培养，每板具有4个切片。在第2-21天获取用过培养基的样品以确定每个时间点下的生物标志物水平。
处理5：-20℃，4小时
在MC3设施中接收胸腺之后，将胸腺组织根据可适用SOP切片，并且培养。将胸腺切片在10-cm圆形组织培养板中培养，每板具有4个切片。根据程序将胸腺切片放置在滤膜的顶部上。在第2天，使测试胸腺切片经受-20℃的温度，持续4小时。将切片返回至正常条件并且培养总共21天。在第2-21天获取用过培养基的样品以确定每个时间点下的生物标志物水平。
处理6：55℃，4小时。
在MC3设施中接收胸腺之后，将胸腺组织根据可适用SOP切片，并且培养。将胸腺切片在10-cm圆形组织培养板中培养，每板具有4个切片。根据程序将胸腺切片放置在滤膜的顶部上。在第2天，使测试胸腺切片经受55℃的温度，持续4小时。将切片返回至正常条件并且培养总共21天。在第2-21天获取用过培养基的样品以确定每个时间点下的生物标志物水平。
处理7：10X PBS，24小时
在MC3设施中接收胸腺之后，将胸腺组织根据可适用SOP切片，并且培养。将胸腺切片在10-cm圆形组织培养板中培养，每板具有4个切片。根据程序将胸腺切片放置在滤膜的顶部上。在第2天，使测试胸腺切片经受10X PBS，持续24小时。将切片放回至TOM中并且培养总共21天。在第2天和第4-21天获取用过培养基的样品以确定每个时间点下的生物标志物水平。
结果
基于对常规和强制降解数据的分析，当与强制降解样品相比时，基于文献和在培养时程内数据的总体趋势，研究的12种生物标志物中有四种生物标志物脱颖而出。这些是CCL21、CXCL16、L-选择素和uPAR。在此章节中讨论对这四种生物标志物的水平的分析。
CCL21 6Ckine
CCL21 6Ckine是TEC表达的趋化因子，已经显示其是胸腺细胞趋向性的(Liu2005)，所述趋向性是在植入培养的胸腺组织后接受者的成功免疫重建的至关重要决定因素。
在21天培养过程中CCL21的表征
用过培养基中CCL21水平的描述性统计呈现于表12中。包括了来自强制降解研究中的对照样品(批次MFG-053、MFG-054和MFG-066)的数据以及来自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036和MFG-038的27天时程样品的结果。未绘制大于测定ULOQ的结果或未将其包括在统计分析中。
表12：在21天内用过培养基中CCL21水平的描述性统计
Figure BDA0003507144800001871
针对分析的每个批次的用过培养基中的CCL21水平相对于天数的散布图提供于图85中，并且箱形图提供于图86中。散布图显示，对于分析的每个批次，用过培养基中的CCL21水平在21天的过程内增加。箱形图表明，总的来说，在批次之间用过培养基中CCL21水平的变异性随着培养所花费时间增加而增加。变异性在第5-9天最低。批次MFG-036在CCL21方面的趋势低于其他批次，没有明显的任何差异原因，因为它是使用与其他批次相同的工艺产生的。其他生物标志物未显示此批次与其他批次明显不同。建议测试另外的批次和另外的测定开发，以更好地了解差异。
强制降解样品中CCL21水平的表征
批次MFG-053和MFG-054
在批次-053(1、3和5)和批次-054(1-8)的强制降解处理过程中用过培养基中的CCL21水平呈现于表13中，并且数据的散布图提供于图38中。散布图含有来自对照样品分析的平均CCL21结果(参见表8)的图。绘制平均结果(n＝6)以表现出未降解批次，因为对于该分析，强制降解对照>ULOQ。应注意，这确实导致对于一些天数的波动，因为并非所有批次都具有在所有天数收集的样品。未绘制大于测定ULOQ的结果。
表13：强制降解研究-批次MFG-053和批次MFG-054中的CCL21水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800001881
批次MFG-066
在批次-066(4-7)的强制降解处理过程中用过培养基中的CCL21水平呈现于表14中，并且数据的散布图提供于图39中。散布图含有来自对照样品分析的平均CCL21结果(参见表7)的图。绘制平均结果(n＝6)以表现出未降解批次，因为对于该分析，强制降解对照>ULOQ。应注意，这确实导致对于一些天数的波动，因为并非所有批次都具有在所有天数收集的样品。未绘制大于ULOQ的结果。将小于LOD的结果绘制在LOD下。
表14：强制降解研究-批次MFG-066中的CCL21水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800001891
ULOQ＝4444.4pg/mL；LOD＝22.2pg/mL。
CXCL16
已经显示CXCL16趋化因子由TEC产生(Bunting 2011)。受体的表达在皮质中的恒定自然杀伤T细胞(iNKT)细胞阳性选择过程中被诱导，并且已显示在髓质中可检测到(Cowan,2015)。
在21天培养过程中CXCL16的表征
用过培养基中CXCL16水平的描述性统计呈现于表15中。包括了来自强制降解研究的对照样品(批次MFG-053、MFG-054和MFG-066)的数据以及来自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036和MFG-038的结果。
表15：在21天内废培养基中CXCL16水平的描述性统计
Figure BDA0003507144800001901
针对分析的每个批次的用过培养基中的CXCL16水平相对于天数的散布图提供于图89中，并且箱形图提供于图90中。散布图显示，对于分析的每个批次，用过培养基中的CXCL16水平在21天的过程内增加。箱形图表明，在批次之间用过培养基中CXCL16水平的变异性随着培养所花费时间增加相当一致。
强制降解样品中CXCL16水平的表征
批次MFG-053和批次MFG-054
在批次-053(1、3和5)和批次-054(1-8)的强制降解处理过程中用过培养基中的CXCL16水平呈现于表16中，并且数据的散布图提供于图91中。散布图含有来自对照样品分析的平均CXCL16结果(参见表9)的图。绘制平均结果(n＝6)以表现出未降解批次，因为对于该分析，强制降解对照>ULOQ。应注意，这确实导致对于一些天数的波动，因为并非所有批次都具有在所有天数收集的样品。对于此分析，移除了仅收集了一个批次的数据的天数，因为它过度代表单一批次，从而导致单独数据图中出现更多的波动。将小于LOD的结果绘制在LOD下。
表16：强制降解研究-批次MFG-053和批次MFG-054中的CXCL16水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800001911
批次MFG-066
在批次-066(4-7)的强制降解处理过程中用过培养基中的CXCL16水平呈现于表17中，并且数据的散布图提供于图92中。散布图含有来自对照样品分析的平均CXCL16结果(参见表9)的图。绘制平均结果(n＝6)以表现出未降解批次，因为对于该分析，强制降解对照>ULOQ。应注意，这确实导致对于一些天数的波动，因为并非所有批次都具有在所有天数收集的样品。对于此分析，移除了仅收集了一个批次的数据的天数，因为它过度代表单一批次，从而导致单独数据图中出现更多的波动。将小于LOD的结果绘制在LOD下。
表17：强制降解研究-批次MFG-066中的CXCL16水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800001921
L-选择素。
L-选择素以高水平表达于发育中和幼稚T细胞上。当培养胸腺细胞时，它从细胞表面释放。通常在被体内健康细胞脱落时迅速重新表达(Fitzhugh 2008)，逐降低低的脱落水平可能反映了胸腺细胞活力的逐渐丧失，因为它们在培养过程中通常不在表面上重新表达此分子(A.Macintyre，未发表的数据)。
在21天培养过程中L-选择素的表征
在21天的过程内培养基中L-选择素水平的描述性统计呈现于表18中。包括了来自强制降解研究的对照样品(批次MFG-053、MFG-054和MFG-066)的数据以及来自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036和MFG-038的结果。
表18：在21天内废培养基中L-选择素水平的描述性统计
Figure BDA0003507144800001931
针对分析的每个批次的用过培养基中的L-选择素水平相对于天数的散布图提供于图93中，并且箱形图提供于图94中。散布图显示，对于分析的每个批次，用过培养基中的L-选择素水平在21天的过程内降低。箱形图表明，总的来说，在批次之间用过培养基中L-选择素水平的变异性随着培养所花费时间增加并且随着L-选择素水平接近零而降低。
强制降解样品中L-选择素水平的表征
批次MFG-053和批次MFG-054
在批次-053(1、3和5)和批次-054(1-8)的强制降解处理过程中用过培养基中的L-选择素水平呈现于表19中，并且数据的散布图提供于图95中。散布图含有来自对照样品分析的平均L-选择素结果(参见表18)的图。绘制平均结果(n＝6)以表现出未降解批次，因为对于该分析，强制降解对照>ULOQ。对于此分析，移除了仅收集了一个批次的数据的天数，因为它过度代表单一批次，从而导致单独数据图中出现更多的波动。将小于LOD的结果绘制在LOD下。
表19：强制降解研究-批次MFG-053中的L-选择素水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800001941
批次MFG-066。
在批次-066(4-7)的强制降解处理过程中用过培养基中的L-选择素水平呈现于表19中，并且数据的散布图提供于图96中。散布图含有来自对照样品分析的平均L-选择素结果(参见表18)的图。将小于LOD的结果绘制在LOD下。
uPAR(CD87)
uPAR(CD87)是尿激酶受体(也称为尿激酶纤溶酶原激活物受体)，其基于选择性剪接以可溶性形式和膜结合形式表达。它有助于细胞外基质的局部降解。已经显示它在人胸腺中表达，并且通过迁移伤口边缘处的表皮角质形成细胞(EK)表达(Loughner 2016)。此后种特征是最有趣的，因为TEC细胞在许多基因的表达方面与EK十分相似(Patel 1995)。在培养的胸腺切片的分泌中的逐渐增加可能反映了TE的激活，并且因此可能是植入后TE生长的标志物。
在21天培养过程中uPAR的表征。
在21天的过程内培养基中uPAR水平的描述性统计呈现于表20中。包括了来自强制降解研究的对照样品(批次MFG-053、MFG-054和MFG-066)的数据以及来自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036和MFG-038的结果。
表20：在21天内用过培养基中uPAR水平的描述性统计
Figure BDA0003507144800001951
Figure BDA0003507144800001961
针对分析的每个批次的用过培养基中的uPAR水平相对于天数的散布图提供于图97中，并且箱形图提供于图98中。散布图显示，对于分析的每个批次，用过培养基中的uPAR水平在21天的过程内增加，具有中等的批次间变异性。箱形图表明，总的来说，在批次之间用过培养基中uPAR水平的变异性随着培养所花费时间增加而增加。
强制降解样品中uPAR水平的表征
批次MFG-053和批次MFG-054
在批次-053(1、3和5)和批次-054(1-8)的强制降解处理过程中用过培养基中的uPAR水平呈现于表21中，并且数据的散布图提供于图99中。散布图含有来自对照样品分析的平均uPAR结果(参见表21)的图。由于此数据在批次之间没有归一化，并且存在大量的批次间变异性，因此图99中呈现的平均数据高度依赖于在哪些天测试了哪些批次。将仅测试一个批次的天数排除在图上的平均值之外。
表21：强制降解研究-批次MFG-053中的uPAR水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800001962
Figure BDA0003507144800001971
批次MFG-066
在批次-066(4-7)的强制降解处理过程中用过培养基中的uPAR水平呈现于表22中，并且数据的散布图提供于图100中。散布图含有来自对照样品分析的平均uPAR结果(参见表21)的图。将小于LOD的结果绘制在LOD下
表21：强制降解研究-批次MFG-066中的uPAR水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800001972
Figure BDA0003507144800001981
LOD＝25.4pg/mL。
相关性。
对四组生物标志物数据(CCL21、CXCL16、L-选择素和uPAR)进行正态性检验(Ryan-Joiner)。CCL21(>0.087)和CXCL16(>0.100)的p值表明它们遵循正态分布。L-选择素(<0.010)和uPAR(<0.010)的p值表明它们不遵循正态分布。针对每种相关性确定皮尔逊相关系数，并且将其呈现于表22中。所述系数在统计学上是显著的，并且除了L-选择素与所有其他生物标志物外，全部彼此表现出强相关性。显示相关性的回归模型提供于图101至图103中。在CCL21与uPAR之间观察到最强的相关性。出于视觉目的示出了回归。
表22：CCL21、CXCL16、L-选择素和uPAR的皮尔逊相关系数
Figure BDA0003507144800001982
另外的结果
CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子)
CCL11趋化因子(嗜酸性粒细胞趋化因子)由髓质TE产生(Bunting 2011)。它最初因其引诱嗜酸性粒细胞的能力而得名，并且已经显示嗜酸性粒细胞浸润可能在具有活跃胸腺生成的胸腺组织中是突出的(Flores 1999)；然而，也已经显示CCL11充当双阳性和单阳性人胸腺细胞的化学引诱剂(Bunting 2011)。
在21天培养过程中CCL11的表征
在21天的过程内培养基中CCL11水平的描述性统计呈现于表23中。包括了来自强制降解研究的对照样品(批次MFG-053、MFG-054和MFG-066)的数据以及来自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036和MFG-038的结果。
表23：在21天内用过培养基中CCL11水平的描述性统计
Figure BDA0003507144800001991
针对分析的每个批次的用过培养基中的CCL11水平相对于天数的散布图提供于图104中，并且箱形图提供于105中。线性回归模型提供于图106中。散布图显示，对于分析的每个批次，用过培养基中的CCL11水平在21天的过程内线性增加。箱形图表明，在批次之间用过培养基中CCL11水平的变异性随着培养所花费时间增加而增加，这也通过随时间渐增的标准偏差值示出于表24中。变异性在第5-9天最低。来自回归分析的经调整的R2值表明培养所花费时间解释了CCL11水平的变异性的51.2％。
批次MFG-053和批次MFG-054
在批次-053(1、3和5)和批次-054(1-8)的强制降解处理过程中用过培养基中的CCL11水平呈现于表24中，并且数据的散布图提供于图107中。散布图含有来自对照样品分析的平均CCL11结果(参见表23)的图。将小于LOD的结果绘制在LOD下。
表24：强制降解研究-批次MFG-053中的CCL11水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800002001
批次MFC-066
在批次-066(4-7)的强制降解处理过程中用过培养基中的CCL11水平呈现于表25中，并且数据的散布图提供于图108中。将小于LOD的结果绘制在LOD下。
表25：强制降解研究-批次MFG-066中的CCL11水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800002011
LOD＝9.7pg/mL。
骨调素(OPN)
骨调素(OPN)是由SPP1基因编码并且在胸腺应激期间增加的细胞因子。增加的水平与胸腺萎缩(胸腺细胞数量的减少)相关联，所述胸腺萎缩是培养的胸腺的希望状态(Wang 2009；Gridley 2013)。OPN是产生皮质类固醇所需的，已经充分确立皮质类固醇诱导胸腺细胞凋亡。
在21天培养过程中OPN的表征
在21天的过程内培养基中OPN水平的描述性统计呈现于表26中。包括了来自强制降解研究的对照样品(批次MFG-053、MFG-054和MFG-066)的数据以及来自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036和MFG-038的结果。
表26：在21天内用过培养基中OPN水平的描述性统计
Figure BDA0003507144800002021
针对分析的每个批次的用过培养基中的OPN水平相对于天数的散布图提供于图109中，并且箱形图提供于图110中。二次回归模型提供于图111中。散布图显示，对于分析的每个批次，用过培养基中的OPN水平在21天的过程内增加。箱形图表明，在批次之间用过培养基中OPN水平的变异性未随着培养所花费时间增加显示出趋势。来自回归分析的经调整的R2值表明培养所花费时间解释了OPN水平的变异性的19.3％。
强制降解样品中OPN水平的表征。
批次MFG-053和批次MFG-054。
在批次-053(1、3和5)和批次-054(1-8)的强制降解处理过程中用过培养基中的OPN水平呈现于表27中，并且数据的散布图提供于图112中。散布图含有来自对照样品分析的平均OPN结果(参见表26)的图。将小于LOD的结果绘制在LOD下
表27：强制降解研究-批次MFG-053中的OPN水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800002031
批次MFG-066
在批次-066(4-7)的强制降解处理过程中用过培养基中的OPN水平呈现于表中，并且数据的散布图提供于图113中。散布图含有来自对照样品分析的平均OPN结果(参见表)的图。将小于LOD的结果绘制在LOD下。
表28：强制降解研究-批次MFG-066中的OPN水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800002041
CXCL12(SDF-1a)
已经证明CXCL12(SDF-1a)由被膜下皮质和髓质TE产生(Bunting 2011；Hernandez-Lopez 2002；Zaitseva 2002)，但也可以由胸腺内存在的胸腺成纤维细胞和内皮细胞产生。已经显示CXCL12将B细胞和抗原呈递细胞(APC)募集至胸腺(Weiss 2003)，预期这对于产生完全的胸腺功能是重要的。它还参与胸腺细胞亚群在胸腺内的定位，并且它增强针对IL-7的胸腺细胞增殖(Hernandez-Lopez 2002)。值得注意的是，已经显示中和CXCL12的抗体减少体外人胸腺器官培养物中的胸腺生成，并且添加CXCL12增加这些培养物中的胸腺生成(Hernandez-Lopez 2002)。
在21天培养过程中CXCL12的表征
在21天的过程内培养基中CXCL12水平的描述性统计呈现于表29中。包括了来自强制降解研究的对照样品(批次MFG-053、MFG-054和MFG-066)的数据以及来自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036和MFG-038的结果。
表29：在21天内用过培养基中CXCL12水平的描述性统计
Figure BDA0003507144800002051
针对分析的每个批次的用过培养基中的CXCL12水平相对于天数的散布图提供于图114中，并且箱形图提供于图115中。三次回归模型提供于图116中。散布图显示，对于分析的每个批次，用过培养基中的CXCL12水平在21天的过程内增加。箱形图表明，总的来说，在批次之间用过培养基中CXCL12水平的变异性随着培养所花费时间增加而增加。变异性在第5-13天最低。来自回归分析的经调整的R2值表明培养所花费时间解释了CXCL12水平的变异性的44.5％强制降解样品中CXCL12水平的表征
批次MFG-053和批次MFG-054
在批次-053(1、3和5)和批次-054(1-8)的强制降解处理过程中用过培养基中的CXCL12水平呈现于表30中，并且数据的散布图提供于图117中。散布图含有来自对照样品分析的平均CXCL12结果(参见表29)的图。将小于LOD的结果绘制在LOD下。
表30：强制降解研究-批次MFG-053和批次MFG-054中的CXCL12水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800002061
批次MFG-066。
在批次-066(4-7)的强制降解处理过程中用过培养基中的CXCL12水平呈现于表31中，并且数据的散布图提供于图118中。散布图含有来自对照样品分析的平均CXCL12结果(参见表29)的图。将小于LOD的结果绘制在LOD下。
表31：强制降解研究-批次MFG-066中的CXCL12水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800002071
CCL20(MIP-3a)。
CCL20(MIP-3a)是其模式与对于胸腺细胞假设的模式一致的趋化因子。
在21天培养过程中CCL20的表征
在21天的过程内培养基中CCL20水平的描述性统计呈现于表32中包括了来自强制降解研究的对照样品(批次MFG-053、MFG-054和MFG-066)的数据以及来自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036和MFG-038的结果。
表32：在21天内用过培养基中CCL20水平的描述性统计
Figure BDA0003507144800002081
针对分析的每个批次的用过培养基中的CCL20水平相对于天数的散布图提供于图119中，并且箱形图提供于图120中。三次回归模型提供于图121中散布图显示，对于分析的每个批次，用过培养基中的CCL20水平在21天的过程内未显示出一致趋势。箱形图表明，总的来说，在批次之间用过培养基中CCL20水平的变异性增加至第9天，然后降低。来自回归分析的经调整的R2值表明培养所花费时间解释了CCL20水平的变异性的12.4％。
强制降解样品中CCL20水平的表征
批次MFG-053和批次MFG-054。
在批次-053(1、3和5)和批次-054(1-8)的强制降解处理过程中用过培养基中的CCL20水平呈现于表33中，并且数据的散布图提供于图122中。散布图含有来自对照样品分析的平均CCL20结果(表32)的图。将小于LOD的结果绘制在LOD下。
表33：强制降解研究-批次MFG-053和批次MFG-054中的CCL20水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800002091
批次MFG-066
在批次-066(4-7)的强制降解处理过程中用过培养基中的CCL20水平呈现于表34中，并且数据的散布图提供于图123中。
表34：强制降解研究-批次MFG-066中的CCL20水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800002092
Figure BDA0003507144800002101
IL-16。
IL-16是已知由淋巴细胞产生的细胞因子。
在21天培养过程中IL-16的表征。
在21天的过程内培养基中IL-16水平的描述性统计呈现于表35中。包括了来自强制降解研究的对照样品(批次MFG-053、MFG-054和MFG-066)的数据以及来自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036和MFG-038的结果。
表35：在21天内用过培养基中IL-16水平的描述性统计。
Figure BDA0003507144800002102
Figure BDA0003507144800002111
针对分析的每个批次的用过培养基中的IL-16水平相对于天数的散布图提供于图124中，并且箱形图提供于图125中。拟合线图(二次回归模型)提供于图126这中。散布图显示，对于分析的每个批次，用过培养基中的IL-16水平在21天的过程内降低。箱形图表明，总的来说，在批次之间用过培养基中IL-16水平的变异性随着培养所花费时间增加并且随着IL-16水平接近零而降低。来自回归分析的经调整的R2值表明培养所花费时间解释了IL-16水平的变异性的57.3％。
强制降解样品中IL-16水平的表征
批次MFG-053和批次-MFG-054。
在批次-053(1、3和5)和批次-054(1-8)的强制降解处理过程中用过培养基中的IL-16水平呈现于表36中，并且数据的散布图提供于图127中。散布图含有来自对照样品分析的平均IL-16结果(参见表35)的图。
表36：强制降解研究-批次MFG-053和批次MFG-054中的IL-16水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800002121
批次MFG-066。
在批次-066(4-7)的强制降解处理过程中用过培养基中的IL-16水平呈现于表37中，并且数据的散布图提供于图128中。散布图含有来自对照样品分析的平均IL-16结果(参见表36的图。将小于LOD的结果绘制在LOD下。
IGFBP-1
已知IGFBP2-6由不表达IGFBP-1的胸腺上皮表达(Gosteli-Peter 1994；Ketcha1999)
在21天培养过程中IGFBP-1的表征。
在21天的过程内培养基中IGFBP-1水平的描述性统计呈现于表37中。包括了来自强制降解研究的对照样品(批次MFG-053、MFG-054和MFG-066)的数据以及来自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036和MFG-038的结果。
表37：在21天内用过培养基中IGFBP-1水平的描述性统计
Figure BDA0003507144800002131
针对分析的每个批次的用过培养基中的IGFBP-1水平相对于天数的散布图提供于图129中，并且箱形图提供于图130中。三次回归模型提供于图131中。散布图显示，对于分析的每个批次，用过培养基中的IGFBP-1水平在21天的过程内增加。箱形图表明，总的来说，在批次之间用过培养基中IGFBP-1水平的变异性随着培养所花费时间增加并且随着IGFBP-1水平接近零而降低。来自回归分析的经调整的R2值表明培养所花费时间解释了IGFBP-1水平的变异性的61.2％
强制降解样品中IGFBP-1水平的表征。
批次MFG-053和批次MFG-054。
在批次-053(1、3和5)的强制降解处理过程中用过培养基中的IGFBP-1水平呈现于表38中，并且数据的散布图提供于图132中。散布图含有来自对照样品分析的平均IGFBP-1结果(参见表37)的图。将小于LOD的结果绘制在LOD下。
表38：强制降解研究-批次MFG-053和批次MFG-054中的IGFBP-1水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800002141
批次MFG-066。
在批次-066(4-7)的强制降解处理过程中用过培养基中的IGFBP-1水平呈现于表39中，并且数据的散布图提供于图133中。散布图含有来自对照样品分析的平均IGFBP-1结果(参见表38)的图。将小于LOD的结果绘制在LOD下。
表39：强制降解研究-批次MFG-066中的IGFBP-1水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800002142
Figure BDA0003507144800002151
MIF。
MIF是其模式与对于胸腺细胞假设的模式一致的趋化因子。
在21天培养过程中MIF的表征。
在21天的过程内培养基中MIF水平的描述性统计呈现于表40中。包括了来自强制降解研究的对照样品(批次MFG-053、MFG-054和MFG-066)的数据以及来自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036和MFG-038的结果
表40：在21天内用过培养基中MIF水平的描述性统计
Figure BDA0003507144800002152
Figure BDA0003507144800002161
针对分析的每个批次的用过培养基中的MIF水平相对于天数的散布图提供于图134中，并且箱形图提供于图135中。线性回归模型提供于图136中。散布图显示，对于分析的每个批次，用过培养基中的MIF水平在21天的过程内降低。箱形图表明，总的来说，在批次之间用过培养基中MIF水平的变异性随着培养所花费时间增加并且随着MIF水平接近零而降低。来自回归分析的经调整的R2值表明培养所花费时间解释了MIF水平的变异性的49.2％。
在批次-053(1、3和5)和批次-054(1-8)的强制降解处理过程中用过培养基中的MIF水平呈现于表41中，并且数据的散布图提供于图137中。散布图含有来自对照样品分析的平均MIF结果(参见表36)的图。未绘制大于ULOQ的结果。
表41：强制降解-批次-053和批次-054中的MIFF水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800002162
Figure BDA0003507144800002171
批次MFG-066。
在批次-066(4-7)的强制降解处理过程中用过培养基中的MIF水平呈现于表42中，并且数据的散布图提供于图138中。散布图含有来自对照样品分析的平均MIF结果(参见表41)的图。未绘制大于ULOQ的结果。
表42：强制降解研究-批次MFG-066中的MIF水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800002172
Figure BDA0003507144800002181
CCL25(TECK)。
CCL25(TECK)是已经显示为胸腺细胞趋向性的趋化因子趋化因子(Liu 2005)。已知它由胸腺树突状细胞以及FoxN1+和FoxN1-TE两者细胞表达(Bunting 2011)；然而，基于对小鼠的研究，其活性显现为对胸腺发育并不至关重要，在所述小鼠中，此趋化因子的唯一受体CCR9被删除(Wurbel 2001)。
在21天培养过程中CCL25的表征。
在21天的过程内培养基中CCL25水平的描述性统计呈现于表43中。包括了来自强制降解研究的对照样品(批次MFG-053、MFG-054和MFG-066)的数据以及来自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036和MFG-038的结果。
表43：在21天内用过培养基中CCL25水平的描述性统计
Figure BDA0003507144800002182
Figure BDA0003507144800002191
针对分析的每个批次的用过培养基中的CCL25水平相对于天数的散布图提供于图139中，并且箱形图提供于图140中。线性回归模型提供于图141中。散布图显示，对于分析的每个批次，用过培养基中的CCL25水平在21天的过程内增加。箱形图表明，总的来说，在批次之间用过培养基中CCL25水平的变异性随着培养所花费时间增加而增加。来自回归分析的经调整的R2值表明培养所花费时间解释了CCL25水平的变异性的49.2％。
强制降解样品中CCL25水平的表征。
批次MFG-053和批次MFG-054。
在批次-053(1、3和5)和批次-054(1-8)的强制降解处理过程中用过培养基中的CCL25水平呈现于表44中，并且数据的散布图提供于142中。散布图含有来自对照样品分析的平均CCL25结果(参见表43)的图。将小于LOD的结果绘制在LOD下。
表44：强制降解研究-批次MFG-053和批次MFG-054中的CCL25水平(pg/mL)
Figure BDA0003507144800002192
Figure BDA0003507144800002201
批次MFG-066。
在批次-066(4-7)的强制降解处理过程中用过培养基中的CCL25水平呈现于表45中，并且数据的散布图提供于图143中。散布图含有来自对照样品分析的平均CCL25结果(参见表44)的图。将小于LOD的结果绘制在LOD下。
表45：强制降解研究-批次MFG-66中的CCL25水平(pg/mL)。
Figure BDA0003507144800002202
Figure BDA0003507144800002211
附录
附录1：
表46. 21天培养表征的生物标志物数据。批次MFG-025数据
Figure BDA0003507144800002212
表47. 21天培养表征的生物标志物数据。批次MFG-026数据。
Figure BDA0003507144800002213
Figure BDA0003507144800002221
表48. 21天培养表征的生物标志物数据。批次MFG-027数据。
Figure BDA0003507144800002222
表49. 21天培养表征的生物标志物数据。批次MFG-035数据。
Figure BDA0003507144800002231
表50. 21天培养表征的生物标志物数据。批次MFG-036数据。
Figure BDA0003507144800002232
Figure BDA0003507144800002241
表51. 21天培养表征的生物标志物数据。批次MFG-038数据。
Figure BDA0003507144800002242
前述实施方式和优点仅是示例性的，并且不应被解释为限制本发明。本教导内容可以容易地应用于其他类型的设备、实验和手术程序。另外，本发明的实施方式的描述旨在是说明性的而非限制权利要求的范围。对于本领域技术人员而言，许多替代方案、修改和变化将是显而易见的。
应理解，虽然已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。
本申请中讨论的参考文献，出于其预期目的通过引用整体并入本文，基于其上下文是清楚的。
本文所引用的所有专利、专利申请和出版物特此通过引用整体并入。这些出版物的公开特此通过引用整体并入本申请中。
本文所引用的每一篇专利、专利申请和出版物的公开特此通过引用整体并入本文。
虽然已经参照各种实施方式公开了本公开，但是本领域其他技术人员可以在不偏离本公开的真实精神以及范围的情况下设想其他实施方式和这些实施方式的变型。所附权利要求旨在理解为包括所有此类实施方式和等效变型。
前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施实施方式。前述描述和实施例详述了某些实施方式并且描述了由诸位发明人设想的最佳模式。然而，应当理解，无论前述内容在文本中的详细程度如何，实施方式可以以多种方式实践，并且应该根据所附权利要求及其任何等同物来解释。
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缩写
AIRE：自身免疫调控基因。
Ab：抗体。
Ag：抗原。
ALCAM，激活的白细胞粘附分子。
ANG-1，促血管生成素1。
APC：抗原呈递细胞。
ATG：胸腺球蛋白。
BCMA，B-细胞成熟抗原/肿瘤坏死因子受体超家族成员17(TNFRSF17)。
b.i.d.：每日两次。
BMI：体重指数。
BSA：体表面积。
BSC：生物安全柜。
CCL11，嗜酸性粒细胞趋化因子。
CCL20，趋化因子(C-C基序)配体20；MIP-3a。
CCL21/6Ckine，趋化因子(C-C基序)配体21。
cDGA：完全DiGeorge异常。
CEACAM-1，癌胚抗原相关细胞粘附分子1。
CFR：联邦法规代码。
cGMP：现行良好生产规范。
CK：细胞角蛋白。
CNI：钙调神经磷酸酶抑制剂。
CTACK、CCL27、C-C基序趋化因子配体27。
CTT：同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品。
CVVHD/F：连续的静脉-静脉血液透析滤过。
CXCL12/SDFF-1a，基质细胞衍生因子1。
CXCL16，趋化因子配体16。
DC：树突状细胞。
DSA：供体特异性抗体。
DGF：延迟的移植功能。
DKK-1，Dickkopf相关蛋白1。
DMSO：二甲基亚砜。
EBV：爱泼斯坦-巴尔病毒。
EGF R，表皮生长因子受体。
EU：内毒素单位。
FBS：胎牛血清。
FDA：食品和药物管理局。
FSGS：局灶性节段性肾小球硬化病。
半乳凝素-7。
GAPDH：甘油醛3-磷酸脱氢酶。
GCP-2，粒细胞趋化蛋白-2(或C-X-C基序趋化因子配体6)。
GDF-15，生长分化因子-15。
GDNF，胶质细胞系来源的神经营养因子。
H&E：苏木精和曙红。
HD：血液透析。
HEPES：N-2-羟乙基哌嗪N’-2-乙烷磺酸。
HI：HI–热失活。
HIP：腹膜内。
HIV：人类免疫缺陷病毒。
HVEM，疱疹病毒进入介体。
ICAM-1，细胞间粘附分子1，CD54.
ICAM-3，细胞间粘附分子3。
IBW：理想体重。
IDDM：胰岛素依赖性糖尿病。
IGFBP-1，胰岛素系生长因子结合蛋白1。
IGFBP-6，胰岛素样生长因子结合蛋白6。
IL-1b，白介素1β。
IL-2Ra，白介素-2受体α链。
IL-2Rg，白介素2受体γ亚基。
IL-12p40，白介素-12β亚基。
IL-16，白介素-16前体。
ISHLT：国际心肺移植学会。
ISO：国际标准化组织。
LAL：鲎变形细胞裂解物。
LIGHT，激活T细胞和未成熟DC上表达的TNF超家族成员。
LOD：检测下限。
M-CSF，巨噬细胞集落刺激因子。
MC3：马库斯细胞治疗中心。
mAb：单克隆抗体。
MHC：主要组织相容性复合物。
MICA，MHC I类多肽相关序列A。
MIF，巨噬细胞迁移抑制因子。
MIP-3b，巨噬细胞炎症蛋白-3β(CCL 19，趋化因子配体19)。
MIP-1b，巨噬细胞炎症蛋白-1β。
MST：平均存活时间。
NRGi-B1，神经调节素。
OPN，骨调素
PBMC：外周血单核细胞。
PBS：磷酸盐缓冲盐水。
PDGF-AA，血小板来源生长因子AA。
PECAM-1，血小板内皮细胞粘附分子-1(CD31)。
PF4，血小板因子4。
PIGF，磷脂酰肌醇-聚糖生物合成F类蛋白。
POD：术后天数。
PRA：面板反应性抗体。
RANTES，激活后调节的正常T细胞表达和推测分泌因子。
SCF R，干细胞因子受体。
SL：舌下。
TBW：总体重。
TC：组织培养。
Tfh：T滤泡辅助细胞。
TOM：胸腺器官培养基。
uPAR(CD87)，尿激酶型纤溶酶原激活物受体。
USP：美国药典。
ULOQ：定量上限。
USP：美国药典。

Claims (126)

1.一种产生适于植入至人中的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的方法，所述方法包括以下步骤：对供体胸腺进行调理方案持续约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；所述方法还包括在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中CCL21的增加水平；以及回收所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片以作为适于植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其还包括将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品冷冻保存在液氮中以供将来植入的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其还包括在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中L-选择素的降低水平。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，所述方法包括在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中M-CSF、半乳凝素-7或IL-16中的一种或多种的降低水平。
5.根据权利要求4所述的方法，其中M-CSF在所述调理方案的过程期间在所述胸腺器官培养基中降低。
6.根据权利要求4所述的方法，其中半乳凝素-7在所述调理方案的过程期间在所述胸腺器官培养基中降低。
7.根据权利要求4所述的方法，其中IL-16在所述调理方案的过程期间在所述胸腺器官培养基中降低。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其还包括在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中CXCL12、CXCL16或CCL11中的一种或多种的增加水平。
9.根据权利要求8所述的方法，其中CXCL12在所述调理方案的过程期间在所述胸腺器官培养基中增加。
10.根据权利要求8所述的方法，其中CXCL16在所述调理方案的过程期间在所述胸腺器官培养基中增加。
11.根据权利要求8所述的方法，其中CCL11在所述调理方案的过程期间在所述胸腺器官培养基中增加。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述调理方案持续六天、或七天、或八天、或九天、或10天、或11天、或12天、或13天、或14天、或15天、或16天、或17天、或18天或19天、或20天、或21天的时段；或持续5-6天、或5-7天、或5-8天、或5-9天、或5-10天、或6至7天、或6至8天、或6至9天、或6至10天、或6至11天、或6至12天、或6至21天、或7至21天、或8至21天、或9至21天、或10至21天、或11至21天、或12至21天、13至21天或14至21天、或15至21天、或16至21天或17至21天或18至21天、或19至21天、或20至21天的时段。
13.根据权利要求8所述的方法，其中CCL21的水平近似图50E中的所述水平。
14.根据权利要求8所述的方法，其中L-选择素的水平近似图50A中的所述水平。
15.根据权利要求8所述的方法，其中M-CSF的水平近似图50B中的所述水平。
16.根据权利要求8所述的方法，其中半乳凝素-7的水平近似图50C中的所述水平。
17.根据权利要求8所述的方法，其中IL-16的水平近似图50D中的所述水平。
18.根据权利要求8所述的方法，其中CXCL16的水平近似图50F中的所述水平。
19.根据权利要求8所述的方法，其中CCL11的水平近似图50G中的所述水平。
20.根据权利要求8所述的方法，其中CXL21的水平近似图50H中的所述水平。
21.一种产生适于植入至人中的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的方法，所述方法包括以下步骤：对供体胸腺进行调理方案持续约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；所述方法还包括在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCFR、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1；以及回收所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片以作为适于植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：在所述调理方案期间在所述供体胸腺组织切片中确定散布在整个所述供体胸腺组织切片中的对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域、至少一个哈索尔小体的存在、散布在整个所述供体胸腺组织切片中的CK14染色以及完整核的存在。
23.一种用于确定同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是否适于植入至人中的方法，所述方法包括以下步骤：将供体胸腺组织切片在胸腺器官培养基中调理约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；以及在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1。
24.根据权利要求24所述的方法，其中所述至少一种标志物选自L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16和CCL11。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述至少一种标志物是L-选择素。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述胸腺器官培养基中L-选择素的水平在所述调理方案的过程期间降低。
27.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述至少一种标志物是M-CSF。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述胸腺器官培养基中M-CSF的水平在所述调理方案的过程期间降低。
29.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述至少一种标志物是半乳凝素-7。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述胸腺器官培养基中半乳凝素-7的水平在所述调理方案的过程期间降低。
31.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述至少一种标志物是IL-16。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述胸腺器官培养基中IL-16的水平在所述调理方案的过程期间降低。
33.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述至少一种标志物是CCL21。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述胸腺器官培养基中CCL21的水平在所述调理方案的过程期间增加。
35.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述至少一种标志物是CXCL12。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述胸腺器官培养基中CXCL12的水平在所述调理方案的过程期间增加。
37.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述至少一种标志物是CXCL16。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述胸腺器官培养基中CXCL16的水平在所述调理方案的过程期间增加。
39.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述至少一种标志物是CCL11。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述胸腺器官培养基中CCL11的水平在所述调理方案的过程期间增加。
41.根据前述权利要求23至40中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：在所述调理方案期间在所述供体胸腺组织切片中确定散布在整个所述供体胸腺组织切片中的对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域、至少一个哈索尔小体的存在、散布在整个所述供体胸腺组织切片中的CK14染色以及完整核的存在。
42.一种用于确定同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是否适于植入至人中的方法，所述方法包括以下步骤：将供体胸腺组织切片在胸腺器官培养基中调理约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；以及在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自图56中的所述标志物的至少一种标志物的水平。
43.一种用于确定同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是否适于植入至人中的方法，所述方法包括以下步骤：将供体胸腺组织切片在胸腺器官培养基中调理约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；以及在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1。
44.根据权利要求23至43中任一项所述的方法，其中在所述培养方案期间检测所述胸腺器官培养基中至少一种标志物的水平，或者在所述调理方案期间检测所述胸腺器官培养基中的至少两种、或至少三种、或至少四种、或至少五种、或至少六种、或至少七种、或至少八种标志物选自L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16和CCL11
45.一种在受试者中治疗胸腺障碍的方法，所述改善包括向患有胸腺障碍的所述受试者中植入同种异体培养的出生后胸腺组织来源切片，在胸腺器官培养基中对所述切片进行调理方案持续约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；以及在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述至少一种标志物选自L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16和CCL11。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述至少一种标志物是L-选择素。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述胸腺器官培养基中L-选择素的水平在所述调理方案的过程期间降低。
49.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述至少一种标志物是M-CSF。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述胸腺器官培养基中M-CSF的水平在所述调理方案的过程期间降低。
51.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述至少一种标志物是半乳凝素-7。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述胸腺器官培养基中半乳凝素-7的水平在所述调理方案的过程期间降低。
53.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述至少一种标志物是IL-16。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述胸腺器官培养基中IL-16的水平在所述调理方案的过程期间降低。
55.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述至少一种标志物是CCL21。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述胸腺器官培养基中CCL21的水平在所述调理方案的过程期间增加。
57.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述至少一种标志物是CXCL12。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述胸腺器官培养基中CXCL12的水平在所述调理方案的过程期间增加。
59.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述至少一种标志物是CXCL16。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述胸腺器官培养基中CXCL16的水平在所述调理方案的过程期间增加。
61.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述至少一种标志物是CCL11。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述胸腺器官培养基中CCL11的水平在所述调理方案的过程期间增加。
63.根据前述权利要求45至62中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：在所述调理方案期间在所述供体胸腺组织切片中确定散布在整个所述供体胸腺组织切片中的对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域、至少一个哈索尔小体的存在、散布在整个所述供体胸腺组织切片中的CK14染色以及完整核的存在。
64.根据权利要求45至63中任一项所述的方法，其中所述胸腺障碍是与完全DiGeorge综合征相关联的先天性无胸腺症。
65.根据权利要求45至63中任一项所述的方法，其中所述胸腺障碍是与22q11.2缺失相关联的先天性无胸腺症。
66.根据权利要求45至63中任一项所述的方法，其中所述胸腺障碍是与CHARGE(缺损、心脏缺陷、鼻后孔闭锁、生长或智力迟钝、生殖器发育不全和耳朵异常或耳聋)相关联的先天性胸腺症。
67.根据权利要求45至63中任一项所述的方法，其中所述胸腺障碍是与chd7(染色质结构域-解旋酶-DNA结合蛋白7)基因中的突变相关联的先天性无胸腺症。
68.根据权利要求45至63中任一项所述的方法，其中所述胸腺障碍是与叉头盒蛋白N1(FOXN1)缺乏相关联的先天性无胸腺症。
69.根据权利要求45至63中任一项所述的方法，其中所述胸腺障碍是与TBX-1或TBX-2基因中的突变相关联的先天性无胸腺症。
70.根据权利要求45至63中任一项所述的方法，其中所述胸腺障碍是年龄相关胸腺退化。
71.根据权利要求45至63中任一项所述的方法，其中所述胸腺障碍与胸腺瘤相关联。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述胸腺瘤是恶性的。
73.根据权利要求71所述的方法，其中所述胸腺瘤是非恶性的。
74.根据权利要求45至63中任一项所述的方法，其中所述胸腺障碍与重症肌无力(MG)、纯红细胞再生障碍和低丙球蛋白血症相关联。
75.一种用于在人受试者中提供免疫能力的方法，所述改善包括以下步骤：将供体胸腺组织切片在胸腺器官培养基中调理约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自来自以下的标志物的至少一种标志物的水平：标志物L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGFR、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1；以及将所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片植入至所述人受试者中。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述至少一种标志物选自L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中如果所述标志物是L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7或IL-1，则所述水平是降低的，或者如果所述标志物是CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，则所述水平是增加的；以及将所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片植入至所述人受试者中。
77.一种用于在经历实体器官移植物的人受试者中提供免疫能力的方法，所述方法包括以下步骤：移除所述人受试者的胸腺；从与所述实体器官中的HLA-I类和HLA-II类等位基因匹配的供体获得胸腺组织；将所述供体胸腺切片；将所述供体胸腺组织切片在胸腺器官培养基中调理约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：标志物L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1；植入所述实体器官；以及将所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片植入至所述人受试者中。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述至少一种标志物选自L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中如果所述标志物是L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7或IL-1，则所述水平是降低的，或者如果所述标志物是CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，则所述水平是增加的；植入所述实体器官；以及将所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片植入至所述人受试者中。
79.一种用于在经历实体器官移植物的人受试者中提供免疫能力的方法，所述方法包括以下步骤：移除所述人受试者的胸腺；从与所述实体器官中的HLA-I类和HLA-II类等位基因匹配的供体获得胸腺组织；将所述供体胸腺切片；将所述供体胸腺组织切片在胸腺器官培养基中调理约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：标志物L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1；植入所述实体器官；以及将所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片植入至所述人受试者中。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述至少一种标志物选自L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中如果所述标志物是L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7或IL-1，则所述水平是降低的，或者如果所述标志物是CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，则所述水平是增加的；植入所述实体器官；以及将所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片植入至所述人受试者中。
81.一种在需要实体器官移植的接受者中促进对获自死亡供体的同种异体实体器官移植物的供体特异性耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)移除所述接受者的胸腺；
(b)用包括一种或多种免疫抑制剂的诱导免疫抑制方案治疗所述接受者，以耗尽所述接受者的T细胞和/或抑制所述接受者的T细胞排斥所移植的实体器官；
(c)提供来自死亡供体的合适的实体人体器官和胸腺；
(d)将所述实体人体器官移植至所述接受者中；
(e)用维持性免疫抑制方案治疗所述接受者；
(f)提供同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，其中对所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在胸腺器官培养基中进行调理方案持续约6天至约21天的时段，以产生同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品切片；进一步，其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在所述胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：标志物L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1；以及
(g)在调理方案的至多21天后，将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品植入至所述接受者中，其中胸腺组织切片的剂量为约1000-22000mm2胸腺组织表面积/m2接受者体表面积，并且进一步地，其中所述植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述接受者中诱导胸腺生成和耐受性。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述至少一种标志物选自所述胸腺器官培养基中的L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中如果所述标志物是L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7或IL-1，则所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平是降低的，或者如果所述标志物是CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，则所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平是增加的；以及
(g)在调理方案的至多21天后，将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品植入至所述接受者中，其中胸腺组织切片的剂量为约1000-22000mm2胸腺组织表面积/m2接受者体表面积，并且进一步地，其中所述植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述接受者中诱导胸腺生成和耐受性。
83.一种用于在需要实体器官移植的人接受者中促进对获自活人供体的同种异体实体器官移植物的供体特异性耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)移除所述接受者的胸腺；
(b)用包括一种或多种免疫抑制剂的诱导免疫抑制方案治疗所述接受者，以耗尽所述接受者的T细胞和/或抑制所述接受者的T细胞排斥所移植的实体器官；
(c)提供来自活人供体的合适的实体器官；
(d)将所述实体器官移植至所述接受者中；
(e)用维持性免疫抑制方案治疗所述接受者；
(f)提供保持在冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品库中的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是由来自胸腺供体的胸腺组织处理的，所述胸腺供体表达所述实体器官移植物中不存在的与所述接受者中的HLA-I类和HLA-II类等位基因匹配的HLA等位基因；其中对所述供体胸腺组织进行调理方案持续约6天至约21天的时段；进一步，其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的胸腺组织切片；在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：所述胸腺器官培养基中的标志物L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1；其中所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平根据图7中所述标志物的水平增加或降低；
(g)解冻所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；以及
(h)将所解冻的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品植入至所述接受者中，其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的剂量为约1000-22000mm2胸腺组织表面积/m2接受者体表面积，并且进一步地，其中所述植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述接受者中诱导胸腺生成和耐受性。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述至少一种标志物选自所述胸腺器官培养基中的L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中如果所述标志物是L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7或IL-1，则所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平是降低的，或者如果所述标志物是CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，则所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平是增加的；
(g)解冻所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；以及
(h)将所解冻的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品植入至所述接受者中，其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的剂量为约1000-22000mm2胸腺组织表面积/m2接受者体表面积，并且进一步地，其中所述植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述接受者中诱导胸腺生成和耐受性。
85.根据权利要求83或84所述的方法，其中HLA匹配允许第二场中所述等位基因的氨基酸序列的微小变化。
86.根据83或84所述的方法，其中HLA匹配允许所述第二场中HLA-DP等位基因的错配。
87.根据权利要求83或84所述的方法，其中将约一半的所解冻的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品移植至所述接受者中并且将其余部分冷冻保存以供将来使用。
88.根据权利要求83或84所述的方法，其中在移植所述实体器官后约一个月或更长时间进行步骤(h)。
89.一种用于在需要实体器官移植的人接受者中促进对获自死亡人供体的同种异体实体器官移植物的供体特异性耐受性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)移除所述接受者的胸腺；
(b)用包括一种或多种免疫抑制剂的诱导免疫抑制方案治疗所述接受者，以耗尽所述接受者的T细胞和/或抑制所述接受者的T细胞排斥所移植的实体器官；
(c)提供来自活人供体的合适的实体器官；
(d)将所述实体器官移植至所述接受者中；
(e)用维持性免疫抑制方案治疗所述接受者；
(f)提供保持在冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品库中的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是由来自胸腺供体的胸腺组织处理的，所述胸腺供体表达所述实体器官移植物中不存在的与所述接受者中的HLA等位基因匹配的HLA等位基因；其中对所述供体胸腺组织进行调理方案持续约6天至约21天的时段；进一步，其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的胸腺组织切片，在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：标志物L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1；其中所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平根据图56中的所述水平增加或降低；
(g)解冻所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；以及
(h)将所解冻的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品植入至所述接受者中，其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的剂量为约1000-22000mm2胸腺组织表面积/m2接受者体表面积，并且进一步地，其中所述植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述接受者中诱导胸腺生成和耐受性。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述至少一种标志物选自所述胸腺器官培养基中的L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中如果所述标志物是L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7或IL-1，则所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平是降低的，或者如果所述标志物是CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，则所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平是增加的；
(g)解冻所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；以及
(h)将所解冻的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品植入至所述接受者中，其中所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品的剂量为约1000-22000mm2胸腺组织表面积/m2接受者体表面积，并且进一步地，其中所述植入的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在所述接受者中诱导胸腺生成和耐受性。
91.一种冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，其通过包括以下步骤的方法制备：
(a)从供体获得合适的胸腺组织；
(b)对以下HLA等位基因进行分型：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB 1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DPB1、HLA-DPA1；
(c)对所述胸腺组织进行调理方案持续约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；
(d)在所述调理方案的过程期间检测所述胸腺器官培养基中选自以下的至少一种标志物的水平：标志物L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1；其中所述胸腺器官培养基中所述标志物的水平根据图7中的所述水平增加或降低；
(e)收回所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片以作为同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；
(f)将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在液氮中冷冻保存；以及
(g)将液氮中的所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品保持在冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品库中。
92.根据权利要求91所述的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，其中所述至少一种标志物选自L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7或IL-1，或者如果所述标志物是CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，则是增加的；
(e)收回所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片以作为同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；
(f)将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在液氮中冷冻保存；以及
(g)将液氮中的所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品保持在冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品库中。
93.根据权利要求77-89中任一项所述的方法，其中所述实体器官移植物是心脏移植物、肾脏移植物、肝脏移植物、肺移植物、心脏/肺移植物、胰腺移植物、肠移植物、胃移植物、腹壁移植物、颅面移植物、头皮移植物、阴茎移植物、子宫移植物、单侧或双侧上肢移植物、单侧血管化复合同种异体移植物或其组合。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述实体器官移植物是心脏移植物。
95.根据权利要求93所述的方法，其中所述心脏移植物是小儿心脏移植物。
96.根据权利要求93所述的方法，其中所述心脏移植物是成人心脏移植物。
97.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调理方案是5天。
98.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调理方案是6天。
99.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调理方案是7天。
100.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调理方案是8天。
101.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调理方案是9天。
102.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调理方案是10天。
103.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调理方案是11天。
104.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调理方案是12天。
105.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调理方案是13天。
106.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调理方案是14天。
107.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调理方案是15天。
108.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调理方案是16天。
109.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调理方案是17天。
110.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调理方案是18天。
111.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调理方案是19天。
112.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调理方案是20天。
113.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述调理方案是21天。
114.一种适于植入至人中的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，其包括以下步骤：
(a)从人供体获得合适的胸腺组织；
(b)对所述胸腺组织进行调理方案持续约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的胸腺组织切片；其中所述胸腺器官培养基中L-选择素和/或M-CSF和/或半乳凝素-7和/或IL-16的水平在所述调理方案的过程期间降低；进一步，其中所述胸腺器官培养基中CCL21和/或CXCL12和/或CXCL16和/或CCL11的水平在所述调理方案的过程期间增加；
(c)收获所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片以作为同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；
(d)将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在液氮中冷冻保存；以及
(e)将液氮中的所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品保持在冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品库中。
115.一种适于植入至人中的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，其包括以下步骤：
(a)从人供体获得合适的胸腺组织；
(b)对所述胸腺组织进行调理方案持续约6天至约21天的时段；其中用于所述供体胸腺组织的所述调理方案包括在胸腺器官培养基中对所述供体胸腺组织进行无菌处理以产生部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片；其中所述胸腺器官培养基中L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCFR、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1的水平在所述调理方案的过程期间根据图56中的所述水平增加或降低；
(c)收获所述部分T细胞耗尽的供体胸腺组织切片以作为同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品；
(d)将所述同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品在液氮中冷冻保存；以及
(e)将液氮中的所述冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品保持在冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品库中。
116.根据权利要求114或115所述的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品，其中所述胸腺器官培养基中CCL21的水平在所述调理方案的过程期间增加。
117.根据权利要求114至116所述的冷冻保存的同种异体冷冻保存的培养的出生后胸腺组织来源产品，其中所述胸腺器官培养基中L-选择素的水平在所述调理方案的过程期间降低。
118.根据权利要求114至117所述的冷冻保存的同种异体冷冻保存的培养的出生后胸腺组织来源产品，其中所述胸腺器官培养基中M-CSF、半乳凝素-7和IL-16中的一种或多种的水平在所述调理方案的过程期间降低。
119.根据权利要求114至118所述的冷冻保存的同种异体冷冻保存的培养的出生后胸腺组织来源产品，其中所述胸腺器官培养基中CXCL12、CXCL16和CCL11中的一种或多种的水平在所述调理方案的过程期间增加。
120.根据前述权利要求114至119中任一项所述的冷冻保存的同种异体冷冻保存的培养的出生后胸腺组织来源产品，其还包括以下步骤：在所述调理方案的约6天与约21天之间在所述供体胸腺组织切片中确定散布在整个所述供体胸腺组织切片中的对角蛋白AE1/AE3呈阳性的区域、至少一个哈索尔小体的存在、散布在整个所述供体胸腺组织切片中的CK14染色以及完整核的存在。
121.一种用于进行根据前述权利要求中任一项所述的方法的试剂盒，其连同确定同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是否适于植入至人中的使用说明书一起。
122.一种用于进行根据前述权利要求中任一项所述的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包括特异性结合以下标志物的至少一种抗体：L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/(Ckin)、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1。
123.根据权利要求122所述的试剂盒，其中所述抗体特异性结合L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11。
124.一种用于确定根据权利要求115至120中任一项培养的冷冻保存的同种异体培养的出生后胸腺组织来源产品是否适于植入至人中的试剂盒，其连同使用说明书一起。
125.根据权利要求110所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括特异性结合以下标志物的至少一种抗体：L-选择素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳凝素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/嗜酸性粒细胞趋化因子、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1和ANG-1。
126.根据权利要求125所述的试剂盒，其中所述标志物选自L-选择素、M-CSF、半乳凝素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11。
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