KR20220045011A - 사람에게 임플란테이션하기 위한 배양된 흉선 조직의 적합성을 결정하는 방법 및 관련된 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

고형 장기 이식물을 필요로 하는 수혜자에게 동종이계 고형 장기를 임플란팅하고, 추가로 기증자로부터 고형 장기의 수혜자에게의 조직공학적 동종이계 배양된 생후 흉선 조직 생성물의 수술적 임플란테이션을 포함함으로써 고형 장기 이식물의 수혜자에게 기증자-특이적 관용 및 면역적격성을 촉진시키는 방법 및 조성물. 사람에게 임플란테이션하기에 적합한 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 생성 방법; 사람에게 임플란테이션하기에 적합한 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 배양하는 방법 및 사람 대상체에서 임플란테이션에 의해 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 사용하는 방법.

Description

사람에게 임플란테이션하기 위한 배양된 흉선 조직의 적합성을 결정하는 방법 및 관련된 사용 방법
선천성 무흉선증을 포함하는 흉선 장애 및 흉선 장애로 인한 다른 면역계 기능이상을 가지는 대상체에게 임플란테이션(implantation) 및 T 세포 재구성을 위한 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물(allogeneic cultured postnatal thymus tissue-derived product; 또는, 때때로 "CTT")이라고도 알려진 T 세포-고갈된 배양된 소아 흉선 조직의 생존능(viability) 및 적합성을 결정하는 데 유용한 생체표지자. 기증자로부터 동종 고형 장기 이식물을 받은 수혜자에서 동종 고형 장기 이식물에 대한 기증자-특이적 면역관용(donor-specific tolerance)을 촉진하는 방법 및 조성물.
장기 이식은 기증자로부터 사람 고형 장기의 준비 및 수확 및 수혜자에게의 이식을 필요로 한다. 고형 장기 이식의 주요 문제점은 수혜자가 기증자를 관용하지 않는다는 점이다. 수혜자 T 세포는 장기를 거부할 것이고, 수혜자 B 세포는 장기에 대한 항체를 발생시켜서 장기의 궁극적인 실패를 야기할 것이다. 고형 장기 이식의 성배(holy grail)는 수혜자에 의한 이식된 사람 장기에 대한 관용의 전개이다. 미국에서는 매년 36,000개 초과의 장기 이식물이 수행되는 것으로 추산되고, 유럽 및 다른 주요 국가에서는 더 많은 것으로 추산된다. 추가로, 미국에서는 장기 이식물을 위한 대기 명단에 120,000 명 초과의 환자가 있는 것으로 추산된다. 건강한 장기의 수요가 적합한 장기의 공급을 상당히 능가한다. 2018년에는, 대략 10,000명의 기증자가 확인되었다. https://optn.transplant.hrsa.gov를 참조한다.
이식물 거부는 고형 장기 이식에서 실질적인 도전과제이다. T 세포 및 B 세포 둘 모두에 의한 이식물 거부는 장기 기능에서 상당한 합병증을 초래할 수 있거나 또는 심지어 이식물 실패를 초래할 수 있다. 5년 이식편 생존은 예를 들어 심장 이식물의 경우 77.7%이고, 신장 이식물의 경우 78.6%이고, 간 이식물의 경우 72.8%이고, 폐 이식물의 경우 53.4%이다. 대표적으로, 이 문제는 주조직 적합 복합체(MHC) 항원을 위한 기증자 및 수혜자의 일치를 통해서 및 수혜자 조직 유형에 대한 항체를 갖는 수혜자를 피함으로써 부분적으로 다루었다. 추가로, 이식물 거부의 기저를 이루는 면역학적 반응을 관리하기 위한 면역억제 레지멘의 사용이 개선되었다. 그러나, 관용은 달성되지 않았고, 많은 장기의 평균 생존은 겨우 10년이다.
임플란테이션 절차 전에 및 동안에 장기 생존능의 보존은 두번째로 중대한 도전과제이다. 장기의 제거, 저장 및 이식은 장기의 내부 구조 및 기능에 깊이 영향을 미칠 수 있고, 이식이 완료된 후에 정상 장기 기능의 복원이 지연되거나 또는 방해받는 정도에 상당히 영향을 미칠 수 있다.
고형 사람 장기가 효과적으로 보존될 수 있는 시간은 장기마다 달라서, 신장은 24-36 hr의 범위이고, 췌장은 12-18 hr의 범위이고, 간은 8-12 hr의 범위이고, 심장 및 폐는 4-6 hr의 범위이다. https://unos.org/transplantation/matching-organs을 참조한다.
장기 손상은 주로 허혈 및 저체온증의 결과로 일어나지만, 또한 생체외에서 또는 임플란테이션 동안에 장기의 재관류와 관련이 있을 수 있다.
생체외 관류를 포함하는 장기 보존 기술이 관련 분야에서 알려져 있고, 장기 손상을 최소화하고 최적의 이식편 생존 및 기능을 촉진하는 역할을 한다.
이식 절차의 대상인 주요한 고형 장기는 신장, 간, 심장, 및 폐를 포함한다. 이들 고형 장기 이식의 성공은 다양한 성공 정도로 달성되었다. 주요한 가변성은 면역-매개 이식편 거부를 간섭하는 데 사용되는 기술에 있다. 경험은 고형 장기 이식을 포함하는 모든 상황에서 유용한 단일 면역억제제 또는 면역억제 기술은 없다는 것을 보여주었다. 제한 인자는 통상적으로 각 개별 면역억제제와 관련된 독성에 있다. 주어진 면역억제제와 관련된 독성은 이식된 고형 장기 또는 다른 장기 예컨대 칼시뉴린 억제제가 거부를 방지하는 데 사용될 때 실패할 수 있는 신장의 정상 기능화를 빈번히 저해할 수 있다.
고형 장기 이식물에서 이식편 거부를 방지하는 데 정상적으로 사용되는 공지된 면역억제제와 관련된 독성 결점은 고형 장기 이식물의 이식편 거부를 방지하는 새로운 방법을 찾아야 하는 필요를 제시한다.
자기 항원과 비자기 항원을 구별하는 능력이 면역 반응에서 가장 중요하다. 이 구별은 자기-관용을 초래한다. 자기-관용의 소실이 있을 때는 자가면역이 전개된다. 이식 절차에서 고형 장기 이식물에 대한 관용을 유발해야 하는 충족되지 않은 필요가 존재한다.
선천성 무흉선증을 포함하는 흉선 장애 및 흉선 장애로 인한 다른 면역계 기능이상을 갖는 대상체에서 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 임플란테이션 절차 전에 및 그 동안에 흉선 조직 생존능의 보존은 본 개시물의 다양한 측면 및 실시양태의 실시에서 중요한 인자이다.
흉선은 외래 항원 및 병원균에 적절하게 반응할 수 있고 한편으로 자기-반응성을 손상시키는 것을 피할 수 있는 T 세포의 발달에 필요하다.
흉선은 초기 T 세포 레퍼토리를 확립해야 하는 그의 필요 때문에 유아기에는 크지만, 곧 항상성을 이루게 되고, 그 후에 퇴화의 느린 진행이 뒤따르고, 이는 성인기 전체에 걸쳐서 계속된다. 지난 20 내지 30년에 걸친 연구는 성인 흉선의 전체 산출량(output)은 감소하지만, 장기는 감염성 질환 또는 암으로부터 보호할 수 있고 면역 인설트(insult) 예컨대 방사선, 화학요법, 및 일부 감염 예컨대 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 후에 레퍼토리를 재군집할 수 있는 새로운 특이성을 갖는 T 세포를 생성하는 데 여전히 대단히 중요하다는 것을 확립하였다(Gruver et al. 2007; Palmer et al. 2018; Sun et al. 2016; Wickemeyer and Sekhsaria 2014). 따라서, 최근에는 연령-관련 흉선 퇴화를 통제하는 메카니즘 및 성인에서 면역 손상 후 흉선 재생을 용이하게 하는 방법을 확인하는 데 집중하였다.
사람에서 연령-관련 흉선 퇴화는 지방 조직에 의한 흉선 실질 조직의 대체와 함께, 발달하는 흉선세포의 소실 및 감소되는 흉선 상피 세포 수에 의해 특징지워진다. 이들 변화를 구동시키는 메카니즘이 흉선-내재성인지 흉선-외재성인지를 결정하는 것은 흉선에 왕래하는 일정한 트래피킹(trafficking) 때문에 동물 모델을 사용하여 다루기가 어렵고, 그러한 질문을 살아있는 사람에서 다루는 것은 일반적으로 가능하지 않다.
어린 기증자로부터 유래된 흉선 조직의 장기 배양물이 이 질문을 평가하는 데 유용하고, 그 이유는 사람 흉선 슬라이스의 시험관내 배양이 흉선세포의 고갈을 초래하고, 한편으로는 일반적으로 흉선 상피 및 간질 세포의 생존능 및 기능을 유지하기 때문이다. 이것은 이들 슬라이스가 단층을 성장하게 하고(Markert et al. 1997b) 선천성 무흉선 수혜자에게 임플란팅될 때 T 세포 재구성을 용이하게 하는 능력으로 입증된다(Davies et al. 2017; Davis et al. 1997; Markert et al. 2004; Markert et al. 1999; Markert et al. 2007; Markert et al. 2010; Markert et al. 1997a; Markert et al. 2011; Markert et al. 2003). 본 출원인은 흉선 장기 배양 동안에 일어나는 흉선세포의 소실이 급성 및 만성 퇴화를 모방할 수 있고, 노화 동안에 흉선 마이크로환경의 변화를 구동시키는 메카니즘을 확인하는 것을 도울 수 있다고 가정하였다.
동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 선천성 무흉선증에 기인하는 T 세포 면역결핍(일차 면역 결핍)의 치료에, 예를 들어 22q11.2 결손과 관련된 완전형 디죠지 기형(cDGA) 및 chd7(크로모도메인-헬리카제-dNA-결합 단백질 7) 유전자에서의 돌연변이와 관련된 CHARGE(안과적 결손증, 심장 결함, 후비공 폐쇄증, 성장 또는 정신 지체, 생식기관형성저하증 및 귀 기형 또는 난청(deafness)) 증후군 의 치료에서 및 포크헤드 박스 단백질 N1(FOXN1) 결핍을 갖는 무흉선 환자에서 유용하다는 것을 보여주었다. 선천성 무흉선증은 희귀한 치명적 병태이고, 현재로서는 규제력을 지닌 승인된 약물 생성물을 이용하는 약물 치료 선택권이 없다.
흉선 상피세포(TEC)를 보유하는 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 실험적 임플란테이션이 선천성 무흉선증을 갖는 소아 환자를 치료하는 데 성공적으로 응용되었다(Markert ML, Devlin BH, McCarthy EA, 2010, "Thymus Transplantation" Clin Immunol., 135(2): 236-46; Markert ML, et al., 2004, "Postnatal thymus Transplantation with immunosuppression as treatment for DiGeorge syndrome," Blood 104(8):2574-2581; Markert ML, et al., 1999, "Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge syndrome," N c J Med 341(16):1180-1189 27).
이 참고문헌에서, 디죠지 증후군(DiGeorge syndrome)은 심장, 흉선 및 부갑상선에 가변적 결함이 있는 병태로 정의된다. 디죠지 증후군이 있는 유아의 대략 1%가 무흉선증을 가지고, 따라서 성숙해서 감염과 싸우는 나이브(
Figure pct00001
) T 세포를 만들 수 없다. 이들 유아는 완전형 디죠지 증후군을 갖는다고 말한다. 포괄적인 것을 의도하지 않지만, 완전형 디죠지 증후군, 22q11.2 결손 증후군, CHARGE, 당뇨병 엄마의 유아, 및 증후군형 또는 유전적 결함이 없는 유아의 척도를 충족시키는 하위그룹의 어린이가 있다. 선천성 무흉선증은 또한 TBX1 또는 TBX2 유전자에서의 돌연변이와 관련될 수 있다.
동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물은 조직공학적 생성물이고, 이 생성물은 제조되어 배양되고 최장 21 일(예를 들어, 약 6 내지 약 21 일의 배양 레지멘) 동안 저장되어 부분적으로 T 세포-고갈된 흉선 조직 슬라이스를 생성하고, 컨디셔닝 과정에 의해 네이티브(native) 흉선으로부터 분화된다. 컨디셔닝 레지멘은 배양된 흉선 조직 슬라이스로부터 기증자 흉선세포를 부분적으로 고갈시킨다. 시험관내 데이터(면역조직화학)에 기초하여, 6 내지 21일의 배양 기간은 상피 망상조직을 사이토케라틴 항체를 사용하여 사정된(assessed) 대로 보존한다. 배양은 바람직하게는 37 ℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 수행하였다.
배양 과정은 기증자 흉선 조직 및 그 안에 함유된 구성 세포의 생물학적 특성을 다음 방식으로 상당히 변경시켜서 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 슬라이스의 효과적인 치료적 특성을 최적화한다. 배양 과정은 필수적인 생물학적 특성을 가지는 배양된 세포/조직의 확정된 조성이 대상체의 면역계의 재구성을 가능하게 하기 위해 대상체에게 수술적 임플란테이션하기에 적합한 방식으로 얻어지는 것을 보장한다.
배양 과정은 기증자 흉선 조직 슬라이스에서 흉선세포의 소실 및 TEC 및 다른 간질 세포의 상대적 풍부화를 초래한다. 배양 과정은 추가로 흉선세포의 고갈 및 TEC의 유지를 초래하여 수혜자의 면역계의 재구성을 가능하게 하고, 기증자 흉선 내의 HLA 항원에 대한 관용이 수혜자에서 발달하는 것을 허용한다. 전반적으로, 배양 과정은 기증자 흉선 조직으로부터 많은 흉선세포를 고갈시키고, 흉선 간질(흉선 상피 세포 및 섬유모세포)의 기능적 아키텍처(architecture)를 보존하도록 설계된다. 줄기 세포로부터 발생하는 흔한 림프구계 전구체가 흉선으로 이동하고, 흉선에 흉선 정착 전구체로서 진입한다.
배양 과정은 문헌(WO2019/165197A1, Cultured Thymus Tissue Transplantation Promotes Donor-Specific Tolerance to Allogeneic Solid Organ Transplants, Markert, M. L.)에서 기술되고, 이 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 슬라이스의 적합성의 분석은 PCT/US2019/040275에서 기술되고, 이것은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
무흉선 환자에서 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물(예를 들어, "RVT-802"라고도 알려짐)의 수술적 투여는 기능적 면역계의 발달을 초래하는 일련의 사건들(a cascade of events)을 야기한다. 수혜자에게 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 수술적 거치 후, T 세포는 기증자 TEC 및 수혜자 수지상 세포(DC)에 의해 교육받는다. 기증자 TEC는 수혜자 DC와 함께, 배양된 흉선 조직 슬라이스로서 임플란팅되는 임플란팅된 기증자 흉선 조직에 대한 관용을 가능하게 한다. 이것은 정상 흉선에서와 동일한 관용 유도이다. 기증자 TEC는 수혜자 DC와 함께 자기에 대한 관용을 야기한다.
임플란팅된 기증자 흉선 조직에서 흉선세포생성(thymopoiesis)은 동종이계이식편 생검 및 말초에서 수혜자 나이브 T 세포의 존재에 의해 실증되었고(Markert ML, 2010,; Markert ML, et al., 2008, "Use of allograft biopsies to assess thymopoiesis after thymus Transplantation," J Immunol 180(9):6354-6364; Markert ML, et al., 2007, "Review of 54 patients with complete DiGeorge anomaly enrolled in protocols for thymus Transplantation: outcome of 44 consecutive transplants," Blood 109(10):4539-454728), 이 문헌은 본원에 참고로 포함된다.
조사 중인 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로 치료되는 어린이의 연구는 혼합 림프구 반응에 의해 기증자 주조직 적합 복합체(MHC)에 대한 관용을 보여준다(Chinn IK, Devlin BH, Li YJ, & Markert ML, 2008, "Long-term tolerance to allogeneic thymus transplants in complete DiGeorge anomaly," Clin Immunol 126(3):277-281). 추가로, 선천성 무흉선증을 갖는 유아는 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 이식 후에 감염 예컨대 Epstein Barr 바이러스를 제어할 수 있다(Markert ML, 2014, Thymus Transplantation. Stiehm's Immune Deficiencies, eds Sullivan KE & Stiehm ER (Academic Press), 1st Ed, pp 1059-1067.
역사적으로, 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 출하 척도는 배양 기간 중 제6 일 - 제21 일로 나중에 정제된(refined) 제조 과정의 중간 지점에서의 조직의 H&E 및 면역염색된 절편의 조직병리학적 평가를 포함하였다. 이 조직병리학적 평가는 효력 검정으로서 역할하였고, 공인 전문의 자격이 있는(board-certified) 병리학자에 의한 정성 분석으로서 수행되었다. 샘플은 조직 슬라이스의 절편을 제작한 후 슬라이드 상에 고정하기 전에 냉동 또는 포르말린 고정에 의해 평가를 위해 제조하였다. 이 방식으로 제조된 샘플은 오랜 기간 동안 안정하고, 재분석이 수행되는 것을 허용한다.
20+년의 발생 역사로부터 입수가능한 역사적 샘플은 긍정적 임상 결과에 연계될 수 있고, 따라서 생성물 품질의 평가를 위한 정량적 조직학 검정의 개발을 위한 강력한 데이터 세트를 제공한다.
새로운 디지털 조직학 검정은 동종이계 배양된 생후 흉선-조직 유래 생성물의 이전의 임상적 로트로부터 및 실험적 로트로부터의 H&E 슬라이드의 스캐닝된 이미지를 사용하여 개발되었다. 이들 이미지를 정량적 방출 검정으로의 개발을 위해 분석하였다. 디지털 조직학 검정은 PCT/US2019/040275에서 더 완전하게 기술된다.
화학유인물질 사이토카인(케모카인) 및 다른 가용성 분자에 반응하는 세포 이동은 흉선 기능을 조절하는 중대하지만 덜 직관적인 메카니즘이다(Hu et al. 2015). 초기 흉선세포 전구체는 케모카인 구배의 영향 하에서 골수로부터 흉선으로 이동한다. 케모카인 구배는 또한 흉선 내에서 그의 이동에 영향을 미친다. 초기 흉선세포 전구체 및 그의 CD4-/CD8- 이중 음성(DN) 자손은 피질 흉선 상피 세포와 상호작용하여, CD4+/CD8+ 이중 양성(DP) 흉선세포로 분화하고, 그 다음에 CD4+ 또는 CD8+ 단일 양성 흉선세포로 분화하도록 양성 선택되고 (Lancaster 2018), 이것은 흉선 수질로 이동한다. 자기-반응성 세포가 음성 선택에 의해 결손된 후, 결과적인 나이브 성숙 T 세포가 말초에 방출된다.
선천성 무흉선증을 가지는 어린이에서 동종이계 배양된 생후 흉선-조직 유래 생성물을 임플란팅하는 것의 전술한 성공에도 불구하고, 면역-재구성을 달성하기 위해서 생존가능하고 기능적이고 임플란테이션에 적합한 배양된 흉선 조직을 확인하는 것이 여전히 필요하다.
발명의 요약
기증자-특이적 면역 관용을 달성하는 것은 여전히 이식에서 궁극적인 면역학적 목표이다. 현존 접근법의 대부분은 흉선에서 동종이계반응성 T 세포의 생성을 목표로 하지 않고 고갈(예를 들어, 알렘투주맙, 티모글로불린 등) 또는 억제(예를 들어, 칼시뉴린 억제제, 바실릭시맙 등)에 의해 말초성 성숙 기증자-반응성 T 세포를 제어하는 데 집중한다. 그러나, 심지어 면역억제 약물 및 새로운 면역조절 레지멘의 극적인 진보에도, 이식물 관용은 아직 일관되게 달성되지 않았다.
본 발명자들은 고형 장기 이식물에 대한 관용이 흉선절제된 수혜자에서 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물(본원에서는 "CTT" 또는 "RVT-802"라고도 부름)의 임플란테이션을 통해 달성되어서 이식된 장기의 거부를 방지하는 이식후 면역억제제의 사용 기간을 단축시킬 수 있다는 것을 보여주었다. 수혜자의 흉선의 제거 및 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 교체는 고형 장기 수혜자의 면역계의 재구성 및 수혜자의 자기에 대한 관용 뿐만 아니라 이식된 동종 고형 장기에 대한 관용을 초래한다.
동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 수술적 삽입에 의한 관용 유도는 조혈 줄기 세포 이식에서 기증자 수지상 세포("DC")를 통한 관용 유도와 유사하다 (Sharabi Y & Sachs DH, 1989, "Mixed chimerism and permanent specific Transplantation tolerance induced by a nonlethal preparative regimen," J Exp Med 169(2):493-502; Manilay JO, Pearson DA, Sergio JJ, Swenson KG, & Sykes M, 1998, "Intrathymic deletion of alloreactive T cells in mixed bone marrow chimeras prepared with a nonmyeloablative conditioning regimen," Transplantation 66(1):96-102.). Transplantation Biology Research Center (TBRC, Boston, MA)로부터의 일련의 연구는 관용 유도에서 흉선의 대단히 중요한 역할을 보여주었고(Yamada K, et al., 1997, "Role of the thymus in Transplantation tolerance in miniature swine. I. Requirement of the thymus for rapid and stable induction of tolerance to class I-mismatched renal allografts," J Exp Med 186(4):497-506), 큰 동물 모델에서 관용 유도와 함께 흉선 이식을 시험하였다(Yamada K, et al., 2000, "Thymic Transplantation in miniature swine. II. Induction of tolerance by Transplantation of composite thymokidneys to thymectomized recipients," J Immunol 164(6):3079-3086; 5; Yamada K, et al., 2003, "Thymic Transplantation in miniature swine: III. Induction of tolerance by Transplantation of composite thymokidneys across fully major histocompatibility complex-mismatched barriers," Transplantation 76(3):530-536; Nobori S, et al., 2006, "Thymic rejuvenation and the induction of tolerance by adult thymic grafts," Proc Natl Acad Sci U S A 103(50):19081-19086. 그들의 일련의 연구에서, 이 그룹은 이식물 관용 유도를 위해 12 일의 시클로스포린("CsA")과 함께 흉선 복합 조직(흉선신장(thymokidney) 및 흉선심장(thymoheart))으로서 HLA-Class II 일치된/Class I 불일치된 기증자(흉선 및 신장 또는 심장)를 성공적으로 사용하였다. 그들은 비혈관화된 흉선은 그들의 모델에서 관용을 유도하지 않았다고 주장하였다. 더 정확하게는, 그러나, 배양되지 않은 비혈관화된 흉선은 장기간 생착하지 않았다. 그들이 지시하는 바와 같이, 비배양된 흉선의 생착 실패는 동종면역 외에 추가로 허혈 손상 때문이었을 수 있다(Yamada K, et al., 2000).　 이식 전에 혈관화된 흉선을 생성하여 관용을 유도하는 이 명쾌한 개념은 이종이식을 사용하지 않고 클리닉에 전달하기 어려울 것이다(Kwun, Jean, Li, Jie, Rouse, Clay, Park, Jae Berm, Farris, Alton B., Kuchibhatla, Maragatha, Turek, Joseph W. Knechtle, Stuart J. Kirk, Allan D. and Markert, M Louise, Cultured thymus tissue Implantation promotes donor-specific tolerance to allogeneic heart transplants, JCI Insight . 2020 Jun 4;5(11):e129983. doi: 10.1172/jci.insight.129983).
비혈관화된 흉선 이식의 한계는 배양 시스템 뿐만 아니라 T 세포 고갈로 극복될 수 있다. TEC를 보유하는 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물(CTT)의 실험적 이식은 선천성 무흉선증을 갖는 소아 환자를 치료하는 데 성공적으로 응용되었다(Markert ML, Devlin BH, McCarthy EA, 2010, "Thymus Transplantation," Clin Immunol., 135(2): 236-46; Markert ML, et al., 2004, "Postnatal thymus Transplantation with immunosuppression as treatment for DiGeorge syndrome," Blood 104(8):2574-2581; Markert ML, et al., 1999, "Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge syndrome," N Engl J Med 341(16):1180-1189 27).
전술한 참고문헌에서, 디죠지 증후군은 심장, 흉선 및 부갑상선에 가변적 결함이 있는 병태로 정의된다. 디죠지 증후군이 있는 유아의 대략 1%가 무흉선증을 가지고, 따라서 감염과 싸우는 T 세포를 가지지 않는다. 이들 유아는 완전형 디죠지 증후군을 갖는다고 말한다. 완전형 디죠지 증후군, 22q11.2 결손 증후군, CHARGE, 당뇨병 엄마의 유아, 및 증후군형 또는 유전적 결함이 없는 유아의 척도를 충족시키는 4 개 하위그룹의 어린이가 있다. 4개 하위그룹 모두에서, 무흉선증을 갖는 유아는 아마도 그 진단 예컨대 22q11.2 결손 증후군 진단을 갖는 전체 어린이의 1%인 매우 작은 그룹을 대표한다.
흉선세포생성은 동종이계이식편 생검 및 말초에 수혜자 나이브 T 세포의 존재에 의해 실증된다(Markert ML, 2010,; Markert ML, et al., 2008, "Use of allograft biopsies to assess thymopoiesis after thymus Transplantation," J Immunol 180(9):6354-6364; Markert ML, et al., 2007, "Review of 54 patients with complete DiGeorge anomaly enrolled in protocols for thymus Transplantation: outcome of 44 consecutive transplants," Blood 109(10):4539-454728). 임상시험용 CTT로 처치를 받은 어린이의 연구는 기증자 MHC에 대한 관용을 혼합 림프구 반응에 의해 보여준다(Chinn IK, Devlin BH, Li YJ, & Markert ML, 2008, "Long-term tolerance to allogeneic transplants in complete DiGeorge anomaly," Clin Immunol 126(3):277-281). 추가로, 선천성 무흉선증을 갖는 유아는 CTT 임플란테이션 후에 감염 예컨대 Epstein Barr 바이러스를 제어할 수 있다(Markert ML, 2014, Thymus Transplantation. Stiehm's Immune Deficiences, eds Sullivan KE & Stiehm ER (Academic Press), 1st Ed, pp 1059-1067). 선천성 무흉선증을 갖는 사람에서의 이들 데이터에 기초하여, 수혜자에서 수술적 삽입 후 고형 장기 기증자의 MHC를 발현하는 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 자기 및 기증자에 대한 관용을 발생할 것이고, 한편으로 수혜자를 감염으로부터 보호할 기능성 T 세포를 생성한다는 것이 결정되었다.
Thymus Gland And Education of Thymocytes. (Kwun, Jean, Li, Jie, Rouse, Clay, Park, Jae Berm, Farris, Alton B., Kuchibhatla, Maragatha, Turek, Joseph W. Knechtle, Stuart J. Kirk, Allan D. and Markert, M Louise, Cultured thymus tissue implantation promotes donor-specific tolerance to allogeneic heart transplats, JCI Insight. 2020 Jun 4;5(11):e129983. doi: 10.1172/jci.insight.129983.
흉선샘은 정상적으로는 심장 위에 위치한다. 흉선은 T 세포 발생을 위한 필수 마이크로환경을 제공하고, 적응 면역계의 확립 및 유지에 중대하다(Boehm T and Takahama Y, 2014, Thymic Development and Selection of T Lympnocytes. Heidelberg: Springer-Verlag). 생후 발생 동안, 흉선은 조혈 줄기 세포를 골수로부터 흉선샘으로 이동하라고 교육한다. 전구체 줄기 세포는 흉선을 집락화하고 이렇게 함으로써 흉선세포를 형성한다. 그 후에 흉선세포는 일련의 성숙 단계를 겪는다. 이것은 흉선세포 상에 나타나는 많은 관찰가능한 세포 표면 표지자의 발현에 의해 증명된다.
T 세포는 감염으로부터 신체의 보호에 대단히 중요하다. 정상적으로 기능하는 흉선에서 발생하는 T 세포는 다양한 세트의 T 세포 수용체(일반적으로 세포 표면 상의 단백질)를 발생하고, 이는 성숙한 T 세포가 폭넓고 다양한 감염과 싸우는 것을 가능하게 한다. 이 교육 과정 동안, 발생하는 T 세포는 흉선에 의해 신체의 정상 단백질, 예컨대 (혈액 글루코스 및 칼슘 수준을 조절하는) 인슐린 또는 부갑상선 호르몬을 공격하지 말라는 지시를 받는다. 이들 지시는 자기면역 조절자 유전자("AIRE 유전자)"의 영향 하에서 수행된다.
간략하게 말하면, 교육 과정은 정상적으로 기능하는 흉선샘에서 일어난다. 흉선샘에 존재하는 흉선세포는 골수 줄기 세포로부터 형성된다. 흉선세포는 흉선 상피세포 ("TEC") 및 흉선 내에 위치하는 수지상 세포("DC")에 의해 수혜자 주조직 적합 복합체(MHC) 단백질(항원) 예컨대 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DQA1, HLA-DPB1, HLA-DPA1 항원을 공격하지 말라는 가르침을 받는다. HLA 항원은 그루브(groove)에 자기-펩타이드를 담고 있는 2 개 단백질을 가진다. 자기-펩타이드는 갑상선 단백질 또는 인슐린 펩타이드 또는 체내에서 발현되는 거의 모든 다른 단백질로부터 유래할 수 있다. 흉선에서 발생하는 흉선세포는 막을 가로지르는 2 개 단백질로 구성된 T 세포 수용체(TCR)를 형성한다. TCR은 T 세포의 세포 표면 상에서 발현된다. 각 T 세포는 그의 독특한 TCR의 많은 카피(copy)를 발현한다. TCR이 수지상 세포 상에 자기 펩타이드: MHC에 너무 단단히 결합하면, 수지상 세포는 T 세포가 세포자살을 겪어서 죽게 하는 신호를 제공한다. 이 메카니즘은 자기에 대한 자가면역의 발생을 방지한다. TEC는 또한 그들이 너무 단단히 결합하고 있다는 신호를 흉선세포에 제공할 수 있다. 마지막으로, DC는 TEC로부터 막의 조각들을 움켜잡을 수 있고, 발생하는 흉선세포에 TEC 자기 펩타이드:MHC를 제시할 수 있다. 흉선세포가 너무 단단히 결합하면, DC는 흉선세포가 세포자살을 겪어서 죽도록 신호를 보낸다. 이들 메카니즘에 의해, 흉선을 떠나는 T 세포는 자기반응성이 없다. 흉선을 떠나는 T 세포는 매우 가변성이고 감염을 인지할 수 있지만, 그들은 신체의 단백질을 공격하지 않는다.
흉선의 두 주요 구성성분은 흉선에서 다음 방식으로 생성되는 상피 및 흉선세포이다. 골수 줄기 세포로부터 유래되는 세포인 공통 림프구계 전구체("CLP")는 조기 흉선 전구체로서 흉선으로 이동한다. CLP는 흉선 상피 및 내피에 의해 생성되는 신호(케모카인)에 반응하여 흉선에 진입한다. 흉선에서 CLP는 흉선세포로 분화하여 증식한다. 흉선세포는 세포 표면 상에서 발현되는 독특한 T-세포 수용체 ("TCR")를 발생한다. 흉선세포는 또한 T 세포 분자 CD3, CD4 및 CD8을 발현하기 시작한다. 방대한 다양한 T 세포가 발생하여 수혜자의 일생 전체에 걸쳐서 세포가 감염에 반응할 수 있게 한다. 혼합 림프구 반응은 배양된 흉선 조직(RVT-802)으로 처치를 받은 어린이에서의 수혜자 T 세포의 흉선 기증자 MHC에 대한 관용을 보여준다.
자기반응성 수혜자 흉선세포는 흉선으로부터 나가기 전에 결손된다. 이것은 수혜자 흉선세포 및 흉선으로 이동하는 수혜자 DC의 상호작용에 의해 일어난다. 세포자살은 자기면역 질환으로부터 신체를 보호하는 조치로서 DC에 너무 단단히 결합하는 수혜자 흉선세포에서 유도된다. 이 과정의 완료 후, 흉선세포는 흉선을 나간다. 새로운 순환 T 세포, 즉, 최근 흉선 이주자는 표지자 CD31, CD45RA 및 CD62L을 발현한다. 수 주 후, CD31 표지자는 더 이상 발현되지 않는다. CD45RA 및 CD62L을 발현하는 T 세포는 나이브 T 세포라고 불린다. 이들 수혜자 T 세포는 미토겐에 반응하여 정상적으로 증식한다. 그들은 자기에 대한 자가반응성을 갖지 않고 감염으로부터 수혜자를 보호한다.
동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물.
동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 선천성 무흉선증에 기인하는 T 세포 면역결핍(일차 면역 결핍)의 치료에 유용하다는 것을 보여주었다. 무흉선증으로 인한 T 세포 면역결핍은 기능성 흉선의 발달을 방지하는 선천성 장애, 예컨대 22q11.2 결손과 관련된 완전형 디죠지 기형(cDGA) 및 chd7 (크로모도메인-헬리카제-DNA-결합 단백질 7) 유전자에서의 돌연변이와 관련된 CHARGE(안과적 결손증, 심장 결함, 후비공 폐쇄증, 성장 또는 정신 지체, 생식기관형성저하증 및 귀 기형 또는 난청) 증후군 및 포크헤드 박스 단백질 N1(FOXN1) 결핍을 갖는 무흉선 환자와 관련된다. 무흉선증을 야기하는 다른 유전적 결함은 TBX1, TBX2, PAX1 및 세마포린 3E(SEMA3E)를 포함한다.(Bernstock, Joshua D, Totten, AH, 및 Atkinson, T. Prescott, "Recurrent microdeletions at chromosome 2p11.2," Bernst℃k, Joshua D, Totten, AH, 및 Atkinson, T. Prescott, JACI 145:358-367) 선천성 무흉선증은 희귀한 치명적 병태이고, 현재로서는 규제하는 승인된 약물 생성물을 이용하는 약물 치료 선택권을 가지고 있지 않다. 치료되지 않고 그대로 두어서 어린이의 면역계의 치료적 재구성이 일어나지 않으면, 선천성 무흉선증으로 인한 일차 면역결핍이 치명적이어서, 거의 모든 유아가 3세 전에 가장 흔하게는 심각한 감염에 의해 사망한다.
동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물은 조직공학적(tissue-engineered) 생성물이다. 본 명세서 및 실시예의 개시물에 기초하여, CTT는 이식되는 고형 장기를 받은 수혜자에서 관용의 발생에 유용할 것으로 예상된다.
본 명세서 및 실시예에서 더 충분히 기술되는 바와 같이, 무흉선 환자에서 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물(예를 들어, "RVT-802")의 수술적 투여는 기능성 면역계의 발달을 초래하는 일련의 사건들을 야기한다. 수혜자에서 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물(예를 들어, RVT-802)의 수술적 거치 후, T 세포는 기증자 TEC 및 수혜자 DC에 의해 교육받는다. 기증자 TEC는 수혜자 DC와 함께, 배양된 흉선 조직 슬라이스로서 임플란팅되는 임플란팅된 기증자 흉선 조직에 대한 관용을 가능하게 한다. 이것은 정상 흉선에서와 동일한 관용 유도이다. 수혜자 TEC는 수혜자 DC와 함께 본 명세서에 기술된 바와 같이 자기에 대한 관용을 야기한다.
이 복잡한 과정은 감염과 싸우는 수혜자의 능력 때문에 동종이계 배양된 생후 흉선 조직 유래 생성물(예를 들어, RVT-802)을 받은 선천성 무흉선증을 갖는 환자에서 >70% 생존을 야기한다는 것을 임상적으로 보여주었다(Markert ML, Devlin BH, Alexieff MJ, Li J, McCarthy EA, Gupton SE, et al., 2007, "Review of 54 patients with complete DiGeorge anomaly enrolled in protocols for thymus Transplantation: outcome of 44 consecutive transplants," Blood, 109(10): 4539-47; Markert ML, Devlin BH, McCarthy EA. Tymus Transplantation. 2010, Clin. Immunol. 135(2): 236-46). 수혜자는 CTT 전에는 치명적이었을 Epstein-Barr 바이러스 같은 바이러스 감염을 제어할 수 있다. (Chinn IK, Devlin BH, Li YJ, & Markert ML, 2008).
CTT의 임플란테이션과 조합한 고형 장기 이식물에서의 관용 유도의 개요
본 명세서의 설명, 도면, 실시예 및 청구범위에 따르면, 본 발명자는 CTT가 래트 심장 이식 모델에서 기증자-특이적 관용을 유도한다는 것을 입증하였다. 본원에서 보고된 실험은 선천성 무흉선증을 갖는 대상체, 예컨대 cDGA에 시달리는 대상체에서 임상적으로 사용되어 온 대등한 CTT 임플란테이션 방법을 사용하였다. cDGA 유아는 CTT의 수술적 거치 전에는 나이브 T 세포를 본질적으로 가지지 않는다. CTT의 수술적 거치 후, 유아는 수술적 절차 후 대략 6 개월 후에 나이브 T 세포를 발생하였다. (Markert ML, et al., 2004, "Postnatal thymus Transplantation with immunosuppression as treatment for DiGeorge syndrome," Blood 104(8):2574-2581; Markert ML, Devlin BH, & McCarthy EA, 2010, "Thymus Transplantation," Clin Immunol 135(2):236-246). 래트 모델에서 관용 유도의 연구는 완전형 디죠지 기형을 갖는 무흉선증 유아에서 1993년부터 2017년까지 동종 생후 배양된 흉선 조직-유래 생성물(CTT)의 이식의 임상시험(investigation)의 결과에 기초하였다. 선천성 무흉선증을 가지는 유아에서 CTT의 수술적 거치의 보고된 연구에서 유리한 결과를 얻었다. 공개된 결과는 그렇지 않았다면 치명적인 이 병태에서 71% (61/86)의 전체 생존률을 보여주었다 (본질적으로 모든 사망이 처음 9-12 개월에 일어났고; 이 사정 시에 중앙값은 11.7 년이고, 범위는 1.2 내지 25 년임) (Markert, ML, et al., 2010). 임플란팅된 배양된 흉선 조직의 생검은 면역조직화학으로 흉선세포생성을 입증하였다(Markert, ML, et al., 2008). 유동 세포 분석 및 스펙트라타이핑(spectratyping)은 다양한 T 세포 레퍼토리의 발생을 보여주었다. 혼합 림프구 반응은 흉선 기증자 항원 제시 세포에 대한 수혜자 T 세포의 관용을 보여준다(Chinn IK, Devlin BH, Li YJ, & Markert ML, 2008).
중요하게는, CTT의 수혜자는 CTT 전에는 치명적이었을 Epstein-Barr 바이러스 같은 바이러스 감염을 제어할 수 있다(Markert, ML, 2014, Thymus Transplantation. Stiehm's Immune Deficiences, eds Sullivan KE & Stiehm ER (Academic Press), 1st Ed, pp 1059-1067). 불일치된 흉선 MHC 항원에 대한 관용을 보여주는 이들 사람 데이터에 기초하여, 래트 모델에서 CTT의 임플란테이션은 래트 심장 이식 모델에서 기증자-특이적 관용을 유도하는 그의 능력에 대해 임상적으로 사용되는 동일한 방법을 사용하여 평가하였다. 이들 연구는 불일치된 심장을 심장 기증자의 MHC 클래스 I 및 클래스 II 항원을 발현하는 기증자 CTT와 함께 (항 CD5에 의한 초기 T 세포 고갈 및 시클로스포린에 의한 면역억제를 이용해서) 이식하는 것이 기증자 심장의 항원에 대한 관용을 유도하고 한편으로는 다른 MHC 항원에 대한 동종이계반응성을 보존한다는 것을 보여주었다.
본 발명은 수혜자에서 이식된 고형 장기에 대한 관용 유도의 방법으로서 고형 장기와 기증자 흉선 동시이식을 구현시킨다. 그 절차로부터 가장 많은 이익을 얻는 환자 그룹은 심장 부전을 갖는 성인 뿐만 아니라 심장 이식물을 필요로 하는 유아이다. 생후 흉선 조직이 존재하고 사망한 유아로부터 제거될 수 있고, 수혜자 흉선이 심장 이식을 받는 유아로부터 일상적으로 제거되기 때문에, 배양된 흉선 조직 임플란테이션(CTT) 외의 추가의 절차가 이 접근법을 클리닉으로 이전하는 데 필요하지 않을 것이다. 유사한 이식물이 또한 성인에서 수행될 수 있다.
동종이계 배양된 생후 흉선-조직 유래 생성물 제조의 개요
본원에서 더 상세히 기술하는 바와 같이, 동종이계 배양된 생후 흉선-조직 유래 생성물을 제조하고, 배양하고, 최장 21일 동안 저장하고(예를 들어, 약 6 일 내지 약 21 일의 배양 레지멘), 임플란테이션 당일에 수술실로 운반하기 위해 개별 멸균 컵에 넣는다.
CTT(배양된 흉선 조직)를 무균 가공하고, 현행 우수 의약품 제조 품질 관리 기준("cGMP"), 예를 들어, 미국 식품의약품청("FDA")에 의해 확립된 cGMP 하에서 배양하여 부분적으로 T 세포-고갈된 흉선 조직 슬라이스를 생성한다. CTT가 아래에서 상세히 기술되는 컨디셔닝 과정에 의해 네이티브 흉선으로부터 분화된다. CTT는 임플란테이션 후 흉선에서 T 세포를 발달시키는 정상 양성 및 음성 선택 과정을 달성하고, T 세포가 기증자 흉선 및 기증자 고형 장기 이식물 둘 모두 뿐만 아니라 수혜자 조직을 관용하는 것을 가능하게 한다. 추가로, 이들 T 세포는 수혜자 주조직 적합성(MHC) 단백질의 맥락에서 외래 항원을 인식하여 감염과 싸울 수 있다.
투여 루트는 아래에서 기술되는 방식으로 CTT의 수술적 임플란테이션에 의한다. 단일 투여는 대표적으로 1,000 내지 22,000 mm2 의 CTT 표면적/m2 수혜자 체표면적("BSA")이다. 표면적은 모든 배양된 조직 슬라이스의 모든 표면적의 합계이다. 개별 CTT 슬라이스가 단일 투여 수술적 절차로 임플란팅된다.
무흉선 환자에서 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 수술적 임플란테이션은 기능성 면역계의 발달을 초래하는 일련의 사건들을 야기한다. (Markert ML, 2007; Markert ML, et al., 2010; Markert ML, Devlin BH, McCarthy EA. Chapter 84 Thymic reconstitution. 2013. In: Fleisher TA, Shearer WT, Schroeder HW, Frew AJ, Weyand CM, editors. Clinical Immunology (Fourth Edition). London; pp. 1032-8).
골수의 수혜자 CLP가 흉선 동종이계이식편으로 이동하고, 초기 흉선 전구체로서 진입하고, 거기에서 수혜자 T 세포로 발달한다. 기증자 흉선 이식편은 수혜자 흉선세포가 병원균을 인식할 수 있는 넓은 레퍼토리의 TCR을 발달시키는 마이크로환경을 제공한다.
기증자 흉선으로의 수혜자 DC의 이동은 새로운 T 세포가 흉선을 떠나서 순환에 진입한 후에 수혜자의 조직을 공격할 자기-반응성 수혜자 흉선세포를 고갈시킨다. 유전적-수혜자 나이브 T 세포는 투여 후 대략 5 -12 개월 후에 순환에서 쉽게 검출가능하다. 이들 수혜자 T 세포는 다양한 TCR 레퍼토리를 가지고, 미토겐에 반응하여 정상적으로 증식한다. 그들은 수혜자를 감염으로부터 보호하고, 자기에 대한 자가반응성을 가지지 않는다.
수혜자 골수 CLP가 흉선 동종이계이식편으로 이동하고, 여기서 그들은 수혜자 T 세포로 발달한다. 기증자 흉선으로 이동한 수혜자 DC에 의한 음성 선택은 수혜자 MHC 항원에 대한 관용을 초래한다. 흉선세포생성의 면역조직화학적 증거가 이식 약 2-3 개월 내에 채취한 임플란팅된 배양된 흉선 조직의 생검에서 관찰된다. 흉선세포생성은 감염을 방어하고 제어하며 자가면역 질환을 방지하는 T 세포의 능력을 반영한다.
나이브 T 세포는 이식후 5-12 개월 후에 순환에서 검출되고, 감염을 방어하고 제어하며 자가면역 질환을 방지하는 능력을 초래한다.
배양된 흉선 조직의 임플란테이션이 완전형 디죠지 기형(cDGA) 또는 포크헤드 박스 단백질 N1(FOXN1) 결핍 같은 병태와 관련된 선천성 무흉선증에 기인하는 일차 면역 결핍을 치료하는 데 유익하다는 것을 처음 보여주었다. 배양 후 정상 흉선 조직(예를 들어 CTT 및 RVT-802)으로 결함 흉선 조직의 대체가 또한 이식된 고형 장기의 수혜자에서 관찰되는 관용의 결여를 제거할 수 있다는 것을 발견하였다.
배양된 흉선 조직의 거치를 통한 선천성 무흉선증의 치료의 기저를 이루는 비임상적 및 임상적 작업은 환자에서 CTT(예를 들어, RVT-802)의 거치가 이식된 고형 장기에 대한 관용의 발달을 허용할 수 있다는 자각에 이르렀다. 구체적으로, 대상체가 기증자 장기의 MHC를 발현하는 CTT의 임플란테이션 전에 먼저 흉선절제되어 면역억제된 경우, CTT의 거치는 면역계를 재구성하여 기증자 장기에 대한 관용을 유도할 것이다.
흉선의 세포 성분과 관련된 일부 표지자의 발현 및 분포의 측정은 흉선 조직의 생체외 배양 후 표현형을 확립한다. 본 명세서 및 실시예에서 기술된 배양 조건은 무흉선 대상체에서 CTT 거치 후 생체내 흉선세포생성의 관찰을 지원한다.
중요하게는, 무흉선 수혜자에서 CTT의 수술적 거치 후, 나이브 T 세포의 발달 및 넓은 범위의 TCR-가변 영역의 존재는 흉선 조직의 배양이 기능성 내인성 T 세포 군락의 발달을 촉진할 수 있다는 분명한 증거를 제공한다. 추가로, 핵심 조절 및 구조 유전자의 발현이 배양 동안에 흉선 조직에서 주목되었다. 순환하는 나이브 (CD45RA+CD62L+) T 세포는 CTT의 수술적 삽입 후 3-5 개월 후에 처음 검출될 수 있다. 이들 관찰은 완전형 디죠지 기형을 갖는 환자의 치료에서 주목되었다(Markert ML, 2010; Markert ML. 2013).
흉선 조직 임플란테이션에 대해 문헌에서 기술된 비임상적 데이터는 동종이계 배양된 생후 흉선 조직의 임플란팅의 확고한 임상적 효능과 긴밀히 협력하여 사람에서의 그의 사용을 지지한다. (Markert ML, Watson TJ, Kaplan I, Hale LP, Haynes BF, 1997, "The human thymic microenvironment during organ culture," Clin Immunol Immunopathol. Jan; 82(1):2 6-36; Hong R, Schulte-Wissermann H, Jarrett-Toth E, Horowitz SD, Manning DD, 1979, "Transplantation of cultured thymic fragments. II. Results in nude mice," J Exp Med., 149(2): 398-415. Li B, Li J, Hsieh CS, Hale LP, Li YJ, Devlin BH, Markert ML, 2009, "Characterization of cultured thymmus tissue used for transplantaion with emphasis on promiscuous expression of thyroid tissue-specific genes," Immunol Res. 2009; 44 (1-3):71-83; Li B, Li J, Devlin BH, Markert ML, 2011, "Thymic microenvironment reconstitution after postnatal human thymus Transplantation," Clin Immunol., Sep; 140(3): 244-59).
완전형 디죠지 기형 환자는 어린 배아의 목에서 발달하는 3 개의 샘, 심장, 흉선 및 부갑상선 샘에서 결함을 가질 수 있다. 정상적으로는 심장 및 흉선은 가슴으로 내려가고, 부갑상선 샘은 칼슘 수준을 조절하고, 목에서 머무른다. CTT로 cDGA 대상체의 치료는 다른 모달리티(modality)로 치료받는 환자에서의 6%의 생존률(비공개 데이터)에 비해 2 세에서 75%의 생존률을 야기한다. 위에서 언급한 바와 같이, 거의 모든 사망이 첫 해에 나이브 T 세포의 발달 전에 일어났다. (Markert, et al., 2010). 중요하게는, CTT 임플란테이션이 심장 및 부갑상선의 문제에 영향을 미치지 않으며, 이 문제는 별도로 관리되어야 한다.
본 개시물의 한 측면은 면역학적 정상 수혜자에서 고형 장기 이식물에 대한 관용을 유도하기 위해 수혜자에서 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 수술적 거치하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 면역적격 수혜자에서 흉선샘을 제거한 후 수혜자의 T 세포를 하나 이상의 면역억제제를 포함하는 유도 면역억제 레지멘으로, 예컨대 하나 이상의 항체 및/또는 하나 이상의 칼시뉴린 억제제로 고갈시키는 것을 포함하거나, 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 본질적으로 이루어진다. 유도 면역억제 레지멘은 대상체에서 성숙 T 세포를 고갈시키고/거나 수혜자의 T 세포가 이식된 고형 장기를 거부하는 것을 억제하는 치료적 유효량으로 투여된다. 사후 기증자로부터 적합한 고형 사람 장기 및 흉선샘을 얻고, 고형 장기를 수혜자에게 이식한다. 유지 면역억제 레지멘이 이식 거부를 억제하기 위해 어느 기간 동안 투여된다. 사후 기증자로부터의 흉선샘을 최장 21 일 동안 컨디셔닝 레지멘(예를 들어, 약 6 일 내지 약 21 일의 컨디셔닝 레지멘)으로 처리하여 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하고, 그에 의해 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 포함한다. 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스는 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해 양성인 영역, 적어도 1 개 해살 소체(Hassall body)의 존재, 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색 및 원상태 핵의 존재를 보여준다. 그 다음에, 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 수혜자에, 대표적으로 대퇴네갈래근에 수술적으로 거치한다. 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물은 수혜자가 임플란테이션 후 나이브 T 세포를 발달시키는 것을 가능하게 한다. 발달하는 모든 새로운 T 세포는 유전적으로 수혜자이고, 수혜자 및 기증자 둘 모두를 관용한다. 흉선 조직 슬라이스의 용량은 약 1,000 - 22,000 mm2의 흉선 조직 표면적/m2 수혜자 체표면적이다. 임플란테이션 후, 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물은 대상체에서 흉선세포생성 및 관용을 유도한다.
심장 이식물을 예로 들어 말하면, 기증자는 사후 기증자일 것이다. 흉선이 심장 제거와 동시에 기증자로부터 제거될 것이다. T 세포 수를 감소시키고 남은 수혜자 T 세포를 억제하여 그들이 기증자 심장을 공격하는 것을 방지하는 유도 면역억제와 함께 즉시 심장 이식이 수행된다. 기증자 흉선은 가공되어 사람 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 형성하고, 이 생성물은 적어도 약 6 일 내지 약 21 일의 컨디셔닝 기간 후에 관용을 유도하기 위해 임플란테이션에 사용될 수 있다. 예방책으로서, 컨디셔닝 후 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 대략 절반은 동결보존될 수 있고, 이렇게 함으로써 나중에 심장 거부로 인한 문제가 거부를 치료하는 데 높은 용량(dose)의 스테로이드 또는 다른 면역억제제의 투여를 필요로 하고, 그에 의해 그 높은 용량의 스테로이드가 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물에 손상을 끼치는 경우, 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 거부 에피소드가 제어된 후에 임플란트에 이용가능할 것이다.
중요하게는, 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 임플란테이션 후에는, 면역 관용이 심지어 감염 존재 하에서도 유지된다. 다른 접근법 예컨대 동시자극 차단의 경우에는, CD8 T 세포의 대략 1/3이 동종이계반응성을 가지기 때문에 바이러스 감염이 관용 소실을 야기할 수 있다. 면역계가 활성화되어 감염과 싸울 때, 동종이계반응성 CD8 T 세포가 고형 장기 이식물을 거부하기 시작한다. 대조적으로, 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로 가공된 흉선조직을 사용하여 관용을 유도할 때는, 잠재적으로 기증자에 대항하는 동종이계반응성 T 세포가 흉선에서 음성 선택의 과정을 통해 결손된다.
한 실시양태에서, 기증자 흉선 조직은 수혜자에게는 없는 기증자 장기의 HLA 대립유전자와 일치한다. 발달하는 모든 새로운 T 세포는 유전적으로 수혜자이고, 수혜자 및 기증자 둘 모두를 관용한다.
본 개시물의 또 다른 측면에서, 다음 단계들을 포함하는 고형 장기 이식물을 필요로 하는 수혜자에서 사후 기증자로부터 얻은 동종 고형 장기 이식물에 대한 기증자-특이적 관용을 촉진하는 방법이 제공된다:
(a) 수혜자의 흉선을 제거하는 단계;
(b) 수혜자를, 수혜자의 T 세포를 고갈시키고/거나 수혜자의 T 세포가 이식된 고형 장기를 거부하는 것을 억제하는 하나 이상의 면역억제제를 포함하는 유도 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(c) 사후 기증자로부터 적합한 고형 사람 장기 및 흉선샘 둘 모두를 제공하는 단계;
(d) 고형 사람 장기를 수혜자에게 이식하는 단계;
(e) 수혜자를 유지 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(f) 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 제공하는 단계로서, 여기서 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 고형 장기 기증자의 적합한 흉선 조직으로부터 얻어지는 것이고; 여기서 기증자 흉선 조직이 최장 21 일 동안 컨디셔닝 레지멘(예를 들어, 약 6 일 내지 약 21 일의 컨디셔닝 레지멘)으로 처리되어 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 생성하는 것이고; 추가로 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고; 여기서 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스가 조직 전체에 걸쳐서 산포된 (항체 AE1/AE3를 사용하는) 사이토케라틴(CK)에 대해 양성인 영역, 적어도 1 개 해살 소체의 존재, 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색 및 원상태 핵의 존재를 보여주는 것인, 단계; 및
(g) 약 6 일 내지 약 21 일의 컨디셔닝 레지멘 후 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 수혜자에게 임플란팅하는 단계로서, 여기서 흉선 조직 슬라이스의 용량이 약 1,000 - 22,000 mm2의 흉선 조직 표면적/m2 수혜자 체표면적이고, 추가로 여기서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 수혜자에서 흉선세포생성 및 관용을 유도하는 것인 단계.
한 실시양태에서, 사후 기증자 심장을 필요로 하는 수혜자에서 동종 심장 이식물에 대한 기증자-특이적 관용을 촉진하는 방법이 제공된다. 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 이식을 위해 사후 기증자로부터 적합한 사람 심장을 얻는 단계;
(b) 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로 컨디셔닝하기 위해 심장을 얻을 때 동시에 사후 기증자 흉선을 제거하고; 여기서 기증자 흉선이 기증자 이식된 장기에서의 HLA 대립유전자와 일치하는 것인 단계;
(c) 수혜자를, 수혜자의 T 세포를 고갈시키고/거나 억제하는 하나 이상의 면역억제제를 포함하는 유도 면역억제 레지멘으로 치료하고, 여기서 하나 이상의 면역억제제가 마취 유도 시에 및 재관류 후에 투여되는 당질코르티코이드를 포함하는 것인, 단계;
(d) 심장을 수혜자에게 이식하는 단계;
(e) 수혜자를 칼시뉴린 억제제, 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 억제제 및 항-흉선세포 글로불린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역억제제를 포함하는 유지 면역억제 레지멘으로 심장의 이식물 거부를 방지하거나 또는 억제하기에 충분한 기간 동안 치료하는 단계;
(f) 제6 일 내지 제21 일에 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 제공하는 단계로서, 여기서 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 기증자 흉선 조직으로부터 얻어지는 것이고, 여기서 기증자 흉선 조직이 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리되어 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 생성하는 것이고; 추가로 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고; 여기서 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스가 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해 양성인 영역, 적어도 1 개 해살 소체의 존재, 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색 및 원상태 핵의 존재를 보여주는 것인, 단계;
(g) 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 일부를 수혜자에게 임플란팅하는 단계로서, 여기서 흉선 조직 슬라이스의 용량이 약 1,000 - 22,000 mm2의 흉선 조직 표면적/m2 수혜자 체표면적이고, 추가로 여기서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 수혜자에서 흉선세포생성 및 관용을 유도하는 것인 단계; 및
(h) 단계 (g)에서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 그 일부를 손상시킬 높은 용량의 스테로이드를 요구하는 조기 거부 에피소드가 있을 경우에 수혜자에게 사용하기 위해 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 일부를 동결보존하는 단계.
한 실시양태에서는, 사후 기증자 심장을 필요로 하는 수혜자에서 동종 심장 이식물에 대한 기증자-특이적 관용을 촉진시키는 방법이 제공된다. 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 이식을 위해 사후 기증자로부터 적합한 고형 사람 심장을 얻는 단계;
(b) 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로 컨디셔닝하기 위해 심장을 얻을 때 동시에 사후 기증자 흉선을 제거하고; 여기서 기증자 흉선이 기증자 이식된 장기에서의 HLA 대립유전자와 일치하는 것인 단계;
(c) 수혜자를, 수혜자의 T 세포를 고갈시키고/거나 억제하는 하나 이상의 면역억제제를 포함하는 유도 면역억제 레지멘으로 치료하고, 여기서 하나 이상의 면역억제제가 마취 유도 시에 및 재관류 후에 투여되는 당질코르티코이드를 포함하는 것인, 단계;
(d) 수혜자의 심장 및 흉선을 수술적으로 제거하는 단계;
(e) 기증자 사람 심장을 수혜자에게 이식하는 단계;
(f) 수혜자를 칼시뉴린 억제제, 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 억제제 및 항-흉선세포 글로불린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역억제제를 포함하는 유지 면역억제 레지멘으로 심장의 이식물 거부를 방지하거나 또는 억제하기에 충분한 시간 동안 치료하고;
여기서 수혜자의 수술후 상태가 너무 불안정하여 당질코르티코이드의 위닝(weaning) 및 수혜자에게 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 안전한 임플란팅을 허용하지 않는 경우에, 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 나중 시점에 수혜자가 안정할 때 임플란팅하기 위해 동결보존되고; 여기서 기증자 흉선 조직이 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리되어 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 생성하는 것이고; 추가로 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고; 여기서 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스가 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해 양성인 영역, 적어도 1 개 해살 소체의 존재, 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색 및 원상태 핵의 존재를 보여주는 것인, 단계;
(h) 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 일부를 환자가 안정한 후에 수혜자에게 이식하고, 여기서 흉선 조직 슬라이스의 용량이 약 1,000 - 22,000 mm2의 흉선 조직 표면적/m2 수혜자 체표면적이고, 추가로 여기서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 수혜자에서 흉선세포생성 및 관용을 유도하는 것인 단계; 및
(i) 단계 (h)에서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 그 일부를 손상시킬 높은 용량의 스테로이드를 요구하는 거부 에피소드가 있을 경우에 수혜자에게 사용하기 위해 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 일부를 동결보존하는 단계.
본 개시물의 또 다른 측면에서, 다음 단계들을 포함하는 고형 장기 이식물을 필요로 하는 사람 수혜자에서 생체 사람 기증자로부터 얻은 동종 고형 장기 이식물에 대한 기증자-특이적 관용을 촉진시키는 방법이 제공된다:
(a) 수혜자의 흉선을 제거하는 단계;
(b) 수혜자를, 수혜자의 T 세포를 고갈시키고/거나 수혜자의 T 세포가 이식된 고형 장기를 거부하는 것을 억제하는 하나 이상의 면역억제제를 포함하는 유도 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(c) 생체 사람 기증자로부터 적합한 고형 장기를 제공하는 단계;
(d) 고형 장기를 수혜자에게 이식하는 단계;
(e) 수혜자를 유지 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(f) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 은행에서 유지되는 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 제공하는 단계로서, 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 고형 장기 이식물에 존재하지 않는 수혜자에서의 HLA 대립유전자와 일치되는 HLA 대립유전자를 발현하는 흉선 기증자로부터의 흉선 조직으로부터 가공되는 것이고; 여기서 기증자 흉선 조직이 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리되는 것이고; 추가로 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고; 여기서 흉선 조직 슬라이스가 컨디셔닝 레지멘 완료시 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해 양성인 영역, 적어도 1 개 해살 소체의 존재, 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색 및 원상태 핵의 존재를 보여주는 것인, 단계;
(g) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 해동하는 단계; 및
(h) 해동된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 수혜자에게 임플란팅하는 단계로서, 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 용량이 약 1,000 - 22,000 mm2의 흉선 조직 표면적/m2 수혜자 체표면적이고, 추가로 여기서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 수혜자에서 흉선세포생성 및 관용을 유도하는 것인 단계.
본 개시물의 제4 측면은 다음 단계들을 포함하는 고형 장기 이식물을 필요로 하는 사람 수혜자에서 사후 사람 기증자로부터 얻은 동종 고형 장기 이식물에 대한 기증자-특이적 관용을 촉진시키는 방법을 제공한다:
(a) 수혜자의 흉선을 제거하는 단계;
(b) 수혜자를, 수혜자의 T 세포를 고갈시키고/거나 수혜자의 T 세포가 이식된 고형 장기를 거부하는 것을 억제하는 하나 이상의 면역억제제를 포함하는 유도 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(c) 생체 사람 기증자로부터 적합한 고형 장기를 제공하는 단계;
(d) 고형 장기를 수혜자에게 이식하는 단계;
(e) 수혜자를 유지 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(f) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 은행에서 유지되는 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 제공하는 단계로서; 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 고형 장기 이식물에 존재하지 않는 수혜자에서의 HLA 대립유전자와 일치되는 HLA 대립유전자를 발현하는 흉선 기증자로부터의 흉선 조직으로부터 가공되는 것이고; 여기서 기증자 흉선 조직이 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리되는 것이고; 추가로 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고, 여기서 흉선 조직 슬라이스가 컨디셔닝 레지멘 완료시 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해서 양성인 영역, 적어도 1 개 해살 소체의 존재, 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색 및 원상태 핵의 존재를 보여주는 것인, 단계;
(g) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 해동하는 단계; 및
(h) 해동된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 수혜자에게 임플란팅하는 단계로서, 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 흉선 조직-유래 생성물의 용량이 약 1,000 - 22,000 mm2의 흉선 조직 표면적/m2 수혜자 체표면적이고, 추가로 여기서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 수혜자에서 흉선세포생성 및 관용을 유도하는 것인 단계.
본 개시물의 전술한 측면의 한 실시양태에서, 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물, 여기서 흉선이 수확 당일에 >50%의 영역이 레이스 모양 염색 패턴으로 케라틴에 대해 양성이고, 해살 소체가 존재하고, CK14가 레이스 모양 패턴으로 염색하고, >90%의 핵이 원상태임을 입증한다.
본 개시물의 한 측면에서 기증자로부터 적합한 흉선 조직을 얻음으로써 제조된 고형 장기 이식물을 받은 대상체에게 임플란테이션을 위한 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 제공되고, 여기서 기증자 흉선 조직이 최장 21 일 동안 컨디셔닝 레지멘(예를 들어, 약 6 일 내지 약 21 일의 컨디셔닝 레지멘)으로 처리되고; 추가로 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하고; 여기서 기증자 흉선 조직 슬라이스가 수확 후 5 일 내지 9 일에 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해서 양성인 영역, 적어도 1 개 해살 소체의 존재, 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색 및 원상태 핵의 존재를 보여주고; 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로서 회수한다.
본 개시물의 전술한 측면의 한 실시양태에서, 흉선은 기증자로부터 수확 당일에 >50%의 영역이 레이스 모양 염색 패턴으로 케라틴에 대해 양성이고, 해살 소체가 존재하고, CK14가 레이스 모양 패턴으로 염색하고, >90%의 핵이 원상태임을 입증한다.
본 개시물의 전술한 측면의 한 실시양태에서, 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물은 동결보존된다.
한 실시양태에서, 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물은 추후 사용을 위해 액체 질소에서 유지된다.
또 다른 실시양태에서, 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물은 동결보존된 조직 은행에서 유지된다.
한 실시양태에서, 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물은 고형 장기 이식물에 존재하지 않는 제안된 수혜자에서의 HLA 대립유전자와 일치되는 HLA 대립유전자를 포함하는 기증자로부터의 적합한 흉선 조직으로부터 제조된다.
한 실시양태에서 HLA 대립유전자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQA1, HLA- DPB1, 및 HLA-DPA1이다.
본 개시물의 한 측면에서 다음 단계들을 포함하는 방법으로 제조된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 제공된다:
(a) 기증자로부터 적합한 흉선 조직을 얻는 단계;
(b) HLA 대립유전자: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQA1, HLA- DPB1, HLA-DPA1을 타이핑하는 단계;
(c) 흉선 조직을 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고; 추가로 여기서 기증자 흉선 조직 슬라이스가 제6 일 내지 제21 일에 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해서 양성인 영역, 적어도 1 개 해살 소체의 존재, 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색 및 컨디셔닝 레지멘 완료시 원상태 핵의 존재를 보여주는 것인, 단계;
(d) 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로서 수확하는 단계;
(e) 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 액체 질소에서 동결보존하는 단계; 및
(f) 액체 질소 중의 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 은행에서 유지하는 단계.
한 실시양태에서, 흉선이 수확 당일에 >50%의 영역이 레이스 모양 염색 패턴으로 케라틴에 대해 양성이고, 해살 소체가 존재하고, CK14가 레이스 모양 패턴으로 염색하고, >90%의 핵이 원상태임을 입증한다.
한 실시양태에서, 액체 질소 중의 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 추후 사용을 위해 수혜자에 의해 보관된다.
본 개시물의 한 측면에서, 수혜자 대상체에게 임플란팅하기 위한 기증자 흉선을 준비하는 방법이 제공된다. 그러한 방법은 기증자 흉선을 최장 약 5 일, 최장 약 6 일, 최장 약 7 일, 최장 약 8 일, 최장 약 9 일, 최장 약 10 일, 최장 약 11 일, 최장 약 12 일, 최장 약 13 일, 최장 약 14 일, 최장 약 15 일, 최장 약 16 일, 최장 약 17 일, 최장 약 18 일, 최장 약 19 일, 최장 약 20 일, 또는 최장 약 21 일 동안 배양하고, 그 다음에 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, 배양된 흉선 조직을 수혜자에게 수술적으로 거치하는 것을 포함하거나, 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 본질적으로 이루어진다. 약 6 일 내지 약 21 일의 배양 기간은 좋은 기능을 초래한다. 동결보존된 흉선 조직의 성공적 이식을 위해, 조직은 대표적으로 약 6 일 내지 약 21 일 동안 배양되고, 그 다음에 동결보존된다.
본 개시물의 한 측면에서, 적합한 기증자로부터의 흉선 조직을 최장 21 일 동안 컨디셔닝 레지멘(예를 들어, 약 6 일 내지 약 21 일의 컨디셔닝 레지멘)으로 처리하는 방법에 의해 제조되는, 고형 장기 이식물을 받은 대상체에게 임플란테이션하기 위한 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물(CTT; RVT-802)이 제공되고; 여기서 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하고, 여기서 흉선 조직 슬라이스가 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해서 양성인 영역, 적어도 1 개 해살 소체의 존재, 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색 및 원상태 핵의 존재를 보여준다.
한 실시양태에서, 기증자 흉선이 수확 당일에 >50%의 영역이 레이스 모양 염색 패턴으로 케라틴에 대해 양성이고, 해살 소체가 존재하고, CK14가 레이스 모양 패턴으로 염색하고, >90%의 핵이 원상태임을 입증한다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 수혜자의 흉선은 수술에 의해 얻어진다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 수혜자의 흉선은 로봇 수술에 의해 얻어진다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 수혜자의 흉선은 흉강경 수술에 의해 얻어진다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 고형 장기는 전장기(whole organ)의 일부이다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 제1 내지 제4 측면의 방법은 세포 관용을 입증하기 위한 혼합 림프구 반응에 추후 사용을 위해서 사후 기증자로부터의 말초 혈액 단핵 세포를 동결보존하는 단계를 추가로 포함한다
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 세포 관용을 입증하기 위한 혼합 림프구 반응은 본 명세서에서 CTT의 임플란테이션 절차에 따라서 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 임플란테이션 후에 수혜자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 및 기증자로부터의 동결보존된 말초 혈액 단핵 세포를 사용하여 수행된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 세포 관용을 입증하기 위한 혼합 림프구 반응은 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 임플란테이션 후 약 6 내지 12 개월 후에 수혜자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 및 기증자로부터의 동결보존된 말초 혈액 단핵 세포로 수행된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 세포 관용을 입증하기 위한 혼합 림프구 반응은 나이브 T 세포가 수혜자에서 총 T 세포의 약 10%를 구성한 후에 수혜자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 및 기증자로부터의 동결보존된 말초 혈액 단핵 세포로 수행된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물은 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 임플란테이션 후 12 개월 내에 대상체에서 흉선세포생성을 유도한다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 관용의 발생은 사후 기증자로부터의 동결보존된 말초 혈액 단핵 세포 및 수혜자로부터의 T 세포로 수행되는 혼합 림프구 반응에 의해 결정된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 체액성 관용은 체액성 면역력의 발달 및 기증자 반응성 항체의 부재에 의해 결정된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 고형 장기 이식물은 심장 이식물, 신장 이식물, 간 이식물, 폐 이식물, 심장/폐 이식물, 췌장 이식물, 장 이식물, 위 이식물, 복벽 이식물, 두개안면 이식물, 두피 이식물, 음경 이식물, 자궁 이식물, 일측성 또는 양측성 상지 이식물, 일측성 혈관화된 복합 동종이계이식편, 또는 그의 조합이다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 고형 장기를 이식하기 전에 수혜자를 HLA-Class I 및 HLA-Class II 패널 반응성 항체("PRA") 점수에 대해 평가하는 단계를 추가로 포함한다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 고형 장기 이식물은 심장 이식물이다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 고형 장기 이식물은 소아 심장 이식물이다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 고형 장기 이식물은 성인 심장 이식물이다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 고형 장기를 이식하기 전에 수혜자를 HLA-Class I 및 HLA-Class II 패널 반응성 항체("PRA") 점수를 평가하는 단계를 추가로 포함한다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, HLA 항체를 갖는 수혜자는 잠재적 기증자와 교차일치된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, HLA 항체를 갖는 수혜자는 UNET와 가상 교차일치된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, >20% 가상 교차일치의 PRA 점수가 기록되면, 방법은 수혜자에서 고형 장기 이식물 때에 수술실에서 혈장사혈을 수행하는 단계를 추가로 포함할 것이다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, >70% 가상 교차일치의 PRA 점수가 기록되면, 방법은 실제 유망 기증자 교차-일치를 수행하고 수혜자에서 고형 장기 이식물 때에 수술실에서 혈장사혈을 수행하는 단계를 추가로 포함할 것이다. 대표적으로, 이식물은 저조한 성공률 때문에 이들 상황에서는 수행되지 않는다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 HLA 항체를 갖는 수혜자를 UNET와 가상 교차-일치함으로써 평가하는 단계를 추가로 포함한다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 HLA 패널 반응성 항체가 >20% 점수를 가지면 수혜자에서 고형 장기 이식물 때에 수술실에서 혈장사혈을 수행하는 단계를 추가로 포함한다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 HLA 패널 반응성 항체가 >70% 점수를 가지면 실제 유망 기증자 교차일치를 수행하고 수혜자에서 고형 장기 이식물 때에 수술실에서 혈장사혈을 수행하는 단계를 추가로 포함한다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 고형 장기는 예를 들어 신장, 부분 간 및 부분 장 이식물의 생체 관련 기증자로부터 수혜자에게로 HLA-일치된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 고형 장기는 HLA-불일치된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 고형 장기는 HLA 일치된다. 또 다른 실시양태에서, HLA 일치는 기증자 및 수혜자에서 HLA 대립유전자: HLA-A, HLA-B HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQA1, HLA- DPB1, HLA-DPA1을 타이핑함으로써 결정된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 고형 장기 이식물은 ABO 적합(ABO compatible)이다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 고형 장기는 HLA-불일치된다. 한 실시양태에서, HLA-불일치는 기증자 및 수혜자에서 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DQA1, HLA-DPB1, HLA-DPA1을 타이핑함으로써 결정된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 배양된 흉선 조직 슬라이스는 대상체의 대퇴네갈래근에 수술적으로 임플란팅된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 배양된 흉선 조직 슬라이스는 네갈래근 외의 영역에서 대상체의 신체에 수술적으로 임플란팅된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 일부가 수혜자의 대퇴네갈래근에 수술적으로 임플란팅된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 여기서 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 남은 부분은 추후 이식을 위해 액체 질소에 동결보존된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 컨디셔닝 레지멘은 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안이다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 기증자 흉선 조직의 컨디셔닝 기간은 약 5 일 내지 약 21 일, 또는 약 5 일, 또는 약 6 일, 또는 약 7 일, 또는 약 8 일, 또는 약 9 일, 또는 약 10 일, 또는 약 11 일, 또는 약 12 일, 또는 약 13 일, 또는 약 14 일, 또는 약 15 일, 또는 약 16 일, 또는 약 17 일, 또는 약 18 일, 또는 약 19 일, 또는 약 20 일, 또는 약 21 일이다.
관련 분야의 통상의 기술을 가진 자는 관련 분야에 알려진 많은 잠재적 유도 면역억제 레지멘 및 유지 면역억제 레지멘이 있고, 적합한 유도 및 유지 면역억제제가 부당한 부담 없이 관련 분야의 기술을 가진 자에 의해 선택될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 다음 예시하는 유도 면역억제 레지멘 및 유지 면역억제 레지멘은 본 발명의 제1 내지 제4 측면의 방법의 실시의 전형이고 청구된 발명을 지지한다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 유도 면역억제 레지멘트는 당질코르티코이드, 항-흉선세포 글로불린(토끼), 항-흉선세포 글로불린(말), 및 알렘투지맙의 군으로부터 선택되는 유도 면역억제제를 포함한다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, ATG는 항흉선세포 글로불린 (토끼)이다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 유도 면역억제 레지멘은 당질코르티코이드의 투여를 포함한다. 한 실시양태에서, 당질코르티코이드는 메틸프레드니솔론을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 당질코르티코이드는 메틸프레드니솔론 소듐 숙시네이트이다. 한 추가의 실시양태에서, 메틸프레드니솔론 소듐 숙시네이트는 4 mg/kg/일 이하로 정맥내 투여된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 유도 면역억제 레지멘은 토끼-유래 항-흉선세포 글로불린을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 토끼-유래 항-흉선세포 글로불린은 약 1.5 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여된다. 한 추가의 실시양태에서, 항-흉선세포 글로불린은 4 일 동안 매일 투여된다. 또 다른 실시양태에서 ATG는 말 유래 ATG이다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 유도 면역억제 레지멘은 바실릭시맙을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 바실릭시맙은 체중 35 kg 미만 수혜자의 경우에는 10 mg의 용량으로 정맥내 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 바실릭시맙은 체중 35 kg 초과 수혜자의 경우에는 20 mg의 용량으로 정맥내 투여된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 제2 면역억제 레지멘은 당질코르티코이드, 칼시뉴린 억제제, 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 억제제, 아자티오프린, 및 항-흉선세포 글로불린("ATG")으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역억제제를 포함한다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 유지 면역억제 레지멘트의 면역억제제는 항-흉선세포 글로불린(ATG)이다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, ATG는 수술실에서 투여를 시작해서 3-14 일의 기간 동안 약 1.5 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 항-흉선세포 글로불린은 약 15 mg/kg/일로 3-14 일 동안 매일 정맥내 투여로 투여된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 제1 면역억제 레지멘은 알렘투주맙을 포함한다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 알렘투주맙은 체중 35 kg 미만 수혜자의 경우 약 0.25 mg/kg의 용량으로 4 일 동안 정맥내 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 알렘투주맙은 체중 35 kg 초과 수혜자의 경우 약 3 내지 20 mg의 용량으로 4 일 동안 정맥내 투여된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 제2 면역억제 레지멘은 칼시뉴린 억제제, 및 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 억제제, 또는 아자티오프린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역억제제를 포함한다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 유지 면역억제 레지멘의 면역 억제제 면역억제제는 칼시뉴린 억제제이다.
한 실시양태에서, 유지 면역억제 레지멘의 면역억제제 면역억제제는 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 억제제이다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 면역억제 레지멘은 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 억제제, 예를 들어, 마이코페놀레이트 모페틸을 포함한다. 한 실시양태에서, 마이코페놀레이트 모페틸은 약 15 내지 약 25 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여된다. 한 실시양태에서, 마이코페놀레이트 모페틸은 1 일 2 내지 3 회 정맥내 투여된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 억제제는 마이코페놀산이다. 또 다른 실시양태에서, 마이코페놀산은 2 또는 3 회 분할된 용량으로 약 25 내지 약 50 mg/kg의 용량으로 투여된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 마이코페놀산은 약 어린이의 경우 약 400 mg/m2/dose 1 일 2 회로 최대 용량 720 mg, 또는 BSA 1.19 내지 1.59 m2의 경우 약 540 mg 1 일 2 회, 또는 BSA > 1.58 m2의 경우 약 720 mg 1 일 2 회의 용량으로 투여된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 마이코페놀레이트 모페틸은 어린이의 경우 약 15 내지 약 25 mg/kg/dose 1 일 2 회 또는 성인의 경우 약 1500 mg 경구 또는 정맥내 1 일 2 회의 용량으로 투여되고, >3500의 WBC를 위해 조정된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 제2 면역억제 레지멘은 메틸프레드니솔론, 프레드니손 및 프레드니솔론으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 당질코르티코이드를 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 당질코르티코이드의 용량은 계속 4 mg/kg/일 미만이다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 당질코르티코이드는 본 개시물의 다른 곳에서 기술되는 바와 같이 점감하는 용량 감소로 투여된다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 칼시뉴린 억제제는 타크롤리무스이다. 또 다른 실시양태에서, 칼시뉴린 억제제는 시클로스포린 A이다.
전술한 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 제2 면역억제 레지멘의 투여는 나이브 T 세포가 총 T 세포의 10%에 도달한 후 위닝한다. 또 다른 실시양태에서, 제2 면역억제 레지멘은 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 임플란테이션 후 위닝한다.
흉선세포가 CTT를 위한 기증자 흉선 조직의 준비 동안에 고갈될 때 흉선 생성 및/또는 케모카인 및 다른 가용성 분자의 방출이 이들 세포 이동 변화 과정을 어떻게 조절할 수 있는지를 평가하기 위해, 본 발명자들은 항체 마이크로어레이를 사용하여 200 개 가용성 분자의 존재에 대해 사람 흉선 장기 배양물로부터의 컨디셔닝된 배지를 스크리닝하였다.
선택된 잠재적으로 기계론적으로 중요한 후보 분자의 발현은 추가의 흉선 장기 배양물을 사용하여 유효성 확인되었고, 5 일 내지 78 세 연령 범위의 기증자로부터 얻은 잘 특성화된 사람 흉선 조직의 패널과 비교하였다. 이 분석을 통해 본 발명자들은 흉선세포 함량의 일부 잠재적으로 중요한 생체표지자를 확인하였다.
배양된 흉선 슬라이스의 흉선세포 함량의 잠재적으로 중요한 생체표지자는 L-셀렉틴이다. 흉선 상피 세포 생존능 및 기능의 또 다른 중요한 생체표지자는 케모카인 CCL21 6Ckine의 선택에 의존한다.
많은 추가의 잠재적 생체표지자는 도 50 및 56에 나타낸다. 특히 관심을 끄는 것은 도 50에 나타낸 생체표지자, 즉 L-셀렉틴, CCL21, CXCL16, M-CSF, 갈렉틴-7, CCL11, IL-16 및 CXCL12이다. 또한, 특히 관심을 끄는 것은 도 56에 나타낸 생체표지자, 특히 0.05 미만의 P-값을 가지는 생체표지자이다. 이들 생체표지자는 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, CCL20 (MIP-3a), IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR (CD87), MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1을 포함할 것이다.
실시예 및 문헌에서 보고된 데이터는 다음 생체표지자가 TEC 기능을 지시한다는 것을 지지한다: CCL21 (6Ckine, CXCL16, 오스테오폰틴(OPN), CCL11, uPAR (CD87) 및 CXCL12. CXCL16: 이 케모카인이 TEC에 의해 생성된다는 것을 보여주었다(Bunting 2011).
오스테오폰틴(OPN; SPP1 유전자에 의해 코딩됨): 이 사이토카인은 흉선 스트레스 동안에 증가하고, 증가된 수준은 흉선 위축(흉선세포 수 감소)과 관련되고, 흉선세포 수 감소는 배양된 흉선의 바람직한 상태이다(Wang 2009; Gridley 2013). OPN이 코르티코스테로이드를 만드는 것이 요구되고, 이는 흉선세포 세포자살을 유도하도록 잘 확립되었다.
CCL11(에오탁신): 이 케모카인은 수질 TE에 의해 만들어진다(Bunting 2011). 그것은 초기에 호산구를 유인하는 그의 능력 때문에 명명되었고, 본 발명자들은 호산구 침윤물이 활성 흉선세포생성과 함께 흉선 조직에서 두드러질 수 있다는 것을 보여주었다(Flores 1999). 그러나, 에오탁신이 또한 이중-양성(DP) 및 단일-양성(SP) 사람 흉선세포 둘 모두에 대한 화학유인물질로서 역할한다는 것을 보여주었다(Bunting 2011).
uPAR(CD87; PLAUR 유전자에 의해 코딩됨): 우로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체라고도 알려진 우로키나제 수용체는 대체적 스플라이싱에 기초하여 가용성 및 막-결합된 형태 둘 모두에서 발현된다. 그것은 세포외 기질의 국소 분해에 도움이 된다. 그것이 사람 흉선에서 및 흥미롭게도, 상처 가장자리에서 표피 각질형성세포(EK)를 이동시킴으로써 발현된다는 것을 보여주었다(Loughner 2016). 이 후자의 특성이 가장 흥미로우며, 그 이유는 TE 세포가 많은 유전자 발현에서 Ek를 미러링(mirroring)하기 때문이다(Patel 1995). 배양된 흉선 슬라이스에 의한 분비의 점진적 증가는 TE의 활성화를 반영할 수 있고, 따라서 임플란테이션 후 TE 과성장(outgrowth)의 표지자일 수 있다.
CXCL12(SDF-1a): 이 케모카인은 그것이 배양 기간의 최종 1/3 동안에만 검출되었다는 점에서 다른 분석물과 상이한 발현 패턴을 가졌다. 제13 일 - 제15 일에 처음 검출가능하고, 그것은 배양에서 그 다음 주 동안에 선형으로(ln 플롯에서) 훨씬 더 높은 수준까지 올라갔다. CXCL12가 피막하 피질 및 수질 TE에 의해 생성된다고 실증되었지만(Bunting 2011; Hernandez-Lopez 2002; Zaitseva 2002), 또한 흉선 내에 존재하는 흉선 섬유모세포 및 내피 세포에 의해 만들어질 수 있다. CXCL12가 B 세포 및 항원-제시 세포(APC)를 흉선으로 동원한다는 것을 보여주었고(Weiss 2003), 이것이 충분한 흉선 기능의 발생에 중요할 것으로 예상된다. 그것은 또한 흉선 내에 흉선세포 부분집합의 국지화에 관여하고, 그것은 IL-7로의 흉선세포 증식을 향상시킨다(Hernandez-Lopez 2002). 중요하게는, CXCL12를 중화하는 항체가 시험관 내에서 사람 흉선 장기 배양물에서 흉선세포생성을 감소시킨다는 것을 보여주었고, CXCL12의 첨가는 이들 배양물에서 흉선세포생성을 증가시킨다 (Hernandez-Lopez 2002).
흉선세포 존재를 반영할 수 있는 추가의 생체표지자는 L-셀렉틴을 포함한다. 이 분자는 발달하는 및 나이브 T 세포에서 높은 수준으로 발현된다. 그것은 흉선세포가 배양될 때 세포 표면으로부터 방출된다. 보통은 생체내에서 건강한 세포에 의해 탈락될 때 신속하게 재발현되고(Fitzhugh 2008), 점진적으로 감소하는 수준의 탈락은 아마도 흉선세포 생존능의 점진적 소실을 반영할 것 같고, 그 이유는 그들이 정상적으로는 배양 동안에 그들의 표면 상에서 이 분자를 재발현하지 않기 때문이다(A. Macintyre, 비공개 데이터).
흉선세포 존재를 반영할 수 있는 또 다른 생체표지자는 IL-16이다. 이 사이토카인은 그의 패턴(아래에서 기술되는 바와 같음)이 흉선세포에 대해 가정된 것과 부합하였기 때문에 포함되었다. 이 생체표지자는 림프구에 의해 만들어지는 것으로 알려져 있다.
흉선세포 존재를 반영할 수 있는 또 다른 생체표지자는 MIF이다. 이 케모카인은 그의 패턴이 흉선세포에 대해 가정된 것과 부합하였기 때문에 포함되었다.
흉선세포 존재를 반영할 수 있는 또 다른 생체표지자는 CCL20 (MIP-3a)이다: 이 케모카인은 그의 패턴이 흉선세포에 대해 가정된 것과 부합하였기 때문에 포함되었다.
흉선세포 존재를 반영할 수 있는 또 다른 생체표지자는 IGFBP-1이다. IGFBP2 - 6은 흉선 상피에 의해 발현된다고 알려져 있고, 흉선상피는 IGFBP-1을 발현하지 않는다 (Gosteli-Peter 1994; Ketcha 1999).
다른 생체표지자는 초기에는 높은 수준, 그 다음에는 시간에 따라 감소하는 것을 보여주었고, 이는 흉선세포-유래 생체표지자의 가정된 특징이며, 이는 실시예 및 문헌의 데이터에 기초해서 생존가능 흉선세포 존재와 상관있다: L-셀렉틴, IL-16, MIF. CCL20 (MIP-3a), 및 IGFBP-1. 시간에 따라 이들 생체표지자의 감소는 흉선 조직 슬라이스가 배양 중인 동안에 T 세포가 고갈된다는 본 발명자들의 더 정성적인 관찰과 일관된다.
CCL21이 흉선 상피 세포에 의해 발현되고(Lkhagvasuren et al. 2013), 그의 화학주성 활성 때문에 흉선세포 전구체를 위해서(Liu et al. 2005) 뿐만 아니라 흉선 내에서의 흉선세포 이동을 위해서(Hu et al. 2015) 기능적으로 중요하다는 것을 보여주었다. 흉선세포의 이 화학주성 특성은 본원에서 기술되는 바와 같이 배양된 흉선 조직의 임플란테이션 후에 수혜자의 성공적 면역 재구성을 위한 대단히 중요한 결정요인일 수 있다.
본원에서 보고된 결과들은 또한 연령-관련 흉선 퇴화 메카니즘의 이해 뿐만 아니라 배양된 흉선 조직의 임플란테이션을 통한 흉선 수혜자의 면역 재구성에 관여하는 메카니즘의 이해를 위해 광범위하게 적용가능할 수 있어야 한다.
실시예에서 및 도 56에서, 적어도 127 개 상이한 분석물이 배양된 사람 흉선 조직 슬라이스로부터 얻은 소모된/컨디셔닝된 배양 배지에서 검출될 수 있고, 이들 분석물 중 42 개가 배양 시간이 지남에 따라 점진적 증가 또는 감소를 보여준다고 보고되었다. 이들 분석물 중에서, 방출되는 가용성 L-셀렉틴의 양은 배양된 흉선에서의 생존가능 흉선세포의 잔류 함량의 비파괴적 표지자로서 유효성 확인되었다. 전연령의 건강한 기증자로부터 얻은 비조작된 흉선 조직에서 시험관내 및 생체내 흉선 장기 배양 둘 모두 동안에 흉선세포가 감소함에 따라 흉선 상피에 의한 케모카인 CCL21, CXCL16, CXCL12 및 CCL11의 발현 및/또는 분비가 증가한다는 것이 입증되었다. 마찬가지로, L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7 및 IL-16의 발현 또는 분비가 배양 과정의 경과 동안에 흉선 장기 배양 배지에서 감소한다는 것이 관찰되었다. 이들 발견은 연령-관련 흉선 퇴화 메카니즘, 뿐만 아니라 면역 재구성을 용이하게 하는 사람 흉선 조직의 품질의 이해에 직접적으로 관련있다. 유아 흉선의 배양 동안에 보이는 변화와 노화와 관련된 변화 사이의 유사점은 배양된 사람 유아 흉선이 또한 연령-관련 흉선 퇴화를 매개하는 메카니즘을 연구하는 데 유용할 수 있는 모델을 제공한다는 것을 시사한다.
본 발명자들이 아는 바로는, 이것은 흉선세포가 고갈될 때 사람 흉선에 의해 생성되고 방출되거나 또는 분비되는 가용성 분자의 제1 큰 스크린이다. 배양이 진행될 때 배지로의 방출을 상당히 증가시키거나 또는 감소시키는 것으로 발견된 42 개 분석물 중 많은 분석물이 흉선 내에 존재하는 세포 유형들에 의해 생성된다는 것을 이전에 보여주었던 사이토카인 및/또는 케모카인이다. 다른 것들은 이 점에서는 새로운 것이다. 실험적 작업은 주로 흉선세포 함량의 표지자로서는 L-셀렉틴의 방출에 집중하였고 TEC 생존능 및 기능의 표지자로서는 CCL21에 집중하였지만, 항체 마이크로어레이 스크리닝으로부터 보고된 데이터는 생체내에서 사람 흉선의 급성 위축, 만성 퇴화 및/또는 재생을 지배하는 새로운 경로를 확인할 수 있는 도 56으로부터의 추가의 분석물을 확인하는 데 사용될 수 있다. 이들은 특히 도 50에나타낸 생체표지자를 포함할 것이다. 예를 들어, 사전에 명시된 선택 척도를 충족시킨 일부 분석물은 그들이 세포 손상 및/또는 저산소 스트레스 동안에 발현되거나 또는 방출된다고 알려져 있고 그들의 수준이 흉선-특이적 생물학보다는 오히려 배양-관련된 조직 손상 및 염증 반응을 반영할 수 있기 때문에 추가로 고려되지 않았다. 배양된 흉선 조직 슬라이스로부터의 배양 상징액에서 알아낸 추가의 생체표지자는 CC25(TECK), 오스테오폰틴(OPN), uPAR(CD87), MIF, CCL20(MIP-3a) 및 IGFBP-1을 포함한다. 방출이 사람 흉선에서 대단히 중요한 세포 유형의 생존능 및/또는 활성화를 반영할 수 있는 추가의 분석물의 연구는, 특히 흉선세포 소실에 대한 반응에 관해서, 임상적으로 및 기계론적으로 중요한 통찰력에 이를 수 있다.
CCL25 (TECK): 검출가능한 수준의 TECK가 검사되는 3 개 흉선 배양물 중 2 개의 배양 기간의 후기에 몇몇 상징액 샘플에만 존재할지라도, 그것은 이 케모카인이 흉선세포에 대해 화학주성이 있다는 것을 보여주었기 때문에(Liu 2005) 흥미롭다. 그것은 흉선 수지상 세포(DC)에 의해 및 FoxN1+ 및 FoxN1- TE 세포 둘 모두에 의해 발현된다고 알려져 있다(Bunting 2011). 그러나, 그의 활성은 이 케모카인의 단독 수용체인 CCR9가 고갈된 마우스 연구에 기초하여 흉선 발달에 대단히 중요한 것으로 보이지 않는다(Wurbel 2001).
마이크로어레이 연구에 기초하여, 컨디셔닝된 배양 배지에서 가용성 L-셀렉틴 수준이 배양된 흉선 슬라이스에서 흉선세포 존재 및 생존능의 잠재적 생체표지자로서 역할할 수 있다는 것을 결정하였다. 이것은 매우 타당한 것 같고, 그 이유는 L-셀렉틴의 발현이 조혈 세포에 제한되고, 구성적으로 뿐만 아니라 이동 동안에 탈락되고(Hafezi-Moghadam et al. 2001), 그 다음에 보통 생체내에서 건강한 세포에 의해 신속하게 재발현되기(Fitzhugh et al. 2008) 때문이다.
실험 결과는 조직학 및 CD3 면역조직화학에 의한 흉선세포 막 완전성의 소실 뿐만 아니라 Ki-67 면역조직화학에 의한 특징적 흉선세포 증식의 결여에 의해 지시되는 바와 같이, L-셀렉틴 방출의 소실이 흉선세포 죽음과 일시적으로 상관 있다는 것을 보여준다.
배양된 사람 흉선 슬라이스의 흉선세포 함량을 비파괴적으로 모니터할 수 있다는 것은 실험 연구의 가장 적당한 수확 시점을 확인하는 데 중요하다. 이것은 또한 임상적으로 중요한 정보를 제공할 수 있고, 그 이유는 기증자 흉선세포의 고갈을 통해 수혜자 흉선세포에 의한 집락화를 위해 발생 틈새(developmental niche)를 개방하는 것이 흉선 임플란테이션에 의한 무흉선 환자의 성공적 면역 재구성에 대단히 중요하다고 믿기 때문이다. 종합해보면, 실시예에서 제시된 연구들은 감소된 L-셀렉틴 방출이 배양된 흉선 슬라이스에서 흉선세포 고갈을 모니터하기 위한 유용한 생체표지자임을 시사한다.
흉선 상피의 존재 및 기능을 반영하는 생체표지자는 또한 대단히 중요한 임상적 기계론적 정보를 제공할 수 있다. 실시예에서 나타낸 연구는 CCL21에 집중하였고, 그 이유는 마이크로어레이 스크린이 이 케모카인이 배양을 시작한 후 곧 배지에 높은 수준으로 분비되기 시작했다는 것을 지시하였기 때문이다. CCL21이 흉선 상피에 의해 발현되고 흉선세포 및 그의 전구체에 대해 화학주성이 있다는 것을 이전에 보여주었다(Liu et al. 2005). 본 발명자들의 연구는 CCL21의 발현이 또한 효소 면역검정에 의해 쉽게 정량화될 수 있다는 것을 보여주었다. 면역조직화학은 배양된 뿐만 아니라 비배양된 흉선에서 TEC에 의한 CCL21 발현을 확증하였고, 수질 및 피막하 피질 흉선 상피에서 가장 강한 발현이 일어났다.
또한 흉선 슬라이스의 CCL21 면역반응성이 배양 동안에 CCL21 분비가 증가함에 따라 반드시 증가하지는 않았다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 이것은 생성된 추가의 CCL21이 그것이 면역조직화학에 의해 검출될 수 있는 세포질에 보유되기보다는 오히려 분비된다는 것을 반영할 수 있다. CCL21은 짧은 반감기를 갖는 전사에 의해 조절되는 높은 턴오버(turnover) 분자이고(Dudal et al. 2015), 따라서 관찰된 양성 면역조직화학적 반응성은 이 케모카인을 활발하게 생성하고 있는 세포를 나타낸다. CCL21의 생성이 배양된 흉선 및 비조작된 노화 흉선 둘 모두에서 흉선세포가 감소함에 따라 현저하게 증가한다는 것은 흉선 상피 세포가 흉선세포 함량을 감지하여 흉선세포 소실에 대항하려는 항상성 시도로 반응할 수 있다는 것을 시사한다.
TEC의 생존능 및 기능을 반영하는 분비된 생체표지자로서의 CCL21의 확인은 또한 흉선 이식에 관해서 임상적으로 중요하다. 임플란팅되는 조직의 품질을 사정할 수 있는 대부분 확립된 방법(예를 들어 유동 세포 분석, 면역조직화학, 유전자 발현 분석)은 분석 동안에 샘플을 파괴한다. 궁극적인 임플란테이션에 이용가능한 조직의 양을 감소시키는 것 외에 추가로, 그러한 결과는 시험되는 슬라이스(들)가 궁극적으로 임플란팅되는 슬라이스의 부분이 아니기 때문에 샘플링 오류가 생긴다. 도 53c에서 보여주는 바와 같이, CCL21의 취합된 소모된 배지의 검정은 임의의 주어진 흉선 기증자로부터 유래된 로트(lot)에서 모든 슬라이스 전체에 걸쳐서 적분하여, 전체 로트 품질의 비파괴적 묘사를 제공한다.
케모카인 CXCL12 (SDF-1α)은 그것이 배양 기간 동안에 상대적으로 후기에 컨디셔닝된 배지에서 검출가능해진다는 점에서 스크리닝에서의 대부분 다른 분석물과 상이하였다(도 50h). 제13 일 - 제15 일에 처음 검출가능하였고, 그것은 배양에서 그 다음 주 동안에 선형으로(ln 플롯에서) 훨씬 더 높은 수준까지 올라갔다. CXCL12가 피막하 피질 및 수질 TEC에 의해 생성된다는 것이 실증되었지만, 또한 흉선 내에 존재하는 흉선 섬유모세포 및 내피 세포에 의해 만들어질 수 있다(Bunting et al. 2011; Hernandez-Lopez et al. 2002; Zaitseva et al. 2002). CXCL12는 B 세포 및 항원-제시 세포를 흉선에 동원하고(Weiss et al. 2013), 이는 완전한 흉선 기능의 생성에 중요할 것으로 예상된다. CXCL12는 또한 흉선 내에 흉선세포 부분집합의 국지화에 관여하고, 그것은 IL-7로의 흉선세포 증식을 증진시킨다(Hernandez-Lopez et al. 2002). 중요하게는, CXCL12를 중화하는 항체가 시험관내에서 사람 흉선 장기 배양물에서 흉선세포생성을 감소시킨다는 것을 보여주었고, CXCL12의 첨가는 이들 배양물에서 흉선세포생성을 증가시킨다(Hernandez-Lopez et al. 2002). 여기서 보여주는 시험관내 흉선 장기 배양물 동안 더 나중 시기의 CXCL12 분비는, 더 어린 기증자와 비교해서 >18세 기증자로부터 유래된 흉선에서 그의 증가된 생체내 발현과 조합해서, 이 케모카인의 발현이 CCL21의 유도된 분비에 요구되는 것보다 더 오래 계속되는 흉선세포 고갈에 의해 유도된다는 것을 시사한다.
스크리닝 데이터는 CXCL16 및 CCL11을 포함해서 다른 케모카인이 배양된 흉선의 생존능 및 기능을 사정하기 위한 생체표지자일 것 같다는 것을 시사하고, 그 이유는 그들이 또한 흉선 장기 배양물 동안에 흉선세포가 소실됨에 따라 증가하기 때문이다. CXCL16 및 CCL11 둘 모두가 TEC에 의해 만들어진다는 것을 이전에 보여주었다(Bunting et al. 2011).
CCL11은 호산구를 유인하는 그의 능력 때문에 에오탁신이라고 원래 명명되었다. 본 발명자들은 호산구 침윤물이 활발한 흉선세포생성과 함께 흉선 조직에 인접해서 두드러질 수 있다는 것을 이전에 보여주었지만(Flores et al. 1999), 그 연구에서는 CCL11 수준이 직접적으로 측정되지 않았다. 그러나, 그 후에 또한 CCL11이 이중-양성 및 단일-양성 사람 흉선세포 둘 모두를 위한 화학유인물질로서 역할한다는 것을 보여주었다(Bunting et al. 2011). 흉선세포생성에서 CXCL16의 특이적 역할의 증거는 덜 분명하다.
실시예에서 제시된 연구는 생존가능 흉선세포의 존재의 생체표지자로서 L-셀렉틴의 사용 및 흉선세포 전구체가 이용가능해진 경우 효율적인 면역 재구성을 예측할 수도 있는 TEC 생존능의 생체표지자로서 CCL21의 사용을 유효성 확인한다. CCL21의 생성은 대표적으로 더 나이 많은 연령 성인으로부터의 배양된 흉선 슬라이스 및 비배양된 흉선 조직 둘 모두에서 흉선세포생성이 견고할 때는 낮고 흉선세포생성이 제대로 발휘되지 않을(compromised) 때는 현저하게 유도된다. 흥미롭게도, TEC 영역 또는 활성 피질 영역으로 정규화 후, 더 나이 어린 기증자(≤18 세)로부터의 흉선조직은 더 나이 많은 성인으로부터의 흉선보다 더 많은 CD3epsilon 및 CD1A mRNA 및 더 적은 케라틴8 (KRT8) 및 케라틴14(KRT14) mRNA를 계속 발현하였다. 이것은 흉선세포생성 및 TEC 유지가 이들 더 나이 어린 기증자에서 잠재적으로 더 효율적일 수 있다는 것을 시사한다. 게다가, 두 정규화 방법 모두에서, TEC 함량 및 활발한 흉선세포생성이 더 나이 어린 기증자에 비해 감소하는 시간대에서는 CCL21 및 CXCL12의 생성이 >18세 기증자로부터 유래된 조직에서 현저히 증가한다. 흉선세포의 수가 흉선 장기 배양물에서 시험관내 및 노화 동안의 생체내 둘 모두에서 감소함에 따라 CCL21 및 CXCL12 둘 모두의 발현이 증가한다는 것은 이들 케모카인의 유도가 T 세포 전구체의 증진된 동원을 통해 감소된 흉선세포 수에 대응하려고 시도하는 항상성 메카니즘의 일부일 가능성을 높인다. 흉선세포-고갈된 배양된 흉선 슬라이스에 의한 흉선세포-유인 케모카인의 증가된 분비는, 그러한 슬라이스가 무흉선 유아 수혜자에게 임플란팅될 때 관찰되는 바와 같이(Markert et al. 2008), 그들의 집락화 및 면역재구성을 초래하는 능력을 증진시킬 것으로 예상될 것이다. 대조적으로, 흉선세포 전구체의 이용가능성 또는 흉선 마이크로환경의 다른 대단히 중요한 측면이 제한하는 경우, CCL21 및 CXCL12의 풍부한 분비는 노화 동안에 더 적은 이익을 제공할 수 있다.
종합해서, 이들 연구는 소아 기증자로부터 유래된 흉선의 장기 배양물이 사람에서 연령-관련 흉선 퇴화의 적어도 일부 측면, 특히, 흉선세포의 소실과 더 직접적으로 관련된 것들을 모델화하는 데 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 그러나, T 세포-고갈된 배양된 소아 흉선은 다른 방식으로 노화된 성인 흉선과 실질적으로 상이해야 한다는 것이 분명하고, 그 이유는 무흉선 수혜자에 T 세포-고갈된 배양된 소아 흉선의 임플란테이션이 면역 재구성 및 감염으로부터의 보호를 초래하고, 반면에 퇴화된 흉선을 갖는 노화된 성인은 더 견고한 흉선 기능을 갖는 더 나이 어린 성인보다 감염에 더 취약하기 때문이다. Palmer, S, Albergante L, Blackburn CC, Newman TJ. Thymic involution and rising disease incidence with age. Pr℃ Natl Acad Sci USA 11colk:1883-1888, 2018.
본원에서 도 56에서 제시된 결과는 배양된 유아 흉선을 사용하여 시험관내에서 사람 흉선 노화의 일부 측면을 모델화하는 잠재적 생체표지자로서 추가의 분자 및 경로의 풍부한 원천을 제공한다. 이것은 교정 심장 수술을 위해 수술 필드(operative field)를 적절히 노출시키기 위해 대부분 유아로부터 흉선의 일부를 제거해야 하는 필요를 고려하면 유아 흉선이 대표적으로 연구에 더 쉽게 이용가능하기 때문에 중요하다. 성인 흉선 조직은 대표적으로 덜 쉽게 이용가능하고, 그 이유는 성인에서 흔한 많은 유형의 심장 수술을 위한 통로를 제공하기 위해 흉선 조직을 제거하는 것이 일반적으로 필요하지 않기 때문이다. 추가로, 제거된 임의의 성인 흉선 조직은 표적으로 연구에 이용가능하지 않으며, 그 이유는 그것이 덜 오가노이드 같이 보이고, 총체적으로 지방과 유사하기 때문이다. 그러나, 성인 고형 장기 수혜자에서 관용이 요망되는 경우에 잠재적으로 성인 흉선 조직이 배양되어서 고형 장기와 동시이식하는 데 사용될 것이다. 생체표지자는 또한 성인 기증자로부터 유래된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 적합성, 기능성 및 생존능을 결정하는 데 유용하다.
흉선세포 화학유인물질 CCL21, CXCL16, CXCL12 및 CCL11의 흉선 생성은 흉선세포 함량이 감소함에 따라 증가한다. 이것은 비록 궁극적으로는 노화 상황에서 성공하지 못할지라도 흉선세포 소실이 잠재적 위축에 대응하려고 시도하는 항상성 메카니즘을 활성화할 수 있고, 이들 메카니즘을 더 충분히 밝히는 추가 연구가 연령-관련 흉선 퇴화를 구동시키는 메카니즘을 이해하고 잠재적으로 반전시키는 데 유용할 것이고, 모든 연령에서 흉선-구동 면역 재구성을 증진시키는 것을 도울 수 있다는 것을 시사한다.
본 개시물의 한 측면에서, 사람에게 임플란테이션하기에 적합한 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 생성하는 방법이 제공되는데, 이는 기증자 흉선을 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리하는 단계를 포함하고; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고; 추가로, 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 증가하는 수준의 CCL21을 검출하는 단계; 및 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 임플란테이션에 적합한 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로서 회수하는 단계를 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 추후 임플란테이션을 위해 액체 질소에 동결보존하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴의 감소하는 수준을 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 CCL21, CXCL12, CXCL16 또는 CCL11 중 하나 이상을 검출하는 단계를 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 CXCL12, CXCL16 또는 CCL11 중 하나 이상의 증가하는 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 CXCL12의 증가하는 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 증가하는 CXCL16을 검출하는 단계를 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 CCL11의 증가하는 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 M-CSF, 갈렉틴-7 또는 IL-16 중 하나 이상을 검출하는 단계를 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 M-CSF, 갈렉틴-7 또는 IL-16 중 하나 이상의 감소하는 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 M-CSF의 감소하는 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 갈렉틴-7의 감소하는 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 IL-16의 감소하는 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 컨디셔닝 레지멘은 5 일, 또는 6 일, 또는 7 일, 또는 8 일, 또는 9 일, 또는 10 일, 또는 11 일, 또는 12 일, 또는 13 일, 또는 14 일, 또는 15 일, 또는 16 일, 또는 17 일, 또는 18 일 또는 19 일, 또는 20 일, 또는 21 일의 기간 동안; 또는 5-6 일, 또는 5-7 일, 또는 5-8 일, 또는 5-9 일, 또는 5-10 일, 또는 6 내지 7 일, 또는 6 내지 8 일, 또는 6 내지 9 일, 또는 6 내지 10 일, 또는 6 내지 11 일, 또는 6 내지 12 일, 또는 6 내지 21 일, 또는 7 내지 21 일, 또는 8 내지 21 일, 또는 9 내지 21 일, 또는 10 내지 21 일, 또는 11 내지 21 일, 또는 12 내지 21 일, 13 내지 21 일 또는 14 내지 21 일, 또는 15 내지 21 일, 또는 16 내지 21 일 또는 17 내지 21 일 또는 18 내지 21 일, 또는 19 내지 21 일, 또는 20 내지 21 일의 기간 동안이다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, CCL21의 수준은 도 50e에서의 수준과 비슷하고/거나, L-셀렉틴의 수준은 도 50a에서의 수준과 비슷하고/거나, M-CSF의 수준은 도 50b에서의 수준과 비슷하고/거나, 갈렉틴-7의 수준은 도 50c에서의 수준과 비슷하고/거나, IL-16의 수준은 도 50d에서의 수준과 비슷하고/거나, CXCL16의 수준은 도 50f에서의 수준과 비슷하고/거나, CCL11의 수준은 도 50g에서의 수준과 비슷하고/거나, CXL21의 수준은 도 50h에서의 수준과 비슷하다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 기증자 흉선 조직 슬라이스에서 컨디셔닝 레지멘의 제6 일 내지 제21 일에, 바람직하게는 제6 일 내지 제9 일에 기증자 흉선 조직 슬라이스 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해 양성인 영역, 적어도 1 개 해살 소체의 존재, 기증자 흉선 조직 슬라이스 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색 및 원상태 핵의 존재를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 배양 레지멘 동안에 흉선 장기 배지에서 적어도 1 개, 또는 적어도 2개, 또는 적어도 3 개, 또는 적어도 4 개, 또는 적어도 5 개, 또는 적어도 6 개, 또는 적어도 7 개 표지자의 수준을 검출하거나, 또는 컨디셔닝 레지멘 동안에 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 및 CCL11로부터 선택되는 적어도 8 개 표지자를 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 배양 레지멘 동안에 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시물의 한 측면에서, 기증자 흉선 조직 슬라이스를 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 컨디셔닝하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계; 및 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 및 CCL11로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하는 단계를 포함하는 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 사람에게 임플란테이션하기에 적합한지 여부를 결정하는 방법이 제공된다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 적어도 1 개 표지자가 L-셀렉틴이고, 여기서 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴의 수준은 시간에 따라, 즉 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 적어도 1 개 표지자가 M-CSF이고, 여기서 흉선 장기 배지에서 M-CSF의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 적어도 1 개 표지자는 갈렉틴-7이고, 여기서 흉선 장기 배지에서 갈렉틴-7의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 적어도 1 개 표지자는 IL-16이고, 여기서 흉선 장기 배지에서 IL-16의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 적어도 1 개 표지자는 CCL21이고, 여기서 흉선 장기 배지에서 CCL21의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 적어도 1 개 표지자는 CXCL12이고, 여기서 흉선 장기 배지에서 CXCL12의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 적어도 1 개 표지자는 CXCL16이고, 여기서 흉선 장기 배지에서 CXCL16의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 적어도 1 개 표지자는 CCL11이고, 여기서 흉선 장기 배지에서 CCL11의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가한다.
본 개시물의 한 측면에서, 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 사람에게 임플란테이션하기에 적합한지 여부를 결정하는 방법이 제공하는데, 이러한 방법은 기증자 흉선 조직 슬라이스를 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 컨디셔닝하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계; 및 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 기증자 흉선 조직 슬라이스에서 컨디셔닝 레지멘의 제6 일 내지 제21 일에 기증자 흉선 조직 슬라이스 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해 양성인 영역, 적어도 1 개 해살 소체의 존재, 기증자 흉선 조직 슬라이스 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색 및 원상태 핵의 존재을 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 컨디셔닝 레지멘은 5 일, 또는 6 일, 또는 7 일, 또는 8 일, 또는 9 일, 또는 10 일, 또는 11 일, 또는 12 일, 또는 13 일, 또는 14 일, 또는 15 일, 또는 16 일, 또는 17 일, 또는 18 일 또는 19 일, 또는 20 일, 또는 21 일의 기간 동안; 또는 5-6 일, 또는 5-7 일, 또는 5-8 일, 또는 5-9 일, 또는 5-10 일, 또는 6 내지 7 일, 또는 6 내지 8 일, 또는 6 내지 9 일, 또는 6 내지 10 일, 또는 6 내지 11 일, 또는 6 내지 12 일, 또는 6 내지 21 일, 또는 7 내지 21 일, 또는 8 내지 21 일, 또는 9 내지 21 일, 또는 10 내지 21 일, 또는 11 내지 21 일, 또는 12 내지 21 일, 13 내지 21 일 또는 14 내지 21 일, 또는 15 내지 21 일, 또는 16 내지 21 일 또는 17 내지 21 일 또는 18 내지 21 일, 또는 19 내지 21 일, 또는 20 내지 21 일의 기간 동안이다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, CCL21의 수준은 도 50e에서의 수준과 비슷하고/거나 L-셀렉틴의 수준은 도 50a에서의 수준과 비슷하고/거나, M-CSF의 수준은 도 50b에서의 수준과 비슷하고/거나, 갈렉틴-7의 수준은 도 50c에서의 수준과 비슷하고/거나, IL-16의 수준은 도 50d에서의 수준과 비슷하고/거나, CXCL16의 수준은 도 50f에서의 수준과 비슷하고/거나, 여기서 CCL11의 수준은 도 50g에서의 수준과 비슷하고/거나, CXL21의 수준은 도 50h에서의 수준과 비슷하다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 및 CCL11로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준, 또는 적어도 2 개, 적어도 3 개, 적어도 4 개, 적어도 5 개, 적어도 6 개, 적어도 7 개의 수준을 검출하거나 또는 적어도 8 개 표지자를 검출하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 감소하고, 추가로 여기서 CCL21, CXCL12, CXCL16, 및 CCL11의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 증가한다.
본 발명의 한 측면에서, 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 사람에게 임플란테이션하기에 적합한지 여부를 결정하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 기증자 흉선 조직 슬라이스를 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 컨디셔닝하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계; 및 도 56의 표지자로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 사람에게 임플란테이션하기에 적합한지 여부를 결정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 이 기증자 흉선 조직 슬라이스를 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 컨디셔닝하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계; 및 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
본 개시물의 한 측면에서, 흉선 장애 치료 방법에 관한 것으로, 개선점이 흉선 장애를 가지는 대상체에게 컨디셔닝 레지멘으로 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 슬라이스를 임플란팅하는 것을 포함하고; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계; 및 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 및 CCL11로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하는 단계를 포함한다,
본 개시물의 또 다른 측면에서, 흉선 장애 치료 방법에 관한 것으로, 개선점이 흉선 장애를 가지는 대상체에게 컨디셔닝 레지멘으로 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 슬라이스를 임플란팅하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계; 및 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하는 단계를 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 적어도 1 개 표지자는 L-셀렉틴이고, 여기서 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 적어도 1 개 표지자는 M-CSF이고, 여기서 흉선 장기 배지에서 M-CSF의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 적어도 1 개 표지자는 갈렉틴-7이고, 여기서 흉선 장기 배지에서 갈렉틴-7의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 적어도 1 개 표지자는 IL-16이고, 여기서 흉선 장기 배지에서 IL-16의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 적어도 1 개 표지자는 CCL21이고, 여기서 흉선 장기 배지에서 CCL21의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 적어도 1 개 표지자는 CXCL12이고, 여기서 흉선 장기 배지에서 CXCL12의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 적어도 1 개 표지자는 CXCL16이고, 여기서 흉선 장기 배지에서 CXCL16의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 적어도 1 개 표지자는 CCL11이고, 여기서 흉선 장기 배지에서 CCL11의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 컨디셔닝 레지멘 동안에 기증자 흉선 조직 슬라이스에서 기증자 흉선 조직 슬라이스 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해 양성인 영역, 적어도 1 개 해살 소체의 존재, 기증자 흉선 조직 슬라이스 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색 및 원상태 핵의 존재를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 흉선 장애는 완전형 디죠지 증후군, 22q11.2 결손, CHARGE (안과적 결손증, 심장 결함, 후비공 폐쇄증, 성장 또는 정신 지체, 생식기관형성저하증 및 귀 기형 또는 난청), CHD7 (크로모도메인-헬리카제-DNA-결합 단백질 7) 유전자에서의 돌연변이 또는 포크헤드 박스 단백질 N1 (FOXN1) 결핍과 관련된 선천성 무흉선증이다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 흉선 장애는 흉선 퇴화이다. 또 다른 실시양태에서, 흉선 장애는 TBX-1 또는 TBX-2 유전자에서의 돌연변이와 관련된 선천성 무흉선증이다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 흉선 장애는 쌍을 이룬 박스 1 (PAX1), 세마포린 3E(SEMA3E), 및 염색체 2p11.2에서의 재발성 미세결손과 관련된다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 흉선 장애는 흉선종과 관련된다. 추가의 실시양태에서 흉선종은 비악성 또는 악성이다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 흉선 장애는 중증 근무력증(MG), 순수 적혈구 무형성 및 저감마글로불린혈증과 관련된다.
본 개시물의 한 측면에서, 사람 대상체에 면역적격성을 제공하는 방법이 제공되며, 개선점이 기증자 흉선 조직 슬라이스를 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 컨디셔닝하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계; 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하고; 여기서 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, 또는 IL-1인 경우에는 수준이 감소하거나 또는 표지자가 CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11인 경우에는 수준이 증가하는 것인, 단계; 및 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 사람 대상체에게 임플란팅하는 단계를 포함한다.
본 개시물의 한 측면에서, 사람 대상체에 면역적격성을 제공하는 방법이 제공되며, 개선점이 기증자 흉선 조직 슬라이스를 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 컨디셔닝하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계; 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터의 표지자로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하는 단계; 및 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 사람 대상체에 임플란팅하는 단계를 포함한다.
본 개시물의 한 측면에서, 고형 장기 이식물을 받은 사람 대상체에 면역적격성을 제공하는 방법이 제공되며, 이 방법은 사람 대상체의 흉선을 제거하는 단계; 고형 장기에서 HLA-Class I 및 HLA-Class II 대립유전자와 일치하는 기증자로부터 흉선 조직을 얻는 단계; 기증자 흉선을 슬라이싱하는 단계; 기증자 흉선 조직 슬라이스를 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 컨디셔닝하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계; 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하고; 여기서 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, 또는 IL-1인 경우에는 수준이 감소하거나 또는 표지자가 CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11인 경우에는 수준이 증가하는 것인, 단계; 고형 장기를 임플란팅하는 단계; 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 사람 대상체에게 임플란팅하는 단계를 포함한다.
이 모델에서 관용의 발달을 더 잘 이해하기 위해, 도 38을 참조할 수 있고, 도 38은 기증자-특이적 관용을 생성하기 위해 사람 연구를 지지하는 데이터를 제공할 이 절차의 영장류 모델을 가진다. 도 38의 실험은 3 마리 원숭이를 가진다. 한 마리는 흉선 및 심장 기증자이다(좌측 칸에 있는 정보). 　두 번째 원숭이는 흉선 및 심장 수혜자이다(두 번째 페이지의 중간 칸에 있는 정보. 이 칸은 실험의 기(stage)를 가진다).　 세번째 원숭이는 대조군이다(세번째 페이지의 우측 칸에 있는 정보). 원래 스프레드시트는 3 마리 동물 모두의 절차를 한 페이지 폭, 많은 페이지 길이에 가졌다는 것을 주목하길 바란다. 스프레드 시트가 허용된 폭보다 더 넓었기 때문에, 스프레드 시트의 각 줄은 3 페이지로 나누어졌다. 표는 3 마리 패널의 군에서 많은 주 및 여러 기 동안 계속된다.
본 개시물의 한 측면에서, 고형 장기 이식물을 받은 사람 대상체에 면역적격성을 제공하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 사람 대상체의 흉선을 제거하는 단계; 고형 장기에서 HLA-Class I 및 II 대립유전자와 일치하는 기증자로부터 흉선 조직을 얻는 단계; 기증자 흉선을 슬라이싱하는 단계; 기증자 흉선 조직 슬라이스를 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 컨디셔닝하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계; 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하는 단계; 고형 장기를 임플란팅하는 단계; 및 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 사람 대상체에게 임플란팅하는 단계를 포함한다.
본 개시물의 한 측면에서, 고형 장기 이식물을 받은 사람 대상체에 면역적격성을 제공하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 사람 대상체의 흉선을 제거하는 단계; 고형 장기에서 HLA-Class I 및 HLA-Class II 대립유전자 둘 모두와 일치하는 기증자로부터 흉선 조직을 얻는 단계; 기증자 흉선을 슬라이싱하는 단계; 기증자 흉선 조직 슬라이스를 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 컨디셔닝하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계; 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하고; 여기서 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, 또는 IL-1인 경우에는 수준이 감소하거나 또는 표지자가 CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11인 경우에는 수준이 증가하는 것인, 단계; 고형 장기를 임플란팅하는 단계; 및 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 사람 대상체에게 임플란팅하는 단계를 포함한다.
본 개시물의 한 측면에서, 고형 장기 이식물을 받은 사람 대상체에 면역적격성을 제공하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 사람 대상체의 흉선을 제거하는 단계; 고형 장기에서 HLA-Class I 및 HLA-Class II 대립유전자 둘 모두와 일치하는 기증자로부터 흉선 조직을 얻는 단계; 기증자 흉선을 슬라이싱하는 단계; 기증자 흉선 조직 슬라이스를 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 컨디셔닝하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계; 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하는 단계; 고형 장기를 이식하는 단계; 및 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 사람 대상체에게 임플란팅하는 단계를 포함한다.
본 개시물의 한 측면에서, 다음 단계들을 포함하는 고형 장기 이식물을 필요로 하는 수혜자에서 사후 기증자로부터 얻은 동종 고형 장기 이식물에 대한 기증자-특이적 관용을 촉진시키는 방법이 제공된다:
(a) 수혜자의 흉선을 제거하는 단계;
(b) 수혜자를, 수혜자의 T 세포를 고갈시키고/거나 수혜자의 T 세포가 이식된 고형 장기를 거부하는 것을 억제하는 하나 이상의 면역억제제를 포함하는 유도 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(c) 사후 기증자로부터 적합한 고형 사람 장기 및 흉선샘 둘 모두를 제공하는 단계;
(d) 고형 사람 장기를 수혜자에게 이식하는 단계;
(e) 수혜자를 유지 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(f) 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 제공하는 단계로서, 여기서 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 컨디셔닝 레지멘으로 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리되어 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 슬라이스를 생성하는 것이고; 추가로 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고; 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하고; 여기서 흉선 장기 배지에서 표지자의 수준이 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, 또는 IL-1인 경우에는 감소하거나 또는 표지자가 CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11인 경우에는 증가하는 것인, 단계; 및
(g) 약 6 일 내지 약 21 일의 컨디셔닝 레지멘 후에 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 수혜자에게 임플란팅하는 단계로서, 여기서 흉선 조직 슬라이스의 용량이 약 1,000 - 22,000 mm2의 흉선 조직 표면적/m2 수혜자 체표면적이고, 추가로 여기서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 수혜자에서 흉선세포생성 및 관용을 유도하는 것인 단계.
본 개시물의 한 측면에서, 다음 단계들을 포함하는 고형 장기 이식물을 필요로 하는 수혜자에서 사후 기증자로부터 얻은 동종 고형 장기 이식물에 대한 기증자-특이적 관용을 촉진시키는 방법이 제공된다:
(a) 수혜자의 흉선을 제거하는 단계;
(b) 수혜자를, 수혜자의 T 세포를 고갈시키고/거나 수혜자의 T 세포가 이식된 고형 장기를 거부하는 것을 억제하는 하나 이상의 면역억제제를 포함하는 유도 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(c) 사후 기증자로부터 적합한 고형 사람 장기 및 흉선샘 둘 모두를 제공하는 단계;
(d) 고형 사람 장기를 수혜자에게 이식하는 단계;
(e) 수혜자를 유지 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(f) 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 제공하는 단계로서, 여기서 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 컨디셔닝 레지멘으로 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리되어 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 슬라이스를 생성하는 것이고; 추가로 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고; 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하는 단계; 및
(g) 약 6 일 내지 약 21 일의 컨디셔닝 레지멘 후에 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 수혜자에게 임플란팅하는 단계로서, 여기서 흉선 조직 슬라이스의 용량이 약 1,000 - 22,000 mm2의 흉선 조직 표면적/m2 수혜자 체표면적이고, 추가로 여기서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 수혜자에서 흉선세포생성 및 관용을 유도하는 것인 단계.
본 개시물의 한 측면에서, 다음 단계들을 포함하는 고형 장기 이식물을 필요로 하는 사람 수혜자에서 생체 사람 기증자로부터 얻은 동종 고형 장기 이식물에 대한 기증자-특이적 관용을 촉진시키는 방법이 제공된다:
(a) 수혜자의 흉선을 제거하는 단계;
(b) 수혜자를, 수혜자의 T 세포를 고갈시키고/거나 수혜자의 T 세포가 이식된 고형 장기를 거부하는 것을 억제하는 하나 이상의 면역억제제를 포함하는 유도 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(c) 생체 사람 기증자로부터 적합한 고형 장기를 제공하는 단계;
(d) 고형 장기를 수혜자에게 이식하는 단계;
(e) 수혜자를 유지 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(f) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 은행에서 유지되는 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 제공하는 단계로서, 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 고형 장기 이식물에 존재하지 않는 수혜자에서의 HLA-Class I 및 HLA-Class II 대립유전자와 일치되는 HLA 대립유전자를 발현하는 흉선 기증자로부터의 흉선 조직으로부터 가공되는 것이고; 여기서 기증자 흉선 조직이 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리되는 것이고; 추가로 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고; 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하고; 여기서 흉선 장기 배지에서 표지자의 수준이 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, 또는 IL-1인 경우에는 감소하거나 또는 표지자가 CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11인 경우에는 증가하는 것인, 단계;
(g) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 해동하는 단계; 및
(h) 해동된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 수혜자에게 임플란팅하는 단계로서, 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 용량이 약 1,000 - 22,000 mm2의 흉선 조직 표면적/m2 수혜자 체표면적이고, 추가로 여기서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 수혜자에서 흉선세포생성 및 관용을 유도하는 것인 단계.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, HLA-DP의 허용적(permissive) 불일치가 허용될 수 있다(Pidala J et al 2014 Blood 124:2596-2606). 추가로, 충분한 수치적 기능적 거리가 있는 경우에는 HLA-DPB1의 비허용적 불일치가 허용될 수 있다 (Crivello P et al 2016 Blood 128:120-129).
본 발명의 한 측면에서, 다음 단계들을 포함하는 고형 장기 이식물을 필요로 하는 사람 수혜자에서 생체 사람 기증자로부터 얻은 동종 고형 장기 이식물에 대한 기증자-특이적 관용을 촉진시키는 방법이 제공된다:
(a) 수혜자의 흉선을 제거하는 단계;
(b) 수혜자를, 수혜자의 T 세포를 고갈시키고/거나 수혜자의 T 세포가 이식된 고형 장기를 거부하는 것을 억제하는 하나 이상의 면역억제제를 포함하는 유도 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(c) 생체 사람 기증자로부터 적합한 고형 장기를 제공하는 단계;
(d) 고형 장기를 수혜자에게 이식하는 단계;
(e) 수혜자를 유지 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(f) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 은행에서 유지되는 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 제공하는 단계로서, 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 고형 장기 이식물에 존재하지 않는 수혜자에서의 HLA-Class I 및 HLA-Class II 대립유전자와 일치되는 HLA 대립유전자를 발현하는 흉선 기증자로부터의 흉선 조직으로부터 가공되는 것이고; 여기서 기증자 흉선 조직이 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리되는 것이고; 추가로 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고; 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하고; 여기서 흉선 장기 배지에서 표지자의 수준이 도 56의 표지자의 수준에 따라서 증가하거나 또는 감소하는 것인 단계;
(g) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 해동하는 단계; 및
(h) 해동된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 수혜자에게 임플란팅하는 단계로서, 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 용량이 약 1,000 - 22,000 mm2의 흉선 조직 표면적/m2 수혜자 체표면적이고, 추가로 여기서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 수혜자에서 흉선세포생성 및 관용을 유도하는 것인 단계.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 해동된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 약 1/2이 수혜자에게 이식되고, 나머지는 추후 사용을 위해 동결보존된다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 단계 (h)가 고형 장기 이식 후 약 1 개월 이상 후에 수행된다.
본 개시물의 한 측면에서, 다음 단계들을 포함하는 고형 장기 이식물을 필요로 하는 사람 수혜자에서 사후 사람 기증자로부터 얻은 동종 고형 장기 이식물에 대한 기증자-특이적 관용을 촉진시키는 방법이 제공된다:
(a) 수혜자의 흉선을 제거하는 단계;
(b) 수혜자를, 수혜자의 T 세포를 고갈시키고/거나 수혜자의 T 세포가 이식된 고형 장기를 거부하는 것을 억제하는 하나 이상의 면역억제제를 포함하는 유도 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(c) 생체 사람 기증자로부터 적합한 고형 장기를 제공하는 단계;
(d) 고형 장기를 수혜자에게 이식하는 단계;
(e) 수혜자를 유지 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(f) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 은행에서 유지되는 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 제공하는 단계로서, 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 고형 장기 이식물에 존재하지 않는 수혜자에서 HLA 대립유전자와 일치되는 HLA 대립유전자를 발현하는 흉선 기증자로부터의 흉선 조직으로부터 가공되는 것이고; 여기서 기증자 흉선 조직이 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리되는 것이고; 추가로 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고; 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하고; 여기서 흉선 장기 배지에서 표지자의 수준이 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, 또는 IL-1인 경우에는 감소하거나, 또는 표지자가 CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11인 경우에는 증가하는 것인, 단계;
(g) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 해동하는 단계; 및
(h) 해동된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 수혜자에게 임플란팅하는 단계로서, 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 용량이 약 1,000 - 22,000 mm2의 흉선 조직 표면적/m2 수혜자 체표면적이고, 추가로 여기서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 수혜자에서 흉선세포생성 및 관용을 유도하는 것인 단계.
본 개시물의 한 측면에서, 다음 단계들을 포함하는 고형 장기 이식물을 필요로 하는 사람 수혜자에서 사후 사람 기증자로부터 얻은 동종 고형 장기 이식물에 대한 기증자-특이적 관용을 촉진시키는 방법이 제공된다:
(a) 수혜자의 흉선을 제거하는 단계;
(b) 수혜자를, 수혜자의 T 세포를 고갈시키고/거나 수혜자의 T 세포가 이식된 고형 장기를 거부하는 것을 억제하는 하나 이상의 면역억제제를 포함하는 유도 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(c) 생체 사람 기증자로부터 적합한 고형 장기를 제공하는 단계;
(d) 고형 장기를 수혜자에게 이식하는 단계;
(e) 수혜자를 유지 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(f) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 은행에서 유지되는 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 제공하는 단계로서; 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 고형 장기 이식물에 존재하지 않는 수혜자에서의 HLA 대립유전자와 일치되는 HLA 대립유전자를 발현하는 흉선 기증자로부터의 흉선 조직으로부터 가공되는 것이고; 여기서 기증자 흉선 조직이 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리되는 것이고; 추가로 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고; 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하고; 여기서 흉선 장기 배지에서 표지자의 수준이 도 7의 수준에 따라서 증가하거나 또는 감소하는 것인 단계;
(g) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 해동하는 단계; 및
(h) 해동된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 수혜자에게 임플란팅하는 단계로서, 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 용량이 약 1,000 - 22,000 mm2의 흉선 조직 표면적/m2 수혜자 체표면적이고, 추가로 여기서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 수혜자에서 흉선세포생성 및 관용을 유도하는 것인 단계.
본 개시물의 한 측면에서, 다음 단계들을 포함하는 방법으로 제조된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 제공된다:
(a) 기증자로부터 적합한 흉선 조직을 얻는 단계;
(b) HLA 대립유전자: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQA1, HLA- DPB1, HLA-DPA1을 타이핑하는 단계;
(c) 흉선 조직을 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계;
(d) 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하고; 여기서 흉선 장기 배지에서 표지자의 수준이 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, 또는 IL-1인 경우에는 감소하거나, 또는 표지자가 CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11인 경우에는 증가하는 것인, 단계;
(e) 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로서 회수하는 단계;
(f) 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 액체 질소에서 동결보존하는 단계; 및
(g) 액체 질소 중의 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 은행에서 유지하는 단계.
본 개시물의 한 측면에서, 다음 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 있다:
(a) 기증자로부터 적합한 흉선 조직을 얻는 단계;
(b) HLA 대립유전자: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQA1, HLA-DPB1, HLA-DPA1을 타이핑하는 단계;
(c) 흉선 조직을 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계;
(d) 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하고; 여기서 흉선 장기 배지에서 표지자의 수준이 도 7의 수준을 따라서 증가하거나 또는 감소하는 것인 단계;
(e) 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로서 회수하는 단계;
(f) 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 액체 질소에서 동결보존하는 단계; 및
(g) 액체 질소 중의 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 은행에서 유지하는 단계.
본 개시물의 한 측면에서, 다음 단계들을 포함하는 고형 장기 이식물을 필요로 하는 사람 수혜자에서 사후 사람 기증자로부터 얻은 동종 고형 장기 이식물에 대한 기증자-특이적 관용을 촉진시키는 방법이 제공된다:
(a) 수혜자의 흉선을 제거하는 단계;
(b) 수혜자를, 수혜자의 T 세포를 고갈시키고/거나 수혜자의 T 세포가 이식된 고형 장기를 거부하는 것을 억제하는 하나 이상의 면역억제제를 포함하는 유도 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(c) 생체 사람 기증자로부터 적합한 고형 장기를 제공하는 단계;
(d) 고형 장기를 수혜자에게 이식하는 단계;
(e) 수혜자를 유지 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(f) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 은행에서 유지되는 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 제공하는 단계로서; 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 고형 장기 이식물에 존재하지 않는 수혜자에서의 HLA 대립유전자와 일치하는 HLA 대립 유전자를 발현하는 흉선 기증자로부터의 흉선 조직으로부터 가공되는 것이고; 여기서 기증자 흉선 조직이 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리되는 것이고; 추가로 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고, 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11로부터 선택되는 흉선 장기 배지에서의 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하고; 여기서 흉선 장기 배지에서 표지자의 수준이 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, 또는 IL-1인 경우에는 감소하거나 또는 표지자가 CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11인 경우에는 증가하는 것인, 단계;
(g) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 해동하는 단계; 및
(h) 해동된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 수혜자에게 임플란팅하는 단계로서, 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 용량이 약 1,000 - 22,000 mm2의 흉선 조직 표면적/m2 수혜자 체표면적이고, 추가로 여기서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 수혜자에서 흉선세포생성 및 관용을 유도하는 것인 단계.
본 개시물의 한 측면에서, 다음 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 제공된다:
(a) 기증자로부터 적합한 흉선 조직을 얻는 단계;
(b) HLA 대립유전자: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQA1, HLA- DPB1, HLA-DPA1을 타이핑하는 단계;
(c) 흉선 조직을 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계;
(d) 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11로부터 선택되는 흉선 장기 배지에서의 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하고; 여기서 흉선 장기 배지에서 표지자의 수준이 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, 또는 IL-1인 경우에는 감소하거나 또는 표지자가 CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11인 경우에는 증가하는 것인, 단계;
(e) 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로서 회수하는 단계;
(f) 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 액체 질소에서 동결보존하는 단계; 및
(g) 액체 질소 중의 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 은행에서 유지하는 단계.
본 개시물의 한 측면에서, 다음 단계들을 포함하는 고형 장기 이식물을 필요로 하는 수혜자에서 사후 사람 기증자로부터 얻은 동종 고형 장기 이식물에 대한 기증자-특이적 관용을 촉진시키는 방법이 제공된다:
(a) 수혜자의 흉선을 제거하는 단계;
(b) 수혜자를, 수혜자의 T 세포를 고갈시키고/거나 수혜자의 T 세포가 이식된 고형 장기를 거부하는 것을 억제하는 하나 이상의 면역억제제를 포함하는 유도 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(c) 생체 사람 기증자로부터 적합한 고형 장기를 제공하는 단계;
(d) 고형 장기를 수혜자에게 이식하는 단계;
(e) 수혜자를 유지 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
(f) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 은행에서 유지되는 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 제공하는 단계로서; 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 고형 장기 이식물에 존재하지 않는 수혜자에서의 HLA 대립유전자와 일치하는 HLA 대립유전자를 발현하는 흉선 기증자로부터의 흉선 조직으로부터 가공되는 것이고; 여기서 기증자 흉선 조직이 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리되는 것이고; 추가로 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하고, 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하고; 여기서 흉선 장기 배지에서 표지자의 수준이 도 56의 표지자의 수준에 따라서 증가하거나 또는 감소하는 것인 단계;
(g) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 해동하는 단계; 및
(h) 해동된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 수혜자에게 임플란팅하는 단계로서, 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 용량이 약 1,000 - 22,000 mm2의 흉선 조직 표면적/m2 수혜자 체표면적이고, 추가로 여기서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 수혜자에서 흉선세포생성 및 관용을 유도하는 것인 단계.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 고형 장기 이식물은 심장 이식물, 신장 이식물, 간 이식물, 폐 이식물, 심장/폐 이식물, 췌장 이식물, 장 이식물, 위 이식물, 복벽 이식물, 두개안면 이식물, 두피 이식물, 음경 이식물, 자궁 이식물, 일측성 또는 양측성 상지 이식물, 일측성 혈관화된 복합 동종이계이식편, 또는 그의 조합이다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 고형 장기 이식물은 심장 이식물, 또는 소아 심장 이식물, 또는 성인 심장 이식물이다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 컨디셔닝 레지멘은 5 일, 또는 6 일, 또는 7 일, 또는 8 일, 또는 9 일, 또는 10 일, 또는 11 일, 또는 12 일, 또는 13 일, 또는 14 일, 또는 15 일, 또는 16 일, 또는 17 일, 또는 18 일 또는 19 일, 또는 20 일, 또는 21 일의 기간 동안; 또는 5-6 일, 또는 5-7 일, 또는 5-8 일, 또는 5-9 일, 또는 5-10 일, 또는 6 내지 7 일, 또는 6 내지 8 일, 또는 6 내지 9 일, 또는 6 내지 10 일, 또는 6 내지 11 일, 또는 6 내지 12 일, 또는 6 내지 21 일, 또는 7 내지 21 일, 또는 8 내지 21 일, 또는 9 내지 21 일, 또는 10 내지 21 일, 또는 11 내지 21 일, 또는 12 내지 21 일, 13 내지 21 일 또는 14 내지 21 일, 또는 15 내지 21 일, 또는 16 내지 21 일 또는 17 내지 21 일 또는 18 내지 21 일, 또는 19 내지 21 일, 또는 20 내지 21 일의 기간 동안이다.
본 개시물의 한 측면에서, 다음 단계들을 포함하는 사람에게 임플란테이션하기에 적합한 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 제공된다:
(a) 사람 기증자로부터 적합한 흉선 조직을 얻는 단계;
(b) 흉선 조직을 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고; 여기서 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴, 및/또는 M-CSF 및/또는 갈렉틴-7 및/또는 IL-16의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소하는 것이고; 추가로 여기서 흉선 장기 배지에서 CCL21 및/또는 CXCL12 및/또는 CXCL16 및/또는 CCL11의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가하는 것인, 단계;
(c) 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로서 수확하는 단계;
(d) 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 액체 질소에서 동결보존하는 단계; 및
(e) 액체 질소 중의 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 은행에서 유지하는 단계.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 흉선 장기 배지에서 CCL21의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 흉선 장기 배지에서 M-CSF, 갈렉틴-7, 및 IL-16 중 하나 이상의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 흉선 장기 배지에서 CCL21, CXCL12, CXCL16, 및 CCL11 중 하나 이상의 수준은 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 방법은 기증자 흉선 조직 슬라이스에서 컨디셔닝 레지멘 동안에 기증자 흉선 조직 슬라이스 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해 양성인 영역, 적어도 1 개 해살 소체의 존재, 기증자 흉선 조직 슬라이스 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색 및 원상태 핵의 존재를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시물의 한 측면에서, 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 사람에게 임플란테이션하기에 적합한지를 결정함에 있어서 사용 설명서와 함께 임의의 전술한 측면 및 실시양태의 방법을 수행하기 위한 키트가 제공된다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 키트는 표지자 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11과 특이적으로 결합하는 적어도 1 개 항체를 포함한다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 키트는 도 56에 나타낸 표지자를 특이적으로 찾아내는 하나 이상의 항체를 포함한다.
본 개시물의 한 측면에서, 전술한 측면 및 실시양태 중 어느 하나에 따라 배양된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 사용 설명서와 함께 사람에게 임플란테이션하기에 적합한지를 결정하기 위한 키트가 제공된다.
본 개시물의 측면 및 실시양태 중 한 실시양태에서, 키트는 표지자 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11과 특이적으로 결합하는 적어도 1 개 항체를 포함한다.
추가로, 명료성을 위해 본 개시물의 상이한 측면들의 맥락에서 및/또는 별개의 실시양태에서 기술되는 본원에서 기술된 일부 특징이 또한 단일의 실시양태와 조합하여 제공될 수 있다는 것을 인식한다. 반대로, 간략성을 위해 본 개시물의 단일의 측면의 맥락에서 및/또는 단일의 실시양태에서 기술된 다양한 특징들은 또한 개별적으로 또는 임의의 적합한 하위조합으로 제공될 수 있다.
본원에서 개시된 원리 및 그의 이점의 더 완전한 이해를 위해, 첨부 도면과 함께 다루는 다음 설명을 참고한다:
도 1은 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물(예를 들어, CTT, RVT-802)이 임플란테이션 후 선천성 무흉선증에서 면역 재구성을 제공하는 방식을 기술한다.
도 2는 면역학적으로 정상인 루이스 래트에서 흉선을 제거하고, 항체를 투여하여 수혜자 래트의 T 세포를 살해하고, 기증자 래트로부터의 배양된 신생아 흉선 조직을 수혜자 래트에게 임플란팅하고, 면역억제제를 약 4 개월 동안 투여하고, 수혜자 래트에서 T 세포 발달을 평가함으로써 실시예 5에서 다른 곳에서 기술된 바와 같이 래트에서 면역계를 재구성하는 단계의 개략도를 보여준다. 중요하게는, 치료 그룹의 모든 래트가 시클로스포린을 중단하기 전에 10% 초과 나이브 T 세포를 가졌다.
도 3은 실시예 5의 두 실험 수혜자 래트(우측의 상승하는 선) 대 흉선 조직 임플란트를 수혜받지 않은 두 대조 래트(기저선의 두꺼운 선)에서 나이브 T 세포의 발달을 보여준다.
도 4는 기증자로부터 흉선을 수확하고, 핸드 마이크로톰으로 만든 기증자 흉선 조직의 얇은 슬라이스를 최장 21 일 동안 배양하고, 배양된 흉선 조직을 수혜자의 대퇴네갈래근에 임플란팅하기 위한 제작 방법의 개략도를 보여준다.
도 5a는 섹션 [00766]에서 논의되는 바와 같은 특성화 시험을 위한 흉선 조직의 슬라이싱을 보여주는 개략도를 보여준다. 도 5b는 흉선 배양에 사용되는 조직 배양 접시에 있는 수술용 스폰지 상의 셀룰로스 필터 상의 흉선 조직의 슬라이스를 보여주는 도면이다.
도 6a-h는 기증자로부터 흉선 수확 후 제5 일, 제9 일, 제12 일 및 제21 일에서의 배양된 흉선 조직의 로트(MFG-056)로부터 흉선 조직 슬라이스의 조직학 시험을 묘사한다. 헤마톡실린 및 에오신-염색 슬라이스(좌측 패널) 및 항-사이토케라틴 항체 AE1/AE3(우측 패널; 갈색은 양성 반응성을 나타냄)의 칵테일과의 그의 상응하는 반응성을 제5 일(도 6a, 도 6b), 제9 일(도 6c, 도 6d), 제12 일(도 6e, 도 6f), 및 제21 일(도 6g, 도 6h) 각각에서 보여준다. 각 패널의 좌측 하단의 바(bar)는 100 μm를 나타낸다. H&E를 갖는 패널은 시간에 따른 T 세포 고갈의 진행을 보여준다. 도 6e 및 도 6f는 주로 상피세포이다. 흉선세포가 시간에 따라 고갈됨에 따라 피막하 피질의 상피의 응축이 일어난다. 유사한 응축이 흉선의 수질 영역에서 일어난다. Photo by Laura P. Hale, MD, PhD, Department of Pathology, Duke University.
도 7a 및 7b는 각각 5 mm(도 9a) 및 100 μm(도 7b)의 축척으로 시간 경로의 제0 일의 흉선 조직 슬라이스의 조직학을 묘사한다. 이것은 제0 일의 저출력(바 5 mm) 및 고출력(바 100 um)에서의 흉선 및 흉선세포를 보여준다. 이것은 정상 흉선이다. 이 때 피질 및 수질 둘 모두가 많은 흉선세포를 가지고, 어두운 청색 핵은 조직의 전체 어두운 청색 외관에 기여한다. Photo by Laura P. Hale, MD, PhD, Department of Pathology, Duke University.
도 8a 및 8b는 각각 5 mm(도 8a) 및 100 μm(도 8b)의 축척으로 시간 경로의 제5 일의 흉선 조직 슬라이스의 조직학을 묘사하는 H&E 염색 슬라이드로부터의 이미지이다. 흉선세포의 고갈의 진행은 조직의 더 많은 호산구(분홍색) 외관을 초래한다. Photo by Laura P. Hale, MD, PhD, Department of Pathology, Duke University.
도 9a 및 도 9b는 각각 5 mm(도 9a) 및 100 μm(도 9b)의 축척으로 시간 경로의 제12 일의 흉선 조직 슬라이스의 H&E 염색을 묘사한다. 본 발명자들은 흉선세포의 진행성 고갈을 관찰한다. 더 높은 배율은 핵이 결여된 많은 호산구성 세포 소체를 보여주고, 이는 핵융해(핵의 용해)를 겪은 괴사성 세포의 증상을 보인다. 이 정도의 괴사는 배양에서 이 시점에서 예상된다. Photo by Laura P. Hale, MD, PhD, Department of Pathology, Duke University.
도 10a 및 도 10b는 각각 5 mm(도 10a) 및 100 μm(도 10b)의 축척으로 시간 경로의 제21 일의 흉선 조직 슬라이스의 H&E 염색을 묘사한다. 도 10b에서 많은 해살 소체를 함유하는 피막하 피질, 피질 영역 및 수질 영역을 포함하는 조직의 전체 아키텍처의 보존을 주목한다. 작은 어두운 세포는 주로 핵융해를 아직 겪지 않은 괴사성 흉선세포이다. Photo by Laura P. Hale, MD, PhD, Department of Pathology, Duke University.
도 11a-e는 항-사이토케라틴 항체(AE1/AE3)의 칵테일로 면역염색된 대표 흉선 슬라이스를 묘사한다. 도 11a. 제0 일; 도 11b. 제5 일; 도 11c. 제9 일; 도 11d. 제12 일; 및 도 11e. 제21 일. 흉선 상피 망상조직(network)의 구조는 배양이 진행할 때 여전히 원상태이다. 막대는 400 μm를 나타낸다. Photo by Laura P. Hale, MD, PhD, Department of Pathology, Duke University.
도 12a 및 12b는 10X PBS의 강제 분해 조건에 노출 후의 흉선 조직 슬라이드의 조직학을 묘사한다. 도 12a는 강제 분해 조건에 노출 후 제9 일에서의 피질을 묘사한다. 도 12b는 강제 분해 조건에 노출 후 제21 일에서의 피질을 묘사한다. 도 12a에서 청색 얼룩은 세포로부터 방출된 DNA이다. 세포들 대다수가 분해 증거를 보여주지만, 원상태 핵을 갖는 세포의 작은 초점을 확인할 수 있다. Photo by Laura P. Hale, MD, PhD, Department of Pathology, Duke University.
도 13은 임상 샘플 MLM247의 H&E 염색 조직학 절편을 묘사한다. 이것은 배양 제0 일이다. 막대는 200 um이다. 이것은 제0 일로부터의 냉동된 절편이다. 이것이 냉동되었기 때문에, 조직이 제0 일에서의 파라핀 포매된 포르말린 고정된 조직과 상이하게 보인다. Photo by Laura P. Hale, MD, PhD, Department of Pathology, Duke University.
도 14는 임상 샘플 MLM219의 냉동된 절편, H&E 염색된 조직학 절편. 이것은 냉동된 절편이고, 따라서 조직이 배양되고 위에서 제시된 파라핀 포매된 포르말린 고정된 조직과 상이하게 보인다. 그럼에도 불구하고, 흉선세포 고갈 및 TEC의 견고한 생존능의 중요한 조직학적 특성을 잘 나타낸다. Photo by Laura P. Hale, MD, PhD, Department of Pathology, Duke University.
도 15는 신선하게 수확된 흉선 조직의 사진이다.
도 16은 실시예 5에서 제시된 바와 같은, 래트 신장 피막 아래에 CTT의 임플란테이션을 위한 수확, 배양, 임플란테이션 및 생검을 기술하는 개략도이다.
도 17a - d는 실시예 5에 기술된 바와 같이 4 조각으로 절단되었던 3 일령 F1 (LWxDA) 래트로부터 흉선 조직의 수확 사진을 제시한다(도 17a). 실시예 5에 기술된 바와 같이 37 ℃ CO2 인큐베이터에서 5-7 일 동안 흉선 장기 배지를 갖는 멸균성 혼합된 셀룰로스 에스테르 필터 상의 배양된 흉선 조각의 사진(도 17b). 도 17c는 LW 래트의 신장 피막 아래에 임플란팅된 CTT의 사진이다. 도 17d는 임플란테이션 후 6 개월 후에 수확된 흉선 이식편의 사진이다. 화살표는 신장 피막 아래의 CTT를 지시한다.
도 18a-d는 100x 배율의 신선한 흉선 조직(위 프레임) 및 CTT(아래 프레임)의 조직학적 외관을 묘사하는 사진이다. 도 18a는 실시예 5에서 기술된 바와 같이 H&E 염색된 신선한 흉선 조직(위 프레임) 및 5 일 동안 배양된 CTT(아래 프레임)에서 수질 분화의 비교를 보여준다. 도 18b는 실시예 5에서 기술된 바와 같이 신선한 흉선 조직(위 프레임)과 비교해서 사이토케라틴에 대해 염색될 때 5 일 동안 배양된 CTT(아래 프레임)에서 관찰가능한 대표적인 레이스모양 패턴을 보여준다. 도 18c는 Ki-67에 대해 염색될 때 신선한 흉선 조직(위 프레임) 및 T 세포가 고갈된 CTT(아래 프레임)를 보여준다. 도 18d는 CD3에 대해 염색된 신선한 흉선 조직(위 프레임) 및 5 일 동안 배양된 다음에 CD3에 대해 염색된 CTT 흉선 조직(아래 프레임)을 보여준다. CD3 염색된 CTT에서 주목되는 갈색 염색(도 18d, 아래 프레임)은 아마도 일부 생존가능 세포 뿐만 아니라 조직으로부터 씻기지 않은 죽은 T 세포의 쇄설물도 나타낼 것이다.
도 19a-d는 600x 배율의 신선한 흉선 조직(위 프레임) 및 CTT(아래 프레임)의 조직학적 외관을 묘사하는 사진이다. 도 19a는 실시예 5에서 기술된 바와 같은 H&E 염색 신선한 흉선 조직(위 프레임) 및 5 일 동안 배양된 CTT(아래 프레임)에서 수질 분화의 비교를 보여준다. 도 19b는 실시예 5에서 기술된 바와 같은 신선한 흉선 조직(위 프레임)과 비교해서 사이토케라틴에 대해 염색될 때 5일 동안 배양된 CTT(아래 프레임)에서 관찰가능한 대표적인 레이스 모양 패턴을 보여준다. 도 19c는 Ki-67에 대해 염색될 때 신선한 흉선 조직(위 프레임) 및 T 세포가 고갈된 CTT(아래 프레임)를 보여준다. 도 19d는 DC3에 대해 염색된 신선한 흉선 조직(위 프레임) 및 5 일 동안 배양된 후 CD3에 대해 염색된 CTT 흉선 조직(아래 프레임)을 보여준다. CD3 염색된 CTT에서 주목되는 갈색 염색(도 19d, 아래 프레임)은 아마도 일부 생존가능 세포 뿐만 아니라 조직으로부터 씻기지 않은 죽은 T 세포의 쇄설물을 나타낸다.
도 20은 실시예 5에서 보고된 실험의 실험 설계의 개략도이다. 이 도면은 Kwun, J. et al., JCI Insight (2020) Jun 4;5(11)에서 나온다.
도 21은 수혜자-유형 T 세포를 재군집하는 것이 CTT 이말로저닉플란테이션(imallogernicplantation) 후 하단 우측 사분면에서 보인다는 것을 보여준다. 이 도면은 Kwun, J. et al., JCI Insight (2020) Jun 4;5(11)에서 나온다.
도 22a 및 도 22b는 양성 사이토케라틴 염색(도 22a), 뿐만 아니라 네이티브 흉선과 유사한 T 세포 염색(도 22b)을 보여주는 임플란테이션 후 8.5 개월에 외식된(explanted) 임플란팅된 흉선을 보여준다. 원래 배율 x 400. 이 도면은 Kwun, J. et al., JCI Insight (2020) Jun 4;5(11)에서 나온다..
도 23은 CTT 임플란테이션이 없는 대조 동물과 비교해서 상당히 증가된 수의 순환 CD4 및 CD8 T 세포의 플롯을 보여준다. 그것은 또한 CTT를 수혜받지 않은 대조 그룹과 비교해서 배양된 흉선 조직 임플란테이션(CTT) 그룹에서 상당히 증가된 수의 나이브 CD4 및 나이브 CD8 T 세포, 및 CTT를 수혜받지 않은 대조 그룹과 비교해서 배양된 흉선 조직 임스플란테이션(imsplantation)(CTT) 그룹에서 상당히 증가된 수의 CD4 및 CD8 최근 흉선 이주자(RTE)를 보여준다. 이 도면은 Kwun, J. et al., JCI Insight (2020) Jun 4;5(11)에서 나온다.
도 24a는 신장의 피막 아래의 정상 흉선 조직학을 보여주는 제180 일에서의 외식된 임플란팅된 CTT의 면역조직학적 분석을 보여준다(도면 24a의 우측). 도 24b는 H&E 상의 외식된 이식편을 보여준다. 생존가능 T 세포 (CD3), T 세포 증식 (Ki67), 및 사이토케라틴(토끼 다클론 항체에 의해 검출됨)에 대한 염색을 보여준다. 사이토케라틴에 대해 염색된 패널에서, 레이스 모양 패턴이 TEC 상의 해살 소체 형성(화살표)과 함께 보인다. 이 도면은 Kwun, J. et al., JCI Insight (2020) Jun 4;5(11)에서 나온다.
도 25는 CTT를 갖는 경우(속찬 삼각형, 청색 선) 및 CTT를 갖지 않는 경우(역삼각형, 적색 선) DA 심장 이식물을 갖는 흉선절제술 및 면역억제 후의 LW 래트의 생존 백분율을 보여준다. CTT를 갖는 LW 래트는 관용하고; CTT를 갖지 않는 LW 래트는 면역결핍이고, 따라서 DA 심장을 거부하지 않는다. 대조군은 LW 비조작된 래트(속빈 정사각형)에서 DA 심장 이식물의 완전 거부를 보여준다. LW 대조 동물은 또한 LW 심장 이식편을 거부하지 않았다(수평선을 갖는 속빈 원)(n = 9). 이 도면은 Kwun, J. et al., JCI Insight (2020) Jun 4;5(11)에서 나온다.
도 26a 및 26b는 도 26C(속찬 청색 정사각형 및 속찬 적색 삼각형)에 묘사된 2004 International Society for Heart & Lung Transplantation (ISHLT)에 의한 거부 징후가 없는 단핵 세포 침윤을 보여주는 CTT를 갖는(도 26a) 및 CTT를 갖지 않는(도26 b) 임플란팅된 동물로부터 이식된 동종이계이식편(DA 심장)의 사진이다. 이 도면은 Kwun, J. et al., JCI Insight (2020) Jun 4;5(11)에서 나온다.
도 27은 삽입된 CTT를 갖는 LW 래트(면역적격성이고, 경추 동종이계 BN 심장을 거부함) 및 삽입된 CTT를 갖지 않는 대조 LW 동물(흉선이 없기 때문에 면역결핍이어서, 경추 BN 심장을 거부할 수 없음) 대 BN 대조군(경추 BN 심장을 거부하는 LW 래트) 및 동종동계 대조군(LW 래트는 경추 LW 심장을 거부하지 않음)에서의 동물 생존 백분율 대 이식편 생존 일수로 플롯팅한 목에서의 BN 심장 이식편 생존의 플롯이다. 이 도면은 Kwun, J. et al., JCI Insight (2020) Jun 4;5(11)에서 나온다.
도 28a 및 도 28b는 각각 11 일 및 46 일에서의 CTT 삽입을 갖는(도 28a) 및 CTT 삽입을 갖지 않는(도 28b) BN 심장 조직의 사진이다. 이들 사진은 도 27 및 도 29의 데이터의 기초이다. 도 28a의 심장은 관용 때문에 거부되지 않는다. 도 28b의 심장은 흉선이 없음으로 인한 면역결핍 때문에 거부되지 않는다. 이 도면은 Kwun, J. et al., JCI Insight (2020) Jun 4;5(11)에서 나온다.
도 29는 경추 BN 심장의 거부 등급을 보여준다. LW 래트에 거치된 동종동계 LW 심장(속빈 원)은 거부되지 않았다. LW 래트에 거치된 BN 심장(속찬 원)은 거부되었다. CTT를 받은 LW 래트에 거치된 BN 심장은 거부되었다(속찬 정사각형). CTT를 수혜받지 않은 LW 래트에 거치된 BN 심장은 2 마리 래트에서 약하게 거부되었고(빗금 친 삼각형), 나머지 3 마리 래트에 의해서는 거부되지 않았다. 이들 데이터는 CTT가 DA를 발현하기 때문에 CTT를 갖는 래트가 그들이 DA 심장을 수용하는 동안에도(도 26c) 제3자 심장을 강하게 거부할 수 있었다는 것을 보여준다. CTT를 갖지 않은 래트는 면역결핍이었고, DA(도 26c) 또는 BN 심장을 거부하지 않았다. 이 도면은 Kwun, J. et al., JCI Insight (2020) Jun 4;5(11)에서 나온다.
도 30a 및 도 30b는 각각 LW 및 DA 심장과 비교해서 래트가 CTT 삽입을 수혜받거나 또는 수혜받지 않은 BN 심장의 사진이다. 도 30a에서, 면역억제가 제거되고 BN 심장이 이식된 후, BN 심장이 빠르게 거부되었고, 따라서 모든 염증 때문에 매우 크다. LW 심장은 심장이 신체를 통해 혈액을 펌핑하기 때문에 정상 크기이다. DA 심장은 그것이 복부에 거치되고 혈액을 펌핑할 필요가 없기 때문에 작다. 도 30b에서, 래트는 면역결핍이고, 면역억제가 제거된 후 BN 또는 DA 심장을 거부할 수 없다. 이 도면은 Kwun, J. et al., JCI Insight (2020) Jun 4;5(11)에서 나온다.
도 31a 및 도 31b는 CTT 삽입을 갖는 및 갖지 않는 래트 대 BN 대조군 및 동종동계 대조 래트로부터의 외식된 경추 BN 심장의 거부 등급의 플롯이다. 도 31a는 일차 복부 DA 심장 동종이계이식편에서 염증 세포의 정량화를 묘사한다. 동종동계 대조군은 LW 래트가 LW 심장을 거부하지 않는다는 것을 보여준다. DA 대조군은 LW 래트가 DA 심장을 거부한다는 것을 보여준다. CTT 그룹은 관용 때문에 DA 심장을 거부하지 않는다. CTT를 갖지 않는 그룹은 흉선 결여로 인한 면역결핍 때문에 DA 심장을 거부하지 않는다. 도 31b는 이차 경추 BN 심장 동종이계이식편에서 염증 세포의 정량화를 묘사한다. 동종동계 대조군은 LW 래트가 LW 심장을 거부하지 않는다는 것을 보여준다. BN 대조군은 LW 래트가 BN 심장을 거부한다는 것을 보여준다. CTT 그룹은 그것이 면역적격이기 때문에 BN 심장을 거부한다. CTT를 갖지 않는 그룹은 흉선 결여로 인한 면역결핍 때문에 BN 심장을 거부하지 않는다. 도 31c는 경추 BN 심장 거부 시에 네이티브 LW 심장과 함께 LW 수혜자로부터 수확된 DA 및 BN 심장 래트를 보여준다. 하단 우측 패널은 BN 심장의 T 세포(갈색)가 그의 거부를 야기한다는 것을 보여준다. 도 31d는 CTT 삽입이 없는 대조 동물로부터의 LW, DA, 및 BN 심장에서 T 세포 침윤을 보여준다. 동물이 면역결핍이기 때문에 T 세포 침윤이 없다. 이 도면은 Kwun, J. et al., JCI Insight (2020) Jun 4;5(11)에서 나온다.
도 32a 내지 도 32c: CTT 후의 체액 관용. 도 32a는 T 세포 유동 교차일치에 의해 측정되는 이식후 기증자-특이적 동종항체(항-DA 및 항-BN 항체)의 대표 히스토그램 플롯을 보여준다. 도 32a의 상단 좌측 패널(DA 대조군)은 이소성 복부 DA 심장 이식물을 받은 후 정상 LW 래트에서 항-DA 항체(두꺼운 선)의 발달을 보여준다. 도 32a의 상단 중간 패널은 CTT를 받은 LW 래트에서 항 DA 항체의 결여를 보여주고; 이것은 관용을 지시한다. 상단 우측 패널은 CTT를 갖지 않는 LW 래트에 의한 반응이 없음을 보여주고; 이것은 기증자 흉선을 수혜받지 않은 경우 흉선절제술 및 T 세포 고갈 후의 래트의 면역결핍을 반영한다. 도 32a의 하단 좌측 패널은 경추 BN 심장을 받은 정상 LW 래트에 의해 형성된 정상 항 BN 항체를 보여준다. 도 32a의 하단 중간 패널은 경추 BN 심장 이식물을 받은 후 BN에 대해 CTT를 갖는 LW 래트의 정상 반응을 보여주고, 면역적격성 및 제3자를 거부하는 능력을 보여준다. 도 32a의 하단 우측 패널은 경추 BN 심장 이식물을 받은 후 BN에 대해 CTT를 갖지 않는 LW 래트의 반응이 없음을 보여주고, 면역부적격성 및 제3자 거부 능력 결여를 보여준다. 도 32b는 일차 DA 심장 이식 후 항-DA 항체의 수준을 보여준다. LWxDA 흉선 기증자로부터의 CTT를 갖는 LW 래트는 그들이 DA를 관용하기 때문에 DA 심장 이식물 후 항-DA 항체를 만들지 않는다. CTT를 갖지 않는 LW 래트는 그들이 면역결핍이기 때문에 DA 심장 이식 후 항-DA 항체를 만들지 않는다. 도 32c는 이차 경추 BN 심장 이식 후 항-BN 항체의 수준을 보여준다. LWxDA 기증자로부터의 CTT를 갖는 LW 래트는 BN에 대한 항체를 만들고, 제3자에 대한 면역적격성을 보여준다. CTT를 갖지 않는 LW 래트는 BN에 대한 항체를 만들지 않고, 면역부적격성을 보여준다. 이 도면은 Kwun, J. et al., JCI Insight (2020) Jun 4;5(11)에서 나온다.　
도 33a-j는 8월령 NHP로부터 신선한 및 배양된 비사람 영장류(NHP) 흉선 조직의 면역조직화학적 사정의 현미경사진을 제시한다. 윗줄은 수확 당일의 NHP 흉선이고, 아랫줄은 12 일 동안 배양 후의 NHP 흉선이다. 조직은 헤마톡실린 및 에오신(도 33a 및 도 33f), CD3(도 33b 및 도 33g), 판(pan) 사이토케라틴(CK) 항체 AE1/AE3(도 33c 및 도 33h), Ki-67(도 33d 및 도 33i), 및 CK14(도 33e 및 도 33j)으로 염색되었다. 모든 사진은 20X 배율이다.
도 34a-p는 12일의 배양 후 8 월령 비사람 영장류(NHP)로부터의 동결보존된 배양된 흉선 조직의 분석을 제시한다. 윗줄은 수확시(도 34a), 배양 제6 일(도 34b), 배양 제12 일(도 34c), 및 12일의 배양 후 35 일의 동결보존 다음에 해동 후(도 34d)의 사이토케라틴이다.　　 도 34d에서의 사이토케라틴(AE1/AE3)은 도 34c에서의 사이토케라틴과 유사하다. 두번째 줄은 각각 도 34e(수확), 도 34f(배양 제6 일), 도 34g(배양 제12 일) 및 도 34h(12 일의 배양 후 35 일의 동결보존 다음에 해동 후)에서 동일 시점에서 CK14 염색을 보여준다. 도 34h의 CK14는 패널 도 34g의 CK14와 매우 유사하다. 세번째 줄은 동일 시점에서 도 34i, 도 34j, 도 34k 및 도 34l에서의 CD3 염색을 보여주고, 이것은 시간 내내 생존가능 T 세포의 예상되는 소실을 가진다. 도 34l의 패널은 매우 적은 T 세포를 가진다는 점에서 도 34k 패널과 유사하다. 네번째 줄 도 34m, 도 34n, 도 34o 및 도 34p는 동일 시점에서 증식하는 T 세포의 Ki-67 염색을 보여준다. Ki-67 염색은 제6 일까지 존재하지 않고(도 34n), 그 이유는 T 세포가 주로 죽었기 때문이다. 이 도면은 배양된 흉선 조직이 환자를 위해 동결보존되는 방법과 유사하게 비사람 영장류 흉선을 동결보존하는 능력을 보여준다. 모든 사진은 40X 배율이다.
도 35는 최대 MHC-불일치된 무-CMV 붉은털 원숭이를 사용하는 실험 이식 전략의 개략도를 제시한다. 수혜자 동물(Y)은 완전한 흉선절제술을 받는다. 기증자 동물(X)은 배양된 흉선 조직 및 수혜자 Y에게 이소성 위치에 거치되는 심장 둘 모두를 기증한다(제1 Tx 및 제2 Tx). 그 다음에 면역억제 약물을 철회하고, 기증자-특이적 관용은 i) 기증자 심장의 계속된 박동, ii) 제3자에 대한 반응성과 함께 nMLR에서 기증자에 대한 관용 및 iii) 제3자 기증자 동물 Z(제3 Tx)로부터의 피부 이식물의 거부에 의해 입증된다.
도 36은 최근 흉선 이주자(RTE)를 확인하기 위한 일반 게이팅(gating) 전략을 기술하는 유동 세포 분석 실험으로부터의 결과의 그래프를 보여준다. 비사람 영장류 말초 혈액 단핵 세포를 수집하고, 다색성 유동 세포 분석을 사용하여 분석한다. 제1 단계는 윗줄 첫번째 패널에서 단일 세포의 확인이다. 윗줄 두번째 패널에서 "단일항"은 림프구(낮은 SSC, 측방 산란, 및 높은 CD45)를 확인하는 데 사용된다. 림프구에서의 CD3 T 세포는 윗줄 세번째 패널에서 확인된다. CD4 및 CD8 세포는 윗줄 네번째 패널에서 보여주는 바와 같이 CD3 세포로부터 게이팅된다. 아랫줄 첫번째 패널에서는, CD28 및 CD95가 CD4 게이트를 사용하여 CD4+ 나이브 부분집합, 중심 기억 부분집합 및 효과기 기억 부분집합을 확인하는 데 사용된다. 아랫줄의 두번째 패널에서는, CD31이 RTE인 CD4+ 나이브 세포의 백분율을 보여주는 데 사용된다. 아랫줄 세번째 및 네번째 패널은 CD8 나이브 T 세포를 제외하고는 RTE에 동일한 접근을 보여준다. 알 수 있는 바와 같이, RTE는 CD4 및 CD8 나이브 부분집합의 99.6% 및 95.2%이다.
도 37은 배양된 유아 흉선에서 CCL21 사정의 현미경사진 이미지 및 그래프를 제시한다. CCL21은 배양된 유아 흉선에 의해 높은 수준으로 생성된다. 배양 제16일에 CCL21 항체(Ab)와의 면역조직화학적 반응성(갈색 염색)은 좌측 패널(상단 좌측 패널, 2X 배율; 하단 좌측 패널, 20X 배율)에서 보여준다. 우측에 3 개 유아 흉선 배양물에 대해서 배양 배지로의 CCL21 분비를 매일 측정하는 상응하는 시간 경로를 보여준다(R&D Systems Duo-Set ELISA). 따라서, 배양된 흉선 조직은 기능적으로 중요한 생체분자 CCL21을 생성할 수 있고, CCL21은 비성숙 흉선세포 전구체를 흉선으로 유인하는 것을 책임지는 케모카인이다.
도 38은 무CMV NHP 모델에서 배양된 흉선 조직의 성공적 생착 후 일치된 심장에 대한 관용 및 불일치된 피부의 거부의 사정을 겨냥한 실시예 8의 실험 설계의 개요를 제시한다. 특히, 수혜자의 흉선절제술(2기의 제1 주) 및 완전한 흉선절제술의 확증 후, 수혜자가 T 세포 고갈되고, 타크롤리무스로 면역억제를 시작하였다. 비혈연 NHP로부터의 불일치된 배양된 기증자 흉선 조직은 3기 제3 주에 수혜자에게 생착된다. 3기 제10 주에 흉선 이식편의 생검을 행하여 흉선세포생성을 평가한다. 나이브 T 세포가 수 개월 후에 발달한 후, 수혜자는 기증자를 관용해야 한다. 그 다음에 수혜자에게 흉선 기증자로부터의 이소성 심장 이식물을 제공한다(4기 제4 주). 면역억제를 위닝한다. 심장의 박동이 뒤따른다(관용을 입증함). 그리고 4기 제10 주에 혼합 림프구 반응이 행해져서 동결보존된 기증자 세포에 대한 관용 및 제3자 세포의 거부를 보여준다. 5기는 나이브 T 세포가 발달하는 데 더 많은 시간이 필요한 경우에 사용된다. 6기는 관용이 발생하지 않은 경우에 사용된다. 수혜자 흉선이 수혜자 NHP에게 이식되어 흉선 조직 이식물 절차가 NHP에서 작동하고 있다는 것을 입증할 것이다.
도 38이 어떻게 포맷되었는지를 아는 것이 도움이 된다. 실험은 3 마리 원숭이를 가진다. 원래 스프레드시트는 1 페이지 폭, 많은 페이지 길이 문서에 3 마리 동물 모두의 절차를 가졌다는 것을 주목한다. 스프레드 시트가 본 특허 출원에서 허용된 폭보다 더 넓었기 때문에, 스프레드 시트의 각 줄이 3 페이지로 나누어졌다. 제1 원숭이는 흉선 및 심장 기증자이고; 이 원숭이에 대한 절차는 1번째, 4번째, 7번째 페이지 등에서 좌측 칸에 있다. 제2 원숭이는 흉선 및 심장 수혜자이고; 중간 칼럼의 정보는 2번째, 5번째, 8번째 페이지 등이다). 제3 원숭이는 대조군이고; 우측 칸의 정보가 3번째, 6번째, 9번째 페이지 등에 있다.
도 39는 추가 면역억제 약물치료, 마이코페닐레이트 모페틸(MMF)이 첨가되는 것을 제외하고는 실시예 8에서와 동일한 실시예 9의 실험 설계의 개요를 제시한다. 약물 MMF는 심장 이식에 일상적으로 사용된다. 이 연구는 배양된 흉선 조직 이식물에 대한 MMF의 임의의 유해한 효과가 있는지를 사정할 것이다.
도 40a-d는 흉선 아키텍처를 보여주는, 배양 제0 일에서의 신선한 흉선의 슬라이스의 현미경사진을 제시한다. 도 40a-b에서, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색은 정상 소아 흉선에 대해 예상되는 바와 같이 경계를 분명히 잘 나타낸 피질 및 더 밝은 염색 수질 영역을 보여준다. 도 40c는 모든 유형의 상피세포를 함께 검출하는 판-사이토케라틴 항체(AE1/AE3)의 칵테일을 이용한 면역조직화학이 흉선 상피 세포가 피질 및 수질 둘 모두에서 피막 아래에 및 밝은 레이스 모양 망상조직으로 존재한다는 것을 입증한다는 것을 보여준다(갈색 염색은 양성 항체 반응을 보여준다). 도 40b 및 도 40c에서 화살표는 해살 소체를 가리킨다. 도 40d는 사이토케라틴 14(CK14) 항체 염색 (갈색)을 보여준다. CK14 항체는 피막하 피질에서 및 수질에서 흉선 상피 세포와 반응할 뿐만 아니라, 피질에서 산포된 흉선 상피 세포와 반응한다. 점선은 피질에 의해 둘러싸인 수질의 영역을 강조한다. SCC는 피막하 피질을 나타내고, Cor은 피질을 나타내고, M은 수질을 나타낸다. 도 40a에서 축척 막대는 1 mm를 나타내고; 도 40b-d에서 축척 막대는 500 μm를 나타낸다.
도 41a-d는 배양된 흉선 슬라이스에서의 해살 소체의 예를 보여주는 현미경사진을 제시한다. 배양 제0 일(도 41a-b) 및 배양 제9 일(도 41c-d)에서의 해살 소체의 조직학적 외관을 보여준다. 도 41a 및 도 41c는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 보여주고; 도 41b 및 도 41d는 판-사이토케라틴(AE1/AE3) 항체와의 반응성을 보여준다(갈색은 양성 반응을 지시한다). 도 41a-d에서 화살촉은 대표 해살 소체를 가리키고, 해살 소체들이 주위의 흉선세포의 고갈 및 괴사 때문에 배양된 흉선의 H&E-염색 절편에서 덜 두드러지게 보인다. 그러나, 해살 소체는 신중한 검사에 의해 또는 면역조직화학을 이용함으로써 여전히 쉽게 확인될 수 있다. 도 41a-d에서 축척 막대는 100 μm를 나타낸다.
도 42a-d는 제7 일에서의 배양된 흉선의 아키텍처를 보여주는 현미경사진을 제시한다. 도 42a-b에서 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색은 흉선세포의 현저한 고갈을 보여주지만, 일부 피질 영역(Cor)은 보유된 핵을 갖는 많은 수의 흉선세포를 여전히 함유한다. 도 42c에서의 판-사이토케라틴(AE1/AE3) 및 도 42d에서의 사이토케라틴 14 (CK14) 면역조직화학은 피막하 피질(SCC)에서 및 수질(M)에서 흉선 상피의 응축을 보여준다. 도 42c-d에서의 갈색은 항체와 양성 반응을 지시한다. 축척 막대는 도 42a에서 1mm 및 도 42b-d에서 500 μm를 나타낸다.
도 43a-d는 제9 일에서의 배양된 흉선의 아키텍처를 보여주는 현미경사진을 제시한다. 도 43a-b는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 보여준다. 있다하더라도 소수의 살아있는 T 세포 또는 흉선 상피 세포가 도 43a에서 점선으로 둘러싸인 엷은-염색 영역에 존재하고, 이것은 거의 완전히 괴사성(Necr)이다. 이 영역에서 이전에 존재하는 대부분 핵은 핵융해에 의해 분해되었다. 잔류 흉선세포로부터의 핵이 완전히 분해되지 않은 다른 영역은 헤마톡실린으로 어두운 청색으로 계속 염색된다. 도 43b에서 화살표는 해살 소체를 가리킨다. 도 43c는 판-사이토케라틴(AE1/AE3) 면역반응성(갈색)을 보여주고; 도 43d는 사이토케라틴 14 (CK14) 면역반응성(갈색)을 보여준다. 축척 막대는 도 43a에서는 1 mm 및 도 43b-d에서는 500 μm를 나타낸다.
도 44a-d는 제12 일에서의 배양된 흉선의 아키텍처를 보여주는 현미경사진을 제시한다. 도 44a-b는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 보여준다. 이 시점에서, 많은 흉선세포가 조직으로부터 소실되었거나 또는 죽었고 그들의 핵이 용해되었으며, 이로 인해 조직이 더 호산구성(분홍색)이 되었다. 일부 영역은 더 호염기성(청색)으로 염색된 피질-유사 영역(Cor) 및 수질-유사 영역(M)을 갖는 정상 비배양된 흉선에 특유한 아키텍처를 보유하지만, 흉선세포 세포충실성은 크게 감소된다. 도 44c는 판-사이토케라틴(AE1/AE3) 면역반응성(갈색)을 보여주고; 도 44d는 사이토케라틴 14 (CK14) 면역반응성(갈색)을 보여준다. 이 시점에서, 피막하 피질(SCC)이 두꺼워지고, 상피세포가 존재하는 흉선세포 수의 감소로 인해 더 두드러지게 보인다. 화살표는 대표 해살 소체를 가리킨다. 막대는 도 44a에서는 1 mm 및 도 44b-d에서는 500 μm를 나타낸다.
도 45a-d는 제20 일에서의 배양된 흉선의 아키텍처를 보여주는 현미경사진을 제시한다. 도 45a-b는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 보여준다. 이 시점에서, 대부분 흉선세포가 조직으로부터 소실되었거나 또는 죽었고 그들의 핵이 용해되었으며, 이로 인해 조직이 더 호산구성(분홍색)이 되었다. 잔류 흉선세포의 큰 그룹은 드물지만, 흉선세포의 핵 특성을 갖는 산포된 세포는 눈에 띈다. 도 45c는 판-사이토케라틴(AE1/AE3) 면역반응성(갈색)을 보여준다. 이전의 수질 영역(M)에 존재하는 상피의 많은 부분이 수질 흉선세포의 소실로 인해 응축되지만, 흉선 상패 세포의 잔류하는 밝은 레이스 모양 3 차원 망상조직를 지시하는 산포된 상피세포는 여전히 남아 있다. 도 45d에서, 사이토케라틴 14 (CK14) 면역조직화학(갈색)은 이전의 수질 영역 및 피막하 피질을 강조한다. 화살표는 대표 해살 소체를 가리킨다. 축척 막대는 도 45a에서 1 mm 및 도 45b-d에서 500 μm를 나타낸다.
도 46a-b는 흉선 슬라이스에서의 원상태 핵의 예를 보여주는 현미경사진을 제시한다. 원상태 흉선 상피 세포 핵(화살표)의 예를 제9 일에서의 피막하 피질에서(도 46a) 및 제21 일에서의 수질에서(도 46b) 보여준다. 헤마톡실린 및 에오신 염색; 축척 막대는 50 μm를 나타낸다.
도 47a-e는 상이한 시점에서 배양된 흉선 조직의 흉선 상피 망상조직의 비교를 보여주는 현미경사진을 제시한다. 도 47a는 제0 일을 보여주고, 도 47b는 제5 일을 보여주고, 도 47c는 제9 일을 보여주고, 도 47d는 제12 일을 보여주고, 도 47e는 제21 일을 보여준다. 흉선세포 고갈 및 괴사의 양의 시점-관련 차이가 있어서 조직이 시간에 따라서 덜 호염기성(청색)이 되지만, 흉선 상피 망상조직(갈색)의 구조는 배양이 진행될 때 원상태로 남아 있다. 개재하는 흉선세포들이 고갈되기 때문에 피질 및 수질 상피 둘 모두가 응축할 수 있다. 갈색은 항-사이토케라틴 항체 (AE1/AE3)의 칵테일과 양성 반응을 지시하고; 헤마톡실린 대비염색. 축척 막대는 400 μm를 나타낸다.
도 48a-k는 배양 중의 시간의 함수로서 흉선 슬라이스에서의 CD3 면역조직화학의 예를 보여주는 현미경사진을 제시한다. 도 48a-b는 제0 일에 피질에서 본질적으로 모든 비성숙 T 세포 및 수질에서 더 성숙한 세포가 CD3 항체와 강하게 반응한다는 것을 보여준다. 더 높은 배율(도 48b)은 CD3의 막 발현과 일관되는 갈색 면역반응성의 고리에 의해 둘러싸인 담청색 핵을 보여준다. 도 48c-e에서, 조직은 제7 일에 CD3 항체와 광범위한 반응성을 여전히 보여준다. 그러나, 도 48d-e는 더 높은 배율로 볼 때 대부분 갈색 초점들이 핵의 증거가 없기 때문에(도 48d) 대다수 면역반응(갈색)이 죽은 흉선세포로부터의 쇄설물과 관련된다는 것을 보여준다. 원상태 핵 및 막 염색(화살표)을 입증하는 세포들의 작은 초점들이 쇄설물로부터 떨어져 있는 영역에서 여전히 확인될 수 있다(도 49e). 배양이 제9 일(도 48f-g), 제12 일(도 48h-i), 및 제21 일 (도 48j-k)을 통해 진행할 때, 흉선세포 세포 쇄설물과의 반응성이 여전히 강하고, 이로 인해 쇄설물로 둘러싸인 잠재적 원상태 세포를 신뢰할만하게 검출하는 것이 어렵다. 보여준 슬라이스들은 모두 이들 시점에서 검사된 다수의 로트를 대표하는 단일 로트로부터 유래한다. 축척 막대는 도 48a, 도 48c, 도 48f, 도 48h, 및 도 48j에서는 500 μm, 및 도 48b, 도 48d, 도 48e, 도 48g, 도 48i, 및 도 48k에서는 50 μm를 나타낸다.
도 49a-k는 배양 중의 시간의 함수로서 흉선 슬라이스에서의 Ki-67 면역조직화학의 예를 보여주는 현미경사진을 제시한다. 보여준 슬라이스는 모두 유사한 시점에서 검사된 다수의 로트를 대표하는 단일 로트로부터 유래한다. 도 49a-b는 제0 일에 피질(Cor)에서 대다수의 비성숙 T 세포가 Ki-67에 특이적인 항체와 강하게 반응한다는 것을 보여준다. 더 높은 배율(도 49b)은 피질 흉선세포의 핵과 강한 양성 반응성을 보여주고(갈색), 반면에 수질(M)에서는 림프구가 아주 드물게 Ki-67 항체와 반응한다. 도 49c-e는 제7 일까지 피질 영역에 여전히 남아 있는 대부분 흉선세포의 핵이 작고, 세포자살과 일관되는 희미한 핵 경계를 가지고, 그들이 Ki-67-특이적 항체와 반응하지 못한다는 것을 보여준다. 항체와 반응하는 세포(도 49e, 화살표)는 더 큰 핵을 가지고, 이는 그들이 흉선 상피 세포임을 시사한다. 잔류 흉선세포 핵의 Ki-67 라벨링의 유사한 결여가 제9 일(도 49f-g), 제12 일(도 49h-iI) 및 제21 일(도 49j-k)에서 보인다. 축척 막대는 도 49a, 도 49c, 도 49e, 도 49g, 및 도 49i에서는 500 μm 및 도 49b, 도 49d, 도49f, 도 4950h, 및 도 49j에서는 50 μm를 나타낸다.
도 50a 내지 도 50h는 사람 흉선 장기 배양물로부터의 컨디셔닝된 배지에서 검출되는 선택된 가용성 분자의 플롯을 보여준다. 도 50a는 L-셀렉틴 Ln/pg 대 배양 일수의 플롯이고; 도 50b는 M-CSF Ln/pg 대 배양 일수의 플롯이고; 도 50c는 갈렉틴-7 Ln/pg 대 배양 일수의 플롯이고; 도 1d는 IL-16 Ln/pg 대 배양 일수의 플롯이고; 도 50e는 CCL21 Ln/pg 대 배양 일수의 플롯이고; 도 50f는 CXCL16 Ln/pg 대 배양 일수의 플롯이고; 도 50g는 CCL11 Ln/pg 대 배양 일수의 플롯이고; 도 50h는 CXCL12 Ln/pg 대 배양 일수의 플롯이다.
도 51은 배양 과정의 제1 일부터 제21 일까지 사람 흉선의 배양된 슬라이스 에서의 흉선세포 함량 pg/ml을 사정하는 플롯을 보여준다.
도 52는 시간의 함수로서 사람 흉선 조직의 배양된 슬라이스에서의 생존가능 흉선세포의 면역조직화학적 사정의 사진을 보여준다. 도 52a는 세포를 T 계열로서 확인하는 항-CD3 항체 및 증식성 세포를 확인하는 항-Ki-67 항체와의 면역조직화학의 사진이고, 배양 초기에 흉선세포 생존능의 급속한 소실을 입증한다. 도 52b는 피질에서의 본질적으로 모든 비성숙 T 세포의 혈장 막을 묘사하는 제0 일의 사진이고, 수질은 막 패턴으로 항-CD3와 강하게 반응하는 것으로 보인다. 도 52c는 Ki-67 증식 표지자에 특이적인 항체를 사용하는 면역조직화학이 당일에 피질 흉선세포와의 풍부한 반응성을 보여준다는 것을 묘사한다. 도 52d는 헤마톡실린 및 에오신 염색을 사용하는 제9 일의 배양된 흉선의 조직학을 보여준다. 감소된 호염기성(청색)은 배양 동안에 기증자 흉선세포의 소실을 지시하고; 도 52e는 수 일의 배양 후에 대다수의 갈색이 죽은 흉선세포가 핵융해/핵 용해를 겪은 후 남는 무핵이지만 여전히 면역반응성인 쇄설물 때문이라는 것을 묘사한다. 도 52f는 장기 배양 동안에 일어나는 흉선세포 죽음이 배양 동안에 더 나중 시점에서 TE 세포와 형태학적으로 일관되는 더 큰 세포와만의 Ki-67 면역반응성을 초래한다는 것을 묘사한다.
도 53a는 배양된 흉선 조직으로부터의 컨디셔닝된 배지 중의 CCL21 수준 pg/ml 대 배양 일수의 플롯을 보여준다. 도 53b는 컨디셔닝 처리될 흉선 조직의 슬라이싱 절차의 예시이다. 도 53c는 시간의 함수로서 흉선 장기 조직 배양물의 슬라이스에 의한 CCL21의 분비의 플롯이다.
도 54a 내지 도 54d는 배양된 및 비배양된 흉선 조직에서의 면역반응성을 묘사하는 사진이다. 도 54a는 수질 영역의 사진이지만, 또한 배양 제0 일에서의 피질 전체에 걸쳐서 산포된 TECS를 포함하고; 도 54b는 수질 영역의 사진이지만, 또한 배양 제16 일에 이미지 전체에 걸쳐서 산포된 TECS를 포함하고; 도 54c는 배양 제0 일의 수질 영역에서의 TEC 뿐만 아니라 피질 영역에서의 산포된 TEC의 사진이다. 도 54d는 배양 제16 일에 수질 영역에서의 TEC 뿐만 아니라 피질 영역에서의 산포된 TEC의 사진이다.
도 55a 내지 도 55f는 전연령에서의 흉선 조직에서 선택된 mRNA의 발현의 플롯이다. 흉선 조직의 FFPE 절편에 존재하는 표적 mRNA의 상대적 양은 제조자의 지시에 따라서 QuantiGene 검정(Thermo Fisher)을 사용하여 정량화하였다. 각 표적 mRNA의 데이터는 GAPDH로 정규화되어("비조정") 제시되고, 그 다음에 추가로 흉선 상피를 함유하는 % 영역으로 정규화되거나("TE에 의해 조정됨") 또는 CD1a-양성 피질 흉선세포를 함유하는 % 영역으로 정규화된다("Cor에 의해 조정됨"). 보여준 데이터는 5 일 내지 78 세 연령 범위의 기증자로부터 유래된 47 개 흉선 샘플로부터 얻었다. 도 55a 및 55b는 각각 ≤18세 기증자(n = 25)로부터 얻은 흉선 조직이 18 세 초과 기증자와 비교할 때 GAPDH에 대해 T 세포 표지자 CD3ε 및 피질 흉선세포 표지자 CD1a(도 55a, b)를 코딩하는 mRNA의 더 높은 발현을 보여주었다는 것이다. 도 55c 및 55d는 각각 사이토케라틴 8(KRT8) 및 14(KRT14)를 코딩하는 mRNA가 ≤18 세 기증자에서가 더 나이 많은 성인과 비교해서 GAPDH에 대해 감소되었다는 것을 묘사하는 사진이다(도 55c, d). 도 55e는 ≤18세 기증자로부터의 흉선에서 GAPDH에 대해 일관되게 낮은 비조정 CCL21 유전자 발현을 묘사하는 사진이다. 도 55f는 ≤18세 기증자로부터의 흉선에서 GAPDH에 대해 일관되게 낮은 비조정 CXCL21 유전자 발현을 묘사하는 사진이다.
도 56은 멀티플렉스 항체 어레이에 의해 결정되는, 흉선 장기 배양물의 소모된 배지에 존재하는 단백질의 표이다.
도 57a 내지 57c는 흉선 조직의 형태학적 측정의 사진이다. 각 측정에서 포함된 영역들은 제조자의 지시에 따라서 ImageScope 소프트웨어(Aperio Technologies, Leica Biosystems imaging, Inc.)에 의해 제공되는 "펜 툴"을 사용하여 윤곽을 그렸다. 도 57a는 녹색으로 윤곽이 그려진 H&E-염색 슬라이드 상의 흉선 조직의 전체 영역을 보여준다. 림프구를 함유하는 이 영역의 비율은 청록색으로 추가로 윤곽이 그려진다. 도 57b는 판-사이토케라틴을 확인하기 위해 AE1/AE3 칵테일과 반응한 절편 상에 황색으로 윤곽이 그려진 흉선 상피를 함유하는 영역("TE 영역")을 보여주는 사진이다. 도 57c는 CD1a 항체와 반응한 절편 상에서 적색으로 윤곽이 그려진 비성숙 흉선세포("피질 영역")를 함유하는 영역을 보여주는 사진이다. 보여준 흉선은 대동맥판막 치환술 시에 32세 여성으로부터 유래하였다. 각 패널에서 축척 막대 = 4 mm. 도 57b 및 57c의 패널에서, 갈색은 항체와 양성 반응을 지시한다.
도 58a 내지 58c는 21 일 동안 배양된 흉선 조직 슬라이스에서 소수의 생존가능 흉선세포를 묘사하는 사진이다. 도 58a는 H&E 절편에서 호염기구증가의 현저한 결여(청색)가 지시하는 바와 같이 배양 제21 일에 소수의 원상태 흉선세포를 함유하는 흉선 슬라이스를 묘사하는 사진이다. 도 58b는 CD3 면역조직화학으로 관찰되는 강한 갈색 면역반응의 대부분이 무핵 세포 쇄설물과 관련되는 것인 배양된 흉선 조직 슬라이스를 묘사하는 사진이지만, 핵융해를 아직 겪지 않은 괴사성 세포에 특유한 핵 및 세포질 염색을 나타내는 죽은 흉선세포(삽도)가 흔하다. 도 58c는 제21 일에서의 Ki-67 면역반응성이 흉선 상피 세포에 특유한 더 큰 핵을 갖는 세포에 제한된다는 것을 묘사하는 사진이다. 막대는 주패널에서는 300 μm, 삽도에서는 50 μm를 나타낸다.
도 59a 내지 59c는 유전자 발현 분석에 사용되는 사람 흉선 조직의 특성을 보여주는 그래프이다. 도 59a는 연구되는 흉선 조직의 연령별 및 성별 분포를 묘사하고, 아래쪽의 검정색으로 채운 원은 여성을 나타내고, 위쪽의 속빈 원은 남성을 나타내고, 중간 회색 원은 성별이 알려지지 않은 기증자를 나타낸다. 도 59b는 흉선 조직의 이 패널에 대해 연령의 함수로서 흉선 상피 세포를 함유하는 % 영역을 플롯한다. 도 59c는 흉선 조직의 이 패널에 대해 연령의 함수로서 CD1a-양성 흉선세포에 의해 확정되는 활성 흉선세포생성을 갖는 % 영역을 플롯한다.
도 60은 신선하게 수확된 흉선 조직의 사진이다.
도 61a 및 61b는 10X PBS의 강제 분해 조건에 노출 후의 흉선 조직 슬라이드의 조직학을 묘사한다. 도 61a는 강제 분해 조건에 노출 후 제9 일에서의 피질을 묘사한다. 도 61b는 강제 분해 조건에 노출 후 제21 일에서의 피질을 묘사한다. 도 61a에서, 청색 얼룩은 세포로부터 방출된 DAN이다. 대다수의 세포는 분해의 증거를 보여주지만, 원상태 핵을 갖는 세포들의 작은 초점들이 확인될 수 있다. Photo by Laura P. Hale, MD, PhD, Department of Pathology, Duke University.
도 62a는 섹션 [00520]에서 논의되는 바와 같이, 특성화 시험을 위한 흉선 조직의 슬라이싱을 보여주는 개략도를 보여준다. 도62b는 흉선의 배양에 사용되는 조직 배양 접시 안의 수술용 스폰지 상에 있는 셀룰로스 필터 상의 흉선 조직의 슬라이스를 보여주는 도면이다.
도 63a 내지 63h는 기증자로부터 흉선 수확 후 제5 일, 제9 일, 제12 일 및 제21 일에 배양된 흉선 조직의 로트(MFG-056)로부터의 흉선 조직 슬라이스의 조직학 시험을 묘사한다. 헤마톡실린 및 에오신-염색 슬라이스(좌측 패널) 및 항-사이토케라틴 항체 AE1/AE3의 칵테일과 그의 상응하는 반응성(우측 패널; 갈색은 양성 반응성을 나타냄)을 제5 일 (도 63a, 도 63b), 제9 일 (도 63c, 도 63d), 제12 일(도 63e, 도 63f), 및 제21 일 (도 63g, 도 63h) 각각에서 보여준다. 각 패널의 하단 좌측의 막대는 100 μm를 나타낸다. H&E를 갖는 패널은 시간에 따른 T 세포 고갈의 진행을 보여준다. 도 14e 및 도 63f는 주로 상피세포이다. 피막하 피질의 상피의 응축이 흉선세포가 시간에 따라 고갈됨에 따라 일어난다. 유사한 응축이 흉선의 수질 영역에서 일어난다. Photo by Laura P. Hale, MD, PhD, Department of Pathology, Duke University.
도 64a 및 64b는 각각 5 mm (도 64a) 및 100 μm (도 64b)의 축척으로 시간 경로의 제0 일에서의 흉선 조직 슬라이스의 조직학을 묘사한다. 이것은 제0 일의 저출력(바 5 mm) 및 고출력(바 100 um)에서의 흉선 및 흉선세포를 보여준다. 이것은 정상 흉선이다. 이 시점에서, 피질 및 수질은 둘 모두 많은 수의 흉선 세포를 가지고, 어두운 청색 핵이 조직의 전체적인 어두운 청색 외관에 기여한다. Photo by Laura P. Hale, MD, PhD, Department of Pathology, Duke University.
도 65a 및 65b는 각각 5 mm (도 65a) 및 100 μm (도 65b)의 축적으로 시간 경로의 제5 일에서의 흉선 조직 슬라이스의 조직학을 묘사하는 H&E 염색 슬라이드로부터의 이미지이다. 흉선세포의 고갈의 진행은 조직의 더 호산구성(분홍색)인 외관을 초래한다. Photo by Laura P. Hale, MD, PhD, Department of Pathology, Duke University.
도 66a 및 도 66b는 각각 5 mm (도 66a) 및 100 μm (도 66b)의 축척으로 시간 경로의 제12 일에서의 흉선 조직 슬라이스의 H&E 염색을 묘사한다. 본 발명자들은 흉선세포의 진행성 고갈을 관찰한다. 더 높은 배율은 핵 융해(핵의 용해)를 겪은 괴사성 세포를 진단하는 핵이 결여된 많은 호산구성 세포 소체를 보여준다. 이 정도의 괴사는 배양 중에 이 시점에서 예상된다. Photo by Laura P. Hale, MD, PhD, Department of Pathology, Duke University.
도 67a 및 도 67b는 각각 5 mm (도 67a) 및 100 μm (도 67b)의 축척으로 시간 경로의 제21 일에서의 흉선 조직 슬라이스의 H&E 염색을 묘사한다. 도 67b에서 많은 해살 소체를 함유하는 피막하 피질, 피질 영역 및 수질 영역을 포함하는 조직의 전체 아키텍처의 보존을 주목한다. 작은 어두운 세포는 주로 핵융해를 아직 겪지 않은 괴사성 흉선세포이다. Photo by Laura P. Hale, MD, PhD, Department of Pathology, Duke University.
도 68a-e는 항-사이토케라틴 항체 (AE1/AE3)의 칵테일로 면역염색된 대표 흉선 슬라이스를 묘사한다. 도 68a. 제0 일; 도 68b. 제5 일; 도 68c. 제9 일; 도 68d. 제12 일; 및 도 68e. 제21 일. 흉선 상피 망상조직의 구조는 배양이 진행될 때 원상태로 남아 있다. 막대는 400 μm를 나타낸다. Photo by Laura P. Hale, MD, PhD, Department of Pathology, Duke University.
도 69는 배양된 유아 흉선에서 CCL21 사정의 현미경사진 및 그래프를 제시한다. CCL21은 배양된 유아 흉선에 의해 높은 수준으로 생성된다. 배양 제16 일에 CCL21 항체(Ab)와의 면역조직화학적 반응성(갈색 염색)을 좌측 패널(상단 좌측 패널, 2X 배율; 하단 좌측 패널, 20X 배율)에서 보여준다. 우측에 3 개 유아 흉선 배양물(R&D Systems Duo-Set ELISA)에 대해서 배양 배지로의 CCL21 분비를 매일 측정하는 상응하는 시간 경로를 보여준다. 따라서, 배양된 흉선 조직은 기능적으로 중요한 생체분자 CCL21을 생성할 수 있고, CCL21은 비성숙 흉선세포 전구체를 흉선으로 유인하는 것을 책임지는 케모카인이다.
도 70a 내지 70d는 흉선 아키텍처를 보여주는 배양 제0 일의 신선한 흉선의 슬라이스의 현미경사진을 제시한다. 도 70a-b에서, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색은 정상 소아 흉선에 대해 예상되는 바와 같이 경계를 분명히 잘 나타낸 피질 및 더 밝은 염색 수질 영역을 보여준다. 도 70c는 모든 유형의 상피세포를 함께 검출하는 판-사이토케라틴 항체(AE1/AE3)의 칵테일과의 면역조직화학이 흉선 상피 세포가 피질 및 수질 둘 모두에서 피막 아래에 및 밝은 레이스 모양 망상조직으로 존재한다(갈색 염색은 양성 항체 반응을 보여준다)는 것을 입증한다는 것을 보여준다. 도 70b 및 도 70c에서 화살표는 해살 소체를 가리킨다. 도 70d는 사이토케라틴 14 (CK14) 항체 염색(갈색)을 보여준다. CK14 항체는 피막하 피질에서 및 수질에서 흉선 상피 세포 뿐만 아니라 피질에서 산포된 흉선 상피 세포와 반응한다. 점선은 피질에 의해 둘러싸인 수질의 영역을 강조한다. SCC는 피막하 피질을 나타내고, Cor은 피질을 나타내고, M은 수질을 나타낸다. 도 70a에서 축척 막대는 1 mm를 나타내고, 도 70b-d에서 축척 막대는 500 μm를 나타낸다.
도 71a 내지 71d는 배양된 흉선 슬라이스에서 해살 소체의 예를 보여주는 현미경사진을 제시한다. 배양 제0 일(도 71a-b) 및 제9 일(도 71c-d)에서의 해살 소체의 조직학적 외관을 보여준다. 도 71a 및 도 71c는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 보여주고; 도 71b 및 도 71d는 판-사이토케라틴(AE1/AE3) 항체와의 반응성을 보여준다(갈색은 양성 반응을 지시한다). 도 71a-d의 화살촉은 대표 해살 소체를 가리키고, 해살 소체들은 주위의 흉선세포의 고갈 및 괴사 때문에 배양된 흉선의 H&E-염색 절편에서 덜 두드러져 보인다. 그러나, 해살 소체는 신중한 검사에 의해 또는 면역조직화학을 사용함으로써 여전히 쉽게 확인될 수 있다. 도 71a-d에서 축척 막대는 100 μm를 나타낸다.
도 72a 내지 72d는 제7 일에서의 배양된 흉선의 아키텍처를 보여주는 현미경사진을 제시한다. 도 72a-b에서 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색은 흉선세포의 현저한 고갈을 보여주지만, 일부 피질 영역(Cor)은 보유된 핵을 갖는 많은 수의 흉선세포를 여전히 함유한다. 도 72c에서 판-사이토케라틴(AE1/AE3) 및 도 72d에서 사이토케라틴 14 (CK14) 면역조직화학은 피막하 피질(SCC)에서 및 수질(M)에서 흉선 상피의 응축을 보여준다. 도 72c-d에서 갈색은 항체와의 양성 반응을 지시한다. 축척 막대는 도 23에서는 1 mm 및 도 72b-d에서는 500 μm를 나타낸다.
도 73a 내지 73d는 제9 일에서의 배양된 흉선의 아키텍처를 보여주는 현미경사진을 제시한다. 도 73a-b는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 보여준다. 있다하더라도 소수의 살아있는 T 세포 또는 흉선 상피 세포가 도 73a에서 점선으로 에워싸인 엷은-염색 영역에 존재하고, 이는 거의 완전히 괴사성(Necr)이다. 이 영역에 이전에 존재하는 대부분 핵은 핵융해에 의해 분해되었다. 잔류 흉선세포로부터의 핵이 완전히 분해되지 않은 다른 영역은 헤마톡실린으로 어두운 청색으로 계속 염색된다. 도 73b의 화살표는 해살 소체를 가리킨다. 도 73c는 판-사이토케라틴(AE1/AE3) 면역반응성(갈색)을 보여주고; 도 73d는 사이토케라틴 14(CK14) 면역반응성 (갈색)을 보여준다. 축척 막대는 도 73a에서는 1 mm 및 도 73b-d에서는 500 μm를 나타낸다.
도 74a 내지 74d는 제12 일에서의 배양된 흉선의 아키텍처를 보여주는 현미경사진을 제시한다. 도 74a-b는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 보여준다. 이 시점에서, 많은 흉선세포가 조직으로부터 소실되었거나 또는 죽었고, 그들의 핵이 용해되었으며, 이로 인해 조직이 더 호산구성(분홍색)이 되었다. 일부 영역은 더 호염기성(청색)으로 염색되는 피질-유사 영역(Cor) 및 수질-유사 영역(M)을 갖는 정상 비배양된 흉선에 특유한 아키텍처를 보유하지만, 흉선세포 세포충실도가 크게 감소된다. 도 74c는 판-사이토케라틴(AE1/AE3) 면역반응성(갈색)을 보여주고; 도 74d는 사이토케라틴 14 (CK14) 면역반응성(갈색)을 보여준다. 이 시점에서, 피막하 피질(SCC)이 두꺼워졌고, 존재하는 흉선세포 수의 감소 때문에 상피세포가 더 두드러지게 보인다. 화살표는 대표 해살 소체를 가리킨다. 막대는 도74a에서는 1 mm 및 도 74b-d에서는 500 μm를 나타낸다.
도 75a-b는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 보여준다. 이 시점에서, 대부분 흉선세포가 조직으로부터 소실되었거나 또는 죽었고 그들의 핵이 용해되었으며, 이로 인해 조직이 더 호산구성(분홍색)이 되었다. 잔류 흉선세포의 큰 그룹은 드물지만, 흉선세포의 핵 특성을 갖는 산포된 세포가 눈에 띈다. 도 75c는 판-사이토케라틴(AE1/AE3) 면역반응성(갈색)을 보여준다. 이전의 수질 영역(M)에 존재하는 상피의 많은 부분이 수질 흉선세포의 소실 때문에 응축하지만, 흉선 상피 세포의 잔류 밝은 레이스 모양 3 차원 망상조직을 지시하는 산포된 상피세포는 남아 있다. 도 75d에서, 사이토케라틴 14 (CK14) 면역조직화학(갈색)은 이전의 수질 영역 및 피막하 피질을 강조한다. 화살표는 대표 해살 소체를 가리킨다. 축척 막대는 도 75a에서 1 mm 및 도 75b-d에서 500 μm를 나타낸다.
도 76a-b는 흉선 슬라이스에서 원상태 핵의 예를 보여주는 현미경사진을 제시한다. 제9 일에서의 피막하 피질에서(도 76a) 및 제21 일에서의 수질에서(도 76b) 원상태 흉선 상피 세포 핵(화살표)의 예를 보여준다. 헤마톡실린 및 에오신 염색; 축척 막대는 50 μm를 나타낸다.
도 77a 내지 77e는 상이한 시점에서 배양된 흉선 조직의 흉선 상피 망상조직의 비교를 보여주는 현미경사진을 제시한다. 도 77a는 제0 일을 보여주고, 도 77b는 제5 일을 보여주고, 도 77c는 제9 일을 보여주고, 도 77d는 제12 일을 보여주고, 도 77e는 제21 일을 보여준다. 흉선세포 고갈 및 괴사의 양의 시점-관련 차이가 있어서 조직이 시간에 따라 덜 호염기성(청색)이 되지만, 흉선 상피 망상조직의 구조(갈색)는 배양이 진행할 때 원상태로 남아 있다. 개재하는 흉선세포가 고갈되 기 때문에 피질 및 수질 상피 둘 모두가 응축할 수 있다. 갈색은 항-사이토케라틴 항체(AE1/AE3)의 칵테일과의 양성 반응을 지시하고; 헤마톡실린 대비염색. 축척 막대는 400 μm를 나타낸다.
도 78a-k는 배양 중 시간의 함수로서 흉선 슬라이스에서 CD3 면역조직화학의 예를 보여주는 현미경사진을 제시한다. 도 78a-b는 제0 일에 피질에서의 본질적으로 모든 비성숙 T 세포 및 수질에서의 더 성숙한 세포가 CD3 항체와 강하게 반응한다는 것을 보여준다. 더 높은 배율(도 78b)은 CD3의 막 발현과 일관되는 갈색 면역반응성의 고리에 의해 둘러싸인 담청색 핵을 보여준다. 도 78c-e에서, 조직은 제7 일에 CD3 항체와 광범위한 반응성을 여전히 보여준다. 그러나, 도 78d-e는 더 높은 배율로 볼 때, 대부분 갈색 초점들이 핵의 증거가 없기 때문에(도 78d) 대다수의 면역반응(갈색)이 죽은 흉선세포로부터의 쇄설물과 관련있다는 것을 보여준다. 원상태 핵 및 막 염색(화살표)을 입증하는 세포의 작은 초점들이 쇄설물로부터 떨어져 있는 영역에서 여전히 확인될 수 있다(도 78e). 배양이 제9 일(도 78f-g), 제12 일(도 78h-i), 및 제21 일(도 78j-k)을 통해 진행할 때, 흉선세포 세포 쇄설물과의 반응성이 여전히 강하고, 이로 인해 쇄설물로 둘러싸인 잠재적 원상태 세포를 신뢰할만하게 검출하는 것이 어렵다. 보여준 슬라이스는 모두 이들 시점에서 검사되는 다수의 로트를 대표하는 단일의 로트로부터 유래한다. 축척 막대는 도 78a, 도 78c, 도 78f, 도 78h, 및 도 78j에서는 500 μm, 및 도 78b, 도 78d, 도 78e, 도 78g, 도 78i, 및 도 78k에서는 50 μm를 나타낸다.
도 79a-k는 배양 중에 시간의 함수로서 흉선 슬라이스에서 Ki-67 면역조직화학의 예를 보여주는 현미경사진을 제시한다. 보여준 슬라이스는 모두 유사한 시점에서 검사한 다수의 로트를 대표하는 단일의 로트로부터 유래한다. 도 79a-b는 제0 일에 피질(Cor)에서의 대다수의 비성숙 T 세포의 핵이 Ki-67에 대해 특이적인 항체와 강하게 반응한다는 것을 보여준다. 더 높은 배율(도 79b)은 피질 흉선세포의 핵과 강한 양성 반응성(갈색)을 보여주는 반면, 수질(M)에서는 림프구가 아주 드물게 Ki-67 항체와 반응한다. 도 79c-e는 제7 일까지 피질 영역에 남아 있는 대부분 흉선세포의 핵이 작고, 세포자살과 일관되는 희미한 핵 경계를 가지고, 그들이 Ki-67-특이적 항체와 반응하지 못한다는 것을 보여준다. 항체와 반응하는 세포(도 79e, 화살표)는 더 큰 핵을 가지고, 이는 그들이 흉선 상피 세포임을 암시한다. 잔류 흉선세포 핵의 Ki-67 라벨링의 유사한 결여가 제9 일(도 79f-g), 제12 일(도 79h-i) 및 제21 일(도 79j-k)에 보인다. 축척 막대는 도 79a, 도 79c, 도 79e, 도 79g, 및 도 79i에서는 500 μm 및 도 79b, 도 79d, 도 79f, 도 79h, 및 도 79j에서 는 50 μm를 나타낸다.
도 80은 사람 흉선 장기 배양물로부터 컨디셔닝된 배지에서 검출되는 uPAR의 플롯이다.
도 81은 사람 흉선 장기 배양물로부터 컨디셔닝된 배지에서 검출되는 OPN의 플롯이다.
도 82는 사람 흉선 장기 배양물로부터 컨디셔닝된 배지에서 검출되는 MIP3a의 플롯이다.
도 83은 사람 흉선 장기 배양물로부터 컨디셔닝된 배지에서 검출되는 IGFBP-1의 플롯이다.
도 84는 사람 흉선 장기 배양물로부터 컨디셔닝된 배지에서 검출되는 MIF의 플롯이다.
도 85는 소모된 배지에서의 CCL21 농도 대 일수의 산점도이다.
도 86은 소모된 배지에서의 CCL21 농도 대 일수의 박스플롯이다.
도 87은 강제 분해 연구 - 로트 MFG-053 및 로트-054에서 도4: CCL21 수준(pg/mL)의 그래프이다.
도 88은 강제 분해 연구 - 로트 MFG-066에서의 CCL21 수준(pg/mL)의 그래프이다.
도 89는 소모된 배지에서의 CXCL16 농도 대 일수의 산점도이다.
도 90은 소모된 배지에서의 CXCL16 농도 대 일수의 박스플롯이다.
도 91은 강제 분해 연구 - 로트 MFG-053 및 로트 MFG-054에서 CXCL16 수준(pg/mL)의 산점도이다.
도 92는 강제 분해 연구 - 로트 MFG-066에서 CXCL21 수준의 산점도이다.
도 93은 소모된 배지에서의 L-셀렉틴 농도 대 일수의 산점도이다.
도 94는 소모된 배지에서의 L-셀렉틴 농도 대 일수의 박스플롯이다.
도 95는 강제 분해 연구 - 로트 MFG-053 및 로트 MFG-054에서 L-셀렉틴 수준(pg/mL)의 산점도이다.
도 96은 강제 분해 연구 - 로트 MFG-066에서 L-셀렉틴 수준의 산점도이다.
도 97은 소모된 배지에서의 uPAR 농도 대 일수의 산점도이다.
도 98은 소모된 배지에서의 uPAR 농도 대 일수의 박스플롯이다.
도 99는 강제 분해 연구 - 로트 MFG-053 및 로트 MFG-054에서 uPAR 수준(pg/mL)의 산점도이다.
도 100은 강제 분해 연구 - 로트 MFG-066에서 uPAR 수준의 산점도이다.
도 101은 CXCL16 대 CCL21의 산점도이다.
도 102는 CCL21 대 uPAR의 2차 회귀 모델이다.
도 103은 CXCL16 대 uPAR의 2차 회귀 모델이다.
도 104는 소모된 배지에서의 CCL11 농도 대 일수의 산점도이다.
도 105는 소모된 배지에서의 CCL11 농도 대 일수의 박스플롯이다.
도 106은 소모된 배지에서의 CCL11 농도 대 일수의 선형 회귀 모델이다.
도 107은 강제 분해 연구 - 로트 MFG-053 및 로트 MFG-054에서 CCL11 수준(pg/mL)의 플롯이다
도 108은 강제 분해 연구 - 로트 MFG-066에서 CCL11 수준의 로트이다.
도 109는 소모된 배지에서의 OPN 농도 대 일수의 산점도이다.
도 110은 소모된 배지에서의 OPN 농도 대 일수의 박스플롯이다.
도 111은 소모된 배지에서의 OPN 농도 대 일수의 2차 회귀 모델이다.
도 112는 강제 분해 연구 - 로트 MFG-053 및 로트 MFC-054에서 OPN 수준(pg/mL)의 플롯이다.
도 113은 강제 분해 연구 - 로트 MFG-066에서의 OPN 수준의 플롯이다.
도 114는 소모된 배지에서의 CXCL12 농도 대 일수의 산점도이다.
도 115는 소모된 배지에서의 CXCL12 농도 대 일수의 박스플롯이다.
도 116은 소모된 배지에서의 CXCL12 농도 대 일수의 적합선 플롯이다.
도 117은 강제 분해 연구 - 로트 MFG-053 및 로트 MFG-054에서 CXCL12 수준(pg/mL)의 산점도이다.
도 118은 강제 분해 연구 - 로트 MFG-066에서 CXCL12 수준의 산점도이다.
도 119는 소모된 배지에서의 CCL20 농도 대 일수의 산점도이다.
도 120은 소모된 배지에서의 CCL20 농도 대 일수의 박스플롯이다.
도 121은 소모된 배지에서의 CCL20 농도 대 일수의 3차 회귀 모델이다.
도 122는 강제 분해 연구 - 로트 MFG-053 및 로트 MFG-054에서 CCL20 수준(pg/mL)의 산점도이다.
도 123은 강제 분해 연구 - 로트 MFG-066에서 CCL20 수준의 산점도이다.
도 124는 소모된 배지에서의 IL-16 농도 대 일수의 산점도이다.
도 125는 소모된 배지에서의 IL-16 농도 대 일수의 박스플롯이다.
도 126은 소모된 배지에서의 IL-16 농도 대 일수의 적합선 플롯이다.
도 127은 강제 분해 연구 - 로트 MFG-053 및 로트 MFG-054에서 IL-16 수준(pg/mL)의 산점도이다.
도 128은 강제 분해 연구 - 로트 MFG-066에서 IL-16 수준의 산점도이다.
도 129는 소모된 배지에서의 IGFBP-1 농도 대 일수의 산점도이다.
도 130은 소모된 배지에서의 IGFBP-1 농도 대 일수의 박스플롯이다.
도 131은 소모된 배지에서의 IGFBP-1 농도 대 일수의 적합선 플롯이다.
도 132는 강제 분해 연구 - 로트 MFG-053에서 IGFBP-1 수준(pg/mL)의 산점도이다.
도 133은 강제 분해 연구 - 로트 MFG-066에서 OGFBP-1 수준의 산점도이다.
도 134는 소모된 배지에서의 MIF 농도 대 일수의 산점도이다.
도 135는 소모된 배지에서의 MIF 농도 대 일수의 박스플롯이다.
도 136은 소모된 배지에서의 MIF 농도 대 일수의 선형 회귀 모델이다.
도 137은 강제 분해 연구 - 로트-MFG-053 및 로트 MFG-054에서 MIF 수준(pg/mL)의 산점도이다.
도 138은 강제 분해 연구-로트 MFG-066에서 MIF 수준의 산점도이다.
도 139는 소모된 배지에서의 CCL25 농도 대 일수의 산점도이다.
도 140은 소모된 배지에서의 CCL25 농도 대 일수의 박스플롯이다.
도 141은 소모된 배지에서의 MIF 농도 대 일수의 선형 회귀 모델이다.
도 142는 강제 분해 연구-로트-053 및 로트-054에서의 CCL25 수준(pg/mL)의 산점도이다.
도 143은 강제 분해 연구-로트 MFG-066에서의 CCL25 수준의 산점도이다.
발명의 상세한 설명
본원에서 제공되는 제목, 주제 및 부제는 본 개시물의 다양한 측면을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 따라서, 아래에서 정의된 용어들은 명세서를 그 전체로 참고하여 더 충분히 정의된다. 본원에서 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 참고로 포함된다.
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본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이 단수 형태 ("a", "an" 및 "the") 및 임의의 단어의 임의의 단수 사용은 명확히 및 명백히 하나의 지시대상으로 제한되지 않으면 복수 지시대상을 포함한다는 것을 추가로 주목한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하다" 및 그의 문법적 변이형은 비제한하는 것으로 의도되고, 이렇게 해서 한 목록에서 항목들의 언급은 치환될 수 있거나 또는 열거된 항목에 추가될 수 있는 다른 유사한 항목을 배제하지 않는다.
본 발명은 다음 정의를 참고하여 가장 명료하게 이해된다.
용어 "약"은 본원에서 대략, 의 영역에서, 거의 또는 쯤을 의미하는 데 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용될 때, 그것은 나타낸 수치 값보다 위로 및 아래로 경계를 연장함으로써 그 범위를 변경한다. 일반적으로, 용어 "약"은 수치 값을 진술된 값보다 위로 및 아래로 +/- 10%의 변동량 정도 변경하는 데 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 약은 명확히 지시되든 지시되지 않든 예를 들어 정수, 분수 및 백분율을 포함하는 수치 값을 지칭한다. 용어 약은 일반적으로 관련 분야의 통상의 기술을 가진 자가 나열된 값과 동등하다(예를 들어 동일한 기능 또는 결과를 가진다)고 여기는 어느 범위의 수치 값(예를 들어, 나열된 범위의 +/-5-10%)을 지칭한다. 적어도 및 약과 같은 용어가 수치 값 또는 범위의 목록에 선행할 때, 그 용어들은 목록에 제공된 모든 값 또는 범위를 수식한다. 일부 경우에서, 용어 약은 가장 가까운 유효숫자로 반올림되는 수치 값을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동물"은 사람 및 비사람 척추동물 예컨대 야생 동물, 가정에서 기르는 동물, 및 농장 동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 동물은 또한 "대상체"라고도 불릴 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생체표지자"는 도 56에서 열거된 물질을 지칭한다. 흉선 장기 배지에서의 생체표지자의 출현과 관련해서 "감소된" 및 "증가된" 수준의 언급은 컨디셔닝 레지멘의 시간 경로 동안의 특정 생체표지자의 증가된 측정값 또는 감소된 측정값을 지칭한다는 것을 추가로 이해해야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "생체적합성"은 포유동물에 임플란팅될 때 포유동물에서 불리한 반응을 유발하지 않는 임의의 물질을 지칭한다.
"만성 이식물 거부"는 일반적으로, 심지어 급성 거부의 성공적인 면역억제의 존재 하에서도, 사람에서 생착 후 수 개월 내지 수 년 내에 일어난다. 섬유증은 모든 유형의 장기 이식물의 만성 거부에서 공통 요인이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는"(comprising) (및 포함하는(comprising)의 임의의 형태, 예컨대, "포함한다"(comprise), "포함한다"(comprises), 및 "포함되는"(comprised)), "가지는"(having) (및 가지는(having)의 임의의 형태, 예컨대 "가진다"(have) 및 "가진다"(has)), "포함하는"(including) (및 포함하는(including)의 임의의 형태, 예컨대 "포함한다"(includes) 및 "포함한다"(include)), 또는 "함유하는"(containing) (및 함유하는(containing)의 임의의 형태, 예컨대 "함유한다"(contains) 및 "함유한다"(contain))는 포괄적이거나 또는 개방형이고, 추가의 나열되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 추가로, 용어 "포함하는"(comprising)과 함께 사용되는 용어는 또한 용어 "로 이루어지는" 또는 "로 본질적으로 이루어지는"과 함께 사용될 수 있는 것으로 이해한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "이식편"은 대표적으로 결함을 대체하거나, 교정하거나 또는 다른 방식으로 극복하기 위해 개체에게 임플란팅되는 조직 또는 장기를 지칭한다. 조직 또는 장기는 동일 개체로부터 기원하는 세포로 이루어질 수 있고; 이 이식편은 본원에서는 다음 호환가능한 용어로 지칭될 수 있다: "자가이식편"(autograft), "자가 이식물", "자가 임플란트" 및 "자가 이식편"(autologous graft). 동일한 종의 유전적으로 상이한 개체로부터의 이식편은 본원에서는 다음 호환가능한 용어로 지칭될 수 있다: "동종이계이식편"(allograft), "동종이계 이식물", "동종이계 임플란트" 및 "동종이계 이식편"(allogeneic graft). 한 개체로부터 그의 동일한 쌍둥이에게로의 이식편을 본원에서는 "동종동계이식편"(isograft), "동종동계 이식물", "동종동계 임플란트" 또는 "동종동계 이식편"(syngeneic graft)이라고 부른다. "이종이식편", "이종 이식물" 또는 "이종 임플란트"는 한 개체로부터 상이한 종의 또 다른 개체에게로의 이식편을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "HLA 일치된"은 HLA 항원 중 어느 것도 기증자와 수혜자 간에 불일치되지 않는 기증자 수혜자 쌍을 지칭한다. 본 발명의 방법에서 HLA 일치는 HLA 대립유전자: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DQA1, HLA- DPB1, 및 HLA-DPA1을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "HLA 불일치된"은 대표적으로 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DQA1, HLA-DPB1, 및 HLA-DPA1에 관해서 기증자 및 수혜자 HLA 항원에서의 일치를 지칭하고, 여기서 기증자와 수혜자 사이의 HLA 불일치가 일어난다. 일부 경우에서, 하나의 하플로타입이 일치되고, 다른 하나가 불일치된다. 이 상황은 생체 또는 사후 기증자로부터의 장기에서 빈번히 발견된다. 기증자-수혜자 쌍에서 HLA 불일치는 HLA-일치된 쌍에 대해 증가된 이식편 거부 위험을 초래한다.
전술한 정의의 배경으로서, HLA 항원은 "사람 백혈구 항원"에 상응하고, 이는 독특한 항원 동일성(identity)을 이들 세포에 부여하는 세포의 표면에서 발현되는 단백질 분자이다. 그들은 또한 "주조직 적합 복합체 항원"으로도 알려져 있다. 따라서 MHC 또는 HLA 항원은 T-세포에 의해 "자기" 또는 "비자기"로 인식되는 표적 분자이다. HLA 항원이 면역 효과기 세포와 동일한 원천의 조혈 줄기 세포로부터 유래하면, 그들은 "자기"라고 여긴다. HLA 항원이 또 다른 원천의 조혈 재구성 세포로부터 유래되면, 그들은 "비자기"라고 여긴다.
HLA 항원의 두 주요 부류가 인식된다: HLA-Class I 및 HLA-Class II. HLA-Class I 항원(사람에서 A, B, 및 C)은 각 세포가 "자기"라고 인식가능하게 한다. HLA-Class II 항원(사람에서 DRB1, DPB1, DPA1, DQB1, 및 DQA1)은 림프구와 항원 제시 세포 간의 반응에 관여한다. 두 부류의 HLA 항원 모두가 이식된 장기 거부의 표적임을 암시하였다.
HLA 유전자는 사람 염색체 위치 6p21에서 클러스터링된다. 이 클러스터의 유전자들은 6개 고전적 이식 HLA 유전자를 코딩한다. 6p21의 세그먼트는 또한 면역계 및 다른 근본적 분자 및 세포 과정의 조절에서 중요한 역할을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자를 코딩한다. 완전한 클러스터는 크기가 거의 3.6 Mb이고, 적어도 224 개 유전자좌를 가진다. 클러스터링의 결과로서, 일부 "하플로타입"이 발생한다(대립유전자의 세트가 단일의 염색체에 존재한다). 한 부모로부터 물려받은 하플로타입은 한 그룹으로서 물려받는 경향이 있다. 각 부모로부터 물려받은 대립유전자의 세트가 하플로타입을 형성하고, 여기서는 일부 대립유전자가 함께 회합되는 경향이 있다. HLA 일치는 수혜자의 하플로타입을 확인하고 적합한 일치하는 기증자를 확인하는 것을 돕는 데 사용된다. 일부 하플로타입이 다른 것들보다 더 우세하고, 그들은 상이한 인종 및 민족 그룹에서 빈도가 다르다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 "을 필요로 하는'은 대상체가 특정 방법 또는 치료의 필요를 가지는 것으로 확인되었다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 확인은 임의의 진단 수단에 의할 수 있다. 본원에서 기술된 임의의 방법 및 치료에서, 대상체는 그것을 필요로 할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 "X 내지 Y의 정수"는 끝점을 포함하는 임의의 정수를 의미한다. 예를 들어, 어구 "X 내지 Y의 정수"는 1, 2, 3, 4, 또는 5를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포유동물"은 설치류(즉, 마우스, 래트, 또는 기니아 피그), 원숭이, 고양이, 개, 암소(cow), 말, 피그(pig) 또는 사람을 의미한다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 사람이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "장기"는 유기체 내에서 특이적 기능 또는 기능의 군을 수행하는 고형 혈관화된 장기를 지칭한다. 용어 장기는 심장, 폐, 신장, 간, 췌장, 피부, 자궁, 뼈, 연골, 소장 또는 대장, 방광, 뇌, 가슴, 혈관, 식도, 나팔관, 담낭, 난소, 췌장, 전립선, 태반, 척수, 상지 및 하지를 포함하는 팔다리, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 기도, 수뇨관, 요도, 자궁을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "방지하다", "방지하는" 및 "방지"는 개체가 주어진 기간 동안 질환, 장애, 또는 병태의 증상을 발달시킬 가능성을 감소시키기 위해 질환, 장애, 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 궁극적으로 나타낼 수 있지만 아직 나타내지 않은 개체에게 요법의 투여를 지칭한다. 그러한 감소는 예를 들어, 환자에서 질환, 장애, 또는 병태의 적어도 하나의 증상의 지연된 개시로 반영될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 호환가능하게 사용되는 용어 "대상체", "개체" 또는 "환자"는 포유동물, 예컨대 마우스, 래트, 다른 설치류, 토끼, 개, 고양이, 돼지(swine), 소(cattle), 양, 말, 또는 영장류, 예컨대 사람을 포함해서 임의의 동물을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 "치료적 유효량"은 조직, 계통, 동물, 개체 또는 사람에서 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 추구되고 있는 생물학적 또는 의학적 반응을 이끌어내는 활성 화합물 또는 제약학적 작용제의 양을 의미한다. 치료적 효과는 치료되고 있는 장애 또는 요망되는 생물학적 효과에 의존한다. 그렇기 때문에, 치료적 효과는 장애와 관련된 증상의 심도의 감소 및/또는 장애의 진행의 억제(부분 또는 완전), 또는 장애 또는 부작용의 개선된 치료, 치유, 방지, 또는 제거일 수 있다. 치료적 반응을 이끌어내는 데 필요한 양은 대상체의 연령, 건강, 체격 및 성별에 기초하여 결정될 수 있다. 최적의 양은 또한 치료에 대한 대상체의 반응의 모니터링에 기초하여 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "조직"은 사람 또는 동물에서 임의의 유형의 조직을 지칭하고, 혈관 조직, 피부 조직, 간 조직, 췌장 조직, 신경 조직, 비뇨생식기 조직, 위장 조직, 뼈 및 연골을 포함하는 골격 조직, 지방 조직, 힘줄 및 인대를 포함하는 결합 조직, 양막 조직, 융모막 조직, 경막, 심막, 근육 조직, 샘 조직, 안면 조직, 눈 조직을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 개시물의 맥락에서 "조직 은행"은 액체 질소 하에서 저장되는 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 장기 저장을 지칭한다. 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 저장소의 확립을 위한 일반 지침은 Guidance for Industry로부터 얻을 수 있다. https://www.fda.gov/downloads/Biologics BloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Tissue/UCM285223.pdf.에서 입수가능한 Current Good Tissue Practice (CGTP) 및 Additional Requirements for Manufacturers of Human Cells, Tissues, and Cellular and Tissue-Based Products(HCT/Ps).
"조직공학(조직공학적)"은 조직 대체 또는 재구성에 사용하기 위해 생체외에서 조직을 생성하는 공정을 지칭한다. 조직공학은 생체 공학적 재료 및 기술과 함께 세포, 유전자 또는 다른 생물학적 빌딩 블록의 포함에 의해 조직 및 장기의 수복 또는 대체에의 접근을 포함하는 "재생 의학"의 예이다.
용어 "이식물 거부"는 급성 및 만성 이식물 거부 둘 모두를 망라한다. "급성 거부"는 이식된 조직이 면역학적으로 외래성일 때 조직 이식물 수혜자의 면역계에 의한 거부이다. 급성 거부는 효과기 기능을 수행하고 이식물 조직을 파괴하는 수혜자의 면역 세포에 의한 이식물 조직의 침윤을 특징으로 한다. 급성 거부의 개시는 급속하고, 일반적으로 이식물 수술 후 수 주 이내에 사람에서 일어난다. 일반적으로, 급성 거부는 면역억제 약물 예컨대 라파마이신, 시클로스포린 A, 항-CD40L 단일클론 항체 등으로 저해될 수 있거나 또는 억제될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료되는" 또는 "치료하는은 치료적 치료 및 예방적 조치 둘 모두를 의미하고, 여기서 목적은 요망되지 않는 생리학적 병태, 장애 또는 질환을 지체시키거나(완화하거나) 또는 유익한 또는 요망되는 임상 결과를 얻는 것이다. 예를 들어, 유익한 또는 요망되는 임상 결과는 증상의 경감; 병태, 장애 또는 질환의 정도의 약화; 병태, 장애 또는 질환의 안정화된(즉, 악화하지 않는) 상태; 병태, 장애 또는 질환 진행의 개시의 지연 또는 지체; 검출가능하든 검출불가능하든 병태, 장애 또는 질환 상태의 호전 또는 차도(부분 또는 완전); 환자에 의해 반드시 식별할 수 있지는 않은 적어도 하나의 측정가능한 물리적 매개변수의 호전; 또는 병태, 장애 또는 질환의 향상 또는 개선을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 기술되는 바와 같이, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위가 다르게 지시되지 않으면 나열된 범위 내의 임의의 정수 및 적당할 때는, 그의 분수(예컨대 정수의 1/10 및 1/100)의 값을 포함한다는 것을 이해해야 한다. 범위들은 거의 정확하고, 정수 초과 정도의 차이가 있을 수 있다.
단위, 접두사, 및 기호는 그들의 Syst
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me International de Unites (SI) 승인된 형태로 나타낸다. 수치 범위는 그 범위를 한정하는 숫자를 포함한다. 측정된 값은 근사치이고 유효숫자 및 측정과 관련된 오차를 고려한다는 것을 이해한다.
명확성을 위해 개별 실시양태의 맥락에서 기술되는 본원에서 기술된 일부 특징이 또한 조합해서 단일의 실시양태에 제공될 수 있다는 것을 추가로 인식한다. 반대로, 간략성을 위해 단일의 실시양태의 맥락에서 기술된 다양한 특징이 또한 개별적으로 또는 임의의 적합한 하위조합으로 제공될 수 있다.
기증자 흉선 조직의 수확
기증자 흉선 조직은 생후 심장 수술 동안에 폐기될 수 있고, 기증자 가족의 충분한 설명 후 동의로 CTT에 사용될 수 있다. 일부 흉선의 제거가 수술 부위를 드러내기 위해 필요할 수 있다. 따라서, 수술 절차의 본질 때문에, 흉선의 일부가 생후 심장 수술에서 심장 수술 동안에 제거될 수 있다.
생후 심장 수술 동안에 흉선 조직의 일부가 수술 절차 동안에 폐기될 수 있다. 흉선이 이식을 위해 스크리닝되든 되지 않든 모든 심장 수술에서 외과의사는 폐기된 흉선 조직을 멸균 용기에 놓는다.
완전형 디죠지 증후군을 갖는 유아에서 흉선 조직 이식을 위한 흉선 조직 기증자는 9 개월 미만의 유아였다. 약물 물질 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 본원에서 기술된 바와 같은 폐기된 흉선 조직을 가공하고 배양함으로써 제조된다.
배양된 흉선 조직 임플란테이션에 흉선의 사용을 위한 동의는 흉선이 수확되기 전에 또는 후에 얻을 수 있다. 그러나, 우회술을 겪기 전에 혈액을 유아로부터 얻는 것을 허용하는 동의가 필요하고, 항상 수술 전에 얻는다. 이 혈액 샘플은 기증자 스크리닝에 사용된다.
폐기된 흉선 조직을 멸균 용기에 넣는다. 기증자 및 기증자의 생모에 대해 조직 이식을 위한 FDA 지침에 따라서 일상적인 시험을 행한다. 조직 유형 일치가 본원에서 기술된 수술적 절차에서는 요구되지 않지만, 그러한 조직 유형 일치가 일부 상황에서는 수행될 수 있다.
조직은 즉시 가공될 수 있거나 또는 다음날 가공을 위해 밤새 냉장 저장될 수 있다. 흉선 조직을 밤새 저장해야 하는 경우에는, 조직이 원래 용기의 흉선 조직을 완전히 덮는 데 충분한 흉선 장기 배지(아래에서 기술되는 "TOM" 배지)에 무균 첨가된다. 흉선을 갖는 용기는 다음날 가공 준비가 될 때까지 냉장고 안에 넣어 둔다.
흉선 조직 컨디셔닝의 개요
컨디셔닝 레지멘은 배양된 흉선 조직 슬라이스로부터 기증자 흉선세포를 고갈시킨다. 시험관내 데이터(면역조직화학)에 기초하여, 12 일 내지 21 일의 배양 기간은 사이토케라틴 항체를 사용하여 사정되는 상피 망상조직을 보존한다. 배양은 바람직하게는 5% CO2 인큐베이터 안에서 37 ℃에서 행한다.
성공적 배양을 위해, 흉선 조직을 바람직하게는 슬라이싱하고, Millipore® 셀룰로스 또는 동등한 필터 상에 놓고, 조직 배양 접시 안의 수술용 스폰지 상에 놓는다. 배지는 흉선 장기 배지(TOM)를 포함하고, 매일 교체한다.
접수하자마자 흉선을 병리학에 의해 사정한다. 동일성 시험은 >50%의 레이스 모양 염색 패턴으로 케라틴에 대해 양성인 영역을 보여주어야 한다. 효력 시험은 해살 소체를 보여주어야 하고; 그것은 또한 CK14 염색을 레이스 모양 패턴으로 보여주어야 한다. 생존능 시험은 절편에서 관찰된 >90% 원상태 핵을 보여주어야 한다. 조직의 로트 출하는 제5 일 내지 제21 일(포함함) 중 어느 하루에 행해지고, 병리학에 의해 수행된다. 동일성의 경우에는, 제5 일 내지 제21 일의 조직 상의 영역이 케라틴, AE1/AE3에 대해 양성이어야 한다. 효력의 경우에는, 제5 일 내지 제21 일의 배양된 흉선 조직이 전체에 걸쳐서 산포된 사이토케라틴 CK14 염색을 보여주어야 하고, 적어도 1 개의 해살 소체가 확인되어야 한다. 생존능의 경우에는, 제5 일 내지 제21 일의 배양된 흉선 조직이 원상태 핵을 보여주어야 한다.
한 실시양태에서, 흉선 조직 슬라이스는 약 12 일 동안 컨디셔닝된 다음 동결보존된다. 또 다른 실시양태에서는 흉선 조직 슬라이스 전부가 약 12 일 동안 컨디셔닝되고, 그 다음에 약 절반이 수혜자에게 임플란팅되고, 남은 흉선 조직 슬라이스는 추후 사용을 위해 동결보존된다.
수확 24 시간 내에, 흉선을 얇은 슬라이스로 절단한다. 슬라이스를 12 - 21 일 동안 배양한다. 아래에서 상세히 기술되는 바와 같은 이 배양 과정은 생존가능 기증자 T 세포를 고갈시키고, 궁극적으로는 수술적으로 임플란팅된 조직 슬라이스가 무흉선 대상체의 면역계를 재구성하는 것을 가능하게 하고, 비록 면역학적으로 유효한 수준이라고는 하지만, 대부분 대상체는 그 연령에서 하위 10 분위 미만의 T 세포 수를 가질 것이다. 아래에서 개요를 서술하는 바와 같은 배양 과정은 기증자 흉선 조직 및 그 안에 함유된 구성 세포의 생물학적 특성을 다음 방식으로 상당히 변경시켜서 CTT 슬라이스의 유효한 치료적 특성을 최적화한다.
배양 과정은 전제조건이 되는 생물학적 특성을 가지는 배양된 세포/조직의 확정된 조성이 대상체의 면역계의 재구성을 가능하게 하기 위해 대상체에게 수술적 임플란테이션하기에 적합한 방식으로 얻어진다는 것을 보장한다.
배양 과정은 흉선세포의 소실 및 기증자 흉선 조직 슬라이스에서 흉선 상피 세포 및 다른 간질 세포의 상대적 풍부화를 초래한다.
배양 과정은 추가로 흉선세포의 고갈 및 TEC의 유지를 초래하여 수혜자의 면역계의 재구성을 가능하게 하고, 기증자 흉선에서의 HLA 항원에 대한 관용이 수혜자에서 발달하는 것을 허용한다.
종합적으로, 제작 과정은 기증자 흉선 조직으로부터 흉선세포를 고갈시키도록 및 흉선 간질(흉선 상피 세포 및 섬유모세포)의 기능적 아키텍처를 보존하도록 설계된다.
한 실시양태에서, 가공된 기증자 흉선 조직은 수술적 임플란테이션 절차 후 흉선 조직 유형에 대한 관용을 유도하는 것을 필요로 하는 대상체에서 흉선 조직 유형(HLA 항원)에 대한 관용을 유도할 수 있는 공학적 흉선 조직 생성물이다.
슬라이싱된 흉선 조직이 계속 생존가능하게 하기 위해, 흉선 절편을 배지-함유 조직 배양 접시에 삽입된 Millipore 셀룰로스 필터 및 수술용 스폰지 상에 놓는다. 각 조직 배양 접시 안의 배양 배지를 기증자로부터의 수확 당일부터 임플란테이션 당일(제12 일 내지 제21 일)까지 매일 교체한다.
기증자 흉선 조직의 배양은 그러한 가공된 조직에서 흉선세포를 고갈시키고, 이는 흉선절제술 후 극심한 면역결핍 대상체에서 매우 문제가 될 수 있는 이식편 대 숙주 질환("GvHD")의 위험을 최소화한다.
배양 중 처음 수 일 동안, 많은 흉선세포가 조직 슬라이스로부터 배양 배지 내로 "떨어지고", 배지 교체 동안에 폐기된다. 배양 기간 동안 배양이 계속됨에 따라, 기증자 흉선세포는 계속 죽지만, 그의 세포 잔여물은 CTT 슬라이스 내에 보유된다.
이론에 의해 얽매이지 않지만, 이들 생존불능 흉선세포 및 핵이 결여된 그의 잔여물의 존재는 그들이 치료 후 수혜자 골수 줄기 세포의 진입에 필요한 흉선 상피 세포의 3 차원 망상조직 내의 개방된 포켓(pocket)을 보존하는 것을 돕기 때문에 조직공학적 생성물의 의도된 기능을 위해 중요하다고 가정된다. 진입하는 골수 줄기 세포를 위한 "공간"을 가지는 것의 중요성은 Markert, 1999에서 환자 DIG003의 경험에 의해 지지된다(아래 참고문헌 목록을 참조한다). 전술한 참고문헌에서 기술된 환자는 CTT 임플란테이션 후 35 일 후에 매우 큰 용량의 스테로이드(40 mg/kg/일 x 3 일의 메틸프레드니솔론)가 주어지고, 이는 흉선세포의 세포자살 및 상피의 응축을 초래한다. 나이브 T 세포가 전혀 발달하지 않았고, 환자는 감염에 굴복하였다. 부검에서, 삽입된 흉선은 흉선세포가 진입할 상피세포 사이의 공간이 없는 생존가능 상피의 덩어리였다.
배양 기간 동안에, HLA 타이핑을 수행하여 환자(수혜자) 및 기증자 조직이 임의의 HLA 대립유전자를 공유하는지 살펴본다. 항-HLA 항체 시험을 수혜자에서 수행하여 수혜자가 흉선에서 HLA 항원에 대한 임의의 항체를 가지는지 결정한다. 수혜자가 기증자의 MHC를 표적화하는 항체를 가지면, 또 다른 흉선을 찾을 것이다. 기증자 및 기증자의 어머니를 FDA 지침서 "Guidance for Industry. Eligibility Determination for Donors of Human Cells, Tissues and Cellular and Tissue-Based Products (HCT/Ps)" 및 더 최근의 지침서에 따라서 감염에 대해 점검한다. 조직을 Code of Federal Regulations (CFR) 1271 subpart D "Current Good Tissue Practice" 하에서 무균 가공한다.
배치(batch) 기록 및 QC 시험의 검토 후 조직은 제작으로부터 출하되어 임플란테이션을 위한 수술팀에 제공되고, 본 명세서에서 기술되는 바와 같이 조직이 수혜자에게 수술적으로 임플란팅된다.
배양된 흉선 조직은 아래에서 및 본 명세서에서 나타낸 실시예에서 더 완전하게 기술되는 방법으로 생성된다.
요약하면, 수확된 흉선 조직의 배양 과정은 기증자 조직 및 거기에 함유된 구성 세포의 생물학적 특성을 다음 방식: 기증자 흉선세포의 소실 및 흉선 상피 세포 및 다른 간질 세포의 풍부화로 변경시키고, 기증자 흉선세포의 고갈은 조직의 생리학적 기능(예를 들어, 사이토카인 및 성장 인자의 분비) 뿐만 아니라 그의 구조적 특성을 변경시킨다.
배양 중에 처음 수 일 동안에, 많은 흉선세포가 조직 슬라이스로부터 배양 배지 내로 "떨어지고", 배지 교체 동안에 폐기된다.
제작 과정 동안에 일어나는 조작은 기증자로부터 얻은 원천 또는 출발 물질과 비교해서 완성된 생성물에 함유된 결과적인 세포의 육안적 및 조직학적 외관의 변화를 야기한다.
배양 중 처음 수 일 동안에 흉선 조직은 조직 상의 및 조직 내의 잔류 혈액 때문에 적색으로 보인다. 예를 들어 도 15를 참조한다.
제5 일과 제21 일 사이에, 제1 일에 분명했던 혈액 오염이 없는 생존가능 조직이 관찰된다.
남은 배양 일수 동안에, 흉선세포가 고갈됨에 따라 조직의 깊이가 감소한다. 조직에서 흉선세포의 밀도의 감소가 면역조직화학에 의해 실증되고, 아래에서 상세히 기술된다.
폐기된 흉선 조직의 수확 후 제0 일에, 조직이 조밀하게 군집된 생존가능 흉선세포가 흉선 상피 세포 및 섬유모세포를 함유하는 간질에 포매된다. AE1/AE3 및 CK14 염색은 사이토케라틴(CK)-양성 흉선 상피 세포의 존재를 확증하고, 이는 정상 흉선에 특유하다. 흉선 상피 세포는 이웃하는 흉선세포를 둘러싸는 섬세한 공정으로 레이스 모양 3 차원 망상조직을 형성한다.
배양 과정 동안에, 흉선의 슬라이스를 아래에서 기술되는 바와 같이 배양한다. 많은 흉선세포가 특히 처음 3 일 동안에 조직으로부터 씻긴다. 이 고갈은 감소된 흉선세포 밀도를 특히 수질 영역에서 보여주는 H&E 염색에 의해 제2 일 정도의 초기에 조직학적으로 확인될 수 있다. 조직에 남아 있는 대다수의 흉선세포는 세포자살 및/또는 괴사와 일관되는 핵 변화를 보여주거나, 또는 핵융해(핵의 완전 소실)를 입증한다. 많은 이들 죽은 흉선세포 및 그들의 세포 잔여물이 흉선 조직 전체에 걸쳐서 계속 존재하고, 상피세포 사이의 공간의 전체 붕괴를 방지하는 것이라고 믿는다.
일부 상피 응축은 외부 영역에서, 예컨대 피막하 피질에서 볼 수 있고, 여기서 흉선세포의 소실은 상피세포 망상조직이 붕괴하는 것을 초래하였다. 이들 응축된 피막하 피질 상피세포는 여러 세포 층 두께의 선형 어레이를 형성할 수 있고, 이는 슬라이스의 기계적 강도에 추가될 수 있다. 일부 수질 상피는 또한 응축하여 인접하는 상피세포의 패치(patch)를 형성할 수 있다.
배양이 진행됨에 따라 흉선세포의 죽음이 계속되고, 괴사성 흉선세포 쇄설물이 조직 내에 보유된다. 수질 및 피막하 피질 상피의 추가 응축은 대략 배양 제7 일 내지 제19 일에 최소로 일어난다.
정상 흉선과 유사한 상피 아키텍처를 갖는 영역이 AE1/AE3 염색을 사용하여 각 흉선에 대해 배양 후기에 여전히 관찰될 수 있다. 더 오래 배양된 조직의 경우, 피질 및 수질의 상피 아키텍처가 여전히 쉽게 구별될 수 있고; 예를 들어, 해살 소체가 수질 영역에 남아 있다. 그러나, 흉선세포 고갈의 정도는 제0 일 후의 시점에서 정상 흉선의 전체 조직학적 외관과 비교해서 H&E에서 실질적으로 상이한 전체 조직학적 외관을 초래한다.
흉선조직의 상세한 배양
동종이계 배양된 흉선 조직-유래 생성물 제조에서 일반적인 절차는 앞에서 기술한 바와 같이 완전형 디죠지 증후군을 갖는 유아의 흉선 조직을 심장 수술을 받은 9 개월 미만 유아로부터 폐기되는 조직으로서 얻는다는 것이다. 고형 장기 이식을 위해, 폐기되는 흉선을 50 세 이하의 개체로부터 얻을 것이다. 흉선 조직의 사용은 그것이 본 명세서에서 나타낸 바와 같은 사용 척도를 충족시키는지에 의존할 것이다.
흉선 조직은 무균 가공되고 cGMP 조건 하에서 배양되어 부분적으로 T 세포-고갈된 흉선 조직 슬라이스를 생성한다.
배양된 흉선 조직(CTT)의 제작은 다음 일반 단계로 이루어진다: 새로 입수한 (incoming) 흉선 조직의 접수 및 가공, 슬라이싱, 배양, 배지 교체, 용량 계산, 포장 및 수술실로 흉선 운반. 추가로, 새로 입수한 흉선 조직을 수용성(acceptability)에 대해 시험하고, 공정중 및 출하 시험을 흉선 조직 슬라이스에 대해 수행한다.
한 실시양태에서, 흉선 조직 슬라이싱 공정은 멸균 1회용 가위 및 포셉(forcep)을 사용하여 흉선 조직의 조각을 절단하는 것을 필요로 한다. 집도의가 흉선의 피막을 포셉 및 가위로 제거하고, 피막을 나중에 처분하기 위해 플레이트의 덮개에 놓는다.
흉선 조직의 조각을 포셉을 사용하여 1회용 조직 슬라이서에 놓는다. 슬라이서(예를 들어, Stadie-Riggs 핸드 마이크로톰(Thomas Scientific, Swedesboro, NJ))의 탑(top)을 슬라이서의 중간 부분 상에 놓고, 제자리에 단단히 조인다. 집도의는 블레이드를 조직 조각을 통해 이동시켜서 슬라이스를 절단한다. 슬라이스의 두께는 대략 0.5 내지 1 mm이다. 필터 공간의 대략 50-90%가 채워지고, 조직 슬라이스의 겹침이 없다.
대표적으로, 3 개의 공정중 조각을 슬라이싱 시작할 때 조직으로부터 절단하고, 그것들은 모두 거의 3 x 3 mm이다. 1 개는 조직학을 위해 보내고, 2 개는 보유한다. 흉선세포는 흉선이 슬라이싱될 때 배지 안으로 자유롭게 흘러 들어간다.
한 실시양태에서, 필터 및 흉선 슬라이스를 조직 배양 접시 안의 TOM으로 포화된 젤라틴 수술용 스폰지에 옮긴다. TOM이 흡상하여 Millipore 필터를 적셔서, 조직을 계속 축축하게 한다. 스폰지 당 2 개 필터를 놓고, 조직 배양 접시 당 2 개 스폰지를 사용한다. 흉선의 조각을 슬라이싱하는 공정을 요구되는 수의 슬라이스가 제조될 때까지 반복한다. 배양 접시에 수술 번호, 접시 번호 및 ISBT 바코드 라벨을 붙인다. 완성된 접시를 5% CO2를 갖는 37 ℃ 가습 인큐베이터 안에 놓는다.
조직공학적 약물 물질은, 흉선 조직 슬라이스가 아래에서 기술되는 바와 같이 배양 접시 안의 배지에 놓이고 약 6 일 내지 약 21 일 동안 배양된 후의 흉선 조직 슬라이스를 포함한다. 조직공학적 약물 생성물은 약물 생성물 용기로 옮긴 후의 흉선 조직 슬라이스를 포함한다. 약물 물질로부터 약물 생성물을 생성하는 데 다른 가공이 수행되지 않고; 약물 생성물을 생성하기 위한 약물 물질의 유일한 가공은 슬라이스를 누출방지 용기로 옮기는 것 및 상응하는 배지 교체이다.
흉선 조직 슬라이스의 배양을 다음 문단에서 더 구체적으로 나타낸다.
한 실시양태에서는, 흉선 조직을 수술실로부터 심장 수술을 받고 있는 9 개월 유아로부터 폐기되는 조직으로서 얻는다. 그 다음에 수술팀이 조직을 나사-캡 뚜껑을 갖는 멸균 표본 컵에 놓고, 가공을 위해 주위 조건 하의 GMP 시설로 운반한다. 흉선을 받은 멸균 표본 용기에 바코드를 포함해서 기증자의 이름 및 의료 기록 번호의 라벨을 붙인다. 기증자 스크리닝 그룹은 흉선에 고유 식별자(흉선에 연속으로 번호가 매겨짐) 및 고유 의료 기록 번호를 제공한다. 제작을 위해, 각 조직은 수술 번호 및 고유 라벨을 가진다. 모든 식별자는 배치 기록과는 별도로 유지되고 비밀로 간직되는 "비밀성 흉선 기증자 서식"(Confidential Thymus Donor Form)에 기록된다.
한 실시양태에서, 약물 물질 용기 폐쇄 시스템은 덮개를 갖는 세포 배양 접시일 수 있다. 1 개의 흉선 조직 슬라이스를 1 개 필터 상에 놓고, 2 개 필터를 접시 안의 흉선 장기 배지에 각 젤라틴 스폰지 상에 놓는다. 4 개 슬라이스를 각 배양 접시에 놓고, 접시들을 출하 준비가 될 때까지 배지를 매일 교체하면서 인큐베이터 안에서 저장한다.
한 실시양태에서, 배양 접시는 Corning으로부터 얻을 수 있다. 접시는 멸균 비발열질 Falcon® 100 mm 폴리스티렌 세포 배양 접시(제품 #353003)일 수 있다. 접시는 진공-기체 플라즈마 처리에 의해 청정화되고, 감마 조사에 의해 멸균화된다. 접시의 치수는 89.43 mm O.D. x 19.18 mm이다.
전형적인 실시양태에서, Surgifoam® 스폰지가 Ethicon에 의해 제작될 수 있고, 그것은 Absorbable Gelatin Sponge, USP의 요건을 충족시킨다. 적합한 스폰지는 지혈용으로 의도된 멸균 수불용성 가단성 돼지 젤라틴 흡수성 스폰지이다. 혼합된 셀룰로스 에스테르 필터의 예시적인 예는 Millipore에 의해 제작된다(제품 # SMWP 02500). 25 mm 친수성 막은 5.0 ㎛ 기공 크기를 가진다. 그것은 셀룰로스 아세테이트 및 셀룰로스 니트레이트의 생물학적 불활성 혼합물로 제조된다. 필터는 사용 전에 에틸렌 옥사이드로 멸균된다.
기증자 흉선을 가공 실험실로 출하 및 수용 후, 흉선을 얇은 슬라이스로 절단하고, 슬라이스를 멸균 배양 접시 안의 수술용 스폰지 상에 놓은 멸균 필터 종이 상에 놓는다. 조직이 즉시 가공되지 않는 경우에는, 조직을 가공이 개시되기 전에 기증자로부터 수확 후 최장 24 시간 동안 2 - 8 ℃에서 아래에 기술되는 바와 같은 흉선 장기 배지(TOM)에 저장한다. TOM은 Ham's F-12 배양 배지, HEPES 완충제, L-글루타민 및 열-불활성화된 태아 소 혈청(FBS)으로 이루어진다.
한 실시양태에서, 가공은 ISO 7 제작 청정실에서 생물학적 안전성 캐비넷(BSC)의 ISO 5 공간에서 일어난다. 단일의 흉선으로부터의 흉선 조직의 단 1 개 로트가 BSC에서 어느 때라도 가공된다. BSC는 사용 전에 청정화된다. 흉선을 시각적 검사로 외관에 대해 시험하고, 칭량한다. 그 다음에 흉선을 150-mm 조직 배양 접시 안의 TOM에 놓는다. 흉선의 피막을 멸균 1회용 포셉 및 가위로 제거한다. 조직 조각을 시험을 위해 및 보유되는 샘플로서 채취한다. 새로 입수한 흉선 조직을 조직학에 의해 동일성에 대해 시험한다. 기증자 자격을 또한 확증한다. 가공은 조직학적 결과 및 모든 기증자 스크리닝 결과를 접수하기 전에 계속한다.
기증자 스크리닝의 수용 척도는 모든 기증자 자격 요건을 충족시켜야 한다는 것이다. 기증자 스크리닝은 흉선 조직 임플란트 수혜자의 안전을 보호하기 위해 21 CFR 1271에 따라서 요구된다. 이 스크리닝은 기증자로부터 수혜자에게로의 질환 전파의 위험을 최소화한다.
흉선 장기 배지(TOM)
배지는 알레르기 반응을 일으킬 가능성이 없는, 사람에게 사용하는 것이 승인된 성분들로 그러한 시약이 입수가능한 때 언제라도 만들어진다.
모든 시약은 모든 성분이 임플란테이션 후 어떠한 문제가 발생하더라도 확인될 수 있도록 추적되어야 한다.
태아 소 혈청(FBS)은 크로이츠펠트 야곱병의 우려 때문에 US 물질을 사용하여 제작되어야 한다. 각 로트에 대한 정보는 사용 전에 FDA에 보내야 한다.
배지는 사용 전에 세균, 진균 및 마이코플라즈마 오염에 대해 시험해야 한다.
한 실시양태에서는, 다음 물질이 TOM 제조에 사용된다:
HAMS F12, Gibco #11765-054 (또는 케이스 11765-062), 500 ml 병 또는 동등한 원천.
HEPES, Gibco #15630-080 또는 균등물, 1M 용액, 100 ml 병. 최종 농도 25 mM.
L-글루타민, Gibco #25030-081 또는 동등한 원천, (스톡 200 mM).
태아 소 혈청, Gibco, #16140(열 불활성화됨) 또는 #10082-147(열 불활성화됨, 인증됨).
한 실시양태에서 HI인 FBS가 다음 방식으로 사용될 수 있다:
FBS는 56 ℃에서 30 min 동안 열 불활성화되어야 한다.
배지의 오염 가능성을 감소시키기 위해, 배지를 분액으로 나누어야 하고, 분액은 1 회 넘게 사용되지 않아야 한다.
남은 FBS의 분액은 연구용으로 25 ml 분액으로 냉동(-20 ℃) 저장될 수 있다.
한 실시양태에서, TOM은 다음 방식으로 제조될 수 있다.
태아 소 혈청을 밤새 냉장고에서, 또는 37 ℃에서 빈번히 온화하게 빙빙 돌리면서 해동시킨다.
비-열 불활성화된 태아 소 혈청이 사용되는 경우에는, 56 ℃에서 30 min 동안 열 불활성화한다.
한 번에 4 리터를 만들 경우에는 모든 배지 성분을 함께 4 리터 플라스크에 넣고, 교반 막대로 자기 교반 플레이트 상에서 중간 속도로(거품이 일지 않음) 3 - 5 분 동안 교반한다.
0.2 마이크로미터 필터 유닛을 사용하여 멸균한다.
한 실시양태에서, TOM 제조물의 멸균화는 다음 방식으로 수행될 수 있다. 1 리터 TOM을 1 리터 플라스크에 분주한다. 일회용 멸균 실린더로 80 ml TOM을 측정한다. 80 ml TOM을 150 ml Corning 필터 멸균화 유닛에 붓는다. 하우스 진공(house vacuum)을 필터에 부착하고, 제조자의 지시에 따라 필터를 멸균한다. 필터 유닛을 용기로부터 제거하고 폐기한다. 수집병을 멸균 캡(유닛에 제공됨)으로 덮는다. TOM 로트 번호 라벨을 붙인다. 1 개 분액을 혐기성 미생물을 갖는 세균 배양물; 진균 배양물 등; 및 마이코플라즈마 배양물에 대해 시험한다. 1 개 분액을 내독소에 대해 시험한다. 모든 TOM 분액을 -20 ℃ 냉동고에 똑바로 세워서 저장한다.
TOM 배지는 사용을 위해 출하될 수 있다: LAL 결과는 시험을 위해 20 배 희석된 샘플의 경우 2 EU/ml 이하이어야 하거나 또는 시험을 위해 10 배 희석된 샘플의 경우 1 EU/ml 이하이어야 하고; 모든 배양 결과는 성장을 위해서는 음성이어야 한다.
BSC는 배지를 여과 및 분주하는 데 사용되어야 한다.
TOM은 출하 전에 멸균성 및 내독소에 대해 시험한다. TOM은 14 일 멸균성 시험 후 수용 척도가 충족될 때까지는 기증자 흉선을 배양하기 위해 출하되지 않는다. 일단 제조되면, TOM은 해동될 때까지 -20 ℃에서 저장되고, 그 시점에서 그것은 사용을 위해 냉장고에서 최장 2 주 동안 저장될 수 있다.
한 실시양태에서, 14-일 멸균성 시험은 예를 들어 BacT/ALERT 배양 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. BacT/ALERT(BioMerieux, Durham, NC)는 자동 미생물 검출 시스템을 사용하여 샘플을 시험하는 데 사용될 수 있는 상업적으로 입수가능한 배양 시스템이다.
모든 공정중 및 약물 물질 배양물은 14 일 동안 인큐베이션되거나 또는 생성물이 양성인 경우에는 즉시 보고된다. 양성 시험의 경우, 유기체(들)를 확인하고, 그들의 항생제 민감성을 결정한다. 호기성 성장을 위한 배지를 함유하는 배양병 및 혐기성 성장을 위한 배지를 함유하는 병에 출하 제1 일, 출하 제7 일 및 출하 당일에 시험될 샘플을 접종한다. 모든 병을 14 일 동안 35-37 ℃에서 인큐베이션한다.
FBS는 Life Technologies의 GIBCO 브랜드로부터 얻을 수 있다. FBS는 유효성 확인된 무균 공정에 의해 제조된다. FBS는 도축장으로부터 제공된 동물, 추적가능성 및 원산지의 USDA 요건을 충족시킨다. 모든 태아 혈액은 사전(pre-mortem) 및 사후(post-moterm) 인증 수의학적 검사를 통과한 건강한 댐(dam)으로부터 유래된 태아로부터 수집된다. 모든 FBS는 수집 날짜 및 장소에 의해 추적가능하다. 미국에서 수집되고 가공되는 FBS는 USDA 승인된 및 점검된 도축 작업장으로부터 얻는다. 미국은 USDA에 의해 발 및 입 질환 및 우역이 없는 것으로 인정된다. 공급자 자격을 얻기 위해서, FBS를 사용 전에 pH, 오스몰랄농도, 내독소, 총 단백질 및 동일성에 대해 시험한다.
완성된 접시를 37 ℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에 놓는다. 흉선 조직의 각 로트를 개별 인큐베이터에 저장한다. 흉선 슬라이스를 인큐베이터에 놓은 후, 입자 샘플링 및 인력 모니터링을 수행한다.
흉선 슬라이스를 최장 21 일(예를 들어 약 6 일 내지 약 21 일의 컨디셔닝 레지멘) 동안 배양하고, 배양 동안에 배지를 매일 교체한다. 이들 흉선 슬라이스를 약물 물질이라고 여긴다. 배양 기간 동안, 많은 흉선세포가 흉선 조직 슬라이스로부터 씻기거나, 또는 흉선세포가 세포자살을 겪고 한편으로는 흉선 간질을 보존한다. 모든 제작 단계는 멸균성 일회용 장비 및 용품을 사용하여 수행한다. 공정중 시험을 위해 배양 접시로부터 피펫으로 배지를 흡입하여 멸균 수집 용기에 모은다. 그 다음에 십(10) mL의 신선한 흉선 장기 배지를 각 배양 접시에 린싱(rinsing) 방식으로 조직 슬라이스 위에 온화하게 분주한다. 배지 교체가 완료된 후, 필요하다면 취합한 배지로부터 멸균성 및 조직학을 위해 샘플을 채취한다. 입자 샘플링 및 인력 모니터링을 완료하고, 라인 청소를 수행한다.
배지를 매일 교체한다.
슬라이스를 최장 21 일(예를 들어 약 6 일 내지 약 21 일의 컨디셔닝 레지멘) 동안 배양한다.
공정중 시험을 수행하여 공정 및 생성물 품질에 대한 통찰력을 제공하고 최종 약물 생성물의 안전성 및 품질을 보장하는 것을 돕는다.
공정중 시험(In-process testing)
멸균성 공정중 시험을 위해 제1 일 및 제7 일에 샘플을 수집한다. 마이코플라즈마 공정중 시험을 위해 제7 일에 샘플을 수집한다. 제5 일 내지 제9 일에 공정중 조직학을 위해 샘플을 수집한다. 출하 전날에 용량을 결정한다. 출하 당일에 그람 염색, BacT, 마이코플라즈마 및 내독소를 시험한다.
그람 염색은 세균 종을 두 그룹 그람-양성 및 그람-음성으로 구별하는 데 사용되는 세균학적 실험실 기술이다. 배양 접시로부터 취합한 소모된 배양 배지에 대해 그람 염색을 시험한다. 방법은 염색 기술을 사용하여 세포벽의 물리적 특성에 기초하여 분류를 결정한다. 이 방법은 예비적 형태학적 확인을 하거나 또는 임상 표본에 상당한 수의 세균이 있는지를 확립하는 데 사용된다. 염색은 수동으로 또는 자동 염색기를 사용하여 수행한다. 두 상이한 염색 방법이 배양 결과에 영향을 미칠 질적 차이를 보여주지 않는다는 것이 입증되었다.
조직학 시험은 임플란테이션 전에 수행되고, 한 실시양태에서는 최소한 다음을 포함한다: (1) 케라틴 AE1/AE3에 대해 양성인 영역이 조직 전체에 걸쳐서 산포되는지; (2) 적어도 1 개 해살 소체가 현미경으로 확인되는지; (3) 슬라이스의 CK14 염색이 흉선 조직 전체에 걸쳐서 산포되는지; 및 (4) 원상태 핵이 현미경으로 관찰되는지의 결정. 한 실시양태에서, 조직학 시험은 약 제6 일 내지 약 제21 일에 수행한다. 해살 소체 및 원상태 핵의 존재 뿐만 아니라 성공적인 CK14 염색은 배양된 정상 건강한 흉선 조직을 지시한다.
배양 시간은 중요한 공정 매개변수이다. 언급한 바와 같이, 배양은 최장 21 일 동안 수행된다.
임플란테이션 전에 배양 중의 흉선 샘플의 시험을 수행하여 배양 중에 생성된 조직학 결과가 배양된 흉선 조직의 역사적 표본의 조직학 시험을 대표하는지 확증한다. 실시예에서 논의되는 샘플에 대한 병리학자의 관찰에 기초해서, 제5 일에서의 조직 슬라이스의 조직학적 외관은 배양의 더 나중 시점(제9 일, 제12 일 및 제21 일) 각각에서 관찰된 것을 반영한다. 한 실시양태에서 흉선 조직의 시험은 다양한 기간 및 간격으로 배양 제5 일 내지 제21 일에 수행할 수 있다. 예를 들어, 시험은 5 일, 또는 6 일, 또는 7 일, 또는 8 일, 또는 9 일, 또는 10 일, 또는 11 일, 또는 12 일, 또는 13 일, 또는 14 일, 또는 15 일, 또는 16 일, 또는 17 일, 또는 18 일 또는 19 일, 또는 20 일, 또는 21 일의 기간 동안; 또는 5-6 일, 또는 5-7 일, 또는 5-8 일, 또는 5-9 일, 또는 5-10 일, 또는 6 내지 7 일, 또는 6 내지 8 일, 또는 6 내지 9 일, 또는 6 내지 10 일, 또는 6 내지 11 일, 또는 6 내지 12 일, 또는 6 내지 21 일, 또는 7 내지 21 일, 또는 8 내지 21 일, 또는 9 내지 21 일, 또는 10 내지 21 일, 또는 11 내지 21 일, 또는 12 내지 21 일, 13 내지 21 일 또는 14 내지 21 일, 또는 15 내지 21 일, 또는 16 내지 21 일 또는 17 내지 21 일 또는 18 내지 21 일, 또는 19 내지 21 일, 또는 20 내지 21 일의 기간 동안인 컨디셔닝 레지멘 동안에 수행할 수 있다. 한 실시양태에서, 컨디셔닝 레지멘은 배양된 흉선 조직의 임플란테이션 전에 약 6 일 내지 약 21 일의 어느 때라도 될 수 있다.
임의의 한 슬라이스의 조직학적 검사는 전체 로트의 수용성에 관한 결론을 확실하게 한다. 흉선으로부터의 임의의 한 슬라이스의 관련된 특성은 전체 흉선의 특성을 반영하고, 조직학 시험을 위해 조직의 단일의 슬라이스의 계속된 사용을 지지한다.
도 12a 및 12b에서 지시된 바와 같이 지시된 강제 분해 시험은 배양된 흉선 조직 생성물이 쉽게 분해되지 않고 냉동/해동 뿐만 아니라 오스몰농도의 변화에 가장 민감하다는 것을 입증하였다. 강제 분해 동안에 시험된 다른 조건은 배양된 흉선 조직 생성물에 대한 영향을 거의 또는 전혀 보여주지 않았다.
배양된 흉선 생성물 약물 물질의 제어
새로 입수한 흉선 조직 생성물에 대한 수용 척도는 하기 표 1에서 확인되는 시험을 포함한다.
Figure pct00003
약어: CK, 사이토케라틴; EU, 내독소 단위; USP, 미국 약전. 흉선 조직은 모든 기증자 스크리닝 결과를 얻기 전에 가공된다.
일반적으로, 중량의 수용 척도는 3 g 이상이다. 이것은 충분한 물질이 최종 생성물의 적절한 투여를 위해 입수가능하다는 것을 보장하기 위해 허용되는 최소 흉선 중량이다. 수용 척도는 흉선 조직 가공 경험에 기초한다.
공정중 시험의 수용 척도를 하기 표 2에서 확인한다.
Figure pct00004
배양된 흉선 조직 약물 물질 시험의 수용 척도는 하기 표 3에서 확인한다.
Figure pct00005
동일성의 수용 척도는 흉선 조직 동일성이 제1 일에 및 중간 시점(제5 일 - 제9 일)에 조직학에 의해 확증되는 것이다. 바코드가 가공 전체에 걸쳐서 조직의 추적에 사용되고, 바코드를 출하시 확증하여 생성물의 정확한 동일성을 검증한다.
면역화학에 의한 조직학
조직학 방법은 관련 분야 기술을 가진 자가 아는 바와 같이 모든 조직 유형에 대해 병원에서 사용되는 표준 방법이다.
생성물의 샘플은 10% 포르말린에 고정되어 실험실로 운반된다. 용기에 환자의 프라이버시를 보호하기 위해 환자 이름 대신 암호화된 식별자를 의료 기록 번호와 함께 라벨로 붙인다. 병리학에 도달하면, 표본에 고유 병리학 수탁 번호를 할당하고 바코드를 붙인다. 그 후의 블록, 슬라이드 및 서류 모두에 이 병리학 수탁 번호로 바코드를 붙인다.
표본을 실험실에서 접수한 후, 포르말린-고정된 조직을 육안 검사하고, 물질에 대한 육안 소견서를 작성하며, 이 소견서는 최종 보고서의 일부가 될 것이다. 그 다음에 포르말린-고정된 조직을 가공하고 자동 프로세서로 표준 방법에 의해 파라핀 블록에 포매한다. 파라핀 블록으로부터 절편을 절단하고, 다음 염색을 ASCP-인증 조직검사학자에 의해 수행한다:
헤마톡실린 & 에오신.
사이토케라틴 AE1/AE3 면역조직화학.
사이토케라틴 14 면역조직화학.
CD3 면역조직화학.
Ki-67 면역조직화학.
전술한 면역조직화학 시험의 수행 동안에, 또한 적당한 대조 슬라이드를 시험하고 검토한다. 모든 대조 슬라이드 및 내부 대조군은 예상되는 면역반응 패턴을 입증한다. 새로 입수한 흉선 샘플은 또한 샘플이 효력 시험의 일부로서 시험될 때 약 6 일 내지 약 21 일 동안 배양 중인 조직 슬라이스의 대조군으로서 역할한다. 새로 입수한 흉선 샘플은 대표적 흉선 샘플로서 나타나고, 그 다음에 그들이 배양되는 동안 조직 슬라이스에 변화가 일어나고, 그 다음에 배양 중에 약 6 일 내지 약 21 일 후에 시험한다. 배양 중 약 6 일 내지 약 21 일 후에, 샘플은 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해서 양성인 영역, 적어도 1 개 해살 소체의 존재, 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색 및 원상태 핵의 존재를 보여주어야 한다.
슬라이드는 흉선 조직의 조직학적 평가에서의 추가 경험과 함께 Anatomic Pathology에서 인증된 병리학자에 의해 해석된다. 최종 보고서는 병리학자에 의해발표되고, 그 보고서는 결과를 실증한다.
배양된 흉선 조직 약물 물질 시험의 수용 척도는 하기 표 4에서 확인된다.
Figure pct00006
배양된 흉선 조직은 미생물이 없어야 한다. 제1 일 및 제7 일에 수행된 멸균성 시험에서, 미생물의 성장이 없어야 한다. 마이코플라즈마는 제7 일의 시험에서 음성이어야 한다. 멸균성 시험은 그람 염색 음성이어야 한다.
생성물 멸균성은 무균 기술을 포함해서 적당한 대조군을 사용하여; 훈련 프로그램을 이용하고 집도의의 자격을 검증하여; 적당한 청정실 적격성 평가 절차를 이용하여; 확립된 청정 배지 충전 절차를 이용하고 사용 준비를 갖춘 멸균화된 장치 또는 유효성 확인된 멸균화 사이클을 이용하여 멸균된 장치를 이용하여 유지한다.
가공된 흉선 조직의 용기를 손상에 대해 시각적으로 검사한다. 조직 슬라이스는 정상적으로는 다양한 두께 및 형상과 함께 황색 내지 적갈색 외관을 나타낸다.
흉선 조직 동일성은 제1 일에 및 중간 시점(제5 일 - 제9 일)에 조직학에 의해 확증한다.
바코드가 가공 전체에 걸쳐서 조직의 추적에 사용되고, 출하시에 바코드가 확증된다.
용량(면적)은 1,000 - 22,000 mm2 흉선 조직/㎡ 수혜자 체표면적이다. 용량은 환자의 체표면적에 적당한 만큼 수술실로 출하되는 슬라이스의 표면적에 의해 제어된다.
허용되는 용량 범위는 1,000 - 22,000 mm2 흉선 조직/m2 수혜자 체표면적(BSA)으로 확정된다. 흉선 조직의 면적은 소프트웨어 분석(PAX-it Image Analysis Software)을 사용하여 사진으로 결정된다. BSA는 환자의 키 cm 및 체중 kg을 사용하여 결정된다. DuBois 및 DuBois 공식이 BSA를 계산하는 데 사용된다:
BSA=0.007184 x [키 (cm)]0.725 x [체중 (kg)]0.425
배양된 흉선 조직을 내독소에 대해 시험한다. 규격은 ≤5 EU/kg 체중/hr이다.
내독소 시험은 예를 들어 Endosafe PTS 시스템을 사용함으로써 수행될 수 있다. Endosafe PTS와 함께 사용되는 카트리지는 비색 속도론적 Limulus Amebocyte Lysate(LAL) 시험을 사용한다. 각 카트리지는 정확한 양의 LAL 시약, 비색 기질 및 대조 표준 내독소를 함유한다. 시험 샘플을 4 개 샘플 저장소에 피펫으로 옮긴다. 그 기구가 샘플을 빨아들여서 2 개 채널(샘플 채널)에서 LAL 시약과 혼합하고 나머지 2 개 채널(스파이크 채널)에서 LAL 시약 및 양성 생성물 대조군과 혼합한다. 샘플을 인큐베이팅한 다음 비색 기질과 조합한다. 혼합 후, 웰의 광학 밀도를 측정하고 기구 내의 기록 보관소에 보관된 표준 곡선과 비교한다. 기구는 각 채널에서 반응 시간을 측정한다. 카트리지의 각 배치에 특이적인 기록 보관소에 보관된 표준 곡선은 반응 시간의 로그 대 내독소 표준 농도의 로그를 사용하여 작성된다. 샘플 및 스파이크 값은 반응 시간을 사용하여 표준 곡선에서 보간법에 의해 계산한다. 이 시험은 미국 약전(USP)의 요건을 충족시킨다.
마이코플라즈마의 시험을 다음 방식으로 수행할 수 있다. 취합한 배지의 샘플을 제7 일에 플레이트로부터 제거하고, 생성물 출하 전에 시험한다.
제작 동안에 양성 배양물의 경우에는, 로트가 폐기되어서 투여되지 않을 것이다. 임상 생성물 투여 후 양성 배양물의 경우에는, 환자의 주치의 및 임상시험 의뢰자가 환자를 적당히 치료할 것이다. 양성 배양물은 오염 유기체의 종을 확인하고 그의 항생제 민감도를 결정할 것을 요구한다. 주치의는 지시되는 경우 흉선 수혜자에게 항생제 요법을 시작할 것이다.
약물 생성물은 사용 전에 유사한 시각적 검사 및 조직학 시험을 받는다.
흉선 조직 슬라이스가 최장 21 일 동안 배양된 후, 슬라이스를 수술실로 운반하기 위한 약물 생성물 용기에 옮긴다. 일단 수술실에 접수되면, 슬라이스를 수혜자 환자의 대퇴근에 삽입한다.
용기는 보이는 손상이 없이 원상태이어야 하고, 흉선 조직 슬라이스는 다양한 두께 및 형상을 갖는 황색 내지 적갈색 조직 슬라이스로서 나타나야 한다. 조직 슬라이스를 시각적으로 검사하여 이들 수용 척도를 충족시키는지 확증한다.
동종이계 배양된 생후 흉선 조직 유래 생성물의 동결보존 및 해동
동종이계 배양된 생후 흉선 조직 유래 생성물의 동결보존은 다음 방식으로 수행될 수 있다.
동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물은 다음 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조된다:
(a) 기증자로부터 적합한 흉선 조직을 얻는 단계;
(b) HLA 대립유전자: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQA1, HLA- DPB1, HLA-DPA1을 타이핑하는 단계;
(c) 흉선 조직을 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고; 추가로 여기서 기증자 흉선 조직 슬라이스가 약 6 일 내지 약 21 일에 컨디셔닝 레지멘의 완료시 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해 양성인 영역, 적어도 1 개 해살 소체의 존재, 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색 및 원상태 핵의 존재를 보여주는 것인, 단계;
(d) 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로서 수확하는 단계;
(e) 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 액체 질소에 동결보존하는 단계; 및
(f) 액체 질소 중의 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 은행에서 유지하는 단계.
한 실시양태에서, 제66항의 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물, 여기서 흉선은 수확 당일에 >50%의 영역이 레이스 모양 염색 패턴으로 케라틴에 대해 양성이고, 해살 소체가 존재하고, CK14가 레이스 모양 패턴으로 염색하고, >90%의 핵이 원상태임을 입증한다.
한 실시양태에서는, 기증자 흉선을 슬라이싱하고, 거의 균등한 두 부분으로 나누고, 각 슬라이스를 그의 셀룰로스 필터와 함께 개별 동결바이알(Nunc tube)에 놓는다. 필터를 반으로 접어서 그것을 튜브 안에 삽입한다. 실온에서 약 1 내지 약 1.5 ml의 냉동 배지[멸균 여과된 90% 열 불활성화된 태아 소 혈청(FBS) 및 10% 디메틸 술폭시드(DMSO)]를 첨가하여 조직을 덮는다. 동결바이알의 멸균 캡을 튜브 위에 다시 놓는다. 모든 튜브를 실온에 있는 Biocision Cool Cell 또는 동등한 용기에 놓는다. CoolCell 안의 임의의 빈 슬롯을 1 ml의 냉동 배지를 가지는 튜브로 채워야 한다. 튜브를 밤새 -80 ℃ 냉동고에 놓는다. 대안으로, 각 조직 뿐만 아니라 필터를 5 ml CryoELITE 조직 Vial(Wheaton) 안에 넣는다. 3 내지 5 ml의 냉동 배지를 실온에 두어서 조직을 덮는다. 스티로폼 상자 안에 놓고, -80 ℃ 냉동고 안에 밤새 둔다. 그 다음에 바이알을 액체 질소 냉동고의 증기상에 옮긴다. 대안으로, 속도 제어 냉동고를 사용하여 동결바이알의 온도를 액체 질소 온도에 이르게 할 수 있다.
조직을 회수하기 위해, 동결바이알 또는 CryoELITE 조직 바이알을 액체 질소 냉동고로부터 제거한다. 바이알 안의 흉선 조각을 37 ℃ 수조 안에서 빙빙 돌리는 운동으로 신속하게 해동시킨다. 튜브에 70% 에탄올을 분무한 다음에 생물학적 안전성 캐비넷(BSC)에 놓는다. 흉선 조직 및 필터를 Nunc 동결바이알 또는 CryoELITE 조직 Vial로부터 포셉을 사용하여 제거한다. 조직 및 필터를 20 ml의 4 ℃ TOM을 함유하는 50 ml 코니칼 튜브 안에 놓는다. 20 ml의 4 ℃ TOM을 함유하는 각 50 ml 코니칼 튜브에 5 개 이하 필터를 놓을 수 있다. 즉시 5 개 필터를 조직과 함께 20 ml의 4 ℃ TOM 배지를 갖는 신선한 코니칼 튜브에 옮기고, 4 ℃에서 15 min 동안 둔다. 세척을 3 회 반복한다. 조직을 계속 4 ℃로 있게 하고, 각 조각을 5 ml의 4 ℃ TOM을 갖는 그 자신의 120 ml Starplex 용기에 옮긴다. 모든 용기를 수술 스위트(suite)의 차가운 팩을 안에 갖는 온도-제어 용기 안으로 가져간다. 조직을 갖는 Starplex 용기를 수술실 안으로 가지고 간다. 필터 상의 조직을 멸균 필드의 대략 2 ml의 멸균 식염수를 갖는 조직 배양 접시에 옮긴다. 수술실 간호사가 포셉으로 긁거나 또는 당김으로써 필터 종이로부터 조직을 제거한다. 수술실 간호사는 조직을 비결정성 더미로 필터 종이 상에 도로 놓는다. 대략 4 개 필터 및 조직을 갖는 조직 배양 접시를 외과의사가 조직에 쉽게 접근할 수 있는 수술 부위로 옮긴다. 조직을 CTT(RVT-802)를 이용한 절차와 유사하게 대퇴 네갈래근에 거치한다. 동결-CTT는 그것이 부분적으로 T-세포 고갈된다는 점에서 CTT와 유사하고, 흉선 조직 슬라이스는 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해 양성인 영역을 보여주고, 슬라이스는 적어도 1 개의 해살 소체를 함유하고, CK14 염색이 조직 전체에 걸쳐서 산포되고, 원상태 핵이 존재한다.
CTT의 이식
한 실시양태에서는, 기증자로부터의 불일치된 흉선 조직 슬라이스를 약 6 일 내지 약 21 일 동안 배양한다. 고형 장기 이식 당일에 통상적으로 마취 유도시에 스테로이드를 제공한다. 심장 또는 폐 이식물의 경우에는, 수혜자의 흉선을 고형 장기 이식물 시에 수술적으로 제거한다. 다른 장기 이식물의 경우에는 이식일 전에 또는 이식 당일에 흉선절제술을 행할 수 있다. 흉선절제술 방법은 흉강경 또는 로봇 수술일 것이다. 재관류 후 수술 종료시, 수혜자는 더 많은 스테로이드를 제공받고 그 후에 수혜자에서 잔류 T 세포(및 NK 세포)의 대부분을 살해하기 위해 3 내지 7 일 동안 말 항-흉선세포 글로불린(예를 들어, 토끼 항-흉선세포 글로불린) 또는 T, B 및 NK 세포를 살해하기 위해 4 일 동안 알렘투주맙을 받는다. 그 다음에 면역억제제(예컨대 시클로스포린 또는 타크롤리무스) 및 마이코페닐레이트의 투여를 T 세포가 발달하여 10% 초과 나이브 T 세포를 보여줄 때까지 시작한다. 나이브 T 세포가 이 수치까지 증가하는 데는 6 내지 12 개월이 걸릴 수 있다. 배양된 흉선 조직을 고형 장기 기증자의 흉선에 대해 가공한다. CTT의 반을 약 6 일 내지 약 21 일에 대퇴 네갈래근에 임플란팅할 수 있다. 흉선의 나머지 반은 수혜자의 추후 사용을 위해 동결보존될 것이다. 면역억제 레지멘은 나이브 T 세포가 수혜자에게 임플란팅된 배양된 흉선 조직 슬라이스에 의해 방출되고 수혜자가 유지 면역억제 레지멘을 위닝하기 위한 척도를 충족시킬 때까지 임의의 남은 T 세포를 억제할 것이다. (면역억제를 위닝하기 위해서는 10% 초과 나이브 T 세포가 필요하다.)
흉선절제술 프로토콜
환자를 수술실로 데려가서 기관내 튜브로 전신 마취시킨다.
흉부 및 복부를 수술 준비하고, 멸균 방식으로 드레이핑한다.
환자는 대략 4 cm의 피부 절개를 통해 전흉골절개술을 받는다.
두 흉막 공간 모두에 진입하여 완전한 절제를 보장한다.
횡경막 신경을 양측에서 노출시키고, 그것들을 손상시키지 않도록 조심한다.
흉선을 확인하고, 하각에서부터 시작하여 상각까지 연장해서 폐의 흉막 외피로부터 조심스럽게 절개한다.
완전한 흉선절제술을 수행한다.
종격 내에서 지혈을 달성한다.
흉관 거치. 항상 1 개의 흉관을 (종격에) 삽입한다. 수술 동안에 단일의 흉막 공간에 진입하는 경우에는, 흉관이 종격부터 흉막 공간 안까지 계속 이어진다. 두 흉막 공간 모두에 진입하는 경우에는, 두번째 흉관을 유사한 방식으로 종격부터 다른 흉막 공간까지 사용한다.
배액구 크기. 2 세 이하 유아의 경우에는 #15 Blake 배액구가 사용된다. 2 세 이상 어린이에게는 #19 Blake 배액구가 사용된다.
흉골 봉합: 신생아 또는 유아에서는 0-Ticron 봉합사가 흉골을 봉합하는 데 사용된다. 약 1 - 2 세에서는 #1 흉골 와이어가 사용된다. 약 2 - 5 세에서는 #4 흉골 와이어가 사용된다.
근막, 피하 조직 및 피부를 연속 흡수성 봉합사로 봉합한다.
피부 상처 vac를 흉골 상에 놓는다.
수술실에서 환자에게서 튜브를 제거한다.
스폰지, 기구 및 바늘 수를 세고, 사례 종료시에 정확해야 한다.
동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 수술적 임플란테이션
동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물은 다음 지시에 따라서 임플란팅되어야 한다. 대퇴에 흉선 조직의 임플란테이션은 건강한 근육 조직 층을 요구한다.
임플란테이션 절차를 위한 준비
계획된 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 최대 및 최소 용량이 각 개별 환자에 대해 계산되어야 한다. 의도된 수혜자를 투여 전에 적절히 확인한다.
층류식 후드 내에서 멸균 조건 하에서, 배지 중의 수술용 스폰지 상에 있는 필터 종이 상의 조직 슬라이스를 조직 배양 접시로부터 제거하고, 20 ml 배지를 갖는 120 ml 멸균 컵 안에 놓고, 멸균성을 유지하기 위해 포장하고, 수술실로 전달하거나 또는 발송을 위해 포장한다. 조직 슬라이스를 사용할 준비가 될 때까지는 개별 용기로부터 제거하지 않는다. 생성물 만료 날짜 및 시간을 검증한다.
항상 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물(조직 슬라이스)을 엄격한 멸균 기술을 사용하여 취급한다. 각 용기를 누출 또는 손상 증거에 대해 점검한다. 오염의 증거가 있으면 사용하지 않는다. 멸균 필드 밖에서, 발송 상자의 포장을 풀어서 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 용기를 꺼낸다. 폴리프로필렌 용기를 함유하는 선반을 바깥 봉지로부터 제거한다. 준비가 될 때, 멸균 필드 밖에 있지만 멸균 수술 준비 테이블에 인접해 있는 팀원이 한번에 하나씩 캡을 열어서 각 용기로부터 캡을 제거한다. 그 다음에 각 열린 용기를 멸균 필드 밖에 있는 팀원이 멸균 필드에 닿지 않게 멸균 필드 위로 그의/그녀의 팔을 뻗어서 잡는다.
멸균 필드 팀원은 포셉을 사용해서 용기로부터 개별 조직 슬라이스를 그의 필터 종이와 함께 제거하고 그것을 멸균 수술 준비 테이블 상의 대략 2 ml 무방부제 식염수를 함유하는 멸균 조직 배양 접시에 놓는다. 4 개 용기로부터 채취한 필터 종이와 함께 4 개 조직 슬라이스를 멸균 필드에서 멸균 필드 팀원 앞에 있는 1 개의 멸균 조직 배양 접시에 놓는다. 멸균 포셉을 사용할 때, 그 다음에는 멸균 필드 팀원이 2 개의 포셉을 사용해서 필터 종이로부터 조직 슬라이스를 벗겨내고, 그 중 하나는 필터를 제자리에서 잡고 있고, 한편 다른 하나는 조직을 당기거나 또는 조직을 긁어내서 더미로 쌓는다. 그 다음에 각 필터 종이로부터 제거된 조직을 그 필터 종이 상에 필터 종이의 중간에 더미로 놓는다. 그 다음에 멸균 조직 배양 접시를 멸균실로 옮긴다. 그 다음에, 외과의사가 처음 4 개 슬라이스를 임플란팅하고 있는 동안에 다음 세트의 4 개의 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 용기가 동일한 방식으로 가공될 것이다. 외과의사가 처음 4 개 슬라이스를 임플란팅하는 것을 완료할 때, 4 개 조직 조각을 갖는 그 다음 접시를 수술 필드에 놓고, 맨처음 조직 배양 접시는 3 번째 세트의 4 개 조직 슬라이스를 로딩하기 위해 멸균 필드에 멸균 필드 팀원 앞으로 돌려보낸다. 이 사이클을 모든 요망되는 조직이 임플란팅될 때까지 계속한다. 수술실에서 공기로부터의 오염을 피하기 위해서 처음에 조직 슬라이스를 전부 옮기지는 않는다.
수술 절차
단계 1. 피부 개방
전신 마취 유도 후, 전방 대퇴 구획 중 하나 위에서 수직 피부 절개(대표적으로 ~5 cm 길이)를 한다. 주: 임플란테이션 절차를 위한 절개의 크기 및 한쪽 또는 양쪽 다리의 사용은 환자의 체격, 임플란팅되는 조직의 계획된 양, 및 그의/그녀의 근육량에 의해 결정된다. 조직의 전부 또는 대부분이 한쪽 다리에 임플란팅될 수 있는 경우라면, 한쪽 다리만 사용되어야 한다.
단계 2. 근막을 개방하여 전방 구획 근육을 노출시킨다.
단계 3. 근육 스프레딩(spreading) 및 임플란테이션
근육을 편도선 클램프 또는 유사한 도구를 사용하여 대퇴 네갈래근의 자연적인 주름을 따라서 분리한다. 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 개별 흉선 슬라이스는 근육 조직을 자르지 않고서 임플란팅되어야 한다. 개별 조직 슬라이스들을 자연적인 주름을 따라서 대퇴 네갈래근 내의 대략 1 cm 이격된 대략 1 cm 깊이의 "포켓"들 안에 놓는다. 환자의 체격에 의존해서, 외과의사는 대략 6-7 개 슬라이스를 각 주름을 따라서 6 내지 7 개 포켓 안에 놓을 수 있다. 개별 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 슬라이스는 각 필터 상의 조직의 질량에 의존해서 임플란테이션 전에 반으로 자를 수 있다. 필터 종이를 완전히 덮었던 두꺼운 조직 슬라이스를 각 조직의 최적의 혈관화를 위해 반으로 잘라야 한다. 요구되는 만큼의 조직을 각 전방 구획 내에 최대 계획된 용량까지 임플란팅한다.
단계 4. 근육 봉합
근육을 단일의 봉합사로 흉선 조직이 임플란팅된 부위 위에서 봉합하여 근육이 재개방되어 이식편이 근육 밖으로 나오는 것을 방지한다. 임플란팅된 조직이 절개부를 봉합하기 전에 흉선 조직이 노출되지 않게 근육 조직에 의해 완전히 덮이는 것을 보장한다.
단계 5. 각 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 조직 슬라이스에 대해 최대의 의도된 용량까지 단계 3-4를 반복한다.
단계 6. 절개부 봉합
지혈을 확증한다. 피부 절개부를 2 층의 흡수성 봉합사로 봉합하고, 표준 드레싱 예컨대 상처 봉합 스트립 또는 피부 글루(skin glue)를 바른다. 근막이 개방되게 두어서 근육 구획이 팽창할 여유를 허용한다. 밀봉 드레싱(occlusive dressing)을 사용해서 오염을 방지할 수 있다.
수술후 수술적/의학적 관리
순한 진통제를 필요한 만큼 사용한다. 감염 또는 열개의 징후를 모니터링한다.
기증자가 폐, 신장, 장, 또는 부분 간에 대해 생체 혈연 기증자인 경우, 그 고형 장기 기증자의 흉선의 일부가 배양 및 임플란테이션에 충분할 수 있다. 수확 당일 및 임플란테이션까지에 대해서 위에서 열거된 병리학 척도를 충족시키는 것이 필요할 것이다.
동결보존된-배양된 흉선 조직은 제3자 기증자로부터 입수가능할 수 있다. 그러나, 제3자 기증자는 고형 장기 기증자에 의해 발현되지 않는 모든 수혜자 HLA 대립유전자를 발현해야 한다. 이것은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DQA1, HLA-DPB1, HLA-DPA1을 포함한다. HLA-DP 대립유전자에서의 불일치는 그 불일치가 "허용적"인 경우에는 수용가능하다. 다른 대립유전자에서는 미미한 불일치가 허용되고, 예를 들어, HLA-A*01:02가 HLA-A*01:01를 담지하는 수혜자에게 허용되고, 다시 말해서, 제2 필드(결장 뒤)가 상이할 수 있고, 제1 필드(결장 앞)은 동일해야 한다.
사람 심장 이식물 절차
대상체의 적격성을 다음을 포함하는 많은 척도에 기초해서 결정한다: 현존 최대 지지 요법에도 불구하고 심장 이식 없이 좋지 않은 12 내지 24 개월 예후; UNOS 척도로 정의되는 바와 같은 성장 장애를 갖는 선천성 또는 후천성 심장 질환; 의학적 요법에 불응성인 선천성 또는 후천성 심장 질환의 상황에서 진행성 심부전의 증상; 비정상 혈류동태 또는 증가하는 폐혈관 저항: 수술이 불가능한 구조적 심장 질환; 약물치료 또는 장치 요법으로 치료가능하지 않은 증상을 보이는 부정맥 또는 좋지 않은 운동 내성.
예를 들어, 대상체가 심장/신장 이식물의 후보가 아니면, 가역성 신 기능이상; 심장/간 이식물의 후보가 아니면, 비가역성 간 질환; 대상체가 심장-폐 이식물의 후보가 아니면, 비가역성 폐 기능이상, 비전통적 기계식 환기장치 지원(즉, 고빈도 환기장치, 최대 설정의 CMV) 사용 또는 고정된 폐고혈압(TPG>15); 미세혈관 질환이 있는 당뇨병; 또는 활동성, 비제어되는 발작 장애를 포함해서 심장 이식물 수술에 대한 많은 절대적 및 상대적 금기증을 사정한다.
다른 금기증은 심장 이식물 후 장기간 생존 및 재활을 제한하는 다른 질환; 약물 남용, 병적 비만, 악성종양; 활동성 정신 장애; 및 다른 이유 예컨대 실증된 의학적 불순응을 포함할 수 있다.
상대적 금기증은 활동성 감염; 인지적 기능이상; 불충분한 혈관 접근 및 상당한 동종감작을 포함한다.
기증자 및 수혜자 조직적합성 관리도 또한 고려된다. 환자를 수혜자가 우선 수혈 또는 우회/혈액 생성물 또는 호모그래프트(homograft) 물질을 사용하는 대수술 같은 "감작 사건"에 반응하여 형성하였을 수 있는 사전형성된 HLA 항체에 대한 패널 반응성 항체 ("PRA")에 대해 평가한다.
수혜자의 선감작(presensitization) 이력, 예를 들어, 이전의 수혈; 번호, 날짜; 이전의 수술; 이전의 임신; 면역접종 이력 및 IVIG 투여(날짜)를 사정한다.
지나치게 높은 HLA-Class I 또는 Class-II PRA를 갖는 환자 또는 반복 이식물을 받은 환자가 탈감작 전략의 후보일 수 있다. 특정한 전략들은 잠재적 수혜자에게 개별화될 수 있고, 혈장사혈, IVIG, 리툭시맙 및/또는 보르테조밉의 사용을 포함할 수 있다. 유의미한 항체는 1:16 희석 후 계속 존재하는 것들이다.
선감작된 환자는 잠재적 기증자와 실제 전향적(prospective) 교차일치를 요구할 수 있다. HLA 항체의 이력을 갖는 환자는 이식물이 고려되고 있을 때 UNET에서 가상 교차일치 시험을 받을 것이다.
선감작된 환자는 다음 일반 지침을 통해 잠재적 기증자와 실제 전향적 교차일치를 요구할 수 있다. HLA 항체의 이력을 갖는 모든 환자가 제의가 고려되고 있을 때 UNET에서 가상 교차일치 시험을 받을 것이다.
cPRA < 20%인 경우: UNET에서 가상 교차일치, 추가 조치가 필요하지 않음; 일상적인 후향적 기증자 교차일치 및 일상적인 면역억제를 진행한다.
cPRA > 20%인 경우: UNET에서 가상 교차일치, 수혜자가 이식시에 수술실("OR")에서 혈장사혈을 받는다.
cPRA > 70%인 경우: 가상 교차일치, 시간이 허용되면 실제 전향적 기증자 교차일치를 얻는 것을 고려하고; OR에서 혈장사혈을 투여한다. 수술후 사혈 지속을 위해 OR에서 사혈 카테테르를 거치하는 것을 고려한다.
진행중 항체 감소 개입은 기증자 교차일치, DSA's 및 임상 경과에 의해 결정된다.
모든 선감작된 환자에 대해서, 이식물 후 처음 2 주 이내에 기증자-특이적 항체를 위해 혈액을 보낼 것이고, 임상적으로 지시되는 대로 반복될 것이다. DSA에 대한 일상적 시험이 모든 이식물 후 환자에 대해서 이식물 후 적어도 6 개월마다 및 임의의 임상적 우려가 있으면 필요한 대로 행해질 것이다.
이식 전 및 이식 후 둘 모두에서 표준 혈액 생성물 수혈 프로토코을 따른다.
면역억제 관리
면역억제 관리는 이식될 고형 장기에 기초하여 결정된다.
소아 심장 이식물
모든 환자는 그들의 임상적 상황 및 위험 인자에 기초하여 바실릭시맙 또는 항-흉선세포 글로불린으로 유도 요법을 받을 것이다. 사용되는 유도 요법의 유형은 이식물 전에 결정될 것이다(제1 면역억제 레지멘 약물 요법).
한 실시양태에서, 이식물 전/유도 요법은 대표적으로 다음의 투여를 포함한다:
수술실 전에 마이코페놀레이트 모페틸 (CellCept®) 25 mg/kg IV.
유도시 메틸프레드니솔론 10 mg/kg IV(최대 용량 500 mg).
x-클램프 방출시 메틸프레드니솔론 10 mg/kg IV(최대 용량 500 mg).
x-클램프 방출시 ATG (항흉선세포 글로불린) 1.5 mg/kg IV.
대안으로, 바실릭시맙(Simulect®)을 사용하고, 수혜자의 체중에 의해 용량이 계획된다.
<35 kg, x-클램프 방출시 10 mg 및 4 일 후 2번째 용량.
>35 kg, x-클램프 방출시 20 mg 및 4 일 후 2번째 용량.
한 실시양태에서 심장 및 CTT 임플란트 후보를 위한 이식물 전 유도 면역억제 요법은 다음을 포함할 수 있다:
바실릭시맙 (Simulect®)―(ATG를 제공할 수 없는 경우).
투여 용량:
<35kg: 최초 용량: 마취 유도시(안정하고 및 메틸프레드니솔론이 제공된 후) 마취에 의해 수술 전에 10 mg IV 투여됨.
제2 용량: 이식 후 4 일 후에 10 mg IV 투여됨; 합병증(심각한 과민성 반응 또는 이식편 소실을 포함함)이 생기면 제2 용량을 고수함.
>35kg: 최초 용량: 안정할 때 마취 유도시 마취에 의해 수술 전에 20 mg IV 투여됨.
제2 용량: 이식 후 4 일 후에 20 mg IV 투여됨; 합병증(심각한 과민성 반응 또는 이식편 소실을 포함함)이 생기면 제2 용량을 고수함.
투여: 20 - 30 분 동안 IV 주입. 반감기 1-11세 어린이: 9.5 일, 12-16 세 청소년: 9.1 일, 성인: 7.2 일.
한 실시양태에서, 항흉선세포 글로불린(ATG, 토끼 유래, Thymoglobulin®)은 심장 이식물 대상체를 위한 다음 용량 일정에 따라서 제공될 수 있다:
림프구 수 및 표지자 및 혈소판 수에 기초하여 3 내지 7 일 동안 1.5 mg/kg/일. 제1 용량이 제2 용량의 스테로이드 후(수술중) 크로스-클램프 방출시 장기 재관류 후에 제공된다.
상기 매개변수에 기초하여 매일 계속되고, 이식물 MD에 의해 결정될 것이다.
투여: 제1 용량의 경우 6 시간 동안 느린 IV 주입, 그 후의 용량은 4 시간 동안 견뎌내는 만큼 제공될 수 있다.
한 실시양태에서, CPB/펌프 사례의 경우 일상적인 수술전/수술중 메틸프레드니솔론 외에 추가로, 환자는 바실릭시맙 전에 마취 유도시 마취에 의해 투여되는 메틸프레드니솔론(SoluMedrol) 10 mg/kg (최대 용량 500mg) IV의 용량 및 그 다음에 재관류시(ATG 전에) 10 mg/kg (최대 500mg)의 제2 용량을 받을 수 있다.
수술후 유지 면역억제(유지 면역억제 레지멘)
한 실시양태에서, 이식물 후 면역억제는 다음을 포함한다:
5 - 7 용량의 경우 일일 ATG (Thymoglobulin®) 1.5 mg/kg IV.
WBC < 2,000 또는 혈소판 수 < 50,000인 경우 고수한다.
WBC 2,000-3,000 또는 혈소판 수 50,000-75,000인 경우에는 ½ 용량.
12 hr마다 마이코페놀레이트 15-25 mg/kg IV/PO.
GI 불내성 또는 백혈구 감소증/호중구 감소증에 대해 조정한다.
GI 불내성인 경우에는 아자티오프린을 대체할 수 있다.
GI 불내성인 경우에는 마이코페놀산(Myfortic®)을 대체할 수 있다.
타크롤리무스는 신 기능 및 구강 내성에 의존해서 tx 후 24-48 hr 후에 시작한다.
시작 용량 ~0.05 mg PO q 12 hr 및 수준에 기초해서 조정함.
처음 6 개월 동안 ~10-15, 6 개월 - 3 년 동안 8-12, >3 년 동안 4-8.
IV 약물치료가 필요하거나 또는 타크롤리무스 불내성인 경우에는 시클로스포린을 대체할 수 있다.
메틸프레드니솔론 5 mg/kg IV q 8 hr x 6 용량 (최대 용량 125 mg).
그 다음에, 1 mg/kg/dose IV/PO q 12 hr (최대 30 mg/dose).
생검 결과에 기초해서 다음 2-3 개월 동안 위닝한다.
한 실시양태에서, 타크롤리무스(FK506, Prograf®)가 투여될 수 있다. 통상적인 투여 형태는 0.5 mg/ml의 정맥내 용액, 및 캡슐 당 0.5 mg, 1 mg, 및 5 mg의 경구 정제를 포함한다.
수혜자가 PO/NG/SL일 때 ~0.05 mg/kg/dose의 출발 용량이 12 hr마다(최대 5 mg/dose) 제공되고, 통상적으로 신 기능이 허용되는 경우이면 수술후 ~24 hr에서 시작한다.
치료적 투여 용량이 달성될 때까지 타크롤리무스 최저 수준(trough level)을 매일 모니터링한다. 치료적 최저 수준을 달성하기 위해 투여를 필요하다면 8 hr마다로 증가시킨다. 약물이 설하 제공되는 경우에는, 캡슐 내용물을 혀 아래에 뿌린다(더 높은 수준을 초래할 수 있다). 경구 및 설하 용량은 같지 않다. 일반적으로 설하 제공되기 위해서는 경구 용량의 ~ ½을 투여하는 것이 필요할 것이다.
타크롤리무스 투여 용량은 마지막 용량 후 10-14 hr(8 hr마다 용량 투여되는 경우에는 7-9 hr) 후에 질량 분석법으로 측정되는 혈청 전혈 수준에 기초해서 투여될 수 있다.
신 및 간 기능, 약물 부작용, 감염 및 거부 이력 모두가 환자의 타크롤리무스 수준을 관리하는 데 고려된다. 환자가 임상적으로 잘 하고 있으면 수준이 요망되는 범위 내에서 +/- 1인 경우에는 용량을 조정할 필요가 없다. 이들 경우에서는, 결정은 이식물 주치의에 달려 있다.
한 실시양태에서는, 타크롤리무스를 견녀낼 수 없는 환자에게 시클로스포린이 투여된다. 시작 용량: 12 hr마다 입으로 2 mg/kg/dose. 치료적 수준에 도달할 수 없는 경우에는(특히 유아 및 나이어린 어린이), 용량 투여 빈도를 8 hr마다로 증가시킨다.
일반적인 투여 용량은 마지막 용량 후 10-14 hr(8 hr마다 용량 투여되는 경우에는 7-9 hr) 후에 질량 분석법으로 측정되는 다음 혈청 전혈 수준에 기초한다.
신 및 간 기능, 약물 부작용, 감염 및 거부 이력 모두가 환자의 시클로스포린 수준을 관리하는 데 고려된다. 환자가 임상적으로 잘 하고 있으면 수준이 요망되는 범위 내에서 +/- 10 - 20인 경우에는 용량을 조정할 필요가 없다. 이들 경우에서, 결정은 이식물 주치의에 달려 있다. 환자의 목표 시클로스포린 수준을 차트에 기록하기 위해 모든 노력을 해야 한다. IV 용량은 일반적으로 경구 용량의 1/3이다.
한 실시양태에서는, 마이코페놀레이트 모페틸 (Cellcept®) (200 mg/ml, 250 mg 또는 500 mg 정제)이 투여될 수 있다:
30-50 mg/kg/일을 둘로 분할된 용량으로 시작한다(최대 용량 어린이 2 g/일, 성인 3 g/일).
IV 용량 = PO 용량.
치료적 약물 모니터링이 요구되지 않지만 독성 우려가 있으면 모니터링할 수 있다.
마이코페놀레이트는 골수 억제 및 호중구 감소증을 야기할 수 있다.
용량은 ANC <500 또는 WBC <1000일 때는 고수될 수 있고; 감소하는 ANC (<1000) 또는 WBC (<3000)의 상황에서는 용량을 감소시킬 필요가 있을 수 있다. 실제로, 용량 Cellcept 500 mg = Myfortic(마이코페놀레이트) 360mg.
한 실시양태에서는, 마이코페놀레이트(Myfortic® 투여형 180 mg 정제, 360mg 정제)가 마이코페놀레이트 모페틸 대신에 다음 용량 매개변수에 따라서 투여될 수 있다:
지연-방출 정제를 시작한다: 400 mg/m2/용량 1 일 2 회; 최대 용량: 720 mg OR BSA 1.19-1.58 m2: 540 mg 1 일 2 회, BSA >1.58 m2: 720 mg 1 일 2 회.
IV 또는 현탁액이 입수가능하지 않음. IV 또는 현탁액이 필요한 경우에는, 약물을 Cellcept로 전환한다. (Cellcept 500mg = Myfortic 360mg). 마이코페놀레이트는 마이코페놀레이트 모페틸과 동일한 골수 억제를 야기할 수 있다.
한 실시양태에서, 마이코페놀레이트 모페틸을 견뎌낼 수 없는 경우에는, 아자티오프린이 다음 방식으로 투여될 수 있다:
2-4 mg/kg/일로 시작하고, 1일 1회 제공된다.
아자티오프린은 골수 억제를 야기하고, 용량은 WBC/ANC에 기초하여 감소시킬 필요가 있을 수 있다. IV 용량은 경구 용량와 같다.
한 실시양태에서는 스테로이드가 메틸프레드니솔론(Solu-Medrol®), 프레드니손 또는 프레드니솔론으로서 투여될 수 있다.
정맥내 스테로이드는 수술중에 (유도 면역억제 요법으로서) 시작하고, 수술후에 8 hr 마다 5 mg/kg/dose (최대 125 mg/dose) IV x 6 용량으로 계속된다.
그 후에 경구 스테로이드가 프레드니손 정제 또는 프레드니솔론 현탁액 3 mg/ml로서 시작할 수 있다. 이식물 수혜자가 경구 면역억제 치료 레지멘을 견뎌낼 수 없으면, 정맥내 메틸프레드니솔론이 계속된다. 경구 요법으로 바꿀 수 있고, 수혜자는 경구 약물치료를 견뎌낼 수 있다. 스테로이드의 전형적인 용량 투여 범위는 다음과 같다:
0-10 kg, BID로 분할하여 2 mg/kg/일로 시작하고, 2 일마다 위닝하고, 1 일 6 mg을 고수한다.
0-30kg, BID로 분할하여 2 mg/kg/일로 시작하고(최대 단일 용량 30 mg, 아래 참조), 2 일마다 5 mg/일 위닝하고, 그 다음에 1 일 10 mg을 고수한다.
>30kg, 30mg BID x 4 용량, 25mg BID x 4 용량, 20mg BID x 4 용량, 15mg BID x 4 용량, 10mg BID x 4 용량, 그 다음에 1 일 15 mg으로 시작해서 추후에 이식물 심장병전문의에 의해 위닝한다.
생검 결과에 기초해서 이식물 후 첫달 동안에 스테로이드를 계속 위닝한다. 거부가 발생하면, 스테로이드는 이식물 심장병전문의의 재량으로 다시 시작될 것이고, 추가의 생검 결과 및 환자 임상 상태에 기초해서 무기한으로 계속된다.
제2 면역억제 레지멘에서 다른 약물은 다음을 포함한다:
시롤리무스(Rapamune®)(0.5 mg, 1 mg, 2 mg 캡슐): 관상동맥 동종이계이식편 혈관병 진단 후에 또는 이식물 심장병전문의에 의해 다른 방식으로 임상적으로 지시된 대로 개시된다.
시작 용량: 1 mg/m2 (최대 용량: 3mg) 1 일 1 회 또는 적정한 수준에 달성하는 데 어려움이 있으면 1 일 2 용량으로 분할됨.
치료적 수준 목표는 4-8이고, 두 약물 모두에 대해 더 낮은 타크롤리무스 수준 (동일 4-8 범위)을 허용한다.
마지막 용량 후 23-25 hr 후에 또는 12 hr마다 투여한 경우에는 마지막 용량 후 11-13 hr 후에 최저 수준을 끌어냄.
시롤리무스를 시작할 때 마이코페놀레이트 (Cellcept®, Myfortic®), 아자티오프린을 중단한다.
Bactrim 예방요법을 시작한다: 고질적인 구강점막 질환(mouth sore), 및 지연된 상처 치유를 야기할 수 있다.
프라바스타틴(Pravachol®)― 십대/더 나이 많은 어린이 및 CAV를 갖는 어린이에서 사용됨
0.2 mg/kg/일을 1 일 1 회 투여로 시작한다(정제 형태로 얻고, 밤에 ¼, ½ 또는 1-2 개 이하 정제/일을 제공할 수 있다.
체중 변화에 따라 용량을 적정한다(최대 용량 20 mg/일).
LFT's, CK를 8 주마다 모니터링한다.
관절 또는 근육 통증이 발생하면 약물을 중단한다.
간시클로비르 IV - 수혜자 또는 기증자가 CMV IgG 양성인 경우에 CMV 방지를 위해 제공됨.
유도 요법: 5 mg/kg IV q 12 hr x 7-14 일.
유지 요법: 1 일 5 mg/kg IV.
WBC 및 신 기능을 모니터링한다.
견뎌낼 수 있을 때는 경구 발간시클로비르로 전이한다.
발간시클로비르(Valcyte®)― 모든 CMV + 수혜자 또는 기증자에서 CMV 방지를 위함.
450 mg 정제 또는 50 mg/ml 현탁액.
4 개월 - 16 세: 총 1 일 경구 용량(mg) = [7 x BSA x Cr 청소율].
> 16 세: 1 일 경구 900 mg.
방문시마다 CMV PCR을 모니터링한다.
트리메토프림-설파메톡사졸 (Bactrim®, Septra®):
단일 강도 정제 80 mg/400 mg, 이중 강도 정제 160 mg/800 mg, 현탁액 5 ml 당 40 mg/200 mg.
PCP/Toxo 방지를 위해 배출 전에, 또한 경구 취식할 때 시작한다.
1 개월 - 12 세: 5-10 mg/kg/일 TMP div BID 연속 일수로 3x/주.
>12 세: 80-160 mg TMP 경구 1 일 또는 160 mg TMP 경구 3x/주.
타크롤리무스 및 시클로스포린 수준을 관련 분야의 통상의 기술을 가진 자에게 알려진 바와 같이 증가시키거나 또는 감소시킬 수 있는 약물에 대해 모니터링한다.
또한 타크롤리무스 및 시클로스포린과 상승적 신독성을 가지는 약물에 대해 모니터링한다.
급성 이식물 거부 치료
한 실시양태에서, 이식물 거부를 알게 될 경우에는 대상체를 다음 방식으로 치료한다.
한 실시양태에서, 이식물 수혜자가 혈역학적 컴프로마이즈(hemodynamic compromise) 없이 등급 0, 1R인 경우: 치료가 요구되지 않고, 스테로이드를 위닝하는 것을 고려할 수 있다.
환자가 혈역학적 컴프로마이즈 없이 등급 2R 세포 거부를 제시하는 경우, 다음 치료 레지멘을 따른다:
유지 면역억제를 최적화한다.
메틸프레드니솔론을 15 mg/kg/일 IV x 3 일 (최대 1000 mg) 투여하고, 12 hr마다 투여 용량으로 분할하거나 또는 24 hr마다 1회 제공할 수 있다.
1 내지 2 주 이내에 생검을 반복하고, 불응성 세포 거부의 경우에는 메틸프레드니솔론 및 임의로 Thymoglobulin®을 반복한다.
거부가 해결되면, 1 개월 후(거부 후 6 주) 생검을 반복하고, 거부가 성공적으로 치료되었으면 이전에 확정된 생검 프로토콜을 재개한다.
불응성 세포 거부의 경우에는 메틸프레드니솔론을 반복하고 티모글로불린을 고려한다.
환자가 혈역학적 컴프로마이즈 없이 등급 2R 세포 거부 또는 더 높은 등급의 거부를 제시하는 경우.
면역억제를 더 높은 수준(10-15)으로 최적화한다.
메틸프레드니솔론을 15 mg/kg/일 IV x 3 일(최대 1000 mg) 투여한다.
Thymoglobulin®을 투여한다.
항체 매개 거부의 증거 또는 우려가 있을 경우에는 혈장사혈을 수행한다.
환자가 혈역학적 컴프로마이즈가 있거나 또는 없이 항체-매개 거부를 제시하는 경우:
메틸프레드니솔론을 15mg/kg/일 IV x 3 일 (최대 1000 mg) 투여한다.
혈장사혈 x 5 회 (매일 또는 격일)를 수행한다.
IVIG를 1 개월에 1-2 gm/kg IV x 6 개월 투여한다.
이식편 기능이상 또는 혈역학적 컴프로마이즈의 증거는 C4d 염색을 포함해서 세포 거부 및 항체-매개 거부에 대한 생검(환자가 안정화될 때)을 보증한다. 생검 결과를 기다리는 동안 메틸프레드니솔론(SoluMedrol)을 시작하고, 티모글로불린 및 혈장사혈을 시작하는 것을 고려한다.
등급 3R 생검 또는 혈역학적 컴프로마이즈를 높은 등급 거부 에피소드로 여긴다.
메틸프레드니솔론(SoluMedrol) 15 mg/kg/일 IV x 3 일 (최대 1000 mg). 이노트로프 요법, 티모글로불린; 및/또는 혈장사혈을 고려한다.
혈역학적 컴프로마이즈가 있거나 또는 없이 항체-매개 거부. 진단: 말초 혈청 샘플에 기증자-특이적 항체의 존재와 함께 심근 조직에서 C4d 침착 확인. AMR에 대해서 스테로이드, ATG 사혈을 고려한다.
신장 및 췌장 면역억제 관리
신장 및 췌장 이식 절차를 위한 전형적인 유도 면역억제 레지멘 및 유지 면역억제 레지멘이 아래에서 제시된다. 한 실시양태에서, 이식물 수혜자는 제2 면역억제 레지멘의 일부로서 유지 요법으로서 벨라타셉트를 받는다. 이 프로토콜은 대표적으로 수혜자가 Epstein Barr Virus (EBV) Ig+이고, DSA (기증자 특이적 동종항체)를 나타내지 않을 때 이용되고; 절대적 또는 계산된 패널 반응성 항체(PRA)와 관계 없이, 이식물은 음성 교차일치를 포함하고, 수혜자는 < 70 세이고 ≤35의 BMI를 가진다. 추가 고려사항은 유도를 견뎌낼 수 있는 수혜자의 능력(그들이 그렇지 않으면 티모글로불린을 받지 않을 경우)을 포함한다. 수혜자는 특발성 국소성 분절성 사구체 경화증(FSGS)의 이력을 가지지 않아야 하고, 이전에 비신장 고형 장기 이식물을 가지지 않아야 한다. 그 프로토콜은 오직 신장 이식물만을 위한 것이다.
한 실시양태에서, 유도 면역억제 레지멘은 수술 중에 메틸프레드니솔론 500 mg을 정맥내 투여하는 것을 포함한다. 알렘투주맙 30 mg을 정맥내 주입에 의해 3 시간의 기간 동안에(스테로이드 투여 후 2 시간 후에) 투여된다. 벨라타셉트 10 mg/kg이 이전 약물 투여 후에 투여된다(TBW)(12.5 mg으로 반올림됨).
한 실시양태에서, 유지 면역억제 레지멘은 POD 4 및 제2 주, 제4 주, 제8 주 및 제12 주의 종료 시에 벨라타셉트 10mg/kg TBW; 그 다음에 매달 5 mg/kg(12.5 mg으로 반올림됨)을 포함한다. 시롤리무스는 1 일 2 mg 투여되고, 2 주 후에 처음으로 최저 수준(목표 8 - 10 ng/ml)이 복용된다. 스테로이드 유지 요법이 정상적으로는 요구되지 않는다.
한 실시양태에서 수혜자가 벨라타셉트의 후보가 아닌 저위험 신 이식물에서, 유도 면역억제 레지멘은 유도 면역억제 레지멘을 포함하지 않을 수 있고, 즉, 유도 면역억제 레지멘은 임의적이다. 유지 면역억제 레지멘은 12 hr마다 투여되는 마이코페놀산 1000 mg 및 12 hr마다 0.1 mg/kg/일로 최대 5 mg 투여되는 타크롤리무스를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서 수혜자가 고위험이고 ATG 금기되고 허약하고 > 70세이고 최근 감염 및 최근 암 활동성의 증거를 가질 때, 유도 면역억제제는 수술실에서 및 수술후 경과일수(POD) 4에서 시작하는 바살릭시이맙 20 mg을 포함할 수 있다. 유지 면역억제 레지멘은 12 hr마다 마이코페놀산 1000 mg 및 12 hr마다 타크롤리무스 0.1 mg/kg/일, 최대 5 mg을 포함할 수 있고, 점감하는(tapering) 용량의 스테로이드를 함께 포함할 수 있다.
고위험 신 이식물 또는 신장 및 췌장 이식물을 포함하는 실시양태에서는 다음 매개변수가 고려된다. 이력적(historic) 피크 PRA>30, 이력적 기증자 특이적 항체(DSA, 절대적 또는 계산된 PRA와 관계 없이), 추정되는 면역학적 이유로 인한 조기 이식편 소실이 있는 2차 이식물, 3차 또는 그 후의 이식물을 가지는 수혜자, 소아 양측 (성인) 수혜자, 신장/췌장, 췌장 단독 및 DGF에 대해 고위험 또는 고위험 생검의 경우. 그러한 이식물에서, 유도 면역억제 레지멘(유도 요법)은 수술실에서 시작되는 티모글로불린 1.5 mg/kg IBW(25 mg으로 반올림됨) x 4 용량을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 수혜자가 0 PRA를 가지고 자가면역 질환을 가지지 않고 높은 BMI를 가지는 경우, 유도 면역억제 레지멘은 수술실에서 시작되는 티모글로불린 1.5mg/kg IBW (25 mg으로 반올림됨) x 4 용량을 포함할 수 있다. 제2 면역억제 레지멘(유지 요법)은 점감하는 용량의 스테로이드, 예컨대 OR에서 500 mg, 240 mg POD 1, 125 mg POD 2, 125 mg POD 3, 90 mg POD 4를 포함할 수 있고, POD 4에서 시작해서 12 hr마다 마이코페놀산 1000 mg 및 12 hr마다 타크롤리무스 0.1 mg/kg/일 , 최대 5 mg을 함께 포함할 수 있다.
신장 이식물 후에 췌장 이식물이 수행되는 실시양태에서, 유도 면역억제 레지멘은 수술실에서 시작되는 티모글로불린 1.5 mg/kg IBW (25 mg으로 반올림됨) x 4 용량을 포함할 수 있다. 제2 면역억제 레지멘트는 1 일 최저 5 mg까지 점감하는 스테로이드, POD 4에서 시작하여 12 hr마다 투여되는 마이코페놀산 1000 mg 및 12 hr마다 0.8 mg/kg/일로 최대 4 mg 투여되는 타크롤리무스를 포함할 수 있다.
마이코페놀산 투여를 포함하는 모든 면역억제 레지멘의 경우, 초기 용량은 환자 및 이식물 인자의 사정에 기초하여 선택될 수 있다.
성인 심장 이식물 면역억제 관리
한 실시양태에서, 정상적으로는 유도 면역억제 레지멘이 투여된다. 유도 요법의 위험이 그러한 요법의 이익보다 더 크다고 생각될 때는 때때로 제외될 수 있다(즉, 유도 면역억제 레지멘은 임의적이다).
한 실시양태에서, 유도 면역억제 레지멘이 투여될 때, 그 레지멘은 Simulect® (바실릭시맙)을 포함할 수 있다: 20 mg IV가 OR에서 재관류(크로스-클램프 제거) 후 제공되고 수술후 경과일수 4에서 반복된다. 유도 면역억제 요법을 받는 환자에서, 제2 면역억제 레지멘트에서 투여되는 칼시뉴린 억제제(CNI)는 수술 후 48 시간 후에 개시되어야 하지만, 환자의 신 상태에 의존해서 추가로 지연될 수 있다. 스테로이드가 수술 전후 기간에 투여될 수 있고, 대표적으로 메틸프레드니솔론이 전신 마취 유도시에 500 mg 정맥내 및 재관류(크로스-클램프 제거) 전에 500 mg IV 투여될 수 있다.
유지 면역억제 레지멘(수술후 유지 면역억제 치료) 실시양태에서, 그 레지멘은 스테로이드를 포함할 수 있고, 예를 들어, 메틸프레드니솔론 125 mg IV q8 hr x 3 용량 (재관류 후 8 hr 후에 시작한다), 그 다음에 프레드니손 수술후 경과일수 2에서 시작하여 0.5 mg/kg 1 일 2 회를 포함할 수 있고; 2 일마다 1 일 2 회 5 mg씩 10 mg 1 일 2 회(또는 20 mg 1 일)까지 감소시키고 이 용량을 이식물 후 30일까지 유지한다. 제2 면역억제 레지멘은 또한 칼시뉴린 억제제(CNI), 예를 들어, 타크롤리무스/FK506/Prograf®(바람직한 작용제): 12 hr마다 입으로 1 mg을 포함할 수 있다. 용량은 10-15 ng/ml의 최저 목표 수준까지 적정된다. 정상 상태(steady state)를 확립하기 위해 5 용량의 칼시뉴린 억제제 후에 대표적인 용량 조정을 한다. CNI의 1 일 수준을 초기에 모니터링하여 CNI 독성을 평가한다.
대안적 실시양태에서는, 시클로스포린/CyA/Neoral®이 12 hr마다 100 mg (1.5 내지 5 mg/kg)의 용량으로 입으로 투여된다. 그 용량은 대표적으로 33 ng/ml의 최저 목표 수준까지 적정된다. 유지 면역억제 레지멘은 또한 항증식 작용제 예컨대 마이코페놀레이트 모페틸(Cellcept®) 1,000 내지 1,500 mg 경구를 포함할 수 있고, 용량은 WBC 수 > 3,000을 유지하도록 조정된다. 대안으로, 항증식 작용제는 1 일 2 회 경구 투여되는 마이코페놀레이트(Myfortic®) 360 mg - 720 mg일 수 있고, 용량은 WBC 수 > 3,000을 유지하도록 조정된다. 또 다른 실시양태에서, 항증식 작용제는 1 일 2 mg/kg의 용량으로 경구 투여되는 아자티오프린(Imuran®)이고, 용량은 WBC 수 > 3,000을 유지하도록 조정된다.
한 실시양태에서, 유지 면역억제 레지멘은 1 일 2 mg의 용량으로 경구 투여되는 시롤리무스(Rapammune®) (TOR-I)를 포함할 수 있다. 용량은 대표적으로 4-12 μg/ml의 최저점을 유지하도록 적정된다.
한 실시양태에서, 유지 면역억제 레지멘은 점감하는 용량의 스테로이드를 포함할 수 있고, 예를 들어 제1 월에는 용량을 1 일 15.0 mg PO로 감소시키고; 제2 월에는 용량을 1 일 12.5 mg PO로 감소시키고; 제3 월에는 용량을 1 일 10.0 mg PO로 감소시키고; 제4 월에는 용량을 1 일 7.5 mg PO로 감소시키고; 제5 월에는 용량을 1 일 5.0 mg PO로 감소시키고; 제6 월에는 용량을 1 일 2.5 mg PO로 감소시킨다. 스테로이드 점감은 근세포 괴사의 증거를 갖는 ≥ISHLT Grade 1R 후에 재평가해야 한다. 점감은 조직학적 거부 지침의 개선 후에 재개될 수 있다.
한 실시양태에서, 유지 면역억제 레지멘은 다음 첨가적/보조적 작용제를 포함할 수 있다: 세포-매개 거부의 경우에는 2.5 내지 5 mg 1 주 2 회 투여되는 메토트렉세이트(MTX). MTX는 ≥등급 1R/2로 3 회 이상 연속 생검 또는 등급 2R/3A로 2 회 연속 생검의 경우에 고려되어야 한다.
성인 간 및 장 면역억제 관리
한 실시양태에서, 신 기능이상이 없는 간 이식물은 유도 면역억제 레지멘 없이 수행될 수 있고, 즉 그러한 유도 면역억제 레지멘은 임의적이다. 유지 면역억제 레지멘은 12 hr마다 마이코페놀레이트 1 g 및 12 hr마다 타크롤리무스 2-3 mg을 점감하는 용량의 스테로이드와 함께 투여하는 것을 포함할 수 있다. 스테로이드의 대표적인 점감하는 용량은 다음과 같다: 수술 중 메틸프레드니솔론 500 mg IV; 수술 후 6 hr 경과시 1 회 메틸프레드니솔론 250 mg IV; POD 1에 1 회 메틸프레드니솔론 180 mg IV; POD 2에 1 회 메틸프레드니솔론 90 mg IV; POD 3에 1회 메틸프레드니솔론 60 mg IV; POD 4에 1 회 메틸프레드니솔론 30 mg IV; POD 5-14에 1 일 프레드니손 20 mg PO; 2 주마다 2.5 mg씩 감소. 한 실시양태에서, 프레드니솔론의 점감하는 용량은 처음 2 주 동안 1 일 20 mg; 2 - 4 주 동안에 1 일 17.5 mg; 4 - 6 주 동안에 1 일 15 m, 6 - 8 주 동안에 1 일 12.5 mg; 8 - 10 주 동안에 1 일 10 mg; 10 - 12 주 동안에 1 일 7.5 mg; 12 - 14 주 동안에 1 일 5 mg; 14 - 16 주 동안에 1 일 2.5 mg으로 투여될 수 있다. 16 주에 중단한다. 일부 상황에서는, 프레드니솔론을 1 일 5 mg까지 위닝하고 1 년 동안 고수한다.
한 실시양태에서는, 신 절약(sparing) 간 이식물이 HD 또는 CVVHD/F를 요구하는 수술전 기능이상이 있는 경우에 수행된다. 또 다른 실시양태에서, 신 절약 간 이식물이 POD 0-1에 > 2 mg/dL의 혈청 크레아티닌 수준을 갖는 수술후 신 기능이상이 있는 경우에 수행된다.
한 실시양태에서, 유도 면역억제 레지멘은 4 용량 동안 48 시간마다 티모글로불린 1.5 mg/kg(25 mg으로 반올림됨)을 포함한다. 한 실시양태에서는, 범혈구 감소증 또는 호중구 감소증의 경우에 용량을 감소시킨다. WBC 수가 2-3이거나 또는 혈소판이 30-50인 경우에는, ½ 용량을 제공한다. WBC가 < 2이거나 또는 혈소판이 < 30인 경우에는, 그 용량을 고수한다.
한 실시양태에서, 예비투약이 지시될 때, 예비투약은 ATG 주입 전 30-60 min에 아세트아미노펜 650 mg VT 또는 경구, 디펜히드라민 25-50 mg; 및 메틸프레드니솔론 40 mg IV로 투여될 수 있다(또는 위에서 기술된 점감을 사용할 수 있다).
한 실시양태에서, 이식물은 장 또는 다장기 이식물 예컨대 간, 장, 췌장 이식물이고, 수혜자가 면역학적 고위험도인 경우(PRA > 0, 임신 또는 분리된 장의 이식물 전, 또는 면역학적 저위험도이지만 감염 고위험도인 경우, 유도 면역억제 레지멘은 위에서 기술된 바와 같은 예비투약을 포함할 수 있고, 또한 24 hr마다 티모글로불린 1.5 mg/kg (25 mg으로 반올림됨을 총 6 mg/kg 및 POD 0 및 4에서 바실릭시맙 20 mg을 포함할 수 있다. 유지 면역억제 레지멘은 위에서 기술된 바와 같은 점감하는 용량의 스테로이드 및 12 hr마다 마이코페놀레이트 1 g 및 12 hr마다 타크롤리무스 1 mg SL (목표 12-16 mg/ml)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서는, 환자가 마이코페놀레이트 모페틸 (Cellcept)을 투여받는 동안에 타크롤리무스가 표적 수준 5 - 8 (간) 또는 12 - 17 (장, 간-장)을 달성하는 용량으로 투여된다. 그 표적은 환자가 약물 연구 시험에 참여하고 있거나, 거부를 가지거나, 신 컴프로마이즈(renal compromise)을 가지거나, 또는 나이가 듦에 따라 변경될 수 있다.
마이코페놀레이트 모페틸 (MMF, Cellcept)이 투여되는 일부 실시양태에서 성인의 표준 용량은 12 hr마다 1,000 mg이다. 범혈구 감소증 또는 호중구 감소증이 있는 환자에서는 다음에 따라서 용량을 감소시킬 수 있다: WBC 2-3 또는 혈소판 30-50: ½ 용량을 제공하는 것을 고려하고; WBC < 2 또는 혈소판 < 30의 경우; 용량을 고수하는 것을 고려한다.
급성 간 동종이계이식편 거부의 치료를 포함하는 일부 실시양태에서는, 다음 치료가 투여될 수 있다: 3 용량 동안 1 일 메틸프레드니솔론 500 mg IV. 간 기능이 개선되고 있지 않은 경우, 추가의 2 용량이 제공될 수 있고(1 일 500 mg IV의 총 5 용량), 반복 러버(lover) 생검이 POD 3의 전날 밤 또는 POD 4의 아침에 수행된다.
일부 실시양태에서는, CMV IgG가 이전에 음성이었던 SoluMedrol® 또는 Thymoglobulin®으로 치료되는 환자가 치료 시작 시에 CMV IgG를 다시 점검받게 해야 한다.
폐 이식물의 면역억제 관리
일부 실시양태에서, 폐 임플란트에서 면역억제 관리는 다음 유도 및 유지 면역억제 레지멘을 따른다. 유도 면역억제 레지멘은 이전에 기술된 유도 면역억제 레지멘을 따를 수 있다. 유지 면역억제 레지멘은 다음을 포함할 수 있다:
칼시뉴린 억제제: 12 hr마다 최저 타크롤리무스 수준을 유지하도록 조정되는 투여 용량의 타크롤리무스. 하기 표 5를 참조한다.
Figure pct00007
시클로스포린은 12 hr마다 하기 표 6에 따라서 최저 CyA 수준을 유지하도록 조정되는 투여 용량으로 투여된다.
Figure pct00008
점감하는 용량의 스테로이드 이식물 후 0-3 개월, 1 일 단위로 20 mg 경구 투여; 이식물 후 3-6 개월, 1 일 단위로 15 mg 경구 투여; 이식물 후 6-9 개월, 1 일 단위로 10 mg 경구 투여; 및 이식물 후 > 9 개월, 1 일 단위로 5 mg 경구 투여.
1 일 단위로 아자티오프린 2 mg/kg이 경구 투여될 수 있다. 시작 전에 정상 TMPT 효소 수준을 보장하고 LFTs/CBC를 따르는 것이 중요하다. 백혈구 감소증이 관찰되면 용량 조정이 고려될 수 있다.
마이코페놀레이트 모페틸(Cellcept®)은 1 일 2 회 1,000 mg의 통상적인 용량으로 투여될 수 있다. 심장 및 폐 이식물의 경우 통상적인 용량은 경구 투여되는 1 일 1,500 mg이다. CBC를 따라야 하고, 백혈구 감소증이 관찰되면 용량 조정이 고려되어야 한다.
시롤리무스는 문합 열개 우려 때문에 이식 후 처음 3 개월 내에 일반적으로 금기된다. 투여되는 경우, 시롤리무스는 대표적으로 경구 투여로 1 일 1 mg 투여되고, 이것은 최저 수준에 기초하여 조정된다. 예를 들어, 제3 작용제로서 또는 CNI 절약을 위해 투여되고, 표적 최저점은 4-8 ng/ml이고; CNI 대체물로서는, 최저 수준이 10-15 ng/ml이다.
실시예
실시예 1: 흉선내 가변성 연구
흉선의 한 부분으로부터의 조직학 시험 결과가 동일한 흉선의 임의의 다른 부분에서의 조직학 시험 결과를 대표한다고 여길 수 있는지 결정하기 위해 흉선내 가변성을 연구하였다. 이 시험의 결과는 일상적 출하 시험 동안에 및 공정 유효성 확인 시험을 위해 얼마나 많은 샘플을 시험해야 하는지를 결정하는 데 사용되었다.
제5 일 - 제9 일에 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해 양성인 영역; 확인된 적어도 1 개의 해살 소체; 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색; 및 관찰된 원상태 핵의 사정을 포함해서 이전에 언급한 바와 같이 조직학 수용 척도를 확립하였다.
이 연구를 위해서, 3 개 흉선을 방향성 있는 방식으로 슬라이싱하고, 각 흉선 내의 슬라이스의 위치를 추적하였다. 슬라이스를 6-웰 플레이트에서 배양해서 각 슬라이스의 추적을 허용하였다. 슬라이싱은 도 5a에서 보여주는 바와 같이 수행하였다.
연구에서 각 흉선에 대해, 슬라이스들을 다음 시점, 기준일(제0 일), 제5 일, 제9 일, 제12 일 및 제21 일 각각에서의 분석에 사용하였다.
각 흉선에 대해 각 시점에서 5 - 11 개 슬라이스를 배양하였다. 슬라이스를 위에서 기술된 방법에 따라 매일 배지를 교체하면서 배양하였다. 슬라이스를 병리학 실험실에서의 H&E 염색을 위해 제출하였고, 동일성, 효력 및 생존능에 대해 분석하였다. 이 연구에서 모든 슬라이스가 위에서 지정된 바와 같은 조직학 시험을 위한 출하 수용 척도, 즉: 제5 일 - 제9 일에 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해 양성인 영역; 확인된 적어도 1 개의 해살 소체; 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색; 및 관찰된 원상태 핵을 충족시켰다.
각 슬라이스가 출하 수용 척도를 충족시켰는지의 사정 외에도 추가로, 병리학자는 각 H&E 및 AE1/AE3 슬라이드를 더 상세히 검토하였다. 배양된 흉선 조직 로트 MFG-056의 이들 슬라이드 중 일부의 이미지를 도 6a-h에서 보여준다. 다음 관찰을 기록하였다.
동일한 기증자 흉선으로부터 유래된 모든 슬라이스가 각 시점에서 수용 척도를 충족시켰다. 상이한 슬라이스에서, 피질의 영역들이 서로 유사하고, 수질의 영역들이 서로 유사하다. 그러나, 슬라이스들간의 피질 및 수질의 상대 비율의 변화가 관찰되었다.
배양 시간의 함수로서 동일 흉선으로부터 유래된 상이한 슬라이스 간에 관찰된 차이는 주로 흉선세포의 괴사의 양(배양 시간이 증가함에 따라 증가함) 및 잔류 흉선세포 수(배양 시간이 증가함에 따라 감소함)와 주로 관련 있다.
이들 관찰에 기초하여, 흉선으로부터의 임의의 한 슬라이스가 전체 흉선을 대표하였다. 추가로, 제5 일에 조직 슬라이스의 조직학적 외관은 더 나중 시점(제9 일, 제12 일 및 제21 일) 각각에서 관찰되는 것을 반영한다.
실시예 2: 전체 흉선 시간 경로 연구
이 연구를 위해, 5 개 흉선을 슬라이싱하고 SOP에 따라서 배양하였다. 슬라이싱 당일에, 면역조직화학을 위해 처음, 중간 및 마지막 슬라이스를 제조하였다. 각 흉선의 나머지를 슬라이싱하고, 6-웰 플레이트에서 배양하였다. 각 흉선을 다음 시점 중 하나에 지정하였다: 기준일(제0 일), 제5 일, 제9 일, 제12 일 및 제21 일. 제0 일 흉선 슬라이스에 대해서는 도 7, 제5 일 슬라이스에 대해서는 도 8, 제12 일 슬라이스에 대해서는 도 9, 및 제21 일 슬라이스에 대해서는 도 10을 참조한다.
각 흉선으로부터의 슬라이스의 총 수는 21 내지 62 개 슬라이스의 범위이다. 슬라이스를 매일 배지를 교체하면서 위에서 개요한 절차에 따라서 배양하였다. 슬라이스를 병리학 실험실에서의 H&E 염색을 위해 제출하였고, 동일성, 효력 및 생존능에 대해 분석하였다. 이 연구에서 모든 슬라이스가 조직학 시험을 위한 출하 수용 척도, 즉: 제5 일 - 제9 일에 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해 양성인 영역; 확인된 적어도 1 개의 해살 소체; 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색; 및 관찰된 원상태 핵을 충족시켰다.
각 슬라이스가 출하 수용 척도를 충족시켰는지의 사정 외에도 추가로, 병리학자는 각 H&E 및 AE1/AE3 슬라이드를 더 상세히 검토하였다. 다음 관찰을 기록하였다.
동일한 기증자 흉선으로부터 유래되고 동일 시점에서 시험된 모든 슬라이스가 위에서 기술된 바와 같은 수용 척도를 그 시점에서 유사하게 충족시켰고, 피질 및 수질의 상대적 양, 잔류 흉선세포 및/또는 괴사의 차이가 있다.
기록된 차이는 상대적 크기, 형상, 흉선 피질 대 수질의 상대적 함량, 괴사의 양, 흉선 상피의 응축 및 잔류 흉선세포의 수였다.
추가로, 상이한 시점에서 시험된 상이한 기증자로부터의 로트도 또한 서로 질적으로 유사하였다. 관찰된 차이는 괴사의 양(배양 시간이 증가함에 따라 증가함) 및 잔류 흉선세포의 수(배양 시간이 증가함에 따라 감소함)와 관련 있다.
임의의 한 슬라이스의 조직학적 검사는 전체 로트의 수용성에 관해 동일한 결론을 초래하였다. 이들 관찰에 기초하여, 흉선으로부터의 임의의 한 슬라이스의 관련 특징은 전체 흉선의 관련 특징을 반영한다. 추가로, 제5 일에서의 조직 슬라이스의 조직학적 외관은 나중 시점(제9 일, 제12 일 및 제21 일) 각각에서 관찰된 것을 반영하지만, 나중 시점에서 더 많은 괴사가 관찰된다. 도 11은 제0 일 내지 제21 일에서 항체 AE1/AE3에 의해 사정되는 바와 같이 상피 망상조직의 유사성을 보여주는 좋은 예이다.
실시예 3: 흉선 조직 강제 분해 연구
이 연구에서는, 흉선 조직 슬라이스를 처리하여 분해되거나 또는 생존불능하다고 여겨지는 조직 슬라이스를 생성하였다. 이 실험에는 3 개 흉선을 사용하였다. 대조 샘플을 각 흉선으로부터 채취하였다. 표 7에서 제시된 처리 조건을 시험하였다.
Figure pct00009
열 충격은 슬라이스를 함유하는 10 cm 배양 접시를 지퍼락 봉지 안에 넣고, 55 ℃ 수조에 넣음으로써 달성하였다. 플레이트는 지지체 위에 받쳐져 있고 물에 잠기지 않았다. 냉동/해동은 10 cm 배양 접시를 -20 ℃ 냉동고에 4 hr 동안 넣은 후 주위에서 해동시킴으로써 달성하였다.
샘플을 배양 중에 제5 일 및 제9 일에 조직학에 대해 시험하였다. 일부 샘플은 또한 제21 일에도 시험하였다. 이 연구에서 모든 슬라이스는 조직학 시험을 위한 출하 수용 척도, 즉: 제5일 - 제9일에 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해 양성인 영역; 확인된 적어도 1 개의 해살 소체; 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색; 및 관찰된 원상태 핵을 충족시켰다.
각 슬라이스가 출하 수용 척도를 충족시켰는지의 평가 외에도 추가로, 병리학자는 각 슬라이드를 더 상세히 검토하였다. 다음 관찰을 기록하였다.
냉동/해동 또는 10X PBS에 노출된 샘플은 가장 많은 괴사를 보여주었지만, 일부 세포는 여전히 원상태인 것으로 보였고, 생존능에 대한 조직학적 척도를 충족시켰다. 10X PBS 노출의 예에 대해서는 도 12를 참조한다.
계속 실온에 있고, 탈수되고, 생리식염수 또는 1% DMSO 중에서 인큐베이팅되거나 또는 열충격을 겪은 슬라이스는 더 적은 정도의 조직학적 변화를 보여주었다.
대조 샘플의 경우, 병리학자는 다음 관찰을 기록하였다.
흉선 조직이 배양됨에 따라 흉선세포가 점진적으로 소실된다. 그러나, 죽은 세포는 그들을 청소하는 식세포를 동원할 수 없기 때문에 배양된 흉선에서 장기간 잔존할 수 있다. 세포자살적 세포 죽음을 겪은 세포의 핵은 처음에 응축하고 헤마톡실린 염료로 더 어둡게(청색) 염색된다. 이들 세포는 그의 에너지를 고갈시키지만 식세포 작용으로 제거되지 않기 때문에, 그들은 그들의 막 완전성을 소실하여 괴사성이 된다. 핵융해(괴사성 세포에서 핵의 용해)는 대표적으로 생체내에서 2-3 일 내에 일어나지만, 흉선 배양 동안에는 더 느리게 일어나는 것 같다. 따라서, 흉선세포 핵이 핵융해를 겪은 괴사성 세포 쇄설물의 큰 호산구성(분홍색) 넓은 구역을 보는 것은 흔하다. 일부 죽은 흉선세포는 그들의 핵을 보유하고, 이것은 생존가능 세포의 핵에 비해 들쭉날쭉한 가장자리 및 변경된 염색 특성을 가진다.
흉선세포가 조직으로부터 고갈되기 때문에, 흉선 상피 세포가 더 잘 보이게 된다. 3 차원 흉선 상피(TE) 망상조직은 연결된 상피세포 및/또는 검사되는 절편에서 연결이 분명하지 않은 (겉보기에) 산포된 TE 세포의 밝은 레이스 모양 배열을 통해 절편에서 정상적으로 입증된다. 흉선세포가 배양 동안에 소실되기 때문에 3 차원 망상조직은 수축한다. 이것은 잔류 상피의 응축을 초래하고, 이렇게 함으로써 피막하 피질 상피 층이 더 두꺼워지고 수질 TE 세포가 더 조밀하게 쌓인다. 생존가능 TE 세포의 핵은 대표적으로 난형이고, 흉선세포의 핵보다 크고, 헤마톡실린(청색) 염색에 의해 윤곽이 그려진 선명하게 경계를 나타낸 핵 막, 뿐만 아니라 하나 이상의 핵소체를 가진다. 이들 TE 핵은 대표적으로 "개방"된 것처럼 보이고, 이는 그들이 헤마톡실린으로 어둡게 염색되지 않는다는 것을 의미한다. 이것은 활성 크로마틴("진정염색질")이 헤마톡실린 염료와 결합할 수 없기 때문에 그들이 살아있고 대사적으로 활성이라는 해석과 들어맞는다. 많은 TE 세포에서 리보솜 합성 부위인 핵소체의 존재는 그들이 살아있고 대사적으로 활성임을 추가로 확증한다. 제5 일, 제12 일 및 제21 일로부터의 대조 절편의 대표적인 조직학적 외관은 각각 도 8, 9 및 10에서 보여준다.
실온, 탈수, 1% DMSO 및 열 충격을 포함하는 처리 조건에 대해서, 병리학자는 슬라이스의 외관이 대조군의 것과 유의미하게 상이하지 않았다는 것을 지시하였다. 열 충격 받은 샘플의 경우, 병리학자는 열 처리가 추가 분해를 방지하는 단백질을 응고시킴으로써 세포를 "고정할" 수 있었다는 것을 언급하였다. 열 처리는 흉선을 포함하여 조직의 고정제로서 사용되었다.
도 12a 및 12b는 강제 분해 조건에 노출 후 흉선 조직 슬라이드의 조직학을 묘사한다. 도 10은 제21 일에서의 대조 흉선 조직 슬라이스의 조직학적 외관을 묘사한다.
강제 분해 조직의 일반적인 조직학적 외관은 이들 시점에서 유사하지만, 제21 일에서는 잔류 흉선세포가 더 적다(도 12b). 수질 영역에서의 대표 해살 소체는 도 12b에서 화살표로 지시된다. 대표하는 생존가능해 보이는 흉선 상피 세포는 도 12a 및 12b에서 화살표로 지시된다. 도 12b에서 보여주는 피질 영역은 제21 일에서의 괴사성 림프구로 거의 전부 이루어진다. 하단 좌측에 있는 막대는 100 μm를 나타낸다.
실시예 4: 흉선 조직 약물 물질 배치 분석
흉선 조직의 10 개 로트의 배치 분석 데이터를 하기 표 8에서 보여준다.
Figure pct00010
여기서, 도스(Dose: 용량)
핵심:
(a) 이들 로트는 제작시 준비되어 있었던 규격에 따라서 시험하였다. 이 표에서 제시되는 약물 물질 시험 결과는 또한 최종 약물 생성물 시험 결과를 나타낸다.
(b) 외관 규격은 탬퍼링 또는 용기 손상의 증거가 없었다.
(c) 조직학 검정이 동일성 및 효력 둘 모두에 사용하였다. 조직학 규격(제5 일 - 제9 일에 시험됨)은 다음과 같았다:
(d) 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴에 대해 양성인 영역.
i. 확인된 적어도 1 개의 해살 소체
ii. 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색
iii. 관찰된 원상태 핵
iv. 멸균성 및 마이코플라즈마 샘플을 제1 일, 제7 일 및 제14 일에
수집하였다.
56 개 임상 흉선, 흉선내 가변성, 흉선간 가변성 및 시간 경로 시험에 사용된 8 개 흉선, 및 강제 분해를 겪은 3 개 흉선의 데이터를 사용해서 현 대조 라이브러리를 생성하였다. 라이브러리(음성 대조군)에서 강제 분해 샘플은 냉동/해동 또는 10X PBS에의 노출에 의해 분해를 겪은 것들이었다. 전체 데이터 세트는 14 개 상이한 클러스터를 초래하였다. 모든 강제 분해 샘플을 함께 클러스터링하고, 임상 샘플 또는 특성화 샘플은 강제 분해 샘플과 함께 클러스터링하지 않았다.
실시예 5
실시예 5의 전체 실험 설계를 도 20에 묘사한다. 수술 절차 및 치료 일정의 도해적 표현을 제시한다. 도면 및 아래 텍스트의 많은 것이 발표를 위한 제출 준비로 작성한 필사본에 근거한다: Kwun, J. et al., JCI Insight . 2020 Jun 4;5(11).
실험 설계의 도해적 설명은 나이브 T 세포 재구성, 흉선세포생성, 및 CTT의 수술적 삽입에 의해 유발되는 기증자-특이적 관용을 묘사한다. 모든 루이스(LW) 래트는 심장 이식 및 CTT의 수술적 삽입 전에 흉선절제되었고 항-CD5 mAb에 의해 T 세포 고갈되었다. F1 (LWxDA) 래트로부터의 CTT 및 DA 래트로부터의 심장을 흉선절제된 LW 수혜자에게 이식하였다. 시클로스포린(CsA)을 이식 후 4 개월 동안 삼투 펌프로 제공하였다. 제3자 BN 심장을 CsA 중단 후 2 내지 3 개월 후에 목에 이식하였다. 대조 래트는 그들이 CTT의 수술적 삽입을 수혜받지 않았다는 것을 제외하고는 동일한 절차를 경험하였다.
실시예 5는 아래에서 기술되는 바와 같이 면역부적격 래트 모델에 임플란팅된 CTT가 이식된 고형 장기에 대한 관용을 유도할 수 있다는 것을 입증한다. 본 발명자들은 CTT(아래에서 기술된 바와 같이 배양됨)의 하플로-일치된 F1(루이스 x 다크 아구티, LWxDA) 임플란트를 혈관화된 불일치된 DA 심장 이식물과 함께 루이스 래트에게 수행하였다.
CTT의 임플란트 전에, 수혜자는 흉선절제되었고 T 세포 고갈되었다.
시클로스포린을 심장 이식 당일에 시작해서 4 개월 동안 투여하였다. 대조 그룹은 CTT의 임플란트를 수혜받지 않았다. 면역억제 중단 후 2 개월 후에, CTT가 임플란팅된 수혜자는 말초 혈액에서 나이브 CD4 (CD62L+CD45RC+) T 세포의 재군집을 보여주었고; 대조 래트는 그렇지 않았다 (도 23). 최근 흉선 이주자 CD4 (CD90+CD45RC+) T 세포를 발달시킨 후에도, CTT가 이식된 수혜자는 DA 심장 동종이계이식편을 거부하지 않았다(도 25). 대조군은 기능성 T 세포 결여로 인해 DA 이식편을 거부하지 않았다(도 25).
기증자-특이적 무반응성을 확증하기 위해서, MHC-불일치된 브라운 노르웨이(BN) 심장을 초기 불일치된 DA 심장 이식물 후 제180 일에 이식하였다. CTT의 F1 (LWxDA) 이식물을 갖는 LW 래트는 제3자 BN 심장을 신속하게 거부하였다 (평균 거부 시간, 10d; n=5) (도 27). 대조군은 제3자 심장을 거부하지 않았다(n=5). CTT의 수혜자는 제3자 BN 기증자에 대해서는 항체를 생성할 수 있었지만 DA 흉선 기증자에 대해서는 항체를 생성할 수 없고 체액성 기증자-특이적 관용을 입증한다(도 32a). 부검에서 이식된 CTT의 면역조직화학은 기능성 흉선 조직을 보여주었다(도 24). 종합해 보면, 루이스 래트에게 제공된 F1(LWxDA) CTT는 기증자 흉선에서 발현되는 동종 DA MHC에 대해 특이적 관용을 초래하였고, 모든 면역억제 금단 후에 DA 심장 이식물의 장기간 생존을 초래하였다.
물질 및 방법
동물 모델
이 실시예 5에서는, 동종 CTT를 아래에서 기술되는 바와 같이 3 일령 F1 (루이스 x 다크 아구티 레이(ray) 새끼로부터 수확해서 배양하고(도 17a 및 17b), 그 다음에 흉선절제된 루이스 (RT-1l) 수혜자 래트에게 이전에 기술된 바와 같은 무흉선 cDGA를 갖는 사람 유아의 치료와 대등한 방식으로 임플란팅하였다. (Markert, ML, et al., 2008; Market, ML, et al., 2010).
루이스 (RT-1l) 및 BN (RT-1n) 래트는 Charles River로부터 구입하였다. DA (RT-1av1) 래트는 Envigo로부터 구입하였다. F1(LEW/DA; RT-1l/av1)은 Duke Breeding Core Division of Laboratory Animal Resources 시설에서 프로토콜 스태프에 의해 사육되었다. 루이스 수혜자는 Rendell VR, Giamberardino C, Li J, Markert ML, & Brennan TV, 2014, "Complete thymectomy in adult rats with non-invasive endotracheal intubation." J Vis Exp (94)에 기술된 바와 같이 흉선절제술을 받았다.
간략하게 말하면, 턱밑샘 및 흉골설골근을 무딘 포셉으로 분리해서 기도 위에 가로놓인 조직을 노출시켰다. 흉골병에서 1- 내지 1.5-cm 절개하였다. 7 cm 암즈형(alms-type) 견인기구를 사용하여 흉골병 및 흉골설골근의 2 개의 반쪽을 견인하여 흉선을 노출시켰다. 흉선을 무딘 포셉으로 움켜잡고 추출시켰다. 흉골의 절단된 말단을 단일의 3 내지 4-0 실크 봉합사로 봉합하였다. 2 방울의 2.5 mg/ml 부피바카인을 절개부 상에 도포하고, 피부의 바깥층을 3 또는 4 개 9-mm 상처 클립으로 봉합하였다.
모든 흉선절제된 래트를 Septra (PMI Nutrition International, LLC)를 함유하는 상용사료(diet)로 유지하였다. 생체내에서 T 세포 고갈을 유도하기 위해, 1 mg 항-CD5 mAb (OX19; BioXCell, NH)를 흉선절제술 후 제0 일, 제5 일 및 제10 일에 복강내 투여하였고, 심장 이식에 대해서 제0 일(심장 이식물 및 CTT 시점)부터 4 개월까지 0.25 mg/kg/d 시클로스포린 펌프로 억제를 제공하였다. 모든 래트를 사용하였고 Duke Institutional Animal Research Ethics Committee의 지침 및 컴플라이언스(compliance)에 따라서 유지하였다.
시험관내 흉선 배양물 및 CTT
3일령 신생아 F1 (LEW/DA) 래트 새끼로부터 흉선을 멸균 수확하고, 세로 자연 시임(seam)을 따라서 4 조각으로 절단하고, TOM 배지를 갖는 조직 배양 접시에서 멸균 니트로셀룰로스 필터(MF-Millipore, Millipore Sigma) 상에 옮겼다(도 17b). 흉선 조직을 37 ℃에서 5% CO2를 갖는 CO2 인큐베이터에서 요망되는 길이의 시간(5 내지 7 일) 동안 배양하였다. 배지를 매일 교체하였다. 흉선 장기 배지(TOM)는 HAMS F12 (Life Technologies) 86.5%; Hepes (Life Technologies) 25mM; L-글루타민 Life Technologies) 2mM; 태아 소 혈청(Life Technologies) 10%; 및 펜-스트렙(Pen-strep)(Life Technologies) 1x로 구성되었다. 이식 당일에, 흉선 조각을 신선한 배지로 린싱(rinsing)하고, 루이스 래트의 신장 피막 아래에 하나의 안전한 봉합사(10-0 모노필라멘트)를 이용해서 이식하였다. 도 17c를 참조한다. 모든 조작은 생물학적 안전성 캐비넷에서 멸균 조건 하에서 일어났다.
복부 및 경추 심장 이식
완전 MHC 불일치된 DA (RT-1av1) 기증자 심장을 흉선절제된 루이스(RT-1l) 수혜자에게 이식하였다. 복부 심장 이식을 Schmid C, Binder J, Heemann U, & Tilney NL, 1994," Successful heterotopic heart transplantation in rat" Microsurgery 15(4):279-281에 의해 기술된 방법의 변경된 기술을 사용하여 수행하였다.
간략하게 말하면, 기증자 심장을 Euro-Collins 용액에서 짧은 기간의 냉허혈 후에 수혜자의 복강 안에 이식하였다. 기증자 폐동맥 및 대동맥을 수혜자 하대정맥 및 하행 대동맥에 순환을 위한 유입 및 유출 혈관으로서 단부-측부 방식으로 연속 9/0 비흡수성 모노필라멘트 봉합사를 사용해서 문합시켰다. 시클로스포린 A (CsA)를 삼투 펌프(Model 2ML4, Alzet)를 통해 제공하였다. 수혜자는 또한 삼투 펌프를 사용하여 흉선 이식 후 시클로스포린 (CsA) 대략 2.5 mg/kg/일을 받았다. 시험 그룹이 흉선 이식 후 4 개월 후에 나이브 T 세포를 10% 넘게 가졌을 때 CsA를 중단하였다. 펌프를 수혜자의 등가운데 영역에 멸균 로딩하고 수술적으로 피하 삽입하였다. 삼투 펌프를 4 개월 동안 매달 교체하였다. DA 심장을 지니는 루이스 수혜자에게 전체 MHC 불일치된 BN (RT-1n) 제3자 심장 이식을 위해서는, Heron, et al. (Heron I., 1971, "A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats," Acta Pathol Microbiol Scand A 79(4):366-372)에 의해 기술된 경추 혈관화된 심장 이식 방법을 변경된 방식으로 사용하였다.
6 내지 7 개월에, 제3자 BN 심장을 목에 이식하였다. 간략하게 말하면, 제3자 심장을 경추 영역의 우측에 하악부터 검상돌기까지 세로 절개를 통해 이식하였다. 기증자 폐동맥 및 외경정맥을 말단끼리 문합시켰고, 대동맥을 우측 총경동맥에 커핑(cuffing) 기술에 의해 문합시켰다. 이식편을 매일 촉진에 의해 모니터링하였고, 나중에 희생 시에 개복술에 의해 확증하였다. 동물들을 거부 당일(박동 중지)에 또는 지정된 시점에 희생시켰다.
유동 세포 분석 및 DSA 모니터링
말초 혈액을 두개 대정맥으로부터 얻어서 항체로 염색하였다. 나이브 및 최근 흉선 이주자를 분석하기 위해, 본 발명자들은 항-래트 CD3 APC (BD Biosciences); 항-래트 CD4 APC-Cy7 (Biolegend); 항-래트 CD8a V450 (BD); 항-래트 CD45 PE-Cy7 (BD); 항-래트 CD45RC - PE (BD); 항-래트 CD62L FITC (BD); 및 항-래트 CD90 BV 510 (Biolegend)의 조합을 사용하였다. T, B, 및 NK 세포의 백분율을 사정하기 위해서, 본 발명자들은 항-래트 TCR FITC (BD); 항-래트 CD4 APC-Cy7(Biolegend); 항-래트 CD8a V450 (BD); 항-래트 CD45 PE-Cy7 (BD); 항-래트 CD45RA PE (Invitrogen); 항-래트 NKR-P1A-APC (Invitrogen)의 조합을 사용하였다. 숙주 대 기증자 구별을 위해, 본 발명자들은 항-래트 TCR APC (Biolegend), 항-래트 CD45 PE-Cy7 (BD); MHC Class I RT1aa (Santa Cruz Biotechnology)의 조합을 사용하였다. 본 발명자들은 또한 비접합된 MHC Class I RT1Aa에 대해서는 이차 염소 항-마우스 IgG (Invitrogen)을 사용하였다. 기증자-특이적 동종항체(DSA)를 DA 기증자 또는 BN 제3자 래트와의 연속적으로 수집된 수혜자 혈청 샘플로부터의 유동 교차일치로 사정하였다. FITC-접합된 판-래트 면역글로불린 항체를 세척 후 샘플에 첨가해서 인큐베이션하였다. T 세포를 APC-접합된 항-CD3으로 염색하였다. 샘플을 LSR fortessa (Beckman Coulter)로 분석하였다.
부검
CTT 후 8 개월 후에 시험 그룹이 경추 BN 심장을 거부했을 때 부검으로 흉선 이식편 및 모든 심장을 평가하였다. 예측한 대로, DA MHC를 발현하지 않는 수혜자-유래 T 세포가 흉선 이식물 수혜자의 말초 혈액에서 나타났다(도 21).
조직학, 면역조직화학(IHC), 및 형태학적 분석
신장 피막 아래로부터의 모든 배양된 흉선 및 CTT 샘플을 OCT (Optimal Cutting Compound; Tissue Tek)에서 냉동시켰다. 대조 흉선 조직은 갓 태어난 내지 5일령 래트 새끼로부터 얻었다. 4 내지 5 mm 절편을 CD3(다클론; Dako), Ki-67 (클론: SP6; Thermo), CK, (다클론; Invitrogen)에 대해 염색하였다. IHC 이미지를 Olympus DP-70 Digital Camera System의 Olympus Vanox AH-3 Microscope를 사용하여 얻었다. 외식된 심장은 중간심실 수준부터 기저부까지 연속 절편화(5μm)되었다. 일상적인 검사 및 거부 등급화를 위해 H&E 염색을 수행하였다. 이식편 침윤 T 세포를 다클론 항-CD3 (Dako) 염색으로 평가하였다. 이식편의 전체 슬라이드를 Aperio ScanScope XT(Aperio Technologies, Inc., Vista, CA)로 스캔하였다.
통계 분석
실험 결과를 GraphPad Prism (GraphPad Software 7.0, San Diego, CA)으로 분석하였다. 이식편 생존의 차이에 대한 로그 순위법 시험 및 스튜던트 t-테스트 또는 Mann-Whitney U 테스트를 다른 데이터에 사용하였다. 모든 데이터는 평균±SD로서 제시하였다. 0.05 미만인 p 값을 통계적으로 유의미한 것으로 여겼다.
결과
조직학적 분석(도 18c 및 18d (100x 배율) 및 도 19c 및 19d (600x 배율)는 배양 후 흉선에서 감소된 Ki67+, CD3+ 세포를 보여주었고, 이는 환자에게 사용된 흉선 조직의 배양 후에 보이는 변화(Markert ML, et al., 2008), "Use of allograft biopsies to assess thymopoiesis after thymus transplantation." J Immunol 180(9):6354-6364)와 유사하다. 배양된 사람 흉선에서처럼, 흉선 상피 세포(TEC)의 망상조직이 사이토케라틴(CK) 염색에 기초하여 래트 배양된 흉선 조직에서 보존되었다 (도 18b (100x 배율) 및 도 19b (600x 배율).
예측한 대로, DA MHC를 발현하지 않는 수혜자-유래 T 세포가 흉선 임플란트 수혜자의 말초 혈액에서 나타났다(도 21). CTT의 임플란테이션 후, 점증적으로 재군집하는 수혜자-유형 T 세포가 도 21의 제26 일, 제55 일, 제97 일 및 제253 일에서 하단 우측 사분면에서 보인다.
생착된 동종 흉선 조직의 면역조직화학적 분석
T 세포 고갈 및 흉선 및 심장 이식 후 순환 T 세포 재군집을 도 23에 묘사한다. 모든 동물은 T 세포 고갈 후 순환 T 세포의 극적 감소를 보여주었다. CTT 삽입(청색/점선)을 갖는 심장 동종이계이식편 수혜자는 순환 T 세포의 점진적 재군집을 보여주었다. CTT 삽입이 없는 동물은 또한 어느 정도의 순환 T 세포(적색/점선)를 보여주었다. 그러나, 나이브 및 최근 흉선 이주자 CD4 및 CD8 T 세포가 CTT 삽입을 갖는 동물에서 상당히 증가하였고(p<0.01), 반면에 대조 동물은 순환 나이브 CD4 및 CD8 T 세포도 RTE CD4 및 CD8 T 세포도 보여주지 않았다.
임플란테이션 후 8.5 개월 후에 외식된 임플란팅된 흉선은 네이티브 흉선과 유사하게 양성 사이토케라틴 염색(도 22a) 뿐만 아니라 T 세포 염색을 보여주었다 (도 22b). 원래 배율 x400.
CTT 삽입을 갖는 동물은 말초 혈액에서 나이브 (CD62L+CD45RC+) CD4 및 CD8 T 세포 뿐만 아니라 최근 흉선 이주자(RTE) T 세포의 상당히 증가된 재군집을 보여주었고, 반면에 흉선 임플란테이션이 없는 대조 그룹은 낮은 수준의 순환 나이브 CD4 및 CD8 T 세포를 보여주었고 순환 RTE CD4 및 CD8 T 세포를 보여주지 않았다(도 23). 총 순환 CD3 T 세포 수는 임플란테이션 전에는 그룹 간에 그다지 상이하지 않았다. 예상 대로, CTT 임플란트를 갖는 LW 수혜자는 CTT의 임플란테이션이 없는 대조 동물과 비교해서 상당히 증가된 수의 순환 CD4 및 CD8 T 세포를 보여주었다(도 23).
심장 동종이계이식편 수혜자의 수혜자에서 제180 일에 신 피막 아래의 생착된 배양된 흉선 조직을 도 24에서 묘사한다.
조직학은 신 조직으로부터 분리된 개별 구조들을 보여주었다(원래 배율, x20). 생착된 배양된 흉선 조직은 정상 흉선 구조(H&E), 생존가능 T 세포(CD3), T 세포 증식(Ki67), 및 상피세포 상에 레이스 모양 패턴(사이토케라틴)을 갖는 해살 소체 형성(검정색 화살표)을 보여주었고, 흉선세포생성과 함께 흉선의 생존능을 확증한다(도 24b). 원래 배율, x200. (데이터는 평균±SD로서 제시된다; n = 그룹 당 8 - 9 마리 동물; 스튜던트 t-테스트, *P<0.05; **P< 0.01; ***P<0.001, ****P<0.0001; NS, 유의미하지 않음 (p>0.05).
추가로, 제180 일에 외식된 임플란팅된 CTT의 면역조직학적 분석은 CTT의 수술적 삽입으로부터 정상적인 흉선 조직학, 생존가능 T 세포(CD3), T 세포 증식(Ki67), 및 TEC 상에 해살 소체 형성(화살표)과 함께 CK의 레이스모양 패턴을 보여주었다(도 24b). 이들 관찰은 동종 심장 이식을 받은 동물에서 이식된 흉선의 생존능 및 기능(흉선세포생성)을 확증하였다.
종합해 보면, CTT가 이식된 래트는 심장 동종이계이식편 수혜자에서 나이브 T 세포 발달과 함께 흉선세포생성을 입증하였다.
T 세포가 DA 뿐만 아니라 LW를 발현하는 CTT에서 발달하였기 때문에 DA 기증자에 반응성인 T 세포가 발달하지 않을 것이라고 예상하였다.
DA 심장을 거부 증거에 대해 평가하였다. 도 25는 면역억제 치료를 받지 않은 DA 심장 이식물을 갖는 LW 래트가 10 일 이내에 DA 심장 이식편을 거부한다는 것을 보여주었다(DA 대조군, 속빈 정사각형). 그러나, RTE (CD90+CD45RC+) T 세포를 발달시킨 후조차도, 수술적으로 삽입된 CTT를 가지는 LW 수혜자는 DA 심장 동종이계이식편을 거부하지 않았다(박동 정지가 없음)(n = 8, 속찬 삼각형). 예상 밖으로, CTT 삽입이 없는 LW 대조 동물은 또한 DA 심장 이식편을 거부하지 않았다(n=9, 속찬 역삼각형). 두 그룹 모두 전체 연구 기간 동안에(제180일) 좋은 박동 질을 보여주었다. 연속 이식편 박동이 반드시 거부 부재를 암시하지는 않기 때문에, 2 마리 수혜자 래트를 면역억제 중지 후 2 개월에(즉, 제3자 BN 경추 심장 이식 전에) 희생시켜서 거부가 없다는 것을 확증하였다. 두 동물 모두로부터 외식된 심장 동종이계이식편(DA 심장)은 최소의 단핵 세포 침윤을 보여주었고(도 26a, CTT 삽입이 있음; 및 도 26b, CTT 삽입이 없음), 2004 International Society for Heart & Lung Transplantation(ISHLT) 등급화에 의한 거부 징후가 없다(도 26c).
Kaplan-Meier 생존 곡선(도 25)은 면역억제가 없는 DA 심장 이식물을 갖는 LW 래트(DA 대조군)와 비교해서 CTT가 있는 또는 없는 동물 및 동종동계 대조군(LW 래트에 LW 심장 이식)로부터 상당히 연장된 이식편 생존을 보여주었다. CTT가 있는 동물 및 CTT가 없는 동물로부터 제180 일에 외식된 이식편의 대표 스캔된 이미지를 도 26a 및 26b에서 보여준다. 이미지들은 전체 슬라이드 스캔으로부터 각색되었다.
ISHLT 등급화는 CTT가 있는 수혜자 대 CTT가 없는 수혜자로부터의 심장 동종이계이식편 간에 거부 등급화의 차이를 보여주지 않았다(n = 그룹 당 3-4 마리) (도 26c). Mann-Whiney U 테스트, *P<0.05; NS, 유의미하지 않음 (p>0.05).
CTT 후 나이브 T 세포의 재구성에 기초해서, 본 발명자들은 CTT를 갖는 동물은 그들의 기증자-반응성 T 세포 레퍼토리를 잃었고, 한편으로 흉선 임플란테이션이 없는 동물은 그들의 T 세포 군집을 완전히 재구성하지 않았다(일반적 저반응성)고 믿는다.
제3자 혈관화된 심장 이식에 대한 동종이계반응성
일반적 저반응성과 반대로 기증자-특이적 무반응성(관용)이 달성되었다는 것을 확증하기 위해서, 추가의 완전 MHC 불일치된 BN 심장 이식을 DA 심장 이식 후 6 내지 7 개월(제180 일 내지 제210 일)에 두 동물 그룹 모두에서 수행하였다.
삽입된 CTT를 갖는 LW 래트(속찬 삼각형. 도 27)는 제3자 BN 심장을 신속하게 거부하였다(이식편 박동의 중지)(n = 5, 중앙 생존 시간(MST) = 10±1.0 일). 그러나, 삽입된 CTT가 없는 대조 LW 동물은 아마도 동종이계반응성 T 세포의 결여 때문에 제3자 심장을 거부하지 않았다(n = 6, MST ≤ 38.5±8.9 일).
이러한 제3자 심장 거부 결여에 따라서, 조직학적 분석은 삽입된 CTT를 갖는 동물(속찬 역삼각형, 도 27)이 심장 동종이계이식편에서 증가된 단핵 세포 침윤을 보여주지만(도 28a), 삽입된 CTT가 없는 동물은 본래의 BN 심장 동종이계이식편을 보여준다(도 28b)는 것을 확증하였다. CTT를 갖는 수혜자는 BN 심장을 신속하게 거부하였고(MST=10±1.0 일)(속찬 정사각형, 도 29), 반면에 CTT가 없는 수혜자는 제3자 BN 심장을 거부하지 않았다(점선 삼각형, 도 29). BN 대조군(속찬 원, 도 29)은 LW 래트에 의한 BN 심장의 거부를 보여준다. 동종동계 대조군(속빈 원, 도 29)은 LW 래트에 의한 LW 심장의 거부가 없음을 보여준다. Kaplan-Meier 생존 곡선(도 27)은 이식편 생존에서 유의미한 차이를 보여주었다. 거부 시에 또는 이식 후 46 일 후에 외식된 BN 심장 이식편의 대표 스캔된 이미지를 각각 도 28a 및 28b에서 보여준다. 삽입된 CTT를 갖는 동물로부터의 BN 심장 이식편은 심각한 단핵 세포 침윤을 보여주었고(도 28a), 반면에 삽입된 CTT가 없는 BN 심장 이식편은 거부 징후를 보여주지 않았다(도 28b). 이미지들은 전체 슬라이드 스캔으로부터 각색되었다.
삽입된 CTT를 갖는 래트로부터의 외식된 BN 심장의 조직학적 분석(ISHLT 등급화)(속찬 정사각형, 도 29)은 동종동계 대조군 또는 삽입된 CTT가 없는 래트와 비교해서 상당히 증가된 염증 세포 침윤을 갖는 등급 3R 거부를 보여주었다(빗금 친 삼각형, 도 29). ISHLT 등급화는 CTT가 없는 동물로부터의 BN 심장과 비교해서 CTT를 갖는 동물로부터의 BN 심장으로부터 상당히 더 높은 거부 등급화를 보여주었다(n = 그룹 당 3-5 마리). Mann-Whiney U 테스트, *P<0.05; **P<0.01; NS, 유의미하지 않음 (p>0.05).
또한, 삽입된 CTT를 갖는 수혜자에서 경추 BN 심장이 크게 확대되었고(도 30a), 반면에 복부 DA 심장은 네이티브 심장보다 더 작았다(도 30a)는 것은 주목할 만하다. 삽입된 CTT가 없는 수혜자로부터의 BN 심장은 CTT를 갖는 수혜자로부터의 BN 심장과 비교해서 크기 증가를 전혀 보여주지 않았다(도 30b).
제3자 심장에서는 일어나지만 CTT의 DA MHC를 공유한 DA 심장에서는 일어나지 않는 선택적 T 세포 침윤
두 통상적 방법을 사용해서 이 래트 심장 이식 모델에서 이식편 거부를 정의하였다: 심장 박동/중지 측정 및 ISHLT 사람 등급화 시스템. 전자는 저등급 거부에 관해서 불감성이고, 반면에 후자는 고등급 거부에 관해서 불감성이다. 따라서, 염증 세포 침윤은 제180 일에 3 마리 래트로부터의 DA 심장에서 및 5 마리 래트에서 7 내지 8 개월에 희생 시의 BN 심장에서 측정하였다. 따라서 염증 세포 침윤은 제180 일에 3 마리 래트로부터의 DA 심장에서 및 5 마리 래트에서 7 내지 8 개월에 희생 시의 BN 심장에서 측정되었다.
T 세포 고갈, CTT의 수술적 삽입, 및 4 개월 동안 투여된 CsA로 처리된 래트는 T 세포 재군집 후 DA 심장에서 증가된 수준의 염증 세포 침윤을 보여주지 않았다(도 31a). DA 대조 이식편(면역억제가 없는 LW 래트에서)은 CTT를 갖거나 또는 CTT가 없는 래트에서의 DA 심장에서 면역 세포의 침윤과 비교해서 DA 심장에서 면역 세포의 상당히 증가된 이식편 침윤을 보여주었다. CTT가 삽입된 동물은 제3자 심장 동종이계이식편 (BN 심장)에서 거대한 염증 세포 침윤을 보여주었다(도 31b). CTT를 갖는 수혜자로부터의 BN 대조 이식편(면역억제가 없는 LW 래트) 및 BN 이식편은 CTT가 없는 동물로부터의 BN 이식편에서의 염증 세포 침윤과 비교해서 상당히 상승된 염증 세포 침윤을 보여주었다. CTT가 삽입되지 않은 래트는 그들의 면역부적격성 때문에 BN 심장에서 침윤을 보여주지 않았다(도 31b, 빗금 친 삼각형).
T 세포 침윤은 면역조직화학으로 평가하였고, CTT가 삽입된 동물의 BN 심장(우측 패널, 도 31c)에서는 일어나지만 DA 심장(중간 패널, 도 31c)에서는 일어나지 않는 선택적 T 세포 침윤, 및 삽입된 CTT가 없는 동물의 두 심장 모두에서 T 세포 침윤의 결여(도 31d)를 확증하였다. DA 및 BN 래트로부터의 심장 동종이계이식편을 BN 심장 거부 시에 네이티브 심장과 함께 수확하였다. 총체적으로, 네이티브 심장 및 DA 심장 (POD 196)은 T 세포의 극적 증가를 보여주지 않았고, 반면에 BN 심장 (POD14)은 삽입된 CTT를 갖는 수혜자에서 거대한 양의 T 세포를 보여주었다. 이미지는 전체 슬라이드 스캔으로부터 각색되었다. 그룹 당 총 3-5 마리 동물을 분석하였다: 스튜던트 t-테스트, *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001, ****P<0.0001; NS, 유의미하지 않음(p>0.05).
이들 데이터는 CTT를 받은 그룹의 경우에는 T 세포 침윤이 제3자 BN 이식편에서만 일어나고, 임플란팅된 흉선과 함께 MHC(DA)를 공유하는 이식편에서는 아마도 (DA 심장) 기증자 항원에 대한 T 세포 레퍼토리의 결여(음성 선택에 의해) 때문에 일어나지 않는다는 것을 확증한다.
흉선 임플란테이션 후 기증자 항원에 대한 체액성 반응
LWxDA 이식물 및 CTT의 수술적 삽입이 뒤따른 흉선절제된 LW 래트에서 언급된 동종 T 세포 무반응성이 기증자 DA MHC에 대한 체액성 관용과 관련되었는지를 결정하기 위해서 항-기증자 항체 반응을 평가하였다. 연속적으로 수집된 수혜자 혈청 샘플을 수집하였고, DA 및 BN 래트로부터의 PBMC와의 유동 교차일치를 수행하였다. 면역억제 없이 DA 또는 BN 심장 이식물을 받은 동물은 그들의 기증자(각각 DA 또는 BN)에 대한 항체를 발달시켰다. 동종동계 심장 동종이계이식편을 갖는 동물은 도 32a(좌측 칸의 수평으로 빗금 친 피크, DA는 위, BN은 아래))에서 보고된 바와 같이 DA 또는 BN MHC에 대한 항체를 생성하지 않았다. T 세포 유동 교차일치에 의해 측정되는 이식물 후 기증자-특이적 동종항체(항-DA 및 항-BN 항체)의 대표 히스토그램 플롯을 도 32a에서 보여준다. CTT를 갖거나 또는 CTT가 없는 수혜자는 DA 항원에 대해 항체를 전혀 생성하지 않았고(도 32a에서 윗줄, 중간 및 우측 칸), 반면에 CTT를 갖는 동물은 BN 항원에 대해서 항체를 생성할 수 있었다(아랫 줄, 중간 패널, 도 32a). 면역억제가 없는 DA 심장 이식의 수혜자 및 면역억제가 없는 BN 심장 이식의 LW 수혜자로부터의 혈청 샘플을 각각 항-DA(윗줄, 좌측 패널, 굵은 선 또는 항-BN 항체(아랫줄, 좌측 패널, 점선)의 양성 대조군(DA 대조군 및 BN 대조군)으로서 사용하였다.
흥미롭게도, T 세포 저반응성과 마찬가지로, 항-DA Ab가 CTT를 갖거나 또는 CTT가 없는 동물에서는 검출되지 않았다(도 32b). 항-BN Ab가 삽입된 CTT를 갖는 LWxDA를 갖는 동물에서는 쉽게 검출되었지만, 삽입된 CTT가 없는 동물에서는 검출되지 않았고, p<0.01 (도 32c). CTT가 없는 동물은 일반적으로 면역결핍이었다. CTT를 갖는 동물은 DA에 대해 특이적 관용을 가졌다.
종합해 보면, 흉선 동시이식은 기증자 흉선에서 발현되는 동종 DA MHC에 대한 특이적 관용을 초래하였고, 따라서 두 기증자-특이적 항-DA T 세포 레퍼토리의 발달의 방지 뿐만 아니라 기증자(DA)-특이적 체액성 반응의 방지를 통해 DA 심장 이식물의 장기간 생존을 초래하였다. 이들 래트에서 제3자 BN 심장의 신속한 거부 뿐만 아니라 BN 기증자 세포에 대한 동종항체 반응에 의해 면역적격성이 입증되었다.
위에서 기술된 치료의 추가 지원은 디죠지 기형 환자의 임상적 경험으로부터 추론될 수 있다.
환자 1은 완전형 디죠지 기형을 가지고 태어난 어린이이다. 그는 출생 시에는 T 세포를 가지지 않았다. 환자 1의 주된 문제는 저칼슘혈증으로 많은 입원을 초래하는 극심한 부갑상선기능저하증이었다. 환자 1에게 배양된 흉선 조직 이식물 (CTT) 및 부모의 부갑상선샘 이식물 둘 모두를 동일한 날에 제공하였다. 3명의 다른 환자에게는 흉선 뿐만 아니라 부모의 부갑상선을 작은 임상 시험으로 제공하였다. 환자 1은 생후 4 개월에 두 이식물을 수혜받았다. 환자 1은 T 세포를 갖지 않지만, 환자 1에게 프로토콜에 따라서 이식 전에 면역억제를 위해 RATGAM을 제공하였다. 다른 면역억제는 제공하지 않았다. 환자 1은 나이브 T 세포 및 미토겐에 대한 정상적 증식성 T 세포 반응을 발생하였다. 시험에서 흉선 및 부갑상선 둘 모두를 받은 4 명 환자 모두가 정상적 부갑상선 호르몬 수준을 발생하였다. 환자 1은 칼슘 보충을 장기간(10 년) 끊을 수 있는 유일한 대상체였다. 나머지 3 명 환자 중에서, 한 명은 폐 문제로 1 년이 되기 전에 사망하였고, 완전형 디죠지 기형을 갖는 다른 2 명은 대략 1 년까지 칼슘 보충을 다시 받아야 했다. 환자 1은 모든 시점에서 부모의 부갑상선 기증자에 대해 음성 혼합 림프구 반응(MLR)을 가지는 유일한 대상체였다. 나머지 3 명 대상체는 그들의 첫 검정부터 시작해서 양성 MLR을 가졌다.
부갑상선 기능을 유지하는 환자 1에 대한 가능한 설명은 환자 1의 부갑상선 기증자가 수혜자 HLA-Class II 대립유전자(하기 표 9에서 "*") 또는 흉선 기증자 HLA-Class II 대립유전자(하기 표 9에서 "
Figure pct00011
" )와 일치하는 HLA-Class II 대립유전자를 가졌다는 것이다.
환자 1에서 CLP가 흉선샘에서 흉선세포로 발달하였다.
환자 1로부터의 수지상 세포가 흉선으로 이동하고, 환자 1 DC 상에서 MHC와 단단히 결합하는 T 세포를 고갈시킨다. 하기 표 9에서 "*" 표시된 대립유전자에 대한 관용이 있다.
흉선 기증자 흉선 상피 세포는 또한 그들(하기 표 9에서 "
Figure pct00012
"로 표시됨)과 단단히 결합한 흉선세포를 고갈시킨다. 이것은 하기 표 9에서 "
Figure pct00013
"로 표시된 대립유전자에 대한 관용의 메카니즘이다.
Figure pct00014
주목할 것은, 수혜자와도 일치하지 않고 흉선 기증자와도 일치하지 않은 부갑상선 기증자에 1개 HLA-B 및 1 개 HLA-C 대립유전자가 있다는 것을 알 수 있다. 본 발명자들은 부갑상선샘이 거부되지 않은 이유를 이해하지 못하였다. 그러나, 10 년이 지난 후, 어린이에게 홍역/볼거리/풍진 생백신을 제공하였다. 부갑상선 기능은 2 주 내에 파괴되었고, 환자 1은 칼슘 보충을 다시 받았다.
본 발명자들은 생백신이 환자 1에서 CD8 T 세포를 활성화하였다는 결론을 내린다. CD8 T 세포의 1/3은 고유 동종이계반응성을 가진다. 동종이계반응성 CD8 T 세포는 부갑상선 기증자에서의 불일치된 HLA-B 및 C 대립유전자에 대해 반응하였다 (표 9에서 큰 굵은 HLA-B 및 HLA-C 대립유전자).
이 환자로부터 얻은 데이터를 이용해서, HLA-Class I 및 HLA-Class II 둘 모두의 일치가 장기간 관용을 유도하는 데 필요하다는 것이 분명하다. 환자가 DPB1*0402를 발현하기 때문에, 수혜자는 부갑상선 기증자에서의 DPB1*04:02 대립유전자에 대해 관용을 가졌다. 환자의 수지상 세포는 흉선으로 가서, DPB1*0402와 너무 단단하게 결합한 임의의 세포를 고갈시켰다. DQA1 대립유전자 DQA1*05:05/08이 흉선에서 발현되기 때문에, 수혜자는 부갑상선을 거부하지 않았다. 아마도 DQA1*01:02 대립유전자는 어머니로부터 환자에게 유전되었을 것이고, 따라서 어린이가 그 특이성을 관용하였을 것이다. 어린이는 부갑상선 기증자에서의 DRB!*11:04 대립유전자에 대해서는 반응하지 않았고, 그 이유는 그것이 어머니의 111:01 대립유전자와 매우 밀접한 관련이 있었기 때문이다. Class I, B*35:03 및 C*04:01 대립유전자에 관해서, 흉선은 그들 대립유전자에 대해 반응성인 흉선세포를 고갈시키지 않았고, 그 이유는 그들이 수혜자에서도 흉선 기증자에서도 발현되지 않았기 때문이다. 임플란트를 받은 후 10 년 후에, 어린이는 MMR 백신을 받았다. 홍역은 매우 강한 자극이다. 순환 T 세포의 대략 1/3이 고유 동종이계반응성을 가진다. 수혜자 CD8 T 세포가 홍역 백신에 노출되었을 때, 그들은 부갑상선에 대해 반응하였고 그것을 빠르게 파괴하였다. 이 환자의 경과는 고형 장기 수혜자에서 Class I 및 Class II 대립유전자 둘 모두가 그들이 고형 장기를 관용하기 위해서는 수혜자에서 또는 흉선 기증자에서 발현되어야 한다는 것을 보여준다. 이 어린이는 잘 자라고 있고, 좋은 T 세포 수 및 기능 및 정상 면역글로불린 수준을 가진다. 그러나, 환자 1은 부모의 부갑상선이 거부되었기 때문에 여전히 칼슘 보충을 받고 있다.
실시예 6. 신선하게 배양된 NHP 흉선 조직의 아키텍처 및 생존능 평가
배양된 흉선 조직 임플란테이션(CTT) 플랫폼을 비사람 영장류(NHP)에서 발달시키기 위해서, NHP 기증자 흉선을 잘라내어 배양하고, 정상 조직 외관 및 구조에 대해 평가한다.
방법
흉선을 붉은털 원숭이 NHP로부터 제한적 상부 흉골절개술을 통해 수술적으로 절제하고, 슬라이싱하고, 본원에서 위에서 기술된 확립된 소아 기술과 동일하게 배양하였다. 실험 및 조직 사정 목적으로 두 항체 패널을 개발하였다. CD3, CD4, CD8, CD28, CD31, CD45RA, 및 CD197을 포함하는 1 개 패널은 유동 세포 분석을 통해 혈액에 최근 흉선 이주자(RTE) 및 나이브 T 세포의 존재를 사정하는 데 사용된다. AE1/AE3 (판-사이토케라틴), 사이토케라틴(CK) 14, Ki-67 (증식), CD3 (T-세포 함량), 및 CCL21 (케모카인 생성)을 포함하는 제2 항체 패널은 수확된 신선한 흉선, 배양된 흉선, 및 본원에서 위에서 및 아래 실시예 8 및 9에서 기술되는 바와 같이 얻은 흉선 이식편 생검의 면역조직화학적(IHC) 사정에 사용된다. 신선한 NHP 흉선에 대한 IHC 항체 패널을 수행하여 조직의 적절성을 실증한다. 본원에서 위에서 기술된 바와 같은 임상 샘플에 대해 확립된 로트 출하 척도가 대퇴근에 임플란테이션하기 전의 배양된 흉선 조직에 사용된다. 도 33a-j에서 보여주는 바와 같은 그래프팅된 흉선 조직의 생검에 대한 평가는 또한 임상 샘플에 대해 확립된 척도를 사용한다.
결과
도 33a-e에서 보여주는 바와 같이, 신선한 NHP 흉선 절편은 신선한 사람 흉선 절편과 밀접하게 유사하다. 도 33a는 정상 NHP 흉선 형태학을 보여준다: 조밀하게 쌓인 피질 흉선세포가 중심 수질과 함께 보이고, 덜 조밀하게 쌓인 것은 중심에 해살 소체와 함께 보였다. 도 33b는 흉선 전체에 걸쳐서 T 세포 상의 CD3 염색을 보여준다. 생존가능 T 세포가 갈색 고리로서 나타난다. 도 33c는 주로 수질에서 레이스 모양 넓은 구역으로서 보이는 사이토케라틴 및 해살 소체를 보여준다. 사이토케라틴은 너무 많은 흉선세포가 있기 때문에 신선한 흉선의 피질에서는 보이지 않는다. 도 33d는 피질에서 Ki-67 항원을 반영하는 갈색 염색을 보여준다. Ki-67 분자는 핵 증식을 지시한다. 이 패널은 복제하는 흉선세포의 고전적 외관을 피질 내에서 보여주고 수질에서는 거의 보여주지 않는다. 도 33e는 CK14를 피질에서 보여주고 수질에서는 덜 보여준다. 12 일의 배양 후에 도 33f-j에서의 염색은 도 33a-e에서의 염색과 극적으로 상이하고, 시험관내 배양 후에 사람 샘플에서의 발견과 현저하게 유사하다. 도 33f는 흉선세포의 극적 소실을 보여주고, 생존가능 흉선 상피 세포가 보유된다. 도 33g는 T 세포(CD3+)의 현저한 고갈을 입증한다. 표적화된 항원은 CD3 엡실론이고, 이것은 T 세포 죽음 후에도 여전히 꽤 안정하다. 죽은 T 세포는 세포 표면 상에만이 아니라 전체에 걸쳐서 CD3 염색을 가진다(이것은 이미지에서 고리로서 나타난다). 그 절편에는 약간의 생존가능 T 세포가 있지만, 수확 당일과 비교해서 매우 적다. 도 33h는 AE1/AE3 사이토케라틴 항체로 염색된다. 사이토케라틴-양성 상피세포는 정상 핵과 생존가능하다. 그들은 매우 적은 T 세포가 흉선에 남아 있기 때문에 부분적으로 응축된다. 도 33i는 Ki-67로 염색된다. 이 절편에는 증식성 흉선세포가 본질적으로 없다. 피질 흉선세포는 거의 죽었다. 도 33j는 생존가능 CK14-양성 상피세포를 가진다. 이들 상피세포는 그들 사이에 공간을 가져서 CTT 후 골수로부터 도달할 흉선 전구체를 초기에 둘러싼다. 12 일의 배양은 임상 CTT에 사용되는 범위(12-21 일) 내이다.
실시예 7. 동결보존된 NHP 흉선 조직의 아키텍처 및 생존능 평가.
백업(backup) 흉선 조직을 제공하기 위해, 배양된 흉선 조직에 대한 관용 유도의 임상적 응용을 위해 동결보존이 필요하다. 배양된 흉선의 대략 절반이 이식후 거부 또는 심장 거부 에피소드를 반전시키는 데 사용되는 높은 용량 스테로이드(들)에 의해 CTT의 손상의 경우에 추후 사용을 위해 동결보존된다.
방법
동결보존을 위해, NHP 흉선 조직을 실시예 6에 기술된 바와 같이 배양한다. 12일의 배양 후, NHP 흉선 조직을 관련 분야의 표준 방법에 따라서 동결보존한다. 도 34a-p에서 보여주는 실험에서는 조직이 35 일 동안 동결보존되었지만, 동결보존되는 시간은 수 년으로까지 연장될 수 있다. 이 실험에서는 그 다음에 동결보존된 조직을 해동하고, 포르말린으로 고정하고, 파라핀으로 포매한다. 면역조직화학은 실시예 6에서와 동일한 항체 패널을 사용하여 수행하였다.
결과
도 34a-p에서 보여주는 데이터는 12 일 동안 배양된 조직(프로토콜에 따라서 허용된 최소 일수; 도 34c, 도 34g, 도 34k, 및 도 34o에서 보여줌)과 12 일 동안 배양된 다음에 35 일 동안 동결보존된 조직(도 34d, 도 34h, 도 34l, 및 도 34p에서 보여줌) 간의 중요한 비교를 강조한다. 도 34c에서의 사이토케라틴과 도 34d에서의 사이토케라틴의 비교는 도 34c가 도 34d보다 더 많은 레이스 모양 패턴을 입증하고, 도 34d에서의 사이토케라틴이 약간 응축된다는 것을 보여준다. 도 34g 및 34h에서 CK14 사이토케라틴 염색은 꽤 유사하다. 도 34k 및 도 34l에서 CD3 염색은 또한 매우 유사하다. Ki-67 염색은 도 34o 및 도 34p 둘 모두에서 존재하지 않고, 이는 도면 33i에서의 발견과 일관된다. 12 일 동안 배양된 흉선 조직 및 동결보존된 흉선 조직 둘 모두가 임상 샘플의 로트 출하 척도를 충족시켰다.
실시예 8. 무-CMV NHP 모델에서 배양된 흉선 조직의 성공적 생착의 사정
이들 실험은 이식된 심장의 관용을 확립하고 진행 중인 면역억제 약물의 필요 없이 장기간 무거부 이식편 생존을 달성하는 목표로 NHP(붉은털 원숭이) 모델에서 심장 이식물 및 CTT를 수행하는 것을 포함한다. 동물들은 최대로 불일치될 것이다.
방법
실험의 개요로서, 최대로 MHC-불일치된 무-CMV 붉은털 원숭이를 사용한다. 수혜자 동물(Y)은 완전한 흉선절제술을 받는다. 기증자 동물(X)은 배양된 흉선 조직 및 수혜자 Y에게 이소성 위치에 거치되는 심장 둘 모두를 기증한다(제1 Tx 및 제2 Tx). 그 다음에 면역억제 약물을 회수하고, 기증자-특이적 관용이 i) 기증자 심장의 계속된 박동, ii) 제3자에 대한 반응성과 함께 MLR에서 기증자에 대한 관용 및 iii) 제3자 기증자 동물 Z(제3 Tx)로부터 피부 이식물의 거부에 의해 입증된다.
모든 실험 NHP는 수컷이다. 흔히 사용되는 항바이러스 예방 약물이 흉선세포생성에 지장을 줄 가능성을 고려해 볼 때, University of California at Davis에서 특이적 무병원균 집락에서 자란 CMV 혈청음성 NHP가 사용된다. 비사람 영장류 이식물 연구에 관여한 Duke의 다른 연구자들의 경험에 기초해서, 의미 있는 분석이 3 마리 수혜자 동물로부터 얻을 수 있다. 이 적은 수는 관용이 (기술적 어려움을 제외하고는) 모든 수혜자 동물에 존재해야 하기 때문이다.
이식 전 대략 1 개월 전에, 수혜자 동물은 궁극적인 기증자 흉선 이식물의 제조에서 부분 흉골절개를 통해 완전한 흉선절제술을 받는다. 수혜자의 T 세포가 붉은털 원숭이-특이적 항-흉선세포 글로불린(rhATG)으로 고갈된다. 동물은 완전히 회복되고, RTE가 말초 혈액에서 더 이상 검출가능하지 않을 때까지(2-3 주로 추산됨) 매주 유동 세포 분석을 받고, 따라서 완전한 네이티브 흉선절제술을 지시한다. 유동 세포 분석 패널은 CD3+, CD4+CD45+CD28+CD95-, 및 CD31+인 CD4+ RTE를 확인한다. 도 36에서 보여주는 바와 같은 게이팅 전략을 참고한다. 전형적인 실험 프로토콜에 대해서는 다음 참고문헌을 참조한다: Markert ML, Sarzotti M, Ozaki DA, Sempowski GD, Rhein ME, Hale LP, et al. Thymic transplantation in complete DiGeorge syndrome: Immunologic and safety evaluation in twelve patients. Blood. 2003;102: 1121-1130, Markert ML, Alexieff MJ, Li J, Sarzotti M, Ozaki DA, Devlin BH, et al. Postnatal thymus transplantation with immunosuppression as treatment for DiGeorge syndrome. Blood. 2004; 104: 2574-2581, Markert ML, Devlin BH, McCarthy EA. Thymus transplantation. Clin Immunol. 2010; 135: 236-246.
MAMU A01을 담지하는 수혜자 동물이 선택되었고, 그 이유는 유동 세포 분석을 위한 대립유전자에 대한 항체가 있어서 수혜자 기원의 RTE의 용이한 구별을 허용하기 때문이다. 기증자는 수혜자에서 초기 흉선절제술이 완전하지 않을 때를 제외하고는 MAMU A01을 발현하지 않을 것이고; 그 다음에, 원래 수혜자는 기증자가 될 것이고, 원래 기증자는 수혜자가 될 것이다.
제1 기: 실시예 8에서 수행되는 실험의 상세한 개요 및 시각표에 대해서는 도 38을 참고한다.
기증자 NHP(MAMU -A:01 음성 및 수혜자 NHP(MAMU -A:01 양성)로부터의 혈액을 유동 세포 분석에 의해 시험하고, CBC 감별 (CBC diff), 혈액 화학 및 CMV 수준을 결정한다. 유사한 시험이 대조 NHP에서 수행될 것이다. 기증자 및 수혜자가 제1 기에서는 서로에 대해 양성 혼합 림프구 반응(MLR)을 가진다는 것을 확증한 후, 기증자 NHP는 흉선 조직 및 나증에 심장 둘 모두를 단일의 수혜자에게 기증한다(아래에서 기술되는 제4 기를 참고한다).
제2 기: 제2 기의 제1 주 제3 일에 수혜자 NHP에 대해 흉선절제술을 수행하고, 수혜자 NHP 흉선을 본 명세서에서 다른 곳에서 기술되는 바와 같이 12 일 동안 배양한다. 그 다음에 수혜자 CTT를 배양 제12 일에 동결보존한다.
제2 기 동안, 수혜자의 CMV 수준을 매주 결정한다. 저장을 위해 DSA (2 ml) 혈액 샘플을 제2 주에 채취한다. CBC diff를 제3 주의 제1 일에 수혜자 NHP에서 측정한다. 유동 세포 분석은 매주 기증자 NHP에서 수혜자가 RTE를 보여주지 않을 때까지 수행한다. 수혜자 NHP에서의 유동 세포 분석은 제2 기 제3 주 제1 일에 수행하여 수혜자 NHP에서 RTE 3을 보여주지 않는다. RTE에 대해 양성이면, 유동 세포 분석을 필요하다면 제4 주 및 제5 주에서 계속한다. CBC, 수준 CMV를 기증자 NHP에서 동시에 결정한다. 매주 CBC 감별, CMC 수준 및 유동 세포 분석을 또한 수혜자 NHP가 RTE를 가지지 않을 때까지 모니터링한다. RTE가 발견되지 않을 때, 실험은 제3 기로 진행한다.
수혜자가 계속 최근 흉선 이주자(RTE)를 입증하기 때문에 흉선절제술이 불충분한 경우에는, NHP가 불완전한 흉선절제술을 가지는 것으로 여겨질 것이다. 그 다음에 수혜자 및 기증자를 바꿀 것이고, 기증자는 MAMU -A:01 양성이고 수혜자는 MAMU -A:01 음성이다. CMV 수준을 제2 기에서 대조 NHP에서 모니터링한다.
제3 기: 제3 기는 제3 기의 제1 주 제1 일에 시작해서 12 hr마다 타크롤리무스를 수혜자 NHP에게 투여하면서 시작한다. 제3 일에, 흉선절제술을 기증자에 대해 수행한다. 제거된 기증자 흉선은 본 명세서 및 이전 실시예에서 다른 곳에서 기술된 바와 같이 12 일의 기간 동안 배양되고, 이 때 반은 동결보존된다. 나머지 반은 제21 일까지 배양되어 제3 기에서 배양 제12 일 내지 제21 일 중 어느 날에라도 수혜자의 네갈래근에 임플란팅될 수 있다.
요약하면, 수혜자는 네갈래근에 배양된 기증자 흉선 조직 임플란테이션 (및 그 다음에 심장 이식) 전 대략 1 내지 2 개월 전에 네이티브 흉선절제술을 받는다. 말초 혈액에서 최근 흉선 이주자(RTE)의 결여에 의해 흉선절제술이 완전한지 확증해야 한다. 수혜자의 면역억제 약물치료를 궁극적으로는 (CD4 나이브 T 세포가 15% 이상인 후에) 완전히 철회하고, 기증자-특이적 관용을 제3자 MLR 및 피부 이식물을 사용하여 입증하고, 이는 흉선 및 심장 기증자 동물로부터의 조직의 특이적 관용의 상황에서 제3자 기증자 조직에 대한 면역적격성을 입증해야 한다.
화학, CMV 수준을 기증자 NHP에서 제3 기 전체에 걸쳐서 비생존 심장 이식물이 제4 기에서 일어날 때까지 측정한다. CBC diff, CMC 수준, 및 혈액 화학을 수혜자 NHP에서 제3 기의 제1 주에 수행한다. 혈액 샘플을 저장을 위해 채혈한다. 유동 세포 분석을 제2 주의 제4 일에 T 세포 고갈을 실증하기 위해 수행한다. CBC diff, 타크롤리무스 수준 및 CMV 수준을 제3 기의 제2 주에 측정하다.
유동 세포 분석, CBC diff 및 CMV 수준을 대조 NHP에서 제3 기 및 제4 기 전체에 걸쳐서 주기적으로 제4 기의 제10 주에서 피부 이식편을 얻을 때까지 모니터링한다.
제3 기의 제3 주의 제1 일에, 그 다음에 CTT의 대략 반을 수혜자 NHP의 대퇴 네갈래근에 임플란팅하고, 나머지는 동결보존한다. 이 절차는 사람 프로토콜에 따라서 행한다. Markert ML, Devlin BH. Thymic reconstitution. In: Rich RR, Shearer WT, Fleischer T, Schroeder HW, Wey및 CM, Frew A, editors. Clinical Immunology 3rd edition. Edinburgh: Elsevier; pp. 2008. pp. 1253-1261. 또한 피부 생검을 수행한다. 제3 기에 제10 주의 제3 일에, CTT 임플란트의 생검을 수행하고, 그 다음에 Cryo-CTT를 다른 다리의 대퇴 네갈래근에 제1 CTT 임플란트 후 대략 7 주 후에 임플란팅하여 생착 가능성을 증가시키고 동결보존된 CTT 효력을 사정한다. 신선하게 배양된 및 동결보존된 임플란팅된 흉선 조직을 임플란테이션 후 대략 6 주 후에 생검하여 생존능 및 정상 조직 아키텍처를 검증한다.
수혜자 NHP에 타크롤리무스를 제1 주의 제1 일에 시작하여 BID 투여한다.
제3 기에서 제2 주의 제1 일에 ATG를 수혜자에서 시작한다. 제2 주의 제3 일에 유동 세포 분석을 수행하여 T 세포 고갈을 보여준다. ATG의 마지막 용량을 수혜자에게 제2 주의 제5 일에, 즉, CTT 임플란트 전 남은 2 일 전에 투여한다. 타크롤리무스는 제3 기 전체에 걸쳐서 나이브 T 세포 <15%가 관찰될 때까지 계속한다. 실험은 T 세포가 >15% 나이브 T 세포를 포함하는 경우에는 제4 기로 진행한다. 나이브 T 세포가 <15%인 경우에는 실험이 제5 기로 진행한다. 타크롤리무스 수준, CMV 수준, CBC diff를 제3 기 전체에 걸쳐서 모니터링하고, 혈액 샘플을 추후 분석을 위해 보존한다. 타크롤리무스 수준, CMV 수준, CMC diff, 크레아티닌 및 ALT 수준을 수혜자 및 대조 NHP에서 제3 기 동안에 매주 측정한다.
제4 기: 비생존 심장 기증을 기증자 NHP에 대해 제4 기의 제4 주의 제1 일에 (이전에 언급한 바와 같이) 수행한다. 기증자 NHP로부터 이소성 심장 이식물을 제4 기의 제4 주의 제1 일에 수행한다. 필요하다면, 기증자 혈액을 수혜자 NHP에 수혈하는 데 사용한다. 수혜자에서 심장 박동을 2 주 동안 1 주 2 회 및 그 다음에 제4 기 전체에 걸쳐서 매주 ECHO 심박동 곡선으로 모니터링한다. 심장이 박동을 중단하면, 수혜자 NHP를 희생시켜야 한다.
제1 주의 제1 일, 제2 일, 제5 일 및 제7 일에 수혜자 NHP의 체중을 재고, 흉선 생검을 점검한다.
제4 기에 제4 주의 제1 일에, 심장 이식 시에 Cryo-CTT의 생검을 수행한다. 타크롤리무스 수준, CMV 수준 및 CBC diff를 제4 기 전체에 걸쳐서 수혜자 NHP에서 1 주 단위로 수행한다.
제4 기의 제10 주에, MLR을 심장 기증자, 수혜자 혈액 및 제3자 혈액으로부터 동결보존된 혈액을 사용하여 수행한다. 수혜자는 기증자 및 자기를 관용해야 하고, 제3자 피부 조직을 거부해야 한다. 제3자 신선한 NHP 피부 조직 및 수혜자 NHP 피부 조직이 수혜자에게 그래프팅될 것이다. 이것은 제4 기의 제10 주에 행한다. 유동 세포 분석, CBC diff, 및 CMV 수준에 의한 수혜자 NHP의 모니터링은 매달 계속한다(대조 NHP를 검정 대조군으로 이용한다.
수혜자 NHP를 심장 이식 후 180 일 후에 희생시킬 수 있다. 병리학을 수혜자에서의 이식된 심장 및 네이티브 심장에 대해 수행할 것이다. 기증자 배양된 및 동결보존된-배양된 흉선 이식물을 IHC에 의해 분석할 뿐만 아니라 흉부 조직을 또한 IHC에 의해 분석할 것이다. 주목할 것은, 기증자 심장이 박동하고 있으면, PI는 기증자 심장이 얼마나 오래 계속 박동할지를 보기 위해 동물이 더 오래 사는 것을 허용하는 선택권을 가진다.
제5 기: 이전에 언급한 바와 같이, 수혜자에서 나이브 T 세포가 제3 기에서 15%에 도달하지 않으면, 타크롤리무스는 제4 기 및 제5 기 전체에 걸쳐서 계속될 것이다. 일단 나이브 T 세포가 >15%에 도달하면, 실험이 제4 기로 진행할 것이다. 제5 기 동안에, CBC diff, 타크롤리무스 수준, 혈액 화학 및 CMV 수준을 모니터링한다.
제6 기: 제5 기에서 나이브 T 세포가 <10%이면, 실험이 제6 기로 진행한다. 제6 기 동안에, 타크롤리무스를 수혜자 NHP에서 4 주의 기간 동안 위닝한다. 그 기간 동안, 유동 세포 분석, CBC diff, CMV 수준 및 혈액 화학 측정값을 얻고, 혈액 샘플을 저장한다. 수혜자로부터의 Cryo-CTT를 이식하고, 제6 기의 제9 주에, Cryo-CTT의 생검을 수행하고, NHP를 희생시키고, 그의 장기를 수확한다. 목적은 네이티브 흉선이 수혜자에서 성공적으로 기능할 수 있다는 것을 보여주는 것이다 (따라서, 기술적 쟁점은 기증자 흉선 조직 이식물의 실패의 이유가 아니다. 유동 세포 분석, CBC diff 및 CMV 수준을 대조 NHP에서 계속 모니터링한다.
도 35는 전체 실험 설계의 개략도를 보여준다.
실시예 9. 동일한 기증자 심장 이식물에 대한 관용을 유도하는 CTT의 능력의 사정
NHP에서 수행된 이 실시예는 본 명세서에서 다른 곳에서 개시된 바와 같이 사람 대상체에서 소아 심장 이식물에 대해 나타낸 개시된 수술적 절차 및 치료와 유사하다.
방법
제1 기: 실시예 9에서 수행되는 실험의 상세한 개요 및 시각표에 대해서는 도 39를 참고한다.
수혜자 및 기증자 NHP 혈액 시험을 제1 기에서 수행한다. 기증자 NHP(MAMU -A:01 음성 및 수혜자 NHP(MAMU -A:01 양성)로부터의 혈액을 유동 세포 분석에 의해 시험하고, CBC 감별(CBC diff), 혈액 화학 및 CMV 수준을 결정한다. 유사한 시험이 대조 NHP에서 수행될 것이다. 제1 기에서 기증자 및 수혜자가 서로에 대해 양성 혼합 림프구 반응(MLR)을 가지는지를 확증한 후에, 기증자 NHP는 흉선 조직, 및 나중에 심장 둘 모두를 단일의 수혜자에게 기증한다(아래에서 기술되는 제4 기를 참고한다).
제2 기: 제2 기의 제1 주의 제3 일에, 흉선절제술 및 피부 생검을 수혜자 Mamu-A:01 양성 수혜자 NHP에서 수술적으로 수행한다. 수혜자 흉선을 제1 주, 제3일부터 제3 주, 제1 일까지 배양한다. 피부 생검으로부터의 피부를 제1 주의 제3 일에 동결보존한다. 유동 세포 분석을 수혜자 NHP에 대해 RTE가 보이지 않을 때까지 매주 수행한다. 제2 기의 제2 주의 제1 일에 음성이면, 실험이 제3 기로 진행한다. CMV 수준을 2 주마다 모니터링하고, DSA (5 ml)를 제2 기의 제2 주에 채취한다.
제3 기: 흉선절제술 및 피부 생검을 기증자 NHP에서 제1 주의 제3 일에 수행한다. 기증자 흉선을 12 일부터(제1 주의 제3 일부터 제3 주의 제1 일까지) 배양한다. 배양된 흉선의 1/2은 임플란팅될 것이고, 나머지 1/2은 동결보존될 것이다. 제4 기까지 기증자 NHP에 대해 다른 절차를 수행하지 않는다.
수혜자 NHP에 대해 수행되는 절차는 제3 주 제1 일에 기증자로부터 수혜자에게로의 배양된 흉선 임플란트를 포함한다. 그 때 타크롤리무스 및 MMF를 제3 주의 제1 일에 시작한다. 타크롤리무스 및 MMF를 제3 기 전체에 걸쳐서 계속한다. 또한 ATG를 제3 주의 제1 일에 5 일 동안 투여하여 T 세포를 고갈시킨다. 또한 제3 기 동안에, 수혜자 혈액 시험을 규칙적으로 수행한다. 타크롤리무스 수준 뿐만 아니라 CMV 수준을 매주 모니터링한다. DSA를 제3 주, 제7 주 및 제16 주에 시험한다. CBC diff를 격주로 크레아티닌 및 ALT와 번갈아서 2 주마다 행한다.
타크롤리무스 및 MMF를 제3 기에 나이브 T 세포가 >15%일 때까지 계속하고, 그 다음에, 실험이 제4 기로 진행한다. 대안으로, 나이브 T 세포가 15%에 도달하지 않으면, 실험은 제5 기(아래에서 기술된 바와 같음)로 진행한다.
제4 기는 제1 주 및 제6 주에 기증자, 수혜자 및 대조 NHP의 MLR 결정을 포함한다. MLR이 기증자에 대해 관용 및 제3자(대조군)에 대해 반응을 보여주면, 실험이 제2 주로 진행한다. 관용을 보여주지 않으면, 실험은 제6 기로 진행한다. 목적은 수혜자가 기증자를 관용하고 기증자가 수혜자에 대해 여전히 반응성인지(이것은 심지어 기증자에게 흉선이 없어도 해당되어야 한다)를 보여주는 것이다.
유동 세포 분석을 제2 주에 수행하여 흉선 거부를 기다리고, 매주 반복한다. 그 다음에 타크롤리무스를 제9 주에 그것을 시작하여 4 주 동안 위닝할 때까지 계속한다.
실험이 제2 주로 진행하면, 타크롤리무스를 계속하고, MMF를 BID 투여 및 그 다음에 제2 주 및 제3 주 동안 매일 투여로 낮추고, 그 다음에 중단한다.
제7 주에서, 비생존 심장 기증 및 피부 생검을 기증자 NHP에서 수행하고, 필요하다면, 수혜자 NHP에 수혈하기 위해 혈액을 저장한다. 이소성 심장 이식물을 수혜자 NHP에서 제7 주의 제1 일에 수행한다. 이식 당일에, 전신 마취 유도 및 기관내 삽관 후 정중 흉골절개술에 의해 기증자 심장을 획득한다. 동시에, 수혜자 NHP가 준비되고, 전신 마취 유도 및 기관내 삽관을 겪는다. 복부가 준비되고, 정중 개복술에 의해 진입된다. NHP는 투여되는 유도 면역요법이고, 정맥내 메틸프레드니솔론이 단일의 볼러스(bolus)로서 20 mg/kg의 용량으로 제공된다. 복부 대동맥 및 하대정맥을 신 동맥 아래에 잘 간수해 두고, 기증자 동종이계이식편의 문합을 위해 준비한다. 그 다음에 대동맥 및 하대정맥을 클램핑하고, 5000 unit 헤파린 정맥내 볼러스를 투여한다. 동종이계이식편으로부터의 폐동맥을 하대정맥에 말단-측부 방식으로 문합시키고, 동종이계이식편으로부터의 상행 대동맥을 유사한 방식으로 신하 복부 대동맥에 문합시킨다. 탈기 및 동리듬 보장 후, 복부를 봉합한다. 심율동전환을 내부 패드를 사용하여 필요한 대로 사용한다.
수술후 기간 내에, 이식된 심장에서의 이식편 기능을 규칙적인 촉진에 의해 및 매주 심장초음파에 의해 임의의 거부 징후(감소된 수축성, 부정맥 등)에 대해 사정한다. 두 면역억제 약물(타크롤리무스 및 마이코페놀레이트 모페틸) 모두를 4 내지 8 주의 기간 동안 위닝한다. 이전 실시예에서 기술된 설치류 모델 작업에 기초해서, 면역억제 철회 후 정상 이식편 기능이 예상되고, 이는 이식된 심장의 관용을 지시한다. 면역억제의 완전 철회 후 수 주 후에, 수혜자는 제3자 NHP로부터 피부 이식을 받고, 제3자 NHP는 또한 최대로 MHC 불일치된다. 거의 동시에, 수혜자는 흉선 및 심장 기증자 둘 모두로부터 뿐만 아니라 제3 자(대조) NHP로부터의 세포를 사용하여 MLR 시험을 받는다. 이들 시험을 사용하여 단순히 기능성 관용보다는 오히려 진정한 관용을 입증한다: 수혜자 동물은 제3자 기증자에 대해서는 MLR에 의해 측정되는 면역 반응을 시작해야 하지만 그들의 흉선 조직 및 심장 기증자에 대해서는 그렇게 하지 않아야 한다. 마찬가지로, 기증자 심장의 계속된 관용이 제3자 피부 이식물의 거부와 함께 예상된다. 실험 종결시에(면역억제 또는 죽음 없이 6 개월), 또는 유의미한 이식편 거부의 징후(활성의 완전 중지)가 있는 경우에, 동종이계이식편, 네이티브 심장, 및 다른 장기(간, 폐, 비장, 허리근)로부터의 샘플을 획득한다. 배양된 흉선 조직 이식의 부위를 또한 분석을 위해 수확한다. 조직 조직학을 수행하여 세포 또는 항체 매개 거부의 증거를 확인한다. 이식된 흉선 조직의 아키텍처 및 생존능을 면역조직화학에 의해 사정한다. 마지막으로, 유동 세포 분석을 사용하여 비장, 림프절, 골수, 및 말초 혈액에서 림프구 표현형을 특성화한다.
Cryo-CTT를 제10 주 제3 일에 이때에 생검한다. 이식된 심장을 제8 주부터 제12 주까지 박동에 대해 모니터링한다. 심장이 박동을 중단하면, 수혜자 NHP를 희생시킨다.
제12 주에, MLR을 기증자, 수혜자 및 대조 NHP의 피부 생검으로부터의 피부 이식편에 대해 수행한다. 심장이 여전히 박동하고 있으면, 제12 주에 신선한 수혜자 피부, 동결보존된 수혜자 피부, 동결보존된 기증자 피부 및 신선한 및 동결보존된 제3자(대조군) 피부의 피부 그래프를 만든다.
제4 기 동안에, 타크롤리무스 수준을 규칙적으로 모니터링한다. CMV 수준을 유동 세포 분석 측정 및 CBC diff 측정과 번갈아 가면서 2 주마다 측정한다. ALT, 크레아티닌 및 DSA를 또한 주기적으로 모니터링한다. 실험을 이소성 심장 이식물 후 180 일 후에 종결하고, 수혜자 NHP를 희생시키고, 병리학을 위해 심장을 수확한다. 수혜자 및 기증자 흉선을 IHC를 위해 보내고, 흉부 조직을 또한 획득하고 IHC에 의해 분석한다.
제5 기: 나이브 T 세포가 >15%가 아니기 때문에 계속된 면역억제가 필요하다면, (MMF를 이미 위닝하였을지라도) 제4 기로 되돌아간다. 타크롤리무스를 나이브 T 세포가 >15%일 때까지 계속한다. 나이브 T 세포가 >10%이면, 제4 기로 되돌아간다. 나이브 T 세포가 <10%이면, 제6 기로 간다. 제5 기 동안, 타크롤리무스 수준을 매주 모니터링하고, CMV 수준 및 CBC diff, 크레아티닌, 및 ALT 수준을 번갈아 가면서 2 주마다 모니터링한다. 유동 세포 분석 및 CBC diff를 대조 NHP에서 2 주 단위로 모니터링한다.
제6 기: 제1 주의 제1 일에 수혜자로부터의 Cryo-CTT를 수혜자에게 그래프팅하여 흉선 임플란트를 NHP에서 만들 수 있다는 것을 보여준다. NHP를 희생시킬 때 수혜자 Cryo-CTT 이식편에서 생검을 수행한다. 유동 세포 분석 및 CBC diff 수준을 제6 기 동안에 대조 NHP에서 2 주마다 측정한다.
이전 기에서처럼, 유동 세포 분석, DSA 및 CBC diff 수준을 CMC 수준, 크레아티닌 및 ALT 수준의 결정과 번갈아 가면서 2 주마다 모니터링한다.
실시예 10. 다수의 연령 범위에서 사람 흉선 조직의 배양가능성을 확정하기 위해 다수의 연령 범위에서의 배양된 사람 흉선 조직의 아키텍처, 생존능 및 기능성 사정
사람 흉선 기증자 풀(pool)을 확장하기 위한 합리적 포함 척도를 개발하는 것은 넓은 연령 범위의 잠재적 심장 기증자에서 기증자 사람 흉선 조직의 배양가능성 및 기능적 및 분자적 특성을 결정하는 것을 요구한다. 사람 흉선은 유아기에는 크기가 끊임없이 증가하고, 안정화하고, 궁극적으로는 퇴화하기 시작한다. 이러한 잘 알려진 연령-관련 퇴화 과정에도 불구하고, 더 나이 많은 어린이 및 성인의 흉선은 실질적 T 세포 생성 용량을 80 세까지 계속 보유할 수 있다는 것을 보여주었다 Hong R, Moore, AL. 1996, "Organ culture for thymus transplantation," Transplantation, 61: 444-448; Rice HE, Skinner MA, Mahaffey SM, Oldham KT, Ing RJ, Hale LP, et al., 2004, "Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations," J Pediatr Surg. 2004;39: 1607-1615. 이들 실험의 근거는 이식에 적합한 흉선 조직을 잠재적으로 제공할 수 있는 기증자 연령 범위를 결정하는 것이다. 지금까지 임플란팅된 사람 흉선은 ≤9 개월 연령의 기증자로부터 얻는다. 그 연령에서, 흉선은 흉선세포생성에서 활성인 피질 및 수질 조직으로 거의 전부 구성된다. 그러나, 유아 기증자를 거의 구할 수 없기 때문에, 대부분 심장 이식물 수혜자는 더 나이 많은 기증자로부터 심장을 받는다. 성인 흉선이 실질적인 T 세포 생성 용량을 계속 보유할지라도, 더 나이 많은 기증자로부터 유래된 흉선은 대표적으로 흉선세포생성에서 활성인 영역을 덜 가지고 Id.; Taub DD, Longo DL, 2009, "Insights into thymic aging and regeneration," Trends Immunol. 30(7):366-373, 상응해서 더 적은 수의 최근 생성된 나이브 T 세포가 말초 혈액에 있다. Hong R, Moore, AL., 1996, "Organ culture for thymus transplantation," Transplantation, 61: 444-448, Rice HE et al, 2004, J Pediatr Surg. 2004;39: 1607-1615; Taub DD, Longo DL, 2009, Trends Immunol. 30(7):366-373. 따라서, 이들 연구는 흉선이 배양된 다음에 심장 동종이계이식편 수혜자에게 동시이식되는 경우에 안전하고 효과적이도록 적당한 기능적 특성을 보유하는 기증자 연령 범위를 결정하는 데 필요하다.
방법
사전동의 후에 총 30 개 샘플을 위해 다른 세 연령 그룹: 9 개월 내지 9 세; 10 세 내지 25 세; 및 26 세 내지 49 세에서 심장 수술 환자로부터 전향적으로 흉선 조직을 수집한다. 이 프로젝트를 위한 예비 연구의 일부로서, 지방 조직을 슬라이싱하기 위한 새로운 맞춤 기기장치를 개발하였다. 더 나이 많은 흉선으로부터의 지방 조직의 Stadie-Riggs 마이크로톰을 이용한 전통적인 슬라이싱은 면역조직화학에 의해 사정될 수 있는 슬라이스를 수득하지 못한다. 지방 흉선의 경우, 따라서, 단면 면도날(대략 10)을 함께 와이어로 엮고 멸균시킨다. 면도날 간의 거리는 대략 1 mm이다. 대략 1cm x 1 cm x 1 cm 흉선 조직 조각을 멸균 조직 배양 접시 바닥에 놓는다. 결합된 면도날을 흉선 조직 안으로 누른다. 개별 슬라이스를 면도날 사이로부터 제거하고 염색에 사용한다. 21 일 동안 사람 흉선 조직의 슬라이싱 및 배양을 이전 실시예에서 기술된 바와 같이 수행한다. 제1 일, 제5 일, 제12 일 및 제21 일로부터의 조직 슬라이스 및 소모된 배지를 추후 분석을 위해 냉동시킨다. 아래에서 기술되는 바와 같은 면역조직학적 연구를 용이하게 하기 위해 제0 일 및 제21 일로부터의 조직 슬라이스를 또한 포르말린-고정된 및 파라핀-포매된(FFPE) 블록으로 가공한다.
분석은 제0 일 및 제21 일로부터의 FFPE 블록으로 시작하고, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 절편 뿐만 아니라 사이토케라틴(AE1/AE3 칵테일), 사이토케라틴(CK) 14, 증식(Ki-67), T 세포 함량(CD3), 및 케모카인(CCL21) 생성에 대한 면역조직화학(IHC)을 사용한다. 제0 일의 수용되는 기증자 흉선의 조직학적 특징은 유기적인 흉선 상피 (TE) 망상조직, CK14를 재군집 잠재력의 표지자로서 발현하는 TE 세포의 존재, 획득시 흉선세포생성의 표지자로서 비성숙 흉선세포 및 해살 소체의 존재, 및 조직 생존능의 지시자로서 >90% 원상태 핵을 포함한다. 배양된 흉선 슬라이스는 흉선 상피 세포 생존능, TE 아키텍처의 유지, 생존가능 흉선세포의 현저한 고갈, 및 비성숙 흉선세포 전구체를 흉선으로 유인하는 책임을 맡은 케모카인 CCL21의 높은 생성을 포함하여 기능적으로 중요한 생체분자의 생성을 마찬가지로 입증해야 한다. 흉선 슬라이스에 의한 CCL21의 생성은 FFPE 슬라이스의 IHC 뿐만 아니라 소모된 배지의 효소 면역검정에 의해 사정한다(도 37).
사용된 흉선 조직이 다양한 정도의 연령-관련 위축을 나타낼 수 있기 때문에, 기본적 흉선 기능을 결정하는 것이 필수적이다. 기본적 흉선 기능은 이전에 기술된 바와 같이 제0 일로부터의 스캔된 조직 절편의 이미지 분석에 의해 결정한다(Hale LP, Markert ML, 2004. "Corticosteroids regulate epithelal differentiation and Hassall body formation in the human thymus," J Immunol. 2004; 172: 617-624). 추가로, 나이브 T 세포의 흉선 생산량은 기증자 말초 혈액을 사용하여 결정된다. 말초 혈액 단핵 세포를 정제하여 보존하고; T 세포 표현형 을 다음 표지자를 사용하여 10-색 유동 세포 분석에 의해 결정한다: 생존능, CD3, CD4, CD8, CD19, CD16+CD56, CD45RA, CD57, 및 CD197. 말초 혈액 T 세포에 존재하는 신호 결합 T-세포 수용체 재배열 절단 서클(sjTREC)을 흉선 기원의 표지자로서 정량화한다. Lee EN, Park JK, Lee J-R, Oh S-O, Baek S-Y, Kim B-S, et al., 2011, "Characterization of the expression of cytokeratins 5, 8, and 14 in mouse thymic epithelial cells during 2011; 44: 14-24.thymus regeneration following acute thymic involution," Anat Cell Biol.
실시예 11. 배양된 사람 흉선의 조직병리학적 사정
이들 실험은 임플란팅된 조직에 사용되는 프로토콜에 따라서 배양될 때 사람 흉선 슬라이스에서 일어나는 조직병리학적 변화를 사정하고 기술하기 위해 수행하였다. 이들 변화의 이해는 이전 수혜자에서 면역 재구성을 성공적으로 생성한 조직의 특성에 기초하여 임플란테이션 전에 배양된 흉선 슬라이스의 질의 전향적 사정을 위한 조직병리학적 척도의 개발 및 유효성 확인을 잠재적으로 초래할 수 있다 Markert ML, Devlin BH, McCarthy EA., 2010, "Thymus transplantation," Clin Immunol. 2010; 135: 236-246. 종합해 보면, 이들 결과를 사용해서 임플란팅에 사용되는 슬라이스의 질을 평가하는 데 잠재적으로 역할을 할 수 있는 헤마톡실린 및 에오신 염색 및 사이토케라틴 면역조직화학에 의해 확인가능한 조직의 구조적 특징에 기초하여 진단 척도를 개발하는 데 사용될 수 있다.
물질 및 방법
흉선 조직은 교정 심장 수술을 받고 있는 < 9 개월 연령 면역적격성 유아 기증자로부터 얻었고, 여기서 흉선의 일부의 제거는 심장 수복을 용이하게 하는 데 일상적으로 요구된다. 각 기증자의 부모(들)는 제거되어 그렇지 않았다면 폐기될 임의의 흉선 조직이 임플란테이션 또는 연구에 잠재적으로 사용되는 것을 허용하는 사전동의서를 제공하였다. 이들 연구는 Institutional Review Board of Duke University Medical Center에 의해 승인되었다. 기증자 흉선을 슬라이싱하고, 우수 의약품 제조 품질 관리 기준(GMP)을 준수하는 세포 제작 실험실에서 수혜자의 근육에 수술적 임플란테이션하기 위해 수술실로 출하하기 전 최장 21일 동안 배양하였다. 기증자 적격성, 배양 및 수술적 임플란테이션 과정의 세부사항은 다른 곳에서 기술되었다 Markert ML, Sarzotti M, Ozaki DA, Sempowski GD, Rhein ME, Hale LP, et al., 2003, "Thymic transplantation in complete DiGeorge syndrome: Immunologic and safety evaluation in twelve patients," Blood, 102: 1121-1130. Markert ML, Alexieff MJ, Li J, Sarzotti M, Ozaki DA, Devlin BH, et al., 2004, "Postnatal thymus transplantation with immunosuppression as treatment for DiGeorge syndrome," Blood, 104: 2574-2581; Markert ML, Devlin BH, Alexieff MJ, Li J, McCarthy EA, Gupton SE, et al., 2007, "Review of 54 patients with complete DiGeorge anomaly enrolled in protocols for thymus transplantation: Outcome of 44 consecutive transplants," Blood, 109: 4539-4547; Hong R, wt al., 1996; Rice HE, eSkinner MA, Mahaffey SM, Oldham KT, Ing RJ, Hale LP, et al., 2004, "Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations," J Pediatr Surg., 39: 1607-1615. 배양 동안에 특정 시점에서, 각 기증자 흉선으로부터의 1 개 이상의 슬라이스를 10% 중성 완충 포르말린에 고정시킨 다음에 가공하고 조직병리학적 평가를 위해 포르말린-고정된 파라핀 포매된 블록으로 포매한다. 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)-염색 절편 및 면역조직화학적 패널을 각 조직 블록에 대해 얻었다. 사용된 항체는 판-사이토케라틴(클론 AE1/AE3; Leica), 사이토케라틴(CK) 14 (클론 LL02; Leica), CD3 (클론 LN10; Leica), 및 Ki-67 (클론 MIB-1; Dako)을 포함하였다. 자동 면역조직화학은 표준 면역과산화효소 방법론 및 3,3'-디아미노벤지딘 (갈색) 기질을 헤마톡실린 대비염색과 함께 사용하여 수행하였다. 배양 중에 시간에 따라서 흉선 샘플 내의 가변성을 사정하기 위해, 로트를 일반적으로 다음 범위 내의 ≥ 3 시점에서 조직학적으로 검사하였다: 제0 일(접수 당일), 제5 일 - 제9 일 및 제12 일 - 제21 일.
결과 및 논의
흉선 장기 배양이 제0 일부터 제21 일까지 진행함에 따라, 슬라이스는 괴사 양 증가, 흉선 상피 응축 증가 및 잔류 T 세포 수 감소를 발생하엿다. 흉선 상피 망상조직의 아키텍처는 21 일의 배양 전체에 걸쳐서 일반적으로 여전히 잘 보존되었고, 장기간 장기-재군집 잠재력을 갖는 흉선 상피 세포의 추정 생체표지자인 사이토케라틴 14의 초점성 발현이 일어난다. 동일한 기증자 흉선으로부터 유래된 모든 장기 슬라이스가 서로 밀접하게 유사하였고, 크기, 형상 및 피질 대 수질의 상대적 함량에 미미한 차이가 있다. 마찬가지로, 상이한 기증자로부터 유래된 슬라이스는 동일한 배양 시점에서 검사될 때 유사한 조직병리학적 특성을 보여주었다.
흉선으로서 조직의 초기 확인
흉선은 얇은 결합 조직 피막을 가지고, 이 결합 조직 피막은 대표적으로 실험실 가공 동안에 제거된다. 그러나, 피막(섬유주) 및 관련 혈관의 확장, 섬유 조직, 지방 조직, 및 가변적 수의 성숙 조혈 세포는 흉선 슬라이스에서 여전히 관찰될 수 있다. 섬유주는 흉선 조직을 소엽으로 나누고, 소엽은 흉선 상피 세포의 레이스 모양으로 보이는 3 차원 망상조직으로 구성되고, 발달하는 T 세포(흉선세포)를 함유하는 공간이 개재한다. 소엽은 대표적으로 바깥쪽 피질 및 안쪽 수질을 입증하고, 그들은 그들의 조직학적 외관 뿐만 아니라 그들이 함유하는 세포의 표현형 및 기능이 다르다. 흉선 피질은 헤마톡실린으로 매우 어둡게 염색되는 조밀하게 쌓인 비성숙 흉선세포 때문에 매우 호염기성(청색)이다. 흉선 수질에 존재하는 더 성숙한 흉선세포의 밀도는 피질의 밀도보다 낮고, 따라서 수질은 더 호산구성(분홍색)인 것처럼 보이는 경향이 있다. 흉선 수질은 또한 해살 소체라고 불리는 질병특유적 호산구성 사이토케라틴-함유 구조를 함유한다. 흉선 내에 존재하는 대식세포는 어둡게 염색되는 흉선세포의 배경과 대비를 이루며 밝은 색상의 원형 영역으로 보이는("별이 빛나는 하늘" 패턴) "가염성 소체"를 형성할 수 있다. 많은 수의 가염성 소체는 스트레스 퇴화에 특유하고, 스트레스 퇴화는 정상 흉선 기증자에서 심각한 심장 결함, 수술, 및/또는 코르티코스테로이드 치료의 스트레스 때문에 일어날 수 있고, 흉선의 임플란테이션 자격을 박탈하지 않는다. 배양 전에(제0 일) 슬라이싱된 정상 흉선의 대표적인 조직학적 특징을 도 40a - d에서 보여준다.
해살 소체의 평가
흉선 수질은 표피의 말단 분화된 상층과도 반응하는 단일클론 항체와 반응하는 말단 분화된 흉선 상피 세포로 구성된 해살 소체라고 불리는 특징적 구조를 함유한다. Hale LP, et al., 2004; 172: 617-624.
해살 소체는 조직 동일성의 표지자로서 역할할 수 있고, 그 이유는 그들이 흉선에서만 발견되기 때문이다. 그들은 또한 투입 기증자 조직의 질을 반영할 수 있고, 그 이유는 말단 분화 과정이 정상적으로 흉선세포-흉선 상피 세포 상호작용에 의해 촉발되기 때문이다. Id. 해살 소체는 H&E-염색 슬라이드 상에서 상피세포의 호산구성 소용돌이 모양으로서의 그의 외관에 의해 통상적으로 쉽게 확인된다(도 41a-d). 가장 중심에 있는 층은 대표적으로 핵이 없다. 가변적인 양의 세포 쇄설물이 또한 해살 소체의 중심에 존재할 수 있다. 해살 소체는 판-사이토케라틴 AE1/AE3 항체로 매우 강하게 염색되고, 이는 헤마톡살린 및 에오신(H&E)-염색 슬라이드에서 명확하게 확인되지 않는 경우에 이들 구조의 동일성의 이차적 확증으로서 사용될 수 있다.
배양 동안에 일반 흉선세포 변화
흉선세포는 흉선 조직이 배양될 때 배지 교체 동안에 버려지는 것으로부터 또는 흉선세포 죽음 후 조직 내에서의 분해로부터 점진적으로 소실된다(도 42-도 45). 그러나, 생체내에서 일어나는 것과는 달리, 죽은 세포는 그들을 청소하는 식세포를 동원할 수 없기 때문에 배양된 흉선에 장기간 잔존할 수 있다. 세포 죽음을 겪는 흉선세포 핵은 핵농축(염색질 응축) 및 분핵화(핵 분절화)를 보여줄 수 있지만, 대표적으로, 이들 세포는 그들의 에너지를 고갈시키지만 식세포 작용으로 제거되지는 않기 때문에, 그들은 핵막 완전성의 소실과 함께 들쑥날쑥한 핵 가장자리를 보여준다. 핵융해(괴사성 세포에서 핵의 완전 용해)는 대표적으로 생체내에서 2-3일 내에 일어나지만, 흉선 배양 동안에는 더 느리게 일어나는 것처럼 보인다. 배양 중에 5-9 일 후, 대부분 흉선세포는 핵을 보유하였지만, 핵막은 원상태가 아니며, 이는 조기 괴사를 지시한다(도 43). 이들 변경된 핵 특징은 핵을 보유할 때조차도 생존가능 흉선세포와 생존불능 흉선세포의 구별을 용이하게 한다. 흉선세포 핵이 핵융해를 겪은 호산구성 괴사성 세포 쇄설물의 큰 초점들도 또한 볼 수 있다(도 43a).
세포 완전성 및 조직 아키텍처의 조직학적 평가
배양된 흉선 조직을 임플란팅해야 할 때, 광범위한 흉선세포 괴사를 갖지만 흉선 상피 세포가 잘 자라는 슬라이스(임플란테이션을 위한 최적 조직)와 유사한 양의 괴사를 가지고 또한 흉선 상피 세포도 손상된 슬라이스를 정확하게 식별할 수 있는 것이 대단히 중요하다. 그것이 생존능을 직접적으로 사정할 수 없을지라도, H&E 슬라이드의 조직학적 검사는 정상 구조의 보존 정도 및 세포 죽음의 지시자의 존재 또는 부재를 사정할 수 있다. 위에서 기술된 바와 같이, 흉선세포가 배양 과정 동안에 고갈될 것으로 예상된다. 많은 흉선세포가 매일 배지 교체하는 동안에 슬라이스로부터 씻긴다. 많은 다른 것들은 현장에서 죽을 것이고, 여기서 그들의 핵 및 세포 소체들이 연장된 기간 동안 남아 있을 수 있다. 그러나, 죽은 흉선세포의 막 완전성이 손상되고, 그들의 핵은 "들쑥날쑥한" 가장자리를 나타낸다. 흉선세포 쇄설물이 덩어리질 수 있고, 이는 개별 세포 경계를 분간하는 것을 불가능하게 한다. 흉선세포 죽음 및 고갈은 배양의 예상된 바람직한 결과이고, 원상태 흉선세포 핵의 상대적 결여는 슬라이스 질을 잠재적으로 반영한다.
흉선 상피 세포는 흉선세포가 조직으로부터 고갈될 때 더 쉽게 시각화된다. 생존가능 흉선 상피 세포의 핵은 대표적으로 타원형이고, 흉선세포의 핵보다 더 크고, 헤마톡실린 염색에 의해 윤곽이 그려진 선명하게 경계를 나타낸 핵막을 가지고, 1 개 이상의 핵소체를 가진다. 이들 흉선 상피 핵은 대표적으로 "개방된" 것처럼보이고, 이는 그들이 헤마톡실린으로 어둡게 염색되지 않는다는 것을 의미한다. 이것은 그들이 살아있고 대사적으로 활성이라는 해석과 들어맞고, 그 이유는 활성 크로마틴("진정염색질")이 헤마톡실린 염료와 결합하지 않기 때문이다. 많은 흉선 상피 세포에서 리보좀 합성 부위인 핵소체의 존재는 그들이 살아있고 고정시에 대사적으로 활성임을 추가로 확증한다. 원상태 및 생존가능한 것같이 보이는 흉선 상피 세포의 예를 도 46a-b에서 보여준다.
제0 일 - 제21 일로부터 임의의 주어진 시점에서 다수의 흉선 슬라이스의 신중한 현미경 검사는 동일한 기증자 흉선으로부터 유래된 모든 슬라이스가 서로 밀접하게 유사하다는 것을 보여주었다. 배양 시간의 함수로서 동일한 흉선으로부터 유래된 상이한 슬라이스 간에 관찰된 차이는 괴사의 양(배양 시간이 증가함에 따라 증가됨) 및 잔류 흉선세포 수(배양 시간이 증가함에 따라 감소됨)와 주로 관련있었다. 상이한 기증자로부터 유래된 슬라이스는 또한 동일한 시점에서 검사될 때 서로 질적으로 유사하였다. 상이한 기증자 조직 간의 차이는 상대 크기, 형상, 흉선 대 수질의 상대 함량(하지만 둘 모두가 검사되는 각 슬라이드에 항상 존재하였음), 괴사의 양, 흉선 상피의 응축, 및 잔류 T 세포 수를 포함하였다. 조직학적 외관의 대부분 변화가 배양 제5 일까지 이미 일어났고, 배양이 진행됨에 따라 일반적으로 흉선세포의 추가 고갈만 일어난다.
흉선 상피 아키텍처의 사정
항-사이토케라틴 항체 AE1 및 AE3 (AE1/AE3)을 함유하는 칵테일은 본질적으로 모든 흉선 상피 세포를 검출한다. 대조적으로, CK14와 반응성인 항체는 피막하 피질에 존재하고 겉보기에는 피질 및 수질의 나머지 전체에 걸쳐서 산포된 흉선 상피 세포의 부분집합을 검출한다. 이들 CK14+ 세포 중 일부가 피질 및 수질 상피세포 둘 모두로 분화될 잠재력을 가지고, Lee EN, Park JK, Lee J-R, Oh S-O, Baek S-Y, Kim B-S, et al., 2011, "Characterization of the expression of cytokeratins 5, 8, and 14 in mouse thymic epithelial cells during thymus regeneration following acute thymic involution," Anat cell Biol. 44: 14-24, 따라서 장기간 재군집하는 세포를 나타낸다는 것을 시사하였다. 흉선세포가 조직으로부터 고갈되기 때문에, 흉선 상피 세포가 더 잘 보이게 된다. 3 차원 흉선 상피 망상조직은 연결된 상피세포 및/또는 검사되는 절편에서 연결이 분명하지 않은 겉보기에 산포된 흉선 상피 세포의 밝은 레이스 모양 배열을 통해 절편에서 정상적으로 입증된다. 3 차원 흉선 상피 망상조직은 흉선세포가 배양 동안에 소실되기 때문에 다양한 정도로 수축한다. 이것은 잔류 상피의 응축을 초래할 수 있고, 이렇게 해서 피막하 피질 상피 층이 더 두꺼워지고, 수질 흉선 상피 세포가 더 조밀하게 쌓인다. 이들 변화의 예를 제0 일(접수일), 제7 일, 제9 일, 제12 일, 및 제20 일에 검사된 단일의 흉선 로트에 대해 도 40 및 도 42-45에서 보여준다. 많은 흉선세포의 소실 및 잠재적으로 괴사성 쇄설물을 함유하는 큰 영역에도 불구하고, 흉선 상피 세포 망상조직의 전체 아키텍처는 적어도 21 일의 배양 내내 일반적으로 여전히 잘 보존된다(도 47a-e).
잔류 T 세포의 사정
위에서 기술한 바와 같이, 임플란테이션을 의도하는 기증자 흉선 조직의 배양의 일차 목적은 T 세포를 부분적으로 고갈시켜서 수혜자 흉선세포 전구체로 임플란팅된 슬라이스의 집락화를 용이하게 하고 이식편-대-숙주 질환의 위험을 감소시키는 것이다. 비성숙 T 세포(흉선세포) 및 성숙 T 세포는 조직학적 절편에서 그들의 형태학에 의해서 뿐만 아니라 이들 세포 유형에 의해 특이적으로 발현되는 단백질을 검출하는 면역조직화학적 염색에 의해 확인될 수 있다. CD3는 >95%의 피질 및 수질 흉선세포 상에 뿐만 아니라 모든 성숙 T 세포 상에 존재하는 항원을 위한 T 세포 수용체의 성분이다. 제0 일에, 피질 및 수질에서 본질적으로 모든 비성숙 T 세포의 혈장막이 CD3 항체와 막 패턴으로 강하게 반응하는 것같이 보인다(도 48a-b). 생존가능 흉선세포/T 세포가 배양이 계속될 때 CD3 항체와 막 패턴으로 계속 반응한다. 그러나, CD3 항체는 또한 죽은 흉선세포가 핵융해를 겪은 후 남아 있는 무핵 쇄설물을 포함해서 죽은 흉선세포와 강하게 반응한다(도 48d, 도 48g, 및 도 48i-k). 낮은 배율로 볼 때 매우 많은 흉선세포 쇄설물이 남아 있어서 슬라이스가 여전히 강하게 및 균일하게 갈색인 것같이 보일 수 있지만(도 48c, 도 48f, 도 48h, 도 48j), 더 높은 배율(예를 들어 40X 대물렌즈)로 슬라이드의 검사는 상대적으로 적은 원상태 잠재적으로 생존가능한 흉선세포가 이들 시점에서 존재한다는 것을 확증한다. 생존불능 세포 및 세포 쇄설물이 임플란테이션 후 수혜자 식세포에 의해 청소될 것이고, 따라서 이식편-대-숙주 질환의 위험을 전하지 않는다. 상당한 양의 강하게 염색된 쇄설물이 인접 세포의 세포막의 사정을 방지하는 경우에 조직 영역에서 CD3+ 막 면역반응성을 정확하게 확인하는 것은 일반적으로 가능하지 않다. 그러나, 배양 동안에 후기 시점에서조차도, CD3 면역조직화학은 대표적으로 원상태 혈장막을 가지는 적어도 일부 흉선세포/T 세포를 강조하여 그들이 여전히 생존가능할 수 있다는 것을 시사한다(도 48e, 도 48g, 도 48i-k).
세포 증식 사정
Ki-67 항원은 증식하고 있는(즉, 세포 주기의 G0기가 아님) 모든 세포의 핵에서 발현된다. 제0 일에, 흉선 피질 내에 존재하는 대다수의 비성숙 흉선세포가 증식하고 있고, 그들의 핵이 Ki-67 증식 항원에 특이적인 항체와 강하게 반응한다. 대조적으로, 드문 더 성숙한 수질 흉선세포 및/또는 상피 또는 간질 세포만이 이 항체와 반응한다(도 49a-b). 배양 제1 일 - 제2 일 후에 관찰되는 면역반응성의 패턴은 산포된 드문 양성 세포의 패턴이고, 그 중 거의 전부가 흉선 상피 세포에 특유한 더 큰 핵을 가진다(도 49c-k). 따라서, Ki-67 염색은 슬라이스 내에서 흉선 상피 세포의 생존능을 실증하기 위한 유용한 보조 염색일 수 있다.
논의
이들 실험은 생후 사람 흉선이 최장 21일 동안 배양될 때 일어나는 조직병리학적 변화를 기술하고, H&E 및 사이토케라틴 면역반응성을 사용한 조직병리학적 검사가 임플란테이션을 의도한 배양된 흉선 슬라이스의 질을 사정하는 데 유용할 수 있다는 것을 입증한다. 흉선 배양이 진행할 때, 슬라이스는 괴사 양 증가, 흉선 상피 응축 증가, 및 잔류 T 세포 수 감소를 발생하였다. 흉선 상피 망상조직은 21일의 배양 전체에 걸쳐서 여전히 원상태였고, 장기간 장기-재군집 잠재력을 갖는 흉선 상피 세포의 추정 생체표지자인 사이토케라틴 14의 발현이 계속된다. 동일한 흉선으로부터의 슬라이스는 질적으로 유사하였고, 이렇게 해서 단일의 슬라이스가 전체 흉선을 충분히 대표할 수 있었다. 상이한 기증자로부터 유래된 배양된 흉선 슬라이스의 조직학적 외관의 가변성이 또한 임의의 주어진 시점에서 최소였다. 배양 동안에 초기(예를 들어 제5 일 - 제9 일)에 관찰된 조직 조직학은 배양 중에 후기(예를 들어, 제12 일 - 제21 일)에 관찰된 것을 밀접하게 반영하였지만, 더 나중 시점에서는 더 많은 흉선세포 고갈 및 괴사가 관찰되었다.
CK14 또는 모든 유형의 사이토케라틴(AE1/AE3)을 인식하는 항체의 면역조직화학은 배양된 흉선 슬라이스의 평가에 유용하였다. 사이토케라틴 중간 필라멘트는 모든 상피세포의 세포골격의 중요 성분이다. 판-사이토케라틴 AE1/AE3 염색은 검사된 흉선 슬라이스 내에서의 상피 망상조직을 입증하고, 이는 더 나중 시점에서 H&E 염색 단독을 사용해서는 쉽게 분간가능하지 않을 수 있다. 특정 흉선 상피 세포에 의해 발현되는 특정 유형의 사이토케라틴이 그의 발생 및 분화기 및 기능적 상태에 의존한다는 것을 보여주었다. 마우스에서, CK5, CK8, 및 CK14와 반응하는 항체가 흉선 상피 세포 아형을 확인하는 데 가장 흔히 사용되었다 Lee EN, et al., 2011, Anat 세포 Biol., 44: 14-24. CK14의 발현은 이 연구에서는 피질 또는 수질 계통으로 분화할 잠재력을 갖는 흉선 상피 세포의 특징이라고 가정한 이전 연구에 기초해서 결정되었다 Li B, Li J, Devlin BH, Markert ML., 2011, "Thymic microenvironment reconstitution after postnatal human thymus transplantation," Clin Immunol. 140: 244-259. 오래 지속하는 면역 재구성의 임상 결과 Markert ML, et al., Blood, 109: 4539-4547이 아마도 흉선 상피 전구체가 임플란팅된 흉선 슬라이스 내에 존재할 것임을 시사할지라도, 그러한 전구체의 정확한 표현형은 사람에서 명확하게 확인되지 않았다. 마우스에서 흉선 상피 전구체의 표현형은 여전히 논란이 많고 Bennett AR, Farley A, Blair NF, Gordon J, Sharp L, Blackburn CC., 2002, "Identification 및 Characterization of thymic epithelial progenitor cells," Immunity 16: 803-814; Wong K, Lister NL, Barsanti M, Lim JMC, Hammett MV, Khong DM, et al., 2014, "Multilineage potential and self-renewal define an epithelial progenitor cell population in the adult thymus," Cell Rep. 8: 1198-1209; Ucar A, Ucar O, Klug P, Matt S, Brunk F, Hofmann TG, et al. , 2014, "Adult thymus contains FoxN1(-) epithelial stem cells that are bipotent for medullary and cortical thymic epithelial lineages," Immunity, 41: 257-269; Ulyanchenko S, O'Neill KE, Medley T, Farley AM, Vaidya HJ, Cook AM, 2016, "Identification of a bipotent epithelial progenitor population in the adult thymus," Cell Rep., 14: 2819-2832, 극히 적은 수가 다수의 항체 및 다색 유동 세포 분석을 사용해서 검출되었다. 따라서 사람 조직 절편에서 흉선 상피 전구체의 직접 검출은 현재로서는 실현가능하지 않다.
이들 실험은 조직이 임플란팅될 수 있는 시점인 배양 제12 일 - 제21 일에 흉선 슬라이스 내에 남아 있는 많은 양의 괴사성 세포 물질을 잠재적으로 확인하였다. 임플란테이션 후 수 개월 후에 생검 검사는 이 괴사성 물질의 증거를 보여주지 않는다 Markert ML, et al., 2008, 180: 6354-6364. 어떠한 특별한 이론에도 얽매이고 싶지 않지만, 본 출원인은 임플란테이션 시에 이 괴사성 쇄설물 및 그의 아래에 있는 세포외 기질의 초기 존재가 발달하는 흉선세포를 위한 피질 및 수질 니쉬(niche)를 포함하여 슬라이스의 기능적 아키텍처를 보존하는 역할을 할 수 있다는 것을 진술한다. 상피세포 및 조혈 전구체 둘 모두의 세포 분화를 지지할 수 있는 쥣과 흉선 "오가노이드"를 재생성하기 위한 세포외 기질을 보존하는 흉선 탈세포화 접근의 최근 사용은 이 가정을 지지한다 Hun M, Barsanti M, Wong K, Ramshaw J, Werkmeister J, Chidgey AP, 2017, "Native thymic extracellular matrix improves in vivo thymic organoid T cell output, and drives in vitro thymic epithelial cell differentiation," Biomaterials, 118: 1-15, supports this hypothesis.
이전 연구는 흉선 상피 세포의 성장 잠재력이 사용된 배양 조건 하에서 견실히 유지되었다는 것을 입증하였고, 이렇게 해서 사이토케라틴-양성 상피 단층이 장기 배양의 개시 후 12 주까지 슬라이스로부터 확립될 수 있었다 Markert ML, et al., 1997, Clinical Immunol Immunopathol., 82: 26-36. 이 실시예에서 기술된 실험은 상피세포 생존능을 직접적으로 사정하지 않았지만, 대신에 원상태 핵의 존재를 대용 표지자로서 사용하였다.
배양된 흉선 조직의 생체표지자에 관한 뒤따르는 실시예의 경우, 다음 절차를 따랐다.
실시예 12: 사람 흉선 조직의 원천
흉선 조직은 수술 필드의 노출을 용이하게 하기 위해 흉선 일부의 제거가 요구되는 의학적으로 필요한 수술을 받는 면역적격성 사람 기증자로부터 얻었다. 조직을 특별히 이 연구 목적으로 얻지는 않았다. 연구된 대다수의 조직이 유아, 소아, 및 성인 기증자로부터 그렇지 않으면 폐기될 조직으로서 익명으로 얻었고, 연령, 성별 및 수술 적응증만 보유하였다. 이러한 사용은 사람 대상체 연구를 구성하지 않기 위해 및 IRB 검토를 면제받기 위해서 Institutional Review Board (IRB) of Duke University Medical Center에 의해 결정되었다. 그러나, 제거되고 그렇지 않으면 폐기될 임의의 흉선 조직이 잠재적으로 연구를 위해 사용되는 것을 허용하기 위해 일부 유아의 부모(들)에 의해 사전동의서가 제공되었다. 이들 동의된 조직은 암호화되었고, 따라서 연구팀은 연령 및 성별 외의 정보의 확인에 접근하지 못하였다. 동의된 폐기되는 조직의 이러한 사용은 IRB of Duke University Medical Center에 의해 승인되었다(Pro00103028).
흉선 가공 및 배양
각 흉선의 대표 부분들을 조직병리학적 평가를 위해 10% 중성 완충 포르말린에 고정한 다음에 가공하고 파라핀 블록(FFPF)으로 포매하였다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E)-염색 절편 및 면역조직화학적 패널을 각 조직 블록에 대해 얻었다. 잠재적으로 사용되는 항체는 판-사이토케라틴(클론 AE1/AE3; Leica), 사이토케라틴(CK) 14(클론 LL02; Leica), CD3(클론 LN10; Leica), Ki-67(클론 MIB-1; Dako), CD1a(클론; 공급처), 및 CCL21(클론; 공급처)을 인식하였다. 자동 또는 수동 면역조직화학을 표준 면역과산화효소 방법론 및 3,3'-디아미노벤지딘(갈색) 기질을 헤마톡실린 대비염색과 함께 사용해서 수행하였다.
< 9 개월 연령의 유아 기증자로부터의 일부 표본의 경우, 흉선 조직을 ~0.5 mm 두께로 슬라이싱하고, 다른 곳에서 상세히 기술된 바와 같이(Hong and Moore 1996)(Markert et al. 2003) 최장 21 일 동안 배양하였다. 간략하게 말하면, 흉선 슬라이스를 흡수성 젤라틴 스폰지 래프트(raft)에 의해 지지되는 필터 상에 놓고, Ham's F12 배양 배지 + 10% 태아 소 혈청에서 배지/공기 계면에서 최장 21 일 동안 배양하였다. 배양 배지를 각 조직 슬라이스 위에 분주되는 신선한 물질로 매일(24 ± 4 hr) 대체하였다. 주어진 기증자 흉선으로부터의 개별 슬라이스로부터 수집된 또는 모든 슬라이스로부터 취합된(pooled)(슬라이스 당 2.5 mL) 소모된/컨디셔닝된 배지의 분액을 -20 ℃에서 분석할 때까지 냉동시켰다. 배양된 흉선 슬라이스의 대표 슬라이스를 일반적으로 다음 범위 내의 ≥3 시점에서 10% 중성 완충 포르말린에 고정시키고 파라핀 블록으로 가공하였다: 제0 일(접수 당일, 슬라이싱되지만 배양되지 않음), 제5 일 - 제9 일, 및 제12 일 - 제21 일.
다중 항체 마이크로어레이 및 효소 면역검정
3 개의 독립적인 흉선 배양물로부터 제1 일 - 제21 일에 얻은 컨디셔닝된 배양 배지의 분액에 존재하는 200 개 분석물의 수준을 제조자의 프로토콜에 따라서 다중 항체 마이크로어레이(RayBiotech)를 사용하여 결정하였다. 적어도 1개 흉선(n = 127)에 대해 검출 하한보다 높은 적어도 2 개 측정치를 갖는 분석물이 자연 로그(ln)-변환되었고, 곡선 아래 면적 및 회귀 분석으로 분석되었다(도 56).
추후 연구를 위해 분석물을 확인하는 선택 척도는 일관되게 증가하는 초기 낮은 수준(흉선 상피 (TE)-유래 생체표지자의 가정된 특징) 또는 일관되게 감소하는 초기 높은 수준(흉선세포-유래 생체표지자의 가정된 특징), 분석되는 흉선 배양물 3개 모두에서 유사한 발현 패턴, 및 기원 및/또는 흉선 생물학의 가정된 세포와 분석물의 기능적 관련성의 공개된 증거를 포함하였다. 고도로 발현되고(곡선 아래 면적에 의해 지시됨), 허위 발견에 대한 보정이 있거나 또는 없이 통계적으로 유의미한(p ≤ 0.05) 변화를 갖는 분석물을 선호하였다. 컨디셔닝된 배지에서 L-셀렉틴의 수준을 희석 인자를 감안하여 각 샘플에 대해 위에서 기술된 바와 같은 항체 마이크로어레이 또는 3952 pg/mL의 하한 정량 한계(LLOQ) 및 4,656,306 pg/mL의 상한 정량 한계를 갖는 LuminexTM 비드(bead)-기반 면역검정(R&D Systems)에 의해 정량화하였다. CCL21 분비를 S자형 최적 적합값 및 로그 스케일(r2 = 0.9986)을 사용하는 표준 곡선에 기초하여 DuoSet 사람 CCL21 ELISA 키트(R&D Systems)를 사용하여 pg/mL로 결정하였다.
다중 유전자 발현 검정
다중 유전자 발현을 제조자의 설명서에 따라서 QuantiGene Plex 검정(Thermo-Fisher)을 사용하여 사람 흉선 조직으로부터 유래된 FFPE 블록으로 측정하였다. 간략하게 말하면, 6 - 8 mm3 흉선 조직을 10 μm 두께 FFPE 절편으로부터 육안절제(macro-dissection)하고, 검정 튜브에 놓고, 용해하여 표적 RNA를 방출하였다. 형광 LuminexTM 비드를 포획 익스텐더(extender), 라벨 익스텐더, 블록킹 프로브, 및 조직 용해물과 함께 인큐베이션하여 확정된 형광 프로파일을 갖는 비드에 대해 특이적인 mRNA를 포획한다. 분기형 DNA 기술을 사용하여 각 결합된 mRNA와 관련된 신호를 증폭시킨 후 스트렙타비딘-피코에리트린과 혼성화하였다. 각 비드의 형광 및 그의 관련된 피코에리트린 신호를 Bio-Plex 200 기기(Bio-Rad)를 사용하여 측정하였다. 각 관심 분석물의 배경-보정 형광 신호를 각 흉선 샘플에 대해 GAPDH의 신호로 정규화하고, 그 다음에 아래에서 기술되는 바와 같이 조직 조성에 기초하여 추가로 정규화하였다.
조직 형태계측
H&E, 판-사이토케라틴(CK) (AE1/AE3), 및 CD1a 면역조직화학적 슬라이드를 Leica SCN 슬라이드 스캐너(Leica Microsystems)를 사용하여 40X 배율로 디지털 스캔하고, 병리학자(LPH)에 의해 가상 현미경(ImageScope software; Leica Biosystems)을 사용하여 검사하였다. H&E 염색에 의해 경계를 분명히 나타낸 슬라이드 상의 흉선 조직의 총 영역("총 영역"), 흉선 상피를 함유하는 영역("TE 영역", CK 면역조직화학에 의해 경계를 분명히 나타냄), 및 비성숙 흉선세포를 함유하는 영역("피질 영역", CD1a 면역조직화학에 의해 경계를 분명히 나타냄)은 이전에 기술된 바와 같은(Ito et al. 2017) ImageScope software에 의해 제공되는 "펜 툴"을 사용하여 그들의 윤곽을 그림으로써 결정하였다(도 57a 내지 57c). 각 조직에 대해 확인된 개별 영역(μm2)을 합계를 위해 Microsoft Excel에 임포트(import)하고, 그 다음에 데이터 제시를 위해 mm2로 반올림하였다. 각 슬라이드 상의 흉선 조직의 양의 차이를 조정하기 위해, TE, 및 피질 영역을 검사되는 흉선 조직의 총면적으로 나눔으로써 총면적의 %로 전환하였다. 발달하는 흉선세포의 조직 함량을 % 피질 면적, 즉, CD1a+ 비성숙 흉선세포를 함유하는 조직의 백분율로 정의하였다.
통계 분석
적어도 1 개 흉선에 대해 200 개 분석물 중 총 127 개가 적어도 2 일에 검출의 검정 한계보다 높은 측정치를 가졌다. 전체적으로, 14 개 분석물을 1개 흉선으로부터의 배지에서 측정하였고, 17 개를 2개 흉선으로부터의 배지에서 측정하였고, 96 개를 3개 흉선으로부터의 배지에서 측정하였다. 개별 위계 선형 회귀 모델을 각 분석물에 대해 적합화하였고, 흉선에 의해 클러스터링되는 반응과 함께 일별로 ln(pg/mL)을 예측하였다. 평균 변화/일 ln(ng/mL)을 반영하는 각 모델로부터의 기울기 매개변수를 평균 일일 배가적 변화 pg/mL를 반영하는 지수화 기울기와 함께 보고하였다. P-값을 Benjamini-Hochberg 절차를 사용하여 허위 발견에 대한 조정과 함께 및 그러한 조정 없이 보고하였다. 모델 결과를 또한 21-일 배양 기간 동안 ln(pg/mL)에 기초하여 계산된 각 분석물에 대한 곡선 아래 사다리꼴 면적(AUC)의 추산치와 함께 보고하였다.
QuantiGene 발현 분석을 넓은 연령 범위에서 전체 흉선 조직에 대해 수행하였기 때문에, 흉선 상피를 함유하였고/거나 흉선세포생성에서 활성인 연구된 조직의 퍼센트가 달랐다. 이것을 다루기 위해, 초기 QuantiGene 결과를 형태계측에 의해 결정되는 흉선 상피 세포를 갖는 퍼센트 면적 또는 활성 피질을 갖는 퍼센트 면적으로 추가로 정규화하였다.
결과
배양된 사람 흉선에 의해 생성되는 가용성 분자
상이한 기증자로부터의 3 개 연속 흉선 배양물로부터 배양 제1 일 - 제21 일에 얻은 컨디셔닝된 배지의 샘플을 다중 항체 마이크로어레이에 의해 200 개 분자에 대해 스크리닝하였다. 적어도 1 개 흉선에 대해 검출 하한보다 높은 적어도 2 개 측정치를 갖는 127 개 분석물을 곡선 아래 면적 및 회귀 분석에 의해 추가로 분석하였다(도 56). 42 개 분석물은 비보정된 p 값 < 0.05에 의해 지시되는 바와 같이 배양이 진행됨에 따라 배양 배지로 상당히 증가된(n = 15) 또는 감소된(n = 27) 방출을 보여주었다(도 56). 이들 분석물 중 5개(L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 및 갈렉틴-7)는 3 개 흉선 배양물 모두에서 유사한 패턴의 발현을 보여주었고, 허위 검출률(FDR) 보정이 적용될 때 배양 중에 시간에 따라서 상관관계에 대해 p < 0.05을 계속 가졌다(도 56).
갈렉틴-7, M-CSF, 및 L-셀렉틴의 수준은 시간에 따라서 감소하였고, 가능한 흉선세포-생선된 가용성 분자의 사전명시된 척도를 충족시켰다(도 50a, 50b, 및 50c).
갈렉틴-7(LGAGS7 유전자에 의해 코딩됨)이 해살 소체에 존재하는 말단 분화된 TE 세포에 의해 발현된다고 보고되었을지라도(Kuwabara et al. 2002), 배지에서 그의 수준은 흉선세포의 생체표지자에 대해 예상된 바와 같이 배양이 진행됨에 따라서 감소하였다. 갈렉틴-7이 다수의 세포 유형에서 세포자살을 촉발하는 p53-유도된 단백질이기 때문에(Biron-Pain et al. 2013), 그것은 또한 배양 동안의 흉선세포 소실과 관련 있을 수 있지만, 흉선세포에 특이적일 것 같지 않다. 마찬가지로, M-CSF가 TE 세포에 의해 생성된다는 것을 보여주었고(Le et al. 1988), 또한 흉선 내에 존재하는 다수의 다른 세포 유형에 의해 생성될 수 있다. 대조적으로, L-셀렉틴의 발현은 조혈 세포에 제한되고, 흉선세포에서 발현된다는 것이 잘 알려져 있다. 그 자체로 분비되지 않지만, L-셀렉틴은 구성적으로 뿐만 아니라 백혈구 부착 및 이동 동안에 탈락되고(Hafezi-Moghadam et al. 2001; Ivetic et al. 2019), 그 다음에 신속하게 재발현되는(Fitzhugh et al. 2008) 제1형 막관통 당단백질이다. 따라서, 컨디셔닝된 배양 배지에서 가용성 L-셀렉틴이 흉선 배양물 내에 존재하는 생존가능 흉선세포의 수와 잠재적으로 관련 있을 수 있는 가용성 생체표지자로서 추가의 유효성 확인을 위해 선택되었다.
배양 배지에 분비되는 CCL21, CXCL16, 및 CXCL12의 수준이 시간에 따라서 증가하였고, 가능한 TE-생성된 가용성 분자의 사전명시된 척도를 충족시켰다(도 50d, 50e, 및 50f). 이들 케모카인 3개 모두가 TE 세포에서 발현된다는 것을 이전에 보여주었다 (Bunting et al. 2011; Liu et al. 2005). 또한 CCL21이 조기 흉선세포 전구체 및 흉선세포 둘 모두에 대한 그의 화학주성 효과 때문에 흉선에서 기능적으로 중요하다는 것을 보여주었다(Hu et al. 2015; Kozai et al. 2017). 따라서 본 발명자들은 CCL21을 배양된 흉선 슬라이스 내의 흉선 상피의 함량 및 기능을 반영할 수 있는 잠재적 생체표지자로서 추가로 유효성 확인하는 것을 택하였다.
L-셀렉틴의 컨디셔닝된 배지 수준이 사람 흉선 장기 배양 동안에 감소하고, 생존가능 흉선세포와 관련된다.
스크리닝 마이크로어레이에 의해 확인되는 장기 배양 배지 내로의 L-셀렉틴 방출의 패턴은 항체 마이크로어레이 및 cc 비드-기반 다중 면역검정 둘 모두를 사용하여 배양 중 시간의 함수로서 1 개의 이전에 분석된(MFG-026) 및 3 개의 추가의 흉선 장기 배양물로부터의 컨디셔닝된 배지에 존재하는 가용성 L-셀렉틴의 수준을 결정함으로써 확증하였다. 초기 스크리닝 어레이에 의해 시사되는 바와 같이, 컨디셔닝된 배양 배지에서 L-셀렉틴의 수준은 일반적으로 초기에는(예를 들어 제1 일) 매우 높지만, 제5 일까지 낮은 수준으로 신속하게 감소하였고, 그 수준을 21일 배양 기간의 나머지 동안에 유지하였다(도 51a, 51b). L-셀렉틴 수준의 이들 변화는 배양 동안에 일어나는 생존가능 흉선세포에서 관찰되는 변화와 유사하였다. 세포를 T 계통으로서 확인하는 항-CD3 항체 및 증식하는 세포를 확인하는 항-Ki-67 항체와의 면역조직화학은 배양 초기에 흉선세포 생존능의 신속한 소실을 입증한다(도 52). 제0 일에, 피질 및 수질에서 본질적으로 모든 비성숙 T 세포의 혈장막은 항-CD3와 막 패턴으로 강하게 반응하는 것같이 보인다(도 52b). 수 일의 배양 후, 대다수의 갈색은 죽은 흉선세포가 핵융해/핵 용해를 겪은 후 남는 무핵이지만 여전히 면역반응성인 쇄설물 때문이지만(도 52e), 그들의 쇄설물이 조직 슬라이스에 여전히 남아 있다. 그러나, 원상태 혈장막을 가지는 것같이 보이는 드문 흉선세포/T 세포는 배양 중에 ~3 주후에도 CD3 면역조직화학에 의해 잠재적으로 확인될 수 있다[보여주지 않음;( Hale 2020) (Markert et al. 1997a). 마찬가지로, Ki-67 증식 표지자에 대해 특이적인 항체를 사용하는 면역조직화학은 피질에서 일어나는 현저한 증식/클론 확장과 일관되는 제0 일에서의 피질 흉선세포와의 풍부한 반응성을 보여준다(도 52c), 그러나, 장기 배양 동안에 일어나는 흉선세포 죽음은 배양 동안에 더 나중 시점에서 TE 세포와 형태학적으로 일관되는 더 큰 세포와만의 Ki-67 면역반응성을 초래한다(도 52f).
CCL21 분비는 장기 배양 동안에 증가한다.
스크리닝 마이크로어레이에 의해 확인되는, 시간에 따라 장기 배양물로의 증가하는 CCL21 방출의 패턴(도 50e)은 효소 면역검정을 사용하여 추가의 흉선 장기 배양에서 CCL21의 정량화에 의해 유효성 확인되었다. 흉선 표본을 도 53b에서 보여주는 바와 같이 연속적으로 슬라이싱하고, 그 다음에 최장 21일 동안 배양하고, 사전명시된 샘플링 계획에 따라서 각 흉선 샘플로부터 유래된 모든 슬라이스로부터 또는 개별 슬라이스로부터 매일 취합된 소모된 배지를 분석하였다. 소모된 배지의 매일 취합된 샘플의 CCL21 함량은 배양 중에 시간이 증가함에 따라 기준선 위로 현저하게 증가된 정상 상태 수준까지 증가하는 패턴을 보여주었다(도 53a; n = 8 개 배양물). 개별 슬라이스에 의한 분비는 정량적으로 달랐지만, 전체 분비 패턴은 주어진 흉선으로부터 유래된 모든 슬라이스에서 유사하였고, 초기 낮은 CCL21 분비가 배양이 계속됨에 따라 지속적으로 훨씬 더 높은 수준으로 증가하였다 (도 53c).
CCL21은 사람 흉선 슬라이스에서 주로 TE 세포에 의해 생성된다.
그 다음, 신선한 및 배양된 사람 흉선 조직으로부터의 FFPE 절편을 CCL21-특이적 항체와 반응시켜서 배양이 진행됨에 따라 관찰되는 이 케모카인의 증가되는 분비를 책임 맡는 세포 유형(들)을 결정하였다. 신선하게 슬라이싱된 비배양된 흉선에서의 TE 세포(제0 일)는 수질 영역에서 가장 강하였지만(도 54a, 54b) 또한 피질에 산포된 TE 세포를 포함하는 패턴으로 CCL21 항체와 중간 정도의 반응성을 보여주었다. 유사한 패턴의 반응성이 배양된 흉선에서 보였고, 수질 영역에서의 TE 세포 뿐만 아니라 피질 영역에서의 산포된 TE 세포의 중간 정도 내지 강한 면역반응성을 가졌다(도 54c, 54d).
전연령에서의 흉선 유전자 발현의 결정
T 세포-고갈된 배양된 사람 유아 흉선으로부터의 이들 결과가 노화하는 사람 흉선의 변화와 얼마나 관련 있을지를 결정하기 위해, 전연령에서 47명 기증자로부터 유래된 FFPE 흉선 조직을 QuantiGene 다중 유전자 발현 검정을 사용하여 연구하였다. 연구된 코호트는 5 일 내지 70 세 연령의 남성 19 명, 5 일 내지 78 세 연령의 여성 27 명, 및 성별이 기록되지 않은 29 세 기증자로부터의 한 샘플을 포함하였다. 이들 샘플의 연령 및 성별 분포를 도 59a에서 보여준다.
≤18 세 기증자(n = XX)로부터 얻은 흉선 조직은 18 세 초과 기증자와 비교할 때(n = XX; p = 0.yy) GAPDH에 대해 T 세포 표지자 CD3ε 및 피질 흉선세포 표지자 CD1a를 코딩하는 mRNA의 더 높은 발현(도 55a, 55b)을 보여주었고, 이는 CD1a 면역조직화학에 의해 더 어린 조직에서 관찰되는 활성 흉선세포생성에 관여하는 증가된 피질 영역과 일관된다(도 59c). 흉선 상피를 함유하는 흉선 조직 절편의 백분율은 또한 더 나이 많은 성인(p 0.zz)에 비해 ≤18세 기증자에서 더 높았다. 그러나, 사이토케라틴 8(KRT8) 및 14(KRT14)를 코딩하는 mRNA는 더 나이 많은 성인에 비해 ≤18세 기증자에서 GAPDH에 대해 감소하였고(도 55c, 55d), 이는 더 어린 기증자에서 흉선 상피를 함유하는 영역의 더 높은 백분율을 고려할 때(도 59b) 예상치 못했던 관찰이다.
이 쟁점을 다루기 위해서, 유전자 발현 결과를 판-사이토케라틴 면역조직화학에 의해 지시되는 바와 같이 흉선 상피를 함유하는 영역 중의 그들의 퍼센트 및 CD1a 면역조직화학에 의해 지시되는 바와 같이 활성 흉선세포생성을 갖는 피질 영역 중의 그들의 백분율에 기초하여 추가로 정규화하였다(도 59). 도 55에서 보여주는 바와 같이, 이들 두 정규화 방법은 비조정된 데이터의 경우에 보이는 이상치를 본질적으로 제거하였고, 매우 유사한 비를 초래하였다. 흥미롭게도, 두 정규화 방법 후, ≤18 세 기증자로부터의 흉선 조직은 더 나이 많은 성인으로부터의 흉선보다 더 많은 CD3E 및 CD1a mRNA 및 더 적은 KRT8 및 KRT14 mRNA를 계속 발현하였다.
흉선세포가 노화 때문에 감소함에 따라 CCL21 및 CXCL12의 전체 흉선 발현은 증가한다.
비조정된 CCL21 유전자 발현은 ≤18세 기증자로부터의 흉선에서 GAPDH에 대해 일관되게 낮았다(도 6e). 대조적으로, 비조정된 CCL21 발현은 더 나이 많은 성인 그룹에서 더 높고 더 가변적이었고, 이상치가 많았다. TE에 기초한 정규화.
흉선세포가 노화 때문에 감소함에 따라 CCL21 및 CXCL12의 전체 흉선 발현은 증가한다.
비조정된 CCL21 유전자 발현은 ≤18세 기증자로부터의 흉선에서 GAPDH에 대해 일관되게 낮았다(도 55e). 대조적으로, 비조정된 CCL21 발현은 더 나이 많은 성인 그룹에서 더 높고 더 가변적이었고, 이상치가 많았다. TE 영역 또는 피질 영역에 기초한 정규화는 이상치를 제거하였고, 두 기증자 연령 그룹 간에 증가된 분리를 초래하였다(도 55e). 유사한 결과가 케모카인 CXCL12에서 보였다(도 55f).
실시예 13
흉선의 한 부분으로부터의 조직학 시험 결과가 동일한 흉선의 임의의 다른 부분에서의 조직학 시험 결과를 대표하는 것으로 여길 수 있는지를 결정하기 위해 흉선내 가변성을 연구하였다. 이 시험의 결과는 얼마나 많은 샘플이 일상적 출하 시험 동안 뿐만 아니라 공정 유효성 확인 시험을 위해 시험되어야 하는지를 결정하는 데 사용하였다.
제5 일 - 제9 일에 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해 양성인 영역; 확인된 적어도 1개 해살 소체; 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색; 및 관찰된 원상태 핵에 대한 사정을 포함하는 조직학 수용 척도를 이전에 언급한 바와 같이 확립하였다.
이 연구를 위해, 3개 흉선을 방향성 있는 방식으로 슬라이싱하고, 각 흉선 내에서 슬라이스의 위치를 추적하였다. 슬라이스를 6-웰 플레이트에서 배양하여 각 슬라이스의 추적을 허용하였다. 슬라이싱을 도 62a에서 보여주는 바와 같이 수행하였다.
연구에서 각 흉선에 대해, 슬라이스를 다음 시점, 기준일(제0 일), 제5 일, 제9 일, 제12 일 및 제21 일 각각에서의 분석에 사용하였다.
각 흉선에 대해 각 시점에서 5 - 11 개 슬라이스를 배양하였다. 슬라이스를 위에서 기술된 방법에 따라서 매일 배지를 교체하면서 배양하였다. 슬라이스를 병리학 실험실에서의 H&E 염색을 위해 제출하였고, 동일성, 효력 및 생존능에 대해 분석하였다. 이 연구에서 모든 슬라이스는 위에서 기술된 바와 같이 조직학 시험을 위한 출하 수용 척도, 즉, 제5 일 - 제9 일에 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해 양성인 영역; 확인된 적어도 1개 해살 소체; 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색; 및 관찰된 원상태 핵을 충족시켰다.
각 슬라이스가 출하 수용 척도를 충족시키는지의 사정 외에도 추가로, 병리학자는 각 H&E 및 AE1/AE3 슬라이드를 더 상세히 검토하였다. 배양된 흉선 조직 로트 MFG-056의 이들 슬라이드 중 일부의 이미지를 도 63a-h에서 보여준다. 다음 관찰을 기록하였다.
동일한 기증자 흉선으로부터 유래된 모든 슬라이스는 각 시점에서 수용 척도를 충족시켰다. 상이한 슬라이스에서, 피질의 영역들이 서로 유사하고, 수질의 영역들이 서로 유사하다. 그러나, 슬라이스 간에 피질 및 수질의 상대 비율의 변화가 관찰되었다.
배양 시간의 함수로서 동일한 흉선으로부터 유래된 상이한 슬라이스 간의 관찰된 차이는 주로 흉선세포의 괴사의 양(배양 시간이 증가함에 따라 증가함) 및 잔류 흉선세포 수(배양 시간이 증가함에 따라 감소함)와 주로 관련 있다.
이들 관찰에 기초해서, 흉선으로부터의 임의의 한 슬라이스가 전체 흉선을 대표하였다. 추가로, 제5 일에 조직 슬라이스의 조직학적 외관은 나중 시점(제9 일, 제12 일 및 제21 일) 각각에서 관찰되는 것을 반영한다.
실시예 14: 전체 흉선 시간 경로 연구
이 연구를 위해, 5 개 흉선을 슬라이싱하고 SOP에 따라서 배양하였다. 슬라이싱 당일에 첫번째, 중간 및 마지막 슬라이스를 면역조직화학을 위해 준비하였다. 각 흉선의 나머지를 슬라이싱하고, 6-웰 플레이트에서 배양하였다. 각 흉선에 다음 시점 중 하나를 지정하였다: 기준일(제0 일), 제5 일, 제9 일, 제12 일 및 제21 일. 제0 일 흉선 슬라이스에 대해서는 도 64a, 제5 일 슬라이스에 대해서는 도 65a, 제12 일 슬라이스에 대해서는 제6 일, 및 제21 일 슬라이스에 대해서는 도 67a를 참조한다.
각 흉선으로부터의 슬라이스의 총 수는 21 내지 62 개 슬라이스의 범위였다. 슬라이스를 위에서 개요한 절차에 따라서 매일 배지를 교체하면서 배양하였다. 슬라이스를 병리학 실험실에서의 H&E 염색을 위해 제출하고, 동일성, 효력 및 생존능에 대해 분석하였다. 이 연구에서 모든 슬라이스는 조직학 시험을 위한 출하 수용 척도, 즉: 제5 일 - 제9 일에 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해 양성인 영역; 확인된 적어도 1개 해살 소체; 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색; 및 관찰된 원상태 핵을 충족시켰다.
각 슬라이스가 출하 수용 척도를 충족시켰는지의 사정 외에도 추가로, 병리학자는 각 H&E 및 AE1/AE3 슬라이드를 더 상세히 검토하였다. 다음 관찰을 기록하였다.
동일한 기증자 흉선으로부터 유래되고 동일한 시점에서 시험되는 모든 슬라이스가 위에서 기술된 바와 같은 수용 척도를 그 시점에서 유사하게 충족시켰고, 피질 및 수질의 상대적 양, 잔류 흉선세포 및/또는 괴사의 차이가 있었다.
기록된 차이는 흉선 피질 대 수질의 상대 크기, 형상, 상대 함량, 괴사의 양, 흉선 상피의 응축 및 잔류 흉선세포의 수였다.
추가로, 상이한 시점에서 시험된 상이한 기증자로부터의 로트는 또한 질적으로 서로 유사하였다. 관찰된 차이는 괴사의 양(배양 시간이 증가함에 따라 증가함) 및 잔류 흉선세포 수(배양 시간이 증가함에 따라 감소함)와 관련 있었다.
임의의 한 슬라이스의 조직학적 검사는 전체 로트의 수용성에 관해 동일한 결론을 초래하였다. 이들 관찰에 기초하여, 흉선으로부터의 임의의 한 슬라이스의 관련 특징은 전체 흉선의 관련 특징을 반영한다. 추가로, 제5 일에 조직 슬라이스의 조직학적 외관은 나중 시점(제9 일, 제12 일 및 제21 일) 각각에서 관찰되는 것을 반영하지만, 나중 시점에서 더 많은 괴사가 관찰된다. 도 68은 제0 일 내지 제21 일에 항체 AE1/AE3에 의해 사정되는 바와 같이 상피 망상조직의 유사성을 보여주는 좋은 예이다.
실시예 15: 흉선 조직 강제 분해 연구
이 연구에서는, 흉선 조직 슬라이스를 처리하여 분해되거나 또는 생존불능하다고 여겨지는 조직 슬라이스를 생성하였다. 3 개 흉선을 이 실험에 사용하였다. 대조 샘플을 각 흉선으로부터 채취하였다. 표 10에서 제시된 처리 조건을 시험하였다.
실시예 16: 흉선 조직 강제 분해 연구
이 연구에서는, 흉선 조직 슬라이스를 처리하여 분해되거나 또는 생존불능하다고 여겨지는 조직 슬라이스를 생성하였다. 3 개 흉선을 이 실험에 사용하였다. 대조 샘플을 각 흉선으로부터 채취하였다. 표 5에서 제시된 처리 조건을 시험하였다.
Figure pct00015
슬라이스를 함유하는 10 cm 배양 접시를 지퍼락에 넣고, 55 ℃ 수조에 넣음으로써 열 충격을 달성하였다. 플레이트는 지지체 상에 받쳐져 있고 물에 잠기지 않았다. 10 cm 배양 접시를 -20 ℃ 냉동고에 4 시간 동안 넣은 다음 주위 온도에서 해동함으로써 냉동/해동을 달성하였다.
샘플들을 배양 중에 제5 일 및 제9 일에 조직학에 대해 시험하였다. 일부 샘플은 또한 제21 일에도 시험하였다. 이 연구에서 모든 슬라이스는 조직학 시험을 위한 출하 수용 척도 즉: 제5 일 - 제9 일에 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해 양성인 영역; 확인된 적어도 1개 해살 소체; 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색; 및 관찰된 원상태 핵을 충족시켰다.
각 슬라이스가 출하 수용 척도를 충족시키는지의 사정 외에도 추가로, 병리학자는 각 슬라이드를 더 상세히 검토하였다. 다음 관찰을 기록하였다.
냉동/해동 또는 10X PBS에 노출된 샘플은 가장 많은 괴사를 보여주었지만, 일부 세포는 여전히 원상태인 것같이 보였고 생존능에 대한 조직학적 척도를 충족시켰다. 10X PBS에의 노출의 예에 대해서는 도 61을 참조한다.
실온에서 유지되고 탈수되고 생리식염수 또는 1% DMSO에서 인큐베이션되거나 또는 열 충격을 받은 슬라이스는 더 적은 정도의 조직학적 변화를 보여주었다.
대조 샘플에 대해서는, 병리학자가 다음 관찰을 기록하였다.
흉선 조직이 배양될 때 흉선세포가 점진적으로 소실된다. 그러나, 죽은 세포는 그들을 청소하는 식세포를 동원할 수 없기 때문에 배양된 흉선에서 장기간 잔존할 수 있다. 세포자살적 세포 죽음을 겪은 세포의 핵은 초기에 응축하고 헤마톡실린 염료로 더 어둡게 (청색) 염색된다. 이들 세포는 그들의 에너지를 고갈시키지만 식세포 작용으로 제거되지는 않기 때문에, 그들은 그들의 막 완전성을 소실하고 괴사성이 된다. 핵융해(괴사성 세포에서 핵의 용해)는 대표적으로 생체내에서 2-3일 내에 일어나지만, 흉선 배양 동안에는 더 느리게 일어나는 것같이 보인다. 따라서, 흉선세포 핵이 핵융해를 겪은 괴사성 세포 쇄설물의 큰 호산구성 (분홍색) 넓은 구역을 보는 것은 흔하다. 일부 죽은 흉선세포는 그들의 핵을 보유하고, 그것은 들쑥날쑥한 가장자리를 가지고, 생존가능 세포의 염색 특성과 비교해서 변경된 염색 특성을 가진다.
흉선세포가 조직으로부터 고갈되기 때문에, 흉선 상피 세포가 더 잘 보이게 된다. 3 차원 흉선 상피(TE) 망상조직은 정상적으로 절편에서 연결된 상피세포 및/또는 검사되는 절편에서 연결이 분명하지 않은 (겉보기에) 산포된 TE 세포의 밝은 레이스 모양의 배열에 의해 입증된다. 흉선세포가 배양 동안에 소실되기 때문에, 3차원 망상조직이 수축한다. 이것은 잔류 상피의 응축을 초래하고, 이렇게 함으로써 피막하 피질 상피 층이 더 두꺼워지고, 수질 TE 세포가 더 조밀하게 채워진다. 생존가능 TE 세포의 핵은 대표적으로 타원형이고, 흉선세포의 핵보다 크고, 헤마톡실린 (청색) 염색에 의해 윤곽이 그려진 선명하게 경계를 나타낸 핵막, 뿐만 아니라 하나 이상의 핵소체를 가진다. 이들 TE 핵은 대표적으로 "개방"된 것으로 보이고, 이는 그들이 헤마톡실린으로 어둡게 염색되지 않는다는 것을 의미한다. 이것은 그들이 살아있고 대사적으로 활성이라는 해석에 들어맞고, 그 이유는 활성 크로마틴("진정염색질")이 헤마톡실린 염료와 결합할 수 없기 때문이다. 많은 TE 세포에서 리보솜 합성 부위인 핵소체의 존재는 그들이 살아있고 대사적으로 활성이라는 것을 추가로 확증한다. 제5 일, 제12 일 및 제21 일로부터의 대조 절편의 대표적인 조직학적 외관을 각각 도 65, 66 및 67에서 보여준다.
실온, 탈수, 1% DMSO 및 열 충격을 포함하는 처리 조건에 대해, 병리학자는 슬라이스들의 외관이 대조군의 외관과 그다지 상이하지 않다는 것을 지시하였다. 열 충격을 받은 샘플에 대해서, 병리학자는 열처리가 추가 분해를 방지하는 단백질을 응고시킴으로써 세포를 "고정"할 수 있다는 것을 언급하였다. 열 처리는 흉선을 포함해서 조직의 고정제로서 사용되었다.
도 12a 및 12b는 강제 분해 조건에 노출 후 흉선 조직 슬라이드의 조직학을 묘사한다. 도 10a 및 10b는 제21 일에 대조 흉선 조직 슬라이스의 조직학적 외관을 묘사한다.
강제 분해 조직의 일반적인 조직학적 외관은 이들 시점에서 유사하지만, 제21 일에는 더 적은 잔류 흉선세포를 가진다(도 12b). 수질 영역에서 대표 해살 소체는 도 12b에서 화살촉으로 지시된다. 대표하는 생존가능해 보이는 흉선 상피 세포는 도 12a 및 12b에서 화살표로 지시된다. 도 12b에서 보여주는 피질 영역은 제21 일에 괴사성 림프구로 거의 전부 이루어진다. 하단 좌측의 막대는 100 μm를 나타낸다.
실시예 17: 흉선 조직 약물 물질 배치 분석
흉선 조직의 10 개 로트에 대한 배치 분석 데이터를 하기 표 11에서 보여준다.
Figure pct00016
핵심:
(e) 이들 로트는 제작시 준비되어 있었던 규격에 따라서 시험하였다. 이 표에서 제시되는 약물 물질 시험 결과는 또한 최종 약물 생성물 시험 결과를 나타낸다.
(f) 외관 규격은 탬퍼링 또는 용기 손상의 증거가 없었다.
(g) 조직학 검정이 동일성 및 효력 둘 모두에 사용되었다. 조직학 규격(제5 일 - 제9 일에 시험됨)은 다음과 같았다:
(h) 조직 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴에 대해 양성인 영역
i. 확인된 적어도 1 개 해살 소체
ii. 조직 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색
iii. 관찰된 원상태 핵
iv. 멸균성 및 마이코플라즈마 샘플을 제1 일, 제7 일 및 제14 일에 수집하였다.
56 개 임상 흉선, 흉선내 가변성, 흉선간 가변성 및 시간 경로 시험에 사용되는 8 개 흉선, 및 강제 분해를 겪은 3 개 흉선의 데이터를 사용해서 현 대조 라이브러리를 생성하였다. 라이브러리에서 강제 분해 샘플(음성 대조군)은 냉동/해동 또는 10X PBS에의 노출에 의해 분해를 겪은 샘플들이었다. 전체 데이터 세트는 14 개 상이한 클러스터를 초래하였다. 모든 강제 분해 샘플을 함께 클러스터링하였고, 임상 샘플 또는 특성화 샘플은 강제 분해 샘플과 클러스터링하지 않았다.
실시예 18
방법
사전동의 후 총 30 개 샘플을 위해 흉선 조직을 3 개의 다른 연령 그룹: 9 개월 내지 9 세; 10 세 내지 25 세; 및 26 세 내지 49 세의 심장 수술 환자로부터 전향적으로 수집한다. 이 프로젝트의 예비 연구의 일부로서, 지방 조직을 슬라이싱하기 위한 신규 맞춤 기기장치를 개발하였다. 더 나이 많은 흉선으로부터의 지방 조직의 Stadie-Riggs 마이크로톰을 이용한 전통적인 슬라이싱은 면역조직화학에 의해 사정될 수 있는 슬라이스를 수득하지 못했다. 지방 흉선의 경우, 따라서, 단면 면도날(대략 10)을 함께 와이어로 엮고 멸균시킨다. 면도날 간의 거리는 대략 1 mm이다. 대략 1cm x 1 cm x 1 cm 흉선 조직 조각을 멸균 조직 배양 접시 바닥에 놓는다. 결합된 면도날을 흉선 조직 안으로 누른다.
개별 슬라이스를 면도날 사이로부터 제거하고, 염색에 사용한다. 21 일 동안 사람 흉선 조직의 슬라이싱 및 배양을 이전 실시예에서 기술된 바와 같이 수행한다. 제1 일, 제5 일, 제12 일 및 제21 일로부터의 조직 슬라이스 및 소모된 배지를 추후 분석을 위해 냉동시킨다. 제0 일 및 제21 일로부터의 조직 슬라이스를 또한 포르말린-고정된 및 파라핀-포매된(FFPE) 블록으로 가공하여 아래에서 기술되는 바와 같은 면역조직학적 연구를 용이하게 한다.
분석은 제0 일 및 제21 일로부터의 FFPE 블록으로 시작하고, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 절편 뿐만 아니라 사이토케라틴(AE1/AE3 칵테일), 사이토케라틴(CK) 14, 증식(Ki-67), T 세포 함량(CD3), 및 케모카인(CCL21) 생성에 대한 면역조직화학(IHC)을 사용한다. 제0 일의 수용되는 기증자 흉선의 조직학적 특징은 유기적인 흉선 상피 (TE) 망상조직, CK14를 재군집 잠재력의 표지자로서 발현하는 TE 세포의 존재, 획득시 흉선세포생성의 표지자로서 비성숙 흉선세포 및 해살 소체의 존재, 및 조직 생존능의 지시자로서 >90% 원상태 핵을 포함한다. 배양된 흉선 슬라이스는 흉선 상피 세포 생존능, TE 아키텍처의 유지, 생존가능 흉선세포의 현저한 고갈, 및 비성숙 흉선세포 전구체를 흉선으로 유인하는 책임을 맡은 케모카인 CCL21의 높은 생성을 포함하여 기능적으로 중요한 생체분자의 생성을 마찬가지로 입증해야 한다. 흉선 슬라이스에 의한 CCL21의 생성은 FFPE 슬라이스의 IHC 뿐만 아니라 소모된 배지의 효소 면역검정에 의해 사정한다(도 69).
사용된 흉선 조직이 다양한 정도의 연령-관련 위축을 나타낼 수 있기 때문에, 기본적 흉선 기능을 결정하는 것이 필수적이다. 기본적 흉선 기능은 이전에 기술된 바와 같이 제0 일로부터의 스캔된 조직 절편의 이미지 분석에 의해 결정한다(Ito, R., Hale, L.P., Geyer, S.M., Li, J., Sornberger, A., Kajimura, J., Kusunoki, Y., Yoshida, K., van den Brink, M.R.M., Kyoizumi, S., Manley, N.R., Nakachi, K., Sempowski, G.D.: Effects of age and exposure to ionizing radiation on human thymus morphology and function. Radiation Res., 187:589-598, 2017. 추가로, 나이브 T 세포의 흉선 생산량은 기증자 말초 혈액을 사용하여 결정된다. 말초 혈액 단핵 세포를 정제하여 보존하고; T 세포 표현형 을 다음 표지자를 사용하여 10-색 유동 세포 분석에 의해 결정한다: 생존능, CD3, CD4, CD8, CD19, CD16+CD56, CD45RA, CD57, 및 CD197. 말초 혈액 T 세포에 존재하는 신호 결합 T-세포 수용체 재배열 절단 서클(sjTREC)을 흉선 기원의 표지자로서 정량화한다. Lee EN, Park JK, Lee J-R, Oh S-O, Baek S-Y, Kim B-S, et al., 2011, "Characterization of the expression of cytokeratins 5, 8, and 14 in mouse thymic epithelial cells during 2011; 44: 14-24.thymus regeneration following acute thymic involution," Anat Cell Biol.
실시예 19. 배양된 사람 흉선의 조직병리학적 사정
이들 실험은 임플란팅된 조직에 사용되는 프로토콜에 따라서 배양될 때 사람 흉선 슬라이스에서 일어나는 조직병리학적 변화를 사정하고 기술하기 위해 수행하였다. 이들 변화의 이해는 이전 수혜자에서 면역 재구성을 성공적으로 생성한 조직의 특성에 기초하여 임플란테이션 전에 배양된 흉선 슬라이스의 질의 전향적 사정을 위한 조직병리학적 척도의 개발 및 유효성 확인을 잠재적으로 초래할 수 있다 Markert ML, Devlin BH, McCarthy EA., 2010, "Thymus transplantation," Clin Immunol. 2010; 135: 236-246. 종합해 보면, 이들 결과를 사용해서 임플란팅에 사용되는 슬라이스의 질을 평가하는 데 잠재적으로 역할을 할 수 있는 헤마톡실린 및 에오신 염색 및 사이토케라틴 면역조직화학에 의해 확인가능한 조직의 구조적 특징에 기초하여 진단 척도를 개발하는 데 사용될 수 있다.
물질 및 방법
흉선 조직은 교정 심장 수술을 받고 있는 < 9 개월 연령 면역적격성 유아 기증자로부터 얻었고, 여기서 흉선의 일부의 제거는 심장 수복을 용이하게 하는 데 일상적으로 요구된다. 각 기증자의 부모(들)는 제거되어 그렇지 않았다면 폐기될 임의의 흉선 조직이 임플란테이션 또는 연구에 잠재적으로 사용되는 것을 허용하는 사전동의서를 제공하였다. 이들 연구는 Institutional Review Board of Duke University Medical Center에 의해 승인되었다. 기증자 흉선을 슬라이싱하고, 우수 의약품 제조 품질 관리 기준(GMP)을 준수하는 세포 제작 실험실에서 수혜자의 근육에 수술적 임플란테이션하기 위해 수술실로 출하하기 전 최장 21일 동안 배양하였다. 기증자 적격성, 배양 및 수술적 임플란테이션 과정의 세부사항은 다른 곳에서 기술되었다 Markert ML, Sarzotti M, Ozaki DA, Sempowski GD, Rhein ME, Hale LP, et al., 2003, "Thymic transplantation in complete DiGeorge syndrome: Immunologic and safety evaluation in twelve patients," Blood, 102: 1121-1130. Markert ML, Alexieff MJ, Li J, Sarzotti M, Ozaki DA, Devlin BH, et al., 2004, "Postnatal thymus transplantation with immunosuppression as treatment for DiGeorge syndrome," Blood, 104: 2574-2581; Markert ML, Devlin BH, Alexieff MJ, Li J, McCarthy EA, Gupton SE, et al., 2007, "Review of 54 patients with complete DiGeorge anomaly enrolled in protocols for thymus transplantation: Outcome of 44 consecutive transplants," Blood, 109: 4539-4547; Hong R, wt al., 1996; Rice HE, eSkinner MA, Mahaffey SM, Oldham KT, Ing RJ, Hale LP, et al., 2004, "Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations," J Pediatr Surg., 39: 1607-1615. 배양 동안에 특정 시점에서, 각 기증자 흉선으로부터의 1 개 이상의 슬라이스를 10% 중성 완충 포르말린에 고정시킨 다음에 가공하고 조직병리학적 평가를 위해 포르말린-고정된 파라핀 포매된 블록으로 포매한다. 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)-염색 절편 및 면역조직화학적 패널을 각 조직 블록에 대해 얻었다. 사용된 항체는 판-사이토케라틴(클론 AE1/AE3; Leica), 사이토케라틴(CK) 14 (클론 LL02; Leica), CD3 (클론 LN10; Leica), 및 Ki-67 (클론 MIB-1; Dako)을 포함하였다. 자동 면역조직화학은 표준 면역과산화효소 방법론 및 3,3'-디아미노벤지딘 (갈색) 기질을 헤마톡실린 대비염색과 함께 사용하여 수행하였다. 배양 중에 시간에 따라서 흉선 샘플 내의 가변성을 사정하기 위해, 로트를 일반적으로 다음 범위 내의 ≥ 3 시점에서 조직학적으로 검사하였다: 제0 일(접수 당일), 제5 일 - 제9 일 및 제12 일 - 제21 일.
결과 및 논의
흉선 장기 배양이 제0 일부터 제21 일까지 진행함에 따라, 슬라이스는 괴사 양 증가, 흉선 상피 응축 증가 및 잔류 T 세포 수 감소를 발생하엿다. 흉선 상피 망상조직의 아키텍처는 21 일의 배양 전체에 걸쳐서 일반적으로 여전히 잘 보존되었고, 장기간 장기-재군집 잠재력을 갖는 흉선 상피 세포의 추정 생체표지자인 사이토케라틴 14의 초점성 발현이 일어난다. 동일한 기증자 흉선으로부터 유래된 모든 장기 슬라이스가 서로 밀접하게 유사하였고, 크기, 형상 및 피질 대 수질의 상대적 함량에 미미한 차이가 있다. 마찬가지로, 상이한 기증자로부터 유래된 슬라이스는 동일한 배양 시점에서 검사될 때 유사한 조직병리학적 특성을 보여주었다.
흉선으로서 조직의 초기 확인
흉선은 얇은 결합 조직 피막을 가지고, 이 결합 조직 피막은 대표적으로 실험실 가공 동안에 제거된다. 그러나, 피막(섬유주) 및 관련 혈관의 확장, 섬유 조직, 지방 조직, 및 가변적 수의 성숙 조혈 세포는 흉선 슬라이스에서 여전히 관찰될 수 있다. 섬유주는 흉선 조직을 소엽으로 나누고, 소엽은 흉선 상피 세포의 레이스 모양으로 보이는 3 차원 망상조직으로 구성되고, 발달하는 T 세포(흉선세포)를 함유하는 공간이 개재한다. 소엽은 대표적으로 바깥쪽 피질 및 안쪽 수질을 입증하고, 그들은 그들의 조직학적 외관 뿐만 아니라 그들이 함유하는 세포의 표현형 및 기능이 다르다. 흉선 피질은 헤마톡실린으로 매우 어둡게 염색되는 조밀하게 쌓인 비성숙 흉선세포 때문에 매우 호염기성(청색)이다. 흉선 수질에 존재하는 더 성숙한 흉선세포의 밀도는 피질의 밀도보다 낮고, 따라서 수질은 더 호산구성(분홍색)인 것처럼 보이는 경향이 있다. 흉선 수질은 또한 해살 소체라고 불리는 질병특유적 호산구성 사이토케라틴-함유 구조를 함유한다. 흉선 내에 존재하는 대식세포는 어둡게 염색되는 흉선세포의 배경과 대비를 이루며 밝은 색상의 원형 영역으로 보이는("별이 빛나는 하늘" 패턴) "가염성 소체"를 형성할 수 있다. 많은 수의 가염성 소체는 스트레스 퇴화에 특유하고, 스트레스 퇴화는 정상 흉선 기증자에서 심각한 심장 결함, 수술, 및/또는 코르티코스테로이드 치료의 스트레스 때문에 일어날 수 있고, 흉선의 임플란테이션 자격을 박탈하지 않는다. 배양 전에(제0 일) 슬라이싱된 정상 흉선의 대표적인 조직학적 특징을 도 71 - d에서 보여준다.
해살 소체의 평가
흉선 수질은 표피의 말단 분화된 상층과도 반응하는 단일클론 항체와 반응하는 말단 분화된 흉선 상피 세포로 구성된 해살 소체라고 불리는 특징적 구조를 함유한다. Hale LP, et al., 2004; 172: 617-624.
해살 소체는 조직 동일성의 표지자로서 역할할 수 있고, 그 이유는 그들이 흉선에서만 발견되기 때문이다. 그들은 또한 투입 기증자 조직의 질을 반영할 수 있고, 그 이유는 말단 분화 과정이 정상적으로 흉선세포-흉선 상피 세포 상호작용에 의해 촉발되기 때문이다. Id. 해살 소체는 H&E-염색 슬라이드 상에서 상피세포의 호산구성 소용돌이 모양으로서의 그의 외관에 의해 통상적으로 쉽게 확인된다(도 72a-d). 가장 중심에 있는 층은 대표적으로 핵이 없다. 가변적인 양의 세포 쇄설물이 또한 해살 소체의 중심에 존재할 수 있다. 해살 소체는 판-사이토케라틴 AE1/AE3 항체로 매우 강하게 염색되고, 이는 헤마톡살린 및 에오신(H&E)-염색 슬라이드에서 명확하게 확인되지 않는 경우에 이들 구조의 동일성의 이차적 확증으로서 사용될 수 있다.
배양 동안에 일반 흉선세포 변화
흉선세포는 흉선 조직이 배양될 때 배지 교체 동안에 버려지는 것으로부터 또는 흉선세포 죽음 후 조직 내에서의 분해로부터 점진적으로 소실된다(도 72 - 도 75). 그러나, 생체내에서 일어나는 것과는 달리, 죽은 세포는 그들을 청소하는 식세포를 동원할 수 없기 때문에 배양된 흉선에 장기간 잔존할 수 있다. 세포 죽음을 겪는 흉선세포 핵은 핵농축(염색질 응축) 및 분핵화(핵 분절화)를 보여줄 수 있지만, 대표적으로, 이들 세포는 그들의 에너지를 고갈시키지만 식세포 작용으로 제거되지는 않기 때문에, 그들은 핵막 완전성의 소실과 함께 들쑥날쑥한 핵 가장자리를 보여준다. 핵융해(괴사성 세포에서 핵의 완전 용해)는 대표적으로 생체내에서 2-3일 내에 일어나지만, 흉선 배양 동안에는 더 느리게 일어나는 것처럼 보인다. 배양 중에 5-9 일 후, 대부분 흉선세포는 핵을 보유하였지만, 핵막은 원상태가 아니며, 이는 조기 괴사를 지시한다(도 24). 이들 변경된 핵 특징은 핵을 보유할 때조차도 생존가능 흉선세포와 생존불능 흉선세포의 구별을 용이하게 한다. 흉선세포 핵이 핵융해를 겪은 호산구성 괴사성 세포 쇄설물의 큰 초점들도 또한 볼 수 있다(도 73a).
세포 완전성 및 조직 아키텍처의 조직학적 평가
배양된 흉선 조직을 임플란팅해야 할 때, 광범위한 흉선세포 괴사를 갖지만 흉선 상피 세포가 잘 자라는 슬라이스(임플란테이션을 위한 최적 조직)와 유사한 양의 괴사를 가지고 또한 흉선 상피 세포도 손상된 슬라이스를 정확하게 식별할 수 있는 것이 대단히 중요하다. 그것이 생존능을 직접적으로 사정할 수 없을지라도, H&E 슬라이드의 조직학적 검사는 정상 구조의 보존 정도 및 세포 죽음의 지시자의 존재 또는 부재를 사정할 수 있다. 위에서 기술된 바와 같이, 흉선세포가 배양 과정 동안에 고갈될 것으로 예상된다. 많은 흉선세포가 매일 배지 교체하는 동안에 슬라이스로부터 씻긴다. 많은 다른 것들은 현장에서 죽을 것이고, 여기서 그들의 핵 및 세포 소체들이 연장된 기간 동안 남아 있을 수 있다. 그러나, 죽은 흉선세포의 막 완전성이 손상되고, 그들의 핵은 "들쑥날쑥한" 가장자리를 나타낸다. 흉선세포 쇄설물이 덩어리질 수 있고, 이는 개별 세포 경계를 분간하는 것을 불가능하게 한다. 흉선세포 죽음 및 고갈은 배양의 예상된 바람직한 결과이고, 원상태 흉선세포 핵의 상대적 결여는 슬라이스 질을 잠재적으로 반영한다.
흉선 상피 세포는 흉선세포가 조직으로부터 고갈될 때 더 쉽게 시각화된다. 생존가능 흉선 상피 세포의 핵은 대표적으로 타원형이고, 흉선세포의 핵보다 더 크고, 헤마톡실린 염색에 의해 윤곽이 그려진 선명하게 경계를 나타낸 핵막을 가지고, 1 개 이상의 핵소체를 가진다. 이들 흉선 상피 핵은 대표적으로 "개방된" 것처럼보이고, 이는 그들이 헤마톡실린으로 어둡게 염색되지 않는다는 것을 의미한다. 이것은 그들이 살아있고 대사적으로 활성이라는 해석과 들어맞고, 그 이유는 활성 크로마틴("진정염색질")이 헤마톡실린 염료와 결합하지 않기 때문이다. 많은 흉선 상피 세포에서 리보좀 합성 부위인 핵소체의 존재는 그들이 살아있고 고정시에 대사적으로 활성임을 추가로 확증한다. 원상태 및 생존가능한 것같이 보이는 흉선 상피 세포의 예를 도 77a-b에서 보여준다.
제0 일 - 제21 일로부터 임의의 주어진 시점에서 다수의 흉선 슬라이스의 신중한 현미경 검사는 동일한 기증자 흉선으로부터 유래된 모든 슬라이스가 서로 밀접하게 유사하다는 것을 보여주었다. 배양 시간의 함수로서 동일한 흉선으로부터 유래된 상이한 슬라이스 간에 관찰된 차이는 괴사의 양(배양 시간이 증가함에 따라 증가됨) 및 잔류 흉선세포 수(배양 시간이 증가함에 따라 감소됨)와 주로 관련있었다. 상이한 기증자로부터 유래된 슬라이스는 또한 동일한 시점에서 검사될 때 서로 질적으로 유사하였다. 상이한 기증자 조직 간의 차이는 상대 크기, 형상, 흉선 대 수질의 상대 함량(하지만 둘 모두가 검사되는 각 슬라이드에 항상 존재하였음), 괴사의 양, 흉선 상피의 응축, 및 잔류 T 세포 수를 포함하였다. 조직학적 외관의 대부분 변화가 배양 제5 일까지 이미 일어났고, 배양이 진행됨에 따라 일반적으로 흉선세포의 추가 고갈만 일어난다.
흉선 상피 아키텍처의 사정
항-사이토케라틴 항체 AE1 및 AE3 (AE1/AE3)을 함유하는 칵테일은 본질적으로 모든 흉선 상피 세포를 검출한다. 대조적으로, CK14와 반응성인 항체는 피막하 피질에 존재하고 겉보기에는 피질 및 수질의 나머지 전체에 걸쳐서 산포된 흉선 상피 세포의 부분집합을 검출한다. 이들 CK14+ 세포 중 일부가 피질 및 수질 상피세포 둘 모두로 분화될 잠재력을 가지고, Lee EN, Park JK, Lee J-R, Oh S-O, Baek S-Y, Kim B-S, et al., 2011, "Characterization of the expression of cytokeratins 5, 8, and 14 in mouse thymic epithelial cells during thymus regeneration following acute thymic involution," Anat cell Biol. 44: 14-24, 따라서 장기간 재군집하는 세포를 나타낸다는 것을 시사하였다. 흉선세포가 조직으로부터 고갈되기 때문에, 흉선 상피 세포가 더 잘 보이게 된다. 3 차원 흉선 상피 망상조직은 연결된 상피세포 및/또는 검사되는 절편에서 연결이 분명하지 않은 겉보기에 산포된 흉선 상피 세포의 밝은 레이스 모양 배열을 통해 절편에서 정상적으로 입증된다. 3 차원 흉선 상피 망상조직은 흉선세포가 배양 동안에 소실되기 때문에 다양한 정도로 수축한다. 이것은 잔류 상피의 응축을 초래할 수 있고, 이렇게 해서 피막하 피질 상피 층이 더 두꺼워지고, 수질 흉선 상피 세포가 더 조밀하게 쌓인다. 이들 변화의 예를 제0 일(접수일), 제7 일, 제9 일, 제12 일, 및 제20 일에 검사된 단일의 흉선 로트에 대해 도 70a-d 및 도 73-도 75에서 보여준다. 많은 흉선세포의 소실 및 잠재적으로 괴사성 쇄설물을 함유하는 큰 영역에도 불구하고, 흉선 상피 세포 망상조직의 전체 아키텍처는 적어도 21 일의 배양 내내 일반적으로 여전히 잘 보존된다(도 78a-e).
잔류 T 세포의 사정
위에서 기술한 바와 같이, 임플란테이션을 의도하는 기증자 흉선 조직의 배양의 일차 목적은 T 세포를 부분적으로 고갈시켜서 수혜자 흉선세포 전구체로 임플란팅된 슬라이스의 집락화를 용이하게 하고 이식편-대-숙주 질환의 위험을 감소시키는 것이다. 비성숙 T 세포(흉선세포) 및 성숙 T 세포는 조직학적 절편에서 그들의 형태학에 의해서 뿐만 아니라 이들 세포 유형에 의해 특이적으로 발현되는 단백질을 검출하는 면역조직화학적 염색에 의해 확인될 수 있다. CD3는 >95%의 피질 및 수질 흉선세포 상에 뿐만 아니라 모든 성숙 T 세포 상에 존재하는 항원을 위한 T 세포 수용체의 성분이다. 제0 일에, 피질 및 수질에서 본질적으로 모든 비성숙 T 세포의 혈장막이 CD3 항체와 막 패턴으로 강하게 반응하는 것같이 보인다(도 79a-b). 생존가능 흉선세포/T 세포가 배양이 계속될 때 CD3 항체와 막 패턴으로 계속 반응한다. 그러나, CD3 항체는 또한 죽은 흉선세포가 핵융해를 겪은 후 남아 있는 무핵 쇄설물을 포함해서 죽은 흉선세포와 강하게 반응한다(도 79d, 도 79g, 및 도 79i-k). 낮은 배율로 볼 때 매우 많은 흉선세포 쇄설물이 남아 있어서 슬라이스가 여전히 강하게 및 균일하게 갈색인 것같이 보일 수 있지만(도 79c, 도 79f, 도 79h, 도 79j), 더 높은 배율(예를 들어 40X 대물렌즈)로 슬라이드의 검사는 상대적으로 적은 원상태 잠재적으로 생존가능한 흉선세포가 이들 시점에서 존재한다는 것을 확증한다. 생존불능 세포 및 세포 쇄설물이 임플란테이션 후 수혜자 식세포에 의해 청소될 것이고, 따라서 이식편-대-숙주 질환의 위험을 전하지 않는다. 상당한 양의 강하게 염색된 쇄설물이 인접 세포의 세포막의 사정을 방지하는 경우에 조직 영역에서 CD3+ 막 면역반응성을 정확하게 확인하는 것은 일반적으로 가능하지 않다. 그러나, 배양 동안에 후기 시점에서조차도, CD3 면역조직화학은 대표적으로 원상태 혈장막을 가지는 적어도 일부 흉선세포/T 세포를 강조하여 그들이 여전히 생존가능할 수 있다는 것을 시사한다(도 79e, 도 79g, 도 79i-k).
세포 증식 사정
Ki-67 항원은 증식하고 있는(즉, 세포 주기의 G0기가 아님) 모든 세포의 핵에서 발현된다. 제0 일에, 흉선 피질 내에 존재하는 대다수의 비성숙 흉선세포가 증식하고 있고, 그들의 핵이 Ki-67 증식 항원에 특이적인 항체와 강하게 반응한다. 대조적으로, 드문 더 성숙한 수질 흉선세포 및/또는 상피 또는 간질 세포만이 이 항체와 반응한다(도 66a-b). 배양 제1 일 - 제2 일 후에 관찰되는 면역반응성의 패턴은 산포된 드문 양성 세포의 패턴이고, 그 중 거의 전부가 흉선 상피 세포에 특유한 더 큰 핵을 가진다. 따라서, Ki-67 염색은 슬라이스 내에서 흉선 상피 세포의 생존능을 실증하기 위한 유용한 보조 염색일 수 있다.
논의
이들 실험은 생후 사람 흉선이 최장 21일 동안 배양될 때 일어나는 조직병리학적 변화를 기술하고, H&E 및 사이토케라틴 면역반응성을 사용한 조직병리학적 검사가 임플란테이션을 의도한 배양된 흉선 슬라이스의 질을 사정하는 데 유용할 수 있다는 것을 입증한다. 흉선 배양이 진행할 때, 슬라이스는 괴사 양 증가, 흉선 상피 응축 증가, 및 잔류 T 세포 수 감소를 발생하였다. 흉선 상피 망상조직은 21일의 배양 전체에 걸쳐서 여전히 원상태였고, 장기간 장기-재군집 잠재력을 갖는 흉선 상피 세포의 추정 생체표지자인 사이토케라틴 14의 발현이 계속된다. 동일한 흉선으로부터의 슬라이스는 질적으로 유사하였고, 이렇게 해서 단일의 슬라이스가 전체 흉선을 충분히 대표할 수 있었다. 상이한 기증자로부터 유래된 배양된 흉선 슬라이스의 조직학적 외관의 가변성이 또한 임의의 주어진 시점에서 최소였다. 배양 동안에 초기(예를 들어 제5 일 - 제9 일)에 관찰된 조직 조직학은 배양 중에 후기(예를 들어, 제12 일 - 제21 일)에 관찰된 것을 밀접하게 반영하였지만, 더 나중 시점에서는 더 많은 흉선세포 고갈 및 괴사가 관찰되었다.
CK14 또는 모든 유형의 사이토케라틴(AE1/AE3)을 인식하는 항체의 면역조직화학은 배양된 흉선 슬라이스의 평가에 유용하였다. 사이토케라틴 중간 필라멘트는 모든 상피세포의 세포골격의 중요 성분이다. 판-사이토케라틴 AE1/AE3 염색은 검사된 흉선 슬라이스 내에서의 상피 망상조직을 입증하고, 이는 더 나중 시점에서 H&E 염색 단독을 사용해서는 쉽게 분간가능하지 않을 수 있다. 특정 흉선 상피 세포에 의해 발현되는 특정 유형의 사이토케라틴이 그의 발생 및 분화기 및 기능적 상태에 의존한다는 것을 보여주었다. 마우스에서, CK5, CK8, 및 CK14와 반응하는 항체가 흉선 상피 세포 아형을 확인하는 데 가장 흔히 사용되었다 Lee EN, et al., 2011, Anat 세포 Biol., 44: 14-24. CK14의 발현은 이 연구에서는 피질 또는 수질 계통으로 분화할 잠재력을 갖는 흉선 상피 세포의 특징이라고 가정한 이전 연구에 기초해서 결정되었다 Li B, Li J, Devlin BH, Markert ML., 2011, "Thymic microenvironment reconstitution after postnatal human thymus transplantation," Clin Immunol. 140: 244-259. 오래 지속하는 면역 재구성의 임상 결과 Markert ML, et al., Blood, 109: 4539-4547이 아마도 흉선 상피 전구체가 임플란팅된 흉선 슬라이스 내에 존재할 것임을 시사할지라도, 그러한 전구체의 정확한 표현형은 사람에서 명확하게 확인되지 않았다. 마우스에서 흉선 상피 전구체의 표현형은 여전히 논란이 많고 Bennett AR, Farley A, Blair NF, Gordon J, Sharp L, Blackburn CC., 2002, "Identification 및 Characterization of thymic epithelial progenitor cells," Immunity 16: 803-814; Wong K, Lister NL, Barsanti M, Lim JMC, Hammett MV, Khong DM, et al., 2014, "Multilineage potential and self-renewal define an epithelial progenitor cell population in the adult thymus," Cell Rep. 8: 1198-1209; Ucar A, Ucar O, Klug P, Matt S, Brunk F, Hofmann TG, et al. , 2014, "Adult thymus contains FoxN1(-) epithelial stem cells that are bipotent for medullary and cortical thymic epithelial lineages," Immunity, 41: 257-269; Ulyanchenko S, O'Neill KE, Medley T, Farley AM, Vaidya HJ, Cook AM, 2016, "Identification of a bipotent epithelial progenitor population in the adult thymus," Cell Rep., 14: 2819-2832, 극히 적은 수가 다수의 항체 및 다색 유동 세포 분석을 사용해서 검출되었다. 따라서 사람 조직 절편에서 흉선 상피 전구체의 직접 검출은 현재로서는 실현가능하지 않다.
이들 실험은 조직이 임플란팅될 수 있는 시점인 배양 제12 일 - 제21 일에 흉선 슬라이스 내에 남아 있는 많은 양의 괴사성 세포 물질을 잠재적으로 확인하였다. 임플란테이션 후 수 개월 후에 생검 검사는 이 괴사성 물질의 증거를 보여주지 않는다 Markert ML, Li J, Devlin BH, Hoehner JC, Rice HE, Skinner MA, 2008, "Use of allograft biopsies to assess thymopoiesis after thymus transplantation," J Immunol, 180: 6354-6364. 어떠한 특별한 이론에도 얽매이고 싶지 않지만, 본 출원인은 임플란테이션 시에 이 괴사성 쇄설물 및 그의 아래에 있는 세포외 기질의 초기 존재가 발달하는 흉선세포를 위한 피질 및 수질 니쉬(niche)를 포함하여 슬라이스의 기능적 아키텍처를 보존하는 역할을 할 수 있다는 것을 진술한다. 상피세포 및 조혈 전구체 둘 모두의 세포 분화를 지지할 수 있는 쥣과 흉선 "오가노이드"를 재생성하기 위한 세포외 기질을 보존하는 흉선 탈세포화 접근의 최근 사용은 이 가정을 지지한다 Hun M, Barsanti M, Wong K, Ramshaw J, Werkmeister J, Chidgey AP, 2017, "Native thymic extracellular matrix improves in vivo thymic organoid T cell output, and drives in vitro thymic epithelial cell differentiation," Biomaterials, 118: 1-15, supports this hypothesis.
이전 연구는 흉선 상피 세포의 성장 잠재력이 사용된 배양 조건 하에서 견실히 유지되었다는 것을 입증하였고, 이렇게 해서 사이토케라틴-양성 상피 단층이 장기 배양의 개시 후 12 주까지 슬라이스로부터 확립될 수 있었다 Markert ML, et al., 1997, Clinical Immunol Immunopathol., 82: 26-36. 이 실시예에서 기술된 실험은 상피세포 생존능을 직접적으로 사정하지 않았지만, 대신에 원상태 핵의 존재를 대용 표지자로서 사용하였다.
실시예 20
소모된 배지에서 사이토카인 및 케모카인 검출
다양한 흉선 배양 조건으로부터의 소모된 배지 샘플을 사이토카인 및 케모카인의 패널 분석을 위해 RayBio, Norcross, Georgia에 보냈다. 시험은 Quantibody Arrays를 사용해서 형광 검출을 사용하여 수행하였다. Quantibody 어레이는 샌드위치 기반 유리 슬라이드 다중 ELISA (비맞춤(non-custom) 키트를 위한 Part Number QAH-CAA-4000)이다. 모든 시험은 RayBio 절차 SOP-TF-QAH-001 및 SOP-TF-QAH-003을 사용하여 수행하였다 상이한 3 세트의 샘플을 보냈고, RayBio에 의해 2배 희석으로 시험하였다. 제1 세트의 샘플은 시험 프로토콜 060717 QAH-CAA-4000 SA31 Duke U에 따라서 제작 로트 MFG-025, MFG-026, 및 MFG-027을 포함하였다. 제2 세트의 샘플은 시험 프로토콜 091117 Cust-H120 SA31 Duke U에 따라서 MFG-035, MFG-036, 및 MFG-038을 포함하였다. 마지막 세트의 샘플은 시험 프로토콜 050118 QAH-CAA-4000 SA113 Duke U에 따라서 MFG-053, MFG-054, 및 MFG-066을 포함하였다. 제1 및 제3 세트의 샘플은 상이한 항체 로트를 이용하여 동등한 키트로 시험하였다. 제2 세트는 일부 분석물만을 표적화하기 위해 상이한 항체 농도의 상이한 항체 칵테일을 가지는 맞춤 키트로 시험하였다. 제2 세트의 시험에 사용된 맞춤 키트는 다른 키트들과 동일한 기반이지만, 더 넓은 어레이의 표적 대신에 엄선된 사이토카인 및 케모카인만을 위한 시험이었다. 이것은 각 샘플 세트에 대해 상이한 검출 상한 및 하한을 초래하였고, 그 이유는 그들이 평균 배경에 의해 확정되기 때문이다. 비록 데이터는 정규화되지 않았지만, 모든 3 개 샘플 제출의 동향은 대표적이어야 한다.
21일 배양 동안의 특성화
로트 MFG-025, MFG-026, MFG-027, MFG-035, MFG-036, 및 MFG-038로부터의 소모된 배지의 샘플을 일상적인 21일 배양 중 제1 일, 제5 일, 제7 일, 제9 일, 제11 일, 제13 일, 제15 일, 제17 일, 제19 일 및 제21 일에 채취하였다.
로트 MFG-053
처리 1: 대조군
MC3 시설에 흉선 접수 후, 흉선 조직을 본 명세서에서 다른 곳에서 기술된 바와 같이 적용가능한 SOP에 따라서 슬라이싱하고, 9 일 동안 배양하였다. 흉선 슬라이스를 플레이트 당 4 개 슬라이스를 갖는 10-cm 원형 조직 배양 플레이트에서 배양하였다. 소모된 배지의 샘플을 제5 일, 제7 일 및 제9 일에 채취하고 프로토콜에 따라서 요구되는 대로 각 시점에서 생체표지자 수준을 결정하였다.
처리 3: -20 ℃, 4 hr
MC3 시설에 흉선 접수 후, 흉선 조직을 본 명세서에서 다른 곳에서 기술된 바와 같이 적용가능한 SOP에 따라서 슬라이싱하고 배양하였다. 흉선 슬라이스를 플레이트 당 4 개 슬라이스를 갖는 10-cm 원형 조직 배양 플레이트에서 배양하였다. 흉선 슬라이스를 절차에 따라서 필터 위에 놓았다. 제2 일에, 시험 흉선 슬라이스를 -20 ℃의 온도에서 4 hr 동안 두었다. 슬라이스를 TOM을 갖는 10-cm 접시에 도로 놓고, 총 9 일 동안 배양하였다. 소모된 배지의 샘플을 제5 일, 제7 일 및 제9 일에 채취하고 각 시점에서 생체표지자 수준을 결정하였다.
처리 5: 55 ℃, 4 hr
MC3 시설에 흉선 접수 후, 흉선 조직을 적용가능한 SOP에 따라서 슬라이싱하고 배양하였다. 흉선 슬라이스를 플레이트 당 4 개 슬라이스를 갖는 10-cm 원형 조직 배양 플레이트에서 배양하였다. 흉선 슬라이스를 절차에 따라서 필터 위에 놓았다. 제2 일에, 시험 흉선 슬라이스를 55 ℃의 온도에서 4 hr 동안 두었다. 슬라이스를 TOM을 갖는 10-cm 접시에 도로 놓고, 총 9 일 동안 배양하였다. 소모된 배지의 샘플을 제5 일, 제7 일 및 제9 일에 채취하고 각 시점에서 생체표지자 수준을 결정하였다.
로트 MFG-054
처리 1: 대조군
처리 2: 실온, 24 hr
MC3 시설에 흉선 접수 후, 흉선 조직을 적용가능한 SOP에 따라서 슬라이싱하고 배양하였다. 흉선 슬라이스를 플레이트 당 4 개 슬라이스를 갖는 10-cm 원형 조직 배양 플레이트에서 배양하였다. 흉선 슬라이스를 절차에 따라서 필터 위에 놓았다. 제2 일에, 시험 흉선 슬라이스를 실온에서 24 hr 동안 두었다. 슬라이스를 TOM을 갖는 10-cm 접시에 도로 놓고, 총 9 일 동안 배양하였다. 소모된 배지의 샘플을 제5 일, 제7 일 및 제9 일에 채취하고 각 시점에서 생체표지자 수준을 결정하였다.
처리 3: 탈수, 24 hr
MC3 시설에 흉선 접수 후, 흉선 조직을 적용가능한 SOP에 따라서 슬라이싱하고 배양하였다. 흉선 슬라이스를 플레이트 당 4 개 슬라이스를 갖는 10-cm 원형 조직 배양 플레이트에서 배양하였다. 흉선 슬라이스를 절차에 따라서 필터 위에 놓았다. 제2 일에, 시험 흉선 슬라이스를 24 hr 동안 탈수시켰다. 슬라이스를 TOM을 갖는 10-cm 접시에 도로 놓고, 총 9 일 동안 배양하였다. 소모된 배지의 샘플을 제5 일, 제7 일 및 제9 일에 채취하고 각 시점에서 생체표지자 수준을 결정하였다.
처리 4: 탈수, 48 hr
MC3 시설에 흉선 접수 후, 흉선 조직을 본 명세서에서 다른 곳에서 기술된 바와 같이 적용가능한 SOP에 따라서 슬라이싱하고 배양하였다. 흉선 슬라이스를 플레이트 당 4 개 슬라이스를 갖는 10-cm 원형 조직 배양 플레이트에서 배양하였다. 흉선 슬라이스를 절차에 따라서 필터 위에 놓았다. 제2 일에, 시험 흉선 슬라이스를 -20 ℃의 온도에 4 hr 동안 두었다. 슬라이스를 TOM을 갖는 10-cm 접시에 도로 놓고, 총 9 일 동안 배양하였다. 소모된 배지의 샘플을 제5 일, 제7 일 및 제9 일에 채취하고 각 시점에서 생체표지자 수준을 결정하였다.
처리 4: 생리식염수, 24 hr
MC3 시설에 흉선 접수 후, 흉선 조직을 적용가능한 SOP에 따라서 슬라이싱하고 배양하였다. 흉선 슬라이스를 플레이트 당 4 개 슬라이스를 갖는 10-cm 원형 조직 배양 플레이트에서 배양하였다. 흉선 슬라이스를 절차에 따라서 필터 위에 놓았다. 제2 일에, 시험 흉선 슬라이스를 48 hr 동안 탈수시켰다. TOM을 접시에 도로 첨가하고, 슬라이스를 총 9 일 동안 배양하였다. 소모된 배지의 샘플을 제5 일, 제7 일 및 제9 일에 채취하고 각 시점에서 생체표지자 수준을 결정하였다.
처리 5: 생리식염수, 24 hr
MC3 시설에 흉선 접수 후, 흉선 조직을 적용가능한 SOP에 따라서 슬라이싱하고 배양하였다. 흉선 슬라이스를 플레이트 당 4 개 슬라이스를 갖는 10-cm 원형 조직 배양 플레이트에서 배양하였다. 흉선 슬라이스를 절차에 따라서 필터 위에 놓았다. 제2 일에, 시험 흉선 슬라이스를 TOM 대신에 생리식염수에서 24 hr 동안 배양하였다. 처리 후, 식염수를 제거하고, 정상 절차에 따라서 TOM을 첨가하고, 슬라이스를 총 9 일 동안 배양하였다. 소모된 배지의 샘플을 제5 일, 제7 일 및 제9 일에 채취하고 각 시점에서 생체표지자 수준을 결정하였다.
처리 6: 생리식염수, 48 hr
MC3 시설에 흉선 접수 후, 흉선 조직을 적용가능한 SOP에 따라서 슬라이싱하고 배양하였다. 흉선 슬라이스를 플레이트 당 4 개 슬라이스를 갖는 10-cm 원형 조직 배양 플레이트에서 배양하였다. 흉선 슬라이스를 절차에 따라서 필터 위에 놓았다. 제2 일에, 시험 흉선 슬라이스를 55 ℃의 온도에 4 hr 동안 두었다. 슬라이스를 TOM을 갖는 10-cm 접시에 도로 놓고, 총 9 일 동안 배양하였다. 소모된 배지의 샘플을 제5 일, 제7 일 및 제9 일에 채취하고 각 시점에서 생체표지자 수준을 결정하였다.
처리 7: 10X PBS, 24 hr
MC3 시설에 흉선 접수 후, 흉선 조직을 적용가능한 SOP에 따라서 슬라이싱하고 배양하였다. 흉선 슬라이스를 플레이트 당 4 개 슬라이스를 갖는 10-cm 원형 조직 배양 플레이트에서 배양하였다. 흉선 슬라이스를 절차에 따라서 필터 위에 놓았다. 제2 일에, 시험 흉선 슬라이스를 TOM 대신에 10X PBS에서 24 hr 동안 배양하였다. 처리 후, 10X PBS를 제거하고, 정상 절차에 따라서 TOM을 첨가하고, 슬라이스를 총 9 일 동안 배양하였다. 소모된 배지의 샘플을 제5 일, 제7 일 및 제9 일에 채취하고 각 시점에서 생체표지자 수준을 결정하였다.
처리 8: 1% DMSO, 24 hr
MC3 시설에 흉선 접수 후, 흉선 조직을 적용가능한 SOP에 따라서 슬라이싱하고 배양하였다. 흉선 슬라이스를 플레이트 당 4 개 슬라이스를 갖는 10-cm 원형 조직 배양 플레이트에서 배양하였다. 흉선 슬라이스를 절차에 따라서 필터 위에 놓았다. 제2 일에, 시험 흉선 슬라이스를 1% DMSO로 24 hr 동안 처리하였다. 슬라이스를 TOM에 도로 놓고, 총 9 일 동안 배양하였다. 소모된 배지의 샘플을 제5 일, 제7 일 및 제9 일에 채취하고 각 시점에서 생체표지자 수준을 결정하였다.
로트 MFG-066
처리 4: 대조군
MC3 시설에 흉선 접수 후, 흉선 조직을 적용가능한 SOP에 따라서 슬라이싱하고 21 일 동안 배양하였다. 흉선 슬라이스를 플레이트 당 4 개 슬라이스를 갖는 10-cm 원형 조직 배양 플레이트에서 배양하였다. 소모된 배지의 샘플을 제2 일 - 제21 일에 채취하고 각 시점에서 생체표지자 수준을 결정하였다.
처리 5: -20 ℃, 4 hr
MC3 시설에 흉선 접수 후, 흉선 조직을 적용가능한 SOP에 따라서 슬라이싱하고 배양하였다. 흉선 슬라이스를 플레이트 당 4 개 슬라이스를 갖는 10-cm 원형 조직 배양 플레이트에서 배양하였다. 흉선 슬라이스를 절차에 따라서 필터 위에 놓았다. 제2 일에, 시험 흉선 슬라이스를 -20 ℃의 온도에서 4 hr 동안 두었다. 슬라이스를 정상 조건으로 되돌려 놓았고, 총 21 일 동안 배양하였다. 소모된 배지의 샘플을 제2 일 - 제21 일에 채취하고 각 시점에서 생체표지자 수준을 결정하였다.
처리 6: 55 ℃, 4 hr
MC3 시설에 흉선 접수 후, 흉선 조직을 적용가능한 SOP에 따라서 슬라이싱하고 배양하였다. 흉선 슬라이스를 플레이트 당 4 개 슬라이스를 갖는 10-cm 원형 조직 배양 플레이트에서 배양하였다. 흉선 슬라이스를 절차에 따라서 필터 위에 놓았다. 제2 일에, 시험 흉선 슬라이스를 55 ℃의 온도에서 4 hr 동안 두었다. 슬라이스를 정상 조건으로 되돌려 놓았고, 총 21 일 동안 배양하였다. 소모된 배지의 샘플을 제2 일 - 제21 일에 채취하고 각 시점에서 생체표지자 수준을 결정하였다.
처리 7: 10X PBS, 24 hr
MC3 시설에 흉선 접수 후, 흉선 조직을 적용가능한 SOP에 따라서 슬라이싱하고 배양하였다. 흉선 슬라이스를 플레이트 당 4 개 슬라이스를 갖는 10-cm 원형 조직 배양 플레이트에서 배양하였다. 흉선 슬라이스를 절차에 따라서 필터 위에 놓았다. 제2 일에, 시험 흉선 슬라이스를 10X PBS로 24 hr 동안 처리하였다. 슬라이스를 TOM에 도로 놓았고, 총 21 일 동안 배양하였다. 소모된 배지의 샘플을 제2 일 및 제4 일 - 제21 일에 채취하고 각 시점에서 생체표지자 수준을 결정하였다.
결과
일상적 및 강제 분해 데이터의 분석에 기초하여, 강제 분해 샘플과 비교할 때 시간 경로에서의 데이터의 전체 동향 및 문헌에 기초하여 연구된 12 개 생체표지자로부터 4 개 생체표지자가 눈에 띄었다. 이들은 CCL21, CXCL16, L-셀렉틴, 및 uPAR이었다. 이들 4 개 생체표지자의 수준의 분석을 이 섹션에서 논의한다.
CCL21 6Ckine
CCL21 6Ckine은 흉선세포에 대해 화학주성임을 보여준 TEC-발현된 케모카인이고(Liu 2005), 이는 배양된 흉선의 임플란테이션 후 수혜자의 성공적 면역 재구성을 위한 대단히 중요한 결정인자이다.
21-일 배양 동안 CCL21의 특성화
소모된 배지에서의 CCL21 수준에 대한 기술 통계(descriptive statistics)를 표 12에서 제시한다. 강제 분해 연구에서의 대조 샘플(로트 MFG-053, MFG-054, 및 MFG-066)로부터의 데이터를 로트 MFG-025, MFG-026, MFG-027, MFG-035, MFG-036, 및 MFG-038로부터의 21-일 시간 경로 샘플로부터의 결과와 함께 포함하였다. 검정 ULOQ보다 큰 결과는 플롯팅되지 않거나 또는 통계 분석에 포함되지 않는다.
Figure pct00017
분석된 각 로트에 대해서 소모된 배지에서의 CCL21 수준 대 일수의 산점도를 도 85에서 제공하고, 박스플롯을 도 86에서 제공한다. 산점도는 소모된 배지에서의 CCL21 수준이 분석된 각 로트에 대해서 21 일의 경과 동안에 증가한다는 것을 보여준다. 박스플롯은 일반적으로 로트 간의 소모된 배지에서의 CCL21 수준의 가변성이 배양에 소모되는 시간이 증가함에 따라 증가한다는 것을 지시한다. 가변성은 제5 일 - 제9 일에 가장 낮았다. 로트 MFG-036은 CCL21에서 다른 로트들보다 낮은 경향이 있고, 그것이 다른 로트들과 동일한 과정을 사용하여 제작되었기 때문에 임의의 차이에 대한 분명한 이유는 없다. 다른 생체표지자는 이 로트가 다른 로트들과 명백히 상이하다는 것을 보여주지 않는다. 그 차이를 더 잘 이해하기 위해서는 추가의 로트의 시험 및 추가의 검정 개발이 권장된다.
강제 분해 샘플에서 CCL21 수준의 특성화
로트 MFG-053 및 MFG-054
로트-053 (1, 3, 및 5) 및 로트-054 (1 - 8)의 강제 분해 처리 동안에 소모된 배지에서의 CCL21 수준을 표 13에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 38에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 CCL21 결과의 플롯을 함유한다(표 8 참조). 그 분석의 경우 강제 분해 대조군이 >ULOQ였기 때문에 비분해된 로트를 나타내기 위해 평균 결과를 플롯팅한다(n = 6). 이것은 몇 일 동안에는 변동을 초래하고, 그 이유는 모든 로트가 모든 날에 수집된 샘플을 가지지는 않기 때문이라는 것을 주목한다. 검정 ULOQ보다 큰 결과는 플롯팅하지 않는다.
Figure pct00018
로트 MFG-066
로트-066 (4 - 7)의 강제 분해 처리 동안에 소모된 배지에서의 CCL21 수준을 표 14에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 39에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 CCL21 결과의 플롯을 함유한다(표 7 참조). 그 분석의 경우 강제 분해 대조군이 >ULOQ였기 때문에 비분해된 로트를 나타내기 위해 평균 결과를 플롯팅한다(n = 6). 이것은 몇 일 동안에는 변동을 초래하고, 그 이유는 모든 로트가 모든 날에 수집된 샘플을 가지지는 않기 때문이라는 것을 주목한다. ULOQ보다 큰 결과는 플롯팅하지 않는다. LOD보다 작은 결과는 LOD에서 플롯팅한다.
Figure pct00019
ULOQ = 4,444.4 pg/mL; LOD = 22.2 pg/mL.
CXCL16
CXCL16 케모카인이 TEC에 의해 생성된다는 것을 보여주었다(Bunting 2011). 수용체의 발현이 피질에서 불변성 자연 살해 T 세포 (iNKT) 세포 양성 선택 동안에 유도되고, 또한 수질에서 검출가능하다는 것을 보여주었다(Cowan, 2015).
21-일 배양 동안에 CXCL16의 특성화
소모된 배지에서의 CXCL16 수준에 대한 기술 통계를 표 15에서 제시한다. 강제 분해 연구로부터의 대조 샘플(로트 MFG-053, MFG-054, 및 MFG-066)로부터의 데이터를 로트 MFG-025, MFG-026, MFG-027, MFG-035, MFG-036, 및 MFG-038로부터의 결과와 함께 포함하였다.
Figure pct00020
분석된 각 로트에 대해서 소모된 배지에서의 CXCL 16 수준 대 일수의 산점도를 도 89에서 제공하고, 박스플롯을 도 90에서 제공한다. 산점도는 분석된 각 로트에 대해서 소모된 배지에서의 CXCL16 수준이 21 일의 경과 동안에 증가한다는 것을 보여준다. 박스플롯은 로트 간의 소모된 배지에서의 CXCL16 수준의 가변성이 배양에 소모되는 시간이 증가함에 따라 꽤 일관된다는 것을 지시한다.
강제 분해 샘플에서 CXCL16 수준의 특성화
로트 MFG-053 및 로트 MFG-054
로트-053 (1, 3, 및 5) 및 로트-054 (1 - 8)의 강제 분해 처리 동안 소모된 배지에서의 CXCL16 수준을 표 16에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 91에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 CXCL16 결과의 플롯을 함유한다(표 9 참조). 그 분석의 경우 강제 분해 대조군이 >ULOQ였기 때문에 비분해된 로트를 나타내기 위해 평균 결과를 플롯팅한다(n = 6). 이것은 몇 일 동안에는 변동을 초래하고, 그 이유는 모든 로트가 모든 날에 수집된 샘플을 가지지는 않기 때문이라는 것을 주목한다. 이 분석의 경우, 단 1 개 로트가 수집된 데이터를 가진 날은 제거되었고 그것은 단일의 로트를 대표하고, 그 결과로 개별 데이터 플롯에 존재하는 것보다 더 많은 변동을 초래한다. LOD보다 작은 결과는 LOD에서 플롯팅한다.
Figure pct00021
로트 MFG-066
로트-066 (4 - 7)의 강제 분해 처리 동안 소모된 배지에서의 CXCL16 수준을 표 17에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 92에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 CXCL16 결과의 플롯을 함유한다(표 9 참조). 그 분석의 경우 강제 분해 대조군이 >ULOQ였기 때문에 비분해된 로트를 나타내기 위해 평균 결과를 플롯팅한다(n = 6). 이것은 몇 일 동안에는 변동을 초래하고, 그 이유는 모든 로트가 모든 날에 수집된 샘플을 가지지는 않기 때문이라는 것을 주목한다. 이 분석의 경우, 단 1 개 로트가 수집된 데이터를 가진 날은 제거되었고 그것은 단일의 로트를 대표하고, 그 결과로 개별 데이터 플롯에 존재하는 것보다 더 많은 변동을 초래한다. LOD보다 작은 결과를 LOD에 플롯팅한다.
Figure pct00022
L-셀렉틴.
L-셀렉틴은 발달하는 및 나이브 T 세포에서 높은 수준으로 발현된다. 그것은 흉선세포가 배양될 때 세포 표면으로부터 방출된다. 생체내에서 건강한 세포에 의해 탈락될 때 통상적으로 신속하게 재발현되고, 점진적으로 감소하는 수준의 탈락은 흉선세포 생존능의 점진적 소실을 반영하며, 그 이유는 그들이 정상적으로는 배양 동안에 표면 상에서 이 분자를 재발현하지 않기 때문이다(A. Macintyre, 비공개 데이터).
21-일 배양 동안의 L-셀렉틴의 특성화
21 일의 경과 동안에 소모된 배지에서 L-셀렉틴 수준의 기술 통계를 표 18에서 제시한다. 강제 분해 연구로부터의 대조 샘플(로트 MFG-053, MFG-054, 및 MFG-066)로부터의 데이터를 로트 MFG-025, MFG-026, MFG-027, MFG-035, MFG-036, 및 MFG-038로부터의 결과와 함께 포함하였다.
Figure pct00023
분석된 각 로트에 대해서 소모된 배지에서의 L-셀렉틴 수준 대 일수의 산점도를 도 93에서 제공하고, 박스플롯을 도 94에서 제공한다. 산점도는 분석된 각 로트에 대해서 소모된 배지에서의 L-셀렉틴 수준이 21 일의 경과 동안에 감소한다는 것을 보여준다. 박스플롯은 로트 간의 소모된 배지에서의 L-셀렉틴 수준의 가변성이 배양에 소모되는 시간이 증가함에 따라 및 L-셀렉틴 수준이 0에 접근함에 따라 일반적으로 감소한다는 것을 지시한다
강제 분해 샘플에서 L-셀렉틴 수준의 특성화
로트 MFG-053 및 로트 MFG-054
로트-053 (1, 3, 및 5) 및 로트-054 (1 - 8)의 강제 분해 처리 동안 소모된 배지에서의 L-셀렉틴 수준을 표 19에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 95에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 L-셀렉틴 결과의 플롯을 함유한다(표 18 참조). 그 분석에 대해서 강제 분해 대조군이 >ULOQ였기 때문에 비분해된 로트를 나타내기 위해 평균 결과를 플롯팅한다(n = 6). 이 분석의 경우, 단 1 개 로트가 수집된 데이터를 가진 날은 제거되었고 그것은 단일의 로트를 대표하고, 그 결과로 개별 데이터 플롯에 존재하는 것보다 더 많은 변동을 초래한다. LOD보다 작은 결과는 LOD에서 플롯팅한다.
Figure pct00024
로트 MFG-066
로트-066(4 - 7)의 강제 분해 처리 동안 소모된 배지에서의 L-셀렉틴 수준을 표 19에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 96에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 L-셀렉틴 결과의 플롯을 함유한다(표 18 참조). LOD보다 작은 결과는 LOD에서 플롯팅한다.
uPAR (CD87)
uPAR (CD87)은 대체적 스플라이싱에 기초하여 가용성 형태 및 막결합 형태 둘 모두에서 발현되는 우로키나제 수용체 (또한 우로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체라고도 알려짐)이다. 그것은 세포외 기질의 국소적 분해를 돕는다. 그것이 사람 흉선에서 및 상처의 가장자리에서 표피 각질형성세포(EK)를 이동시킴으로써 발현된다는 것을 보여주었다(Loughner 2016). 이 후자 특징은 많은 유전자 발현에서 TEC가 EK와 흡사하기 때문에 가장 흥미롭다(Patel 1995). 배양된 흉선 슬라이스에 의한 분비의 점진적 증가는 TE의 활성화를 반영할 수 있고, 따라서 임플란테이션 후 TE 과성장의 표지자일 수 있다.
21-일 배양 동안의 uPAR의 특성화
21 일의 경과 동안에 소모된 배지에서 uPAR 수준에 대한 기술 통계를 표 20에서 제시한다. 강제 분해 연구로부터의 대조 샘플(로트 MFG-053, MFG-054, 및 MFG-066)로부터의 데이터를 로트 MFG-025, MFG-026, MFG-027, MFG-035, MFG-036, 및 MFG-038로부터의 결과와 함께 포함하였다.
Figure pct00025
분석된 각 로트에 대해 소모된 배지에서의 uPAR 수준 대 일수의 산점도를 도 97에서 제공하고, 박스 플롯을 98에서 제공한다. 산점도는 분석된 각 로트에 대해 소모된 배지에서의 uPAR 수준이 21 일의 경과 동안 증가하고 로트-로트 가변성이 중간 정도임을 보여준다. 박스플롯은 로트간 소모된 배지에서의 uPAR 수준의 가변성이 일반적으로 배양에 소모된 시간이 증가함에 따라 증가한다는 것을 지시한다.
강제 분해 샘플에서 uPAR 수준의 특성화
로트 MFG-053 및 로트 MFG-054
로트-053(1, 3, 및 5) 및 로트-054(1 - 8)의 강제 분해 처리 동안에 소모된 배지에서의 uPAR 수준을 표 21에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 99에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 uPAR 결과의 플롯을 함유한다(표 21을 참조한다). 이 데이터는 로트 간에 정규화되지 않았고 많은 양의 로트-로트 가변성이 있었기 때문에, 도 99에서 제시된 평균 데이터는 어느 로트가 어느 날에 시험되었는지에 매우 의존한다. 1 개의 로트만 시험된 날은 그래프에서 평균으로부터 배제하였다.
Figure pct00026
로트 MFG-066
로트-066(4 - 7)의 강제 분해 처리 동안에 소모된 배지에서의 uPAR 수준을 표 22에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 100에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 uPAR 결과의 플롯을 함유한다(표 21 참조). LOD보다 작은 결과는 LOD에서 플롯한다.
(표 21)
Figure pct00027
LOD = 25.4 pg/mL
상관 관계
4 세트의 생체표지자 데이터(CCL21, CXCL16, L-셀렉틴 및 uPAR)를 정규성 시험(Ryan-Joiner)으로 시험하였다. CCL21(> 0.087) 및 CXCL16(> 0.100)의 p 값은 그들이 정상 분포를 따른다는 것을 지시한다. L-셀렉틴(< 0.010) 및 uPAR(< 0.010)의 p-값은 그들이 정상 분포를 따르지 않는다는 것을 지시한다. 피어슨 상관 계수를 각 상관 관계에 대해 결정하였고, 표 22에서 제시한다. 계수들은 통계적으로 유의미하였고, 모두가 서로 강한 상관 관계를 나타냈으며, 모든 다른 생체표지자와 함께 L-셀렉틴은 제외한다. 상관 관계를 보여주는 회귀 모델을 도 101 내지 도 103에서 제공한다. 가장 강한 상관 관계는 CCL21과 uPAR 사이에서 관찰되었다. 회귀를 시각적 목적으로 보여준다.
Figure pct00028
추가 결과
CCL11 (에오탁신)
CCL11 케모카인(에오탁신)을 수질 TE에 의해 생성한다(Bunting 2011). 그것은 처음에는 호산구를 유인하는 그의 능력 때문에 명명되었고, 호산구 침윤물이 활성 흉선세포생성을 갖는 흉선 조직에서 두드러질 수 있다는 것을 보여주었고(Flores 1999); 그러나, 또한 CCL11이 이중-양성 및 단일-양성 사람 흉선세포 둘 모두의 화학유인물질로서 역할한다는 것을 보여주었다(Bunting 2011).
21-일 배양 동안 CCL11의 특성화
21 일의 경과 동안에 소모된 배지에서의 CCL11 수준에 대한 기술 통계를 표 23에서 제시한다. 강제 분해 연구로부터의 대조 샘플로부터의 데이터(로트 MFG-053, MFG-054, 및 MFG-066)를 로트 MFG-025, MFG-026, MFG-027, MFG-035, MFG-036, 및 MFG-038로부터의 결과와 함께 포함하였다.
Figure pct00029
분석된 로트 각각에 대해 소모된 배지에서의 CCL11 수준 대 일수의 산점도를 도 104에서 제공하고, 박스플롯을 105에서 제공한다. 선형 회귀 모델을 도 106에서 제공한다. 산점도는 분석된 각 로트에 대해 소모된 배지에서의 CCL11 수준이 21 일의 경과 동안에 선형 증가한다는 것을 보여준다. 박스플롯은 로트 간에 소모된 배지에서의 CCL11 수준의 가변성이 배양에 소모되는 시간이 증가함에 따라 증가한다는 것을 지시하고, 이는 또한 표 24에서 시간에 따라 증가하는 표준편차 값으로 보여준다. 가변성은 제5 일 - 제9 일에 가장 낮았다. 회귀 분석으로부터 조정된 R2 값은 배양에 소모된 시간이 CCL11 수준의 가변성의 51.2%를 설명한다는 것을 지시한다.
로트 MFG-053 및 로트 MFG-054
로트-053 (1, 3, 및 5) 및 로트-054 (1 - 8)의 강제 분해 처리 동안에 소모된 배지에서의 CCL11 수준을 표 24에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 107에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 CCL11 결과의 플롯을 함유한다(표 23을 참조한다). LOD보다 작은 결과는 LOD에서 플롯한다.
Figure pct00030
로트 MFC-066
로트-066 (4 - 7)의 강제 분해 처리 동안에 소모된 배지에서의 CCL11 수준을 표 25에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 108에서 제공한다. LOD보다 작은 결과는 LOD에서 플롯한다.
Figure pct00031
LOD = 9.7 pg/mL.
오스테오폰틴(OPN)
오스테오폰틴(OPN)은 SPP1 유전자에 의해 코딩되는 사이토카인이고, 흉선 스트레스 동안에 증가한다. 증가된 수준은 흉선 위축(흉선세포 수 감소)과 관련되고, 이는 배양된 흉선의 바람직한 상태이다(Wang 2009; Gridley 2013). OPN은 코르티코스테로이드를 만드는 데 요구되고, 이는 흉선세포 세포자살을 유도하도록 잘 확립되었다.
21-일 배양 동안의 OPN의 특성화
21 일의 경과 동안에 소모된 배지에서의 OPN 수준의 기술 통계를 표 26에서 제시한다. 강제 분해 연구로부터의 대조 샘플(로트 MFG-053, MFG-054, 및 MFG-066)로부터의 데이터를 로트 MFG-025, MFG-026, MFG-027, MFG-035, MFG-036, 및 MFG-038로부터의 결과와 함께 포함하였다.
Figure pct00032
분석된 각 로트에 대해 소모된 배지에서의 OPN 수준 대 일수의 산점도를 도 109에서 제공하고, 박스플롯을 도 110에서 제공한다. 2차 회귀 모델을 도 111에서 제공한다. 산점도는 분석된 각 로트에 대해 소모된 배지에서의 OPN 수준이 21 일의 경과 동안에 증가한다는 것을 보여준다. 박스플롯은 로트 간에 소모된 배지에서의 OPN 수준의 가변성이 배양에 소모된 시간이 증가함에 따라 경향을 보여주지 않는다는 것을 지시한다. 회귀 분석으로부터의 조정된 R2 값은 배양에 소모된 시간이 OPN 수준의 가변성의 19.3%를 설명한다는 것을 지시한다.
강제 분해 샘플에서 OPN 수준의 특성화
로트 MFG-053 및 로트 MFG-054
로트-053 (1, 3, 및 5) 및 로트-054 (1 - 8)의 강제 분해 처리 동안에 소모된 배지에서의 OPN 수준을 표 27에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 112에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 OPN 결과의 플롯을 함유한다 (표 26 참조). LOD보다 작은 결과는 LOD에서 플롯한다.
Figure pct00033
로트 MFG-066
로트-066 (4 - 7)의 강제 분해 처리 동안에 소모된 배지에서의 OPN 수준을 표에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 113에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 OPN 결과의 플롯을 함유한다 (표 참조). LOD보다 작은 결과는 LOD에서 플롯한다.
Figure pct00034
CXCL12 (SDF-1a)
CXCL12 (SDF-1a)가 피막하 피질 및 수질 TE에 의해 생성된다는 것이 실증되었지만(Bunting 2011; Hernandez-Lopez 2002; Zaitseva 2002), 또한 흉선 내에 존재하는 흉선 섬유모세포 및 내피 세포에 의해 만들어질 수 있다. CXCL12가 B 세포 및 항원-제시 세포(APC)를 흉선에 동원한다는 것을 보여주었고(Weiss 2003), 이것이 완전한 흉선 기능의 생성에 중요한 것으로 예상된다. 그것은 또한 흉선 내에 흉선세포 부분집합의 국지화에 관여하고, 그것은 IL-7로의 흉선세포 증식을 향상시킨다(Hernandez-Lopez 2002). 주목할 것은, CXCL12를 중화하는 항체가 시험관내에서 사람 흉선 장기 배양물에서 흉선세포생성을 감소시킨다는 것을 보여주었고, CXCL12의 첨가는 이들 배양물에서 흉선세포생성을 증가시킨다 (Hernandez-Lopez 2002).
21-일 배양 동안에 CXCL12의 특성화
21 일의 경과 동안에 소모된 배지에서의 CXCL12 수준에 대한 기술 통계를 표 29에서 제시한다. 강제 분해 연구로부터의 대조 샘플(로트 MFG-053, MFG-054, 및 MFG-066)로부터의 데이터를 로트 MFG-025, MFG-026, MFG-027, MFG-035, MFG-036, 및 MFG-038로부터의 결과와 함께 포함하였다.
Figure pct00035
분석된 로트 각각에 대해 소모된 배지에서의 CXCL12 수준 대 일수의 산점도를 도 114에서 제공하고, 박스플롯을 도 115에서 제공한다. 3차 회귀 모델을 도 116에서 제공한다. 산점도는 분석된 각 로트에 대해 소모된 배지에서의 CXCL12 수준이 21 일의 경과 동안에 증가한다는 것을 보여준다. 박스플롯은 로트 간에 소모된 배지에서의 CXCL12 수준의 가변성이 일반적으로 배양에 소모되는 시간이 증가함에 따라 증가한다는 것을 지시한다. 가변성은 제5 일 - 제13 일에 가장 낮았다. 회귀 분석으로부터의 조정된 R2 값은 배양에 소모된 시간이 CXCL12 수준의 가변성의 44.5%를 설명한다는 것을 지시한다.
강제 분해 샘플에서 CXCL12 수준의 특성화
로트 MFG-053 및 로트 MFG-054
로트-053 (1, 3, 및 5) 및 로트-054 (1 - 8)의 강제 분해 처리 동안에 소모된 배지에서의 CXCL12 수준을 표 30에서 제시하고, 데이터의 산점도를 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 CXCL12 결과의 플롯을 함유한다(표 29 참조). LOD보다 작은 결과는 LOD에서 플롯한다.
Figure pct00036
로트 MFG-066
로트-066 (4 - 7)의 강제 분해 처리 동안에 소모된 배지에서의 CXCL12 수준을 표 31에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 118에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 CXCL12 결과의 플롯을 함유한다(표 29 참조). LOD보다 작은 결과는 LOD에서 플롯한다.
Figure pct00037
CCL20 (MIP-3a)
CCL20(MIP-3a)은 흉선세포에 대해 가정된 것과 부합하는 패턴을 갖는 케모카인이다.
21-일 배양 동안에 CCL20의 특성화
21 일의 경과 동안에 소모된 배지에서의 CCL20 수준에 대한 기술 통계를 표 32에서 제시한다. 강제 분해 연구로부터의 대조 샘플(로트 MFG-053, MFG-054, 및 MFG-066)로부터의 데이터를 로트 MFG-025, MFG-026, MFG-027, MFG-035, MFG-036, 및 MFG-038로부터의 결과와 함께 포함하였다.
Figure pct00038
분석된 각 로트에 대해 소모된 배지에서의 CCL20 수준 대 일수의 산점도를 도 119에서 제공하고, 박스플롯을 도 120에서 제공한다. 3차 회귀 모델을 도 121에서 제공한다. 산점도는 분석된 각 로트에 대해 소모된 배지에서의 CCL20 수준이 21 일의 경과 동안에 일관된 경향을 보여주지 않는다는 것을 보여준다. 박스플롯은 로트 간에 소모된 배지에서의 CCL20 수준의 가변성이 일반적으로 제9 일까지는 증가하고 그 다음에는 감소한다는 것을 지시한다. 회귀 분석으로부터의 조정된 R2 값은 배양에 소모된 시간이 CCL20 수준의 가변성의 12.4%를 설명한다는 것을 지시한다.
강제 분해 샘플에서 CCL20 수준의 특성화
로트 MFG-053 및 로트 MFG-054
로트-053(1, 3, 및 5) 및 로트-054(1 - 8)의 강제 분해 처리 동안에 소모된 배지에서의 CCL20 수준을 표 33에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 122에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 CCL20 결과의 플롯을 함유한다(표 32). LOD보다 작은 결과는 LOD에서 플롯한다.
Figure pct00039
로트 MFG-066
로트-066(4 - 7)의 강제 분해 처리 동안에 소모된 배지에서의 CCL20 수준을 표 34에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 123에서 제공한다.
Figure pct00040
IL-16
IL-16은 림프구에 의해 만들어지는 것으로 알려진 사이토카인이다.
21-일 배양 동안의 IL-16의 특성화
21 일의 경과 동안에 소모된 배지에서의 IL-16 수준에 대한 기술 통계를 표 35에서 제시한다. 강제 분해 연구로부터의 대조 샘플(로트 MFG-053, MFG-054, 및 MFG-066)로부터의 데이터를 로트 MFG-025, MFG-026, MFG-027, MFG-035, MFG-036, 및 MFG-038로부터의 결과와 함께 포함하였다.
Figure pct00041
분석된 각 로트에 대해 소모된 배지에서의 IL-16 수준 대 일수의 산점도를 도 124에서 제공하고, 박스플롯을 도 125에서 제공한다. 적합선 플롯(2차 회귀 모델)을 도 126에서 제공한다. 산점도는 분석된 각 로트에 대해 소모된 배지에서의 IL-16 수준이 21 일의 경과 동안에 감소한다는 것을 보여준다. 박스플롯은 로트 간에 소모된 배지에서의 IL-16 수준의 가변성이 일반적으로 배양에 소모된 시간이 증가함에 따라 및 IL-16 수준이 0에 접근함에 따라 감소한다는 것을 지시한다. 회귀 분석으로부터의 조정된 R2 값은 배양에 소모된 시간이 IL-16 수준의 가변성의 57.3%를 설명한다는 것을 지시한다.
강제 분해 샘플에서 IL-16 수준의 특성화
로트 MFG-053 및 Lot-MFG-054
로트-053 (1, 3, 및 5) 및 로트-054 (1 - 8)의 강제 분해 처리 동안에 소모된 배지에서의 IL-16 수준을 표 36에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 127에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 IL-16 결과의 플롯을 함유한다(표 35 참조).
Figure pct00042
로트 MFG-066
로트-066(4 - 7)의 강제 분해 처리 동안에 소모된 배지에서의 IL-16 수준을 표 37에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 128에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 IL-16 결과의 플롯을 함유한다(표 36 참조). LOD보다 작은 결과는 LOD에서 플롯한다.
IGFBP-1
IGFBP2 - 6은 흉선 상피에 의해서 발현된다고 알려져 있고, 흉선 상피는 IGFBP-1을 발현하지 않는다(Gosteli-Peter 1994; Ketcha 1999).
21 일 배양 동안 IGFBP-1의 특성화
21 일의 경과 동안에 소모된 배지에서의 IGFBP-1 수준에 대한 기술 통계를 표 37에서 제시한다. 강제 분해 연구로부터의 대조 샘플(로트 MFG-053, MFG-054, 및 MFG-066)로부터의 데이터를 로트 MFG-025, MFG-026, MFG-027, MFG-035, MFG-036, 및 MFG-038로부터의 결과와 함께 포함하였다.
Figure pct00043
분석된 각 로트에 대해 소모된 배지에서의 IGFBP-1 수준 대 일수의 산점도를 도 129에서 제공하고, 박스플롯을 도 130에서 제공한다. 3차 회귀 모델을 도 131에서 제공한다. 산점도는 분석된 각 로트에 대해 소모된 배지에서의 IGFBP-1 수준이 21 일의 경과 동안에 증가한다는 것을 보여준다. 박스플롯은 로트 간에 소모된 배지에서의 IGFBP-1 수준의 가변성이 일반적으로 배양에 소모된 시간이 증가함에 따라 및 IGFBP-1 수준이 0에 접근함에 따라 감소한다는 것을 지시한다. 회귀 분석으로부터의 조정된 R2 값은 배양에 소모된 시간이 IGFBP-1 수준의 가변성의 61.2%를 설명한다는 것을 지시한다.
강제 분해 샘플에서 IGFBP-1 수준의 특성화
로트 MFG-053 및 로트 MFG-054
로트-053 (1, 3, 및 5)의 강제 분해 처리 동안에 소모된 배지에서의 IGFBP-1 수준을 표 38에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 132에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 IGFBP-1 결과의 플롯을 함유한다(표 37 참조). LOD보다 작은 결과는 LOD에서 플롯한다.
Figure pct00044
로트 MFG-066
로트-066(4 - 7)의 강제 분해 처리 동안에 소모된 배지에서의 IGFBP-1 수준을 표 39에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 133에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 IGFBP-1 결과의 플롯을 함유한다(표 138 참조). LOD보다 작은 결과는 LOD에서 플롯한다.
Figure pct00045
MIF
MIF는 흉선세포에 대해 가정되는 것과 부합하는 패턴을 갖는 케모카인이다.
21-일 배양 동안 MIF의 특성화
21 일의 경과 동안에 소모된 배지에서의 MIF 수준의 기술 통계를 표 40에서 제시한다. 강제 분해 연구로부터의 대조 샘플(로트 MFG-053, MFG-054, 및 MFG-066)로부터의 데이터를 로트 MFG-025, MFG-026, MFG-027, MFG-035, MFG-036, 및 MFG-038로부터의 결과와 함께 포함하였다.
Figure pct00046
분석된 각 로트에 대해 소모된 배지에서의 MIF 수준 대 일수의 산점도를 도 134에서 제공하고, 박스플롯을 도 135에서 제공한다. 선형 회귀 모델을 도 136에서 제공한다. 산점도는 분석된 각 로트에 대해 소모된 배지에서의 MIF 수준이 21 일의 경과 동안에 감소한다는 것을 보여준다. 박스플롯은 로트 간에 소모된 배지에서의 MIF 수준의 가변성이 일반적으로 배양에 소모된 시간이 증가함에 따라 및 MIF 수준이 0에 접근함에 따라 감소한다는 것을 지시한다. 회귀 분석으로부터의 조정된 R2 값은 배양에 소모된 시간이 MIF 수준의 가변성의 49.2%를 설명한다는 것을 지시한다.
로트-053(1, 3, 및 5) 및 로트-054(1 - 8)의 강제 분해 처리 동안에 소모된 배지에서의 MIF 수준을 표 41에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 137에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 MIF 결과의 플롯을 함유한다(표 36 참조). ULOQ보다 큰 결과는 플롯하지 않는다.
Figure pct00047
로트 MFG-066
로트-066 (4 - 7)의 강제 분해 처리 동안에 소모된 배지에서의 MIF 수준을 표 42에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 138에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 MIF 결과의 플롯을 함유한다(표 41 참조). ULOQ보다 큰 결과는 플롯하지 않는다.
Figure pct00048
CCL25(TECK)
CCL25(TECK)는 흉선세포에 대해 화학주성이라는 것을 보여준 케모카인이다(Liu 2005). 그것이 흉선 수지상 세포에 의해 및 FoxN1+ 및 FoxN1- TE 세포 둘 모두에 의해 발현된다고 알려져 있고(Bunting 2011); 하지만, 그의 활성은 이 케모카인의 단독 수용체인 CCR9가 결손된 마우스의 연구에 기초한 흉선 발달에 대단히 중요한 것으로 보이지 않는다(Wurbel 2001).
21 일 배양 동안 CCL25의 특성화
21 일의 경과 동안에 소모된 배지에서의 CCL25 수준에 대한 기술 통계를 표 43에서 제시한다. 강제 분해 연구로부터의 대조 샘플(로트 MFG-053, MFG-054, 및 MFG-066)로부터의 데이터를 로트 MFG-025, MFG-026, MFG-027, MFG-035, MFG-036, 및 MFG-038로부터의 결과와 함께 포함하였다.
Figure pct00049
분석된 각 로트에 대해 소모된 배지에서의 CCL25 수준 대 일수의 산점도를 도 139에서 제공하고, 박스플롯을 도 140에서 제공한다. 선형 회귀 모델을 도 141에서 제공한다. 산점도는 분석된 각 로트에 대해 소모된 배지에서의 CCL25 수준이 21 일의 경과 동안에 증가한다는 것을 보여준다. 박스플롯은 로트 간에 소모된 배지에서의 CCL25 수준의 가변성이 일반적으로 배양에 소모된 시간이 증가함에 따라 증가한다는 것을 지시한다. 회귀 분석으로부터의 조정된 R2 값은 배양에 소모된 시간이 CCL25 수준의 가변성의 49.2%를 설명한다는 것을 지시한다.
강제 분해 샘플에서 CCL25 수준의 특성화
로트 MFG-053 및 로트 MFG-054
로트-053 (1, 3, 및 5) 및 로트-054 (1 - 8)의 강제 분해 처리 동안에 소모된 배지에서의 CCL25 수준을 표 44에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 142에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 CCL25 결과의 플롯을 함유한다(표 43 참조). LOD보다 작은 결과는 LOD에서 플롯한다.
Figure pct00050
로트 MFG-066
로트-066 (4 - 7)의 강제 분해 처리 동안에 소모된 배지에서의 CCL25 수준을 표 45에서 제시하고, 데이터의 산점도를 도 143에서 제공한다. 산점도는 대조 샘플의 분석으로부터의 평균 CCL25 결과의 플롯을 함유한다(표 44 참조). LOD보다 작은 결과는 LOD에서 플롯한다.
Figure pct00051
부록
부록 1:
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
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상기 실시양태 및 이점은 전형적인 것에 지나지 않고, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 가르침은 다른 유형의 장치, 실험 및 수술적 절차에 쉽게 적용될 수 있다. 또한, 본 발명의 실시양태의 설명이 예시적이고 청구범위의 범위를 제한하지 않는 것을 의도한다. 많은 대안, 변형 및 변화가 관련 분야의 숙련된 자에게 명백할 것이다.
본 발명이 그의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 상기 설명이 예시적임을 의도하고 첨부된 청구범위의 범위에 의해 한정되는 본 발명의 범위를 제한하지 않는 것을 의도한다는 것을 이해해야 한다. 다른 측면, 이점, 및 변형이 다음 청구범위의 범위 내에 있다.
본 출원에서 논의된 참고문헌은 맥락에 기초해서 분명한 의도된 목적을 위해 전체가 참고로 포함된다.
본원에서 인용된 모든 특허, 특허출원 및 간행물은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 이들 간행물의 개시 전체가 본 출원에 참고로 포함된다.
본원에서 인용된 모든 특허, 특허 출원, 간행물, 및 수탁번호의 개시는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 개시물이 다양한 실시양태에 관해서 개시되었지만, 이들의 다른 실시양태 및 변화가 본 개시물의 진정한 정신 및 범위로부터 벗어남이 없이 관련 분야의 숙련자들에 의해 고안될 수 있다는 것이 명백하다. 첨부된 청구범위가 모든 그러한 실시양태 및 동등한 변화를 포함하는 것으로 해석되는 것을 의도한다.
상기 명세서는 관련 분야의 숙련자가 실시양태를 실시하는 것을 가능하게 하기에 충분한 것으로 고려된다. 상기 설명 및 실시예는 일부 실시양태를 상술하고, 본 발명자들에 의해 고려된 가장 좋은 방식을 기술한다. 그러나, 상기 내용이 명세서에서 아무리 상세해 보일 수 있더라도, 실시양태가 많은 방식으로 실시될 수 있고 첨부된 청구범위 및 그의 임의의 균등물에 따라서 해석되어야 한다는 것을 이해할 것이다.
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약어
AIRE: 자기면역 조절 유전자.
Ab: 항체.
Ag: 항윈.
ALCAM, 활성화 백혈구 세포 부착 분자.
ANG-1, 안지오포이에틴 1.
APC: 항원 제시 세포.
ATG: 티모글로불린.
BCMA, B-세포 성숙화 항원/종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 17 (TNFRSF17).
b.i.d.: 1 일 2 회.
BMI: 체중량 지수.
BSA: 체표면적.
BSC: 생물학적 안전성 캐비넷.
CCL11, 에오탁신.
CCL20, 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 20; MIP-3a.
CCL21/6Ckine, 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 21.
cDGA: 완전형 디죠지 기형.
CEACAM-1, 태아성암항원-관련 세포 부착 분자 1.
CFR: 미국연방규정집.
cGMP: 현행 우수 의약품 제조 품질 관리 기준.
CK: 사이토케라틴.
CNI: 칼시뉴린 억제제.
CTACK, CCL27, C-C 모티프 케모카인 리간드 27.
CTT: 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물.
CVVHD/F: 지속적 정정맥 혈액투석여과.
CXCL12/SDFF-1a, 간질 세포-유래 인자 1.
CXCL16, 케모카인 리간드 16.
DC: 수지상 세포.
DSA: 기증자-특이적 항체.
DGF: 지연된 이식편 기능.
DKK-1, Dickkopf-관련 단백질 1.
DMSO: 디메틸 설폭시드.
EBV: 엡스타인 바르 바이러스.
EGF R, 표피 성장 인자 렉터(rector).
EU: 내독소 단위.
FBS: 태아 소 혈청.
FDA: 식품의약품청.
FSGS: 초점성 분절성 사구체 경화증.
갈렉틴-7.
GAPDH: 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소.
GCP-2, 과립구 화학주성 단백질-2, (또는 C-X-C 모티프 케모카인 리간드 6).
GDF-15, 성장 분화 인자-15.
GDNF, 아교세포주-유래 신경영양 인자.
H&E: 헤마톡실린 및 에오신.
HD: 혈액투석.
HEPES: N-2-히드록시에틸 페페라진 N'-2-에탄-설폰산.
HI: HI - 열 불활성화.
HIP: 복강내.
HIV: 사람 면역결핍 바이러스.
HVEM, 헤르페스바이러스 진입 매개체.
ICAM-1, 세포간 부착 분자 1, CD54.
ICAM-3, 세포간 부착 분자 3.
IBW: 이상적 체중.
IDDM: 인슐린 의존 당뇨병.
IGFBP-1, 인슐린 라인(line) 성장 인자 결합 단백질 1.
IGFBP-6, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 6.
IL-1b, 인터루킨 1 베타.
IL-2Ra, 인터루킨-2 수용체 알파 사슬.
IL-2Rg, 인터루킨 2 수용체 서브유닛 감마.
IL-12p40, 인터루킨-12 서브유닛 베타.
IL-16, 프로-인터루킨-16.
ISHLT: 국제 심장 및 폐 이식 협회.
ISO: 국제 표준화 기구.
LAL: 투구게 유주세포 용해물.
LIGHT, 활성화된 T 세포 및 비성숙 DC에서 발현되는 TNF 슈퍼패밀리의 구성원.
LOD: 검출 하한.
M-CSF, 대식세포 집락-자극 인자.
MC3: Marcus Center for Cellular Cures.
mAb: 단일클론 항체.
MHC: 주조직 적합성 복합체.
MICA, MHC Class I 폴리펩티드-관련 서열 A.
MIF, 대식세포 이동 억제 인자.
MIP-3b, 대식세포 염증 단백질-3 베타(CCL 19, 케모카인 리간드 19).
MIP-1b, 대식세포 염증 단백질-1β
MST: 평균 생존 시간.
NRGi-B1, 뉴레굴린.
OPN, 오스테오폰틴
PBMC: 말초 혈액 단핵 세포.
PBS: 인산염 완충 식염수.
PDGF-AA, 혈소판-유래 성장 인자 AA.
PECAM-1, 혈소판 내피 세포 부착 분자-1 (CD31).
PF4, 혈소판 인자 4.
PIGF, 포스파티딜이노시톨-글리칸 생합성 클래스 F 단백질.
POD: 수술후 경과 일수.
PRA: 패널 반응성 항체.
RANTES, 활성화시 조절되는, 발현되고 분비될 정상 T 세포 (Regulated upon Activation, Normal T Cell Expressed and Presumably Secreted).
SCF R, 줄기 세포 인자 수용체.
SL: 설하.
TBW: 총 체중.
TC: 조직 배양물.
Tfh: T 여포성 헬퍼.
TOM: 흉선 장기 배지.
uPAR (CD87), 우로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체.
USP: 미국 약전.
ULOQ: 정량 상한.
USP: 미국 약전

Claims (126)

  1. 사람에게 임플란테이션하기에 적합한 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물(allogeneic cultured postnatal thymus tissue-derived product)을 생성하는 방법으로서,
    기증자 흉선을 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계를 포함하고; 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 증가하는 수준의 CCL21을 검출하는 단계; 및 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 임플란테이션에 적합한 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로서 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 차후 임플란테이션을 위해 액체 질소에서 동결보존하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 감소하는 수준의 L-셀렉틴을 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 감소하는 수준의 M-CSF, 갈렉틴-7 또는 IL-16 중 하나 이상을 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 M-CSF가 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 감소하는 것인, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 갈렉틴-7이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 감소하는 것인, 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 IL-16이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 감소하는 것인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 증가하는 수준의 CXCL12, CXCL16 또는 CCL11 중 하나 이상을 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 CXCL12가 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 증가하는 것인, 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 CXCL16이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 증가하는 것인 방법
  11. 제8항에 있어서, 상기 CCL11이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 증가하는 것인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘이 6 일, 또는 7 일, 또는 8 일, 또는 9 일, 또는 10 일, 또는 11 일, 또는 12 일, 또는 13 일, 또는 14 일, 또는 15 일, 또는 16 일, 또는 17 일, 또는 18 일 또는 19 일, 또는 20 일, 또는 21 일의 기간 동안; 또는 5-6 일, 또는 5-7 일, 또는 5-8 일, 또는 5-9 일, 또는 5-10 일, 또는 6 내지 7 일, 또는 6 내지 8 일, 또는 6 내지 9 일, 또는 6 내지 10 일, 또는 6 내지 11 일, 또는 6 내지 12 일, 또는 6 내지 21 일, 또는 7 내지 21 일, 또는 8 내지 21 일, 또는 9 내지 21 일, 또는 10 내지 21 일, 또는 11 내지 21 일, 또는 12 내지 21 일, 13 내지 21 일 또는 14 내지 21 일, 또는 15 내지 21 일, 또는 16 내지 21 일 또는 17 내지 21 일 또는 18 내지 21 일, 또는 19 내지 21 일, 또는 20 내지 21 일의 기간 동안인, 방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 CCL21의 수준이 도 50e에서의 수준과 비슷한 것인, 방법.
  14. 제8항에 있어서, 상기 L-셀렉틴의 수준이 도 50a에서의 수준과 비슷한 것인, 방법.
  15. 제8항에 있어서, 상기 M-CSF의 수준이 도 50b에서의 수준과 비슷한 것인, 방법.
  16. 제8항에 있어서, 상기 갈렉틴-7의 수준이 도 50c에서의 수준과 비슷한 것인, 방법.
  17. 제8항에 있어서, 상기 IL-16의 수준이 도 50d에서의 수준과 비슷한 것인, 방법.
  18. 제8항에 있어서, 상기 CXCL16의 수준이 도 50f에서의 수준과 비슷한 것인, 방법.
  19. 제8항에 있어서, 상기 CCL11의 수준이 도 50g에서의 수준과 비슷한 것인, 방법.
  20. 제8항에 있어서, 상기 CXL21의 수준이 도 50h에서의 수준과 비슷한 것인, 방법.
  21. 사람에게 임플란테이션하기에 적합한 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 생성하는 방법으로서,
    기증자 흉선을 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계를 포함하고; 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 생체표지자의 수준을 검출하는 단계; 및 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 임플란테이션에 적합한 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로서 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 생성하는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘 동안에 기증자 흉선 조직 슬라이스에서 기증자 흉선 조직 슬라이스 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해서 양성인 영역, 적어도 1 개 해살 소체(Hassall body)의 존재, 기증자 흉선 조직 슬라이스 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색 및 원상태(intact) 핵의 존재를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  23. 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 사람에게 임플란테이션하기에 적합한지 여부를 결정하는 방법으로서,
    기증자 흉선 조직 슬라이스를 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 컨디셔닝하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계; 및 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 사람에게 임플란테이션하기에 적합한지 여부를 결정하는 방법.
  24. 제24항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 및 CCL11로부터 선택된 것인, 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 L-셀렉틴인, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소하는 것인, 방법.
  27. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 M-CSF인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 흉선 장기 배지에서 M-CSF의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소하는 것인, 방법.
  29. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 갈렉틴-7인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 흉선 장기 배지에서 갈렉틴-7의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소하는 것인, 방법.
  31. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 IL-16인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 흉선 장기 배지에서 IL-16의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소하는 것인, 방법.
  33. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 CCL21인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 흉선 장기 배지에서 CCL21의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가하는 것인, 방법.
  35. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 CXCL12인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 흉선 장기 배지에서 CXCL12의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가하는 것인, 방법.
  37. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 CXCL16인, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 흉선 장기 배지에서 CXCL16의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가하는 것인, 방법.
  39. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 CCL11인, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 흉선 장기 배지에서 CCL11의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가하는 것인, 방법.
  41. 제23항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘 동안에 기증자 흉선 조직 슬라이스에서 기증자 흉선 조직 슬라이스 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해서 양성인 영역, 적어도 1 개 해살 소체의 존재, 기증자 흉선 조직 슬라이스 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색 및 원상태 핵의 존재를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  42. 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 사람에게 임플란테이션하기에 적합한지 여부를 결정하는 방법으로서,
    기증자 흉선 조직 슬라이스를 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 컨디셔닝하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계; 및 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 도 56의 표지자로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 사람에게 임플란테이션하기에 적합한지 여부를 결정하는 방법.
  43. 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 사람에게 임플란테이션하기에 적합한지 여부를 결정하는 방법으로서,
    기증자 흉선 조직 슬라이스를 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 컨디셔닝하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계; 및 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 사람에게 임플란테이션하기에 적합한지 여부를 결정하는 방법.
  44. 제23항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 레지멘 동안에 흉선 장기 배지에서 적어도 1 개, 또는 적어도 2개, 또는 적어도 3 개, 또는 적어도 4 개, 또는 적어도 5 개, 또는 적어도 6 개, 또는 적어도 7 개 표지자의 수준을 검출하거나, 또는 컨디셔닝 레지멘 동안에 흉선 장기 배지에서 적어도 8 개 표지자를 검출하는 것이 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 및 CCL11로부터 선택되는 것인, 방법.
  45. 대상체에서 흉선 장애를 치료하는 방법으로서, 개선점이 흉선 장애를 가지는 대상체에게 컨디셔닝 레지멘으로 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 슬라이스를 임플란팅하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계; 및 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하는 단계를 포함하는 것인, 대상체에서 흉선 장애를 치료하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 및 CCL11로부터 선택되는 것인, 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 L-셀렉틴인, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소하는 것인, 방법.
  49. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 M-CSF인, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 흉선 장기 배지에서 M-CSF의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소하는 것인, 방법.
  51. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 갈렉틴-7인, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 흉선 장기 배지에서 갈렉틴-7의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소하는 것인, 방법.
  53. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 IL-16인, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 흉선 장기 배지에서 IL-16의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소하는 것인, 방법.
  55. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 CCL21인, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 흉선 장기 배지에서 CCL21의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가하는 것인, 방법.
  57. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 CXCL12인, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 흉선 장기 배지에서 CXCL12의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가하는 것인, 방법.
  59. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 CXCL16인, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 흉선 장기 배지에서 CXCL16의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가하는 것인, 방법.
  61. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 CCL11인, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 흉선 장기 배지에서 CCL11의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가하는 것인, 방법.
  63. 제45항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘 동안에 기증자 흉선 조직 슬라이스에서 기증자 흉선 조직 슬라이스 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해서 양성인 영역, 적어도 1 개 해살 소체의 존재, 기증자 흉선 조직 슬라이스 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색 및 원상태 핵의 존재를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  64. 제45항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흉선 장애가 완전형 디죠지(complete DiGeorge) 증후군과 관련된 선천성 무흉선증인, 방법.
  65. 제45항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흉선 장애가 22q11.2 결손과 관련된 선천성 무흉선증인, 방법.
  66. 제45항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흉선 장애가 CHARGE(안과적 결손증, 심장 결함, 후비공 폐쇄증, 성장 또는 정신 지체, 생식기관형성저하증 및 귀 기형 또는 난청)와 관련된 선천성 무흉선증인, 방법.
  67. 제45항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흉선 장애가 chd7 (크로모도메인-헬리카제-DNA-결합 단백질 7) 유전자에서의 돌연변이와 관련된 선천성 무흉선증인, 방법.
  68. 제45항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흉선 장애가 포크헤드 박스 단백질 N1 (FOXN1) 결핍과 관련된 선천성 무흉선증인, 방법.
  69. 제45항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흉선 장애가 TBX-1 또는 TBX-2 유전자에서의 돌연변이와 관련된 선천성 무흉선증인, 방법.
  70. 제45항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흉선 장애가 연령-관련 흉선 퇴화인, 방법.
  71. 제45항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흉선 장애가 흉선종과 관련된 것인, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 흉선종이 악성인, 방법.
  73. 제71항에 있어서, 상기 흉선종이 비악성인, 방법.
  74. 제45항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흉선 장애가 중증 근무력증(MG), 순수 적혈구 무형성 및 저감마글로불린혈증과 관련된 것인, 방법.
  75. 사람 대상체에 면역적격성을 제공하는 방법으로서, 개선점이 기증자 흉선 조직 슬라이스를 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 컨디셔닝하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계; 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하는 단계; 및 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 사람 대상체에게 임플란팅하는 단계를 포함하는 것인, 사람 대상체에 면역적격성을 제공하는 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11로부터 선택되는 것이고; 여기서 상기 수준이 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, 또는 IL-1인 경우에는 감소하거나, 또는 표지자가 CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11인 경우에는 증가하고; 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 사람 대상체에 임플란팅하는 것인, 방법.
  77. 고형 장기 이식물을 받은 사람 대상체에 면역적격성을 제공하는 방법으로서,
    사람 대상체의 흉선을 제거하는 단계; 고형 장기에서 HLA-Class I 및 HLA-Class II 대립유전자와 일치하는 기증자로부터 흉선 조직을 얻는 단계; 기증자 흉선을 슬라이싱하는 단계; 기증자 흉선 조직 슬라이스를 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 컨디셔닝하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계; 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하는 단계; 고형 장기를 임플란팅하는 단계; 및 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 사람 대상체에게 임플란팅하는 단계를 포함하는, 고형 장기 이식물을 받은 사람 대상체에 면역적격성을 제공하는 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11로부터 선택되는 것이고; 여기서 상기 수준이 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, 또는 IL-1인 경우에는 감소하거나, 또는 표지자가 CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11인 경우에는 증가하고; 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 사람 대상체에게 임플란팅하는 것인, 방법.
  79. 고형 장기 이식물을 받은 사람 대상체에 면역적격성을 제공하는 방법으로서,
    사람 대상체의 흉선을 제거하는 단계; 고형 장기에서 HLA-Class I 및 HLA-Class II 대립유전자와 일치하는 기증자로부터 흉선 조직을 얻는 단계; 기증자 흉선을 슬라이싱하는 단계; 기증자 흉선 조직 슬라이스를 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 컨디셔닝하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계; 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하는 단계; 고형 장기를 임플란팅하는 단계; 및 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 사람 대상체에게 임플란팅하는 단계를 포함하는, 고형 장기 이식물을 받은 사람 대상체에 면역적격성을 제공하는 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11로부터 선택되는 것이고; 여기서 상기 수준이 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, 또는 IL-1인 경우에는 감소하거나, 또는 표지자가 CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11인 경우에는 증가하고; 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 사람 대상체에게 임플란팅하는 것인, 방법.
  81. 고형 장기 이식물을 필요로 하는 수혜자에서 사후 기증자로부터 얻은 동종이계 고형 장기 이식물에 대한 기증자-특이적 면역관용(donor-specific tolerance)을 촉진시키는 방법으로서, 다음 단계들을 포함하는 방법:
    (a) 수혜자의 흉선을 제거하는 단계;
    (b) 수혜자를, 수혜자의 T 세포를 고갈시키고/거나 수혜자의 T 세포가 이식된 고형 장기를 거부하는 것을 억제하는 하나 이상의 면역억제제를 포함하는 유도 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
    (c) 사후 기증자로부터 적합한 고형 사람 장기 및 흉선샘 둘 모두를 제공하는 단계;
    (d) 고형 사람 장기를 수혜자에게 이식하는 단계;
    (e) 수혜자를 유지 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
    (f) 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 제공하는 단계로서, 여기서 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 컨디셔닝 레지멘으로 흉선 장기 배지에서 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리되어 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 슬라이스를 생성하는 것이고; 추가로 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고; 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하는 것인, 단계; 및
    (g) 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 최장 21 일의 컨디셔닝 레지멘 후에 수혜자에게 임플란팅하는 단계로서, 여기서 흉선 조직 슬라이스의 용량이 약 1,000 - 22,000 mm2의 흉선 조직 표면적/m2 수혜자 체표면적이고, 추가로 여기서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 수혜자에서 흉선세포생성 및 관용을 유도하는 것인, 단계.
  82. 제81항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11로부터 선택되는 것이고; 여기서 흉선 장기 배지에서 표지자의 수준이 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, 또는 IL-1인 경우에는 감소하거나, 또는 표지자가 CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11인 경우에는 증가하고;
    (g) 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 최장 21 일의 컨디셔닝 레지멘 후에 수혜자에게 임플란팅하는 단계로서, 여기서 흉선 조직 슬라이스의 용량이 약 1,000 - 22,000 mm2의 흉선 조직 표면적/m2 수혜자 체표면적이고, 추가로 여기서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 수혜자에서 흉선세포생성 및 관용을 유도하는 것인 단계인, 방법.
  83. 고형 장기 이식물을 필요로 하는 사람 수혜자에서 생체(living) 사람 기증자로부터 얻은 동종이계 고형 장기 이식물에 대한 기증자-특이적 면역 관용을 촉진시키는 방법으로서, 다음 단계들을 포함하는 방법:
    (a) 수혜자의 흉선을 제거하는 단계;
    (b) 수혜자를, 수혜자의 T 세포를 고갈시키고/거나 수혜자의 T 세포가 이식된 고형 장기를 거부하는 것을 억제하는 하나 이상의 면역억제제를 포함하는 유도 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
    (c) 생체 사람 기증자로부터 적합한 고형 장기를 제공하는 단계;
    (d) 고형 장기를 수혜자에게 이식하는 단계;
    (e) 수혜자를 유지 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
    (f) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 은행에서 유지되는 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 제공하는 단계로서, 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 고형 장기 이식물에 존재하지 않는 수혜자에서의 HLA-Class I 및 HLA-Class II 대립유전자와 일치되는 HLA 대립유전자를 발현하는 흉선 기증자로부터의 흉선 조직으로부터 가공되는 것이고; 여기서 기증자 흉선 조직이 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리되는 것이고; 추가로 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고; 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 흉선 장기 배지에서 검출하고; 여기서 흉선 장기 배지에서 표지자의 수준이 도 7의 표지자의 수준에 따라서 증가하거나 또는 감소하는 것인, 단계;
    (g) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 해동하는 단계; 및
    (h) 해동된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 수혜자에게 임플란팅하는 단계로서, 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 용량이 약 1,000 - 22,000 mm2의 흉선 조직 표면적/m2 수혜자 체표면적이고, 추가로 여기서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 수혜자에서 흉선세포생성 및 관용을 유도하는 것인, 단계.
  84. 제83항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11로부터 선택되는 것이고; 여기서 상기 흉선 장기 배지에서 표지자의 수준이 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, 또는 IL-1인 경우에는 감소하거나, 또는 표지자가 CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11인 경우에는 증가하고;
    (g) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 해동하는 단계; 및
    (h) 해동된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 수혜자에게 임플란팅하는 단계로서, 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 용량이 약 1,000 - 22,000 mm2의 흉선 조직 표면적/m2 수혜자 체표면적이고, 추가로 여기서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 수혜자에서 흉선세포생성 및 관용을 유도하는 것인 단계인, 방법.
  85. 제83항 또는 제84항에 있어서, 상기 HLA 일치가 제2 필드에서 대립유전자의 아미노산 서열의 미미한 변화를 허용하는 것인, 방법.
  86. 제83항 또는 제84항에 있어서, 상기 HLA 일치가 제2 필드에서 HLA-DP 대립유전자에 대해 불일치를 허용하는 것인, 방법.
  87. 제83항 또는 제84항에 있어서, 해동된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 약 1/2이 수혜자에게 이식되고, 나머지가 추후 사용을 위해 동결보존되는 것인, 방법.
  88. 제83항 또는 제84항에 있어서, 단계 (h)가 고형 장기의 이식 후 약 1 개월 이상 후에 수행되는 것인, 방법.
  89. 고형 장기 이식물을 필요로 하는 사람 수혜자에서 사후 사람 기증자로부터 얻은 동종이계 고형 장기 이식물에 대한 기증자-특이적 면역 관용을 촉진시키는 방법으로서, 다음 단계들을 포함하는 방법:
    (a) 수혜자의 흉선을 제거하는 단계;
    (b) 수혜자를, 수혜자의 T 세포를 고갈시키고/거나 수혜자의 T 세포가 이식된 고형 장기를 거부하는 것을 억제하는 하나 이상의 면역억제제를 포함하는 유도 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
    (c) 생체 사람 기증자로부터 적합한 고형 장기를 제공하는 단계;
    (d) 고형 장기를 수혜자에게 이식하는 단계;
    (e) 수혜자를 유지 면역억제 레지멘으로 치료하는 단계;
    (f) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 은행에서 유지되는 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 제공하는 단계로서, 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 고형 장기 이식물에 존재하지 않는 수혜자에서의 HLA 대립유전자와 일치되는 HLA 대립유전자를 발현하는 흉선 기증자로부터의 흉선 조직으로부터 가공되는 것이고; 여기서 기증자 흉선 조직이 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리되는 것이고; 추가로 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고; 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1 개 표지자의 수준을 검출하고; 여기서 흉선 장기 배지에서 표지자의 수준이 도 56의 수준에 따라서 증가하거나 또는 감소하는 것인, 단계;
    (g) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 해동하는 단계; 및
    (h) 해동된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 수혜자에게 임플란팅하는 단계로서, 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 용량이 약 1,000 - 22,000 mm2의 흉선 조직 표면적/m2 수혜자 체표면적이고, 추가로 여기서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 수혜자에서 흉선세포생성 및 관용을 유도하는 것인, 단계.
  90. 제89항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11로부터 선택되는 것이고; 여기서 흉선 장기 배지에서 표지자의 수준이 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, 또는 IL-1인 경우에는 감소하거나, 또는 표지자가 CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11인 경우에는 증가하고;
    (g) 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 해동하는 단계; 및
    (h) 해동된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 수혜자에게 임플란팅하는 단계로서, 여기서 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물의 용량이 약 1,000 - 22,000 mm2의 흉선 조직 표면적/m2 수혜자 체표면적이고, 추가로 여기서 임플란팅된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 수혜자에서 흉선세포생성 및 관용을 유도하는 것인 단계인, 방법.
  91. 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로서, 다음 단계들을 포함하는 방법으로 제조된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물:
    (a) 기증자로부터 적합한 흉선 조직을 얻는 단계;
    (b) HLA 대립유전자: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DQA1, HLA- DPB1, HLA-DPA1을 타이핑하는 단계;
    (c) 흉선 조직을 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는, 단계;
    (d) 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 흉선 장기 배지에서 표지자 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1로부터 선택되는 적어도 1개 표지자의 수준을 검출하는 단계로서; 여기서 흉선 장기 배지에서 표지자의 수준이 도 7의 수준에 따라서 증가하거나 또는 감소하는 것인, 단계;
    (e) 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로서 회수하는 단계;
    (f) 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 액체 질소에서 동결보존하는 단계; 및
    (g) 액체 질소 중의 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 은행에서 유지하는 단계.
  92. 제91항에 있어서, 상기 적어도 1 개 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, 또는 IL-1로부터 선택되거나, 또는 표지자가 CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11인 경우에는 증가하고;
    (e) 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로서 회수하는 단계;
    (f) 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 액체 질소에서 동결보존하는 단계; 및
    (g) 액체 질소 중의 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 은행에서 유지하는 단계인, 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물.
  93. 제77항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고형 장기 이식물이 심장 이식물, 신장 이식물, 간 이식물, 폐 이식물, 심장/폐 이식물, 췌장 이식물, 장 이식물, 위 이식물, 복벽 이식물, 두개안면 이식물, 두피 이식물, 음경 이식물, 자궁 이식물, 일측성 또는 양측성 상지(upper limb) 이식물, 일측성 혈관화된 복합 동종이계이식편, 또는 그의 조합인, 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 고형 장기 이식물이 심장 이식물인, 방법.
  95. 제93항에 있어서, 상기 심장 이식물이 소아 심장 이식물인, 방법.
  96. 제93항에 있어서, 상기 심장 이식물이 성인 심장 이식물인, 방법.
  97. 제1항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘이 5 일인, 방법.
  98. 제1항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘이 6 일인, 방법.
  99. 제1항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘이 7 일인, 방법.
  100. 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘이 8 일인, 방법.
  101. 제1항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘이 9 일인, 방법.
  102. 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘이 10 일인, 방법.
  103. 제1항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘이 11 일인, 방법.
  104. 제1항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘이 12 일인, 방법.
  105. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘이 13 일인, 방법.
  106. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘이 14 일인, 방법.
  107. 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘이 15 일인, 방법.
  108. 제1항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘이 16 일인, 방법.
  109. 제1항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘이 17 일인, 방법.
  110. 제1항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘이 18 일인, 방법.
  111. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘이 19 일인, 방법.
  112. 제1항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘이 20 일인, 방법.
  113. 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨디셔닝 레지멘이 21 일 인, 방법.
  114. 사람에게 임플란테이션하기에 적합한 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로서, 다음 단계들을 포함하는 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물:
    (a) 사람 기증자로부터 적합한 흉선 조직을 얻는 단계;
    (b) 흉선 조직을 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고; 여기서 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴, 및/또는 M-CSF 및/또는 갈렉틴-7 및/또는 IL-16의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소하는 것이고; 추가로 여기서 흉선 장기 배지에서 CCL21 및/또는 CXCL12 및/또는 CXCL16 및/또는 CCL11의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가하는 것인, 단계;
    (c) 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로서 수확하는 단계;
    (d) 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 액체 질소에서 동결보존하는 단계; 및
    (e) 액체 질소 중의 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 은행에서 유지하는 단계.
  115. 사람에게 임플란테이션하기에 적합한 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로서, 다음 단계들을 포함하는 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물:
    (a) 사람 기증자로부터 적합한 흉선 조직을 얻는 단계;
    (b) 흉선 조직을 컨디셔닝 레지멘으로 약 6 일 내지 약 21 일의 기간 동안 처리하는 단계로서; 여기서 기증자 흉선 조직을 위한 컨디셔닝 레지멘이 기증자 흉선 조직을 흉선 장기 배지에서 무균 가공하여 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 생성하는 것을 포함하는 것이고; 여기서 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1의 수준이 도 56의 수준에 따라서 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가하거나 또는 감소하는 것인, 단계;
    (c) 부분적으로 T-세포 고갈된 기증자 흉선 조직 슬라이스를 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물로서 수확하는 단계;
    (d) 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 액체 질소에서 동결보존하는 단계; 및
    (e) 액체 질소 중의 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물을 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물 은행에서 유지하는 단계.
  116. 제114항 또는 제115항에 있어서, 상기 흉선 장기 배지에서 CCL21의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가하는 것인, 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물.
  117. 제114항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흉선 장기 배지에서 L-셀렉틴의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소하는 것인, 동결보존된 동종이계 동결보존된 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물.
  118. 제114항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흉선 장기 배지에서 M-CSF, 갈렉틴-7, 및 IL-16 중 하나 이상의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 감소하는 것인, 동결보존된 동종이계 동결보존된 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물.
  119. 제114항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흉선 장기 배지에서 CXCL12, CXCL16, 및 CCL11 중 하나 이상의 수준이 컨디셔닝 레지멘의 경과 동안에 증가하는 것인, 동결보존된 동종이계 동결보존된 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물.
  120. 제114항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기증자 흉선 조직 슬라이스에서 컨디셔닝 레지멘의 약 6 일 내지 약 21 일의 범위에서 기증자 흉선 조직 슬라이스 전체에 걸쳐서 산포된 케라틴 AE1/AE3에 대해서 양성인 영역, 적어도 1 개 해살 소체의 존재, 기증자 흉선 조직 슬라이스 전체에 걸쳐서 산포된 CK14 염색 및 원상태 핵의 존재를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 동결보존된 동종이계 동결보존된 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물.
  121. 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 사람에게 임플란테이션하기에 적합한지 결정하기 위한 사용 설명서와 함께, 제1항 내지 제120항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 키트.
  122. 제1항 내지 제121항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 키트로서, 상기 키트가 표지자 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/(Ckin), 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1과 특이적으로 결합하는 적어도 1 개 항체를 포함하는 것인, 키트.
  123. 제122항에 있어서, 상기 항체가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11과 특이적으로 결합하는 것인, 키트.
  124. 제115항 내지 제120항 중 어느 한 항에 따라서 배양된 동결보존된 동종이계 배양된 생후 흉선 조직-유래 생성물이 사용 설명서와 함께 사람에게 임플란테이션하기에 적합한지 여부를 결정하기 위한 키트.
  125. 제110항에 있어서, 상기 키트가 표지자 L-셀렉틴, CXCL16, M-CSF, CCL21/6Ckine, 갈렉틴-7, MIF, GDNF, CTACK, MIP-3b, ICAM-1, PECAM-1, IL-2Rg, SCF R, IL-16, GDF-15, PDGF-AA, CXCL12/SDFF-1a, MIP-3a, IL-2Ra, ICAM-3, LIGHT, IGFBP-1, BCMA, EGF R, uPAR, MIP-1b, PIGF, PF4, CCL11/에오탁신, HVEM, IGFBP-6, IL-6R. IL-12p40, RANTES, MICA, GCP-2, OPN, ALCAM, NRG1-B1, CEACAM-1, IL-1b, DKK-1 및 ANG-1과 특이적으로 결합하는 적어도 1 개 항체를 포함하는 것인, 키트.
  126. 제125항에 있어서, 상기 표지자가 L-셀렉틴, M-CSF, 갈렉틴-7, IL-16, CCL21, CXCL12, CXCL16, 또는 CCL11로부터 선택되는 것인, 키트.
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