TW202218671A - 測定經培養胸腺組織植入人體內之適用性之方法及相關使用方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供用於促進實體器官移植之接受者之供體特異性耐受及免疫活性的方法及組合物，其藉由在需要實體器官移植之接受者中植入同種異體實體器官且進一步包含在供體之實體器官之該接受者中手術植入經組織工程改造之同種異體培養之出生後胸腺組織產物來進行。本發明提供用於生產適用於植入人體內之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物的方法；培養適用於植入人體內之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物的方法及使用經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物植入人類受試者之方法。

Description

測定經培養胸腺組織植入人體內之適用性之方法及相關使用方法

本發明提供適用於測定T細胞耗乏之經培養小兒胸腺組織之生存力及適用性的生物標記物，亦稱為經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物（或有時稱為「CTT」），其用於在患有胸腺病症（包括先天無胸腺症及由胸腺病症所致之其他免疫系統功能障礙）的受試者中植入及T細胞重建。本發明提供用於促進接受來自供體之同種異體實體器官移植體之接受者中對同種異體實體器官移植體的供體特異性耐受之方法及組合物。

器官移植需要自供體製備及採集人類實體器官且移植至接受者中。實體器官移植之主要問題為接受者對供體之不耐受性。接受者T細胞將排斥器官且接受者B細胞將產生針對器官之抗體，造成其最終衰竭。實體器官移植之關鍵為接受者對所移植人類器官產生耐受性。估計在美國每年進行超過36,000例器官移植，且在歐洲及其他主要國家進行更多。進一步估計，在美國器官移植之等待清單上存在超過120,000位患者。對健康器官之需求顯著超出適合器官之供應。在2018年，鑑別約10,000名供體。參見https://optn.transplant.hrsa.gov。

移植排斥為實體器官移植之實質性挑戰。T細胞及B細胞兩者之移植排斥可導致器官功能之顯著併發症或甚至導致移植失敗。5年移植物存活率，例如對於心臟移植為77.7%，對於腎臟移植為78.6%，對於肝臟移植為72.8%且對於肺移植為53.4%。通常，此問題已部分地經由匹配主要組織相容複合體（MHC）抗原之供體及接受者且藉由避免接受者與接受者組織類型之抗體來解決。另外，使用免疫抑制方案以控制移植排斥反應之下的免疫學反應已得到改良。然而，耐受性尚未實現且許多器官之平均存活率僅為10年。

在植入程序之前及期間器官生存力之保留為第二重要挑戰。器官之移除、儲存及移植可極大地影響器官之內部結構及功能且可顯著影響在移植完成之後延遲或預防正常器官功能恢復的程度。

可有效保存實體人類器官之時段隨器官而變化，其中腎臟在24至36小時範圍內，胰臟在12至18小時範圍內，肝臟在8至12小時範圍內且心臟及肺在4至6小時範圍內。參見https://unos.org/transplantation/matching-organs。

器官損傷主要由於缺血及低溫症而出現，但亦可與活體外或植入期間之器官的再灌注有關。

用於器官保存之技術（包括活體外灌注）為此項技術中已知的且用於使器官受損降至最低且提高最佳移植物存活率及功能。

已為移植程序之受試者的主要實體器官包括腎臟、肝臟、心臟及肺。移植此等實體器官之成功已實現不同成功程度。主要變化存在於用於干擾免疫介導之移植排斥的技術中。經驗表明，不存在一種適用於涉及實體器官移植之所有設定之單一免疫抑制劑或技術。限制因素通常存在於與各個別免疫抑制劑相關之毒性中。與給定免疫抑制劑相關之毒性可能經常妨礙移植的實體器官或其他器官（諸如腎臟）之正常功能，當鈣調神經磷酸酶抑制劑用於預防排斥反應時可能失效。

與通常用於預防實體器官移植中之移植排斥的已知免疫抑制劑相關之毒性缺陷存在對發現預防實體器官移植之移植排斥的新方法之需要。

區分自身抗原與非自身抗原之能力為免疫反應的中心。此鑑別引起自身耐受性。自體免疫在存在自身耐受性喪失時顯現。在誘導對實體器官移植之耐受性的移植程序中存在未滿足之需求。

在患有胸腺病症（包括先天無胸腺症及由胸腺病症所致之其他免疫系統功能障礙）的受試者中進行經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物的植入程序之前及期間胸腺組織生存力之保存為實踐本發明之各種態樣及實施例的重要因素。

胸腺為發育可適當對外來抗原及病原體有反應，同時避免損傷自身反應性之T細胞所必需。

胸腺由於其需要建立初始T細胞譜系而在嬰兒期較大，但迅速變得恆穩，隨後持續整個成人期之緩慢的退化過程。過去二三十年之研究已確立，雖然成人胸腺之整體輸出降低，但器官對於產生具有新穎特異性的T細胞仍然至關重要，該等T細胞可保護免受感染性疾病或癌症且在諸如輻射、化學療法及諸如人類免疫缺陷病毒（HIV）的一些感染之免疫損害後再填入譜系（Gruver等人2007；Palmer等人2018；Sun等人2016；Wickemeyer及Sekhsaria 2014）。因此，近期注意力已集中於鑑別控管年齡相關之胸腺退化的機制及促進在成人免疫損傷之後胸腺再生的方法。

人體內之年齡相關之胸腺退化係藉由發育中之胸腺細胞損失及胸腺上皮細胞數目減少來表徵，藉由脂肪組織替代胸腺實質。判定驅動此等變化之機制是否為胸腺固有與胸腺非固有的難以使用動物模型解決，此係由於對胸腺之持續遷移，且此類問題通常不可能在活的人體內解決。

來源於年輕供體之胸腺組織的器官培養物適用於評估此等問題，因為人類胸腺切片之活體外培養導致胸腺細胞耗乏，同時通常維持胸腺上皮及基質細胞之生存力及功能。此係藉由此等切片生長出單層（Markert等人1997b）及在植入至泌尿無胸腺症接受者中時促進T細胞重建的能力來證明（Davies等人2017；Davis等人1997；Markert等人2004；Markert等人1999；Markert等人2007；Markert等人2010；Markert等人1997a；Markert等人2011；Markert等人2003）。吾等假設在胸腺器官培養期間發生之胸腺細胞損失可模擬急性及慢性退化且有助於鑑別驅動胸腺微環境在衰老期間變化的機制。

已展示經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物適用於治療由先天性無胸腺症引起之T細胞免疫缺乏（原發性免疫缺乏），例如治療與22q11.2缺失相關之完全DiGeorge氏畸形（complete DiGeorge Anomaly；cDGA）及與chd7（染色域-解旋酶-DNA-結合蛋白7）基因之突變相關的CHARGE（缺損、心臟缺陷、鼻後孔閉鎖、生長或智力遲鈍、生殖器發育不全及耳畸形或耳聾）症候群及患有叉頭框蛋白N1（FOXN1）缺乏症之無胸腺症患者。先天無胸腺症為罕見的致命病況且目前不具有利用管理機構批准之藥品的藥物治療選擇方案。

保留胸腺上皮細胞（TEC）之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物的實驗植入已成功地應用於治療患有先天無胸腺症之兒科患者（Markert ML, Devlin BH, McCarthy EA, 2010, 「《胸腺移植（Thymus transplantation）》」, 《臨床免疫學（Clin Immunol.）》, 135(2): 236-46；Markert ML等人, 2004, 「《出生後胸腺移植與免疫抑制用於治療DiGeorge氏症候群（Postnatal thymus transplantation with immunosuppression as treatment for DiGeorge syndrome）》」, 《血液（Blood）》104(8):2574-2581；Markert ML等人, 1999, 「《在完全DiGeorge氏症候群中移植胸腺組織（Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge syndrome）》」, 《新英格蘭醫學雜誌（N c J Med）》341(16):1180-1189 27）。

在此參考文獻中，DiGeorge氏症候群（DiGeorge Syndrome）定義為在心臟、胸腺及副甲狀腺中存在可變缺陷之病況。約1%之患有DiGeorge氏症候群之嬰兒患有無胸腺症且因此無法產生成熟且對抗感染之T細胞。據稱此等嬰兒患有完全DiGeorge氏症候群。在不意欲包括端點之情況下，存在符合完全DiGeorge氏症候群、22q11.2缺失症候群、CHARGE、糖尿病母親之嬰兒及無綜合症或基因缺陷之嬰兒的兒童亞群。先天無胸腺症亦可與TBX1或TBX2基因之突變相關。

同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物為組織工程改造之產物，其製備、培養且儲存至多21天（例如約6至約21天之培養方案）以產生部分T細胞耗乏之胸腺組織切片且其藉由預處理過程與天然胸腺分化。預處理方案（conditioning regimen）部分耗乏來自經培養胸腺組織切片之供體胸腺細胞。基於活體外資料（免疫組織化學），如使用細胞角蛋白抗體所評定，在6天與21天之間的培養時段保留上皮網路。培養較佳地在37℃下在5% CO ₂培育箱中進行。

培養過程顯著改變供體胸腺組織及其中所含之成分細胞之生物特徵，其以下方式為最佳化經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物切片的有效治療特性。培養過程確保具有先決條件生物特徵之經培養細胞/組織的限定組合物以適用於手術植入受試者中以使得能夠重建受試者之免疫系統的方式獲得。

培養過程導致胸腺細胞損失及供體胸腺組織切片中之TEC及其他基質細胞的相對富集。培養過程進一步導致胸腺細胞耗乏及維持TEC以使得能夠重建接受者之免疫系統且允許在接受者中產生對供體胸腺中之HLA抗原的耐受性。總體而言，培養過程經設計以耗乏來自供體胸腺組織之許多胸腺細胞且保留胸腺基質（胸腺上皮細胞及纖維母細胞）之功能架構。自幹細胞產生之常見淋巴祖細胞遷移至胸腺且進入胸腺作為胸腺沈降祖細胞。

培養過程描述於WO2019/165197A1，《經培養胸腺組織移植促進對同種異體實體器官移植之供體特異性耐受（Cultured Thymus Tissue Transplantation Promotes Donor-Specific Tolerance to Allogeneic Solid Organ Transplants）》, Markert, M. L.中，其特此以全文引用之方式併入。經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物切片之適用性的分析描述於PCT/US2019/040275中，其以全文引用之方式併入本文中。

在無胸腺症患者中手術投與經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物（例如，亦稱為「RVT-802」）導致一系列事件，從而導致功能性免疫系統發育。在接受者中手術置入同種異體的經培養出生後胸腺組織衍生產物之後，T細胞由供體TEC及接受者樹突狀細胞（DC）培養。與接受者DC結合之供體TEC能夠耐受植入供體胸腺組織，其作為經培養胸腺組織切片植入。此與正常胸腺中之耐受性誘導相同。與接受者DC結合之供體TEC導致對自身之耐受性。

所植入供體胸腺組織中之胸腺生成已藉由同種異體移植活組織檢查及外周存在接受者原生T細胞證明（Markert ML, 2010；Markert ML等人, 2008, 「《使用同種異體移植活組織檢查以評定胸腺移植之後的胸腺生成（Use of allograft biopsies to assess thymopoiesis after thymus transplantation）》」， 《免疫學雜誌（J Immunol）》180(9):6354-6364；Markert ML等人, 2007, 「《綜述54名參加胸腺移植方案之完全DiGeorge氏畸形的患者：44名連續移植之結果（Review of 54 patients with complete DiGeorge anomaly enrolled in protocols for thymus transplantation: outcome of 44 consecutive transplants）》」, 《血液》109(10):4539-454728），其以引用之方式併入本文中。

用研究性同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物治療之兒童的研究藉由混合淋巴球反應展示對供體主要組織相容複合體（MHC）之耐受性（Chinn IK, Devlin BH, Li YJ及Markert ML, 2008, 「《對完全DiGeorge畸形中之同種異體胸腺移植的長期耐受性（Long-term tolerance to allogeneic thymus transplants in complete DiGeorge anomaly）》」， 《臨床免疫學》126(3):277-281）。另外，患有先天無胸腺症之嬰兒在同種異體培養之出生後胸腺組織衍生移植之後能夠控制感染，諸如埃-巴二氏病毒（Epstein Barr virus）（Markert ML, 2014, 《胸腺移植》《Stiehm氏免疫缺乏（Stiehm's Immune Deficiences）》, Sullivan KE及Stiehm ER編（美國學術出版社（Academic Press）），第1版，第1059-1067頁）。

歷史上，同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物釋放準則已包括在製造過程之中點對組織之H&E及免疫染色切片的組織病理學評估，其後來細化至6至21天之培養時段。此組織病理學評估已充當效能分析，且已作為定性分析由委員會認證之病理學家進行。在分割組織切片之前，藉由冷凍或福馬林固定來製備用於評估之樣本且接著固定至載玻片上。以此方式製備之樣本在長時段內穩定，允許進行再分析。

可獲自20多年之發展歷史的歷史樣本可與陽性臨床結果相關，且因此提供用於開發用於評估產物品質之定量組織學分析的強大資料集。

使用同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之前述臨床批次及實驗批次之H&E載玻片的掃描影像開發一種新的數位組織學分析。分析此等影像以發展為定量釋放分析。數位組織學分析更完全描述於PCT/US2019/040275中。

回應於化學引誘劑細胞介素（趨化介素）及其他可溶性分子之細胞遷移為調節胸腺功能之重要但不直觀的機制（Hu等人2015）。早期胸腺細胞祖細胞在趨化介素梯度之影響下自骨髓遷移胸腺。趨化介素梯度亦影響其在胸腺內之遷移。早期胸腺細胞祖細胞及其CD4-/CD8-雙陰性（DN）後代與皮質胸腺上皮細胞相互作用，分化為CD4+/CD8+雙陽性（DP）胸腺細胞，且接著進行陽性選擇以分化為遷移至胸腺髓質之CD4+或CD8+單一陽性胸腺細胞（Lancaster 2018）。在自反應性細胞藉由陰性選擇缺失之後，所得原生成熟T細胞釋放至外周中。

儘管先前在患有先天無胸腺症之兒童中成功植入同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，但仍需要鑑別活的、功能性且適用於植入之經培養胸腺組織以便實現免疫重建。

實現供體特異性免疫耐受性仍然為移植之最終免疫目標。大部分當前方法集中於藉由耗乏（例如阿倫珠單抗（alemtuzumab）、胸腺球蛋白等）或抑制（例如鈣調神經磷酸酶抑制劑、巴利昔單抗（basiliximab）等）來控制外周成熟供體反應性T細胞而無需靶向胸腺中同種異體反應性T細胞之產生。然而，即使在免疫抑制藥物及新型免疫調節方案顯著進展之情況下，尚未一致地實現移植耐受性。

本發明人已展示，經由在切除胸腺接受者中植入經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物（在本文中亦稱為「CTT」或「RVT-802」），可實現對實體器官移植之耐受性，以縮短使用移植後免疫抑制劑來預防移植器官之排斥反應的時段。接受者胸腺之移除及經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之取代導致實體器官接受者之免疫系統的重建及對接受者自身以及對移植的同種異體實體器官之耐受性。

藉由手術插入經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之耐受性誘導類似於在造血幹細胞移植中經由供體樹突狀細胞（「DC」）之耐受性誘導（Sharabi Y及Sachs DH, 1989, 「《非致死性製備型方案誘導之混合嵌合體及永久特異性移植耐受性（Mixed chimerism and permanent specific transplantation tolerance induced by a nonlethal preparative regimen）》」,《實驗醫學雜誌（ J Exp Med）》169(2):493-502；Manilay JO, Pearson DA, Sergio JJ, Swenson KG及Sykes M, 1998, 「《使用非清髓性預處理方案製備之混合骨髓嵌合體中同種異體反應性T細胞的胸腺內缺失（Intrathymic deletion of alloreactive T cells in mixed bone marrow chimeras prepared with a nonmyeloablative conditioning regimen）》」, 《移植（ Transplantation）》66(1):96-102.）。自移植生物學研究中心（TBRC，Boston，MA）之一系列研究顯示胸腺在耐受性誘導中之關鍵作用（Yamada K等人, 1997, 「《胸腺在小型豬之移植耐受性中的作用.I.胸腺要求快速且穩定地誘導對I類錯配腎臟同種異體移植之耐受性（Role of the thymus in transplantation tolerance in miniature swine. I. Requirement of the thymus for rapid and stable induction of tolerance to class I-mismatched renal allografts）》」, 《實驗醫學雜誌》186(4):497-506）且在較大動物模型中測試具有耐受性誘導之胸腺移植（Yamada K等人, 2000, 「小型豬中之胸腺移植.II.藉由將複合胸腺腎臟移植至胸腺切除接受者來誘導耐受性（Thymic transplantation in miniature swine. II. Induction of tolerance by transplantation of composite thymokidneys to thymectomized recipients）》」, 《免疫學雜誌（ J Immunol）》 164(6):3079-3086; 5；Yamada K等人, 2003， 「微型豬中之胸腺移植：III.藉由跨完全主要組織相容性複合體錯配屏障移植複合胸腺腎臟來誘導耐受性（Thymic transplantation in miniature swine: III. Induction of tolerance by transplantation of composite thymokidneys across fully major histocompatibility complex-mismatched barriers）》」, 《移植》76(3):530-536；Nobori S等人, 2006, 「胸腺再生及由成人胸腺移植物誘導之耐受性（Thymic rejuvenation and the induction of tolerance by adult thymic grafts）》」, 《美國國家科學院院刊（ Proc Natl Acad Sci U S A）》103(50):19081-19086）。在其系列研究中，此組成功地使用HLA-II類匹配/I類錯配供體（胸腺及腎臟或心臟）作為胸腺複合組織（胸腺腎臟及胸腺心臟），使用環孢素（「CsA」12天用於移植耐受性誘導。其主張非血管化胸腺在其模型中不誘導耐受性。然而，更精確地，未經培養之非血管化胸腺不長期移植。如其所指示，未經培養之胸腺之移植失敗可歸因於除同種異體免疫以外之缺血性損傷（Yamada K等人, 2000）。在移植以誘導耐受性之前產生血管化胸腺之此精緻概念將難以在不使用異種移植的情況下轉變為臨床。（Kwun, Jean, Li, Jie, Rouse, Clay, Park, Jae Berm, Farris, Alton B., Kuchibhatla, Maragatha, Turek, Joseph W. Knechtle, Stuart J. Kirk, Allan D.及Markert, M Louise, 《經培養之胸腺組織植入促進對同種異體心臟移植之供體特異性耐受（ Cultured thymus tissue implantation promotes donor-specific tolerance to allogeneic heart transplants）》, 《JCI洞察（JCI Insight.）》2020年6月4日;5(11):e129983.數位物件識別碼：10.1172/jci.insight.129983）。

非血管化胸腺移植之限制可藉由培養系統以及T細胞耗乏來克服。保留TEC之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物（CTT）的實驗移植已成功地應用於治療患有先天無胸腺症之兒科患者（Markert ML, Devlin BH, McCarthy EA, 2010, 「《胸腺移植》」, 《臨床免疫學》, 135(2): 236-46；Markert ML等人, 2004, 「《出生後胸腺移植與免疫抑制用於治療DiGeorge氏症候群》」, 《血液》104(8):2574-2581；Markert ML等人, 1999, 「《在完全DiGeorge氏症候群中移植胸腺組織》」, 《新英格蘭醫學雜誌（ N Engl J Med）》341(16):1180-1189 27）。

在前述參考文獻中，DiGeorge氏症候群定義為在心臟、胸腺及副甲狀腺中存在可變缺陷之病況。約1%之患有DiGeorge氏症候群之嬰兒患有無胸腺症及因此無T細胞來對抗感染。據稱此等嬰兒患有完全DiGeorge氏症候群。存在符合完全DiGeorge氏症候群、22q11.2缺失症候群、CHARGE、糖尿病母親之嬰兒及無綜合症或基因缺陷之嬰兒的4個兒童亞群。在所有四個組中，患有無胸腺症之嬰兒表示極小群組，可能1%之總數兒童攜帶診斷，諸如22q11.2缺失症候群之診斷。

胸腺生成已藉由同種異體移植活組織檢查及外周存在接受者原生T細胞證明（Markert ML, 2010；Markert ML等人, 2008, 「《使用同種異體移植活組織檢查以評定胸腺移植之後的胸腺生成》」， 《免疫學雜誌》180(9):6354-6364；Markert ML等人, 2007, 「《綜述54名參加胸腺移植方案之完全DiGeorge氏畸形的患者：44名連續移植之結果》」, 《血液》109(10):4539-454728）。研究性CTT治療之兒童的研究展示藉由混合淋巴球反應對供體MHC之耐受性（Chinn IK, Devlin BH, Li YJ及Markert ML, 2008, 「《對完全DiGeorge畸形中之同種異體胸腺移植的長期耐受性》」, 《臨床免疫學》126(3):277-281）。另外，患有先天無胸腺症之嬰兒在CTT植入之後能夠控制感染，諸如埃-巴二氏病毒（Markert ML, 2014, 《胸腺移植》.《Stiehm氏免疫缺乏》, Sullivan KE及Stiehm ER編，（美國學術出版社），第1版，第1059-1067頁）。基於患有先天無胸腺症之人類的此等資料，確定在接受者中手術插入之後表現實體器官供體之MHC的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物將對自動及供體兩者產生耐受性，同時生產將保護接受者免於感染之功能性T細胞。 胸腺及胸腺細胞之培育 .（Kwun, Jean, Li, Jie, Rouse, Clay, Park, Jae Berm, Farris, Alton B., Kuchibhatla, Maragatha, Turek, Joseph W. Knechtle, Stuart J. Kirk, Allan D.及Markert, M Louise, 《經培養之胸腺組織植入促進對同種異體心臟移植之供體特異性耐受》, 《JCI洞察》.2020年6月4日;5(11):e129983.數位物件識別碼：10.1172/jci.insight.129983）。

胸腺通常位於心臟頂部上。胸腺為T細胞發育提供必要微環境且對適應性免疫系統之建立及維持至關重要（Boehm T及Takahama Y, 2014, 《胸腺發育及T淋巴球之選擇（ Thymic Development and Selection of T Lymphocytes）》.海德堡（Heidelberg）：斯普林格出版社（Springer-Verlag））。在出生後發育期間，胸腺培養自骨髓遷移至胸腺之造血幹細胞。祖細胞幹細胞移植於胸腺，藉此形成胸腺細胞。此後，胸腺細胞經歷一系列成熟步驟。此藉由呈現在胸腺細胞上之多個可觀察到的細胞表面標記物之表現來證明。

T細胞對於保護身體免於感染至關重要。在正常運作之胸腺中發育的T細胞產生一組不同T細胞受體（通常為細胞表面上之蛋白質），其使成熟T細胞能夠對抗各種感染。在此培育過程期間，胸腺指示中之T細胞未攻擊身體的正常蛋白質，諸如胰島素或副甲狀腺激素（其調節血液中之葡萄糖及鈣含量）。此等指令在自體免疫性調節基因（「 AIRE基因」）之影響下進行。

簡言之，培育過程發生在正常起作用之胸腺中。存在於胸腺中之胸腺細胞由骨髓幹細胞形成。胸腺細胞由位於胸腺內之胸腺上皮細胞（「TEC」）及樹突狀細胞（「DC」）培育，使其不攻擊接受者主要組織相容複合體（MHC）蛋白（抗原），諸如HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DQA1、HLA-DPB1、HLA-DPA1抗原。HLA抗原具有2種在凹槽中保持自身肽之蛋白質。自身肽可來自甲狀腺蛋白或胰島素肽或體內表現之幾乎任何其他蛋白質。在胸腺中發育之胸腺細胞形成由兩種跨越膜之蛋白質構成的T細胞受體（TCR）。TCR在T細胞之細胞表面上表現。各T細胞表現其獨特TCR之多個複本。若TCR過於緊密地結合至自身肽：樹突狀細胞上之MHC，則樹突狀細胞提供信號以使T細胞經歷細胞凋亡及死亡。此機制防止對自身之自體免疫的發展。TEC亦可向過於緊密結合之胸腺細胞提供信號。最後，DC可自TEC截取少量膜且將TEC自身肽:MHC呈遞至發育中的胸腺細胞。若胸腺細胞過於緊密結合，則DC發送信號使得胸腺細胞經歷細胞凋亡且死亡。藉由此等機制，離開胸腺之T細胞不具有自身反應性。離開胸腺之T細胞極其可變且可識別感染但其不會攻擊身體的蛋白質。

胸腺之兩種主要成分為按以下方式在胸腺中產生之上皮細胞及胸腺細胞。來源於骨髓幹細胞、常見淋巴祖細胞（「CLP」）之細胞作為早期胸腺祖細胞遷移至胸腺。CLP回應於藉由胸腺上皮細胞及內皮產生之信號（趨化介素）而進入胸腺。在胸腺中，CLP分化為胸腺細胞且增殖。胸腺細胞產生在細胞表面上表現之獨特的T細胞受體（「TCR」）。胸腺細胞亦開始表現T細胞分子CD3、CD4及CD8。廣泛多樣之T細胞發育使得細胞能夠在接受者之整個壽命中對感染有反應。混合淋巴球反應展示在用經培養胸腺組織（RVT-802）治療之兒童中的接受者T細胞對胸腺供體MHC之耐受性。

自反應性接受者胸腺細胞在自胸腺離開之前缺失。此係藉由接受者胸腺細胞及遷移至胸腺之接受者DC的相互作用而發生。在接受者胸腺細胞中誘導細胞凋亡，該等胸腺細胞過於緊密結合至DC作為保護身體免於自體免疫疾病之措施。在完成此過程之後，胸腺細胞離開胸腺。新循環T細胞（亦即，近期胸腺移植物）表現標記物CD31、CD45RA及CD62L。在數週之後，CD31標記物不再表現。表現CD45RA及CD62L之T細胞稱為原生T細胞。此等接受者T細胞通常回應於有絲分裂原而增殖。其保護接受者免於感染，而對自身無自體反應性。 同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物 .

已展示同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物適用於治療由先天無胸腺症引起之T細胞免疫缺乏（原發性免疫缺乏）。由無胸腺症所致之T細胞免疫缺乏與先天性病症相關，其預防功能性胸腺之發育，諸如與22q11.2缺失相關之完全DiGeorge氏畸形（cDGA）及與 chd7（染色域-解旋酶-DNA-結合蛋白7）基因之突變相關的CHARGE（缺損、心臟缺陷、鼻後孔閉鎖、生長或智力遲鈍、生殖器發育不全及耳畸形或耳聾）症候群及患有叉頭框蛋白N1（FOXN1）缺乏症之無胸腺症患者。造成無胸腺症之其他基因缺陷包括TBX1、TBX2、PAX1及信號蛋白3E（semaphorine 3E；SEMA3E），及Bernstock, Joshua D, Totten, AH及Atkinson, T. Prescott, 「《在染色體2p11.2處之復發性微缺失（Recurrent microdeletions at chromosome 2p11.2）》」, Bernstock, Joshua D, Totten, AH, 及Atkinson, T. Prescott, JACI 145:358-367。先天無胸腺症為罕見的致命病況且目前不具有利用管理機構批准之藥品的藥物治療選擇方案。若不進行治療且不發生兒童免疫系統之治療性重建，則由先天無胸腺症所致之原發性免疫缺乏為致命的，其中幾乎所有嬰兒在三歲之前死亡，最通常死於嚴重感染。

同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物為經組織工程改造之產物。基於本說明書及實例中之揭示內容，預期CTT適用於在接受所移植實體器官之接受者中發展耐受性。

如在本說明書及實例中更充分地描述，在無胸腺症患者中手術投與同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物（例如，「RVT-802」）導致一系列事件，從而導致功能性免疫系統發育。在接受者中手術置入同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之後，T細胞由供體TEC及接受者DC培養。與接受者DC結合之供體TEC能夠耐受植入供體胸腺組織，其作為經培養胸腺組織切片植入。此與正常胸腺中之耐受性誘導相同。如本說明書中所描述，與接受者DC結合之接受者TEC導致對自身之耐受性。

已臨床上展示，由於接受者對抗感染之能力，此複雜過程導致患有先天無胸腺症之接受同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物（例如，RVT-802）的患者中大於70%存活率（Markert ML， Devlin BH, Alexieff MJ, Li J, McCarthy EA, Gupton SE等人, 2007, 「《綜述54名參加胸腺移植方案之完全DiGeorge氏畸形的患者：44名連續移植之結果》」, 《血液》, 109(10): 4539-47；Markert ML, Devlin BH, McCarthy EA.《胸腺移植》.2010, 《臨床免疫學》135(2): 236-46）。接受者能夠控制病毒感染，諸如在CTT之前已致命的埃-巴二氏病毒。（Chinn IK, Devlin BH, Li YJ及Markert ML, 2008）。

實體器官移植 CTT 植入中之耐受性誘導之概述根據本說明書之描述、圖式、實例及申請專利範圍，本發明者已證明，CTT在大鼠心臟移植模型中誘導供體特異性耐受。本文所報導之實驗使用臨床上在患有先天無胸腺症之受試者（諸如罹患cDGA之受試者）中已使用之類似的CTT植入方法。cDGA嬰兒在手術置入CTT之前基本上沒有原生T細胞。在手術置入CTT之後，嬰兒在手術程序之後約6個月發育出原生T細胞。（Markert ML等人, 2004, 「《出生後胸腺移植與免疫抑制用於治療DiGeorge氏症候群》」, 《血液》104(8):2574-2581；Markert ML, Devlin BH及McCarthy EA, 2010, 「《胸腺移植》」, 《臨床免疫學》135(2):236-246）。大鼠模型中之耐受性誘導的研究係基於自1993年至2017年在患有完全DiGeorge氏畸形之無胸腺症嬰兒中之同種異體出生後的經培養胸腺組織衍生產物（CTT）之移植的研究結果。在患有先天無胸腺症之嬰兒中手術置入CTT之報導研究中獲得有利的結果。公開之結果展示在此另外致命病況中71%（61/86）之總存活率（基本上所有死亡發生在前9至12個月內；中值11.7年，在此評定時介於1.2至25年範圍內）（Markert， ML等人, 2010)。植入之經培養胸腺組織的活組織檢查已證明免疫組織化學上之胸腺生成（Markert, ML等人, 2008）。流式細胞量測術及光譜分型已展示不同T細胞譜系之發展。混合淋巴球反應展示接受者T細胞對胸腺供體抗原呈遞細胞之耐受性（Chinn IK， Devlin BH, Li YJ及Markert ML, 2008）。

重要的是，CTT之接受者能夠控制病毒感染，諸如在CTT之前已致命的埃-巴二氏病毒（Markert, ML, 2014, 《胸腺移植》《Stiehm氏免疫缺乏》, Sullivan KE及Stiehm ER編（美國學術出版社），第1版，第1059-1067頁）。基於展示對不匹配胸腺MHC抗原之耐受性的此等人類資料，使用臨床上使用之相同方法針對其在大鼠心臟移植模型中誘導供體特異性耐受的能力評估在大鼠模型中植入CTT。此等研究展示，移植不匹配心臟以及表現心臟供體之MHC I類及II類抗原之供體CTT（具有藉由抗CD5耗乏之初始T細胞及使用環孢素之免疫抑制）誘導對供體心臟之抗原的耐受性，同時保持針對其他MHC抗原之同種異體反應性。

本發明證實供體胸腺與實體器官共移植作為關於在接受者中移植之實體器官的耐受性誘導之方法。將最獲益於程序之患者群體為患有心臟衰竭之成人以及需要心臟移植之嬰兒。由於出生後胸腺組織存在且可自已故嬰兒移除，且接受者胸腺常規地自經歷心臟移植之嬰兒移除，因此將不需要除經培養胸腺組織植入（CTT）以外的額外程序來將此方法轉移至診所。成人中亦可進行類似移植。 製備同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之概述

同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物製備、培養且儲存至多21天（例如約6天至約21天之培養方案），且在植入當天，將其置於個別無菌杯中以供運輸至手術室，如本文更詳細地描述。

CTT（經培養胸腺組織）經無菌處理且在當前良好作業規範（「cGMP」）下培養，例如由美國食品及藥物管理局（U.S. Food & Drug Administration）（「FDA」）確立之cGMP，以產生部分T細胞耗乏之胸腺組織切片。CTT藉由下文詳細描述之預處理過程自天然胸腺分化。CTT在植入之後影響在胸腺中發育T細胞的正常陽性及陰性選擇過程，使得T細胞能夠耐受供體胸腺及供體實體器官移植兩者加上接受者組織。另外，此等T細胞可在接受者主要組織相容（MHC）蛋白之情形下識別外來抗原從而對抗感染。

投藥途徑係以下文所描述之方式藉由手術植入CTT。單次投藥通常為1,000至22,000 mm ²之以m ²為單位之CTT表面積/接受者體表面積（「BSA」）。表面積為所有經培養組織切片之所有表面積的總合。個別CTT切片在單次投與手術程序中植入。

在無胸腺症患者中手術植入同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物導致一系列事件，從而導致功能性免疫系統發育。（Markert ML, 2007；Markert ML等人, 2010；Markert ML, Devlin BH, McCarthy EA.《第84章胸腺重建（ Chapter 84 Thymic reconstitution）》2013.參見：Fleisher TA, Shearer WT, Schroeder HW, Frew AJ, Weyand CM編.《臨床免疫學（第四版）》倫敦;第1032-8頁）。

骨髓之接受者CLP遷移至胸腺同種異體移植物，作為早期胸腺祖細胞進入且在此處發育為接受者T細胞。供體胸腺移植物提供微環境，其中接受者胸腺細胞產生能夠識別病原體之廣泛的TCR譜系。

將接受者DC遷移至供體胸腺在新T細胞離開胸腺且進入循環之後耗乏將攻擊接受者組織的自反應性接受者胸腺細胞。在投與之後約5至12個月，在循環中可容易地偵測基因接受者原生T細胞。此等接受者T細胞具有不同TCR譜系且通常回應於有絲分裂原而增殖。其保護接受者免於感染，而對自身無自體反應性。

接受者骨髓CLP遷移至胸腺同種異體移植物，其中其發育為接受者T細胞。藉由已遷移至供體胸腺之接受者DC進行的陰性選擇引起對接受者MHC抗原之耐受性。在移植約2至3個月內取得之所植入經培養胸腺組織的活組織檢查中觀測到胸腺生成之免疫組織化學證據。胸腺生成反映T細胞防禦及控制感染以及預防自體免疫疾病之能力。

在移植後5至12個月在循環中偵測到原生T細胞，從而產生防禦及控制感染以及預防自體免疫疾病之能力。

首次展示經培養胸腺組織之植入有益於治療由與諸如完全DiGeorge氏畸形（cDGA）或叉頭框蛋白N1（FOXN1）缺乏的病況相關之先天無胸腺症引起之原發性免疫缺乏。發現在培養之後用正常胸腺組織（例如CTT及RVT-802）替換缺陷胸腺組織亦可免除在移植實體器官之接受者中觀測到的耐受性缺乏。

在經由置入經培養胸腺組織先天性無胸腺症之基礎上的非臨床及臨床工作導致實現在患者中置入CTT（例如，RVT-802）可允許產生對移植實體器官的耐受性。具體而言，若受試者在植入表現供體器官之MHC的CTT之前首先經胸腺切除且免疫抑制，則置入CTT將重建免疫系統且誘導對供體器官之耐受性。

與胸腺之細胞組分相關之某些標記物的表現及分佈之量測在活體外培養胸腺組織之後建立表型。本說明書及實例中所描述之培養條件支援在無胸腺症受試者中置入CTT之後活體內胸腺生成之觀測結果。

重要的係，在無胸腺症接受者中手術置入CTT之後，原生T細胞之發育及大範圍TCR可變區之存在提供明確的證據，培養胸腺組織可促進功能性內源性T細胞群體之產生。另外，在培養期間，在胸腺組織中注意到關鍵調節及結構性基因之表現。在手術插入CTT之後3至5個月可首先偵測到循環原生（CD45RA+CD62L+）T細胞。此等觀測結果已在治療患有完全DiGeorge氏畸形之患者中注意到（Markert ML, 2010；Markert ML.2013）。

針對胸腺組織植入之文獻中所描述之非臨床資料與植入同種異體培養之出生後胸腺組織的穩定臨床功效比對且支援其用於人體內。（Markert ML, Watson TJ, Kaplan I, Hale LP, Haynes BF, 1997, 「《在器官培養期間之人類胸腺微環境（The human thymic microenvironment during organ culture）》」, 《臨床免疫學及免疫病理學（ Clin Immunol Immunopathol.）》1月; 82(1):2 6-36；Hong R, Schulte-Wissermann H, Jarrett-Toth E, Horowitz SD, Manning DD, 1979, 「《經培養胸腺片段之移植.II.裸小鼠中之結果（Transplantation of cultured thymic fragments. II. Results in nude mice）》, 《實驗醫學雜誌》, 149(2):398-415。Li B, Li J, Hsieh CS, Hale LP, Li YJ, Devlin BH, Markert ML, 2009, 「《用於移植之經培養胸腺組織的表徵，強調甲狀腺組織特異性基因之混雜表現（Characterization of cultured thymus tissue used for transplantation with emphasis on promiscuous expression of thyroid tissue-specific genes）》」, 《免疫學研究（ Immunol Res.）》2009; 44(1-3):71-83；Li B, Li J, Devlin BH, Markert ML, 2011, 「《在出生後人類胸腺移植之後的胸腺微環境重建（Thymic microenvironment reconstitution after postnatal human thymus transplantation）》」, 《臨床免疫學》, 9月; 140(3): 244-59）。

完全DiGeorge氏畸形患者可能在年輕胚胎之頸部中發育之三個腺體、心臟、胸腺及副甲狀腺中存在缺陷。通常，心臟及胸腺下降至胸部中且副甲狀腺調節鈣離子含量，且保持在頸部中。與藉由其它模態治療之患者中的6%存活率（未公開資料）相比，用CTT治療cDGA受試者導致兩歲時之存活率為75%。如上文所指出，幾乎所有死亡發生在原生T細胞發育之前的第一年內。（Markert等人, 2010）。值得注意的係，CTT植入不影響必須分別控制之心臟及副甲狀腺之問題。

本發明之一態樣提供用於在接受者中手術置入經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物以在免疫學上正常的接受者中誘導對實體器官移植之耐受性的方法。此類方法包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：在免疫活性的接受者中移除胸腺；隨後用誘導免疫抑制方案耗乏接受者之T細胞，該方案包含一或多種免疫抑制劑，諸如一或多種抗體及/或一或多種鈣調神經磷酸酶抑制劑。誘導免疫抑制方案以治療有效量投與以耗乏受試者中之成熟T細胞及/或抑制接受者之T細胞排斥所移植之實體器官。自已故供體獲得適合之實體人類器官及胸腺且將實體器官移植至接受者中。投與維持免疫抑制方案持續一段時間以抑制移植排斥反應。使來自已故供體之胸腺經歷預處理方案持續至多21天之時段（例如，約6天至約21天之預處理方案），以在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片，藉此包含經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物。部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片展示對分散於整個組織中之角蛋白AE1/AE3呈陽性之區域、至少一種胸腺小體（Hassall body）之存在、分散於整個組織中之CK14染色及完整細胞核的存在。接著將經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物以手術方式置放於接受者中，通常置放於大腿的四頭肌中。經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物使接受者能夠在植入之後發育原生T細胞。所發育之所有新T細胞為基因接受者且對接受者及供體兩者具有耐受性。胸腺組織切片之劑量為約1,000 - 22，000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織表面積/接受者體表面積。在植入之後，經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在受試者中誘導胸腺生成及耐受性。

以心臟移植作為一實例，供體將為已故供體。胸腺將在移除心臟之同時自供體移除。緊接著在誘導免疫抑制之情況下進行心臟移植以減少T細胞數目且抑制剩餘接受者T細胞從而防止其攻擊供體心臟。供體胸腺經處理以形成人類經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其可用於植入以在至少約6天至約21天預處理時段之後誘導耐受性。作為預防措施，約一半的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物可在預處理之後冷凍保存，使得若存在心臟之隨後排斥反應的問題，則需要投與高劑量之類固醇或其他免疫抑制劑以治療排斥反應，且藉此極高劑量之類固醇損害經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物將在控制排斥反應發作之後可用於植入。

重要的是，在植入經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之後，即使在感染之存在下仍保持免疫耐受性。在諸如共刺激阻斷之其他方法的情況下，病毒感染可導致耐受性喪失，此係因為約三分之一的CD8 T細胞具有同種異體反應性。當免疫系統經活化以對抗感染時，同種異體反應性CD8 T細胞開始排斥實體器官移植。相比之下，當使用加工成經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物的胸腺組織以誘導耐受性時，經由胸腺中之負選擇過程使針對供體之可能同種異體反應性T細胞缺失。

在一實施例中，供體胸腺組織匹配不在接受者中之供體器官中的HLA對偶基因。所發育之所有新T細胞為基因接受者且對接受者及供體兩者具有耐受性。

在本發明之另一態樣中，提供一種用於促進需要實體器官移植之接受者中獲自已故供體之同種異體實體器官移植的供體特異性耐受之方法，該方法包含以下步驟： （a）移除接受者之胸腺； （b）用包含一或多種免疫抑制劑之誘導免疫抑制方案治療接受者以耗乏接受者之T細胞及/或抑制接受者之T細胞排斥所移植之實體器官； （c）提供來自已故供體之適合實體人類器官及胸腺； （d）將實體人類器官移植至接受者中； （e）用維持免疫抑制方案治療接受者； （f）提供經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其中經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物係獲自適合之實體器官供體的胸腺組織；其中供體胸腺組織經歷預處理方案至多21天之時段（例如，約6天至約21天之預處理方案）以生產經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；另其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；其中部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片展示對分散於整個組織中之細胞角蛋白（CK）（使用抗體AE1/AE3）呈陽性的區域、至少一種胸腺小體之存在、遍及組織分散之CK14染色及完整細胞核的存在；及 （g）在約6至約21天預處理方案之後將經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物植入接受者中，其中胸腺組織切片之劑量為約1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織表面積/接受者體表面積，且另其中所植入經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在接受者中誘導胸腺生成及耐受性。

在一實施例中，提供一種促進需要已故供體心臟之接受者中對同種異體心臟移植之供體特異性耐受的方法。該方法包含以下步驟： （a）自已故供體獲得適合之人類心臟以供移植； （b）在獲得心臟之同時移除已故供體胸腺，以用於預處理為經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；其中供體胸腺匹配供體移植器官中之HLA對偶基因； （c）用包含一或多種免疫抑制劑之誘導免疫抑制方案治療接受者以耗乏及/或抑制接受者之T細胞，其中一或多種免疫抑制劑包含在誘導麻醉時及在再灌注之後投與的糖皮質素； （d）將心臟移植至接受者中； （e）用維持免疫抑制方案治療接受者持續足以預防或抑制心臟之移植排斥反應的時段，該維持免疫抑制方案包含一或多種選自由以下組成之群的免疫抑制劑：鈣調神經磷酸酶抑制劑、肌苷單磷酸去氫酶抑制劑及抗胸腺細胞球蛋白； （f）在第6天與第21天之間提供經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其中經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物係獲自供體胸腺組織，其中供體胸腺組織經歷預處理方案約6至約21天之時段以產生經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；另其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；其中部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片展示對分散於整個組織中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域、至少一種胸腺小體之存在、遍及組織分散之CK14染色及完整細胞核的存在； （g）將經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之一部分植入接受者中，其中胸腺組織切片之劑量為約1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織表面積/接受者體表面積，且另其中所植入經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在接受者中誘導胸腺生成及耐受性；及 （h）在存在需要高劑量之類固醇之早期排斥反應發作的情況下冷凍保存待用於接受者中之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物的一部分，該等類固醇將損害在步驟（g）中植入之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物的部分。

在一實施例中，提供一種促進需要已故供體心臟之接受者中對同種異體心臟移植之供體特異性耐受的方法。該方法包含以下步驟： （a）自已故供體獲得適合之實體人類心臟以供移植； （b）在獲得心臟之同時移除已故供體胸腺，以用於預處理為經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；其中供體胸腺匹配供體移植器官中之HLA對偶基因； （c）用包含一或多種免疫抑制劑之誘導免疫抑制方案治療接受者以耗乏及/或抑制接受者之T細胞，其中一或多種免疫抑制劑包含在誘導麻醉時及在再灌注之後投與的糖皮質素； （d）以手術方式移除接受者之心臟及胸腺； （e）將供體人類心臟移植至接受者中； （f）用維持免疫抑制方案治療接受者持續足以預防或抑制心臟之移植排斥反應的時段，該維持免疫抑制方案包含一或多種選自由以下組成之群的免疫抑制劑：鈣調神經磷酸酶抑制劑、肌苷單磷酸去氫酶抑制劑及抗胸腺細胞球蛋白；其中，若接受者之術後狀況不太穩定而無法停用糖皮質素且在接受者中安全地植入經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，則經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在接受者穩定時冷凍保存以待稍後植入，其中供體胸腺組織經歷預處理方案約6至約21天之時段以生產經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；另其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；其中部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片展示對分散於整個組織中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域、至少一種胸腺小體之存在、遍及組織分散之CK14染色及完整細胞核的存在； （h）在患者穩定之後，將經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之一部分植入接受者中，其中胸腺組織切片之劑量為約1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織表面積/接受者體表面積，且另其中所植入經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在接受者中誘導胸腺生成及耐受性；及 （i）在存在需要高劑量之類固醇之排斥反應發作的情況下冷凍保存待用於接受者中之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物的一部分，該等類固醇將損害在步驟（h）中植入之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物的部分。

在本發明之另一態樣中，提供一種用於促進需要實體器官移植之人類接受者中獲自活人類供體之同種異體實體器官移植的供體特異性耐受之方法，該方法包含以下步驟： （a）   移除接受者之胸腺； （b）   用包含一或多種免疫抑制劑之誘導免疫抑制方案治療接受者以耗乏接受者之T細胞及/或抑制接受者之T細胞排斥所移植之實體器官； （c）   提供來自活人類供體之適合實體器官； （d）   將實體器官移植至接受者中； （e）   用維持免疫抑制方案治療接受者； （f）    提供保存在冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物庫中之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；其中冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物由來自胸腺供體的胸腺組織處理所得，該胸腺組織表現與接受者中的HLA對偶基因匹配但不存在於實體器官移植體中之HLA對偶基因；其中供體胸腺組織經歷預處理方案約6天至約21天之時段；另其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之胸腺組織切片，其中胸腺組織切片在完成預處理方案後展示對分散於整個組織中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域、至少一種胸腺小體之存在、遍及組織分散之CK14染色及完整細胞核的存在； （g）   解凍冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；及 （h）   將解凍之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物植入接受者中，其中冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之劑量為約1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織表面積/接受者體表面積，且另其中所植入之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在接受者中誘導胸腺生成及耐受性。

本發明之一第四態樣提供一種用於促進需要實體器官移植之接受者中對獲自已故供體之同種異體實體器官移植的供體特異性耐受之方法，該方法包含以下步驟： （a）移除接受者之胸腺； （b）用包含一或多種免疫抑制劑之誘導免疫抑制方案治療接受者以耗乏接受者之T細胞及/或抑制接受者之T細胞排斥所移植之實體器官； （c）提供來自活人類供體之適合實體器官； （d）將實體器官移植至接受者中； （e）用維持免疫抑制方案治療接受者； （f）提供保存在冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物庫中之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；其中冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物由來自胸腺供體的胸腺組織處理所得，該胸腺組織表現與接受者中的HLA對偶基因匹配但不存在於實體器官移植體中之HLA對偶基因；其中供體胸腺組織經歷預處理方案約6天至約21天之時段；另其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之胸腺組織切片，其中胸腺組織切片在完成預處理方案後展示對分散於整個組織中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域、至少一種胸腺小體之存在、分散於整個組織中之CK14染色及完整細胞核的存在； （g）解凍冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；及 （h）將解凍之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物植入接受者中，其中冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之劑量為約1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織表面積/接受者體表面積，且另其中所植入之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在接受者中誘導胸腺生成及耐受性。

在本發明之前述態樣的一實施例中，經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其中在採集當天，胸腺表明大於50%之區域對花邊染色圖案中之角蛋白呈陽性，存在胸腺小體，CK14在花邊圖案中染色且大於90%之細胞核為完整的。

在本發明之一態樣中，提供一種用於植入經歷實體器官移植之受試者中的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，該產物藉由獲自供體之適合胸腺組織而製備，其中供體胸腺組織經歷預處理方案至多21天之時段（例如，約6天至約21天之預處理方案）；另其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；其中供體胸腺組織切片在採集後第5天與第9天之間展示對分散於整個組織中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域、至少一種胸腺小體之存在、分散於整個組織中之CK14染色及完整細胞核的存在；回收部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片作為經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物。

在本發明之前述態樣的一實施例中，在自供體採集當天，胸腺表明大於50%之區域對花邊染色圖案中之角蛋白呈陽性，存在胸腺小體，CK14在花邊圖案中染色且大於90%之細胞核為完整的。

在本發明之前述態樣的一實施例中，冷凍保存經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物。

在一實施例中，將冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物保存在液氮中以供將來使用。

在另一實施例中，將冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物保存在冷凍保存之組織庫中。

在一實施例中，經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物係由來自供體之適合之胸腺組織製備，該供體包含與所提議的接受者中之HLA對偶基因匹配但不存在於實體器官移植體中之HLA對偶基因。

在一實施例中，HLA對偶基因為：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DPB1及HLA-DPA1。

在本發明之一態樣中，提供一種冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其藉由包含以下步驟之方法製備： （a）   自供體獲得適合之胸腺組織； （b）   對HLA對偶基因進行分型：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DPB1、HLA-DPA1； （c）   使胸腺組織經歷預處理方案約6天至約21天之時段；其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；另其中在第6天至第21天，供體胸腺組織切片在完成預處理方案後展示對分散於整個組織中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域、至少一種胸腺小體之存在、分散於整個組織中之CK14染色及完整細胞核的存在； （d）   採集部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片作為經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物； （e）   將經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物冷凍保存在液氮中；及 （f）    將液氮中之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物保存在冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物庫中。

在一實施例中，在採集當天，胸腺表明大於50%之區域對花邊染色圖案中之角蛋白呈陽性，存在胸腺小體，CK14在花邊圖案中染色且大於90%之細胞核為完整的。

在一實施例中，冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物保持在液氮中以供接受者將來使用。

在本發明之一態樣中，提供一種製備用於植入接受者受試者之供體胸腺的方法。此類方法包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：培養供體胸腺至多約5天、至多約6天、至多約7天、至多約8天、至多約9天、至多約10天、至多約11天、至多約12天、至多約13天、至多約14天、至多約15天、至多約16天、至多約17天、至多約18天、至多約19天、至多約20天或至多約21天；且接著將經培養胸腺組織以手術方式置放至接受者中，如本文進一步描述。約6與約21天之間的培養時段產生良好功能。為了成功移植冷凍保存的胸腺組織，組織通常培養約6至約21天，且接著冷凍保存。

在本發明之一態樣中，提供一種用於植入經歷實體器官移植之受試者的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物（CTT；RVT-802），該產物由使來自適合之供體的胸腺組織經歷預處理方案至多21天之時段（例如，約6天至約21天之預處理方案）的方法製得；其中用於經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之胸腺組織切片，其中胸腺組織切片展示對分散於整個組織中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域、至少一種胸腺小體之存在、分散於整個組織中之CK14染色及完整細胞核的存在。

在一實施例中，在採集當天，供體胸腺表明大於50%之區域對花邊染色圖案中之角蛋白呈陽性，存在胸腺小體，CK14在花邊圖案中染色且大於90%之細胞核為完整的。

在前述態樣及實施例之一實施例中，接受者之胸腺係藉由手術獲得。

在前述態樣及實施例之一實施例中，接受者之胸腺係藉由機器人手術獲得。

在前述態樣及實施例之一實施例中，接受者之胸腺係藉由胸腔鏡手術獲得。

在前述態樣及實施例之一實施例中，實體器官為整個器官之一部分。

在前述態樣及實施例之一實施例中，第一至第四態樣之方法進一步包含冷凍保存來自已故供體之外周血液單核細胞以供將來用於混合淋巴球反應中以證明細胞耐受性的步驟。

在前述態樣及實施例之一實施例中，在根據本說明書中之CTT的植入程序將經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物植入後，使用來自接受者之外周血液單核細胞及來自供體之冷凍保存的外周血液單核細胞進行混合淋巴球反應以證實細胞耐受性。

在前述態樣及實施例之一實施例中，在植入經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物後約6至12個月，用來自接受者之外周血液單核細胞及來自供體之冷凍保存的外周血液單核細胞進行混合淋巴球反應以證實細胞耐受性。

在前述態樣及實施例之一實施例中，在原生T細胞佔接受者中之總T細胞的約10%之後，用來自接受者之外周血液單核細胞及來自供體之冷凍保存的外周血液單核細胞進行混合淋巴球反應以證實細胞耐受性。

在前述態樣及實施例之一實施例中，所植入之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在植入經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物後12個月內在受試者中誘導胸腺生成。

在前述態樣及實施例之一實施例中，耐受性之發展係藉由用來自已故供體之冷凍保存的外周血液單核細胞及來自接受者之T細胞進行的混合淋巴球反應來判定。

在前述態樣及實施例之一實施例中，體液耐受性係藉由體液免疫之發展及供體反應性抗體之缺乏來判定。

在前述態樣及實施例之一實施例中，實體器官移植為心臟移植、腎臟移植、肝臟移植、肺移植、心臟/肺移植、胰臟移植、腸移植、胃移植、腹壁移植、顱面移植、頭皮移植、陰莖移植、子宮移植、單側或雙側上肢移植、單側血管化複合同種異體移植或其組合。

在前述態樣及實施例之一實施例中，該方法進一步包含在移植實體器官之前評估接受者之HLA-I類及HLA-II類組反應性抗體（「PRA」）得分。

在前述態樣及實施例之一實施例中，實體器官移植為心臟移植。

在前述態樣及實施例之一實施例中，實體器官移植為兒科心臟移植。

在前述態樣及實施例之一實施例中，實體器官移植為成人心臟移植。

在前述態樣及實施例之一實施例中，該方法進一步包含在移植實體器官之前評估接受者之HLA-I類及HLA-II類組反應性抗體（「PRA」）得分。

在前述態樣及實施例之一實施例中，具有HLA抗體之接受者與潛在供體交叉匹配。

在前述態樣及實施例之一實施例中，具有HLA抗體之接受者幾乎與UNET交叉匹配。

在前述態樣及實施例之一實施例中，若記錄大於20%虛擬交叉匹配之PRA得分，則方法將進一步包含在接受者中進行實體器官移植時在手術室中進行血漿清除術之步驟。

在前述態樣及實施例之一實施例中，若記錄大於70%虛擬交叉匹配之PRA得分，則方法將進一步包含在接受者中進行實體器官移植時在手術室中進行實際預期供體交叉匹配及進行血漿清除術的步驟。通常，由於成功率不佳，移植不會在此等情形下進行。

在前述態樣及實施例之一實施例中，方法進一步包含藉由幾乎與UNET交叉匹配來評估具有HLA抗體之接受者的步驟。

在前述態樣及實施例之一實施例中，若HLA組反應性抗體得分大於20%，則方法進一步包含在接受者中進行實體器官移植時在手術室中進行血漿清除術。

在前述態樣及實施例之一實施例中，若HLA組反應性抗體得分大於70%，則方法將進一步包含在接受者中進行實體器官移植時在手術室中進行實際預期供體交叉匹配及進行血漿清除術。

在前述態樣及實施例之一實施例中，實體器官（例如來自腎臟、部分肝臟及部分腸道移植體之活的相關供體之實體器官）與接受者為HLA匹配的。

在前述態樣及實施例之一實施例中，實體器官為HLA錯配的。

在前述態樣及實施例之一實施例中，實體器官為HLA匹配的。在另一實施例中，HLA匹配係藉由對HLA對偶基因進行分型來判定：供體及接受者中之HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DPB1、HLA-DPA1。

在前述態樣及實施例之一實施例中，實體器官移植為ABO相容的。

在前述態樣及實施例之一實施例中，實體器官為HLA錯配的。在一實施例中，HLA錯配係藉由對供體及接受者中之HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DQA1、HLA-DPB1、HLA-DPA1進行分型來判定。

在前述態樣及實施例之一實施例中，經培養胸腺組織切片以手術方式植入受試者之四頭肌大腿肌肉中。

在前述態樣及實施例之一實施例中，經培養胸腺組織切片以手術方式植入受試者身體之除四頭肌以外之區域中。

在前述態樣及實施例之一實施例中，經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之一部分以手術方式植入接受者之四頭肌大腿肌肉中。

在前述態樣及實施例之一實施例中，其中經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物的殘餘部分冷凍保存在液氮中以供將來移植。

在前述態樣及實施例之一實施例中，預處理方案持續約6天至約21天之時段。

在前述態樣及實施例之一實施例中，供體胸腺組織之預處理時段為約5天至約21天、或約5天、或約6天、或約7天、或約8天、或約9天、或約10天、或約11天、或約12天、或約13天、或約14天、或約15天、或約16天、或約17天、或約18天、或約19天、或約20天、或約21天。

一般熟習此項技術者應瞭解，存在諸多此項技術中已知的潛在誘導免疫抑制方案及維持免疫抑制方案，且適合之誘導及維持免疫抑制劑可由熟習此項技術者選擇而無不當負擔。以下說明性誘導免疫抑制方案及維持免疫抑制方案為本發明之第一至第四態樣之方法實踐的實例且支援所主張之發明。

在前述態樣及實施例之一實施例中，誘導免疫抑制方案包含選自以下之群的誘導免疫抑制劑：糖皮質素、抗胸腺細胞球蛋白（兔）、抗胸腺細胞球蛋白（馬類）及阿侖單抗（alemtuzimab）。

在前述態樣及實施例之一實施例中，ATG為抗胸腺細胞球蛋白（兔）。

在前述態樣及實施例之一實施例中，誘導免疫抑制方案包含投與糖皮質素。在一實施例中，糖皮質素包含甲基普賴蘇穠（methylprednisolone）。在另一實施例中，糖皮質素為甲基普賴蘇穠丁二酸鈉。在另一實施例中，以不超過4 mg/kg/天經靜脈內投與甲基普賴蘇穠丁二酸鈉。

在前述態樣及實施例之一實施例中，誘導免疫抑制方案包含兔源性抗胸腺細胞球蛋白。在另一實施例中，以約1.5 mg/kg之劑量靜脈內投與兔源性抗胸腺細胞球蛋白。在另一實施例中，每天投與抗胸腺細胞球蛋白持續四天。在另一實施例中，ATG為馬類衍生之ATG。

在前述態樣及實施例之一實施例中，誘導免疫抑制方案包含巴利昔單抗。在另一實施例中，針對體重小於35 kg之接受者，以10 mg之劑量靜脈內投與巴利昔單抗。在另一實施例中，針對體重大於35 kg之接受者，以20 mg之劑量靜脈內投與巴利昔單抗。

在前述態樣及實施例之一實施例中，第二免疫抑制方案包含一或多種選自由以下組成之群的免疫抑制劑：糖皮質素、鈣調神經磷酸酶抑制劑、肌苷單磷酸去氫酶抑制劑、硫唑嘌呤（azathioprine）及抗胸腺細胞球蛋白（「ATG」）。

在前述態樣及實施例之一實施例中，維持免疫抑制方案之免疫抑制劑為抗胸腺細胞球蛋白（ATG）。

在前述態樣及實施例之一實施例中，在約1.5 mg/kg之劑量下靜脈內投與ATG持續以在手術實中投藥開始3至14天的時段。

在前述態樣及實施例一實施例中，每天以約15 mg/kg/天藉由靜脈內投藥來投與抗胸腺細胞球蛋白持續3至14天。

在前述態樣及實施例之一實施例中，第一免疫抑制方案包含阿倫珠單抗。

在前述態樣及實施例之一實施例中，針對體重小於35 kg之接受者，以約 0.25 mg/kg之劑量靜脈內投與阿倫珠單抗4天。在另一實施例中，針對體重大於35 kg之接受者，以約3至20 mg之劑量靜脈內投與阿倫珠單抗4天。

在前述態樣及實施例之一實施例中，第二免疫抑制方案包含一或多種選自由以下組成之群的免疫抑制劑：鈣調神經磷酸酶抑制劑及肌苷單磷酸去氫酶抑制劑、或硫唑嘌呤。

在前述態樣及實施例之一實施例中，維持免疫抑制方案之免疫抑制劑為鈣調神經磷酸酶抑制劑。在一實施例中，維持免疫抑制方案之免疫抑制劑為肌苷單磷酸去氫酶抑制劑。

在前述態樣及實施例之一實施例中，免疫抑制方案包含肌苷單磷酸去氫酶抑制劑，例如黴酚酸酯（mycophenolate mofetil）。在一實施例中，以約15至約25 mg/kg之劑量靜脈內投與黴酚酸酯。在一實施例中，靜脈內投與黴酚酸酯一天兩次至三次。

在前述態樣及實施例之一實施例中，肌苷單磷酸去氫酶抑制劑為黴酚酸。在另一實施例中，以2或3次分次劑量以約25至約50 mg/kg之劑量投與黴酚酸。

在前述態樣及實施例之一實施例中，以針對兒童約400毫克/平方公尺/劑每天兩次（最大劑量720 mg）、或BSA 1.19至1.59 m ²約540 mg每天兩次或BSA大於1.58m ²約720 mg每天兩次之劑量投與黴酚酸。

在前述態樣及實施例之一實施例中，對於兒童一天兩次以約15至約25毫克/公斤/劑之劑量或對於成人每天兩次以約1500 mg之劑量經口或經靜脈內投與黴酚酸酯且調節WBC 大於3500。

在前述態樣及實施例之一實施例中，第二免疫抑制方案可進一步包含選自由以下組成之群的糖皮質素：甲基普賴蘇穠、普賴松（prednisone）及普賴蘇濃（prednisolone）。在一實施例中，糖皮質素之劑量保持低於4毫克/公斤/天。

在前述態樣及實施例之一實施例中，以逐漸減少的劑量投與糖皮質素，如在本發明中他處所描述。

在前述態樣及實施例之一實施例中，鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司（tacrolimus）。在另一實施例中，鈣調神經磷酸酶抑制劑為環孢素A。

在前述態樣及實施例之一實施例中，第二免疫抑制劑方案之投與在原生T細胞達至總T細胞的10%之後停止。在又另一實施例中，第二免疫抑制劑方案在植入經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之後停止。

為了評估在製備CTT之供體胸腺組織期間耗乏胸腺細胞時胸腺產生及/或趨化介素及其他可溶性分子之釋放可如何調節此等細胞遷移變化之過程，吾等使用抗體微陣列自人類胸腺器官培養物篩選條件培養基以存在200種可溶性分子。

使用額外胸腺器官培養物來驗證所選擇的潛在機械重要的候選分子之表現，且與自年齡範圍在5天至78歲內之供體獲得的一組充分表徵之人類胸腺組織進行比較。經由此分析，吾等鑑別胸腺細胞含量之某些潛在重要的生物標記物。

經培養胸腺切片之胸腺細胞含量之潛在重要生物標記物為L-選擇素。胸腺上皮細胞生存力及功能之另一重要生物標記物依賴於趨化介素CCL21 6Ckine之分泌。

諸多額外潛在生物標記物闡述於圖50及圖56中。尤其受關注的為圖50中所闡述之生物標記物，亦即L-選擇素、CCL21、CXCL16、M-CSF、半乳糖凝集素-7、CCL11、IL-16及CXCL12。此外，尤其受關注的為圖56中所闡述之生物標記物，特定言之P值小於0.05之生物標記物。此等生物標記物將包括：L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、CCL20（MIP-3a）、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR（CD87）、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素（Eotaxin）、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1。

實例及文獻中所報導之資料支援以下生物標記物指示TEC功能：CCL21（6Ckine）、CXCL16、骨橋蛋白（OPN）、CCL11、uPAR（CD87）及CXCL12。CXCL16：此趨化介素已展示由TEC產生（Bunting 2011）。

骨橋蛋白（OPN；由SPP1基因編碼）：此細胞激素在胸腺應激期間增加且所增加含量與胸腺萎縮（胸腺細胞數目減少）相關，胸腺細胞數目減少為經培養胸腺之所需狀態（Wang 2009；Gridley 2013）。OPN為製備皮質類固醇所需的，其已證實誘導胸腺細胞凋亡。

CCL11（伊紅趨素）：此趨化介素係藉由髓質TE製備（Bunting 2011）。其最初根據其吸引嗜伊紅血球之能力而命名且吾等已展示嗜伊紅血球浸潤在具有活性胸腺生成之胸腺組織中可能為顯著的（Flores 1999）。然而，亦展示伊紅趨素充當用於雙陽性（DP）及單陽性（SP）人類胸腺細胞兩者之化學引誘劑（Bunting 2011）。

uPAR（CD87；由PLAUR基因編碼）：亦稱為尿激酶纖維蛋白溶酶原活化因子受體之尿激酶接受者基於替代性剪接以可溶性及膜結合形式表現。其有助於胞外基質之局部降解。已展示其在人類胸腺中表現且有趣的係，藉由在傷口邊緣處遷移表皮角質細胞（EK）（Loughner 2016）。此後一特徵為最受關注的，因為TE細胞反映許多基因之表現中之EK（Patel 1995）。藉由經培養胸腺切片分泌之逐漸增加可反映TE之活化且因此為在植入後TE過度生長之標記物。

CXCL12（SDF-1a）：此趨化介素具有不同於其他分析物之表現模式，因為其僅在培養時段之最終1/3期間偵測到。首先可在第13至15天偵測，其在培養中在下週內線性上升（在ln曲線圖中）至高得多的水準。已證明CXCL12由囊下皮質及髓質TE產生（Bunting 2011；Hernandez-Lopez 2002；Zaitseva 2002），且亦可由胸腺內存在之胸腺纖維母細胞及內皮細胞製備。已展示CXCL12將B細胞及抗原呈遞細胞（APC）補充至胸腺（Weiss 2003），預期其在產生全胸腺功能方面為重要的。其亦涉及胸腺內之胸腺細胞亞群之定位且其增強胸腺細胞增殖至IL-7（Hernandez-Lopez 2002）。值得注意的係，已展示中和CXCL12之抗體活體外減少人類胸腺器官培養物中之胸腺生成且CXCL12之添加增加此等培養物中之胸腺生成（Hernandez-Lopez 2002）。

可反映胸腺細胞存在之額外生物標記物包括L-選擇素。此分子以高含量在發育及原生T細胞上表現。當培養胸腺細胞時，其自細胞表面釋放。通常當活體內健康細胞脫落時快速再表現（Fitzhugh 2008），脫落水準逐漸降低有可能反映胸腺細胞生存力之逐漸喪失，此係因為在培養期間其通常不在其表面上再表現此分子（A. Macintyre，未公開資料）。

可反映胸腺細胞存在之另一生物標記物為IL-16。此細胞激素包括在內，因為其模式（如下所描述）對應於對胸腺細胞之假設。已知此生物標記物由淋巴球製備。

可反映胸腺細胞存在之又另一生物標記物為MIF。此趨化介素包括在內，因為其模式對應於對胸腺細胞之假設。

可反映胸腺細胞存在之再一生物標記物為CCL20（MIP-3a）：此趨化介素包括在內，因為其模式對應於對胸腺細胞之假設。

可反映胸腺細胞存在之另一生物標記物為IGFBP-1。已知IGFBP2-6由不表現IGFBP-1之胸腺上皮細胞表現（Gosteli-Peter 1994；Ketcha 1999）。

展示接著隨時間降低之最初高含量的其他生物標記物，基於實例及文獻中之資料的胸腺細胞衍生之生物標記物的假設特徵與活胸腺細胞之存在相關：L-選擇素、IL-16、MIF、CCL20（MIP-3a）及IGFBP-1。隨時間推移此等生物標記物之減少與吾等更定性的觀測結果一致，即在培養胸腺組織切片時T細胞耗乏。

已展示CCL21由胸腺上皮細胞表現（Lkhagvasuren等人2013）且由於其對胸腺細胞前驅體之趨化活性而在功能上很重要（Liu等人2005），以及對胸腺內之胸腺細胞遷移在功能上很重要（Hu等人2015）。如本文所描述，胸腺細胞之此趨化性特性可為植入經培養胸腺組織之後接受者成功免疫重建之關鍵決定因素。

此處報導之結果亦應廣泛地適用於理解與年齡相關之胸腺退化的機制以及經由植入經培養胸腺組織來理解涉及無胸腺症接受者之免疫重建的機制。

在實例中且在圖56上，據報導，至少127種不同的分析物可在自經培養人類胸腺組織切片獲得之廢/條件培養基中偵測到且此等分析物中之42種展示隨培養時間而逐漸增加或減少。在此等分析物中，所釋放之可溶性L-選擇素之量經證實為經培養胸腺中活胸腺細胞之殘餘含量的非破壞性標記物。在胸腺器官活體外培養期間及活體內在整個生命期內自健康供體獲得之未經處理的胸腺組織中，趨化介素CCL21、CXCL16、CXCL12及CCL11藉由胸腺上皮細胞之表現及/或分泌證實隨著胸腺細胞減少而增加，類似地，觀測到在培養過程之時程期間胸腺器官培養基中之L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7及IL-16之表現或分泌降低。此等結果與理解與年齡相關之胸腺退化的機制以及有助於免疫重建之人類胸腺組織之品質直接相關。在嬰兒胸腺培養期間所見之變化與衰老相關之彼等變化之間的平行表明經培養人類嬰兒胸腺亦提供可適用於研究介導年齡相關之胸腺退化之機制的模型。

據吾等所知，此為人類胸腺在胸腺細胞耗乏時產生及釋放或分泌之可溶性分子的第一次大篩選。42種分析物中之多數被認為隨著培養進展已顯著增加或減少釋放至培養基中，該等分析物為先前已展示由胸腺內存在之細胞類型產生的細胞介素及/或趨化介素。其他者在此方面為新穎的。雖然實驗工作主要集中於釋放L-選擇素作為胸腺細胞含量之標記物且集中於CCL21作為TEC生存力及功能之標記物，但自抗體微陣列篩選所報導之資料可用於鑑別來自圖56之額外分析物，其可鑑別活體內控管人類胸腺之急性萎縮、慢性退化及/或再生的新穎路徑。此等將尤其包括圖50所闡述之生物標記物。舉例而言，未進一步考慮一些符合預先指定選擇標準之分析物，因為已知其在細胞損傷及/或低氧應激期間表現或釋放且其含量可反映培養物相關組織損害及發炎反應而非胸腺特異性生物學。在來自經培養胸腺組織切片之培養上清液中注意到的額外生物標記物包括CC25（TECK）、骨橋蛋白（OPN）、uPAR（CD87）、MIF、CCL20（MIP-3a）及IGFBP-1。對其釋放可反映人類胸腺中之關鍵細胞類型之生存力及/或活化的額外分析物之研究可導致臨床上及機理上重要的見解，特定言之關於對胸腺細胞損失之反應。

CCL25（TECK）：儘管可偵測含量之TECK僅存在於所檢驗之3種胸腺培養物中之2種的培養週期後期之上清液之少數樣品中，但令人感興趣的係，因為此趨化介素已展示對胸腺細胞之趨化性（Liu 2005）。已知其由胸腺樹突狀細胞（DC）及FoxN1+及FoxN1-TE細胞兩者表現（Bunting 2011）。然而，基於其中CCR9（此趨化介素之唯一受體）缺失之小鼠的研究，其活性似乎對胸腺發育不重要（Wurbel 2001）。

基於微陣列研究，確定條件培養基中之可溶性L-選擇素含量可充當經培養胸腺切片中之胸腺細胞存在及生存力的潛在生物標記物。此似乎為極其合理的，因為L-選擇素之表現限於造血細胞且組成性地以及在遷移期間脫落（Hafezi-Moghadam等人2001），接著通常由健康細胞活體內快速地再表現（Fitzhugh等人2008）。

實驗結果展示，L-選擇素釋放之損失在時間上與胸腺細胞死亡相關，如經由組織學及CD3免疫組織化學由胸腺細胞膜完整性之損失以及藉由Ki-67免疫組織化學由特徵性胸腺細胞增殖之缺乏所指示。

能夠非破壞性地監測經培養人類胸腺切片之胸腺細胞含量對於鑑別實驗研究之最適當的採集時間點為重要的。此亦可提供臨床上重要的資訊，音位咸信經由耗乏供體胸腺細胞藉由接受者胸腺細胞移生開放發育生態棲位對於無胸腺症患者經由胸腺植入來成功免疫重建至關重要。總之，實例中所展示之研究表明減少之L-選擇素釋放為用於監測經培養胸腺切片中之胸腺細胞耗乏的適用生物標記物。

反映胸腺上皮細胞之存在及功能之生物標記物亦可提供關鍵機理資訊。實例中闡述之研究集中於CCL21，因為微陣列篩選指示在開始培養後不久，此趨化介素開始以高含量分泌至培養基中。先前展示CCL21由胸腺上皮細胞表現且對胸腺細胞及其前驅體具有趨化性（Liu等人2005）。吾等研究展示CCL21之表現亦可容易地藉由酶免疫分析法定量。免疫組織化學藉由經培養以及未培養之胸腺中的TEC證實CCL21表現，其中在髓質及囊下皮質胸腺上皮細胞中表現最強。

亦值得注意的係，胸腺切片之CCL21免疫反應性不一定隨著CCL21分泌在培養期間增加而增加。此可反映所產生之額外CCL21分泌而非保留於細胞質中，其中其可經由免疫組織化學偵測。CCL21為轉錄調節的高轉換分子，其具有短半衰期（Dudal等人2015），因為所觀測到的陽性免疫組織化學反應性表示積極產生此趨化介素之細胞。在經培養胸腺及未處理衰老胸腺中，CCL21之產生隨著胸腺細胞減少而顯著增加，表明胸腺上皮細胞可感測胸腺細胞含量且以恆穩嘗試反應以抵消胸腺細胞損失。

將CCL21鑑別為反映TEC之生存力及功能之分泌生物標記物在臨床上對於胸腺移植亦為重要的。可評定待植入組織之品質的大部分現有方法（例如流式細胞量測術、免疫組織化學、基因表現分析）在分析期間破壞樣品。除減少可供用於最終植入之組織量以外，此類結果還會受到取樣誤差的影響，因為所測試切片不為最終植入之切片的部分。如圖53C中所示，CCL21之混合廢培養基之分析可整合來源於任何給定胸腺供體之批次中的所有切片，從而提供整體批次品質之非破壞性圖像。

趨化介素CXCL12（SDF-1α）在篩選中與大部分其他分析物之不同之處在於其在培養時段期間在條件培養基中變得相對晚可偵測到（圖50H）。首先可在第13至15天偵測，其在培養中在下週內線性上升（在ln曲線圖中）至高得多的水準。已證明CXCL12由囊下皮質及髓質TEC產生，但亦可由胸腺內存在之胸腺纖維母細胞及內皮細胞製備（Bunting等人2011；Hernandez-Lopez等人2002；Zaitseva等人2002）。CXCL12將B細胞及抗原呈遞細胞補充至胸腺（Weiss等人2013），預期其在產生全胸腺功能方面為重要的。CXCL12亦涉及胸腺內之胸腺細胞亞群的定位且其增強胸腺細胞增殖至IL-7 （Hernandez-Lopez等人2002）。值得注意的係，已展示中和CXCL12之抗體在活體外減少人類胸腺器官培養物中之胸腺生成且CXCL12之添加增加此等培養物中之胸腺生成（Hernandez-Lopez等人2002）。相較於較年輕供體，此處展示之在活體外胸腺器官培養期間CXCL12分泌之較晚時序以及其在來源於大於18歲之供體的胸腺中活體內增加的表現表明此趨化介素之表現由比誘導CCL21分泌所需之更長期的胸腺細胞耗乏所誘導。

篩選資料表明，其他趨化介素（包括CXCL16及CCL11）為評定經培養胸腺之生存力及功能的可能生物標記物，因為其亦隨著胸腺細胞在胸腺器官培養期間損失而增加。CXCL16及CCL11兩者先前已展示由TEC製備（Bunting等人2011）。

CCL11由於其吸引嗜伊紅血球之能力而最初命名為伊紅趨素。吾等先前展示，嗜伊紅血球浸潤可顯著鄰近於具有活性胸腺生成之胸腺組織（Flores等人1999），儘管在彼等研究中未直接量測CCL11含量。然而，CCL11隨後亦展示充當雙陽性及單陽性人類胸腺細胞兩者之化學引誘劑（Bunting等人2011）。CXCL16在胸腺生成中之特定作用之證據不太清楚。

實例中所展示之研究驗證L-選擇素作為活胸腺細胞之存在的生物標記物及CCL21作為TEC生存力之生物標記物的用途，若胸腺細胞前驅體可用，則其亦可預測有效的免疫重建。當胸腺生成穩固時CCL21之產生通常較低且當胸腺生成變得受損時，在來自老年人之經培養胸腺切片及未培養胸腺組織中均顯著誘導。有趣的係，在TEC區域或活性皮質區域標準化之後，相比於來自老年人之胸腺，來自較年輕供體（小於或等於 18歲）之胸腺組織持續表現更多CD3ε及CD1A mRNA以及更少角蛋白8（KRT8）及角蛋白14（KRT14）mRNA。此表明胸腺生成及TEC維持在此等較年輕供體中可能更高效。此外，對於兩種標準化方法，衍生自大於18歲供體之組織的CCL21及CXCL12之產生顯著增加，為TEC含量及活性胸腺生成相比於較年輕供體降低的時間框。CCL21及CXCL12之表現皆隨著胸腺器官培養物中活體外及活體內衰老期間胸腺細胞數目減少而增加，此提高誘導此等趨化介素為恆穩機制之部分的可能性，該等恆穩機制試圖經由增強T細胞前驅體之募集來對抗胸腺細胞數目減少。如在此類切片植入至無胸腺症嬰兒接受者中時所觀測到，預期藉由胸腺細胞耗乏之經培養胸腺切片增加吸引胸腺細胞之趨化介素的分泌增強其移生及導致免疫重建之能力（Markert等人2008）。相比之下，若胸腺細胞前驅體之可利用性或胸腺微環境之其他關鍵態樣受到限制，則CCL21及CXCL12之大量分泌可在衰老期間提供較少益處。

總之，此等研究展示，來源於兒科供體之胸腺的器官培養物可用於模擬人體內之與年齡相關之胸腺退化的至少一些態樣，特定言之與胸腺細胞損失更直接相關的彼等態樣。然而，明顯的係，T細胞耗乏之經培養兒科胸腺在其他方式中必須實質上不同於老年人胸腺，因為將T細胞耗乏之經培養兒科胸腺植入無胸腺症接受者中引起免疫重建及免於感染之保護，然而與具有更強健胸腺功能之較年輕成人相比，胸腺退化之老年人更易受感染。Palmer, S, Albergante L， Blackburn CC, Newman TJ.《胸腺退化及疾病發病率隨著年齡增長而升高（Thymic involution and rising disease incidence with age）》《美國國家科學院院刊》11期:1883-1888, 2018。

本文圖56中展示之結果提供額外分子及路徑之豐富來源作為潛在生物標記物以使用經培養嬰兒胸腺來活體外模擬人類胸腺衰老的一些態樣。此為重要的，因為嬰兒胸腺在需要自大多數嬰兒移除胸腺之一部分以適當地暴露手術區域以進行校正性心臟手術的情況下通常更容易可供用於研究。成人胸腺組織通常不太容易獲得，因為通常不需要移除胸腺組織以為成人常見之多種類型之心臟手術提供通路。此外，所移除之任何成人胸腺組織通常不可用於研究，因為其呈現較少類器官且大體上類似於脂肪。然而，若成人實體器官接受者需要耐受性，則成人胸腺組織將可能經培養且用於與實體器官共移植。生物標記物亦適用於測定來源於成人供體之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物的適用性、功能性及生存力。

胸腺細胞化學引誘劑CCL21、CXCL16、CXCL12及CCL11之胸腺產生隨著胸腺細胞含量降低而增加。此表明胸腺細胞損失可活化試圖抵消潛在萎縮之恆穩機制，儘管最終在衰老環境中未成功，但更充分闡明此等機制之將來研究將適用於理解且可能逆轉驅動年齡相關之胸腺退化的機制且可有助於增強所有年齡段之胸腺驅動的免疫重建。

在本發明之一態樣中，提供一種產生適用於植入人體之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物的方法，其包含以下步驟：使供體胸腺經歷預處理方案持續約6天至約21天的時段；其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；進一步包含偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中CCL21之含量增加；及回收部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片作為適用於植入的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，方法進一步包含在液氮中冷凍保存經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物以用於將來植入的步驟。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，方法進一步包含偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中L-選擇素之含量降低。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，方法包含偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11中之一或多者。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，方法包含偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中CXCL12、CXCL16或CCL11中之一或多者的含量增加。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，方法包含偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中CXCL12之含量增加。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，方法包含偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中CXCL16之含量增加。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，方法包含偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中CCL11之含量增加。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，方法包含偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中M-CSF、半乳糖凝集素-7或IL-16中之一或多者。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，方法包含偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中M-CSF、半乳糖凝集素-7或IL-16中之一或多者的含量降低。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，方法包含偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中M-CSF之含量降低。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，方法包含偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中半乳糖凝集素-7之含量降低。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，方法包含偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中IL-16之含量降低。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，預處理方案持續5天、或6天、或7天、或8天、或9天、或10天、或11天、或12天、或13天、或14天、或15天、或16天、或17天、或18天或19天、或20天、或21天之時段；或持續5至6天、或5至7天、或5至8天、或5至9天、或5至10天、或6至7天、或6至8天、或6至9天、或6至10天、或6至11天、或6至12天、或6至21天、或7至21天、或8至21天、或9至21天、或10至21天、或11至21天、或12至21天、13至21天或14至21天、或15至21天、或16至21天或17至21天或18至21天、或19至21天、或20至21天之時段。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，CCL21之含量接近圖50E中之含量，且/或 L-選擇素之含量接近圖50A中之含量，且/或M-CSF之含量接近圖50B中之含量，且/或半乳糖凝集素-7之含量接近圖50C中之含量，且/或IL-16之含量接近圖50D中之含量，且/或CXCL16之含量接近圖50F中之含量，且/或其中CCL11之含量接近圖50G中之含量，且/或CXL21之含量接近圖50H中之含量。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，方法進一步包含在第6天與第21天之間，較佳地在預處理方案之第6天與第9天之間，判定在供體胸腺組織切片中對分散於整個供體胸腺組織切片中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域、至少一種胸腺小體之存在、分散於整個供體胸腺組織切片中之CK14染色及完整細胞核之存在。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，方法進一步包含偵測在培養方案期間胸腺器官培養基中至少一種標記物之含量，或至少兩種、或至少三種、或至少四種、或至少五種、或至少六種、或至少七種標記物之含量，或偵測在預處理方案期間胸腺器官培養基中至少八種選自以下的標記物：L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16及CCL11。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，方法進一步包含偵測在培養方案期間胸腺器官培養基中至少一種選自以下之標記物的含量：L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1。

在本發明之一態樣中，提供一種用於判定經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物是否適用於植入人體內之方法，該方法包含以下步驟：將供體胸腺組織切片在胸腺器官培養基中預處理約6天至約21天之時段；其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；及偵測胸腺器官培養基中至少一種選自以下之標記物的含量：L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16及CCL11。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，至少一種標記物為L-選擇素，且其中胸腺器官培養基中L-選擇素之含量隨時間推移，亦即在預處理方案之時程期間降低。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，至少一種標記物為M-CSF，且其中胸腺器官培養基中M-CSF之含量在預處理方案之時程期間降低。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，至少一種標記物為半乳糖凝集素-7，且其中胸腺器官培養基中半乳糖凝集素-7之含量在預處理方案之時程期間降低。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，至少一種標記物為IL-16，且其中胸腺器官培養基中IL-16之含量在預處理方案之時程期間降低。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，至少一種標記物為CCL21，且其中胸腺器官培養基中CCL21之含量在預處理方案之時程期間增加。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，至少一種標記物為CXCL12，且其中胸腺器官培養基中CXCL12之含量在預處理方案之時程期間增加。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，至少一種標記物為CXCL16，且其中胸腺器官培養基中CXCL16之含量在預處理方案之時程期間增加。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，至少一種標記物為CCL11，且其中胸腺器官培養基中CCL11之含量在預處理方案之時程期間增加。

在本發明之一態樣中，提供一種用於判定經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物是否適用於植入人體內之方法，該方法包含以下步驟：將供體胸腺組織切片在胸腺器官培養基中預處理約6天至約21天之時段；其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；及偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中選自以下之至少一種標記物的含量：L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，方法進一步包含測定在預處理方案之第6天與第21天之間，在供體胸腺組織切片中對分散於整個供體胸腺組織切片中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域、至少一種胸腺小體之存在、分散於整個供體胸腺組織切片中之CK14染色及完整細胞核之存在。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，預處理方案持續5天、或6天、或7天、或8天、或9天、或10天、或11天、或12天、或13天、或14天、或15天、或16天、或17天、或18天或19天、或20天、或21天之時段；或持續5至6天、或5至7天、或5至8天、或5至9天、或5至10天、或6至7天、或6至8天、或6至9天、或6至10天、或6至11天、或6至12天、或6至21天、或7至21天、或8至21天、或9至21天、或10至21天、或11至21天、或12至21天、13至21天或14至21天、或15至21天、或16至21天或17至21天或18至21天、或19至21天、或20至21天之時段。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，CCL21之含量接近圖50E中之含量，且/或 L-選擇素之含量接近圖50A中之含量，且/或M-CSF之含量接近圖50B中之含量，且/或半乳糖凝集素-7之含量接近圖50C中之含量，且/或IL-16之含量接近圖50D中之含量，且/或CXCL16之含量接近圖50F中之含量，且/或其中CCL11之含量接近圖50G中之含量，且/或CXL21之含量接近圖50H中之含量。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，方法進一步包含偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中至少一種標記物的含量，或至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種之含量，或偵測至少八種標記物之含量，該等標記物選自L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16及CCL11，且其中胸腺器官培養基中L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16之含量時在預處理方案之時程期間降低，且另其中胸腺器官培養基中CCL21、CXCL12、CXCL16及CCL11之含量在預處理方案之時程期間增加。

在本發明之一態樣中，存在一種用於判定經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物是否適用於植入人體內之方法，該方法包含以下步驟：將供體胸腺組織切片在胸腺器官培養基中預處理約6天至約21天之時段；其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；及偵測選自圖56中之標記物的至少一種標記物之含量。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，存在一種用於判定經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物是否適用於植入人體內之方法，該方法包含以下步驟：將供體胸腺組織切片在胸腺器官培養基中預處理約6天至約21天之時段；其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；及偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中選自以下之至少一種標記物的含量：L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1。

在本發明之一態樣中，存在一種治療胸腺病症之方法，其改良包含將在胸腺器官培養基中經歷預處理方案約6天至約21天之時段的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生切片植入至患有胸腺病症之受試者中；其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；及偵測至少一種選自以下之標記物的含量：L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16及CCL11。

在本發明之另一態樣中，存在一種治療胸腺病症之方法，其改良包含將在胸腺器官培養基中經歷預處理方案持續約6天至約21天之時段的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生切片植入至患有胸腺病症之受試者中；其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；及偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中至少一種標記物的含量，該至少一種標記物係選自L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，至少一種標記物為L-選擇素，且其中胸腺器官培養基中L-選擇素之含量在預處理方案之時程期間降低。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，至少一種標記物為M-CSF，且其中胸腺器官培養基中M-CSF之含量在預處理方案之時程期間降低。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，至少一種標記物為半乳糖凝集素-7，且其中胸腺器官培養基中半乳糖凝集素-7之含量在預處理方案之時程期間降低。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，至少一種標記物為IL-16，且其中胸腺器官培養基中IL-16之含量在預處理方案之時程期間降低。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，至少一種標記物為CCL21，且其中胸腺器官培養基中CCL21之含量在預處理方案之時程期間增加。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，至少一種標記物為CXCL12，且其中胸腺器官培養基中CXCL12之含量在預處理方案之時程期間增加。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，至少一種標記物為CXCL16，且其中胸腺器官培養基中CXCL16之含量在預處理方案之時程期間增加。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，至少一種標記物為CCL11，且其中胸腺器官培養基中CCL11之含量在預處理方案之時程期間增加。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，方法進一步包含測定在預處理方案期間在供體胸腺組織切片中對分散於整個供體胸腺組織切片中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域、至少一種胸腺小體之存在、分散於整個供體胸腺組織切片中之CK14染色及完整細胞核之存在。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，胸腺病症為與完全DiGeorge氏症候群、22q11.2缺失、CHARGE（缺損、心臟缺陷、鼻後孔閉鎖、生長或智力遲鈍、生殖器發育不全及耳畸形或耳聾）、CHD7（染色域-解旋酶-DNA-結合蛋白7）基因或叉頭框蛋白N1（FOXN1）缺乏之突變相關的先天無胸腺症。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，胸腺病症為胸腺退化。在另一實施例中，胸腺病症為與 TBX-1或TBX-2基因之突變相關之先天無胸腺症。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，胸腺病症與配對框1（PAX1）、信號蛋白3E（ SEMA3E）及染色體2p11.2處之復發性微缺失相關。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，胸腺病症與胸腺瘤相關。在又另一實施例中，胸腺瘤為非惡性或惡性的。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，胸腺病症與重症肌無力（Mg）、純紅血球發育不全及低γ球蛋白血症相關。

在本發明之一態樣中，提供一種用於在人類受試者中提供免疫能力之方法，其改良包含以下步驟：將供體胸腺組織切片在胸腺器官培養基中預處理約6天至約21天之時段；其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中至少一種標記物的含量，該至少一種標記物選自標記物L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中若標記物為L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7或IL-1，則含量降低，或若標記物為CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，則含量增加；及將部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片植入人類受試者中。

在本發明之一態樣中，提供一種用於在人類受試者中提供免疫能力之方法，其改良包含以下步驟：將供體胸腺組織切片在胸腺器官培養基中預處理約6天至約21天之時段；其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；及偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中至少一種標記物的含量，該至少一種標記物係選自來自以下之標記物：L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1；及將部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片植入人類受試者中。

在本發明之一態樣，提供一種用於在經歷實體器官移植之人類受試者中提供免疫能力的方法，方法包含以下步驟：移除人類受試者之胸腺；自匹配實體器官中之HLA-I類及HLA-II類對偶基因的供體獲得胸腺組織；切片供體胸腺；將供體胸腺組織切片在胸腺器官培養基中預處理約6天至約21天之時段；其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中至少一種標記物之含量，該至少一種標記物選自標記物L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中若標記物為L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7或IL-1，則含量降低，或若標記物為CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，則含量增加；植入實體器官；及將部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片植入人類受試者中。

為了較佳理解此模型中之耐受性發展，吾人可參考具有此程序之靈長類動物模型的圖38，該模型將提供資料以支援產生供體特異性耐受之人類研究。圖38中之實驗具有3隻猴。一隻為胸腺及心臟供體（左側行之資訊）。第二隻為胸腺及心臟接受者（第2頁中間行中之資訊。此行具有實驗之階段）。第三隻為對照組（第3頁右側行中之資訊）。請注意，原始試算表具有所有三隻動物之程序，一頁寬，多頁長。因為總分析表寬於所允許寬度，所以將總分析表之各列劃分為3頁。該表以3個小組為一組持續進行數週及幾個階段。

在本發明之一態樣中，提供一種用於在經歷實體器官移植之人類受試者中提供免疫能力之方法，方法包含以下步驟：移除人類受試者之胸腺；自匹配實體器官中之HLA-I類及HLA-II類對偶基因之供體獲得胸腺組織；將供體胸腺切片；將供體胸腺組織切片在胸腺器官培養基中預處理約6天至約21天之時段；其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中至少一種標記物之含量，該至少一種標記物係選自標記物L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1；植入實體器官；及將部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片植入人類受試者中。

在本發明之一態樣，吾人此處提供一種用於在經歷實體器官移植之人類受試者中提供免疫能力的方法，方法包含以下步驟：移除人類受試者之胸腺；自匹配實體器官中之HLA-I類及HLA-II類對偶基因兩者的供體獲得胸腺組織；將供體胸腺切片；將供體胸腺組織切片在胸腺器官培養基中預處理約6天至約21天之時段；其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中至少一種標記物之含量，該至少一種標記物選自標記物L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中若標記物為L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7或IL-1，則含量降低，或若標記物為CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，則含量增加；植入實體器官；及將部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片植入人類受試者中。

在本發明之一態樣中，提供一種用於在經歷實體器官移植之人類受試者中提供免疫能力之方法，方法包含以下步驟：移除人類受試者之胸腺；自匹配實體器官中之HLA-I類及HLA-II類對偶基因兩者之供體獲得胸腺組織；將供體胸腺切片；將供體胸腺組織切片在胸腺器官培養基中預處理約6天至約21天之時段；其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中至少一種標記物之含量，該至少一種標記物係選自標記物L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1；植入實體器官；及將部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片植入人類受試者中。

在本發明之一態樣中，提供一種促進需要實體器官移植之接受者中獲自已故供體之同種異體實體器官移植的供體特異性耐受之方法，方法包含以下步驟： （a）移除接受者之胸腺； （b）用包含一或多種免疫抑制劑之誘導免疫抑制方案治療接受者以耗乏接受者之T細胞及/或抑制接受者之T細胞排斥所移植之實體器官； （c）提供來自已故供體之適合實體人類器官及胸腺； （d）將實體人類器官移植至接受者中； （e）用維持免疫抑制方案治療接受者； （f）提供一種經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其中經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在胸腺器官培養基中經歷預處理方案持續約6天至約21天之時段以產生經同種異體培養的出生後胸腺組織衍生產物切片；另其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中至少一種標記物的含量，該至少一種標記物選自標記物L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中若標記物為L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7或IL-1，則胸腺器官培養基中標記物之含量降低，或若標記物為CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，則含量增加；及 （g）在約6至約21天預處理方案之後將經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物植入接受者中，其中胸腺組織切片之劑量為約1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織表面積/接受者體表面積，且另其中所植入經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在接受者中誘導胸腺生成及耐受性。

在本發明之一態樣中，提供一種促進需要實體器官移植之接受者中獲自已故供體之同種異體實體器官移植的供體特異性耐受之方法，方法包含以下步驟： （a）移除接受者之胸腺； （b）用包含一或多種免疫抑制劑之誘導免疫抑制方案治療接受者以耗乏接受者之T細胞及/或抑制接受者之T細胞排斥所移植之實體器官； （c）提供來自已故供體之適合實體人類器官及胸腺； （d）將實體人類器官移植至接受者中； （e）用維持免疫抑制方案治療接受者； （f）提供經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其中經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在胸腺器官培養基中經歷預處理方案約6天至約21天之時段以產生經同種異體培養的出生後胸腺組織衍生產物切片；此外其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中至少一種標記物之含量係選自標記物L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1；及 （g）在約6至約21天預處理方案之後將經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物植入接受者中，其中胸腺組織切片之劑量為約1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織表面積/接受者體表面積，且另其中所植入經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在接受者中誘導胸腺生成及耐受性。

在本發明之一態樣中，提供一種用於促進需要實體器官移植之人類接受者中獲自活人類供之同種異體實體器官移植的供體特異性耐受之方法，方法包含以下步驟： （a）移除接受者之胸腺； （b）用包含一或多種免疫抑制劑之誘導免疫抑制方案治療接受者以耗乏接受者之T細胞及/或抑制接受者之T細胞排斥所移植之實體器官； （c）提供來自活人類供體之適合實體器官； （d）將實體器官移植至接受者中； （e）用維持免疫抑制方案治療接受者； （f）提供保存在冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物庫中之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；其中冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物由來自胸腺供體之胸腺組織處理所得，該胸腺組織表現與接受者中之HLA-I類及HLA-II類對偶基因匹配但不存在於實體器官移植體中之HLA對偶基因；其中使供體胸腺組織經歷預處理方案約6天至約21天之時段；另其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之胸腺組織切片；偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中至少一種標記物的含量，該至少一種標記物選自標記物L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中若標記物為L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7或IL-1，則胸腺器官培養基中標記物之含量降低，或若標記物為CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，則含量增加； （g）解凍冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，及 （h）將解凍之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物植入接受者中，其中冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之劑量為約1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織表面積/接受者體表面積，且此外其中所植入之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在接受者中誘導胸腺生成及耐受性。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，可允許HLA-DP之容許錯配（Pidala J等人2014《血液》124:2596-2606）。另外，若存在足夠的數值功能距離，則可允許HLA-DPB1之非容許錯配（Crivello P等人2016《血液》128:120-129）。

在本發明之一態樣中，提供一種用於促進需要實體器官移植之人類接受者中獲自活人類供體之同種異體實體器官移植的供體特異性耐受之方法，方法包含以下步驟： （a）移除接受者之胸腺； （b）用包含一或多種免疫抑制劑之誘導免疫抑制方案治療接受者以耗乏接受者之T細胞及/或抑制接受者之T細胞排斥所移植之實體器官； （c）提供來自活人類供體之適合實體器官； （d）將實體器官移植至接受者中； （e）用維持免疫抑制方案治療接受者； （f）提供保存在冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物庫中之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；其中冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物係由來自胸腺供體之胸腺組織處理所得，該胸腺組織表現與接受者中之HLA-I類及HLA-II類對偶基因匹配但不存在於實體器官移植體中之HLA對偶基因；其中使供體胸腺組織經歷預處理方案約6天至約21天之時段；另其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之胸腺組織切片；偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中至少一種標記物之含量係選自胸腺器官培養基中之標記物L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1；其中胸腺器官培養基中標記物之含量根據圖56中之標記物的含量而增加或降低； （g）解凍冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；及 （h）將解凍之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物植入接受者中，其中冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之劑量為約1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織表面積/接受者體表面積，且另其中所植入經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在接受者中誘導胸腺生成及耐受性。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，將約一半之經解凍之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物移植至接受者中且剩餘部分冷凍保存以供將來使用。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，在移植實體器官之後約一個月或更長時間進行步驟（h）。

在本發明之一態樣中，提供一種用於促進需要實體器官移植之人類接受者中獲自已故人類供體之同種異體實體器官移植的供體特異性耐受之方法，方法包含以下步驟： （a）移除接受者之胸腺； （b）用包含一或多種免疫抑制劑之誘導免疫抑制方案治療接受者以耗乏接受者之T細胞及/或抑制接受者之T細胞排斥所移植之實體器官； （c）提供來自活人類供體之適合實體器官； （d）將實體器官移植至接受者中； （e）用維持免疫抑制方案治療接受者； （f）提供保存在冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物庫中之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；其中冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物係由來自胸腺供體之胸腺組織處理所得，該胸腺組織表現與接受者中之HLA類對偶基因匹配但不存在於實體器官移植體中之HLA對偶基因；其中使供體胸腺組織經歷預處理方案約6天至約21天之時段；此外其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之胸腺組織切片，偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中至少一種標記物的含量，該至少一種標記物選自標記物L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中若標記物為L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7或IL-1，則胸腺器官培養基中標記物之含量降低，或若標記物為CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，則含量增加； （g）解凍冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；及 （h）將解凍之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物植入接受者中，其中冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之劑量為約1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織表面積/接受者體表面積，且另其中所植入經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在接受者中誘導胸腺生成及耐受性。

在本發明之一態樣中，提供一種用於促進需要實體器官移植之人類接受者中獲自已故人類供體之同種異體實體器官移植的供體特異性耐受之方法，方法包含以下步驟： （a）移除接受者之胸腺； （b）用包含一或多種免疫抑制劑之誘導免疫抑制方案治療接受者以耗乏接受者之T細胞及/或抑制接受者之T細胞排斥所移植之實體器官； （c）提供來自活人類供體之適合實體器官； （d）將實體器官移植至接受者中； （e）用維持免疫抑制方案治療接受者； （f）提供保存在冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物庫中之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；其中冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物係由來自胸腺供體之胸腺組織處理所得，該胸腺組織表現與接受者中之HLA類對偶基因匹配但不存在於實體器官移植體中之HLA對偶基因；其中使供體胸腺組織經歷預處理方案約6天至約21天之時段；另其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之胸腺組織切片，偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中至少一種標記物之含量，該至少一種標記物選自標記物L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1；其中胸腺器官培養基中標記物之含量根據圖7中之含量而增加或降低； （g）解凍冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；及 （h）將解凍之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物植入接受者中，其中冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之劑量為約1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織表面積/接受者體表面積，且另其中所植入經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在接受者中誘導胸腺生成及耐受性。

在本發明之一態樣中，提供一種冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其藉由包含以下步驟之方法製備： （a）自供體獲得適合之胸腺組織； （b）對HLA對偶基因進行分型：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB 1、HLA-DQB 1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DPB1、HLA-DPA1； （c）使胸腺組織經歷預處理方案約6天至約21天之時段；其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片； （d）偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中至少一種標記物之含量，該至少一種標記物選自標記物L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中若標記物為L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7或IL-1，則胸腺器官培養基中標記物之含量降低，或若標記物為CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，則含量增加； （e）取回部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片作為經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物； （f）將經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物冷凍保存在液氮中；及 （g）將液氮中之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物保存在冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物庫中。

在本發明之一態樣中，存在一種冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其藉由包含以下步驟之方法製備： （a）自供體獲得適合之胸腺組織； （b）對HLA對偶基因進行分型：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB 1、HLA-DQB 1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DPB1、HLA-DPA1； （c）使胸腺組織經歷預處理方案約6天至約21天之時段；其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片； （d）偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中至少一種標記物的含量，該至少一種標記物選自標記物L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1；其中胸腺器官培養基中標記物之含量根據圖7中之含量而增加或降低； （e）取回部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片作為經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物； （f）將經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物冷凍保存在液氮中；及 （g）將液氮中之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物保存在冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物庫中。

在本發明之一態樣中，提供一種用於促進需要實體器官移植之人類接受者中獲自已故人類供體之同種異體實體器官移植的供體特異性耐受之方法，方法包含以下步驟： （a）移除接受者之胸腺； （b）用包含一或多種免疫抑制劑之誘導免疫抑制方案治療接受者以耗乏接受者之T細胞及/或抑制接受者之T細胞排斥所移植之實體器官； （c）提供來自活人類供體之適合實體器官； （d）將實體器官移植至接受者中； （e）用維持免疫抑制方案治療接受者； （f）提供保存在冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物庫中之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；其中冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物係由來自胸腺供體之胸腺組織處理所得，該胸腺組織表現與接受者中之HLA對偶基因匹配但不存在於實體器官移植體中之HLA對偶基因；其中使供體胸腺組織經歷預處理方案約6天至約21天之時段；另其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之胸腺組織切片，偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中至少一種標記物的含量，該至少一種標記物選自胸腺器官培養基中之標記物L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中若標記物為L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7或IL-1，則胸腺器官培養基中標記物之含量降低，或若標記物為CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，則含量增加； （g）解凍冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；及 （h）將解凍之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物植入接受者中，其中冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之劑量為約1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織表面積/接受者體表面積，且另其中所植入經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在接受者中誘導胸腺生成及耐受性。

在本發明之一態樣中，提供一種冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其藉由包含以下步驟之方法製備： （a）自供體獲得適合之胸腺組織； （b）對HLA對偶基因進行分型：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB 1、HLA-DQB 1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DPB1、HLA-DPA1； （c）使胸腺組織經歷預處理方案約6天至約21天之時段；其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片； （d）偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中至少一種標記物之含量，該至少一種標記物選自胸腺器官培養基中之標記物L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中若標記物為L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7或IL-1，則胸腺器官培養基中標記物之含量降低，或若標記物為CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，則含量增加； （e）取回部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片作為經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物； （f）將經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物冷凍保存在液氮中；及 （g）將液氮中之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物保存在冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物庫中。

在本發明之一態樣中，提供一種用於促進需要實體器官移植之人類接受者中獲自已故人類供體之同種異體實體器官移植的供體特異性耐受之方法，方法包含以下步驟： （a）移除接受者之胸腺； （b）用包含一或多種免疫抑制劑之誘導免疫抑制方案治療接受者以耗乏接受者之T細胞及/或抑制接受者之T細胞排斥所移植之實體器官； （c）提供來自活人類供體之適合實體器官； （d）將實體器官移植至接受者中； （e）用維持免疫抑制方案治療接受者； （f）提供保存在冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物庫中之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；其中冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物係由來自胸腺供體之胸腺組織處理所得，該胸腺組織表現與接受者中之HLA對偶基因匹配但不存在於實體器官移植體中之HLA對偶基因；其中使供體胸腺組織經歷預處理方案約6天至約21天之時段；另其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之胸腺組織切片，偵測在預處理方案之時程期間胸腺器官培養基中至少一種標記物之含量，該至少一種標記物選自標記物L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1；其中胸腺器官培養基中標記物之含量根據圖56中之標記物的含量而增加或降低； （g）解凍冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；及 （h）將解凍之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物植入接受者中，其中冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之劑量為約1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織表面積/接受者體表面積，且另其中所植入經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在接受者中誘導胸腺生成及耐受性。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，實體器官移植為心臟移植、腎臟移植、肝臟移植、肺移植、心臟/肺移植、胰臟移植、腸移植、胃移植、腹壁移植、顱面移植、頭皮移植、陰莖移植、子宮移植、單側或雙側上肢移植、單側血管化複合同種異體移植或其組合。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，實體器官移植為心臟移植、或小兒心臟移植、或成人心臟移植。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，預處理方案持續5天、或6天、或7天、或8天、或9天、或10天、或11天、或12天、或13天、或14天、或15天、或16天、或17天、或18天或19天、或20天、或21天之時段；或持續5至6天、或5至7天、或5至8天、或5至9天、或5至10天、或6至7天、或6至8天、或6至9天、或6至10天、或6至11天、或6至12天、或6至21天、或7至21天、或8至21天、或9至21天、或10至21天、或11至21天、或12至21天、13至21天或14至21天、或15至21天、或16至21天或17至21天或18至21天、或19至21天、或20至21天之時段。

在本發明之一態樣中，提供一種適用於植入人體內之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其包含以下步驟： （a）   自人類供體獲得適合之胸腺組織； （b）   使胸腺組織經歷預處理方案約6天至約21天之時段；其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；其中胸腺器官培養基中L-選擇素及/或M-CSF及/或半乳糖凝集素-7及/或IL-16之含量在預處理方案之時程期間降低；另其中胸腺器官培養基中CCL21及/或CXCL12及/或CXCL16及/或CCL11之含量在預處理方案之時程期間增加； （c）   採集部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片作為經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物； （d）   將經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物冷凍保存在液氮中；及 （e）   將液氮中之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物保存在冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物庫中。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，胸腺器官培養基中CCL21之含量在預處理方案之時程期間增加。

在本發明之態樣及實施例的一實施例，胸腺器官培養基中L-選擇素之含量在預處理方案之時程期間降低。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，胸腺器官培養基中M-CSF、半乳糖凝集素-7及IL-16中之一或多者的含量在預處理方案之時程期間降低。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，胸腺器官培養基中CCL21、CXCL12、CXCL16及CCL11中之一或多者的含量在預處理方案之時程期間增加。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，方法進一步包含測定在預處理方案期間在供體胸腺組織切片中對分散於整個供體胸腺組織切片中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域、至少一種胸腺小體之存在、分散於整個供體胸腺組織切片中之CK14染色及完整細胞核的存在。

在本發明之一態樣中，提供一種用於執行前述態樣及實施例中之任一者之方法的套組，其與使用說明書一起用於測定經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物是否適用於植入人體內。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，套組包含至少一種特異性結合標記物L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11之抗體。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，套組包含一或多種特定發現圖56中闡述之標記物的抗體。

在本發明之一態樣中，提供一種用於判定根據前述態樣及實施例中之任一者所培養之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物是否適用於植入人體內之套組以及使用說明書。

在本發明之態樣及實施例的一實施例中，套組包含至少一種特異性結合標記物L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11之抗體。

應進一步瞭解，為清楚起見在本發明之不同態樣之上下文中及/或在獨立實施例中所描述之本文所描述的某些特徵亦可以單一實施例之組合形式提供。相反，為簡潔起見而描述於本發明之單一實施例之上下文中及/或單一實施例中的各種特徵亦可單獨地或以任何適合的子組合形式提供。

本文所提供之標題（titles/headings）及子標題不應解釋為限制本發明之各種態樣。因此，下文定義之術語參考整個說明書更充分地定義。所有在本文中引用之參考文獻以全文引用的方式併入。

除非另外定義，否則本文所使用之科學及技術術語應具有一般熟習此項技術者通常所理解之含義。此外，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。在本申請案中，除非另外陳述，否則「或」之使用意謂「及/或」。在多項附屬項之情況下，「或」之使用僅以替代方式重新提及前述獨立或附屬請求項。

應進一步注意，如本說明書及所附申請專利範圍中所使用，除非明確且肯定地限於一個指示物，否則單數形式「一（a/an）」與「該」及任何字組之任何單數使用形式包括複數個指示物。如本文所使用，術語「包括」及其文法變體意欲為非限制性的，使得清單中之各項的敍述不排除可取代或添加至所列項中之其他類似項。

參考以下定義最明確地理解本發明：

術語「約（about）」在本文中用以意謂大致（approximately）、大約（in the region of）、大概（roughly）或約（around）。當術語「約」結合數值範圍使用時，其藉由擴展高於及低於所述數值之界限來修飾該範圍。一般而言，術語「約」在本文中用以修改數值至所陳述值以上及以下+/- 10%之偏差。如本文所使用，術語約係指數值，包括例如整數、分數及百分比，無論是否明確指示。術語約通常係指一般熟習此項技術者將認為等效於所述值(例如，具有相同功能或結果)之數值的範圍(例如，所述範圍之+/-5-10%)。當諸如至少及約之術語時先於數值或範圍之清單時，術語修飾清單中提供之所有值或範圍。在一些情況下，術語約可包括經四捨五入至最接近有效數字之數值。

如本文所使用，術語「動物」包括（但不限於）人類及非人類脊椎動物，諸如野生動物、家畜及農畜。動物亦可稱為「受試者」。

如本文所使用，術語「生物標記物」係指圖56中所列舉之物質。應進一步理解，關於胸腺器官培養基中之生物標記物的出現，參考「降低的」及「增加的」含量係指在預處理方案之時程內的特定生物標記物之增加量測值或減少量測值。

如此處所使用，「生物相容性」係指當植入哺乳動物中時不會引起哺乳動物中之不良反應的任何材料。

「慢性移植排斥反應」通常在移植後數月至數年內發生在人體內，即使在成功免疫抑制急性排斥反應之存在下。纖維化為所有類型之器官移植的慢性排斥反應中之常見因素。

如本文所使用，術語「包含（comprising）」（及包含之任何形式，諸如「包含（comprise）」、「包含（comprises）」及「包含（comprised）」）、「具有（having）」（及具有之任何形式，諸如「具有（have）」及「具有（has）」）、「包括（including）」（及包括之任何形式，諸如「包括（includes）」及「包括（include）」）或「含有（containing）」（及含有之任何形式，諸如「含有（contains）」及「含有（contain）」）為包括性或開放的且不排除額外未列出之要素或方法步驟。另外，與術語「包含」結合使用之術語亦應理解為能夠結合術語「由…組成」或「基本上由…組成」使用。

如本文所使用，「移植物」係指植入至個體中，通常用以替代、矯正或以其他方式克服缺陷之組織或器官。組織或器官可由來源於相同個體之細胞組成；此移植物在本文中藉由以下可互換術語指代：「自體移植物（autograft）」、「自體移植體（autologous transplant）」、「自體植入體（autologous implant）」及「自體移植物（autologous graft）」。來自相同物種之基因不同的個體之移植物在本文中藉由以下可互換術語指代：「同種異體移植物（allograft）」、「同種異體移植體（allogeneic transplant）」、「同種異體植入體（allogeneic implant）」及「同種異體移植物（allogeneic graft）」。來自個體與其同卵雙生之移植物在本文中係指「同基因型移植物（isograft）」、「同基因型移植體（syngeneic transplant）」、「同基因型植入體（syngeneic implant）」或「同基因型移植物（syngeneic graft）」。「異種移植物（xenograft）」、「異種移植體（xenogeneic transplant）」或「異種植入體（xenogeneic implant）」係指自一個個體至不同物種之另一個體的移植物。

如本文所使用，術語「HLA匹配」係指供體接受者對，其中HLA抗原中無一者在供體與接受者之間錯配。本發明之方法中之HLA匹配包含：HLA對偶基因：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DQA1、HLA-DPB1及HLA-DPA1。

如本文所使用，術語「HLA錯配」係指通常相對於HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DQA1、HLA-DPB1及HLA-DPA1之供體及接受者HLA抗原之匹配，其中在供體與接受者之間發生HLA錯配。在一些情況下，一個單倍型匹配且另一者錯配。經常發現此情況，其中器官來自活的或已故供體。供體-接受者對中之HLA錯配導致相對於HLA匹配對之移植排斥反應之風險增加。

作為前述定義之背景，HLA抗原對應於「人類白血球抗原」，其為在賦予此等細胞獨特抗原一致性之細胞表面上表現之蛋白分子。其亦稱為「主要組織相容複合體抗原」。因此，MHC或HLA抗原為藉由T細胞識別為「自身」或「非自身」之目標分子。若HLA抗原來源於與免疫效應細胞相同之造血幹細胞來源，則其視為「自身」。若HLA抗原來源於造血復原細胞之另一來源，則其視為「非自身」。

識別兩種主要的HLA抗原類別：HLA-I類及HLA-II類。HLA-I類抗原（人體內之A、B及C）使各細胞可識別為「自身」。HLA-II類抗原（人體內之DRB1、DPB1、DPA1、DQB1及DQA1）涉及淋巴球與抗原呈遞細胞之間的反應。兩種類別之HLA抗原已暗指為移植器官之排斥的目標。

HLA基因聚集在人類染色體位置6p21上。此基因簇編碼六種典型的移植HLA基因。6p21之片段亦編碼在調節免疫系統及其他基本分子及細胞過程中具有重要作用之蛋白質的基因。完整簇量測大約3.6 Mb，具有至少224個基因座。由於聚類，出現某些「單倍型」（存在於單一染色體上之對偶基因集合）。自一個母體遺傳之單倍型傾向於作為一個群體遺傳。遺傳自各母體之對偶基因集合形成單倍型，其中一些對偶基因傾向於締合在一起。   HLA匹配用於鑑別接受者之單倍型且有助於鑑別適合之匹配供體。某些單倍型比其他單倍型更普遍且其在不同人種及種族群體中之頻率不同。

如本文所使用，片語「有需要」意謂受試者已鑑別為需要特定方法或治療。在一些實施例中，鑑別可藉由任何診斷方式。在本文所描述之方法及治療中之任一者中，受試者可有需要。

如本文所使用，片語「X至Y之整數」意謂包括端點之任何整數。舉例而言，片語「X至Y之整數」意謂1、2、3、4或5。

如本文所使用，術語「哺乳動物」意謂嚙齒動物（亦即，小鼠、大鼠或天竺鼠）、猴、貓、狗、牛、馬、豬或人類。在一些實施例中，哺乳動物為人類。

如本文所使用，術語「器官」係指在生物體內執行特定功能或功能之群組的實體血管化器官。術語器官包括（但不限於）心臟、肺、腎臟、肝臟、胰臟、皮膚、子宮、骨骼、軟骨、小腸或大腸、膀胱、大腦、乳房、血管、食道、輸卵管、膽囊、卵巢、胰臟、前列腺、胎盤、脊髓、包括上部及下部之四肢、脾臟、胃、睪丸、胸腺、甲狀腺、氣管、尿管、尿道、子宮。

如本文所使用，術語「預防（prevent/preventing/prevention）」係指向可最終表現至少一種疾病、病症或病況之症狀但尚未如此進行之個體投與療法，以降低個體在給定時段內將罹患疾病、病症或病況之症狀的可能性。此類減少可反映於例如患者中之至少一種疾病、病症或病況之症狀的延遲發作中。

如本文所使用，術語「受試者」、「個體」或「患者」可互換使用，意謂任何動物，包括哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、其他嚙齒動物、兔、狗、貓、豬、牛、綿羊、馬或靈長類動物，諸如人類。

如本文所使用，片語「治療有效量」意謂在組織、系統、動物、個體或人類中引起研究人員、獸醫、醫生或其他臨床醫師所尋求之生物或藥物反應的活性化合物或醫藥劑之量。治療效果視所治療之病症或所需生物作用而定。因此，治療效果可為與病症相關之症狀之嚴重程度降低及/或抑制（部分或完全）病症之進展，或改善病症之治療、恢復、預防或消除，或副作用。引發治療反應所需之量可基於受試者之年齡、健康狀況、身材及性別而判定。亦可基於監測受試者對治療之反應而判定最佳量。

如本文所使用，術語「組織」係指人類或動物中之任何類型之組織，且包括（但不限於）血管組織、皮膚組織、肝臟組織、胰臟組織、神經組織、泌尿生殖組織、胃腸組織、包括骨骼及軟骨之骨骼組織、脂肪組織、包括肌腱及韌帶之結締組織、羊膜組織、絨膜組織、硬腦膜、心包、肌肉組織、腺組織、面部組織、眼部組織。

在本發明之上下文中，「組織庫」係指儲存在液氮下之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之長期儲存。建立同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之儲存庫的通用指南可自工業指南中得到。當前良好組織規範（CGTP）及用於人類細胞、組織及基於細胞及組織之產物（HCT/Ps）之製造商的額外要求可獲自https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/ GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Tissue/UCM285223.pdf。

「組織工程改造」係指活體外產生用於組織替換或重建之組織的過程。組織工程改造為「再生醫學」之實例，其涵蓋藉由併入細胞、基因或其他生物結構單元以及生物工程改造材料及技術來修復或替換組織及器官之方法。

術語「移植排斥反應」涵蓋急性及慢性移植排斥反應兩者。當移植組織為免疫外來的時，「急性排斥反應」為組織移植接受者之免疫系統的排斥反應。急性排斥反應係藉由接受者之免疫細胞浸潤移植組織來表徵，其實施其效應子功能且破壞移植組織。急性排斥反應之發作快速且通常在移植手術之後數週內發生在人體內。一般而言，急性排斥反應可用免疫抑制藥物（諸如雷帕黴素（rapamycin）、環孢素A、抗CD40L單株抗體及類似者）抑制或遏制。

如本文所使用，術語「治療（treat/treated/treating）」意謂治療性治療及防治性措施兩者，其中目標為減緩（減輕）非所需生理病況、病症或疾病，或獲得有益或所需臨床結果。舉例而言，有益或所需臨床結果包括（但不限於）症狀緩解；病況、病症或疾病之程度減輕；病況、病症或疾病之狀態穩定（亦即，未惡化）；病況、病症或疾病之發作延遲或進展減緩；改善病況、病症或疾病狀態或緩解病況、病症或疾病狀態（無論部分或完全），無論可偵測或不可偵測；改善至少一種可量測物理參數，不一定可由患者辨別；或病況、病症或疾病之增強或改善。

如本文所描述，除非另外指示，否則任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括在所列舉範圍內之任何整數值及（在適當時）其分數（諸如整數之十分之一及百分之一）。範圍為近似值且可變化大於整數。

單位、前綴及符號以其國際單位制(Système International de Unites；SI)接受之形式表示。數值範圍包括限定該範圍之數值。考慮到有效數位及與量測相關之誤差，所量測值應理解為大致的。

應進一步瞭解，出於明晰之目的而在獨立實施例的情形中描述之本文所描述之某些特徵亦可以組合形式提供於單一實施例中。相反，為簡潔起見而描述於單一實施例之上下文中的各種特徵亦可單獨地或以任何適合的子組合形式提供。 採集供體胸腺組織 .

供體胸腺組織可在出生後心臟手術期間丟棄且可在供體家人知情同意之情況下用於CTT。可能有必要移除一些胸腺以顯示手術部位。因此，由於手術程序之性質，可在出生後心臟手術中之心臟手術期間移除胸腺之一部分。

在出生後心臟手術期間，可在手術程序期間丟棄胸腺組織之一部分。對於所有心臟手術，無論胸腺是否針對移植進行篩選，外科醫生將已丟棄之胸腺組織置放至無菌容器中。

患有完全DiGeorge氏症候群之嬰兒中胸腺組織移植之胸腺組織供體已為九個月齡下之嬰兒。如本文所描述，藉由處理及培養丟棄的胸腺組織來製造原料藥同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物。

在採集胸腺之前或之後，可獲得用於在經培養胸腺組織植入中使用胸腺之同意。然而，允許血液在經歷旁路之前獲自嬰兒之同意為必需的且始終在手術之前獲得。此血液樣本用於供體篩選。

將丟棄的胸腺組織置放於無菌容器中。根據FDA組織移植指南對供體及供體之生育母親進行常規測試。在本文所描述之手術程序中不需要組織類型匹配，但此類組織類型匹配可在某些情形下進行。

組織可立即處理或冷藏隔夜儲存以供第二天處理。若胸腺組織隔夜儲存，則將組織無菌添加至胸腺器官培養基（下文所描述之「TOM」培養基）中，其足以完全覆蓋原始容器中之胸腺組織。將含有胸腺之容器置放於冰箱中直至第二天準備處理。 預處理胸腺組織之概述

預處理方案耗盡來自經培養胸腺組織切片之供體胸腺細胞。基於活體外資料（免疫組織化學），如使用細胞角蛋白抗體所評定，在12天與21天之間的培養時段保留上皮網路。培養較佳地在37℃下在5% CO ₂培育箱中進行。

為了成功培養，較佳地將胸腺組織切片且置放在Millipore®纖維素或當量過濾器上且置於組織培養皿中之手術海綿上。培養基包含胸腺器官培養基（TOM）且每天更換。

所接受之胸腺藉由病理學評定。關於一致性之測試必須展示對於大於50%之區域對花邊染色圖案中之角蛋白呈陽性。針對效能之測試必須展示胸腺小體；其亦必須展示花邊圖案中之CK14染色。針對生存力之測試必須展示在切片中觀測到之大於90%完整細胞核。組織之批次釋放第5天與第21天（包括端點）之間的一天進行且藉由病理學進行。關於一致性，第5天與第21天之間的組織上之區域必須對角蛋白，AE1/AE3呈陽性。對於效能，第5天與第21天之間的經培養胸腺組織必須展示各處分散之細胞角蛋白CK14染色，且必須存在至少一種所鑑別之胸腺小體。對於生存力，第5天與第21天之間的經培養胸腺組織必須展示完整細胞核。

在一實施例中，將胸腺組織切片預處理約12天且接著冷凍保存。在另一實施例中，將所有胸腺組織切片預處理約12天，接著約一半植入於接受者中且剩餘的胸腺組織切片冷凍保存以供將來使用。

在採集24小時內，將胸腺切成薄片。切片在培養物中保持12至21天。如下文詳細描述，此培養過程耗盡活供體T細胞且最終能夠以手術方式植入組織切片以重建無胸腺症受試者之免疫系統，儘管處於免疫學上有效含量，但大部分受試者將具有低於年齡之第10個百分點的T細胞計數。如下文所概述，培養過程顯著改變供體胸腺組織及其中所含之成分細胞之生物特徵，其以下方式為最佳化CTT切片的有效治療特性。

培養過程確保具有先決條件生物特徵之經培養細胞/組織的限定組合物以適用於手術植入至受試者中以使得能夠重建受試者之免疫系統的方式獲得。

培養過程導致胸腺細胞損失及供體胸腺組織切片中之胸腺上皮細胞及其他基質細胞的相對富集。

培養過程進一步導致胸腺細胞耗乏及維持TEC以使得能夠重建接受者之免疫系統且允許在接受者中產生對供體胸腺中之HLA抗原的耐受性。

總體而言，製造過程經設計以耗乏來自供體胸腺組織之胸腺細胞且保留胸腺基質（胸腺上皮細胞及纖維母細胞）之功能架構。

在一實施例中，經處理之供體胸腺組織為能夠在手術植入程序之後在有需要之受試者中誘導對胸腺組織類型（HLA抗原）的耐受性之經工程改造之胸腺組織產物。

為了使切片之胸腺組織保持存活，將胸腺切片置於Millipore纖維素過濾器上且將手術海綿插入至含培養基之組織培養皿中。自供體採集日至植入日（第12天至第21天）每天更換各組織培養皿中之培養基。

培養供體胸腺組織耗盡此類經處理組織中之胸腺細胞，其使移植物抗宿主疾病（「GvHD」）之風險降至最低，此在胸腺切除術後之深度免疫缺乏受試者中可能為高度難以解決的。

在培養前幾天期間，許多胸腺細胞自組織切片「脫落」至培養基中且在培養基更換期間丟棄。當在培養時段期間繼續培養時，供體胸腺細胞繼續死亡但其細胞殘餘物保留在CTT切片內。

在不受理論束縛之情況下，假設此等非活胸腺細胞及其缺乏細胞核之殘餘物的存在對於經組織工程改造之產物之意欲功能為重要的，此係因為其有助於在處理後進入接受者骨髓幹細胞所必需之胸腺上皮細胞的三維網路中保留開放囊袋。對於進入骨髓幹細胞具有「空間」之重要性由在Markert, 1999年之患者DIG003的經驗支撐（參見下文之參考文獻清單）。前述參考文獻中所描述之患者在CTT植入之後35天給予極大劑量之類固醇（40毫克/公斤/天× 3天甲基普賴蘇穠），其導致胸腺細胞之細胞凋亡及上皮細胞之凝聚。從未發育出原生T細胞，且患者死於感染。在屍體剖檢時，所插入胸腺為大量活的上皮細胞，上皮細胞之間無空間以供胸腺細胞進入。

在培養時段期間，進行HLA分型以查看患者（接受者）及供體組織是否共有任何HLA對偶基因。在接受者中進行抗HLA抗體測試以判定接受者是否具有針對胸腺中之HLA抗原的任何抗體。若接受者具有靶向供體之MHC的抗體，則將尋求另一胸腺。根據FDA指導文件「行業指南.人類細胞、組織及細胞及基於組織之產物（HCT/Ps）之供體的合格性測定」及最新指導文件檢查供體及供體母體之感染情況。組織在聯邦法規（CFR）1271子部分D「當前良好組織操作」下經處理無菌。

在審查批次記錄及QC測試之後，組織係自製造釋放且提供至手術小組用於植入，將組織以手術方式植入至接受者中，如本說明書中所描述。

經培養胸腺組織以下文更完整描述之方法且在本說明書中闡述之實例中產生。

總而言之，所採集之胸腺組織的培養過程按以下方式顯著改變供體組織及其中所含之成分細胞的生物特徵：供體胸腺細胞損失及胸腺上皮細胞及其他基質細胞富集，且供體胸腺細胞之耗乏改變組織之生理功能（例如，分泌細胞介素及生長因子）以及其結構特性。

在培養前幾天期間，許多胸腺細胞自組織切片「脫落」至培養基中且在培養基更換期間丟棄。

與獲自供體之來源或起始材料相比，在製造過程期間發生之操作導致成品中所含有之所得細胞的總體外觀及組織學外觀變化。

在培養之前幾天期間的胸腺組織由於組織上及組織內之殘餘血液而呈現紅色。參見例如圖15。

在第5天至第21天之間觀測到活組織減去在第1天顯而易見之血液污染。

在培養之剩餘天數期間，組織之深度隨著胸腺細胞耗乏而降低。藉由免疫組織化學證明組織中胸腺細胞之密度的降低且在下文詳細地描述。

在採集丟棄的胸腺組織之後第0天，組織密集地填充有嵌入於含有胸腺上皮細胞及纖維母細胞之基質中之活胸腺細胞。AE1/AE3及CK14染色證實細胞角蛋白（CK）-陽性胸腺上皮細胞之存在，其為正常胸腺之特徵。胸腺上皮細胞形成具有圍繞相鄰胸腺細胞之精細過程的花邊三維網路。

在培養過程期間，培養胸腺之切片，如下文所描述。自組織中洗去大量胸腺細胞，尤其在前3天內。此耗乏可早在第2天藉由H&E染色劑進行組織學鑑別，其展示降低的胸腺細胞密度，特定言之在髓質區域中。保留在組織中之大部分胸腺細胞展示與細胞凋亡及/或壞死一致之細胞核變化或證實核溶解（細胞核完全損失）。許多此等死胸腺細胞及其細胞殘餘物仍然存在於整個胸腺組織中，且咸信防止上皮細胞之間的空間完全崩塌。

一些上皮凝聚可見於外部區域中，諸如囊下皮質中，其中胸腺細胞損失已導致上皮細胞網路崩塌。此等凝聚之囊下皮質上皮細胞可形成數個細胞層厚的線性陣列，其可增加至切片之機械強度。一些髓質上皮細胞亦可凝聚以形成相鄰上皮細胞之斑塊。

胸腺細胞死亡隨著培養進展而繼續，保留組織內之壞死胸腺細胞碎片。髓質及囊下皮質上皮細胞之進一步凝聚在培養之約第7天與第19天之間最少。

對於各胸腺，使用AE1/AE3染色在培養後期仍可觀測到具有類似於正常胸腺之上皮架構的區域。對於培養更長之組織，皮質及髓質之上皮架構仍可容易地辨別；例如胸腺小體保留在髓質區域中。然而，在第0天之後的時間點，胸腺細胞耗乏之程度導致在H&E上與正常胸腺相比實質上不同的整體組織學外觀。 胸腺組織之詳細培養 .

如先前所描述，製備同種異體培養之胸腺組織衍生產物之通用程序為自經歷心臟手術之9個月齡以下的嬰兒獲得患有完全DiGeorge氏症候群之嬰兒的胸腺組織作為丟棄組織。對於實體器官移植，丟棄之胸腺將獲自至多50歲之個體。胸腺組織之使用將視其是否滿足本說明書中闡述之使用準則而定。

胸腺組織經無菌處理且在cGMP條件下培養以產生部分T細胞耗乏之胸腺組織切片。

經培養胸腺組織（CTT）之製造由以下通用步驟組成：接受及處理新進之胸腺組織、切片、培養、培養基更換、劑量計算、封裝及將胸腺運輸至手術室。另外，測試新進之胸腺組織的接受性及過程內且對胸腺組織切片進行釋放測試。

在一實施例中，胸腺組織切片過程需要使用無菌、一次性剪刀及鑷子以切斷一塊胸腺組織。操作者用鑷子及剪刀移除胸腺之囊且將囊置放於盤蓋中以備後用。

使用鑷子將一塊胸腺組織置放在一次性組織切片器中。切片機之頂部（例如，Stadie-Riggs手動薄片切片機（新澤西州斯韋茲伯勒之托馬斯科學公司（Thomas Scientific, Swedesboro, NJ）））置放至切片機之中間部分上且收緊就位。操作員使刀片穿過組織片以切斷切片。切片厚度為約0.5至1 mm。填充大約50-90%之過濾器空間，而無需重疊組織切片。

通常，在開始切片時切斷組織之三個加工中的片，其皆為大約3×3mm。一片送去用於組織學，且保留兩片。在將胸腺切片時，胸腺細胞自由流動至培養基中。

在一實施例中，將過濾器及胸腺切片轉移至組織培養皿中經TOM飽和的明膠手術海綿。TOM吸濕Millipore過濾器，保持組織潮濕。每個海綿置放兩個過濾器且每個組織培養皿使用2個海綿。重複胸腺切片過程直至已製備所需數目之切片。培養皿經操作編號、培養皿編號及ISBT條碼標籤標記。將完成的培養皿置放於37℃下具有5% CO ₂之含濕氣培育箱中。

經組織工程改造之原料藥包含在其已置放於培養基中之培養皿中之後的胸腺組織切片且培養約6天至約21天，如下文所描述。經組織工程改造之藥品包含在轉移至藥品容器中之後的胸腺組織切片。不進行其他處理以自原料藥產生藥品；僅處理原料藥以產生藥品為將切片轉移至防漏容器中且更換相應的培養基。

胸腺組織切片之培養更特定言之闡述於以下段落中。

在一實施例中，胸腺組織係獲自手術室作為來自9個月齡且在經歷心臟手術下之嬰兒的丟棄組織。接著藉由手術小組將組織置放於帶螺帽頂部之無菌試樣杯中且在環境條件下輸送至GMP設備用於處理。其中接受胸腺之無菌試樣容器經標記，包括條碼，供體名稱及病歷編號。供體篩選組給予胸腺獨特識別符（連續編號之胸腺）及獨特病歷編號。對於製造，各組織具有操作編號及獨特標記。所有標識符記錄在與批次記錄分開保存且保密之「機密胸腺供體表格」上。

在一實施例中，原料藥容器閉合系統可為帶蓋的細胞培養皿。將一片胸腺組織置放於過濾器上且將兩個過濾器置放於培養皿中之胸腺器官培養基中的各明膠海綿上。將四個切片置放於各培養皿中且將培養皿儲存於培育箱中，每天更換培養基，直至準備釋放。

在一實施例中，培養皿可獲自康寧(Corning)。培養皿可為無菌、非熱原的Falcon ^®100 mm聚苯乙烯細胞培養皿（產物編號353003）。培養皿係藉由真空氣體電漿處理來清潔且藉由γ照射滅菌。培養皿之尺寸為89.43 mm O.D. × 19.18 mm。

在一例示性實施例中，Surgifoam ^®海綿可由愛惜康（Ethicon）製造且其滿足可吸收明膠海綿USP之要求。適合之海綿為意欲用於止血用途之無菌的水不溶性的有延展性的豬明膠可吸收海綿。混合纖維素酯過濾器之說明性實例由密理博（Millipore）製造（產物編號SMWP 02500）。25 mm親水性膜具有5.0 µm孔徑。其由乙酸纖維素及硝酸纖維素之生物性惰性混合物製成。過濾器在使用之前藉由環氧乙烷滅菌。

在供體胸腺釋放且接受至加工實驗室中之後，將胸腺切分為薄片，將其置放於置於無菌培養皿中之手術海綿上的無菌濾紙上。若組織未立即處理，則其在開始處理之前自供體採集之後在2-8℃下儲存於胸腺器官培養基（TOM）中至多24小時，如下文所描述。TOM由哈姆氏（Ham's）F-12培養基、HEPES緩衝液、L-麩醯胺酸及熱滅活胎牛血清（FBS）組成。

在一實施例中，處理在ISO 7製造無塵室中之生物安全櫃（BSC）之ISO 5空間中發生。在BSC中在任何時間僅處理來自單一胸腺之一批胸腺組織。在使用之前清潔BSC。藉由目視檢查測試胸腺之外觀且稱重。接著將胸腺置放於TOM中之150-mm組織培養皿中。用無菌一次性鑷子及剪刀移除胸腺之囊。採集組織片用於測試且作為樣本保留。藉由組織學測試新進胸腺組織之一致性。亦證實供體合格性。處理在接受組織學結果及所有供體篩選結果之前繼續。

供體篩選之驗收準則為必須滿足所有供體合格性要求。每21 CFR 1271需要供體篩選以保護胸腺組織植入體接受者之安全性。此篩選使疾病自供體傳遞至接受者之風險降至最低。 胸腺器官培養基（ TOM ）

培養基由批准用於人體內之成分製成，只要此類試劑為可用的，該等成分不太可能引起過敏性反應。

必須追蹤所有試劑使得若出現任何問題，則可在植入之後鑑別所有成分。

由於庫賈氏病（Creutzfeldt-Jakob Disease）之問題，胎牛血清（FBS）必須使用美國材料製造。關於各批次之資訊必須在使用之前發送至FDA。

在使用之前必須針對培養基之細菌、真菌及微漿菌污染測試培養基。

在一實施例中，以下材料用於製備TOM：

HAMS F12，Gibco #11765-054（或案例11765-062），500 ml瓶或等效來源。

HEPES, Gibco #15630-080或等效物，1M溶液，100 ml瓶。最終濃度25 mM。

L-麩醯胺酸，Gibco #25030-081或等效來源，（儲備液200 mM）。

胎牛血清，Gibco，#16140（熱滅活）或#10082-147（熱滅活，經認證）。

在一實施例中，可按以下方式使用作為HI之FBS：

FBS必須在56℃下加熱滅活30分鐘（min）。

為了降低培養基污染之或然性，培養基必須劃分為等分試樣且不應使用等分試樣超過一次。

剩餘FBS之等分試樣可冷凍（-20℃）儲存於25ml等分試樣中以供研究使用。

在一實施例中，可按以下方式製備TOM。

在冰箱中或在37℃下在頻繁的平緩渦流下解凍胎牛血清隔夜。

若使用非熱滅活胎牛血清，則在56℃下熱滅活30分鐘。

若一次製備4公升，則將所有培養基組分一起放入4公升燒瓶中，用磁性攪拌板上之攪拌棒以中速攪拌3至5分鐘（無起泡）。

使用0.2微米過濾單元進行滅菌。

在一實施例中，可按以下方式進行TOM製劑之滅菌。將1公升TOM分配至一公升燒瓶中。在一次性無菌圓筒中量測80 ml TOM。將80 ml TOM倒入150 ml康寧過濾滅菌單元中。按照製造商之說明將室內真空附接至過濾器且過濾器滅菌。自容器移除過濾器單元且丟棄。用無菌蓋（配備有單元）蓋住採集瓶。用TOM批號標記。測試以下之一等分試樣：含有厭氧菌之細菌培養物；真菌培養物，其他；及黴漿菌培養物。測試一等分試樣之內毒素。將所有TOM等分試樣直立儲存在-20 ^o℃冷凍器中。

若：對於稀釋20倍用於測試之樣本，LAL結果必須等於或小於2 EU/ml，或對於稀釋10倍用於測試之樣本，LAL結果必須等於或小於1 EU/ml，則釋放TOM培養基以供使用；所有培養結果必須對生長呈陰性。

BSC必須用於過濾及分配培養基。

在釋放之前測試TOM之無菌性及內毒素。不釋放TOM用於培養供體胸腺，直至在已滿足14天無菌性測試驗收準則之後。一旦製備，TOM在-20℃下儲存直至解凍，此時其可儲存於冰箱中至多兩週以供使用。

在一實施例中，14天無菌性測試可例如使用BacT/ALERT培養系統進行。BacT/ALERT（北卡羅來納州達勒姆市之生物梅里埃（BioMerieux, Durham, NC））為可用於使用自動化微生物偵測系統測試樣品之市售培養系統。

將所有加工中及原料藥培養物培育14天或若產物變為陽性，則立即報導。對於陽性測試，鑑別生物體且測定其抗生素敏感性。含有用於好氧生長之培養基的培養瓶及含有用於厭氧生長之培養基的瓶子接種在第1天、第7天及釋放當天待測試之樣品。所有瓶子在35-37℃下培育14天。

FBS可獲自GIBCO品牌，生命科技公司（Life Technologies）。FBS係藉由無菌、經驗證之方法製備。FBS滿足USDA對屠宰場來源之動物、可追溯性及原產國的要求。自來源於健康母畜之胎兒收集所有胎兒血液，該等母畜已通過死前及死後認證之獸醫檢測。所有FBS可按收集之日期及地點進行追蹤。在美國收集及處理之FBS來自USDA批准且檢測之屠宰機構。USDA認為美國沒有口蹄疫及牛瘟。為了使供應商具有資格，在使用之前測試FBS之pH、滲透壓、內毒素、總蛋白及一致性。

將完成的培養皿置放於37℃下具有5% CO ₂之含濕氣培育箱中。各批次之胸腺組織儲存於單獨的培育箱中。在將胸腺切片已置放於培育箱中之後，進行粒子取樣及人員監測。

將胸腺切片培養至多21天（例如約6天至約21天之預處理方案），且在培養期間每天更換培養基。此等胸腺切片視為原料藥。在培養期間，自胸腺組織切片中洗去許多胸腺細胞或胸腺細胞在保存胸腺基質之經歷細胞凋亡。所有製造步驟均使用無菌一次性設備及供應品進行。培養基藉由移液管自培養皿抽取且彙集至無菌收集容器中用於加工中測試。接著以沖洗方式將十（10）mL之新鮮胸腺器官培養基輕輕地分配至各培養皿的組織切片上。在完成培養基更換之後，若需要，樣品取自彙集培養基以用於無菌性及組織學。完成粒子取樣及人員監測且進行管線清除。

每天更換培養基。

將切片培養至多21天（例如約6天至約21天之預處理方案）。

進行加工中測試以提供對過程及產物品質之深刻理解且有助於確保最終藥品之安全性及品質。 加工中測試

在第1天及第7天收集樣品以進行無菌性加工中測試。在第7天收集樣品用於黴漿菌加工中測試。在第5天與第9天之間收集樣品以用於加工中組織學測試。在釋放之前一天測定劑量。在釋放當天測試革蘭氏染色（Gram stain）、BacT、黴漿菌及內毒素。

革蘭氏染色為用於將細菌物種分為兩組（革蘭氏陽性及革蘭氏陰性）之細菌學實驗室技術。對來自培養皿之混合的廢培養基測試革蘭氏染色。方法使用染色技術以基於細胞壁之物理特性來確定分類。此方法用於進行初步形態學鑑別或確定臨床試樣中是否存在大量細菌。手動或使用自動化染色機進行染色。已證實兩種不同染色方法未顯示將影響培養結果之定性差異。

在植入之前進行組織學測試，且在一實施例中最少包括：（1）測定對角蛋白AE1/AE3呈陽性之區域分散在整個組織中；（2）微觀鑑別至少1種胸腺小體；（3）組織切片之CK14染色分散在整個胸腺組織中；及（4）微觀觀察到完整細胞核。在一實施例中，在約6天至約21天之間進行組織學測試。胸腺小體及完整細胞核之存在以及成功CK14染色指示已培養之正常健康胸腺組織。

培養時間為重要的製程參數。如所指出，培養進行至多21天。

在植入之前，對培養物中之胸腺樣品進行測試以確認培養物中產生之組織學結果是否代表所培養胸腺組織之歷史試樣的組織學測試。基於由病理學家針對實例中所論述之樣品所做的觀測結果，組織切片在第5天之組織學外觀反映在培養之較晚時間點中之每一者（第9天、第12天及第21天）觀測到的情況。在一實施例中，可在培養之第5天與第21天之間的各種計時器時段及間隔進行胸腺組織之測試。舉例而言，可在預處理方案期間進行測試，該預處理方案持續5天、或6天、或7天、或8天、或9天、或10天、或11天、或12天、或13天、或14天、或15天、或16天、或17天、或18天或19天、或20天、或21天之時段；或持續5至6天、或5至7天、或5至8天、或5至9天、或5至10天、或6至7天、或6至8天、或6至9天、或6至10天、或6至11天、或6至12天、或6至21天、或7至21天、或8至21天、或9至21天、或10至21天、或11至21天、或12至21天、13至21天或14至21天、或15至21天、或16至21天或17至21天或18至21天、或19至21天、或20至21天之時段。在一實施例中，預處理方案可植入經培養胸腺組織之前約6天與約21天之間的任何時間。

任一切片之組織學檢查證實關於整個批次之可接受性的結論。來自胸腺之任一切片之相關特徵反映整個胸腺之彼等特徵，支撐繼續使用組織之單一切片以用於組織學測試。

如圖12A及圖12B中所指示之強制降解測試證明經培養胸腺組織產物不容易降解，且對冷凍/解凍以及容積滲透濃度之變化最敏感。在強制降解期間測試之其他條件展示對經培養胸腺組織產物幾乎沒有影響。 經培養胸腺產物原料藥之對照

新進胸腺組織產物之驗收準則包括下表1中鑑別之測試。 表1.新進胸腺組織

屬性	測試日	測試參數	驗收標準
處理步驟：新進胸腺組織
安全性	第0天	供體篩選	根據21 CFR 1271滿足供體合格性要求
一致性	第0天	目視檢查	容器完整 標籤準確 粉紅色至深紅色，可能存在黑色標記
第0天	組織學	大於 50%之區域對花邊染色圖案中之角蛋白呈陽性 所鑑別之胸腺小體 花邊圖案中之CK14染色 在切片中觀察到之大於 90%完整的細胞核
品質	第0天	重量	大於或等於 3公克

縮寫：CK，細胞角蛋白；EU，內毒素單位；USP，美國藥典。在獲得所有供體篩選結果之前處理胸腺組織。

一般而言，重量之驗收準則為大於或等於3公克。此為確保足夠材料可用於適當給藥最終產物而接受之最小胸腺重量。驗收準則係基於處理胸腺組織之經驗。

在下表2中鑑別加工中測試之驗收準則。 表2.加工中測試：

屬性	測試日	測試參數	驗收標準
製程步驟：原料藥加工中測試
安全性	第1天	無菌性	未生長
安全性	第7天	無菌性	未生長
第7天	黴漿菌	對黴漿菌之存在呈陰性
效力	第5天至第9天	組織學	在第5天至第9天分散於整個組織中之對角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域 至少1種所鑑別之胸腺小體 在整個組織中分散之CK14染色 觀測到的完整細胞核

在下表3中鑑別經培養胸腺組織原料藥測試之驗收準則。 表3.經培養胸腺組織原料藥測試

屬性	測試日	測試參數	驗收標準
製程步驟：原料藥釋放測試
外觀	釋放日	目視檢查	沒有篡改或損壞容器之證據 具有不同厚度和形狀之黃色至棕色組織切片
一致性	第5天至第9天	組織學	在第1天及在中點（第5至9天）藉由組織學確認胸腺組織一致性。
釋放日	條碼	條碼用於在整個處理中追蹤組織且在釋放時確認條碼。
強度	釋放前一天	劑量	1000 - 22,000 mm 2之以m 2為單位的胸腺組織/接受者體表面積
安全性	釋放日	內毒素 （USP ＜85＞）	＜ 5 EU/公斤體重/小時
釋放日	無菌性	未生長
釋放日	黴漿菌	對黴漿菌之存在呈陰性
釋放日	革蘭氏染色	陰性

一致性之驗收準則為在第1天及在中點(第5至9天)藉由組織學確認胸腺組織一致性。條碼用於在整個處理中追蹤組織且在釋放時證實條碼以驗證產物之正確一致性。 免疫化學組織學

如熟習此項技術者所知，組織學方法為由醫院用於所有組織類型之標準方法。

將產物樣品固定在10%福馬林中且運輸至實驗室。容器經編碼的標識符而非患者之姓名標記以保護患者隱私以及病歷號。在到達病理科時，試樣分配唯一的病理學寄存編號，且帶條碼。後續的區塊、載玻片及文書工作皆用此病理學寄存編號進行條碼化。

在實驗室接收試樣之後，大體上檢查福馬林固定之組織，且製備將成為最終報告之部分的材料之書面總體描述。接著在自動化處理機上，藉由標準方法處理福馬林固定之組織且包埋至石蠟塊中。自石蠟塊切割切片且藉由ASCP認證之組織技術人員進行以下染色：

蘇木精及曙紅。

細胞角蛋白AE1/AE3免疫組織化學。

細胞角蛋白14免疫組織化學。

CD3免疫組織化學。

Ki-67免疫組織化學。

在進行前述免疫組織化學測試期間，亦測試且審查適當對照載玻片。所有對照載玻片及內部對照組均顯示預期的免疫反應性模式。當測試樣品作為效力測試之部分時，新進胸腺樣品亦充當用於已經培養約6天至約21天之組織切片的對照物。新進胸腺樣品呈現為典型的胸腺樣品且接著組織切片在培養時發生變化且接著在培養約6天至約21天之後進行測試。在培養約6天至約21天之後，樣品必須展示對在整個組織中分散之角蛋白AE1/AE3呈陽性之區域、至少一種胸腺小體之存在、在整個組織中分散之CK14染色及完整細胞核的存在。

載玻片由在解剖病理學中認證之病理學家解譯，其在胸腺組織之組織學評估中具有額外經歷。最終報告由病理學家發佈，且報告記錄結果。

在下表4中鑑別經培養胸腺組織原料藥測試之驗收準則。 表4.經培養胸腺組織原料藥釋放測試

製程步驟：藥品釋放測試
標識	釋放日	目視檢查	沒有篡改或損壞容器之證據 具有不同厚度及形狀之黃色至棕色組織切片，黏附在圓形白色濾紙上
第5至9天	組織學	在第1天及在中點（第5至9天）藉由組織學確認胸腺組織一致性。
釋放日	條碼	條碼用於在整個處理中追蹤組織且在釋放時確認條碼。

所培養之胸腺組織必須不含微生物。在第1天及第7天進行之無菌性測試中，應該不存在微生物生長。在第7天測試時，黴漿菌應為陰性。無菌性測試應為革蘭氏染色陰性。

使用包括無菌技術之適當控制來維持產物無菌性；採用培訓程式且驗證操作員之資格；利用適當的潔淨室檢核程序；採用建立的清潔培養基填充程序及利用即用型滅菌設備或利用經驗證之滅菌週期滅菌的設備。

目視檢查經處理之胸腺組織的容器之受損。組織切片通常展現具有不同厚度及形狀之黃色至紅棕色外觀。

在第1天及在中點（第5至9天）藉由組織學確認胸腺組織一致性。

條碼用於在整個處理中追蹤組織且在釋放時確認條碼。

劑量（面積）為1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織/接受者體表面積。劑量係受釋放至手術室之切片的表面積控制，適於患者之體表面積。

可接受之劑量範圍定義為1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織/接受者體表面積（BSA）。胸腺組織之面積藉由使用軟體分析（PAX-it影像分析軟體）之像片來測定。使用以cm為單位之患者身高及以kg為單位之體重來測定BSA。杜布瓦（DuBois）及杜布瓦公式用於計算BSA：

BSA=0.007184 × [身高(cm)] ^0.725× [體重(kg)] ^0.425。

測試經培養胸腺組織之內毒素。規格為小於或等於 5 EU/公斤體重/小時。

可例如藉由使用Endosafe PTS系統進行內毒素測試。與Endosafe PTS一起使用之濾筒使用顯色動力學鱟變形細胞溶菌液（LAL）測試。各濾筒含有精確量之LAL試劑、顯色受質及對照標準物內毒素。將測試樣品吸移至四個樣品儲集器中。儀器在兩個通道（樣品通道）中抽取樣品且與LAL試劑混合，且在其他兩個通道（尖峰通道）中與LAL試劑及陽性產物對照混合。將樣品培育，接著與顯色受質組合。在混合之後，量測孔之光學密度且與儀器中存檔之標準曲線進行比較。儀器量測各通道中之反應時間。對各批次之濾筒具有特異性之存檔標準曲線使用反應時間之對數與內毒素標準濃度之對數來構建。藉由使用反應時間內插標準曲線來計算樣品及尖峰值。此測試滿足美國藥典（USP）之要求。

可按以下方式進行黴漿菌測試。在第7天自培養盤移除彙集培養基之樣品且在產物釋放之前測試。

在製造期間陽性培養之情況下，批次將丟棄且將不會投與。在臨床產物投與之後陽性培養之情況下，患者之主治醫師及試驗委託者將適當地治療患者。陽性培養需要鑑別污染生物體之物種且測定其抗生素敏感性。若指示，主治醫師將為胸腺接受者進行抗生素療法。

藥品在使用之前經歷類似的目視檢查及組織學測試。

在胸腺組織切片已培養至多21天之後，將切片轉移至藥品容器中以用於運輸至手術室。一旦在手術室中接受，則將切片插入至接受者患者之大腿肌肉內。

容器應無破損而無可見損壞，且胸腺組織切片應呈現為具有不同厚度及形狀之黃色至紅棕色組織切片。目視檢查組織切片以確認滿足此等驗收準則。 同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之冷凍保存及解凍

同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之冷凍保存可按以下方式進行。

一種冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其藉由包含以下步驟之方法製備：

（a）      自供體獲得適合之胸腺組織；

（b）      對HLA對偶基因進行分型：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DPB1、HLA-DPA1；

（c）      使胸腺組織經歷預處理方案約6天至約21天之時段；其中用於供體胸腺組織之預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；另其中在約6天至約21天時，供體胸腺組織切片在完成預處理方案後展示對分散於整個組織中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域、至少一種胸腺小體之存在、分散於整個組織中之CK14染色及完整細胞核的存在；

（d）      採集部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片作為經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；

（e）      將經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物冷凍保存在液氮中；及

（f）      將液氮中之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物保存在冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物庫中。在一實施例中，如請求項66之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其中在採集當天，胸腺顯示大於50%之區域對花邊染色圖案中之角蛋白呈陽性，存在胸腺小體，CK14在花邊圖案中染色且大於90%之細胞核為完整的。

在一實施例中，將供體胸腺切片且分成大致兩個等份，將各切片與其纖維素過濾器一起放置於單獨的冷凍小瓶（Nunc管）中。將過濾器對折以將其插入至管中。在室溫下添加約1至約1.5 ml之冷凍培養基[無菌過濾之90%熱滅活胎牛血清（FBS）及10%二甲亞碸（DMSO）]以覆蓋組織。將冷凍小瓶之無菌蓋更換在該管上。將所有管放在Biocision冷卻池或在室溫下之等效容器中。冷卻池中之任何空槽應填充有具有1 ml冷凍培養基之管。將管置放在-80℃冷凍器中隔夜。替代地，將各組織加上過濾器置放在5ml CryoELITE組織小瓶（惠頓（Wheaton））中。將3至5 ml之冷凍培養基置於室溫下以覆蓋組織。置於聚苯乙烯發泡塑料箱中且置於-80 ^o冷凍器中隔夜。接著將小瓶轉移至液氮冷凍器之氣相。替代地，可使用受控速率冷凍器以使冷凍小瓶之溫度達到液氮溫度。

為了回收組織，自液氮冷凍器移除冷凍小瓶或CryoELITE組織小瓶。在37℃水浴中在渦漩運動下快速解凍小瓶中之胸腺片。該管用70%乙醇噴塗且接著置放於生物安全櫃（BSC）中。使用鑷子自Nunc冷凍小瓶或CryoELITE組織小瓶移除胸腺組織及過濾器。將組織及過濾器置放於含有20ml之4℃TOM的50 ml錐形管中。至多5個過濾器可置放於含有20 ml之4℃TOM的各50 ml錐形管中。立即將帶有組織之5個過濾器轉移至含有20 ml之4℃TOM培養基的新製錐形管且置放在4℃15分鐘。下重複洗滌3次。將組織保持在4℃下，將各片轉移至其自身含有5毫升4 ^oTOM之120 ml Starplex容器。將所有容器放入其中具有冷封裝之溫度受控容器中之外科套件中。將具有組織之Starplex容器帶入手術室。將過濾器上之組織轉移至含有約2 ml之無菌鹽水之組織培養皿中的無菌區域。洗滌護士藉由用鑷子刮擦或拉擦來自濾紙移除組織。洗滌護士將組織以非晶形堆形式放回濾紙上。組織培養皿帶有約4個過濾器且將組織轉移至外科醫生可易於接近組織之手術部位。類似於CTT（RVT-802）之程序，將組織置放於四頭肌肌肉中。Cryo-CTT與CTT之相似之處在於其為部分T細胞耗乏之，胸腺組織切片展示對在整個組織中分散之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域，含有至少一種胸腺小體之切片，CK14染色在整個組織中分散且存在完整的細胞核。 CTT 移植

在一實施例中，將來在供體之不匹配胸腺組織切片培養約6天至約21天。在實體器官移植當天，通常在麻醉誘導下給予類固醇。對於心臟或肺移植，接受者之胸腺在實體器官移植時以手術方式移除。對於其他器官移植，胸腺切除術可在移植前一天或移植當天進行。胸腺切除術方法將為手術、胸腔鏡或機器人。在再灌注之後手術結束時，接受者在接受馬類抗胸腺細胞球蛋白（例如，兔抗胸腺細胞球蛋白）之前3至7天內給予更多類固醇以殺死接受者中之大部分殘餘T細胞（及NK細胞）或在4天內給予阿倫珠單抗以殺死T細胞、B細胞及NK細胞。接著開始投與免疫抑制劑（諸如環孢素或他克莫司）及黴酚酸酯直至T細胞發育且顯示大於10%原生T細胞。其可對原生T細胞耗費6至12個月以增加至此數目。將經培養胸腺組織處理為實體器官之供體的胸腺。可在約6天至約21天之間將一半CTT植入四頭肌中。另一半胸腺將冷凍保存以供接受者將來使用。免疫抑制方案將抑制任何T細胞，直至原生T細胞藉由植入接受者中之經培養胸腺組織切片釋放且接受者滿足中斷維持免疫抑制方案之準則。（超過10%原生T細胞需要中止免疫抑制。） 胸腺切除術方案

將患者帶至手術室且藉由氣管內導管置於全身麻醉下。

胸部及腹部以無菌方式準備且覆蓋。

患者經歷穿過約4 cm之皮膚切口的完全胸骨切開術。

進入兩個胸膜腔以保證完全切除。

膈神經在兩側上觀測到且注意不要損害該等神經。

鑑別胸腺且自肺之胸膜腔小心剝離，以下角開始且延伸至上角。

進行完整的胸腺切除術。

在縱隔內實現止血。

胸管置入。始終插入一根胸管（至縱隔中）。若在手術期間進入單一胸膜腔，則胸管自縱隔繼續進入該胸膜腔。若進入兩個胸膜腔，則以類似方式自縱隔至另一胸膜腔使用第二胸管。

引流管大小。#15 Blake引流管用於至多2歲之嬰兒。#19 Blake引流管用於2歲及以上之兒童。

胸骨閉合：在新生兒或嬰兒中，0-Ticron縫合線用於閉合胸骨。在約1至2歲時，使用#1胸骨線。在約2至5歲，使用#4胸骨線。

筋膜、皮下組織及皮膚用可吸收縫合線閉合。

將皮膚傷口vac置於胸骨上。

患者在手術室中拔管。

取用海綿、儀器及針頭計數且必須在病例結束時校正。 同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之手術植入 .

應根據以下說明植入同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物。將胸腺組織植入至大腿中需要健康的肌肉組織床。 植入程序之準備

應針對各個別患者計算規劃之植入的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物的最大及最小劑量。在投藥之前正確鑑別預期的接受者。

在層流罩內之無菌條件下，將培養基中之手術海綿上之濾紙上的組織切片自組織培養皿移除且置放於含有20 ml培養基之120 ml無菌杯中，封裝以保持無菌性，且遞送至手術室或封裝以用於裝運。組織切片不自個別容器移除直至準備使用為止。驗證產物有效期及時間。

始終使用嚴格的無菌技術，處理同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物（組織切片）。檢查各容器之洩漏或損壞跡象。若存在污染跡象，則不使用。在無菌區域之外，自運輸箱解封裝同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物容器。自外袋移除含有聚丙烯容器之托架。當就緒時，無菌區域之外但鄰近於無菌製備台之小組成員將打開且自各容器移除蓋子，一次一個。接著各打開的容器藉由小組成員保持在無菌區域外，使其（his/her）手臂在無菌區域上延伸而不接觸無菌區域。

無菌區域小組成員將使用一對鑷子以自容器移除帶有其濾紙之個別組織切片，且將其置放在無菌製備台上含有約2 ml無防腐劑之鹽水的無菌組織培養皿中。將取自四個容器之帶有濾紙的四個組織切片置放於一個無菌組織培養皿中，該培養皿位於無菌區域小組成員前方的無菌區域上。使用無菌鑷子，無菌區域小組成員接著使用兩對鑷子自濾紙剝離組織切片，其中之一者將過濾器固定在原位，而另一者拉動組織或將組織刮擦成堆。自各濾紙移除組織，接著在濾紙之中間成堆地放在該濾紙上。接著將無菌組織培養皿轉移至無菌區域。接著將以相同方式處理下一組四個同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物容器，同時外科醫生植入前4個切片。當外科醫生完成植入前四個切片時，將具有4片組織之下一個培養皿置於手術區域中且將初始組織培養皿返回至無菌區域小組成員前方的無菌區域，以用於裝載第3組四個組織切片。繼續此循環直至植入所有所需組織。所有組織切片在開始時未轉移以避免手術室中之空氣污染。 手術程序

步驟 1.皮膚開口 .

在誘導全身麻醉之後，在前大腿區室中之一者上方製成垂直皮膚切口（長度通常約5 cm）。注意：切口之大小及用於植入程序之一條或兩條腿的用途藉由患者之體型、植入組織之規劃量及其肌肉質量來測定。若所有或大部分組織可植入於一條腿中，則應使用僅一條腿。

步驟 2.打開筋膜以暴露前區室肌肉.

步驟 3.肌肉擴散及植入.

使用扁桃體夾具或類似儀器沿四頭肌之自然溝分離肌肉。同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物個別胸腺切片應在無需切割肌肉組織之情況下植入。將個別切片組織置放於「囊袋」中，沿著自然溝在四頭肌內相隔約1 cm且深度約1 cm。視患者體型而定，外科醫生可沿著各溝將約6至7個切片置放至6至7個囊袋中。視各過濾器上之組織質量而定，個別同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物切片可在植入之前切成兩半。已完全覆蓋濾紙之厚組織切片應切成兩半以實現各組織之最佳血管形成。在各前區室內植入儘可能多的所需組織直至最大規劃劑量。

步驟 4.肌肉閉合 .

在植入胸腺組織之部位內用單一縫合線閉合肌肉以防止肌肉再打開及移植物脫離肌肉。確保在閉合切口之前，植入組織由無暴露胸腺組織之肌肉組織完全覆蓋。

步驟 5.對各同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物組織切片重複步驟3至4，直至最大預期劑量。

步驟 6.切口閉合 .

確認止血。用兩層可吸收縫合線閉合皮膚切口且應用標準敷料，諸如傷口閉合條或皮膚膠。使筋膜打開以為肌肉區室腫脹留出空間。封閉敷料可用於防止污染。 術後手術 / 醫療管理 .

按需要使用輕度鎮痛劑。監測感染或裂開之跡象。

若供體為肺、腎臟、腸或部分肝臟之活的相關供體，則實體器官供體之胸腺之一部分可足以用於培養及植入。   將需要滿足採集當天及植入前上文所列之病理學準則。

冷凍保存之經培養胸腺組織可獲自第3方供體。然而，第3方供體必須表現不由實體器官供體表現之所有接受者HLA對偶基因。此包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DQA1、HLA-DPB1及HLA-DPA1。若錯配為「容許的」，則HLA-DP對偶基因中之錯配為可接受的。在其他對偶基因中，允許輕微錯配，例如HLA-A*01:02成為攜帶HLA-A*01:01之接受者，換言之，第二區域（在結腸之後）可為不同的，第一區域（在結腸之前）必須一致。 人類心臟移植程序

受試者之合格性係基於多個準則而判定，包括：儘管當前最大支持性療法，但在無心臟移植之情況下12至24個月的不良預後；如由UNOS準則所定義之先天性或後天性心臟病伴有發育不良；在難以用醫療療法治療之先天性或後天性心臟病之情況下的晚期心臟衰竭之症狀；異常血流動力學或肺血管阻力增加；不可手術之結構性心臟病；不適合於藥物或裝置療法之症狀性心律不齊或不良運動耐性。

評定多種對心臟移植手術之絕對及相對禁忌症，包括例如可逆腎功能障礙，除非受試者為心臟/腎臟移植之候選者；不可逆肝病，除非為心臟/肝臟移植之候選者；不可逆肺功能障礙，使用非習知機械呼吸器支援（亦即，高頻呼吸器，CMV之最大設置）或固定肺動脈高壓（TPG大於15），除非受試者為心臟-肺移植之候選者；糖尿病伴有微血管疾病；或活動性、不受控之癲癇症。

其他禁忌症可包括在心臟移植之後限制長期存活率及康復之其他疾病；藥物濫用、病態肥胖、惡性腫瘤；活動性精神病症；及其他原因，諸如所之醫療不順應性。

相對禁忌症包括活動性感染；認識功能障礙；血管通路不足及顯著同種致敏反應。

亦考慮供體及接受者組織相容性管理。評估患者對預先形成的HLA抗體之組反應性抗體（「PRA」），接受者可能已回應於「致敏事件」而形成，諸如使用旁路/血液製品或同源移植材料之預先輸注或主要手術。

評定接受者之預致敏史，例如先前輸血；編號、日期；先前手術；先前妊娠；免疫接種病史及IVIG投藥（具有日期）。

具有過高HLA-I類或II類PRA之患者或經歷重複移植之彼等患者可為去敏策略的候選者。特定策略將對於潛在接受者個別化且可包括使用血漿清除術、IVIG、利妥昔單抗（rituximab）及/或硼替佐米（bortezomib）。顯著抗體為彼等在1:16稀釋之後仍然之抗體。

預致敏患者可能需要與潛在供體進行實際預期交叉匹配。在考慮移植時，具有HLA抗體病史之患者將在UNET中進行虛擬交叉匹配。

預致敏患者可能需要經由以下普通準則與潛在供體進行實際預期交叉匹配。在考慮供應時，具有HLA抗體病史之所有患者將在UNET中進行虛擬交叉匹配。

若cPRA ＜ 20%：UNET中之虛擬交叉匹配，則不需要額外量測；繼續進行常規回溯性供體交叉匹配及常規免疫抑制。

若cPRA 大於 20%：UNET中之虛擬交叉匹配，則接受者在移植時在手術室（「OR」）中接受血漿清除術。

若cPRA 大於 70%：虛擬交叉匹配，則考慮在時間允許時獲得實際預期供體交叉匹配；在OR中投與血漿清除術。考慮在OR中置入提取導管用於手術後繼續提取。

進行中抗體減少干預係藉由供體交叉匹配、DSA及臨床病程來測定。

對於所有預致敏患者，血液將在移植後前兩週內遞送用於供體特異性抗體且如臨床上所指示重複。針對DSA之常規測試將在移植後至少每6個月對所有移植後患者進行，且若存在臨床問題，則按需要進行。

移植前及移植後均遵循標準血液製品輸注方案。 免疫抑制管理

免疫抑制管理係基於待移植之實體器官而判定。 小兒心臟移植

所有患者將基於其臨床情況及風險因素接受巴利昔單抗或抗胸腺細胞球蛋白之誘導療法。所使用該誘導療法的類型將在移植之前測定（第一免疫抑制方案藥物療法）。

在一實施例中，移植前/誘導療法通常包含投與：

在手術室之前，25 mg/kg IV黴酚酸酯（CellCept®）。

在誘導時10 mg/kg IV甲基普賴蘇穠（最大劑量500 mg）。

在釋放x-夾具時10 mg/kg IV甲基普賴蘇穠（最大劑量500 mg）。

在釋放x-夾具時1.5 mg/kg IV ATG（抗胸腺細胞球蛋白）。

替代地，使用巴利昔單抗（Simulect®），按接受者之體重給藥。

＜35 kg，在釋放x-夾具時10 mg且在4天後第2次給藥。

大於35 kg，在釋放x-夾具時20 mg且在4天後第2次給藥。

在一實施例中，用於心臟及CTT植入候選者之移植前誘導免疫抑制療法可包含：

巴利昔單抗（Simulect®）-（若不能提供ATG）。

給藥：

＜35kg：初始劑量：藉由麻醉在誘導麻醉時術前投與之10 mg IV（在穩定及給予甲基普賴蘇穠之後）。

第二劑量：在移植之後4天投與的10 mg IV；若出現併發症（包括嚴重過敏反應或移植物損失），則保持第二劑量

大於35kg：初始劑量：當穩定時，藉由麻醉在誘導麻醉時術前投與之20 mg IV。

第二劑量：在移植之後4天投與的20 mg IV；若出現併發症（包括嚴重過敏反應或移植物損失），則保持第二劑量。

投藥：在20至30分鐘內IV輸注。半衰期兒童1至11歲：9.5天，青少年12至16歲：9.1天，成人：7.2天。

在一實施例中，抗胸腺細胞球蛋白（ATG，兔衍生，Thymoglobulin®）可根據以下用於心臟移植受試者之給藥時程給予：

1.5毫克/公斤/天，持續3至7天，基於淋巴球計數及標記物及血小板計數。第一劑量在釋放交叉夾具時器官再灌注之後在第二次給藥類固醇（術中灌注）之後給予。

基於以上參數每天持續將藉由移植MD測定。

投藥：在第一次給藥6小時內緩慢IV輸注，後續劑量可根據耐受在4小時內給予。

在一實施例中，除CPB/泵病例之常規手術前/手術中甲基普賴蘇穠以外，患者可在巴利昔單抗之前誘導麻醉時接受麻醉投與之一定劑量的甲基普賴蘇穠（索盧米羅（SoluMedrol））10mg/kg（最大劑量500mg）IV，且接著在再灌注時（ATG之前）接受第二劑量之10mg/kg（最大500mg）。 術後維持免疫抑制（維持免疫抑制方案）

在一實施例中，移植後免疫抑制包含：

ATG（Thymoglobulin®）每天1.5 mg/kg IV，持續5至7次劑量。

若WBC ＜ 2,000或血小板計數＜50,000，則保持。

若WBC 2,000-3,000或血小板計數50,000-75,000，則½劑量。

黴酚酸酯，每12小時15至25 mg/kg IV/PO

調節GI不耐受或白血球減少症/嗜中性白血球減少症。

若GI不耐受，則可取代硫唑嘌呤。

若GI不耐受，則可取代黴酚酸（Myfortic®）。

視腎功能及口服耐受性而定，他克莫司在tx之後24至48小時開始。

起始劑量約0.05 mg PO q 12小時且基於含量調節。

前6個月為約10至15，6個月至3年8至12，大於3年4至8。

若需要IV藥物或對他克莫司不耐受，則可取代環孢素。

甲基普賴蘇穠5 mg/kg IV q 8小時× 6次劑量（最大劑量125 mg）。

接著，1 mg/kg/劑量IV/PO q 12小時（最大30 mg/劑）。

基於活組織檢查結果，在下一個2至3個月內終止。

在一實施例中，可投與他克莫司（FK506，Prograf®）。常見的劑型包括0.5mg/ml之靜脈內溶液及每粒膠囊0.5mg、1mg及5mg之口服膠囊。

當接受者為PO/NG/SL時，每12小時給予約0.05毫克/公斤/劑之起始劑量（最大5mg/劑），若腎功能可接受，則通常在術後約24小時開始。

每天監測他克莫司最低含量直至實現治療性給藥。必要時，每8小時遞增投藥，以獲得治療性最低含量。若舌下給予藥物，則將膠囊內容物撒在舌下（可產生較高含量）。並非口服及舌下劑量。一般而言，需要投與約½之待舌下給予的經口劑量。

可基於在最後給藥之後藉由質譜分析法10至14小時（若每8小時給藥，則7至9小時）量測之血清全血含量來投與他克莫司給藥。

在控制患者之他克莫司含量時，均考慮腎臟及肝臟功能、不良藥物作用、感染及排斥病史。若含量在所需範圍內下降+/-1，若患者臨床上良好進行，則不需要進行劑量調節。在此等情況下，由主治移植醫師作出決策。

在一實施例中，向不能耐受他克莫司之患者投與環孢素。起始劑量：每12小時口服2毫克/公斤/劑。若不能達成治療性水準（尤其嬰兒及幼兒），則給藥頻率增加至每8小時。

一般給藥係基於在最後給藥之後藉由質譜分析法10至14小時（若每8小時給藥，則7至9小時）量測之以下血清全血含量。

在控制患者之環孢素含量時，均考慮腎臟及肝臟功能、不良藥物作用、感染及排斥病史。若含量在所需範圍內下降+/- 10-20，若患者臨床上良好進行，則不需要進行劑量調節。在此等情況下，由移植主治醫師作出決策。應盡一切努力在圖表中記錄患者之目標環孢素含量。IV劑量通常等於經口劑量之1/3。

在一實施例中，可投與黴酚酸酯（Cellcept®）（200mg/ml、250mg或500mg片）：

開始以兩個分次劑量30至50毫克/公斤/天（最大劑量兒童2公克/天，成人3公克/天）。

IV劑量= PO劑量。

不需要治療藥物監測，但若考慮到毒性，若可進行監測。

黴酚酸酯可造成骨髓抑制及嗜中性白血球減少症。

當ANC ＜500或WBC ＜1000時可保持劑量；可需要在降低ANC（＜1000）或WBC（＜3000）之情況下減少劑量。實際上，Cellcept之劑量500mg =Myfortic（黴酚酸酯）360mg。

在一實施例中，根據以下劑量參數，可投與黴酚酸酯（Myfortic®劑型180mg錠劑，360mg錠劑）代替黴酚酸酯：

開始延遲釋放錠劑：400毫克/平方公尺/劑，每天兩次；最大劑量：720 mg OR BSA 1.19-1.58 m ²：540 mg，每天兩次，BSA  大於1.58 m ²：720 mg，每天兩次。

無法獲得IV或懸浮液。若需要IV或懸浮液，則將藥物轉化為Cellcept。（Cellcept 500mg =Myfortic 360mg）。黴酚酸酯可造成與黴酚酸酯相同的骨髓抑制。

在一實施例中，若未能耐受黴酚酸酯，則可按以下方式投與硫唑嘌呤：

開始2至4毫克/公斤/天，每天給予一次。

硫唑嘌呤導致骨髓抑制且基於WBC/ANC可能需要降低劑量。IV劑量等於經口劑量。

在一實施例中，可以甲基普賴蘇穠（Solu-Medrol®）、普賴松或普賴蘇穠形式投與類固醇。

術中開始靜脈內類固醇（作為誘導免疫抑制療法），且在術後繼續以5毫克/公斤/劑（最大125毫克/劑量）IV，每8小時× 6劑。

此後可以普賴松錠劑或普賴蘇穠懸浮液3 mg/ml形式開始口服類固醇。若移植接受者不能耐受經口免疫抑制治療方案，則繼續靜脈內甲基普賴蘇穠。可切換至口服療法，使得接受者可耐受口服藥物。類固醇之例示性給藥範圍為：

0-10 kg，以2毫克/公斤/天開始，分次BID，每2天中止，每天保持6mg

0-30kg，以2毫克/公斤/天開始，分次BID（最大單次劑量30mg，參見下文），每兩天以5毫克/天停藥，接著每天保持10mg。

大於 30kg，30mg BID × 4劑、25mg BID × 4劑、20mg BID × 4劑、15mg BID × 4劑、10mg BID × 4劑，接著每天以15mg開始，以便藉由移植心臟病專家進一步停藥

基於活組織檢查結果，在移植之後第一個月內繼續停用類固醇。若出現排斥反應，則類固醇將由移植心臟病專家酌情決定重新開始且基於進一步活組織檢查結果及患者臨床狀態無限地繼續。

第二免疫抑制方案中之其他藥物包括以下：

西羅莫司（Sirolimus）（Rapamune®）（0.5mg、1mg、2mg膠囊）：在診斷冠狀動脈同種異體移植血管病變之後開始或如移植心臟病專家另外臨床上指示。

起始劑量：每天一次1 mg/m ²（最大劑量：3mg）或若難以達成足夠含量，則分為2次日劑量。

治療性含量目標為4-8，若關於兩種藥物，則接受較低他克莫司含量（相同4-8範圍）。

若每12小時給藥，則在最後給藥後23至25小時或在最後給藥後11至13小時繪製最低含量。

當開始西羅莫司時，中斷黴酚酸酯（Cellcept®，Myfortic®），硫唑嘌呤。

開始細菌感染防治：可導致棘手的口腔潰瘍，及創傷癒合延遲。

普伐他汀（Pravastatin）（Pravachol®）—用於青少年/大齡兒童及患有CAV之彼等

開始每天一次投與0.2毫克/公斤/天（以錠劑形式出現，可在晚上每天給予¼、½或至多1至2片）。

隨著重量變化逐漸增加劑量（最大劑量20毫克/天）。

每8週監測LFT、CK。

若關節或肌肉疼痛產生，則中斷藥物。

若接受者或供體為CMV IgG陽性，則給予更昔洛韋（Ganciclovir）IV以供CMV預防。

誘導療法：5mg/kg IV q 12小時× 7至14天。

維持療法：每天5mg/kg IV。

監測WBC及腎功能。

當可耐受時轉變為口服纈更昔洛韋（valganciclovir）。

纈更昔洛韋（Valcyte®）—用於所有CMV+接受者或供體中之CMV預防。

450mg片或50mg/ml懸浮液。

4個月-16歲：每日總經口劑量(mg) = [7 × BSA × Cr清除率]。

大於 16歲：每天經口900mg。

在各問診時監測CMV PCR。

甲氧苄啶-磺胺甲基異噁唑（Trimethoprim-Sulfamethoxazole）（Bactrim®，Septra®）：

單一強度錠劑80 mg/400 mg，雙強度片劑160 mg/800 mg，懸浮液5ml 40 mg/200 mg。

在出院之前，亦在服用口服粗粉時開始，以用於i PCP/Toxo預防。

1至12歲：5-10毫克/公斤/天TMP分成BID 3×/週，連續幾天。

大於12歲：每天經口80-160mg TMP，或3×/週經口160mg TMP。

如一般熟習此項技術者所知，監測可增加或減少他克莫司及環孢素含量之藥物。

亦監測具有伴隨他克莫司及環孢素之協同腎毒性之藥物。 急性移植排斥反應治療

在一實施例中，受試者在注意到移植排斥反應之情況下按以下方式治療。

在一實施例中，若移植接受者在無血液動力學損害之情況下為0級、1R級：不需要治療且可考慮停用類固醇。

若患者在無血液動力學損害之情況下呈現2R級細胞排斥反應，則遵循以下治療方案：

使維持免疫抑制最佳化。

以15毫克/公斤/天IV × 3天投與甲基普賴蘇穠（最大1000mg）可劃分為每12小時給藥或每24小時給藥一次。

在1至2週內，關於難治性細胞排斥反應重複甲基普賴蘇穠及視情況Thymoglobulin®進行重複活組織檢查。

若排斥反應消退，則在1個月後（排斥反應後6週）重複活組織檢查且若排斥反應得到成功治療，則恢復先前定義之活組織檢查方案。

對於難治性細胞排斥反應，甲基普賴蘇穠重複且考慮胸腺球蛋白。

若患者呈現2R級細胞排斥反應而無血液動力學損害或較高等級排斥反應。

使免疫抑止最佳化以具有較高水準（10-15）。

以15毫克/公斤/天IV × 3天（最大1000 mg）投與甲基普賴蘇穠。

投與Thymoglobulin®。

若有證據或考慮抗體介導之排斥反應，則進行血漿清除術。

若患者呈現具有或不具有血液動力學損害之抗體介導之排斥反應：

以15毫克/公斤/天IV × 3天（最大1000 mg）投與甲基普賴蘇穠。

進行血漿清除術5次操作（每天或每隔一天）。

每月× 6個月IV投與IVIG 1至2公克/公斤。

移植物功能障礙或血液動力學損害之證據證明活組織檢查（當患者穩定時）用於細胞排斥反應及抗體介導之排斥反應，包括C4d染色。開始甲基普賴蘇穠（索盧米羅），同時等待活組織檢查結果，考慮開始胸腺球蛋白及血漿清除術。

將3R級活組織切片或血液動力學損害視為高級排斥反應事件。

甲基普賴蘇穠（索盧米羅）15毫克/公斤/天IV × 3天（最大1000 mg）考慮心肌療法（inotrope therapy）、胸腺球蛋白；及/或血漿清除術。

在具有或不具有血液動力學損害之情況下的抗體介導之排斥反應。診斷：鑑別在外周血清樣品中存在供體特異性抗體之心肌組織中的C4d沈積。考慮類固醇、AMR之ATG提取法。 腎臟及胰腺免疫抑制管理

用於腎臟及胰臟移植程序之例示性誘導免疫抑制方案及維持免疫抑制方案呈現如下。在一實施例中，移植接受者接受貝拉西普（belatacept）作為維持療法作為第二免疫抑制方案之部分。當接受者為埃-巴二氏病毒（EBV）Ig+時，通常採用此方案，不展現DSA（供體特異性同種抗體）；無關於絕對或經計算之組反應性抗體（PRA），移植涉及陰性交叉匹配且接受者＜ 70歲，BMI 小於或等於 35。其他考慮因素包括接受者耐受誘導之能力（若其將不會另外接受胸腺球蛋白）。接受者不應具有特發性局灶節段性腎小球硬化（FSGS）之病史且不具有前述非腎臟實體器官移植。該方案僅用於腎臟移植。

在一實施例中，誘導免疫抑制方案包含在術中靜脈內投與500 mg甲基普賴蘇穠。藉由靜脈內輸注歷經三小時之時段（類固醇投與後2小時）投與30 mg阿倫珠單抗。在先前藥物投與之後投與10 mg/kg貝拉西普（TBW）（捨入至最接近12.5 mg）。

在一實施例中，維持免疫抑制方案包含，其在POD 4及第2、4、8及12週之結束時貝拉西普10mg/kg TBW；接著每月5mg/kg（捨入至最接近12.5 mg）。每天投與2mg西羅莫司，第一最低含量在2週之後採用（目標8-10 ng/ml）。通常不需要類固醇維持療法。

在一實施例中，在接受者不為貝拉西普候選者之低風險腎移植中，誘導免疫抑制方案可不包含誘導免疫抑制方案，亦即，誘導免疫抑制方案為視情況選用的。維持免疫抑制方案可包含每12小時投與1000 mg黴酚酸且每12小時投與0.1毫克/公斤/天他克莫司，其中每12小時投與最多5 mg。

在一實施例中，當接受者具有高風險及ATG禁忌、虛弱、年齡大於 70且具有近期感染及近期癌症活性之證據時，誘導免疫抑制劑可包含20 mg巴馬利昔單抗（basalixiimab）以在手術室中及術後第4（POD）天開始。維持免疫抑制方案可包含每12小時投與1000 mg黴酚酸且每12小時投與0.1毫克/公斤/天他克莫司，最大值為5 mg，其中類固醇劑量逐漸減少。

在涉及高風險腎臟移植或腎臟及胰臟移植之一實施例中，考慮以下參數。具有歷史峰值PRA大於30之接受者、歷史供體特異性抗體（DSA，無關於絕對或計算之PRA）、由於假定免疫學原因而具有早期移植物損失的第2次移植、第3次或更多次移植、小兒成塊（成人）接受者、腎臟/胰臟、單獨的胰臟及是否存在DGF高風險或高風險活組織檢查。在此類移植中，誘導免疫抑制方案（誘導療法）包含在手術室中開始之1.5mg/kg IBW（捨入至最接近25mg）× 4劑之胸腺球蛋白。

在一實施例中，在接受者具有零PRA、無自體免疫疾病及高BMI之情況下，誘導免疫抑制方案可包含在手術室中開始之1.5mg/kg IBW（捨入至最接近25 mg）× 4劑之胸腺球蛋白。第二免疫抑制方案（維持療法）可包含逐漸減少類固醇之劑量，諸如OR中500 mg、240 mg POD 1、125 mg POD 2、125 mg POD 3、90 mg POD 4，POD 4開始每12小時服用黴酚酸1000 mg及每12小時0.1毫克/公斤/天他克莫司，最多5 mg。

在其中在腎臟移植之後進行胰腺移植之一實施例中，誘導免疫抑制方案可包含手術室中開始之1.5mg/kg IBW（捨入至最接近25 mg）× 4劑的胸腺球蛋白。第二免疫抑制方案可包含類固醇遞減至最低每天5 mg、POD 4開始每12小時投與黴酚酸1000 mg及每12小時投與0.8毫克/公斤/天他克莫司，最多4 mg。

對於涉及投與黴酚酸之所有免疫抑制方案，可基於對患者及移植因素之評定選擇初始劑量。 成人心臟移植免疫抑制管理

在一實施例中，通常投與誘導免疫抑制方案。當認為誘導療法之風險勝過此類療法之益處時，有時可能出現例外情況（亦即，誘導免疫抑制方案為視情況選用的）。

在一實施例中，當投與誘導免疫抑制方案時，方案可包含Simulect®（巴利昔單抗）：在再灌注之後（交叉夾具移除）在OR中給予20mg IV，且術後第4天重複。在接受誘導免疫抑制療法之患者中，在第二免疫抑制方案中投與之鈣調神經磷酸酶抑制劑（CNI）應在手術後48小時開始，但可視患者之腎臟狀況而進一步延遲。類固醇可在圍手術期投與，通常在誘導全身麻醉時靜脈內投與甲基普賴蘇穠500 mg，且在再灌注（交叉夾具移除）之前投與500 mg IV。

在一實施例中，維持免疫抑制方案（術後維持免疫抑制治療），方案可包含類固醇，例如甲基普賴蘇穠125 mg IV q8小時× 3劑（在再灌注之後8小時開始），接著普賴松：每天兩次0.5 mg/kg，術後第2天開始；每2天減少劑量每天兩次5 mg至每天兩次10 mg（或每天20mg）且在移植後保持此劑量至30天。第二免疫抑制方案亦可包含鈣調神經磷酸酶抑制劑（CNI），例如他克莫司/FK506/Prograf ®（較佳藥劑）：每12小時口服1mg。將劑量逐漸降低至最低目標水準10至15 ng/ml。在5劑鈣調神經磷酸酶抑制劑之後進行典型的劑量調節以建立穩態；最初監測CNI之每日含量以評估CNI毒性。

在一替代實施例中，環孢素/CyA/Neoral®以100 mg（1.5至5 mg/kg）之劑量每12小時經口投與。劑量通常逐漸降低至33 ng/ml之最低目標水準。維持免疫抑制方案亦可包含抗增殖劑，諸如經口1,000至1,500 mg之黴酚酸酯（Cellcept®），其中調節劑量以維持WBC計數大於 3,000。在替代方案中，抗增殖劑可為一天兩次經口投與360 mg至720 mg之黴酚酸酯（Myfortic®），其中調節劑量以維持WBC計數大於 3,000。在另一實施例中，抗增生劑為以每天2 mg/kg之劑量經口投與之硫唑嘌呤（Imuran®），其中調節劑量以維持WBC計數大於 3,000。

在一實施例中，維持免疫抑制方案可包含以每天2 mg之劑量經口投與之西羅莫司（Rapammune®）（TOR-I）。劑量通常逐漸降低以保持4至12 µg/ml之谷值。

在一實施例中，維持免疫抑制方案可包含逐漸減少類固醇之劑量，例如第1個月，將劑量減少至每天15.0 mg PO；第2個月，將劑量減少至每天12.5 mg PO；第3個月，將劑量減少至每天10.0 mg PO；第4個月，將劑量減少至每天7.5 mg PO；第5個月，將劑量減少至每天5.0 mg PO；第6個月，將劑量減少至每天2.5 mg PO。類固醇逐漸減少應在大於或等於 ISHLT 1R級之後再次評估，證明肌細胞壞死。可在改良組織學排斥準則之後恢復逐漸減少。

在一實施例中，維持免疫抑制方案可包含以下額外/輔助藥劑：每週兩次投與2.5至5 mg用於細胞介導之排斥反應的甲胺喋呤（MTX）。MTX應考慮用於大於或等於1R/2級之3個或更多個連續活組織檢查，或2R/3A級之2個連續活組織檢查。 成人肝臟及腸免疫抑制管理

在一實施例中，無腎臟功能障礙之肝臟移植可在無任何誘導免疫抑制方案之情況下進行，亦即此類誘導免疫抑制方案為視情況選用的。維持免疫抑制方案可包含每12小時投與1 g黴酚酸酯及每12小時投與2至3 mg他克莫司以及劑量逐漸減少之類固醇。典型的劑量逐漸減少之類固醇為：術中甲基普賴蘇穠500 mg IV；術後6小時甲基普賴蘇穠250 mg IV一次；POD 1甲基普賴蘇穠180 mg IV一次；POD 2甲基普賴蘇穠90mg IV一次；POD 3甲基普賴蘇穠60mg IV一次；POD 4甲基普賴蘇穠30mg IV一次；POD 5-14普賴松每天20 mg PO；每2週減少2.5 mg。在一實施例中，逐漸減少劑量之普賴蘇穠可每天投與20 mg，持續前2週；每天17.5 mg，持續2至4週；每天15 mg，持續4至6週，每天12.5 mg，持續6至8週；每天10 mg，持續8至10週；每天7.5 mg，持續10至12週；每天5 mg，持續12至14週；每天2.5 mg，持續14至16週。在16週停止。在某些情況下，普賴蘇穠停用至每天5 mg且保持一年。

在一實施例中，在存在需要HD或CVVHD/F之術前功能障礙的情況下進行腎保留性肝移植。在另一實施例中，在POD 0-1上存在血清肌酐含量大於2 mg/dL之術後腎功能障礙的情況下進行腎保留性肝移植。

在一實施例中，誘導免疫抑制方案包含每48小時1.5 mg/kg（捨入至最接近25 mg）之胸腺球蛋白，持續4次給藥。在一實施例中，減少劑量以用於全部血球減少症或嗜中性白血球減少症。若WBC計數為2-3或血小板為30-50，則給予½劑量。若WBC ＜ 2或血小板 ＜ 30，則保持該劑量。

在一實施例中，當指示術前用藥時，可在ATG輸注之前30至60分鐘投與術前用藥，VT或經口投與乙醯胺苯酚650 mg、苯海拉明（diphenhydramine）25至50 mg；以及甲基普賴蘇穠40 mg IV（或可使用上文所描述之逐漸減少）。

在一實施例中，移植為腸或多內臟移植，諸如肝臟、腸、胰臟移植，其中接受者處於高免疫風險（PRA 大於 0，先前妊娠或移植經分離之腸），或在存在低免疫風險但具有感染之高風險的情況下，誘導免疫抑制方案可包含如上文所描述的術前用藥，且亦可包含每24小時1.5 mg/kg（捨入至最接近25 mg）之胸腺球蛋白（總共6 mg/kg），及在POD 0及4 的20 mg之巴利昔單抗。維持免疫抑制方案可包含如上文所描述劑量逐漸減少之類固醇及每12小時1 g黴酚酸酯及每12小時SL 1 mg他克莫司（目標為12-16 mg/ml）。

在某些實施例中，他克莫司以實現目標含量5‐8（肝臟）或12‐17（腸道，肝‐腸）之劑量投與，同時病患服用黴酚酸酯（Cellcept）。若患者參與藥物研究試驗、具有排斥反應、腎臟損害或年齡增長，則可改變目標。

在投與黴酚酸酯（MMF，Cellcept）之某些實施例中，成人之標準劑量為每12小時1,000 mg。可根據以下在患有全部血球減少症或嗜中性白血球減少症之患者中進行劑量減少：WBC 2‐3或血小板30‐50：考慮到給出½劑量；對於WBC ＜ 2或血小板＜ 30；考慮保持劑量。

在涉及治療急性肝臟同種異體移植排斥反應之某些實施例中，可投與以下治療：每天甲基普賴蘇穠500 mg IV，每天3劑。若肝功能測試未改善，則可給予額外兩個劑量（總共5劑，每天500 mg IV），其中對POD 3之晚上或POD 4之早上進行重複的同情活組織檢查.

在某些實施例中，用SoluMedrol®或Thymoglobulin®治療之患者（其CMV IgG先前呈陰性）應在治療開始時再檢查CMV IgG。 肺移植中之免疫抑制管理

在某些實施例中，肺植入中之免疫抑制管理遵循以下誘導及維持免疫抑制方案。誘導免疫抑制方案可遵循先前所描述之誘導免疫抑制方案。維持免疫抑制方案可包含以下：

鈣調神經磷酸酶抑制劑：每12小時他克莫司，調節劑量來維持最低他克莫司含量。 參見下面的表5。 表5：他克莫司最低含量

移植後之時間	臨床因素	目標谷值
第1年	年輕、排斥反應風險高、腎功能正常	12-15 ng/ml
第1年	大於或等於 65歲及/或CKD	8-12 ng/ml
1-3年	年輕、難治性排斥反應、腎功能正常	10-14 ng/ml
1-3年	2-3期CKD	8-10 ng/ml
1-3年	3-4期CKD	6-8 ng/ml
大於 3年	2-3期CKD	6-8 ng/ml
大於 3年	4期CKD	6 ng/ml
坎帕斯後		8 ng/ml或更低，取決於腎功能。

每12小時投與之環孢素，根據下表6調節劑量以維持最低CyA含量。 表6：環孢素最低含量

移植後之時間	臨床因素	目標谷值
第1年	年輕、排斥反應風險高、腎功能正常	250-300 ng/ml
第1年	大於或等於 65歲及/或CKD	150-200 ng/ml
1-3年	年輕、難治性排斥反應、腎功能正常	250-300  ng/ml
1-3年	2-3期CKD	150-200 ng/ml
1-3年	3-4期CKD	100- 150 ng/ml
大於 3年	2-3期CKD	100-150  ng/ml
大於 3年	4期CKD	75-125 ng/ml
坎帕斯後		150 ng/ml或更低，取決於腎功能。

移植後0至3個月類固醇劑量逐漸減少，每天經口投與20 mg；移植後3至6個月，每天經口投與15 mg；移植後6至9個月，每天經口投與10 mg；及移植後大於9個月，每天經口投與5 mg。

可每天經口投硫唑嘌呤2 mg/kg。重要的係確保開始之前的正常TMPT酶含量且遵循LFT/CBC。若觀測到白血球減少症，則可考慮劑量調節。

黴酚酸酯（Cellcept®）可以每天兩次1,000 mg之常見劑量投與。心臟及肺移植之常見劑量為每天經口投與1,500 mg。隨後應進行CBC且若觀測到白血球減少症，則應考慮劑量調節。

在移植之後前3個月內，由於吻合口裂開之問題，通常禁忌西羅莫司。若投與，則通常藉由經口投藥每天投予1 mg西羅莫司，其係基於最低含量而進行調整。舉例而言，作為第3藥劑或針對CNI備用投與，目標最低為4-8 ng/ml；且作為CNI替代方案，最低含量為10-15 ng/ml。 實例

實例1：胸腺內可變性研究.

研究胸腺內可變性以判定來自胸腺之一部分之組織學測試結果是否可視為代表相同胸腺的任何其他部分之組織學測試結果。此測試之結果用於測定在常規釋放測試及用於製程驗證測試期間應測試多少樣品。

建立組織學驗收準則，如先前所指出，包括評定以下各者：對在第5至9天分散於整個組織中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域；至少1種所鑑別之胸腺小體；在整個組織中分散之CK14染色；及觀測到的完整細胞核。

對於此研究，將三個胸腺以定向方式切片，且追蹤各胸腺內之切片位置。將切片在6孔盤中培養以允許追蹤各切片。如圖5A中所示進行切片。

對於研究中之各胸腺，切片專用於在以下時間點中之每一者分析：基線（第0天）、第5天、第9天、第12天及第21天。

對於各胸腺，在各時間點培養5至11個切片。根據上文所述之方法培養切片，每天更換培養基。將切片提交用於病理學實驗室中之H&E染色且分析一致性、效力及生存力。此研究中之所有切片符合如上文所指定之組織學測試的釋放驗收準則，亦即：對在第5至9天分散於整個組織中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域；至少1種所鑑別之胸腺小體；在整個組織中分散之CK14染色；及觀測到的完整細胞核。

除評定各切片是否符合釋放驗收準則以外，病理學家對各H&E及AE1/AE3載玻片進行更詳細的審查。用於所培養胸腺組織批次MFG-056之此等載玻片中之一些的影像展示於圖6A-H中。注意到以下觀測結果。

來源於相同供體胸腺之所有切片在各時間點皆符合驗收準則。在不同切片中，皮質區域彼此相似，且髓質區域彼此相似。然而，觀測到在切片之間的皮質及髓質之相對比例的變化。

在來源於相同胸腺之不同切片之間觀測到的隨培養時間變化之差異主要與壞死量、主要胸腺細胞（其隨著培養時間增加而增加）及殘餘胸腺細胞數目（其隨著培養時間增加而減少）相關。

基於此等觀測結果，來自胸腺之任一切片代表整個胸腺。另外，組織切片在第5天之組織學外觀反映在較晚時間點中之每一者（第9天、第12天及第21天）觀察到的情況。

實例2：整個胸腺時程研究.

對於此研究，對五種胸腺進行切片且根據SOP培養。在切片當天，製備第一、中間及最後一個切片用於免疫組織化學。將各胸腺之剩餘部分切片且在6孔盤中培養。各胸腺指定用於以下時間點中之一者：基線（第0天）、第5天、第9天、第12天及第21天。參見第0天胸腺切片之圖7、第5天切片之圖8、第12天切片之圖9及第21天切片之圖10。

來自各胸腺之切片總數在21至62個切片範圍內。按照上文概述之程序培養切片，每天更換培養基。將切片提交用於病理學實驗室中之H&E染色且分析一致性、效力及生存力。此研究中之所有切片符合組織學測試的釋放驗收準則，亦即：對在第5至9天分散於整個組織中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域；至少1種所鑑別之胸腺小體；在整個組織中分散之CK14染色；及觀測到的完整細胞核。

除評定各切片是否符合釋放驗收準則以外，病理學家對各H&E及AE1/AE3載玻片進行更詳細的審查。注意到以下觀測結果。

如上文所描述，來源於相同供體胸腺且在相同時間點測試之所有切片與皮質及髓質、殘餘胸腺細胞及/或壞死之相對量之變化類似地符合彼時間點的驗收準則。

注意到的差異為相對尺寸、形狀、胸腺皮質與髓質之相對含量、壞死量、胸腺上皮細胞之凝聚及殘餘胸腺細胞數目。

另外，在不同時間點測試之來自不同供體之批次亦定性地彼此類似。觀測到之差異與壞死量（隨著培養時間增加而增加）及殘餘胸腺細胞數目（其隨著培養時間增加而減少）相關。

任一個切片之組織學檢查產生關於整個批次之可接受性的相同結論。基於此等觀測結果，來自胸腺之任一切片的相關特徵反映整個胸腺之彼等特徵。另外，組織切片在第5天之組織學外觀反映在較晚時間點中之每一者（第9天、第12天及第21天）觀測到的情況，但在較晚時間點處觀測到更多壞死。圖11為展示第0天至第21天，如藉由抗體AE1/AE3所評定之上皮網路之相似性的良好實例。

實例3：胸腺組織強制降解研究.

在此研究中，處理胸腺組織切片以產生視為降解或無法存活的組織切片。三個胸腺用於此等實驗。對照樣品取自各胸腺。測試表7中呈現之處理條件。 表7：強制降解處理條件

條件	處理持續時間
對照	未處理
熱衝擊，55℃	4小時
冷凍/解凍，-20℃/環境	4小時
室溫，20-24℃（在BSC中培養）	24小時
脫水（在培養基之不存在下培養）	24小時
48小時
營養耗盡，（在生理鹽水中培養）	24小時
48小時
滲透壓變化，（在10× PBS中培養）	24小時
DMSO暴露，（在含1% DMSO之TOM中培養）	24小時

藉由將含有切片之10 cm培養皿置放於Ziploc袋中，且置放於55℃水浴中來實現熱衝擊。培養盤靜置在支撐物上且未浸沒。藉由將10 cm培養皿置放至-20℃冷凍器中4小時，隨後在環境下解凍來實現冷凍/解凍。

在培養第5天及第9天測試樣品之組織學。亦在第21天測試一些樣品。此研究中之所有切片符合組織學測試的釋放驗收準則，亦即：對在第5至9天分散於整個組織中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域；至少1種所鑑別之胸腺小體；在整個組織中分散之CK14染色；及觀測到的完整細胞核。

除評定各切片是否符合釋放驗收準則以外，病理學家對各載玻片進行更詳細的審查。注意到以下觀測結果。

暴露於冷凍/解凍或10× PBS之樣品展示大部分壞死，但一些細胞仍呈現完整且符合生存力之組織學標準。參見圖12，暴露於10× PBS之實例。

保持在室溫下、經脫水、在生理鹽水或1% DMSO中培育或經受熱衝擊之切片展示較小程度之組織學變化。

對於對照樣品，病理學家注意以下觀測結果。

胸腺細胞隨著培養胸腺組織而逐漸地損失。然而，死細胞可能由於不能募集吞噬細胞來清除其而長期保留於所培養之胸腺中。經歷凋亡細胞死亡之細胞的細胞核最初凝聚且用蘇木精染料染色更深（藍色）。因為此等細胞耗乏其能量但不經吞噬，所以其失去其膜完整性且變得壞死。核溶解（壞死細胞中細胞核之溶解）通常在活體內2至3天內發生，但似乎在胸腺培養期間更緩慢地發生。因此，發現壞死細胞碎片之大嗜伊紅血球（粉紅色）擴增尋常，其中胸腺細胞核已經歷核溶解。一些死胸腺細胞保留其細胞核，與活細胞之細胞核相比，其具有粗糙的邊緣及改變之染色特徵。

隨著胸腺細胞自組織耗乏，胸腺上皮細胞變得更可見。三維胸腺上皮（TE）網路通常在切片中經由連接之上皮細胞及/或（看起來）分散的TE細胞（其連接在所檢查之切片中不明顯）淺色及花邊配置展現。隨著胸腺細胞在培養期間損失，三維網路收縮。此引起殘餘上皮細胞凝聚，使得囊下皮質上皮層變得較厚且髓質TE細胞變得更密封。活TE細胞之細胞核通常為橢圓形，其大於胸腺細胞之細胞核，且具有由蘇木精（藍色）染料所勾勒之清晰界定之核膜，以及一或多種核仁。此等TE細胞核通常看起來「開放」，意謂其不會經蘇木精染成深色。此與其存活及代謝活性之解釋擬合，此係因為活性染色體（「真染色質」）無法結合蘇木精染料。在許多TE細胞中存在核仁（其為核糖體合成位點）進一步證實其為活的且具有代謝活性。圖8、圖9及圖10分別展示第5天、第12天及第21天之對照切片之典型組織學外觀。

對於包括室溫、脫水、1% DMSO及熱衝擊之處理條件，病理學家指示切片之外觀與對照之彼等外觀無顯著不同。對於熱衝擊樣品，病理學家指出，熱處理可藉由凝聚防止進一步降解之蛋白質而使細胞「固定」。熱處理已用作組織（包括胸腺）之固定劑。

圖12A及圖12B描繪在暴露於強制降解條件之後胸腺組織載玻片之組織學。圖10描繪在第21天對照胸腺組織切片之組織學外觀。

強制降解組織之一般組織學外觀在此等時間點類似，但在第21天具有較少殘餘胸腺細胞（圖12B）。髓質區域中代表性胸腺小體均藉由圖12B中之箭頭指示。代表性呈現活力的胸腺上皮細胞藉由圖12A及圖12B中之箭頭指示。展示於圖12B中之皮質區域在第21天幾乎完全由壞死淋巴球組成。左下方之條形表示100 μm。

實例4：胸腺組織原料藥批次分析

10批胸腺組織之批次分析資料展示於下表8中。 表8

批次	製造年份	新進胸腺重量（g）	給予患者之最終劑量（mm 2/m 2）	對RVT-802 a進行之測試
外觀 b	組織學 c	內毒素	無菌性 d	黴漿菌 d	革蘭氏染色
MLM428	2016	4.97	8,034	通過	通過	＜ 0.500 EU/mL	未生長	未生長	陰性
MLM434	2016	7.48	9,110	通過	通過	＜ 0.500 EU/mL	未生長	未生長	陰性
MLM435	2016	27.74	7,104	通過	通過	＜ 0.500 EU/mL	未生長	未生長	陰性
MLM437	2016	8.99	9,884	通過	通過	＜ 0.500 EU/mL	未生長	未生長	陰性
MLM438	2017	10.68	19,134	通過	通過	＜ 0.500 EU/mL	未生長	未生長	陰性
MLM444	2017	10.51	19,402	通過	通過	＜ 0.500 EU/mL	未生長	未生長	陰性
MLM447	2017	5.95	8,459	通過	通過	＜ 0.500 EU/mL	未生長	未生長	陰性
MLM449	2017	7.81	9.260	通過	通過	＜ 0.500 EU/mL	未生長	未生長	陰性
MLM450	2017	12.99	17,128	通過	通過	＜ 0.500 EU/mL	未生長	未生長	陰性
MLM452	2017	7.61	16,802	通過	通過	＜ 0.500 EU/mL	未生長	未生長	陰性

關鍵： (a) 根據製造時在適當位置之說明書測試此等批次。此表中呈現之原料藥測試結果亦表示最終藥品測試結果。 (b)                外觀規格未證明對容器之篡改或損壞。 (c) 組織學分析用於一致性及效力兩者。組織學規格（在第5天至第9天之間測試）如下： (d)                對整個組織中所分散之角蛋白呈陽性的區域。 i.                 至少1種所鑑別之胸腺小體 ii.              分散於整個組織中之CK14染色 iii.            觀測到的完整細胞核 iv.            在第1、7及14天收集無菌性及黴漿菌樣品。

關於56個臨床胸腺、8個用於胸腺內可變性、胸腺間可變性及時程測試之胸腺及3個經歷強制降解之胸腺的資料用於產生當前對照文庫。文庫中之強制降解樣品（陰性對照）為藉由暴露於冷凍/解凍或10× PBS而經歷降解之樣品。全資料集產生14個不同叢集。所有強制降解樣品聚集在一起且無臨床樣品或表徵樣品與強制降解樣品聚集在一起。

實例5.

實例5之整體實驗設計描繪於圖20中。呈現手術程序及治療時程之示意性圖示。以下圖式及大部分文本來自準備提交公開案之手稿：Kwun, J.等人,《JCI洞察》2020年6月4日;5(11)。

實驗設計之示意圖描繪原生T細胞重建、胸腺生成及由CTT手術插入誘導之供體特異性耐受。在心臟移植及CTT手術插入之前，所有路易斯（LW）大鼠經胸腺切除且經由抗CD5 mAb耗乏T細胞。將來自F1（LWxDA）大鼠之CTT及來自DA大鼠之心臟移植至胸腺切除之LW接受者中。在移植之後經由滲透泵給予環孢素（CsA）四個月。在CsA中斷之後，將第三方BN心臟移植至頸部中2至3個月。除其未接受CTT手術插入之外，對照大鼠經歷相同程序。

如下文所描述，實例5表明植入免疫功能不全大鼠模型中之CTT可誘導對移植實體器官之耐受性。吾等在血管化錯配DA心臟移植至路易斯大鼠中之情況下進行單倍匹配F1（Lewis × Dark Agouti，LWxDA）CTT之植入體（如下文所描述培養）。

在CTT植入前，接受者經胸腺切除且T細胞耗乏。

在心臟移植當天起，投與環孢素4個月。對照組未接受CTT之植入體。在中止免疫抑制之後兩個月，植入CTT之接受者顯示周邊血液中原生CD4（CD62L+CD45RC+）T細胞之再生；對照大鼠無一者（圖23）。即使在開發近期胸腺移植物CD4（CD90+CD45RC+）T細胞之後，移植有CTT之接受者仍未排斥DA心臟同種異體移植物（圖25）。由於缺乏功能性T細胞，對照未排斥DA移植物（圖25）。

為了證實供體特異性無反應，在初始錯配DA心臟移植後第180天移植MHC錯配挪威棕色大鼠（Brown Norway；BN）心臟。具有CTT之F1（LWxDA）移植之LW大鼠迅速排斥第三方BN心臟（平均排斥時間，10d；n=5）（圖27）。對照未排斥第三方心臟(n=5)。CTT之接受者能夠針對第三方BN供體產生抗體，但不針對顯示體液供體特異性耐受之DA胸腺供體產生抗體（圖32A）。在屍檢時移植之CTT的免疫組織化學展示功能性胸腺組織（圖24）。總之，給予路易斯大鼠之F1（LWxDA）CTT引起對供體胸腺中表現之同種異體DA MHC之特異性耐受，在停用所有免疫抑制之後導致DA心臟移植之長期存活。

材料及方法. 動物模型

在此實例5中，自3日齡F1（Lewis × Dark Agouti幼鼠）採集同種異體CTT且培養（圖17A及17B），如下文所描述，且接著以與治療患有無胸腺症cDGA之人類嬰兒相當的方式植入胸腺切除之路易斯（RT RT 1 ^l）接受者大鼠中，如先前所描述。（Markert, ML等人, 2008；Market, ML等人, 2010）。

路易斯（RT-1l）及BN（室溫-1n）大鼠係購自查士利華（Charles River）。DA（RT-1av1）大鼠係購自Envigo。F1（LEW/DA；RT-1l/av1）由在實驗室動物資源設施之杜克育種核心部門之方案工作人員培育。路易斯接受者接受胸腺切除術，如Rendell VR, Giamberardino C, Li J, Markert ML及Brennan TV, 2014, 「《使用非侵入性氣管內插管之成人大鼠的完全胸腺切除術（Complete thymectomy in adult rats with non-invasive endotracheal intubation）》」. 《視覺試驗雜誌（ J Vis Exp）》(94)中所描述。

簡言之，用鈍鑷子分離頜下腺體及胸骨舌骨肌以暴露上覆氣管之組織。在胸骨柄中製造1-cm至1.5-cm切口。7 cm阿爾姆斯型牽開器用於牽開胸骨柄及兩半胸骨舌骨肌以暴露胸腺。胸腺用鈍鑷子夾住且取出。用單個3至4-0絲質縫合線閉合胸骨之切割端。將兩滴2.5 mg/ml布比卡因（bupivacaine）施加於切口上且用三個或四個9-mm創緣夾閉合皮膚外層。

所有胸腺切除之大鼠維持含有Septra（PMI Nutrition International, LLC）之飲食。為了活體內誘導T細胞耗乏，在胸腺切除術之後第0、5及10天腹膜內投與1mg抗CD5 mAb（OX19；BioXCell，NH）且相對於心臟移植之第0天（心臟移植及CTT時間點）至4個月用0.25 mg/kg/d環孢素泵進行抑制。根據杜克機構動物研究倫理委員會之準則及順應性使用且保持所有大鼠。 活體外胸腺培養及 CTT

無菌採集三日齡新生F1（LEW/DA）大鼠幼鼠之胸腺，沿經度天然接縫切割成四片，且轉移至具有TOM培養基之組織培養皿中的無菌硝化纖維素過濾器（MF-Millipore，密理博西格瑪（Millipore Sigma））上（圖17B）。在含5% CO ₂之CO ₂培育箱中在37℃下培養胸腺組織持續所需時間長度（5至7天）。每天更換培養基。胸腺器官培養基（TOM）由86.5%之HAMS F12（生命科技公司）；25mM之Hepes（生命科技公司）；2mM之L-麩醯胺酸（生命科技公司）；10%之胎牛血清（生命科技公司）；及1×之青黴素-鏈黴素（生命科技公司）構成。在移植當天，胸腺片用新鮮培養基沖洗且用一根固定縫合線（10-0單絲）移植在路易斯大鼠之腎囊下。參看圖17C。所有操作均在無菌條件下在生物安全櫃中進行。 腹部及頸部心臟移植

將全MHC錯配DA（RT-1 ^av1）供體心臟移植至胸腺切除之路易斯（RT-1 ^l）接受者中。使用由以下描述之方法的改良技術進行腹部心臟移植：Schmid C, Binder J, Heemann U及Tilney NL, 1994, 「《大鼠中之成功異位心臟移植（Successful heterotopic heart transplantation in rat》」, 《顯微手術（ Microsurgery）》15(4):279-281。

簡言之，在Euro-Collins溶液中短期冰缺血之後，將供體心臟移植至接受者之腹腔中。使用9/0不可吸收單絲縫合線，將供體肺動脈及主動脈與接受者下腔靜脈及降主動脈以端側方式吻合作為循環之流入及流出血管。經由滲透泵（2ML4型，Alzet）給予環孢素A（CsA）。接受者亦在使用滲透泵進行胸腺移植之後接受環孢素（CsA），約2.5毫克/公斤/天。當測試組具有超過10%之原生T細胞時，CsA在胸腺移植之後4個月中斷。泵以無菌方式裝載且以手術方式皮下插入至接受者之中背側區域。每月更換滲透泵持續4個月。對於完全MHC錯配BN（RT-1 ⁿ）第三方心臟移植至帶有DA心臟之路易斯接受者，以改良方式使用由以下描述的頸部血管化心臟移植方法：Heron等人（Heron I., 1971, 「《用於家兔及大鼠之輔助頸部心臟移植的技術（A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats）》」, 《微生物病理學學報（ Acta Pathol Microbiol Scand A）》79(4):366-372）。

在第6至7個月時，第3方BN心臟移植於頸部中。簡言之，經由自下頜骨至劍突之縱向切口將第三方心臟移植至頸部區域之右側。使供體肺動脈與頸外靜脈端對端吻合，且藉由套袖技術使主動脈與右側頸總動脈吻合。通過每日觸診監測移植物，然後在處死時通過剖腹術確認移植物。在排斥反應當天（停止搏動）或指定時間點處死動物。 流動式細胞量測分析及監測 DSA

外周血液係獲自顱腔靜脈且用抗體染色。為了分析原生及近期胸腺移植物，吾等使用抗大鼠CD3 APC（BD生物科學（BD Biosciences））；抗大鼠CD4 APC-Cy7（Biolegend）；抗大鼠CD8a V450（BD）；抗大鼠CD45 PE-Cy7（BD）；抗大鼠CD45RC-PE（BD）；抗大鼠CD62L FITC（BD）；及抗大鼠CD90 BV 510（Biolegend）之組合。為了評定T、B及NK細胞之百分比，吾等使用抗大鼠TCR FITC（BD）；抗大鼠CD4 APC-Cy7（Biolegend）；抗大鼠CD8a V450（BD）；抗大鼠CD45 PE-Cy7（BD）；抗大鼠CD45RA PE（英傑）；抗大鼠NKR-P1A-APC（英傑）之組合。對於宿主與供體鑑別，吾等使用抗大鼠TCR APC（Biolegend）、抗大鼠CD45 PE-Cy7（BD）；MHC I類RT1Aa（聖塔克魯斯生物技術（Santa Cruz Biotechnology））之組合。吾等亦使用二級山羊抗小鼠IgG（英傑）用於非結合MHC I類RT1Aa。藉由來自連續收集之接受者血清樣品與DA供體或BN第三方大鼠之流動交叉匹配來評定供體特異性同種抗體（DSA）。將FITC結合之泛大鼠免疫球蛋白抗體添加至樣品中且在洗滌之後培育。T細胞用APC結合抗CD3染色。在LSR fortessa（貝克曼庫爾特實驗室（Beckman Coulter））上分析樣品。 屍檢

當測試組排斥頸部BN心臟時，在CTT之後8個月在屍檢時評估胸腺移植物及所有心臟。如所預測，不表現DA MHC之接受者衍生之T細胞出現於胸腺移植接受者之周邊血液中（圖21）。 組織學、免疫組織化學（ IHC ）及形態分析

將來自腎囊下之所有經培養胸腺及CTT樣品冷凍於OCT（最佳切割化合物；Tissue Tek）中。對照胸腺組織係獲自新生至5日齡大鼠幼鼠。對四至五mm切片染色CD3（多株；Dako）、Ki-67（純系：SP6；Thermo）、CK（多株；英傑）。使用Olympus DP-70數位攝影機系統之Olympus Vanox AH-3顯微鏡獲得IHC影像。使移植之心臟自中心室水平至底部進行連續切片（5µm）。進行H&E染色用於常規檢查及排斥分級。用多株抗CD3（Dako）染色評估移植物浸潤T細胞。用Aperio ScanScope XT（阿普瑞奧技術公司, Vista, CA）掃描移植物之整個載玻片。 統計分析

藉由格拉夫帕德稜柱（GraphPad Prism）（格拉夫帕德軟體7.0，聖地亞哥，加利福尼亞州）分析實驗結果。移植物存活率及斯圖登氏t檢驗（student t-test）或曼-惠特尼U檢驗（Mann-Whitney U test）之差異的對數秩測試用於其他資料。所有資料均呈現為平均值± SD。小於0.05之 p值視為統計學上顯著的。

結果

組織學分析（圖18C及圖18D（100x放大倍數）及圖19C及圖19D（600×放大倍數）展示培養之後胸腺中之Ki67+、CD3+細胞減少，類似於培養用於患者之胸腺組織之後所見的變化（Markert ML等人, 2008, 「《使用同種異體移植活組織檢查以評定胸腺移植之後的胸腺生成》」《免疫學雜誌》180(9):6354-6364）。如在經培養人類胸腺中，將胸腺上皮細胞（TEC）之網路保存在基於細胞角蛋白（CK）染色之大鼠經培養胸腺組織中（圖18B（100×放大倍數）及圖19B（600×放大倍數））。

如所預測，不表現DA MHC之接受者衍生之T細胞出現於胸腺植入接受者之外周血液中（圖21）。在CTT植入之後，在第26、55、97及253天，在圖21之右下方象限中看到逐漸再生之接受者型T細胞。 移植之同種異體胸腺組織的免疫組織化學分析 .

T細胞耗乏及胸腺及心臟移植之後的循環T細胞再生描繪於圖23中。所有動物在T細胞耗乏之後展示循環T細胞之顯著減少。具有CTT插入（藍色/虛線）之心臟同種異體移植接受者顯示循環T細胞之逐漸再生。未插入CTT之動物亦展示一定程度之循環T細胞（紅色/虛線）。然而，在具有CTT插入之動物中，原生及近期胸腺移植物CD4及CD8 T細胞顯著增加(p＜0.01)，而對照動物未展示循環原生或RTE CD4及CD8T細胞。

在植入後8.5個月移植之所植入胸腺展示陽性細胞角蛋白染色（圖22A），以及類似於天然胸腺之T細胞染色（圖22B）。原始放大倍數乘以400。

插入CTT之動物顯示，原生（CD62L+CD45RC+）CD4及CD8 T細胞以及外周血液中之近期胸腺移植（RTE）T細胞之再生顯著增加，而無胸腺症植入之對照組展示低含量之循環原生CD4及CD8 T細胞且未展示循環RTE CD4及CD8 T細胞（圖23）。在植入之前各組之間的總循環CD3 T細胞數目無顯著不同。如所預期，與無CTT植入之對照動物相比，具有CTT植入之LW接受者展示數目顯著增加之循環CD4及CD8 T細胞（圖23）。

在第180天在心臟同種異體移植接受者之接受者中的腎囊下所植入之經培養胸腺組織描繪於圖24中。

組織學展示與腎組織不同之結構（原始放大倍數，×20）。移植之培養的胸腺組織展示正常胸腺結構（H&E）、活T細胞（CD3）、T細胞增殖（Ki67）及在上皮細胞上具有花邊圖案（細胞角蛋白）之胸腺小體形成（黑色箭頭），從而證實具有胸腺生成之胸腺的生存力（圖24B）。原始放大倍數，×200。（資料呈現為平均±SD；n=8-9隻動物/組；斯圖登氏t檢驗，*P＜0.05；**P＜ 0.01；***P＜0.001，****P＜0.0001；NS不顯著（p大於0.05）。

另外，在第180天移植之植入CTT的免疫組織學分析展示正常胸腺組織學、活T細胞（CD3）、T細胞增殖（Ki67）及來自手術插入CTT之TEC上的具有胸腺小體形成（箭頭）之CK之花邊圖案（圖24B）。此等觀測結果證實接受同種異體心臟移植之動物中之移植胸腺的生存力及功能（胸腺生成）。

總之，移植CTT之大鼠證明在心臟同種異體移植接受者中伴有原生T細胞發育之胸腺生成。

預期對DA供體有反應性之T細胞將不會發育，因為T細胞在表現DA以及LW之CTT中發育。

評估DA心臟之排斥跡象。   圖25展示具有DA心臟移植且無需任何免疫抑制處理之LW大鼠在10天內排斥DA心臟移植物（DA對照，空心方塊）。然而，即使在發育RTE（CD90 ⁺CD45RC ⁺）T細胞之後，具有以手術方式插入之CTT之LW接受者仍未排斥（未停止搏動）DA心臟同種異體移植物（n=8，實心三角形）。出乎意料地，無CTT插入之LW對照動物亦不排斥DA心臟移植物（n=9，倒置實心三角形）。兩組在整個研究期間（第180天）展示良好搏動品質。由於連續移植物搏動不一定意味著排斥反應不存在，所以在停止免疫抑制之後兩個月（亦即，在第3方BN頸部心臟移植之前）處死兩隻接受者大鼠以證實不存在排斥反應。來自兩隻動物之移植心臟同種異體移植物（DA心臟）展示最小單核細胞浸潤（圖26A，具有CTT插入；及圖26B，無CTT插入），無排斥反應跡象，由2004年國際心臟移植協會（ISHLT）分級之圖26C。

卡本-麥爾（Kaplan-Meier）存活曲線（圖25）展示相比於具有無任何免疫抑制（DA對照）之DA心臟移植的LW大鼠，具有或不具有CTT之動物及同基因型對照（LW大鼠中之LW心臟）的移植物存活顯著延長。在第180天來自具有或不具有CTT之動物的所移植之移植物之代表性掃描影像展示於圖26A及圖26B中。影像由整個載玻片掃描調適。

ISHLT定級展示來自具有CTT之接受者與無CTT之接受者的心臟同種異體移植物之間無排斥分級差異（每組n=3-4）（圖26C）。曼-惠特尼U檢驗，*P＜0.05；NS，不顯著（p大於0.05）。

基於CTT之後原生T細胞重建，吾等咸信具有CTT之動物失去其供體反應性T細胞譜系，而無胸腺症植入之動物未完全重建其T細胞群體（一般的低反應性）。 對第三方血管化心臟移植之同種異體反應性

為了證實實現與一般反應性相對之供體特異性無反應性（耐受性），在DA心臟移植後6至7個月（第180至210天）在兩組動物中進行額外的完全MHC錯配之BN心臟移植。

插入CTT之LW大鼠（實心三角形，圖27）快速排斥（移植物搏動停止）第三方BN心臟（n=5，中位數存活時間（MST）=10±1.0天）。然而，未插入CTT之對照LW動物不排斥第三方心臟（n=6，MST小於或等於38.5±8.9天），可能歸因於缺乏任何同種異體反應性T細胞。

根據此第三方心臟排斥之缺乏，組織學分析證實具有CTT插入之動物（倒置實心三角形，圖27）展示心臟同種異體移植物中單核細胞浸潤增加（圖28A），而未插入CTT之動物展示原始BN心臟同種異體移植物（圖28B）。具有CTT之接受者快速排斥BN心臟（MST=10±1.0天）（實心方塊，圖29），而無CTT之接受者未排斥第三方BN心臟（虛線三角形，圖29）。BN對照（實心圓，圖29）展示LW大鼠對BN心臟之排斥反應。同基因型對照（空心圓，圖29）展示LW大鼠缺乏對LW心臟之排斥反應。卡本-麥爾存活曲線（圖27）展示移植物存活之顯著不同。在排斥反應時或移植後46天，所移植的BN心臟移植物之代表性掃描影像分別展示於圖28A及圖28B中。來自插入CTT之動物之BN心臟移植物展示嚴重的單核細胞浸潤（圖28A），而來自未插入CTT之動物之BN心臟移植物未展示排斥跡象（圖28B）。影像由整個載玻片掃描調適。

來自插入CTT（實心方塊，圖29）之大鼠的移植的BN心臟之組織學分析（ISHLT分級）展示相比於未插入CTT（加陰影三角形，圖29）之同基因型對照或大鼠，具有顯著增加之發炎性細胞浸潤的3R級排斥反應。ISHLT分級展示，相比於來自無CTT之動物的BN心臟，來自具有CTT之動物的BN心臟顯著較高的排斥分級（每組n=3-5）。曼-惠特尼U檢驗，*P＜0.05；**P＜0.01；NS，不顯著（p大於0.05）。

亦值得注意的係，插入CTT之接受者中之頸部BN心臟極大地增大（圖30A），而腹部DA心臟小於天然心臟（圖30A）。與來自具有CTT之接受者的BN心臟相比，來自未插入CTT之接受者的BN心臟並未展示任何尺寸增大（圖30B）。 第三方心臟而非共有 CTT 之 DA MHC 之 DA 心臟中的選擇性 T 細胞浸潤 .

兩種習知方式用於在此大鼠心臟移植模型中界定移植排斥反應：心臟跳動/停止量測及ISHLT人類分級系統。前者對於低級排斥反應不敏感，而後者對於高級排斥反應不敏感。因此，在第180天3隻大鼠之DA心臟及在第7至8個月處死時5隻大鼠之BN心臟中量測發炎性細胞浸潤。因此，在第180天3隻大鼠之DA心臟及在第7至8個月處死時5隻大鼠中之BN心臟中量測發炎性細胞浸潤。

用T細胞耗乏、手術插入CTT及投與CsA四個月處理之大鼠在T細胞再生之後的DA心臟中未展示增加之發炎性細胞浸潤水準（圖31A）。DA對照移植物（在無免疫抑制之LW大鼠中）展示，相比於具有CTT或不具有CTT之大鼠中之DA心臟中的免疫細胞之浸潤，DA心臟中之免疫細胞之移植物浸潤顯著增加。插入CTT之動物展示第三方心臟同種異體移植物（BN心臟）中大量發炎性細胞浸潤（圖31B）。與來自無CTT之動物之BN移植物中的彼等發炎性細胞浸潤相比，BN對照移植物（在無免疫抑制之LW大鼠中）及來自具有CTT之接受者的BN移植物展示顯著升高的發炎性細胞浸潤。未插入CTT之大鼠由於其免疫功能不全而在BN心臟中未展示浸潤（圖31B，加陰影三角形）。

用免疫組織化學評估T細胞浸潤且證實BN中之選擇性T細胞浸潤（右圖，圖31C）但非插入CTT之動物的DA（中部圖，圖31C）心臟且在未插入CTT之動物得兩個心臟中缺乏T細胞浸潤（圖31D）。在BN心臟排斥時，用天然心臟採集來自DA及BN大鼠之心臟同種異體移植物。大體上，天然心臟及DA心臟（POD 196）未展示T細胞之顯著增加，而BN心臟（POD14）展示在插入CTT之接受者中大量的T細胞。影像由整個載玻片掃描調適。每組總共3-5隻動物進行分析；斯圖登氏t檢驗，*P＜0.05；**P＜ 0.01；***P＜0.001，****P＜0.0001；NS，不顯著（p大於0.05）。

此等資料證實對於接受CTT之組，僅在第三方BN移植物中發生T細胞浸潤，但不在與植入之胸腺共享MHC（DA）之移植物中發生，此可能係由於缺乏針對（DA心臟）供體抗原之T細胞譜系（藉由陰性選擇）。 胸腺植入後對供體抗原之體液反應

評估抗供體抗體反應以確定在胸腺切除之LW大鼠中所指出之同種異體T細胞無反應性，隨後LWxDA移植及CTT之手術插入是否與針對供體DA MHC之體液耐受性相關。收集連續收集之接受者血清樣品且與來自DA及BN大鼠之PBMC進行流動交叉匹配。接受DA或BN心臟移植而無免疫抑制之動物產生針對其供體之抗體（分別為DA或BN）。具有同基因型心臟同種異體移植物之動物不產生針對DA或BN MHC之抗體，如圖32A中所報導（在左側行中水平加陰影峰，DA在頂部，且BN在底部）。藉由T細胞流動交叉配對量測之移植後供體特異性同種抗體（抗DA及抗BN抗體）之代表性直方圖展示於圖32A中。具有或不具有CTT之接受者不產生任何針對DA抗原之抗體（圖32A中頂列、中間及右側行），而具有CTT之動物能夠產生針對BN抗原之抗體（下部列，中間圖，圖32A）。將來自無免疫抑制之DA心臟移植之接受者及來自無免疫抑制之BN心臟移植之LW接受者的血清樣品分別用作抗DA（頂列、左圖、粗線）或抗BN抗體（底部列、左圖、虛線）之陽性對照（DA對照及BN對照）。

有趣地，與T細胞低反應性類似，在有或無CTT之動物中未偵測到抗DA Ab（圖32B）。在插入CTT之具有LWxDA之動物中容易地偵測到抗BN Ab，但未在未插入CTT之動物中偵測到，p＜0.01（圖32C）。無CTT之動物一般為免疫缺乏的。具有CTT之動物對DA具有特異性耐受。

總之，胸腺共移植導致對供體胸腺中表現之同種異體DA MHC的特異性耐受，且因此經由預防供體特異性抗DA T細胞譜系之發育以及預防供體（DA）-特異性體液反應而導致DA心臟移植之長期存活。藉由第三方BN心臟之快速排斥以及針對BN供體細胞之同種異體抗體反應，在此等大鼠中證實免疫能力。

對上文所描述之處理的進一步支持可自患有DiGeorge氏畸形患者之臨床經驗推導出。

患者1為出生時患有完全DiGeorge氏畸形的孩童。其在出生時無T細胞。患者1之主要問題為嚴重的副甲狀腺低能症，導致許多人因低鈣血症而住院。患者1在同一天接受經培養胸腺組織移植體（CTT）及親本副甲狀腺移植體。在小型臨床試驗中，存在三名其他患者接受胸腺加親本副甲狀腺。患者1在4個月生命時接受兩種移植體。儘管患者1不具有T細胞，但在根據方案在移植之前給予患者1用於免疫抑制之RATGAM。未給予其他免疫抑制。患者1對有絲分裂原產生原生T細胞及正常增殖T細胞反應。在試驗中接受胸腺及副甲狀腺之所有四名患者均產生正常副甲狀腺激素含量。患者1為能夠長期（10年）停止補充鈣之唯一受試者。在三名其他患者中，一名在一年之前死於肺部問題，且其他兩名患有完全DiGeorge氏畸形，必須恢復鈣補充約一年。患者1為在所有時間點對親本副甲狀腺供體具有陰性混合淋巴球反應（MLR）的唯一受試者。其他三名受試者具有陽性MLR，其始於其第一次分析。

患者1維持副甲狀腺功能之可能解釋為患者1之副甲狀腺供體具有匹配接受者HLA-II類對偶基因（下表9中之「*」）或胸腺供體HLA-II類對偶基因（下表9中之「 ^ǂ」）的HLA-II類等位基因。

患者1中之CLP發育為胸腺中之胸腺細胞。

來自患者1之樹突狀細胞遷移至胸腺且缺失與患者1 DC上之MHC緊密結合之T細胞。對下表9中標記為「*」之對偶基因存在耐受性。參見表9。

胸腺供體胸腺上皮細胞亦缺失緊密結合至其之胸腺細胞（下表9中標記為「 ^ǂ」）。此為對下表9中標記為「 ^ǂ」的對偶基因之耐受性機制。 表9

	HLA-A	HLA-B	HLA-C	HLA-DRB1	HLA-DQB1	HLA-DQA1	HLA-DPB1
患者1	24:02*	08:01	07:02	03:01	02:01	nt	04:01
	02:01*	44:05*	02:02*	16:01*	05:02*	Nt*	04:02*
副甲狀腺	02:01*	44:05*	02:02*	16:01*	05:02/05*	01:02*	04:02*
供體	24:01*	35:03	04:01	11:04 ǂ	03:01/19 ǂ	05:05/09 ǂ	04:02 ǂ
胸腺供體	02:01*	44:03	02:02	11:01 ǂ	03:01 ǂ	05:05/09 ǂ	04:01 ǂ
	32:01	40:02	14:03	04:05	03:03	03:02/03	02:01

值得注意的係，吾人可看到，副甲狀腺供體中存在一個HLAB及一個HLAC對偶基因不與接受者匹配，亦不與胸腺供體匹配。吾等未理解副甲狀腺為何不被排斥。然而，在10年過去之後，給予兒童活麻疹/腮腺炎/風疹疫苗。副甲狀腺功能在兩週內破壞且患者1恢復補鈣。

吾等得出結論，活疫苗活化患者1中之CD8 T細胞。三分之一的CD8 T細胞具有固有同種異體反應性。同種異體反應性CD8 T細胞針對副甲狀腺供體中之錯配HLA-B及C對偶基因（表9中之較大粗體HLA-B及HLA-C對偶基因）反應。

利用來自此患者之資料，顯而易見需要HLA-I類與HLA-II類之匹配來誘導長期耐受性。接受者對副甲狀腺供體中之DPB1*04:02對偶基因具有耐受性，因為患者表現DPB1*0402。患者之樹突狀細胞進入胸腺且缺失過於緊密地結合至DPB1*0402之任何細胞。接受者不排斥副甲狀腺，因為DQA1對偶基因DQA1*05:05/08在胸腺中表現。有可能地，患者自母體遺傳DQA1*01:02對偶基因且因此兒童耐受該特異性。孩童並未針對副甲狀腺供體中之DRB!*11:04對偶基因起反應，因為其與母體中之111:01對偶基因緊密相關。   關於I類，B*35:03及C*04:01對偶基因，胸腺未缺失對彼等對偶基因具反應性之胸腺細胞，因為其不在接受者中、不在胸腺供體中表現。在接受植入體之後十年，孩童接受MMR疫苗。麻疹為極強的刺激物。約三分之一的循環T細胞具有固有同種異體反應性。當接受者CD8 T細胞暴露於麻疹疫苗時，其針對副甲狀腺產生反應且快速將其破壞。此患者之時程展示，實體器官接受者中之I類及II類對偶基因兩者必須在接受者中或在胸腺供體中表現，以對實體器官具有耐受性。此孩童茁壯成長，T細胞數目及功能良好且免疫球蛋白含量正常。然而，由於親本副甲狀腺被排斥，因此患者1仍然需要鈣。

實例6. 評估新鮮培養之 NHP 胸腺組織的架構及生存力

為了在非人類靈長類動物（NHP）中研發經培養胸腺組織植入（CTT）平台，切除且培養NHP供體胸腺，且評估正常組織外觀及結構。

方法

胸腺係經由受限的上胸骨切開術自恆河獼猴NHP以手術方式切除，切片且與上文所描述之建立的小兒技術相同地培養。已出於實驗及組織評定目的研發兩個抗體組。包含CD3、CD4、CD8、CD28、CD31、CD45RA及CD197之一組用於經由流式細胞量測術評定血液中近期胸腺移植體（RTE）及原生T細胞之存在（圖36）。包含AE1/AE3（泛細胞角蛋白）、細胞角蛋白（CK）14、Ki-67（增殖）、CD3（T細胞含量）及CCL21（趨化介素產生）之第二抗體組用於如上文及下文實例8及9中所描述獲得之採集的新鮮胸腺、經培養胸腺及胸腺移植物活組織切片 之免疫組織化學（IHC）評定。對新鮮NHP胸腺進行IHC抗體組以記錄組織之適合性。如上文所描述，針對臨床樣品建立之批次釋放準則在植入大腿肌肉之前用於所培養之胸腺組織。如圖33A-J中所示之對接枝胸腺組織的活組織切片之評估亦使用針對臨床樣品確立之準則。

結果

如圖33A-E中所示，新鮮NHP胸腺切片極其類似於新鮮人類胸腺切片。圖33A展示正常NHP胸腺形態：發現密集堆積之皮質胸腺細胞有中心髓質，且較不密集堆積，在中心有胸腺小體。圖33B展示在整個胸腺中對T細胞之CD3染色。活T細胞呈現為棕色環。圖33C展示在髓質中大部分所見之細胞角蛋白作為花邊延伸部分及胸腺小體。細胞角蛋白並未見於新鮮胸腺之皮質中，因為存在許多胸腺細胞。圖33D展示反映皮質中之Ki-67抗原之棕色染色。Ki-67分子指示細胞核增殖。此圖展示皮質中之複製胸腺細胞而在髓質中極少的胸腺細胞之典型外觀。圖33E展示皮質中之CK14及髓質中之較少CK14。圖33F-J中之染色在培養12天後與圖33A-E中之染色顯著不同，且顯著地類似於活體外培養之後人類樣品中之發現。圖33F展示胸腺細胞之顯著損失，其中保留活胸腺上皮細胞。圖33G證實T細胞（CD3+）之顯著耗乏。所靶向之抗原為CD3 ε，即使在T細胞死亡後仍非常穩定。死亡T細胞整個具有CD3染色，而不僅在細胞表面上（其在影像中呈現為環形）。在切片中存在一些活T細胞，但與採集日相比極少。圖33H用AE1/AE3細胞角蛋白抗體染色。細胞角蛋白-陽性上皮細胞可與正常細胞核一起存活。其由於在胸腺中留下極少T細胞而部分凝聚。圖33I用Ki-67染色。此切片中基本上不存在增殖性胸腺細胞。皮質胸腺細胞大部分死亡。圖33J具有活的CK14-陽性上皮細胞。此等上皮細胞之間具有空間以包圍將在CTT之後自骨髓到達之早期胸腺祖細胞。培養12天在用於臨床CTT（12至21天）之範圍內。

實例7. 評估冷凍保存的 NHP 胸腺組織之架構及生存力

對於誘導對所培養胸腺組織之耐受性之臨床應用，需要冷凍保存，以便提供備用胸腺組織。大約一半經培養胸腺冷凍保存以供將來在移植後排斥反應或由用於逆轉心臟排斥反應發作之高劑量類固醇對CTT造成損害之情況下使用。

方法

對於冷凍保存，如實例6中所描述培養NHP胸腺組織。在培養12天後，根據此項技術中之標準方法冷凍保存NHP胸腺組織。在圖34A-P中所展示之實驗中，組織冷凍保存35天，然而，冷凍保存時間可延長至數年。在此實驗中，接著解冷凍保存之組織，福馬林固定且石蠟包埋。使用與實例6中相同的抗體組進行免疫組織化學。

結果圖34A-P中所展示之資料強調培養12天之組織（每個方案允許的最小值；展示於圖34C、圖34G、圖34K及圖34O中）與培養12天且接著冷凍保存35天之組織（展示於圖34D、圖34H、圖34L及圖34P中）之間的重要比較。比較圖34C中之細胞角蛋白與圖34D中之細胞角蛋白展示：圖34C表明比圖34D更花邊的圖案，且圖34D中之細胞角蛋白略微凝聚。圖34G及圖34H中之CK14細胞角蛋白染色非常類似。圖34K及圖34L中之CD3染色亦極其類似。在圖34O及圖34P兩者中不存在Ki-67染色，與圖33I中之發現一致。培養12天之胸腺組織及冷凍保存之胸腺組織兩者均滿足臨床樣品之批次釋放準則。

實例8. 對在無 CMV 之 NHP 模型中成功移植經培養胸腺組織之評定

此等實驗涉及在NHP（恆河獼猴）模型中進行心臟移植及CTT，目標為建立移植心臟之耐受性及實現長期無排斥移植存活率而無需持續的免疫抑制藥物。將最大限度地錯配動物。

方法

作為實驗概述，使用最大限度MHC-錯配之無CMV恆河獼猴。接受者動物（Y）經歷完全胸腺切除術。供體動物（X）供予經培養胸腺組織及置於異位位置之心臟至接受者Y（第一Tx及第二Tx）中。接著停用免疫抑制藥物且供體特異性耐受係藉由i）供體心臟持續跳動，ii）對第三方具有反應性之MLR中之供體的耐受性及iii）來自第3方供體動物Z（第三Tx）之皮膚移植的排斥反應來證明。

所有實驗NHP均為雄性。鑒於常用抗病毒預防性藥物可能干擾隨胸腺生成，使用在加利福尼亞大學戴維斯分校的特定無病原體菌落中培養之CMV血清反應陰性NHP。基於與非人類靈長類動物移植研究有關之杜克大學的其他研究者之經驗，有意義的分析可來自3隻接受者動物。此低數目係因為耐受性應存在於每個接受者動物中（除了技術困難之外）。

在移植之前約一個月，接受者動物在準備最終供體胸腺移植時經由部分胸骨切開術進行完全胸腺切除術。接受者之T細胞用恆河猴特異性抗胸腺細胞球蛋白（rhATG）耗乏。動物完全恢復且經歷每週流式細胞量測術直至外周血液中之RTE不再可偵測到（估計為2至3週），因此表明完全天然胸腺切除術。流式細胞量測術小組鑑別CD4+ RTE，即CD3+、CD4+CD45+CD28+CD95-及CD31+。參考如圖36中所展示之閘控策略。參見以下例示性實驗方案之參考文獻：Markert ML, Sarzotti M, Ozaki DA, Sempowski GD, Rhein ME, Hale LP等人《完全DiGeorge氏症候群中之胸腺移植：對十二名患者之免疫及安全評估（ Thymic transplantation in complete DiGeorge syndrome: Immunologic and safety evaluation in twelve patients）》 .《血液》.2003 ;102:1121 -1130，Markert ML, Alexieff MJ, Li J, Sarzotti M, Ozaki DA, Devlin BH等人《出生後胸腺移植與免疫抑制用於治療DiGeorge氏症候群》 .《血液》. 2004; 104: 2574-2581 ，Markert ML, Devlin BH, McCarthy EA .《胸腺移植》《臨床免疫學》 .2010; 135: 236-246。

選擇攜帶MAMU A01之接受者動物，此係因為存在針對對偶基因之抗體用於流式細胞量測術，從而允許容易區分接受者來源之RTE。供體將不表現MAMU A01，除了接受者中之初始胸腺切除術未完成時；接著原始接受者將變成供體且原始供體將變成接受者。

階段1：請參看圖38，對於在實例8中進行之實驗的詳細概述及時間線。

藉由流式細胞量測術測試來自供體NHP（MAMU-A:01陰性）及接受者NHP（MAMU-A:01陽性）之血液，測定CBC差異（CBC diff）、血液化學及CMV含量。將在對照NHP中進行類似測試。在確認供體及接受者在階段1中彼此具有陽性混合淋巴球反應（MLR）之後，供體NHP將胸腺組織及隨後的心臟供給至單個接受者（參考下文所描述之階段4）。

階段2：如在本說明書中其他地方所描述，在第1週、階段2之第3天，對接受者NHP進行胸腺切除術且培養接受者NHP胸腺12天。接著在培養之第12天冷凍保存接受者CTT。

在階段2期間，每週測定接受者之CMV含量。在第2週取DSA（2 ml）血液樣本以供儲存。在第3週之第1天，在接受者NHP中量測CBC diff。每週在供體NHP中進行流式細胞測量術直至接受者展示無RTE。在階段2之第3週之第1天在接受者NHP中進行流式細胞量測術，以顯示在接受者NHP中無RTE 3。若對RTE呈陽性，則在第4週及第5週內繼續流式細胞量測術（若需要）。同時在供體NHP中確定CBC、含量CMV。亦監測每週CBC差異、CMC含量及流式細胞量測術直至接受者NHP無RTE為止。當未發現RTE時，實驗繼續進行至階段3。

若由於接受者繼續展示近期胸腺移植（RTE）而導致胸腺切除術不充分，則將認為NHP具有不完全胸腺切除術。接受者及供體接著將切換，其中供體為MAMU-A:01陽性且接受者MAMU-A:01陰性。在階段2中，在對照NHP中監測CMV含量。

階段3：階段3開始於每十二小時自階段3之第1週、第1天開始向接受者NHP投與他克莫司。在第3天，對供體進行胸腺切除術。如說明書及先前實例中其他地方所描述，當一半經冷凍保存時，培養移除之供體胸腺持續12天之時段。另一半可培養至第21天，且在階段3中，自培養之第12天至第21天的任何一天植入接受者之四頭肌。

總之，接受者在四頭肌（及隨後心臟移植）中的經培養供體胸腺組織植入之前約一至兩個月經歷天然胸腺切除術。必須藉由外周血液中缺乏近期胸腺移植（RTE）來確認胸腺切除術完成。接受者之免疫抑制藥物最終（在CD4原生T細胞為15%或更大之後）停用，且使用第三方MLR及皮膚移植證實供體特異性耐受，其應顯示在來自胸腺及心臟供體動物之組織之特異性耐受的情況下，針對第三方供體組織之免疫能力。

在整個階段3中之供體NHP中量測化學方法、CMV含量，直至在第4階段發生非存活性心臟移植。在階段3之第1週內，在接受者NHP中進行CBC diff、CMC含量及血液化學。抽取血液樣本用於儲存。在第2週之第4天進行流式細胞量測術以記錄T細胞耗乏。在階段3之第2週內量測CBC diff、他克莫司含量及CMV含量。

在整個階段3及4中，定期在對照NHP中監測流式細胞量測術、CBC diff及CMV含量，直至在階段4之第10週內獲得皮膚移植物。

在階段3、第3週之第1天，接著將約一半CTT植入接受者NHP之四頭肌中且剩餘部分冷凍保存。根據人類方案進行該程序。Markert ML, Devlin BH.《胸腺重建》.參見：Rich RR, Shearer WT, Fleischer T, Schroeder HW, Weyand CM, Frew A編.《臨床免疫學第3版》.愛丁堡：愛思唯爾（Edinburgh: Elsevier）; 第2008頁.第1253-1261頁。亦進行皮膚活組織檢查。在階段3中，在第10週之第3天，進行CTT植入體之活組織檢查，且在第一次CTT植入之後約7週，接著將Cryo-CTT植入另一支腿之四頭肌肉中，以增加移植進展至評估冷凍保存之CTT效力的可能性。在植入之後約6週對新鮮培養及冷凍保存的植入胸腺組織進行活組織檢查以驗證生存力及正常組織架構。

接受者NHP自第1週之第1天開始投與他克莫司BID。

ATG在階段3中、第2週之第1天在接受者中開始。在第2週之第3天，進行流式細胞量測術以展示T細胞消耗。在第2週之第5天向接受者投與最後一劑之ATG，亦即CTT植入之前2天休息。在整個階段3中繼續他克莫司直至觀測到原生T細胞＜15%。若T細胞包含大於15%原生T細胞，則實驗繼續進行至階段4。若原生T細胞＜15%，則實驗繼續進行至階段5。在整個階段3中監測他克莫司含量、CMV含量、CBC diff且保存血液樣本用於將來分析。在階段3期間，在接受者及對照NHP中每週量測他克莫司含量、CMV含量、CMC diff、肌酐及ALT含量。

階段4：在階段4之第4週之第1天，對供體NHP進行非存活性心臟供給（如先前所提及）。在階段4之第4週之第1天進行來自供體NHP之異位心臟移植。必要時，供體血液用於輸注至接受者NHP中。在兩週內每週兩次監測接受者之心跳，且接著在整個階段4中每週藉由ECHO心電圖監測。若心臟停止跳動，則處死接受者NHP。

在第1週之第1天、第2天、第5天及第7天，稱重接受者NHP且檢查胸腺活組織切片。

在階段4中，在第4週之第1天，在心臟移植時進行Cryo-CTT之活組織檢查。在整個階段4中，在接受者NHP中每週進行他克莫司含量、CMV含量及CBC diff。

在階段4之第10週，使用來自心臟供體之冷凍保存的血液、接受者血液及第三方血液進行MLR。接受者應對供體及自身耐受且排斥第三方皮膚組織。第三方新鮮NHP皮膚組織及接受者NHP皮膚組織將移植於接受者上。此在階段4之第10週內進行。每月繼續藉由流式細胞量測術、CBC diff及CMV含量監測接受者NHP（使用對照NHP作為分析對照）。

可在心臟移植之後180天處死接受者NHP。將對接受者中之經移植心臟及天然心臟進行病理學。經培養之供體及冷凍保存之經培養胸腺移植物將藉由IHC以及胸組織進行，亦藉由IHC進行分析。值得注意的係，若供體心臟在跳動，則PI選擇允許動物存活更長時間以查看供體心臟將繼續跳動多長時間。

階段5：如先前所指出，若接受者中之原生T細胞在階段3中未達至15%，則他克莫司將在整個階段4及5中繼續使用。在原生T細胞達至大於15%後，實驗將繼續進行至階段4。在階段5期間，監測CBC diff、他克莫司含量、血液化學及CMV含量。

階段6：若階段5中原生T細胞＜10%，則實驗進行至階段6。在階段6期間，在4週之時段內，在接受者NHP中停用他克莫司。在該時段期間，獲得流式細胞量測術、CBC diff、CMV含量及血液化學量測值，且保存血液樣本。移植來自接受者之Cryo-CTT，且在階段6之第9週內，進行Cryo-CTT之活組織檢查，且處死NHP且採集其器官。目的在於展示天然胸腺可成功地在接受者中起作用（因此，技術問題並非供體胸腺組織移植失敗之原因）。在對照NHP中繼續監測流式細胞量測術、CBC diff及CMV含量。

圖35展示整體實驗設計之示意圖。

實例9. 評定 CTT 誘導對同一供體心臟移植之耐受性的能力 .

如在本說明書中其他地方所揭示，在NHP中進行之此實例平行於針對人類受試者中之小兒心臟移植所闡述之所揭示手術程序及治療。

方法

階段1：請參看圖39，對於在實例9中進行之實驗的詳細概述及時間線。

在階段1中進行接受者及供體NHP血液測試。藉由流式細胞量測術測試來自供體NHP（MAMU-A:01陰性）及接受者NHP（MAMU-A:01陽性）之血液，測定CBC差異（CBC diff）、血液化學及CMV含量。將在對照NHP中進行類似測試。在確認供體及接受者在階段1中彼此具有陽性混合淋巴球反應（MLR）之後，供體NHP將胸腺組織及隨後的心臟供給至單個接受者（參考下文所描述之階段4）。

階段2：第2期中第1週之第3天，在接受者Mamu-A:01陽性接受者NHP中以手術方式進行胸腺切除術及皮膚活組織檢查。在第1週、第3天至第3週、第1天培養接受者胸腺。在第1週之第3天冷凍保存來自皮膚活組織切片之皮膚。對接受者NHP每週進行流式細胞量測術直至未展示RTE。同上，假如在階段2之第2週之第1天為陰性，其RTE為陰性，實驗繼續進行至階段3。每兩週監測一次CMV含量且在階段2之第2週服用DSA（5 ml）。

階段3：在第1週之第3天在供體NHP中進行胸腺切除術及皮膚活組織檢查。自12天（自第1週之第3天至第3週之第1天）培養供體胸腺。將植入一半經培養之胸腺且剩餘一半將冷凍保存。不對供體NHP執行其他程序直至階段4。

對接受者NHP執行之程序包括在第3週之第1天自供體至接受者之經培養胸腺植入。此時，他克莫司及MMF在第3週之第1天開始。   在整個階段3中繼續他克莫司及MMF。亦在第3週之第1天投與ATG持續五天以耗乏T細胞。亦在階段3期間，定期進行接受者血液測試。每週監測他克莫司含量以及CMV含量，在第3週、第7週及第16週測試DSA。在交替週內，CBC diff與肌酐及ALT每兩週交替。

在階段3中繼續他克莫司及MMF直至原生T細胞大於15%，接著實驗繼續進行至階段4。替代地，若原生T細胞未達至15%，則實驗繼續進行至階段5（下文描述）。

階段4在第1週及第6週需要供體、接受者及對照NHP之MLR測定。若MLR展示對供體之耐受性且回應於第三方（對照），則實驗繼續進行至第2週。若未展示耐受性，則實驗繼續進行至階段6。目的為展示接受者對供體之耐受性且供體仍對接受者具有反應性（其應為即使在供體中無胸腺症之情況）。

在第2週進行流式細胞量測術以觀測胸腺排斥反應，且每週重複一次。接著繼續他克莫司直至其在第9週開始經4週停用。

若實驗繼續進行至第2週，則繼續他克莫司且MMF降至BID投與，且接著在第2週及第3週內每天投與，且接著停止。

在第7週，在供體NHP中進行非存活性心臟供給及皮膚活組織檢查且必要時，儲存血液以用於輸注至接受者NHP中。在第7週之第1天，在接受者NHP中進行異位心臟移植。在移植當天，供體心臟在全身麻醉誘導及氣管內插管後經由中值胸骨切開術取得。同時，接受者NHP經準備且經歷全身麻醉誘導及氣管內插管。準備腹部且經由中值開腹術進入。NHP為以單次推注形式以20 mg/kg劑量給予靜脈內甲基普賴蘇穠之投與的誘導免疫療法。將腹部主動脈及下腔靜脈固定在腎動脈下方且準備用於供體同種異體移植物之吻合術。接著夾持主動脈及下腔靜脈且靜脈內推注投與5000單位肝素。來自同種異體移植物之肺動脈以端至側方式與下腔靜脈吻合，且來自同種異體移植物之升主動脈以類似於腎下腹主動脈之方式吻合。在脫氣且確保竇性節律後，閉合腹部。使用內部襯墊按需要使用心臟複律。

在手術後時段中，移植心臟中之移植功能係藉由常規觸診及每週心動迴聲圖評定任何排斥跡象（收縮性減少、心律不整等）。歷經4至8週之時段停用兩種免疫抑制藥物（他克莫司及黴酚酸酯）。基於前述實例中所描述之嚙齒動物模型工作，在停用免疫抑制之後預期移植物功能正常，表明移植心臟之耐受性。在完全停用免疫抑制之後數週，接受者自亦最大限度地MHC錯配之第三方NHP進行皮膚移植。大約同時，接受者使用來自胸腺及心臟供體兩者以及來自第三方（對照）NHP之細胞進行MLR測試。此等測試用於展現真實耐受性而非僅功能性耐受性：接受者動物應對第三方供體而非對其胸腺組織及心臟供體建立由MLR量測之免疫反應。同樣，預期供體心臟之持續耐受性以及第三方皮膚移植之排斥反應。在實驗結束時（在無免疫抑制或死亡之情況下6個月）或具有明顯移植排斥反應之跡象（活動完全停止），取得同種異體移植物、天然心臟及來自其他器官（肝臟、肺、脾臟、腰肌）之樣品。亦採集所培養胸腺組織移植之部位用於分析。進行組織組織學以鑑別細胞或抗體介導之排斥反應之跡象。移植的胸腺組織之架構及生存力係藉由免疫組織化學評定。最後，流式細胞量測術用於表徵脾臟、淋巴結、骨髓及外周血液中之淋巴球表現型。

在第10週之第3天，此時對Cryo-CTT進行活組織檢查。在第8至12週監測移植之心臟的跳動情況。若心臟停止跳動，則處死接受者NHP。

在第12週，對來自供體、接受者及對照NHP之皮膚活組織切片的皮膚移植物進行MLR。若心臟仍在跳動，則在第12週由新鮮接受者皮膚、冷凍保存之接受者皮膚、冷凍保存之供體皮膚及新鮮且冷凍保存之第三方（對照）皮膚製成皮膚圖。

在階段4期間，定期監測他克莫司含量。CMV含量兩週量測一次，與流式細胞量測術量測及CBC diff量測交替進行。亦週期性地監測ALT、肌酐及DSA。實驗在異位心臟移植之後180天終止且處死接受者NHP且採集心臟用於病理學。接受者及供體胸腺經遞送以用於IHC，且亦取得胸組織且藉由IHC分析。

階段5：若由於原生T細胞不大於15%而需要持續的免疫抑制，則返回至階段4（儘管已停用MMF）。繼續他克莫司直至原生T細胞大於15%。若原生T細胞大於10%，則返回至階段4。若原生T細胞＜10%，則轉至階段6。在階段5期間，每週監測他克莫司含量，且每兩週交替監測CMV含量及CBC diff、肌酐及ALT含量。在對照NHP中每兩週監測流式細胞量測術及CBC diff。

階段6：在第1週之第1天，將來自接受者之Cryo-CTT移植至接受者以展示可在NHP中製得胸腺植入體。當處死NHP時，在接受者Cryo-CTT移植物中進行活組織檢查。在階段6期間，在對照NHP中每兩週量測流式細胞量測術及CBC diff含量。

如同前述階段流式細胞測量術，每兩週監測DSA及CBC diff含量，與CMC含量、肌酐及ALT含量之測定交替進行。

實例10. 跨多個年齡範圍評定經培養人類胸腺組織之架構、生存力及功能性以界定跨多個年齡範圍之人類胸腺組織之可培養性 .

開發用於擴展人類胸腺供體庫之合理納入準則需要測定廣泛年齡範圍內之潛在心臟供體的供體人類胸腺組織之可培養性以及功能性及分子特徵。人類胸腺之尺寸在嬰兒期中穩定增加，穩定且最終開始退化。儘管此熟知的年齡相關之退化過程，但已顯示，大齡兒童及成人之胸腺可繼續將實質性T細胞生產能力保持至第8個十年，Hong R, Moore,AL.1996, 「《用於胸腺移植之器官培養物（Organ culture for thymus transplantation）》」, 《移植》 ,61:444-448；Rice HE, Skinner MA, Mahaffey SM, Oldham KT, Ing RJ, Hale LP等人, 2004, 「《針對完全DiGeorge氏症候群：醫療及手術考慮因素（Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations）》」, 《美國小兒外科雜誌（ J Pediatr Surg）》 .2004;39: 1607-1615。此等實驗之基本原理為確定可潛在地提供適用於移植之胸腺組織的供體年齡範圍。植入至目前為止之人類胸腺來自小於或等於 9月齡之供體。在該年齡時，胸腺幾乎完全由在胸腺生成中具有活性之皮質及髓質組織組成。然而，因為幾乎無嬰兒供體可用，所以大部分心臟移植接受者接受來自大齡供體之心臟。儘管成人胸腺繼續保持實質性T細胞生產能力，但來源於大齡供體之胸腺通常在胸腺生成中具有較少活性區域，同上；Taub DD, Longo DL, 2009, 「《對胸腺衰老及再生之見解（Insights into thymic aging and regeneration）》」, 《免疫學趨勢（ Trends Immunol）》.30(7):366-373，但相對應地，外周血液中之最近產生的原生T細胞之數目降低。Hong R, Moore, AL, 1996, 「《用於胸腺移植之器官培養物》」, 《移植》, 61:444-448 ,Rice HE等人， 2004, 《美國小兒外科雜誌》 .2004;39:1607-1615；Taub DD, Longo DL, 2009, 《免疫學趨勢》.30(7):366-373。因此，此等研究對於測定胸腺在其保持合適功能特徵之供體年齡範圍為安全且有效的（若培養，則共移植至心臟同種異體移植物接受者中）為必需的。

方法

預期自三個不同年齡之心臟手術患者收集胸腺組織：9個月至9歲；10歲至25歲；及26歲至49歲，在知情同意書之後總共30個樣本。作為此項目之初步研究的部分，開發了用於切片脂肪組織之新穎定製儀器。用Stadie-Riggs薄片切片機對來自大齡胸腺之脂肪組織進行傳統切片不會產生可藉由免疫組織化學評定之切片。   因此，對於脂肪胸腺，單刃剃刀片（約10）連接在一起且滅菌。刀片之間的距離為約1mm。將約1cm × 1 cm × 1 cm之胸腺組織片置於無菌組織培養皿底部。將捆綁之剃刀片壓入胸腺組織中。自剃刀片之間移出個別切片且用於染色。如前述實例中所描述進行人類胸腺組織之切片及培養持續21天。將第1、5、12及21天之組織切片及廢培養基冷凍以供進一步分析。亦將第0天及第21天之組織切片加工成福馬林固定且石蠟包埋（FFPE）之方塊以促進免疫組織化學研究，如下文所描述。

分析開始於第0天及第21天之FFPE塊，使用蘇木精及曙紅（H&E）染色切片以及細胞角蛋白（AE1/AE3混合物）、細胞角蛋白（CK）14增殖（Ki-67）、T細胞含量（CD3）及趨化介素（CCL21）產生之免疫組織化學（IHC）。在第0天可接受的供體胸腺之組織學特徵包括組織胸腺上皮（TE）網路、表現CK14作為再生潛力之標記物之TE細胞的存在、不成熟胸腺細胞及在獲取時作為胸腺生成之標記物的胸腺小體之存在，及作為組織生存力之指標的大於90%完整細胞核。經培養胸腺切片應類似地展現胸腺上皮細胞生存力、維持TE架構、明顯耗乏活胸腺細胞及產生功能上重要的生物分子，包括CCL21之高產量，負責將不成熟胸腺細胞前驅體吸引至胸腺之趨化介素。經由FFPE切片之IHC以及廢培養基之酶免疫分析法評定藉由胸腺切片產生CCL21（圖37）。

因為所使用之胸腺組織可展現不同程度之年齡相關之萎縮，所以測定基線胸腺功能為必需的。如先前描述，藉由第0天之經掃描組織切片的影像分析來測定基線胸腺功能（Hale LP, Markert ML, 2004.「《皮質類固醇調節人類胸腺中之上皮細胞分化及胸腺小體形成（Corticosteroids regulate epithelial cell differentiation and Hassall body formation in the human thymus）》」, 《免疫學雜誌》 .2004; 172: 617-624）。另外，使用供體外周血液測定原生T細胞之胸腺輸出。純化及保存外周血液單核細胞：T細胞表現型係藉由10色流式細胞量測術使用以下標記物測定：生存力、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16+CD56、CD45RA、CD57及CD197。存在於外周血液T細胞中之信號接合T細胞受體重排切除環（sjTREC）定量為胸腺來源之標記物，Lee EN, Park JK, Lee J-R, Oh S-O, Baek S-Y、Kim B-S等人, 2011, 「《在2011年期間小鼠胸腺上皮細胞中之細胞角蛋白5、8及14之表現的表徵；44:14-24.急性胸腺退化後胸腺再生（Characterization of the expression of cytokeratins 5, 8, and 14 in mouse thymic epithelial cells during 2011; 44: 14-24.thymus regeneration following acute thymic involution）》」, 《解剖學與細胞生物學（ Anat Cell Biol）》。

實例11. 經培養人類胸腺之組織病理學評定

進行此等實驗以評定及描述當根據用於植入組織之方案培養時發生於人類胸腺切片中之組織病理學變化。基於在先前接受者中已成功產生免疫重建之組織的特徵，理解此等變化可能導致組織病理學準則之發展及驗證，用於預期評定植入之前經培養胸腺切片之品質，Markert ML, Devlin BH, McCarthy EA, 2010, 「《胸腺移植》」, 《臨床免疫學》.2010; 135: 236-246。總之，此等結果可用於開發基於可能用以評估用於植入之切片之品質的蘇木精及曙紅染色及細胞角蛋白免疫組織化學鑑別之組織之結構特徵的診斷準則。

材料及方法

胸腺組織係獲自＜9月齡之正進行校正性心臟手術之免疫活性的嬰兒供體，其中常規地需要移除胸腺之一部分以便於心臟修復。各供體之母體提供書面知情同意書以允許移除且以其他方式將丟棄之任何胸腺組織可能用於植入或研究。此等研究由杜克大學醫學中心機構審查委員會批准。將供體胸腺切片且在符合良好製造過程（GMP）的細胞製造實驗室中培養長至21天，隨後釋放至手術室用於手術植入接受者之肌肉中。供體檢核、培養及手術植入過程之細節已在其他地方描述Markert ML, Sarzotti M, Ozaki DA, Sempowski GD, Rhein ME, Hale LP等人, 2003, 「《完全DiGeorge氏症候群中之胸腺移植：對十二名患者之免疫及安全評估》」, 《血液》, 102: 1121-1130。Markert ML, Alexieff MJ, Li J, Sarzotti M, Ozaki DA, Devlin BH等人, 2004, 「《出生後胸腺移植與免疫抑制用於治療DiGeorge氏症候群》」, 《血液》, 104: 2574-2581；Markert ML, Devlin BH, Alexieff MJ, Li J, McCarthy EA, Gupton SE等人, 2007, 「《綜述54名參加胸腺移植方案之完全DiGeorge氏畸形的患者：44名連續移植之結果》」, 《血液》, 109: 4539-4547；Hong R等人, 1996；Rice HE, eSkinner MA, Mahaffey SM, Oldham KT, Ing RJ, Hale LP等人, 2004, 「《針對完全DiGeorge氏症候群：醫療及手術考慮因素》」, 《美國小兒外科雜誌》, 39: 1607-1615。在培養期間之特定時間點，將來自各供體胸腺之一或多個切片固定在10%中性緩衝福馬林中，接著加工且包埋於福馬林固定的石蠟包埋塊中以用於組織病理學評估。獲得各組織塊之蘇木精及曙紅（H&E）-染色切片及免疫組織化學圖。所使用之抗體包括泛細胞角蛋白（純系AE1/AE3；徠卡）、細胞角蛋白細胞角蛋白（CK）14（純系LL02；徠卡）、CD3（純系LN10；徠卡）及Ki-67（純系MIB-1；Dako）。使用標準免疫過氧化酶方法及3,3'-二胺基聯苯胺（棕色）受質，使用蘇木精複染劑進行自動化免疫組織化學。為了評定培養中隨時間推移胸腺樣品內之可變性，通常在大於或等於 3個時間點在以下範圍內組織學上檢查批料：第0天（接受日）、第5至9天及第12至21天。

結果及論述

隨著胸腺器官培養自第0天至第21天有進展，切片出現壞死量增加、胸腺上皮細胞凝聚增加及殘餘T細胞之數目減少。胸腺上皮細胞之架構通常在整個21天培養中保持良好保存，其中局灶性表現細胞角蛋白14，具有長期器官再生潛力之胸腺上皮細胞的推定生物標記物。來源於相同供體胸腺之所有器官切片彼此極其相似，在尺寸、形狀及皮質與髓質之相對含量方面存在輕微差異。類似地，當在相同培養時間點檢查時，來源於不同供體之切片展示類似組織病理學特徵。

初步鑑定組織為胸腺

胸腺具有通常在實驗室加工期間移除之薄結締組織囊。然而，仍可在胸腺切片中觀測到囊之（小樑）之延伸部分及締合血管、纖維組織、脂肪組織及可變數目之成熟造血細胞。小樑將胸腺組織分成由胸腺上皮細胞之呈花邊狀的三維網路構成之小葉，其中間入含有發育T細胞（胸腺細胞）之空間。小葉通常展現外皮質及內髓質，其組織學外觀以及其含有之細胞之表現型及功能不同。胸腺皮質由於密集堆積之不成熟胸腺細胞而為極嗜鹼性的（藍色），其用蘇木精染色得極深。存在於胸腺髓質中之更成熟胸腺細胞之密度低於皮質的密度，因此髓質往往會呈現更嗜伊紅血球性（粉紅色）。胸腺髓質亦含有稱為胸腺小體之含特殊病徵性嗜伊紅血球性細胞角蛋白結構。胸腺內存在之巨噬細胞可形成針對深色染色胸腺細胞之背景呈現為深色環形區域（「星空（starry sky）」圖案）之「可染小體（tingible bodies）」。大量可染小體為應激退化之特徵，其可能在正常胸腺供體中由於嚴重心臟缺陷、手術及/或皮質類固醇治療之應激而發生且不會摒棄用於植入之胸腺。在培養之前（第0天）切片正常胸腺之典型組織學特徵展示於圖40A-D中。

對胸腺小體之評定

胸腺髓質含有稱為胸腺小體之特徵結構，其由與單株抗體反應之末端分化的胸腺上皮細胞構成，該等單株抗體亦與表皮之末端分化的上層反應。Hale LP等人, 2004; 172: 617-624。

胸腺小體可充當組織一致性之標記物，因為其僅存在於胸腺中。其亦可反映輸入供體組織之品質，因為終末分化過程通常由胸腺細胞-胸腺上皮細胞相互作用觸發。同上。胸腺小體通常容易藉由其外觀而鑑別為H&E染色載玻片上之上皮細胞的嗜伊紅血球性螺紋（圖41A-D）。最中心的層通常缺乏細胞核。可變量之細胞碎片亦可存在於胸腺小體之中心。用泛細胞角蛋白AE1/AE3抗體極強烈地染色胸腺小體，若在蘇木精及曙紅（H&E）染色的載玻片中未明確鑑別，則其可用作此等結構之一致性的二次確認。

在培養期間之一般胸腺細胞變化

胸腺細胞隨著在培養基變化期間利用清除或利用胸腺細胞死亡來培養胸腺組織、隨後在組織內降解而逐漸地損失（圖42至圖45）。然而，不同於活體內發生之情形，死細胞可能由於不能募集吞噬細胞來清除其而長期保留於所培養之胸腺中。經歷細胞死亡之胸腺細胞核可展示固縮（染色體凝聚）及核破裂（細胞核碎裂），但通常，因為此等細胞耗乏其能量但不為吞噬性的，所以其展示出核膜完整性損失之粗糙核邊緣。核溶解（壞死細胞中細胞核之完全溶解）通常在活體內2至3天內發生，但似乎在胸腺培養期間更緩慢地發生。在培養5至9天之後，大部分胸腺細胞保留細胞核，但核膜不完整，表明早期壞死（圖43）。即使在保留細胞核時，此等改變的細胞核特徵有助於區分活的及非活的胸腺細胞。亦可發現嗜伊紅血球性壞死細胞碎片之較大病灶，其中胸腺細胞核已經歷核溶解（圖43A）。

細胞完整性及組織架構之組織學評定

當植入經培養胸腺組織時，重要的係能夠準確地區分具有大量胸腺細胞壞死但繁衍胸腺上皮細胞（用於植入之最佳組織）之切片與具有類似壞死量的切片，其中胸腺上皮細胞亦受損。儘管其無法直接評定生存力，但H&E載玻片之組織學檢查可評定正常結構之保存程度及細胞死亡指示物之存在或不存在。如上文所描述，預期胸腺細胞在培養過程期間耗乏。在每日培養基改變期間，自切片洗滌許多胸腺細胞。許多其他胸腺細胞將原位死亡，其中其細胞核及細胞體可保持較長時段。然而，死亡的胸腺細胞之膜完整性受損且其細胞核展現「粗糙的」邊緣。胸腺細胞碎片可凝集在一起，使得不可能辨別單個細胞邊界。胸腺細胞死亡及耗乏為培養之預期且合乎需要的結果，且完整胸腺細胞核之相對缺乏可能反映切片品質。

當胸腺細胞自組織耗乏時，更容易觀測到胸腺上皮細胞。活胸腺上皮細胞之細胞核通常為橢圓形，其大於胸腺細胞之細胞核，且具有由蘇木精染料所勾勒之清晰界定之核膜，及一或多種核仁。此等胸腺上皮細胞核通常看起來「開放」，意謂其不會經蘇木精染成深色。此與其存活及代謝活性之解釋擬合，此係因為活性染色體（「真染色質」）不結合蘇木精染料。在許多胸腺上皮細胞中存在作為核糖體合成位點之核仁進一步證實其在固定時存活且具有代謝活性。完整且呈現活力的胸腺上皮細胞之實例展示於圖46A-B中。

自第0天至第21天之任何給定時間點，多個胸腺切片之仔細微觀檢查顯示來源於相同供體胸腺之所有切片彼此極其類似。在來源於相同胸腺之不同切片之間觀測到的隨培養時間變化之差異主要與壞死量（隨著培養時間增加而增加）及殘餘胸腺細胞數目（隨著培養時間增加而減少）相關。當在相同時間點檢查時，來源於不同供體之切片亦定性地彼此類似。不同供體組織之間的差異包括相對大小、形狀、胸腺與髓質之相對含量（但兩者皆始終存在於所檢查之各切片上）、壞死量、胸腺上皮細胞之凝聚及殘餘T細胞數目。在培養之第5天已出現組織學外觀之大部分變化，通常隨著培養進展僅有胸腺細胞額外耗乏。

評定胸腺上皮架構

含有抗細胞角蛋白抗體AE1及AE3（AE1/AE3）之混合物偵測基本上所有胸腺上皮細胞。相比之下，與CK14具有反應性之抗體偵測存在於囊下皮質中且在整個皮質及髓質之剩餘部分中看起來分散之胸腺上皮細胞亞群。此等CK14+細胞中之一些已表明具有分化成皮質及髓質上皮細胞兩者的潛力， Lee EN, Park JK, Lee J-R, Oh S-O, Baek S-Y, Kim B-S等人, 2011, 「《在急性胸腺退化後胸腺再生期間小鼠胸腺上皮細胞中之細胞角蛋白5、8及14之表現的表徵（Characterization of the expression of cytokeratins 5, 8, and 14 in mouse thymic epithelial cells during thymus regeneration following acute thymic involution）》」, 《解剖學與細胞生物學》. 44: 14-24，且因此表示長期再生細胞。隨著胸腺細胞自組織耗乏，胸腺上皮細胞變得更可見。三維胸腺上皮網路通常在切片中經由連接之上皮細胞及/或看起來分散的胸腺上皮細胞（其連接在所檢查之切片中不明顯）之淺色及花邊配置展現。隨著胸腺細胞在培養期間損失，三維胸腺上皮網路收縮至不同程度。此可導致殘餘上皮細胞凝聚，使得囊下皮質上皮層變得較厚且髓質胸腺上皮細胞變得更密集堆積。此等變化之實例展示於圖40及圖42至圖45中，用於在第0天（接受當天）、第7天、第9天、第12天及第20天檢查之單一胸腺批次。儘管損失許多胸腺細胞及可能含有壞死碎片之較大區域，但胸腺上皮細胞網路之整體架構通常保持良好保存直至培養至少21天（圖47A-E）。

殘餘T細胞之評定

如上文所描述，培養意欲用於植入之供體胸腺組織之主要目的為部分耗乏T細胞以促進植入切片與接受者胸腺細胞前驅體移生且降低移植物抗宿主病之風險。不成熟T細胞（胸腺細胞）及成熟T細胞可在組織學切片中藉由其形態以及藉由偵測由此等細胞類型特異性表現之蛋白質的免疫組織化學染色來鑑別。CD3為抗原之T細胞受體之組分，其存在於大於95%之皮質及髓質胸腺細胞以及所有成熟T細胞上。在第0天，皮質及髓質中之基本上所有不成熟T細胞之質膜呈現與呈膜模式之CD3抗體具有強反應性（圖48A-B）。隨著培養繼續，活胸腺細胞/T細胞在膜模式下繼續與CD3抗體反應。然而，CD3抗體亦與死胸腺細胞（包括在死胸腺細胞經歷核溶解之後保留的無核碎片）強烈反應（圖48D、圖48G及圖48I-K）。如此多的胸腺細胞碎片殘留，當在低放大倍數下觀察時，切片可仍然呈現強烈且均勻的棕色（圖48C、圖48F、圖48H、圖48J），儘管在較高放大率下（例如40×物鏡）檢查載玻片證實在此等時間點存在相對極少的完整的潛在活胸腺細胞。非活細胞及細胞碎片將在移植之後由接受者吞噬細胞清除，且因此不傳遞移植物抗宿主病之風險。通常不可能準確鑑別組織區域中之CD3+膜免疫反應性，其中大量的強染色碎片妨礙對相鄰細胞之細胞膜的評估。然而，即使在培養期間之晚期時間點，CD3免疫組織化學通常突出顯示至少一些具有完整質膜之胸腺細胞/T細胞，表明其仍可存活（圖48E、圖48G、圖48I-K）。

細胞增殖之評定

Ki-67抗原在所有增殖的細胞之細胞核中表現（亦即，不在細胞週期之G0階段中）。在第0天，存在於胸腺皮質內之大部分不成熟胸腺細胞增殖且其細胞核與對Ki-67增殖抗原具有特異性之抗體強烈反應。相比之下，僅罕見的更成熟髓質胸腺細胞及/或上皮或基質細胞與此抗體反應（圖49A-B）。在培養第1天至第2天之後觀測到的免疫反應性之模式屬於分散的稀有陽性細胞，其幾乎皆具有胸腺上皮細胞之較大細胞核特徵（圖49C-K）。因此，Ki-67染色可為用於記錄切片內胸腺上皮細胞之生存力的適用之輔助染色。

論述

此等實驗描述當出生後人類胸腺培養至多21天時發生之組織病理學變化，且表明使用H&E及細胞角蛋白免疫反應性之組織病理學檢查可適用於評定意欲用於植入之經培養胸腺切片的品質。隨著胸腺培養有進展，切片出現壞死量增加、胸腺上皮細胞凝聚增加及殘餘T細胞之數目減少。胸腺上皮細胞在整個21天培養中保持完整，且細胞角蛋白14（具有長期器官再生潛力之胸腺上皮細胞的推定生物標記物）持續表現。來自相同胸腺之切片定性地類似，使得單個切片可充分代表整個胸腺。來源於不同供體之經培養胸腺切片之組織學外觀的可變性在任何給定時間點亦最小。在培養期間早期（例如，第5至9天）觀測到的組織組織學密切反映在培養後期（例如，第12至21天）觀測到之情況，但在較晚時間點觀測到更多胸腺細胞耗乏及壞死。

識別CK14或所有類型之細胞角蛋白（AE1/AE3）之抗體的免疫組織化學適用於評估經培養之胸腺切片。細胞角蛋白中間絲為所有上皮細胞之細胞骨架之重要組分。泛細胞角蛋白AE1/AE3染色表明檢查之胸腺切片內之上皮網路，其在較晚時間點僅使用H&E染色可不容易地辨別。已展示由特定胸腺上皮細胞表現之細胞角蛋白之特定類型視其發育階段及分化及功能狀態而定。在小鼠中，與CK5、CK8及CK14反應之抗體最常用於鑑別胸腺上皮細胞亞型，Lee EN等人, 2011, 《解剖學與細胞生物學》, 44: 14-24。在此研究中，基於前述研究測定CK14表現，其中假設CK14表現為具有分化為皮質或髓質譜系之潛力的胸腺上皮細胞之特性，Li B, Li J, Devlin BH, Markert ML., 2011, 「《在出生後人類胸腺移植之後的胸腺微環境重建》」， 《臨床免疫學》.140: 244-259。儘管長效免疫重建之臨床結果（Markert ML等人, 《血液》, 109: 4539-4547）表明胸腺上皮祖細胞有可能存在於植入胸腺切片內，此類祖細胞之精確表現型尚未在人類中確定鑑別。小鼠中之胸腺上皮祖細胞之表現型仍然為有爭論的，Bennett AR, Farley A, Blair NF, Gordon J, Sharp L, Blackburn CC., 2002, 「《胸腺上皮祖細胞之鑑別及表徵（Identification and characterization of thymic epithelial progenitor cells）》」, 《免疫》16: 803-814；Wong K, Lister NL, Barsanti M, Lim JMC, Hammett MV, Khong DM等人, 2014, 「《多系潛力及自體更新限定成人胸腺中之上皮祖細胞群（Multilineage potential and self-renewal define an epithelial progenitor cell population in the adult thymus）》」, 《細胞通訊（ Cell Rep）》. 8: 1198-1209；Ucar A, Ucar O, Klug P, Matt S, Brunk F, Hofmann TG等人, 2014, 「《成人胸腺含有FoxN1(-)上皮幹細胞，對髓質及皮質胸腺上皮譜系具有雙能作用（Adult thymus contains FoxN1(-) epithelial stem cells that are bipotent for medullary and cortical thymic epithelial lineages）》」, 《免疫》, 41: 257-269；Ulyanchenko S, O'Neill KE, Medley T, Farley AM, Vaidya HJ, Cook AM, 2016, 「《鑑別成人胸腺中之雙能上皮祖細胞群（Identification of a bipotent epithelial progenitor population in the adult thymus）》」, 《細胞通訊》, 14: 2819-2832，且已使用多種抗體及多色流式細胞量測術僅偵測到低數目。因此，直接偵測人類組織切片中之胸腺上皮祖細胞目前不可行。

此等實驗鑑定在培養第12至21天時（可能植入組織時之時間點）胸腺切片內殘留的潛在大量壞死細胞材料。在植入之後數月的活組織檢查未展示此壞死材料之證據，Markert ML等人, 2008, 180: 6354-6364。儘管不希望受任何特定理論束縛，但申請人認為在植入時初始存在此壞死碎片及其下層胞外基質可用以保存切片之功能架構，包括用於產生胸腺細胞之皮質及髓質生態棲位。胸腺去細胞化方法之近期使用，其保存胞外基質以重建可支援上皮細胞及造血前驅體之細胞分化的鼠類胸腺「類器官」，Hun M, Barsanti M, Wong K, Ramshaw J, Werkmeister J, Chidgey AP, 2017, 「《天然胸腺胞外基質改善活體內胸腺類器官T細胞輸出，且驅動活體外胸腺上皮細胞分化（Native thymic extracellular matrix improves in vivo thymic organoid T cell output, and drives in vitro thymic epithelial cell differentiation）》」, 《生物材料（ Biomaterials）》, 118: 1-15，支援此假設。

先前研究證明，胸腺上皮細胞之生長潛力在所用培養條件下穩固地維持，使得在器官培養開始之後至多12週，可自切片建立細胞角蛋白陽性上皮單層，Markert ML等人, 1997, 《臨床免疫學與免疫病理學（ Clinical Immunol Immunopathol.）》, 82: 26-36。此實例中所描述之實驗不直接評定上皮細胞生存力，而實際上使用完整細胞核之存在作為替代標記物。

對於以下與用於培養胸腺組織之生物標記物相關之實例，遵循以下程序。

實例12：人類胸腺組織之來源.

胸腺組織係獲自免疫活性的人類供體，其正在進行醫學上必須的手術，其中需要移除胸腺之一部分以便於暴露手術區域。沒有獲得專門出於此研究之目的之組織。大部分所研究組織匿名地自嬰兒、兒童及成人供體獲得，作為否則將被丟棄之組織，僅保留年齡、性別及手術指示。此用途藉由杜克大學醫學中心機構審查委員會（IRB）確定不構成人類受試者研究且免除IRB審查。然而，由一些嬰兒之母體提供書面知情同意書以允許移除否則將丟棄之任何胸腺組織可能用於研究。對此等同意組織進行編碼，因此研究小組無法獲得除年齡及性別以外的鑑別資訊。同意丟棄組織之此用途由杜克大學醫學中心之IRB批准（Pro00103028）。

胸腺處理及培養

各胸腺之代表性部分固定在10%中性緩衝福馬林中，接著加工且包埋於石蠟塊（FFPE）中以用於組織病理學評估。獲得各組織塊之蘇木精及曙紅（H&E）-染色切片及免疫組織化學圖。可能使用之抗體識別泛細胞角蛋白（純系AE1/AE3；徠卡）、細胞角蛋白（CK）14（純系LL02；徠卡）、CD3（純系LN10；徠卡）、Ki-67（純系MIB-1；Dako）、CD1a（純系；供應商）及CCL21（純系；供應商）。使用標準免疫過氧化酶方法及3,3'-二胺基聯苯胺（棕色）受質，使用蘇木精複染劑進行自動化或手動免疫組織化學。

對於一些來自＜9月齡嬰兒供體之試樣，將胸腺組織切片為約0.5 mm厚且培養至多21天，如其他地方詳細描述（Hong及Moore 1996）（Markert等人2003）。簡言之，將胸腺切片置放於由可吸收明膠海綿錠支撐之過濾器上且在哈姆氏F12培養基（Ham's F12 culture medium）+ 10%胎牛血清中在培養基/空氣界面處培養至多21天。每天（24 ± 4小時）用分配於各組織切片上之新鮮材料替換培養基。在20℃下冷凍收集自個別切片或彙集自給定供體胸腺之所有切片（每個切片2.5 mL）之廢/條件培養基之等分試樣直至分析。將經培養胸腺切片之代表性切片固定在10%中性緩衝福馬林中且在大於或等於 3個時間點加工成石蠟塊，該時間點通常在以下範圍內：第0天（接受日，切片但未培養）、第5天至第9天及第12天至第21天。

多重抗體微陣列及酶免疫分析

在第1天至21天獲自三種獨立胸腺培養物之條件培養基之等分試樣中存在的200種分析物之含量係根據製造商之方案，使用多重抗體微陣列（RayBiotech）來測定。具有至少兩個超過至少一個胸腺（n = 127）之偵測下限之量度的分析物經天然對數（ln）轉換且進行曲線下面積及回歸分析（圖56）。

鑑別用於進一步研究之分析物之選擇準則包括持續增加之最初低水準（胸腺上皮（TE）衍生之生物標記物的假設特徵）或持續降低之最初高水準（胸腺細胞衍生之生物標記物的假設特徵）、在所有三個所分析之胸腺培養物中之類似表現模式及分析物與假設的細胞來源及/或胸腺生物學之功能性相關性的公開證據。較佳為高度表現之彼等分析物（如曲線下面積所指示）且具有統計學上顯著之變化（p 小於或等於 0.05），具有或不具有用於錯誤發現之校正。藉由如上文所描述之抗體微陣列或基於LuminexTM珠粒之免疫分析（研發系統）定量條件培養基中之L-選擇素含量，對於各樣品，其定量下限（LLOQ）為3952 pg/mL且定量上限為4,656,306 pg/mL，考慮稀釋因素。使用DuoSet人類CCL21ELISA套組（研發系統），基於使用反曲、最佳擬合值及對數尺度（r2 =0.9986）之標準曲線，以pg/mL為單位測定CCL21分泌。

多重基因表現分析

多重基因表現在來源於人類胸腺組織之FFPE塊上，根據製造商之規格使用QuantiGene Plex分析（Thermo-Fisher）量測。簡言之，自10 µm厚的FFPE切片宏觀解剖6-8 mm的3個胸腺組織，置放於分析試管中，且溶解以釋放目標RNA。螢光LuminexTM珠粒與捕獲增效劑、標記增效劑、阻斷探針及組織裂解物一起培育以將特異性mRNA捕獲至具有限定螢光特徵之珠粒。分支DNA技術用於擴增與各結合之mRNA相關的信號，接著與抗生蛋白鏈菌素-藻紅素雜交。各珠粒及其相關藻紅素信號之螢光使用Bio-Plex 200儀器（Bio-Rad）量測。將各所關注之分析物的背景校正之螢光信號歸一化為各胸腺樣品之GAPDH的螢光信號，接著基於如下文所描述之組織組合物進一步歸一化。

組織形態測定

H&E、泛細胞角蛋白（CK）（AE1/AE3）及CD1a免疫組織化學載玻片在40×放大倍數下使用Leica SCN幻燈片掃瞄器（Leica Microsystems）進行數位掃描，且藉由病理學家（LPH）使用虛擬顯微鏡檢查（ImageScope軟體；徠卡生物系統）進行檢查。藉由H&E染色所定義之載玻片上之胸腺組織的總面積（「總面積」）、含有胸腺上皮細胞之面積（「TE面積」，如由CK免疫組織化學所定義）及含有不成熟胸腺細胞之面積（「皮質面積」，如由CD1a免疫組織化學所定義）藉由使用由ImageScope軟體提供之「筆工具」對其進行輪廓描繪來測定，如先前所描述（Ito等人2017）（圖57A至圖57C）。將針對各組織所鑑別之個別區域（以μm2為單位）導入Microsoft Excel中以進行求和，接著捨入至最接近mm2以用於資料呈現。為了調整各載玻片上胸腺組織量之差異，藉由除以所檢查之胸腺組織之總面積將TE及皮質面積轉化為總面積%。發育的胸腺細胞之組織含量由皮質面積%（亦即含有CD1a+不成熟胸腺細胞之組織百分比）定義。

統計分析

對於至少一個胸腺，總共200種分析物中之127種在至少兩天內之量測值高於偵測之分析極限。總計，在來自一個胸腺之培養基中量測14種分析物，17種在來自兩個胸腺之培養基中量測，且96種在來自三個胸腺之培養基中量測。針對各分析物擬合單獨的分級線性回歸模型，每天預測ln(pg/mL)且反應聚集於胸腺。報導來自各模型之斜率參數，反映以ln(ng/mL)計之平均變化/天，以及指數斜率，其反映以pg/mL計之平均每日相乘變化。使用本傑明-霍赫貝格程序（Benjamini-Hochberg procedure）在調整及不調整錯誤發現之情況下報導P值。亦報導模型結果以及在21天培養時段內基於ln(pg/mL)計算的各分析物之梯形曲線下面積(AUC)之評估。

由於對廣泛年齡範圍內的整個胸腺組織進行定量基因表現分析，因此含有胸腺上皮細胞及/或在胸腺生成中具有活性之所研究組織的百分比變化。為瞭解決此問題，如藉由形態測定所測定，初始定量基因結果另外歸一化為具有胸腺上皮細胞之面積百分比或具有活性皮質之面積百分比。

結果

由經培養人類胸腺產生之可溶性分子

經由多重抗體微陣列篩選來自不同供體之三個連續胸腺培養物在培養的第1至21天獲得之條件培養基之樣品的200個分子。藉由曲線下面積及回歸分析進一步分析具有高於至少一個胸腺之偵測下限之至少兩個量度的127種分析物（圖56）。四十二種分析物展示隨著培養有進展，向培養基中之釋放顯著增加（n = 15）或降低（n = 27），如由未校正的p值＜ 0.05所指示（圖56）。此等分析物中之五種（L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine及半乳糖凝集素-7）顯示在所有三種胸腺培養物中表現之類似模式且在應用錯誤偵測速率（FDR）校正時，持續與培養時間相關而具有p ＜ 0.05（圖56）。

半乳糖凝集素-7、M-CSF及L-選擇素之含量隨時間降低，符合可能的胸腺細胞產生之可溶性分子的預定準則（圖50A、圖50B及圖50C）。

儘管已報導半乳糖凝集素-7（由LGAGS7基因編碼）由存在於胸腺小體中之末端分化的TE細胞表現（Kuwabara等人2002），如針對胸腺細胞之生物標記物所預期，培養基中之含量隨培養而降低。由於半乳糖凝集素-7為在多種細胞類型中觸發細胞凋亡之p53誘導蛋白質（Biron-Pain等人2013），其亦可與培養期間之胸腺細胞損失相關，但不大可能對胸腺細胞具有特異性。同樣，已展示M-CSF由TE細胞產生（Le等人1988）且亦可藉由存在於胸腺內之多種其他細胞類型產生。相比之下，L-選擇素之表現限於造血細胞且眾所周知在胸腺細胞上表現。雖然本身未分泌，但L-選擇素為以組成性方式以及在白血球黏附及遷移期間脫落的I型跨膜醣蛋白（Hafezi-Moghadam等人2001；Ivetic等人2019），接著快速再表現（Fitzhugh等人2008）。因此，選擇在條件培養基中之可溶性L-選擇素以作為可能與胸腺培養物內存在之活胸腺細胞數目相關之可溶性生物標記物進行進一步驗證。

分泌於培養基中之CCL21、CXCL16及CXCL12之含量隨時間增加，符合可能的TE產生之可溶性分子之預定標準（圖50D、圖50E及圖50F）。先前已展示此等趨化介素中之所有三者均表現於TE細胞中（Bunting等人2011；Liu等人2005）。CCL21亦已展示在胸腺中功能上重要，因為其對早期胸腺細胞祖細胞及胸腺細胞之趨化性作用（Hu等人2015；Kozai等人2017）。因此，吾等選擇進一步驗證CCL21作為可能反映經培養胸腺切片內胸腺上皮細胞之含量及功能之潛在生物標記物。

L-選擇素之條件培養基含量在人類胸腺器官培養期間降低且與活胸腺細胞相關。

藉由篩選微陣列鑑別之L-選擇素釋放至器官培養基中之模式係藉由使用基於抗體微陣列及cc珠粒之多重免疫分析兩者，確定存在於來自先前分析之條件培養基（MFG-026）及三種額外胸腺器官培養物中之隨培養時間而變的可溶性L-選擇素之含量來證實。如初始篩選陣列所表明，條件培養基中之L-選擇素之含量最初（例如第1天）通常極高，但第5天快速降低至21天培養時段之剩餘時間保持之低含量（圖51A、圖51B）。L-選擇素含量之此等變化平行於在培養期間發生之活胸腺細胞中觀測到之變化。使用鑑別細胞為T譜系之抗CD3抗體及鑑別增殖性細胞之抗Ki-67抗體的免疫組織化學表明在培養早期胸腺細胞生存力之快速損失（圖52）。在第0天，皮質及髓質中之基本上所有不成熟T細胞之質膜呈現與呈膜模式之抗CD3具有強反應性（圖52B）。在培養數天之後，大部分棕色係歸因於無核，但仍具有免疫反應性的碎片，其在死亡的胸腺細胞經歷核溶解/細胞核溶解之後仍然存在（圖52E）但其碎片保留在組織切片中。然而，似乎具有完整質膜之罕見胸腺細胞/T細胞可能藉由CD3免疫組織化學鑑別，即使在培養約3週之後[未展示；（Hale 2020）（Markert等人1997a）。類似地，使用對Ki-67增殖標記物具有特異性之抗體的免疫組織化學展示在第0天與皮質胸腺細胞存在充足的反應性（圖52C），與皮質中發生之明顯增殖/純系擴增一致。然而，在器官培養期間發生之胸腺細胞死亡導致Ki-67免疫反應性，僅在培養期間較晚時間點，較大細胞與TE細胞形態一致（圖52F）。

CCL21分泌在器官培養期間增加

藉由使用酶免疫分析在額外胸腺器官培養物中定量CCL21來驗證藉由篩選微陣列（圖50E）所鑑別的CCL21隨時間增加釋放至器官培養基中之模式。如圖53B中所示，連續切片胸腺試樣，接著培養至多21天，其中根據預定取樣計劃分析自來源於各胸腺樣品之所有切片或自個別切片每日彙集之廢培養基。廢培養基之每日混合樣品之CCL21含量展示隨培養時間之增加而增量至穩態水準的模式，其顯著增加超過基線（圖53A；n = 8種培養物）。個別切片之分泌定量上不同，但對於來源於給定胸腺之所有切片，整體分泌模式類似，其中最初低CCL21分泌隨著培養持續進行而增加至持續高得多的水準（圖53C）。

CCL21主要由人類胸腺切片中之TE細胞產生。

接著，使來自新鮮及經培養人類胸腺組織之FFPE切片與CCL21特異性抗體反應以測定造成隨培養進展而觀測到的此趨化介素分泌增加的細胞類型。新鮮切片非培養胸腺中之TE細胞（第0天）以在髓質區域中最強之模式展示與CCL21抗體之適度反應性（圖54A、圖54B），但亦包括分散於皮質中之TE細胞。在所培養胸腺中可見類似反應性模式，其中髓質區域中之TE細胞以及皮質區域中之分散TE細胞具有中度至強烈的免疫反應性（圖54C、圖54D）。

測定在整個生命期中之胸腺基因表現

為了判定此等來自T細胞耗乏之經培養人類嬰兒胸腺之結果如何可能涉及衰老人類胸腺之變化，使用定量基因多重基因表現分析來研究來源於47個供體整個生命期中之FFPE胸腺組織。所研究群組包括5日齡至70歲之19名男性、5日齡至78歲之27名女性及來自其性別未記錄之29歲供體的一個樣本。此等樣品之年齡及性別分佈展示於圖59A中。

當相比於供體大於18歲之供體（n = XX；P = 0.yy）時，獲自小於或等於 18歲供體（n = XX）之胸腺組織顯示編碼T細胞標記物CD3ε及皮質胸腺細胞標記物CD1a之mRNA相對於GAPDH的較高表現（圖55A、圖55B），與藉由CD1a免疫組織化學在較年輕組織中觀測到之涉及活性胸腺生成的皮質區域增加一致（圖59C）。與老年人相比，小於或等於 18歲供體中含有胸腺上皮細胞之胸腺組織部分的百分比亦較高（P = 0.zz）。然而，與老年人相比，小於或等於 18歲供體中之編碼細胞角蛋白8（KRT8）及14（KRT14）之mRNA相對於GAPDH減少（圖55C、圖55D），考慮到較年輕供體中含有胸腺上皮細胞之區域的百分比較高，此觀測結果出人意料（圖59B）。

為瞭解決此問題，另外基於如由泛細胞角蛋白免疫組織化學所指示之其含有胸腺上皮之面積的百分比及活性胸腺生成之皮質面積的百分比來歸一化基因表現結果，如由CD1a免疫組織化學所指示（圖59）。如圖55中所示，此等兩種歸一化方法基本上消除在未調整資料之情況下可見的離群值且產生極類似比率。有趣的係，在兩種歸一化方法之後，來自小於或等於 18歲供體之胸腺組織相比於來自老年人之胸腺持續表現更多CD3E及CD1A mRNA及較少KRT8及KRT14 mRNA。

CCL21及CXCL12之全胸腺表現隨著胸腺細胞因衰老而減少而增加。

相對於來自小於或等於 18歲供體之胸腺中之GAPDH，未調節之CCL21基因表現一致較低（圖6E）。相比之下，在老年組中，未調節之CCL21表現更高且更可變，具有多個離群值。基於TE歸一化。

CCL21及CXCL12之全胸腺表現隨著胸腺細胞因衰老而減少而增加。

相對於來自小於或等於 18歲供體之胸腺中之GAPDH，未調節之CCL21基因表現一致較低（圖55E）。相比之下，在老年組中，未調節之CCL21表現更高且更可變，具有多個離群值。基於TE面積或皮層面積之歸一化消除離群值，且導致兩個供體年齡組之間的分離增加（圖55E）。對於趨化介素CXCL12可見類似結果（圖55F）。

實例13

研究胸腺內可變性以判定來自胸腺之一部分之組織學測試結果是否可視為代表相同胸腺的任何其他部分之組織學測試結果。此測試之結果用於測定在常規釋放測試及用於製程驗證測試期間應測試多少樣品。

建立組織學驗收準則，如先前所指出，包括評定以下各者：對在第5至9天分散於整個組織中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域；至少1種所鑑別之胸腺小體；在整個組織中分散之CK14染色；及觀測到的完整細胞核。

對於此研究，將三個胸腺以定向方式切片，且追蹤各胸腺內之切片位置。將切片在6孔盤中培養以允許追蹤各切片。如圖62A中所示進行切片。

對於研究中之各胸腺，切片專用於在以下時間點中之每一者分析：基線（第0天）、第5天、第9天、第12天及第21天。

對於各胸腺，在各時間點培養5至11個切片。根據上文所述之方法培養切片，每天更換培養基。將切片提交用於病理學實驗室中之H&E染色且分析一致性、效力及生存力。此研究中之所有切片符合如上文所指定之組織學測試的釋放驗收準則，亦即：對在第5至9天分散於整個組織中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域；至少1種所鑑別之胸腺小體；在整個組織中分散之CK14染色；及觀測到的完整細胞核。

除評定各切片是否符合釋放驗收準則以外，病理學家對各H&E及AE1/AE3載玻片進行更詳細的審查。用於所培養胸腺組織批次MFG-056之此等載玻片中之一些的影像展示於圖63A-H中。注意到以下觀測結果。

來源於相同供體胸腺之所有切片在各時間點皆符合驗收準則。在不同切片中，皮質區域彼此相似，且髓質區域彼此相似。然而，觀測到在切片之間的皮質及髓質之相對比例的變化。

在來源於相同胸腺之不同切片之間觀測到的隨培養時間變化之差異主要與壞死量、主要胸腺細胞（其隨著培養時間增加而增加）及殘餘胸腺細胞數目（其隨著培養時間增加而減少）相關。

基於此等觀測結果，來自胸腺之任一切片代表整個胸腺。另外，組織切片在第5天之組織學外觀反映在較晚時間點中之每一者（第9天、第12天及第21天）觀察到的情況。

實例14：全胸腺時程研究.

對於此研究，對五種胸腺進行切片且根據SOP培養。在切片當天，製備第一、中間及最後一個切片用於免疫組織化學。將各胸腺之剩餘部分切片且在6孔盤中培養。各胸腺指定用於以下時間點中之一者：基線（第0天）、第5天、第9天、第12天及第21天。參見第0天胸腺切片之圖64A、第5天切片之圖65A、第12天切片之圖66A及第21天切片之圖67A。

來自各胸腺之切片總數在21至62個切片範圍內。按照上文概述之程序培養切片，每天更換培養基。將切片提交用於病理學實驗室中之H&E染色且分析一致性、效力及生存力。此研究中之所有切片符合組織學測試的釋放驗收準則，亦即：對在第5至9天分散於整個組織中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域；至少1種所鑑別之胸腺小體；在整個組織中分散之CK14染色；及觀測到的完整細胞核。

除評定各切片是否符合釋放驗收準則以外，病理學家對各H&E及AE1/AE3載玻片進行更詳細的審查。注意到以下觀測結果。

如上文所描述，來源於相同供體胸腺且在相同時間點測試之所有切片與皮質及髓質、殘餘胸腺細胞及/或壞死之相對量之變化類似地符合彼時間點的驗收準則。

注意到的差異為相對尺寸、形狀、胸腺皮質與髓質之相對含量、壞死量、胸腺上皮細胞之凝聚及殘餘胸腺細胞數目。

另外，在不同時間點測試之來自不同供體之批次亦定性地彼此類似。觀測到之差異與壞死量（隨著培養時間增加而增加）及殘餘胸腺細胞數目（其隨著培養時間增加而減少）相關。

任一個切片之組織學檢查產生關於整個批次之可接受性的相同結論。基於此等觀測結果，來自胸腺之任一切片的相關特徵反映整個胸腺之彼等特徵。另外，組織切片在第5天之組織學外觀反映在較晚時間點中之每一者（第9天、第12天及第21天）觀測到的情況，但在較晚時間點處觀測到更多壞死。圖68為展示第0天至第21天，如藉由抗體AE1/AE3所評定之上皮網路之相似性的良好實例。

實例15：胸腺組織強制降解研究.

在此研究中，處理胸腺組織切片以產生視為降解或無法存活的組織切片。三個胸腺用於此等實驗。對照樣品取自各胸腺。測試表10中呈現之處理條件。

實例16：胸腺組織強制降解研究.

在此研究中，處理胸腺組織切片以產生視為降解或無法存活的組織切片。三個胸腺用於此等實驗。對照樣品取自各胸腺。測試表5中呈現之處理條件。 表10：強制降解處理條件

條件	處理持續時間
對照	未處理
熱衝擊，55℃	4小時
冷凍/解凍，-20℃/環境	4小時
室溫，20-24℃（在BSC中培養）	24小時
脫水（在培養基之不存在下培養）	24小時
48小時
營養耗盡，（在生理鹽水中培養）	24小時
48小時
滲透壓變化，（在 10× PBS 中培養）	24小時
DMSO暴露，（在含1% DMSO之TOM中培養）	24小時

藉由將含有切片之10 cm培養皿置放於Ziploc袋中，且置放於55℃水浴中來實現熱衝擊。培養盤靜置在支撐物上且未浸沒。藉由將10 cm培養皿置放至-20℃冷凍器中4小時，隨後在環境溫度下解凍來實現冷凍/解凍。

在培養第5天及第9天測試樣品之組織學。亦在第21天測試一些樣品。此研究中之所有切片符合組織學測試的釋放驗收準則，亦即：對在第5至9天分散於整個組織中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域；至少1種所鑑別之胸腺小體；在整個組織中分散之CK14染色；及觀測到的完整細胞核。

除評定各切片是否符合釋放驗收準則以外，病理學家對各載玻片進行更詳細的審查。注意到以下觀測結果。

暴露於冷凍/解凍或10× PBS之樣品展示大部分壞死，但一些細胞仍呈現完整且符合生存力之組織學標準。參見圖61，暴露於10× PBS之實例。

保持在室溫下、經脫水、在生理鹽水或1% DMSO中培育或經受熱衝擊之切片展示較小程度之組織學變化。

對於對照樣品，病理學家注意以下觀測結果。

胸腺細胞隨著培養胸腺組織而逐漸地損失。然而，死細胞可能由於不能募集吞噬細胞來清除其而長期保留於所培養之胸腺中。經歷凋亡細胞死亡之細胞的細胞核最初凝聚且用蘇木精染料染色更深（藍色）。因為此等細胞耗乏其能量但不經吞噬，所以其失去其膜完整性且變得壞死。核溶解（壞死細胞中細胞核之溶解）通常在活體內2至3天內發生，但似乎在胸腺培養期間更緩慢地發生。因此，發現壞死細胞碎片之大嗜伊紅血球（粉紅色）擴增尋常，其中胸腺細胞核已經歷核溶解。一些死胸腺細胞保留其細胞核，與活細胞之細胞核相比，其具有粗糙的邊緣及改變之染色特徵。

隨著胸腺細胞自組織耗乏，胸腺上皮細胞變得更可見。三維胸腺上皮（TE）網路通常在切片中經由連接之上皮細胞及/或（看起來）分散的TE細胞（其連接在所檢查之切片中不明顯）淺色及花邊配置展現。隨著胸腺細胞在培養期間損失，三維網路收縮。此引起殘餘上皮細胞凝聚，使得囊下皮質上皮層變得較厚且髓質TE細胞變得更密封。活TE細胞之細胞核通常為橢圓形，其大於胸腺細胞之細胞核，且具有由蘇木精（藍色）染料所勾勒之清晰界定之核膜，以及一或多種核仁。此等TE細胞核通常看起來「開放」，意謂其不會經蘇木精染成深色。此與其存活及代謝活性之解釋擬合，此係因為活性染色體（「真染色質」）無法結合蘇木精染料。在許多TE細胞中存在核仁（其為核糖體合成位點）進一步證實其為活的且具有代謝活性。圖65、圖66及圖67分別展示自第5天、第12天及第21天之對照切片之典型組織學外觀。

對於包括室溫、脫水、1% DMSO及熱衝擊之處理條件，病理學家指示切片之外觀與對照之彼等外觀無顯著不同。對於熱衝擊樣品，病理學家指出，熱處理可藉由凝聚防止進一步降解之蛋白質而使細胞「固定」。熱處理已用作組織（包括胸腺）之固定劑。

圖12A及圖12B描繪在暴露於強制降解條件之後胸腺組織載玻片之組織學。圖10A及圖10B描繪在第21天對照胸腺組織切片之組織學外觀。

強制降解組織之一般組織學外觀在此等時間點類似，但在第21天具有較少殘餘胸腺細胞（圖12B）。髓質區域中代表性胸腺小體均藉由圖12B中之箭頭指示。代表性呈現活力的胸腺上皮細胞藉由圖12A及圖12B中之箭頭指示。展示於圖12B中之皮質區域在第21天幾乎完全由壞死淋巴球組成。左下方之條形表示100 μm。

實例17：胸腺組織原料藥批次分析

10批胸腺組織之批次分析資料展示於下表11 中。 表11

批次	製造年份	新進胸腺重量（g）	給予患者之最終劑量（mm 2/m 2）	對RVT-802 a進行之測試
外觀 b	組織學 c	內毒素	無菌性 d	黴漿菌 d	革蘭氏染色
MLM428	2016	4.97	8,034	通過	通過	＜ 0.500 EU/mL	未生長	未生長	陰性
MLM434	2016	7.48	9,110	通過	通過	＜ 0.500 EU/mL	未生長	未生長	陰性
MLM435	2016	27.74	7,104	通過	通過	＜ 0.500 EU/mL	未生長	未生長	陰性
MLM437	2016	8.99	9,884	通過	通過	＜ 0.500 EU/mL	未生長	未生長	陰性
MLM438	2017	10.68	19,134	通過	通過	＜ 0.500 EU/mL	未生長	未生長	陰性
MLM444	2017	10.51	19,402	通過	通過	＜ 0.500 EU/mL	未生長	未生長	陰性
MLM447	2017	5.95	8,459	通過	通過	＜ 0.500 EU/mL	未生長	未生長	陰性
MLM449	2017	7.81	9.260	通過	通過	＜ 0.500 EU/mL	未生長	未生長	陰性
MLM450	2017	12.99	17,128	通過	通過	＜ 0.500 EU/mL	未生長	未生長	陰性
MLM452	2017	7.61	16,802	通過	通過	＜ 0.500 EU/mL	未生長	未生長	陰性

關鍵： (e) 根據製造時在適當位置之說明書測試此等批次。此表中呈現之原料藥測試結果亦表示最終藥品測試結果。 (f)  外觀規格未證明對容器之篡改或損壞。 (g) 組織學分析用於一致性及效力兩者。組織學規格（在第5天至第9天之間測試）如下： (h)                對整個組織中所分散之角蛋白呈陽性的區域。 i.            至少1種所鑑別之胸腺小體 ii.          分散於整個組織中之CK14染色 iii.       觀測到的完整細胞核 iv.       在第1、7及14天收集無菌性及黴漿菌樣品。

關於56個臨床胸腺、8個用於胸腺內可變性、胸腺間可變性及時程測試之胸腺及3個經歷強制降解之胸腺的資料用於產生當前對照文庫。文庫中之強制降解樣品（陰性對照）為藉由暴露於冷凍/解凍或10× PBS而經歷降解之樣品。全資料集產生14個不同叢集。所有強制降解樣品聚集在一起且無臨床樣品或表徵樣品與強制降解樣品聚集在一起。

實例18.

方法

預期自三個不同年齡之心臟手術患者收集胸腺組織：9個月至9歲；10歲至25歲；及26歲至49歲，在知情同意書之後總共30個樣本。作為此項目之初步研究的部分，開發了用於切片脂肪組織之新穎定製儀器。用Stadie-Riggs薄片切片機對來自大齡胸腺之脂肪組織進行傳統切片不會產生可藉由免疫組織化學評定之切片。因此，對於脂肪胸腺，單刃剃刀片（約10）連接在一起且滅菌。刀片之間的距離為約1mm。將約1cm × 1 cm × 1 cm之胸腺組織片置於無菌組織培養皿底部。將捆綁之剃刀片壓入胸腺組織中。

自剃刀片之間移出個別切片且用於染色。如前述實例中所描述進行人類胸腺組織之切片及培養持續21天。將第1、5、12及21天之組織切片及廢培養基冷凍以供進一步分析。亦將第0天及第21天之組織切片加工成福馬林固定且石蠟包埋（FFPE）之方塊以促進免疫組織化學研究，如下文所描述。

分析開始於第0天及第21天之FFPE塊，使用蘇木精及曙紅（H&E）染色切片以及細胞角蛋白（AE1/AE3混合物）、細胞角蛋白（CK）14增殖（Ki-67）、T細胞含量（CD3）及趨化介素（CCL21）產生之免疫組織化學（IHC）。在第0天可接受的供體胸腺之組織學特徵包括組織胸腺上皮（TE）網路、表現CK14作為再生潛力之標記物之TE細胞的存在、不成熟胸腺細胞及在獲取時作為胸腺生成之標記物的胸腺小體之存在，及作為組織生存力之指標的大於90%完整細胞核。經培養胸腺切片應類似地展現胸腺上皮細胞生存力、維持TE架構、明顯耗乏活胸腺細胞及產生功能上重要的生物分子，包括CCL21之高產量，負責將不成熟胸腺細胞前驅體吸引至胸腺之趨化介素。經由FFPE切片之IHC以及廢培養基之酶免疫分析法評定藉由胸腺切片產生CCL21（圖69）。

因為所使用之胸腺組織可展現不同程度之年齡相關之萎縮，所以測定基線胸腺功能為必需的。如先前描述，基線胸腺功能係藉由自第0天經掃描組織切片之影像分析來判定（Ito, R., Hale, L.P., Geyer, S.M., Li, J., Sornberger, A., Kajimura, J., Kusunoki, Y., Yoshida, K., van den Brink, M.R.M., Kyoizumi, S., Manley, N.R., Nakachi, K., Sempowski, G.D.: 《年齡及暴露於電離輻射對人類胸腺形態及功能之影響（ Effects of age and exposure to ionizing radiation on human thymus morphology and function.）》《輻射研究（ Radiation Res.）》 , 187:589-598, 2017。另外，使用供體外周血液測定原生T細胞之胸腺輸出。純化及保存外周血液單核細胞：T細胞表現型係藉由10色流式細胞量測術使用以下標記物測定：生存力、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16+CD56、CD45RA、CD57及CD197。存在於外周血液T細胞中之信號接合T細胞受體重排切除環（sjTREC）定量為胸腺來源之標記物，Lee EN, Park JK, Lee J-R, Oh S-O, Baek S-Y、Kim B-S等人, 2011, 「《在2011年期間小鼠胸腺上皮細胞中之細胞角蛋白5、8及14之表現的表徵；44:14-24.急性胸腺退化後胸腺再生》」, 《解剖學與細胞生物學》。

實例19. 經培養人類胸腺之組織病理學評定

進行此等實驗以評定及描述當根據用於植入組織之方案培養時發生於人類胸腺切片中之組織病理學變化。基於在先前接受者中已成功產生免疫重建之組織的特徵，理解此等變化可能導致組織病理學準則之發展及驗證，用於預期評定植入之前經培養胸腺切片之品質，Markert ML, Devlin BH, McCarthy EA, 2010, 「《胸腺移植》」, 《臨床免疫學》2010; 135: 236-246。總之，此等結果可用於開發基於可能用以評估用於植入之切片之品質的蘇木精及曙紅染色及細胞角蛋白免疫組織化學鑑別之組織之結構特徵的診斷準則。

材料及方法

胸腺組織係獲自＜ 9月齡之正進行校正性心臟手術之免疫活性的嬰兒供體，其中常規地需要移除胸腺之一部分以便於心臟修復。各供體之母體提供書面知情同意書以允許移除且以其他方式將丟棄之任何胸腺組織可能用於植入或研究。此等研究由杜克大學醫學中心機構審查委員會批准。將供體胸腺切片且在符合良好製造過程（GMP）的細胞製造實驗室中培養長至21天，隨後釋放至手術室用於手術植入接受者之肌肉中。供體檢核、培養及手術植入過程之細節已在其他地方描述Markert ML, Sarzotti M, Ozaki DA, Sempowski GD, Rhein ME, Hale LP等人, 2003, 「《完全DiGeorge氏症候群中之胸腺移植：對十二名患者之免疫及安全評估》」, 《血液》, 102: 1121-1130。Markert ML, Alexieff MJ, Li J, Sarzotti M, Ozaki DA, Devlin BH等人, 2004, 「《出生後胸腺移植與免疫抑制用於治療DiGeorge氏症候群》」, 《血液》, 104: 2574-2581；Markert ML, Devlin BH, Alexieff MJ, Li J, McCarthy EA, Gupton SE等人, 2007, 「《綜述54名參加胸腺移植方案之完全DiGeorge氏畸形的患者：44名連續移植之結果》」, 《血液》, 109: 4539-4547；Hong R等人, 1996；Rice HE, eSkinner MA, Mahaffey SM, Oldham KT, Ing RJ, Hale LP等人, 2004, 「《針對完全DiGeorge氏症候群：醫療及手術考慮因素》」, 《美國小兒外科雜誌》, 39: 1607-1615。在培養期間之特定時間點，將來自各供體胸腺之一或多個切片固定在10%中性緩衝福馬林中，接著加工且包埋於福馬林固定的石蠟包埋塊中以用於組織病理學評估。獲得各組織塊之蘇木精及曙紅（H&E）-染色切片及免疫組織化學圖。所使用之抗體包括泛細胞角蛋白（純系AE1/AE3；徠卡）、細胞角蛋白細胞角蛋白（CK）14（純系LL02；徠卡）、CD3（純系LN10；徠卡）及Ki-67（純系MIB-1；Dako）。使用標準免疫過氧化酶方法及3,3'-二胺基聯苯胺（棕色）受質，使用蘇木精複染劑進行自動化免疫組織化學。為了評定培養中隨時間推移胸腺樣品內之可變性，通常在大於或等於 3個時間點在以下範圍內組織學上檢查批料：第0天（接受日）、第5至9天及第12至21天。

結果及論述.

隨著胸腺器官培養自第0天至第21天有進展，切片出現壞死量增加、胸腺上皮細胞凝聚增加及殘餘T細胞之數目減少。胸腺上皮細胞之架構通常在整個21天培養中保持良好保存，其中局灶性表現細胞角蛋白14，具有長期器官再生潛力之胸腺上皮細胞的推定生物標記物。來源於相同供體胸腺之所有器官切片彼此極其相似，在尺寸、形狀及皮質與髓質之相對含量方面存在輕微差異。類似地，當在相同培養時間點檢查時，來源於不同供體之切片展示類似組織病理學特徵。

初步鑑定組織為胸腺.

胸腺具有通常在實驗室加工期間移除之薄結締組織囊。然而，仍可在胸腺切片中觀測到囊之（小樑）之延伸部分及締合血管、纖維組織、脂肪組織及可變數目之成熟造血細胞。小樑將胸腺組織分成由胸腺上皮細胞之呈花邊狀的三維網路構成之小葉，其中間有含有發育T細胞（胸腺細胞）之空間。小葉通常展現外皮質及內髓質，其組織學外觀以及其含有之細胞之表現型及功能不同。胸腺皮質由於密集堆積之不成熟胸腺細胞而為極嗜鹼性的（藍色），其用蘇木精染色得極深。存在於胸腺髓質中之更成熟胸腺細胞之密度低於皮質的密度，因此髓質往往會呈現更嗜伊紅血球性（粉紅色）。胸腺髓質亦含有稱為胸腺小體之含特殊病徵性嗜伊紅血球性細胞角蛋白結構。胸腺內存在之巨噬細胞可形成針對深色染色胸腺細胞之背景呈現為深色環形區域（「星空」圖案）之「可染小體」。大量可染小體為應激退化之特徵，其可能在正常胸腺供體中由於嚴重心臟缺陷、手術及/或皮質類固醇治療之應激而發生且不會摒棄用於植入之胸腺。在培養之前（第0天）切片正常胸腺之典型組織學特徵展示於圖71-D中。

對胸腺小體之評定

胸腺髓質含有稱為胸腺小體之特徵結構，其由與單株抗體反應之末端分化的胸腺上皮細胞構成，該等單株抗體亦與表皮之末端分化的上層反應。Hale LP等人, 2004; 172: 617-624。

胸腺小體可充當組織一致性之標記物，因為其僅存在於胸腺中。其亦可反映輸入供體組織之品質，因為終末分化過程通常由胸腺細胞-胸腺上皮細胞相互作用觸發。同上。胸腺小體通常容易藉由其外觀而鑑別為H&E染色載玻片上之上皮細胞的嗜伊紅血球性螺紋（圖72A-D）。最中心的層通常缺乏細胞核。可變量之細胞碎片亦可存在於胸腺小體之中心。用泛細胞角蛋白AE1/AE3抗體極強烈地染色胸腺小體，若在蘇木精及曙紅（H&E）染色的載玻片中未明確鑑別，則其可用作此等結構之一致性的二次確認。

在培養期間之一般胸腺細胞變化

胸腺細胞隨著在培養基變化期間利用清除或利用胸腺細胞死亡來培養胸腺組織、隨後在組織內降解而逐漸地損失（圖72至圖75）。然而，不同於活體內發生之情形，死細胞可能由於不能募集吞噬細胞來清除其而長期保留於所培養之胸腺中。經歷細胞死亡之胸腺細胞核可展示固縮（染色體凝聚）及核破裂（細胞核碎裂），但通常，因為此等細胞耗乏其能量但不為吞噬性的，所以其展示出核膜完整性損失之粗糙核邊緣。核溶解（壞死細胞中細胞核之完全溶解）通常在活體內2至3天內發生，但似乎在胸腺培養期間更緩慢地發生。在培養5至9天之後，大部分胸腺細胞保留細胞核，但核膜不完整，表明早期壞死（圖24）。即使在保留細胞核時，此等改變的細胞核特徵有助於區分活的及非活的胸腺細胞。亦可發現嗜伊紅血球性壞死細胞碎片之較大病灶，其中胸腺細胞核已經歷核溶解（圖73）。

細胞完整性及組織架構之組織學評定.

當植入經培養胸腺組織時，重要的係能夠準確地區分具有大量胸腺細胞壞死但繁衍胸腺上皮細胞（用於植入之最佳組織）之切片與具有類似壞死量的切片，其中胸腺上皮細胞亦受損。儘管其無法直接評定生存力，但H&E載玻片之組織學檢查可評定正常結構之保存程度及細胞死亡指示物之存在或不存在。如上文所描述，預期胸腺細胞在培養過程期間耗乏。在每日培養基改變期間，自切片洗滌許多胸腺細胞。許多其他胸腺細胞將原位死亡，其中其細胞核及細胞體可保持較長時段。然而，死亡的胸腺細胞之膜完整性受損且其細胞核展現「粗糙的」邊緣。胸腺細胞碎片可凝集在一起，使得不可能辨別單個細胞邊界。胸腺細胞死亡及耗乏為培養之預期且合乎需要的結果，且完整胸腺細胞核之相對缺乏可能反映切片品質。

當胸腺細胞自組織耗乏時，更容易觀測到胸腺上皮細胞。活胸腺上皮細胞之細胞核通常為橢圓形，其大於胸腺細胞之細胞核，且具有由蘇木精染料所勾勒之清晰界定之核膜，及一或多種核仁。此等胸腺上皮細胞核通常看起來「開放」，意謂其不會經蘇木精染成深色。此與其存活及代謝活性之解釋擬合，此係因為活性染色體（「真染色質」）不結合蘇木精染料。在許多胸腺上皮細胞中存在作為核糖體合成位點之核仁進一步證實其在固定時存活且具有代謝活性。完整及呈現活力的胸腺上皮細胞之實例展示於圖77A-B中。

自第0天至第21天之任何給定時間點，多個胸腺切片之仔細微觀檢查顯示來源於相同供體胸腺之所有切片彼此極其類似。在來源於相同胸腺之不同切片之間觀測到的隨培養時間變化之差異主要與壞死量（隨著培養時間增加而增加）及殘餘胸腺細胞數目（隨著培養時間增加而減少）相關。當在相同時間點檢查時，來源於不同供體之切片亦定性地彼此類似。不同供體組織之間的差異包括相對大小、形狀、胸腺與髓質之相對含量（但兩者皆始終存在於所檢查之各切片上）、壞死量、胸腺上皮細胞之凝聚及殘餘T細胞數目。在培養之第5天已出現組織學外觀之大部分變化，通常隨著培養進展僅有胸腺細胞額外耗乏。

評定胸腺上皮架構.

含有抗細胞角蛋白抗體AE1及AE3（AE1/AE3）之混合物偵測基本上所有胸腺上皮細胞。相比之下，與CK14具有反應性之抗體偵測存在於囊下皮質中且在整個皮質及髓質之剩餘部分中看起來分散之胸腺上皮細胞亞群。此等CK14+細胞中之一些已表明具有分化成皮質及髓質上皮細胞兩者的潛力， Lee EN, Park JK, Lee J-R, Oh S-O, Baek S-Y, Kim B-S等人, 2011, 「《在急性胸腺退化後胸腺再生期間小鼠胸腺上皮細胞中之細胞角蛋白5、8及14之表現的表徵》」, 《解剖學與細胞生物學》44: 14-24，且因此表示長期再生細胞。隨著胸腺細胞自組織耗乏，胸腺上皮細胞變得更可見。三維胸腺上皮網路通常在切片中經由連接之上皮細胞及/或看起來分散的胸腺上皮細胞（其連接在所檢查之切片中不明顯）之淺色及花邊配置展現。隨著胸腺細胞在培養期間損失，三維胸腺上皮網路收縮至不同程度。此可導致殘餘上皮細胞凝聚，使得囊下皮質上皮層變得較厚且髓質胸腺上皮細胞變得更密集堆積。此等變化之實例展示於圖70A-D及圖73至圖75中，用於在第0天（接受當天）、第7天、第9天、第12天及第20天檢查之單一胸腺批次。儘管損失許多胸腺細胞及可能含有壞死碎片之較大區域，但胸腺上皮細胞網路之整體架構通常保持良好保存直至培養至少21天（圖78A-E）。

殘餘T細胞之評定

如上文所描述，培養意欲用於植入之供體胸腺組織之主要目的為部分耗乏T細胞以促進植入切片與接受者胸腺細胞前驅體移生且降低移植物抗宿主病之風險。不成熟T細胞（胸腺細胞）及成熟T細胞可在組織學切片中藉由其形態以及藉由偵測由此等細胞類型特異性表現之蛋白質的免疫組織化學染色來鑑別。CD3為抗原之T細胞受體之組分，其存在於大於95%之皮質及髓質胸腺細胞以及所有成熟T細胞上。在第0天，皮質及髓質中之基本上所有不成熟T細胞之質膜呈現與呈膜模式之CD3抗體具有強反應性（圖79A-B）。隨著培養繼續，活胸腺細胞/T細胞在膜模式下繼續與CD3抗體反應。然而，CD3抗體亦與死胸腺細胞（包括在死胸腺細胞經歷核溶解之後保留的無核碎片）強烈反應（圖79D、圖79G及圖79I-K）。如此多的胸腺細胞碎片殘留，當在低放大倍數下觀察時，切片可仍然呈現強烈且均勻的棕色（圖79C、圖79F、圖79H、圖79J），儘管在較高放大率下（例如40×物鏡）檢查載玻片證實在此等時間點存在相對極少的完整的潛在活胸腺細胞。非活細胞及細胞碎片將在移植之後由接受者吞噬細胞清除，且因此不傳遞移植物抗宿主病之風險。通常不可能準確鑑別組織區域中之CD3+膜免疫反應性，其中大量的強染色碎片妨礙對相鄰細胞之細胞膜的評估。然而，即使在培養期間之晚期時間點，CD3免疫組織化學通常突出顯示至少一些具有完整質膜之胸腺細胞/T細胞，表明其仍可存活（圖79E、圖79G、圖79I-K）。

細胞增殖之評定

Ki-67抗原在所有增殖的細胞之細胞核中表現（亦即，不在細胞週期之G0階段中）。在第0天，存在於胸腺皮質內之大部分不成熟胸腺細胞增殖且其細胞核與對Ki-67增殖抗原具有特異性之抗體強烈反應。相比之下，僅罕見的更成熟髓質胸腺細胞及/或上皮或基質細胞與此抗體反應（圖66A-B）。在培養第1天至第2天之後觀測到的免疫反應性之模式屬於分散的稀有陽性細胞，其幾乎皆具有胸腺上皮細胞之較大細胞核特徵。因此，Ki-67染色可為用於記錄切片內胸腺上皮細胞之生存力的適用之輔助染色。

論述

此等實驗描述當出生後人類胸腺培養至多21天時發生之組織病理學變化，且表明使用H&E及細胞角蛋白免疫反應性之組織病理學檢查可適用於評定意欲用於植入之經培養胸腺切片的品質。隨著胸腺培養有進展，切片出現壞死量增加、胸腺上皮細胞凝聚增加及殘餘T細胞之數目減少。胸腺上皮細胞在整個21天培養中保持完整，且細胞角蛋白14（具有長期器官再生潛力之胸腺上皮細胞的推定生物標記物）持續表現。來自相同胸腺之切片定性地類似，使得單個切片可充分代表整個胸腺。來源於不同供體之經培養胸腺切片之組織學外觀的可變性在任何給定時間點亦最小。在培養期間早期（例如，第5至9天）觀測到的組織組織學密切反映在培養後期（例如，第12至21天）觀測到之情況，但在較晚時間點觀測到更多胸腺細胞耗乏及壞死。

識別CK14或所有類型之細胞角蛋白（AE1/AE3）之抗體的免疫組織化學適用於評估經培養之胸腺切片。細胞角蛋白中間絲為所有上皮細胞之細胞骨架之重要組分。泛細胞角蛋白AE1/AE3染色表明檢查之胸腺切片內之上皮網路，其在較晚時間點僅使用H&E染色可不容易地辨別。已展示由特定胸腺上皮細胞表現之細胞角蛋白之特定類型視其發育階段及分化及功能狀態而定。在小鼠中，與CK5、CK8及CK14反應之抗體最常用於鑑別胸腺上皮細胞亞型，Lee EN等人, 2011, 《解剖學與細胞生物學》, 44: 14-24。在此研究中，基於前述研究測定CK14表現，其中假設CK14表現為具有分化為皮質或髓質譜系之潛力的胸腺上皮細胞之特性，Li B, Li J, Devlin BH, Markert ML., 2011, 「《在出生後人類胸腺移植之後的胸腺微環境重建》」， 《臨床免疫學》140: 244-259。儘管長效免疫重建之臨床結果（Markert ML等人, 《血液》, 109: 4539-4547）表明胸腺上皮祖細胞有可能存在於植入胸腺切片內，此類祖細胞之精確表現型尚未在人類中確定鑑別。小鼠中之胸腺上皮祖細胞之表現型仍然為有爭論的，Bennett AR, Farley A, Blair NF, Gordon J, Sharp L, Blackburn CC., 2002, 「《胸腺上皮祖細胞之鑑別及表徵》」, 《免疫》16: 803-814；Wong K, Lister NL, Barsanti M, Lim JMC, Hammett MV, Khong DM等人, 2014, 「《多系潛力及自體更新限定成人胸腺中之上皮祖細胞群》」, 《細胞通訊（Cell Rep）》. 8: 1198-1209；Ucar A, Ucar O, Klug P, Matt S, Brunk F, Hofmann TG等人, 2014, 「《成人胸腺含有FoxN1(-)上皮幹細胞，對髓質及皮質胸腺上皮譜系具有雙能作用》」, 《免疫》, 41: 257-269；Ulyanchenko S, O'Neill KE, Medley T, Farley AM, Vaidya HJ, Cook AM, 2016, 「《鑑別成人胸腺中之雙能上皮祖細胞群》」, 《細胞通訊》, 14: 2819-2832，且已使用多種抗體及多色流式細胞量測術僅偵測到低數目。因此，直接偵測人類組織切片中之胸腺上皮祖細胞目前不可行。

此等實驗鑑定在培養第12至21天時（可能植入組織時之時間點）胸腺切片內殘留的潛在大量壞死細胞材料。在植入之後數個月的活組織檢查展示無此壞死材料之證據，Markert ML, Li J, Devlin BH, Hoehner JC, Rice HE, Skinner MA, 2008, 「《使用同種異體移植活組織檢查以評定胸腺移植之後的胸腺生成》」, 《免疫學雜誌》, 180: 6354-6364。儘管不希望受任何特定理論束縛，但申請人認為在植入時初始存在此壞死碎片及其下層胞外基質可用以保存切片之功能架構，包括用於產生胸腺細胞之皮質及髓質生態棲位。胸腺去細胞化方法之近期使用，其保存胞外基質以重建可支援上皮細胞及造血前驅體之細胞分化的鼠類胸腺「類器官」，Hun M, Barsanti M, Wong K, Ramshaw J, Werkmeister J, Chidgey AP, 2017, 「《天然胸腺胞外基質改善活體內胸腺類器官T細胞輸出，且驅動活體外胸腺上皮細胞分化》」, 《生物材料》, 118: 1-15，支援此假設。

先前研究證明，胸腺上皮細胞之生長潛力在所用培養條件下穩固地維持，使得在器官培養開始之後至多12週，可自切片建立細胞角蛋白陽性上皮單層，Markert ML等人, 1997, 《臨床免疫學與免疫病理學》, 82: 26-36。此實例中所描述之實驗不直接評定上皮細胞生存力，而實際上使用完整細胞核之存在作為替代標記物。

實例20

偵測廢培養基中之細胞介素及趨化介素

將來自各種胸腺培養條件之廢培養基樣品遞送至RayBio，Norcross，Georgia，用於一組細胞介素及趨化介素之分析。使用量子體陣列使用螢光偵測進行測試。量子體陣列為基於夾層之玻璃載片多重ELISA（零件編號QAH-CAA-4000，非定製套組）。使用RayBio程序SOP-TF-QAH-001及SOP-TF-QAH-003進行所有測試。發送三組不同樣品且藉由RayBio以2倍稀釋度測試。第一組樣品包括根據測試方案060717 QAH-CAA-4000 SA31 Duke U之製造批次MFG-025、MFG-026及MFG-027。第二組樣品包括根據測試方案091117 Cust-H120 SA31 Duke U之MFG-035、MFG-036及MFG-038。最後一組樣品包括根據測試方案050118 QAH-CAA-4000 SA113 Duke U之MFG-053、MFG-054及MFG-066。第一及第二組樣品利用不同的抗體批次用等效套組進行測試。用定製套組測試第二組，該定製套組使不同抗體濃度之抗體混合物僅靶向某些分析物。用於第二組測試之定製套組與其他套組的基礎相同，但僅針對選擇細胞介素及趨化介素而非較寬目標陣列進行測試。此導致各樣品集之偵測的上限及下限不同，如其由平均背景定義。儘管資料尚未經歸一化，但所有三種樣品提交之趨勢應為代表性的。

在21天培養期間表徵

在常規21天培養之第1、5、7、9、11、13、15、17、19及21天採集來自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036及MFG-038之廢培養基之樣品。

批次MFG-053

處理1：對照

在MC3設施中接受胸腺之後，根據可應用的SOP將胸腺組織切片，如本說明書中其他地方所描述且培養9天。在10-cm圓形組織培養盤中培養胸腺切片，每盤4片。在第5天、第7天及第9天採集廢培養基之樣品以根據方案視需要在各時間點測定生物標記物含量。

處理3：-20℃，4小時

在MC3設施中接受胸腺之後，根據可應用的SOP將胸腺組織切片，如本說明書中其他地方所描述且進行培養。在10-cm圓形組織培養盤中培養胸腺切片，每盤4片。將胸腺切片按程序置放於過濾器之頂部上。在第2天，測試胸腺切片經受-20℃之溫度4小時。將切片放回含有TOM之10-cm培養皿中且培養總共9天。在第5天、第7天及第9天採集廢培養基之樣品以測定各時間點處之生物標記物含量。

處理5：55℃，4小時

在MC3設施中接受胸腺之後，根據可應用的SOP將胸腺組織切片且進行培養。在10-cm圓形組織培養盤中培養胸腺切片，每盤4片。將胸腺切片按程序置放於過濾器之頂部上。在第2天，測試胸腺切片經受55℃之溫度4小時。將切片放回含有TOM之10-cm培養皿中且培養總共9天。在第5天、第7天及第9天採集廢培養基之樣品以測定各時間點處之生物標記物含量。

批次MFG-054

處理1：對照。

處理2：室溫，24小時

在MC3設施中接受胸腺之後，根據可應用的SOP將胸腺組織切片且進行培養。在10-cm圓形組織培養盤中培養胸腺切片，每盤4片。將胸腺切片按程序置放於過濾器之頂部上。在第2天，測試胸腺切片經受室溫24小時。將切片放回含有TOM之10-cm培養皿中且培養總共9天。在第5天、第7天及第9天採集廢培養基之樣品以測定各時間點處之生物標記物含量。

處理3：脫水，24小時

在MC3設施中接受胸腺之後，根據可應用的SOP將胸腺組織切片且進行培養。在10-cm圓形組織培養盤中培養胸腺切片，每盤4片。將胸腺切片按程序置放於過濾器之頂部上。在第2天，測試胸腺切片經歷脫水24小時。將切片放回含有TOM之10-cm培養皿中且培養總共9天。在第5天、第7天及第9天採集廢培養基之樣品以測定各時間點處之生物標記物含量。

處理4：脫水，48小時

在MC3設施中接受胸腺之後，根據可應用的SOP將胸腺組織切片，如本說明書中其他地方所描述且進行培養。在10-cm圓形組織培養盤中培養胸腺切片，每盤4片。將胸腺切片按程序置放於過濾器之頂部上。在第2天，測試胸腺切片經受-20℃之溫度4小時。將切片放回含有TOM之10-cm培養皿中且培養總共9天。在第5天、第7天及第9天採集廢培養基之樣品以測定各時間點處之生物標記物含量。

處理4：生理鹽水，24小時

在MC3設施中接受胸腺之後，根據可應用的SOP將胸腺組織切片且進行培養。在10-cm圓形組織培養盤中培養胸腺切片，每盤4片。將胸腺切片按程序置放於過濾器之頂部上。在第2天，測試胸腺切片經歷脫水48小時。向培養皿中添加TOM且培養切片總共9天。在第5天、第7天及第9天採集廢培養基之樣品以測定各時間點處之生物標記物含量。

處理5：生理鹽水，24小時

在MC3設施中接受胸腺之後，根據可應用的SOP將胸腺組織切片且進行培養。在10-cm圓形組織培養盤中培養胸腺切片，每盤4片。將胸腺切片按程序置放於過濾器之頂部上。在第2天，測試胸腺切片在生理鹽水中而非TOM中培養24小時。在處理後，移除鹽水且根據正常程序添加TOM且培養切片總共9天。在第5天、第7天及第9天採集廢培養基之樣品以測定各時間點處之生物標記物含量。

處理6：生理鹽水，48小時

在MC3設施中接受胸腺之後，根據可應用的SOP將胸腺組織切片且進行培養。在10-cm圓形組織培養盤中培養胸腺切片，每盤4片。將胸腺切片按程序置放於過濾器之頂部上。在第2天，測試胸腺切片經受55℃之溫度4小時。將切片放回含有TOM之10-cm培養皿中且培養總共9天。在第5天、第7天及第9天採集廢培養基之樣品以測定各時間點處之生物標記物含量。

處理7：10× PBS，24小時

在MC3設施中接受胸腺之後，根據可應用的SOP將胸腺組織切片且進行培養。在10-cm圓形組織培養盤中培養胸腺切片，每盤4片。將胸腺切片按程序置放於過濾器之頂部上。在第2天，測試胸腺切片在10× PBS中而非TOM中培養24小時。在處理後，移除10× PBS且根據正常程序添加TOM且培養切片總共9天。在第5天、第7天及第9天採集廢培養基之樣品以測定各時間點處之生物標記物含量。

處理8：1% DMSO，24小時

在MC3設施中接受胸腺之後，根據可應用的SOP將胸腺組織切片且進行培養。在10-cm圓形組織培養盤中培養胸腺切片，每盤4片。將胸腺切片按程序置放於過濾器之頂部上。在第2天，測試胸腺切片經歷1% DMSO持續24小時。將切片放回TOM中且培養總共9天。在第5天、第7天及第9天採集廢培養基之樣品以測定各時間點處之生物標記物含量。

批次MFG-066

處理4：對照

在MC3設施中接受胸腺之後，根據可應用的SOP將胸腺組織切片且培養21天。在10-cm圓形組織培養盤中培養胸腺切片，每盤4片。在第2天至第21天採集廢培養基之樣品以測定各時間點之生物標記物含量。

處理5：-20℃，4小時

在MC3設施中接受胸腺之後，根據可應用的SOP將胸腺組織切片且進行培養。在10-cm圓形組織培養盤中培養胸腺切片，每盤4片。將胸腺切片按程序置放於過濾器之頂部上。在第2天，測試胸腺切片經受-20℃之溫度4小時。切片返回至正常條件且培養總共21天。在第2天至第21天採集廢培養基之樣品以測定各時間點之生物標記物含量。

處理6：55℃，4小時。

在MC3設施中接受胸腺之後，根據可應用的SOP將胸腺組織切片且進行培養。在10-cm圓形組織培養盤中培養胸腺切片，每盤4片。將胸腺切片按程序置放於過濾器之頂部上。在第2天，測試胸腺切片經受55℃之溫度4小時。切片返回至正常條件且培養總共21天。在第2天至第21天採集廢培養基之樣品以測定各時間點之生物標記物含量。

處理7：10× PBS，24小時

在MC3設施中接受胸腺之後，根據可應用的SOP將胸腺組織切片且進行培養。在10-cm圓形組織培養盤中培養胸腺切片，每盤4片。將胸腺切片按程序置放於過濾器之頂部上。在第2天，測試胸腺切片經歷10× PBS持續24小時。將切片放回TOM中且培養總共21天。在第2天及第4天至第21天採集廢培養基之樣品以測定各時間點處之生物標記物含量。

結果

基於對常規及強制降解資料之分析，當與強制降解樣品相比時，四種生物標記物自基於文獻及培養時程內資料中之整體趨勢所研究之12種生物標記物脫穎而出。此等為CCL21、CXCL16、L-選擇素及uPAR。此部分中論述此等四種生物標記物之含量分析。

CCL21 6Ckine

CCL21 6Ckine為一種TEC表現之趨化介素，已展示對胸腺細胞具有趨化性（Liu 2005），其為植入經培養胸腺之後接受者成功免疫重建之關鍵決定因素。

在21天培養期間CCL21之表徵

廢培養基中CCL21含量之描述性統計值呈現於表12中。包括來自強制降解研究批次MFG-053、MFG-054及MFG-066）之對照樣品的資料及來自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036及MFG-038之21天時程樣品的結果。大於分析ULOQ之結果未繪製或包括於統計分析中。 表12：21天內廢培養基中CCL21含量之描述性統計

天數	N	平均值 （ pg/mL ）	標準差 （ pg/mL ）	最小值 （ pg/mL ）	最大值 （ pg/mL ）
1	6	269.3	173.3	118.2	608.3
2	1	1056	--	1056	1056
3	1	1837	--	1837	1837
5	6	9090	4584	3314	16977
7	6	9724	3918	2886	13865
9	6	11896	4579	2871	15084
11	6	17323	8668	3798	30947
13	6	16043	7541	3518	24110
15	6	19550	8611	4040	28863
17	6	16323	6478	5219	23834
19	6	18202	7765	4141	25507
21	6	17817	7570	6157	27366

所分析批次中之每一者的廢培養基中CCL21含量與天數之散點圖提供於圖85中，且盒狀圖提供於圖86中。散點圖展示對於所分析之各批次，廢培養基中CCL21含量在21天時程內增加。盒狀圖指示，一般而言，批次之間的廢培養基中CCL21含量之可變性隨著培養所耗費之時間的增加而增加。在第5至9天可變性最低。批次MFG-036傾向低於CCL21中之其他批次，由於其係使用與其他批次相同之程序製造，因此不存在明顯原因造成任何差異。其他生物標記物並未將此批次展示為明顯不同於其他批次。推薦額外批次之測試及其他分析開發以更好地理解該差異。

強制降解樣品中CCL21含量之表徵

批次 MFG-053及MFG-054

在批次-053（1、3及5）及批次-054（1-8）之強制降解處理期間廢培養基中CCL21含量呈現於表13中，且資料之散點圖提供於圖38中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均CCL21結果之曲線圖（參見表8）。繪製平均結果（n=6）以展現未降解批次，因為對於該分析，強制降解之對照大於ULOQ。應注意，此確實導致幾天的振盪，此係因為並非所有批次皆已在所有日收集樣本。未繪製大於分析ULOQ之結果。 表13：強制降解研究中CCL21含量（pg/mL）-批次MFG-053及MFG-054

樣品	處理	天數
5	7	9
MFG-053-1	對照	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ
MFG-053-3	55℃，4小時	444.44	204.91	93.23
MFG-053-5	-20℃，4小時	535.62	262.26	206.28
MFG-054-1	對照	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ
MFG-054-2	室溫，24小時	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ
MFG-054-3	脫水，24小時	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ
MFG-054-4	脫水，48小時	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ
MFG-054-5	生理鹽水，24小時	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ
MFG-054-6	生理鹽水，48小時	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ
MFG-054-7	10× PBS，24小時	242.90	124.75	26.54
MFG-054-8	1% DMSO，24小時	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ

批次MFG-066

在批次-066（4-7）之強制降解處理期間廢培養基中CCL21含量呈現於表14中，且資料之散點圖提供於圖39中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均CCL21結果之曲線圖（參見表7）。繪製平均結果（n=6）以展現未降解批次，因為對於該分析，強制降解之對照大於ULOQ。應注意，此確實導致幾天的振盪，此係因為並非所有批次皆已在所有日收集樣本。未繪製大於ULOQ之結果。在LOD處繪製小於LOD之結果。 表14：強制降解研究中CCL21含量（pg/mL）-批次MFG-066

天數	處理
MFG-066-4 對照	MFG-066-5 -20℃ ， 4 小時	MFG-066-6 55℃ ， 4 小時	MFG-066-7 10× PBS ， 24 小時
2	1055.77	1218.52	1742.07	1167.76
3	1836.70	1201.87	3925.59	N/A
4	＞ ULOQ	839.84	845.34	699.39
5	＞ ULOQ	877.32	471.78	392.67
6	＞ ULOQ	754.17	256.94	396.58
7	＞ ULOQ	559.68	282.62	279.21
8	＞ ULOQ	588.84	104.05	298.42
9	＞ ULOQ	688.31	161.01	201.13
10	＞ ULOQ	1050.48	84.54	133.97
11	＞ ULOQ	829.68	81.83	93.49
12	＞ ULOQ	1369.54	89.00	87.53
13	＞ ULOQ	1208.39	230.84	72.30
14	＞ ULOQ	1256.14	48.61	62.37
15	＞ ULOQ	985.02	57.27	＜ LOD
16	＞ ULOQ	982.11	32.06	＜ LOD
17	＞ ULOQ	677.25	＜ LOD	＜ LOD
18	＞ ULOQ	1004.75	70.45	32.59
19	＞ ULOQ	687.93	25.76	22.20
20	＞ ULOQ	703.81	＜ LOD	＜ LOD
21	＞ ULOQ	666.17	＜ LOD	＜ LOD

ULOQ = 4,444.4 pg/mL；LOD = 22.2 pg/mL。

CXCL16

已展示CXCL16趨化介素由TEC產生（Bunting 2011）。受體之表現在皮質中之恆定自然殺手T細胞（iNKT）細胞陽性選擇期間經誘導且亦展示在髓質中為可偵測的（Cowan，2015）。

在21天培養期間CXCL16之表徵

廢培養基中CXCL16含量之描述性統計呈現於表15中。包括來自強制降解研究（批次MFG-053、MFG-054及MFG-066）之對照樣品的資料以及來自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036及MFG-038之結果。 表15：21天內廢培養基中CXCL16含量之描述性統計

天數	N	平均值 （ pg/mL ）	標準差 （ pg/mL ）	最小值 （ pg/mL ）	最大值 （ pg/mL ）
1	6	1219	915	560	2919
2	1	858	--	858	858
3	1	625	--	625	625
4	1	815	--	815	815
5	9	1382	770	367	2643
6	1	1261	--	1261	1261
7	9	1888	696	581	2735
8	1	1880	--	1880	1880
9	9	2262	798	767	3381
10	1	2151	--	2151	2151
11	7	2739	834	1694	4154
12	1	3036	--	3036	3036
13	7	2887	317	2439	3344
14	1	3305	--	3305	3305
15	7	3401	774	2463	4739
16	1	2110	--	2110	2110
17	7	2923	567	2068	3777
18	1	2224	--	2224	2224
19	7	3146	776	2496	4770
20	1	2171	--	2171	2171
21	7	3175	630	2296	3875

所分析批次中之每一者的廢培養基中CXCL16含量與天數之散點圖提供於圖89中，且盒狀圖提供於圖90中。散點圖展示對於所分析之各批次，廢培養基中CXCL16含量在21天時程內增加。盒狀圖指示，批次之間的廢培養基中CXCL16含量之可變性隨著培養所耗費之時間的增加而極其一致。

強制降解樣品中CXCL16含量之表徵

批次MFG-053及批次MFG-054

在批次-053（1、3及5）及批次-054（1-8）之強制降解處理期間廢培養基中CXCL16含量呈現於表16中，且資料之散點圖提供於圖91中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均CXCL16結果之曲線圖（參見表9）。繪製平均結果（n=6）以展現未降解批次，因為對於該分析，強制降解之對照大於ULOQ。應注意，此確實導致幾天的振盪，此係因為並非所有批次皆已在所有日收集樣本。對於此分析，移除僅一個批次具有所收集之資料的天數，因為其表示單個批次，導致存在於個別資料圖中之更多振盪。在LOD處繪製小於LOD之結果。 表16：強制降解研究中CXCL16含量（pg/mL）-批次MFG-053及批次MFG-054

樣品	處理	天數
5	7	9
MFG-053-1	對照	2189.56	2186.22	2022.29
MFG-053-3	55℃，4小時	30.93	＜ LOD	＜ LOD
MFG-053-5	-20℃，4小時	90.40	33.04	＜ LOD
MFG-054-1	對照	366.89	581.29	767.14
MFG-054-2	室溫，24小時	343.08	205.64	473.06
MFG-054-3	脫水，24小時	501.35	999.45	1593.32
MFG-054-4	脫水，48小時	419.68	555.55	1672.57
MFG-054-5	生理鹽水，24小時	297.52	913.83	748.42
MFG-054-6	生理鹽水，48小時	448.61	897.02	657.56
MFG-054-7	10× PBS，24小時	83.97	16.69	＜ LOD
MFG-054-8	1% DMSO，24小時	387.73	450.04	910.37

批次MFG-066

在批次-066（4-7）之強制降解處理期間廢培養基中CXCL16含量呈現於表17中，且資料之散點圖提供於圖92中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均CXCL16結果之曲線圖（參見表9）。繪製平均結果（n=6）以展現未降解批次，因為對於該分析，強制降解之對照大於ULOQ。應注意，此確實導致幾天的振盪，此係因為並非所有批次皆已在所有日收集樣本。對於此分析，移除僅一個批次具有所收集之資料的天數，因為其表示單個批次，導致存在於個別資料圖中之更多振盪。在LOD處繪製小於LOD之結果。 表17：強制降解研究中CXCL16含量（pg/mL）-批次MFG-066

天數	處理
MFG-066-4 對照	MFG-066-5 -20℃ ， 4 小時	MFG-066-6 55℃ ， 4 小時	MFG-066-7 10× PBS ， 24 小時
2	858.18	642.28	982.28	858.53
3	624.66	474.03	405.94	N/A
4	814.60	165.71	120.34	316.00
5	1359.07	180.45	58.36	126.00
6	1260.63	157.88	26.27	91.89
7	1360.16	93.07	17.81	55.73
8	1880.25	99.93	＜ LOD	21.82
9	1764.02	118.51	＜ LOD	＜ LOD
10	2150.67	215.01	＜ LOD	＜ LOD
11	1694.25	153.79	＜ LOD	＜ LOD
12	3035.93	257.70	＜ LOD	＜ LOD
13	2439.40	275.28	＜ LOD	＜ LOD
14	3304.55	361.69	＜ LOD	＜ LOD
15	2781.62	324.09	＜ LOD	＜ LOD
16	2109.69	263.37	＜ LOD	＜ LOD
17	2067.51	269.48	＜ LOD	＜ LOD
18	2224.33	430.96	＜ LOD	＜ LOD
19	2648.50	419.62	＜ LOD	＜ LOD
20	2170.56	420.26	＜ LOD	＜ LOD
21	2632.22	243.42	＜ LOD	＜ LOD

L-選擇素.

L-選擇素以高含量在發育及原生T細胞上表現。當培養胸腺細胞時，其自細胞表面釋放。通常當活體內健康細胞脫落時快速再表現（Fitzhugh 2008），脫落水準逐漸降低有可能反映胸腺細胞生存力之逐漸喪失，此係因為在培養期間其通常不在表面上再表現此分子（A. Macintyre，未公開資料）。

在21天培養期間L-選擇素之表徵

在21天時程內，廢培養基中L-選擇素含量之描述性統計呈現於表18中。包括來自強制降解研究（批次MFG-053、MFG-054及MFG-066）之對照樣品的資料以及來自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036及MFG-038之結果。 表18：21天內廢培養基中L-選擇素含量之描述性統計

天數	N	平均值 （ pg/mL ）	標準差 （ pg/mL ）	最小值 （ pg/mL ）	最大值 （ pg/mL ）
1	6	28833	10290	14966	43399
2	1	8299	--	8299	8299
3	1	5350	--	5350	5350
4	1	2647	--	2647	2647
5	9	5719	3535	2306	12219
6	1	1274	--	1274	1274
7	9	4589	3440	740	12573
8	1	695	--	695	695
9	9	3630	2678	566	9924
10	1	570	--	570	570
11	7	3130	2971	448	9297
12	1	729	--	729	729
13	7	2597	3472	367	10396
14	1	790	--	790	790
15	7	2453	3110	289	9385
16	1	179	--	179	179
17	7	1834	2386	446	7170
18	1	452	--	452	452
19	7	1965	1803	488	5934
20	1	496	--	496	496
21	7	1578	2307	289	6755

所分析批次中之每一者的廢培養基中L-選擇素含量與天數之散點圖提供於圖93中，且盒狀圖提供於圖94中。散點圖展示對於所分析之各批次，廢培養基中L-選擇素含量在21天時程內降低。盒狀圖指示批次之間的廢培養基中L-選擇素含量之可變性通常隨著培養中所耗費的時間增加且隨著L-選擇素含量接近零而降低。

強制降解樣品中L-選擇素含量之表徵

批次MFG-053及批次MFG-054

在批次-053（1、3及5）及批次-054（1-8）之強制降解處理期間廢培養基中L-選擇素含量呈現於表19中，且資料之散點圖提供於圖95中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均L-選擇素結果之曲線圖（參見表18）。繪製平均結果（n=6）以展現未降解批次，因為對於該分析，強制降解之對照大於ULOQ。對於此分析，移除僅一個批次具有所收集之資料的天數，因為其表示單個批次，導致存在於個別資料圖中之更多振盪。   在LOD處繪製小於LOD之結果。 表19：強制降解研究中L-選擇素含量（pg/mL）-批次MFG-053

樣品	處理	天數
5	7	9
MFG-053-1	對照	9798.40	6609.20	5079.13
MFG-053-3	55℃，4小時	2999.26	482.28	246.81
MFG-053-5	-20℃，4小時	5301.16	1172.91	223.17
MFG-054-1	對照	7109.64	4058.36	3174.80
MFG-054-2	室溫，24小時	7401.82	2167.23	3192.93
MFG-054-3	脫水，24小時	9755.36	7403.73	4551.37
MFG-054-4	脫水，48小時	12371.63	7316.71	4915.73
MFG-054-5	生理鹽水，24小時	4662.78	4475.18	2726.21
MFG-054-6	生理鹽水，48小時	7188.82	4556.11	1558.68
MFG-054-7	10× PBS，24小時	740.20	385.16	＜ LOD
MFG-054-8	1% DMSO，24小時	3830.68	1806.22	2506.04

批次MFG-066.

在批次-066（4-7）之強制降解處理期間廢培養基中L-選擇素含量呈現於表19中，且資料之散點圖提供於圖96中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均L-選擇素結果之曲線圖（參見表18）。在LOD處繪製小於LOD之結果。

uPAR（CD87）

uPAR（CD87）為基於替代性剪接以可溶性及膜結合形式表現之尿激酶受體（亦稱為尿激酶纖維蛋白溶酶原活化因子受體）。其有助於胞外基質之局部降解。已展示其在人類胸腺中且藉由在傷口邊緣處遷移表皮角質細胞（EK）來表現（Loughner 2016）。此後一特徵為最受關注的，因為TEC反映許多基因之表現中之EK（Patel 1995）。    藉由經培養胸腺切片分泌之逐漸增加可反映TE之活化且因此可為在植入後TE過度生長之標記物。

在21天培養期間uPAR之表徵.

在21天時程內，廢培養基中uPAR含量之描述性統計呈現於表20中。包括來自強制降解研究（批次MFG-053、MFG-054及MFG-066）之對照樣品的資料以及來自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036及MFG-038之結果。 表20：21天內廢培養基中uPAR含量之描述性統計

天數	N	平均值 （ pg/mL ）	標準差 （ pg/mL ）	最小值 （ pg/mL ）	最大值 （ pg/mL ）
1	6	1168	190	973	1418
2	1	226	--	226	226
3	1	354	--	354	354
4	1	373	--	373	373
5	9	3336	2475	649	8285
6	1	614	--	614	614
7	9	4166	2748	577	8554
8	1	827	--	827	827
9	9	5772	3436	1086	9476
10	1	1178	--	1178	1178
11	7	9282	4444	1180	14195
12	1	1760	--	1760	1760
13	7	9749	4342	1759	15015
14	1	1640	--	1640	1640
15	7	11025	5142	1434	16984
16	1	1810	--	1810	1810
17	7	11262	5069	2286	16818
18	1	2349	--	2349	2349
19	7	11167	5257	2728	18078
20	1	2358	--	2358	2358
21	7	11370	4903	2432	17772

所分析批次中之每一者的廢培養基中uPAR含量與天數之散點圖提供於圖97中，且盒狀圖提供於圖98中。散點圖展示，對於所分析之各批次，廢培養基中uPAR含量在21天時程內增加，具有中度批次間可變性。盒狀圖指示，批次之間的廢培養基中uPAR含量之可變性通常隨著培養所耗費之時間的增加而增加。

強制降解樣品中uPAR含量之表徵

批次MFG-053及批次MFG-054

在批次-053（1、3及5）及批次-054（1-8）之強制降解處理期間廢培養基中uPAR含量呈現於表21中，且資料之散點圖提供於圖99中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均uPAR結果之曲線圖（參見表21）。由於此資料並未在批次之間歸一化，且存在大量批次間可變性，因此圖99中呈現之平均資料高度取決於在哪些天測試哪些批次。僅測試一個批次之天數自圖示上之平均值排除。 表21：強制降解研究中uPAR含量（pg/mL）-批次MFG-053

樣品	處理	天數
5	7	9
MFG-053-1	對照	1586.63	1876.48	2209.44
MFG-053-3	55℃，4小時	623.75	357.64	114.32
MFG-053-5	-20℃，4小時	769.17	392.63	114.06
MFG-054-1	對照	868.64	742.05	1253.03
MFG-054-2	室溫，24小時	554.80	571.46	772.94
MFG-054-3	脫水，24小時	970.93	960.90	1308.89
MFG-054-4	脫水，48小時	1395.64	1092.91	1438.90
MFG-054-5	生理鹽水，24小時	684.60	1174.55	745.63
MFG-054-6	生理鹽水，48小時	795.46	1394.48	1047.94
MFG-054-7	10× PBS，24小時	187.83	131.33	81.76
MFG-054-8	1% DMSO，24小時	517.56	725.97	894.00

批次MFG-066

在批次-066（4-7）之強制降解處理期間廢培養基中uPAR含量呈現於表22中，且資料之散點圖提供於圖100中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均uPAR結果之曲線圖（參見表21）。在LOD處繪製小於LOD之結果。 表21：強制降解研究中uPAR含量（pg/mL）-批次MFG-066

天數	處理
MFG-066-4 對照	MFG-066-5 -20℃ ， 4 小時	MFG-066-6 55℃ ， 4 小時	MFG-066-7 10× PBS ， 24 小時
2	226.24	310.87	238.27	269.59
3	354.17	552.13	244.32	N/A
4	373.38	398.20	199.96	287.12
5	648.60	327.72	118.72	214.89
6	614.27	307.83	105.12	173.27
7	576.95	253.79	96.84	125.15
8	827.26	425.72	60.88	117.14
9	1085.62	454.03	30.14	107.97
10	1177.62	573.41	33.07	86.39
11	1180.05	472.15	37.90	85.87
12	1759.50	816.44	46.03	91.19
13	1758.80	687.40	109.49	57.20
14	1639.73	728.67	26.22	54.81
15	1434.30	633.52	＜ LOD	26.11
16	1810.32	484.86	＜ LOD	＜ LOD
17	2286.43	564.93	＜ LOD	＜ LOD
18	2349.14	973.23	27.01	＜ LOD
19	2728.06	707.92	＜ LOD	＜ LOD
20	2358.15	680.65	27.13	＜ LOD
21	2432.05	563.35	＜ LOD	＜ LOD

LOD = 25.4 pg/mL。

相關性.

對四組生物標記物資料（CCL21、CXCL16、L-選擇素及uPAR）進行常態測試（Ryan-Joiner）。CCL21（大於 0.087）及CXCL16（大於 0.100）之p值指示其遵循常態分佈。L-選擇素（＜ 0.010）及uPAR（＜ 0.010）之p值指示其不遵循常態分佈。皮爾森相關性係數（Pearson correlation coefficients）係針對相關性中之每一者而判定且呈現於表22中。係數為統計學上顯著的，且所有均展現彼此之較強相關性，除了L-選擇素與所有其他生物標記物以外。展示相關性之回歸模型提供於圖101至圖103中。在CCL21與uPAR之間觀測到最強相關性。出於視覺目的展示回歸。 表22：CCL21、CXCL16、L-選擇素及uPAR之皮爾森相關性係數

	CCL21	CXCL16	L- 選擇素
CXCL16	0.606
L- 選擇素	-0.486	-0.374
uPAR	0.817	0.727	-0.278

其他結果

CCL11（伊紅趨素）

CCL11趨化介素（伊紅趨素）由髓質TE產生（Bunting 2011）。最初關於其吸引嗜伊紅血球之能力進行命名，且已展示嗜伊紅血球浸潤可在具有活性胸腺生成之胸腺組織中顯著（Flores 1999）；然而，亦已展示CCL11充當用於雙陽性及單陽性人類胸腺細胞之化學引誘劑（Bunting 2011）。

在21天培養期間CCL11之表徵

在21天時程內，廢培養基中CCL11含量之描述性統計呈現於表23中。包括來自強制降解研究（批次MFG-053、MFG-054及MFG-066）之對照樣品的資料以及來自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036及MFG-038之結果。 表23：21天內廢培養基中CCL11含量之描述性統計

天數	N	平均值 （ pg/mL ）	標準差 （ pg/mL ）	最小值 （ pg/mL ）	最大值 （ pg/mL ）
1	6	2.2	0.7	1.3	3.1
2	1	9.7	--	9.7	9.7
3	1	9.7	--	9.7	9.7
4	1	9.7	--	9.7	9.7
5	9	22.9	41.3	1.3	131.3
6	1	9.7	--	9.7	9.7
7	9	36.5	20.7	9.7	66.0
8	1	26.9	--	26.9	26.9
9	9	85.4	81.6	11.2	254.4
10	1	31.8	--	31.8	31.8
11	7	98.2	69.7	22.7	234.3
12	1	96.2	--	96.2	96.2
13	7	123.6	74.4	37.8	257.4
14	1	116.5	--	116.5	116.5
15	7	151.1	83.2	54.1	265.9
16	1	160.5	--	160.5	160.5
17	7	176.7	103.3	77.1	384.6
18	1	310.6	--	310.6	310.6
19	7	201.0	112.7	106.1	414.7
20	1	231.2	--	231.2	231.2
21	7	227.6	127.2	101.4	441.9

所分析批次中之每一者的廢培養基中CCL11含量與天數之散點圖提供於圖104中且盒狀圖提供於圖105中。線性回歸模型提供於圖106中。散點圖展示對於所分析之各批次，廢培養基中CCL11含量在21天時程內線性增加。盒狀圖指示批次之間的廢培養基中CCL11含量之可變性隨培養所耗費之時間增加而增加，此亦會藉由隨時間推移增加之標準差值展示於表24中。在第5至9天可變性最低。來自回歸分析之經調節R ²值指示培養所耗費之時間解釋CCL11含量之可變性的51.2%。

批次MFG-053及批次MFG-054

在批次-053（1、3及5）及批次-054（1-8）之強制降解處理期間廢培養基中CCL11含量呈現於表24中，且資料之散點圖提供於圖107中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均CCL11結果之曲線圖（參見表23）。在LOD處繪製小於LOD之結果。 表24：強制降解研究中CCL11含量（pg/mL）-批次MFG-053

樣品	處理	天數
5	7	9
MFG-053-1	對照	＜ LOD	58.88	254.39
MFG-053-3	55℃，4小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-053-5	-20℃，4小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-1	對照	＜ LOD	＜ LOD	11.16
MFG-054-2	室溫，24小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-3	脫水，24小時	＜ LOD	14.61	35.01
MFG-054-4	脫水，48小時	＜ LOD	57.41	109.19
MFG-054-5	生理鹽水，24小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-6	生理鹽水，48小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-7	10× PBS，24小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-8	1% DMSO，24小時	＜ LOD	16.69	32.58

批次MFC-066

在批次-066（4-7）之強制降解處理期間廢培養基中CCL11含量呈現於表25中，且資料之散點圖提供於圖108中。在LOD處繪製小於LOD之結果。 表25：強制降解研究中CCL11含量（pg/mL）-批次MFG-066

天數	處理
MFG-066-4 對照	MFG-066-5 -20℃ ， 4 小時	MFG-066-6 55℃ ， 4 小時	MFG-066-7 10× PBS ， 24 小時
2	0.00	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
3	0.00	＜ LOD	＜ LOD	N/A
4	0.00	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
5	3.10	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
6	8.40	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
7	13.58	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
8	26.90	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
9	36.90	50.66	＜ LOD	＜ LOD
10	31.84	140.66	＜ LOD	＜ LOD
11	39.28	264.99	＜ LOD	＜ LOD
12	96.19	545.87	＜ LOD	＜ LOD
13	101.91	797.66	＜ LOD	＜ LOD
14	116.49	847.03	＜ LOD	＜ LOD
15	177.41	853.97	＜ LOD	＜ LOD
16	160.51	980.33	＜ LOD	＜ LOD
17	162.22	985.17	＜ LOD	＜ LOD
18	310.58	1367.42	＜ LOD	＜ LOD
19	255.68	1089.50	＜ LOD	＜ LOD
20	231.17	1220.33	＜ LOD	＜ LOD
21	343.86	1124.40	＜ LOD	＜ LOD

LOD = 9.7 pg/mL。

骨橋蛋白（OPN）

骨橋蛋白（OPN）為由SPP1基因編碼之細胞介素且在胸腺應激期間增加。增加之含量與胸腺萎縮（胸腺細胞數目減少）相關，其為經培養胸腺之理想狀態（Wang 2009；Gridley 2013）。OPN為製備皮質類固醇所需的，其已證實誘導胸腺細胞凋亡。

在21天培養期間OPN之表徵

在21天時程內，廢培養基中OPN含量之描述性統計呈現於表26中。包括來自強制降解研究（批次MFG-053、MFG-054及MFG-066）之對照樣品的資料以及來自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036及MFG-038之結果。 表26：21天內廢培養基中OPN含量之描述性統計

天數	N	平均值 （ pg/mL ）	標準差 （ pg/mL ）	最小值 （ pg/mL ）	最大值 （ pg/mL ）
1	6	5592	3632	2483	12084
2	1	5941	--	5941	5941
3	1	5124	--	5124	5124
4	1	6688	--	6688	6688
5	9	9589	2090	7147	13717
6	1	6471	--	6471	6471
7	9	10283	2246	6755	13942
8	1	7503	--	7503	7503
9	9	10254	2492	6502	14907
10	1	8358	--	8358	8358
11	7	12962	7206	7640	28982
12	1	9975	--	9975	9975
13	7	10993	1375	9191	13367
14	1	9790	--	9790	9790
15	7	14107	6705	9664	28982
16	1	7629	--	7629	7629
17	7	11386	2479	8067	14821
18	1	6954	--	6954	6954
19	7	12416	2894	8756	16660
20	1	7662	--	7662	7662
21	7	11404	1787	9596	14642

所分析批次中之每一者的廢培養基中OPN含量與天數之散點圖提供於圖109中，且盒狀圖提供於圖110中。二次回歸模型提供於圖111中。散點圖展示對於所分析之各批次，廢培養基中OPN含量在21天時程內增加。盒狀圖指示，批次之間的廢培養基中OPN含量之可變性不展示隨著培養所耗費之時間增加的趨勢。來自回歸分析之經調節R ²值指示培養所耗費之時間解釋OPN含量之可變性的19.3%。

強制降解樣品中OPN含量之表徵.

批次MFG-053及批次MFG-054.

在批次-053（1、3及5）及批次-054（1-8）之強制降解處理期間廢培養基中OPN含量呈現於表27中，且資料之散點圖提供於圖112中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均OPN結果之曲線圖（參見表26）。在LOD處繪製小於LOD之結果。 表27：強制降解研究中OPN含量（pg/mL）-批次MFG-053

樣品	處理	天數
5	7	9
MFG-053-1	對照	9051.16	10494.61	10257.37
MFG-053-3	55℃，4小時	5755.22	2447.84	323.30
MFG-053-5	-20℃，4小時	5412.33	1356.19	311.38
MFG-054-1	對照	8204.45	7425.51	6502.26
MFG-054-2	室溫，24小時	6278.27	6259.90	7061.52
MFG-054-3	脫水，24小時	7922.19	8691.84	8161.90
MFG-054-4	脫水，48小時	6772.23	6950.47	9069.79
MFG-054-5	生理鹽水，24小時	8284.11	8270.36	8650.79
MFG-054-6	生理鹽水，48小時	7884.72	9491.01	7300.88
MFG-054-7	10× PBS，24小時	1199.92	303.01	＜ LOD
MFG-054-8	1% DMSO，24小時	8151.87	7736.58	8673.01

批次MFG-066

在批次-066（4-7）之強制降解處理期間廢培養基中OPN含量呈現於表28中，且資料之散點圖提供於圖113中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均OPN結果之曲線圖（參見表26）。在LOD處繪製小於LOD之結果。 表28：強制降解研究中OPN含量（pg/mL）-批次MFG-066

天數	處理
MFG-066-4 對照	MFG-066-5 -20℃ ， 4 小時	MFG-066-6 55℃ ， 4 小時	MFG-066-7 10× PBS ， 24 小時
2	5941.42	5539.21	5421.78	6531.38
3	5123.63	5976.10	5959.32	N/A
4	6688.17	3893.95	3147.49	5729.23
5	7188.12	2913.08	1763.42	2773.82
6	6470.90	1639.25	662.82	1731.26
7	6754.85	1006.91	322.94	550.05
8	7502.70	981.05	74.27	345.42
9	8490.86	1753.27	＜ LOD	90.47
10	8357.82	2323.33	＜ LOD	90.86
11	7639.75	2008.82	＜ LOD	＜ LOD
12	9975.27	3876.91	＜ LOD	＜ LOD
13	9191.25	3867.66	87.77	＜ LOD
14	9790.47	3446.07	＜ LOD	＜ LOD
15	9663.58	3608.04	＜ LOD	＜ LOD
16	7628.70	2761.86	＜ LOD	＜ LOD
17	8066.54	2377.30	＜ LOD	＜ LOD
18	6954.15	4060.38	＜ LOD	＜ LOD
19	8756.05	3549.93	＜ LOD	＜ LOD
20	7662.28	2800.63	＜ LOD	＜ LOD
21	9596.49	2620.97	＜ LOD	＜ LOD

CXCL12（SDF-1a）

已證明CXCL12（SDF-1a）由囊下皮質及髓質TE產生（Bunting 2011；Hernandez-Lopez 2002；Zaitseva 2002），且亦可由胸腺內存在之胸腺纖維母細胞及內皮細胞製備。已展示CXCL12將B細胞及抗原呈遞細胞（APC）補充至胸腺（Weiss 2003），預期其在產生全胸腺功能方面為重要的。其亦涉及胸腺內之胸腺細胞亞群之定位且其增強胸腺細胞增殖至IL-7（Hernandez-Lopez 2002）。值得注意的係，已展示中和CXCL12之抗體活體外減少人類胸腺器官培養物中之胸腺生成，且CXCL12之添加增加此等培養物中之胸腺生成（Hernandez-Lopez 2002）。

在21天培養期間CXCL12之表徵

在21天時程內，廢培養基中CXCL12含量之描述性統計呈現於表29中。包括來自強制降解研究（批次MFG-053、MFG-054及MFG-066）之對照樣品的資料以及來自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036及MFG-038之結果。 表29：21天內廢培養基中CXCL12含量之描述性統計

天數	N	平均值 （ pg/mL ）	標準差 （ pg/mL ）	最小值 （ pg/mL ）	最大值 （ pg/mL ）
1	6	4.6	0.3	4.3	4.9
2	1	6.3	--	6.3	6.3
3	1	6.3	--	6.3	6.3
4	1	6.3	--	6.3	6.3
5	9	5.2	0.9	4.3	6.3
6	1	6.3	--	6.3	6.3
7	9	6.0	2.5	4.3	12.3
8	1	6.3	--	6.3	6.3
9	9	5.2	0.9	4.3	6.3
10	1	6.3	--	6.3	6.3
11	7	5.3	1.5	4.3	8.3
12	1	8.6	--	8.6	8.6
13	7	5.5	1.6	4.3	8.8
14	1	11.0	--	11.0	11.0
15	7	9.9	5.8	4.9	20.5
16	1	7.5	--	7.5	7.5
17	7	12.6	8.4	4.9	29.7
18	1	12.9	--	12.9	12.9
19	7	20.1	13.2	5.7	37.4
20	1	15.5	--	15.5	15.5
21	7	22.3	14.6	8.2	50.2

所分析批次中之每一者的廢培養基中CXCL12含量與天數之散點圖提供於圖114中，且盒狀圖提供於圖115中。三次回歸模型提供於圖116中。散點圖展示對於所分析之各批次，廢培養基中CXCL12含量在21天時程內增加。盒狀圖指示，批次之間的廢培養基中CXCL12含量之可變性通常隨著培養所耗費之時間的增加而增加。在第5至13天可變性最低。來自回歸分析之經調節R ²值指示培養所耗費之時間解釋CXCL12含量之可變性的44.5%。

強制降解樣品中CXCL12含量之表徵

批次MFG-053及批次MFG-054

在批次-053（1、3及5）及批次-054（1至8）之強制降解處理期間廢培養基中CXCL12 含量呈現於表30中，且資料之散點圖提供於本發明中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均CXCL12結果之曲線圖（參見表29）。在LOD處繪製小於LOD之結果。 桌子30：強制降解研究中的 CXCL12 水平（pg/mL）- 批次MFG-053及批次MFG-054

樣品	處理	天數
5	7	9
MFG-053-1	對照	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-053-3	55℃，4小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-053-5	-20℃，4小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-1	對照	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-2	室溫，24小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-3	脫水，24小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-4	脫水，48小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-5	生理鹽水，24小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-6	生理鹽水，48小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-7	10× PBS，24小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-8	1% DMSO，24小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD

批次MFG-066.

在批次-066（4-7）之強制降解處理期間廢培養基中CXCL12 含量呈現於表31中且資料之散點圖提供於圖118中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均CXCL12結果之曲線圖（參見表29）。在LOD處繪製小於LOD之結果。 表31：強制降解研究中CXCL12含量（pg/mL）-批次MFG-066

天數	處理
MFG-066-4 對照	MFG-066-5 -20℃ ， 4 小時	MFG-066-6 55℃ ， 4 小時	MFG-066-7 10× PBS ， 24 小時
2	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
3	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	N/A
4	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
5	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
6	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
7	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
8	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
9	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
10	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
11	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
12	8.60	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
13	8.77	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
14	10.96	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
15	10.80	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
16	7.53	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
17	10.98	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
18	12.95	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
19	14.08	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
20	15.47	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
21	18.57	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD

CCL20（MIP-3a）.

CCL20（MIP-3a）為其圖案對應於假設用於胸腺細胞之趨化介素。

在21天培養期間CCL20之表徵

在21天時程內，廢培養基中CCL20含量之描述性統計呈現於表32中。包括來自強制降解研究（批次MFG-053、MFG-054及MFG-066）之對照樣品的資料以及來自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036及MFG-038之結果。 表32：21天內廢培養基中CCL20含量之描述性統計

天數	N	平均值 （ pg/mL ）	標準差 （ pg/mL ）	最小值 （ pg/mL ）	最大值 （ pg/mL ）
1	6	22.8	16.6	8.1	54.1
2	1	311.9	--	311.9	311.9
3	1	270.1	--	270.1	270.1
4	1	341.9	--	341.9	341.9
5	9	92.4	168.0	6.6	533.0
6	1	448.8	--	448.8	448.8
7	9	54.5	68.9	4.5	222.8
8	1	366.9	--	366.9	366.9
9	9	58.9	87.8	2.9	283.2
10	1	243.7	--	243.7	243.7
11	7	42.5	51.0	2.5	147.4
12	1	195.4	--	195.4	195.4
13	7	31.7	40.4	1.6	116.3
14	1	141.2	--	141.2	141.2
15	7	21.6	22.6	1.1	62.0
16	1	43.7	--	43.7	43.7
17	7	14.3	16.7	1.1	47.2
18	1	38.8	--	38.8	38.8
19	7	9.9	11.7	1.1	33.7
20	1	17.4	--	17.4	17.4
21	7	7.7	7.5	1.1	19.6

所分析批次中之每一者的廢培養基中CCL20含量與天數之散點圖提供於圖119中且盒狀圖提供於圖120中。三次回歸模型提供於圖121中。散點圖展示對於所分析之各批次，廢培養基中CCL20含量在21天時程內未展示一致的趨勢。盒狀圖指示批次之間的廢培養基中CCL20含量之可變性通常增加直至第9天，接著減小。來自回歸分析之經調節R ²值指示培養所耗費之時間解釋CCL20含量之可變性的12.4%。

強制降解樣品中CCL20含量之表徵

批次MFG-053及批次MFG-054.

在批次-053（1、3及5）及批次-054（1-8）之強制降解處理期間廢培養基中CCL20含量呈現於表33中，且資料之散點圖提供於圖122中。散點圖含有來自對照樣品表32之分析的平均CCL20結果之曲線圖。在LOD處繪製小於LOD之結果。 表33：強制降解研究中CCL20含量（pg/mL）-批次MFG-053及批次MFG-054

樣品	處理	天數
5	7	9
MFG-053-1	對照	81.96	51.90	40.47
MFG-053-3	55℃，4小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-053-5	-20℃，4小時	30.66	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-1	對照	36.53	9.39	16.57
MFG-054-2	室溫，24小時	32.98	15.88	15.36
MFG-054-3	脫水，24小時	76.32	44.29	25.21
MFG-054-4	脫水，48小時	178.63	72.54	38.18
MFG-054-5	生理鹽水，24小時	37.71	17.40	13.53
MFG-054-6	生理鹽水，48小時	29.80	19.57	＜ LOD
MFG-054-7	10× PBS，24小時	76.22	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-8	1% DMSO，24小時	57.68	38.68	28.91

批次MFG-066

在批次-066（4-7）之強制降解處理期間廢培養基中CCL20含量呈現於表34中，且資料之散點圖提供於圖123中。 表34：強制降解研究中CCL20含量（pg/mL）-批次MFG-066

天數	處理
MFG-066-4 對照	MFG-066-5 -20℃ ， 4 小時	MFG-066-6 55℃ ， 4 小時	MFG-066-7 10× PBS ， 24 小時
2	311.88	528.39	516.27	672.07
3	270.06	745.91	154.68	N/A
4	341.94	455.90	49.55	377.65
5	532.95	171.73	21.34	281.59
6	448.83	125.63	9.69	136.92
7	222.80	61.26	＜ LOD	32.66
8	366.90	43.35	＜ LOD	18.96
9	283.22	45.43	＜ LOD	＜ LOD
10	243.72	45.69	＜ LOD	＜ LOD
11	147.41	29.46	＜ LOD	＜ LOD
12	195.40	47.01	＜ LOD	＜ LOD
13	116.31	40.86	＜ LOD	＜ LOD
14	141.19	38.75	＜ LOD	＜ LOD
15	61.99	32.39	＜ LOD	＜ LOD
16	43.67	19.70	＜ LOD	＜ LOD
17	47.21	13.72	＜ LOD	＜ LOD
18	38.78	86.57	＜ LOD	＜ LOD
19	33.72	81.16	＜ LOD	＜ LOD
20	17.44	67.62	＜ LOD	＜ LOD
21	19.60	52.20	＜ LOD	＜ LOD

IL-16.

IL-16為已知由淋巴球產生之細胞介素。

在21天培養期間IL-16之表徵.

在21天時程內，廢培養基中IL-16含量之描述性統計呈現於表35中。包括來自強制降解研究（批次MFG-053、MFG-054及MFG-066）之對照樣品的資料以及來自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036及MFG-038之結果。 表35：21天內廢培養基中IL-16含量之描述性統計

天數	N	平均值 （ pg/mL ）	標準差 （ pg/mL ）	最小值 （ pg/mL ）	最大值 （ pg/mL ）
1	6	2168.3	719	1280.0	3039.5
2	1	725.4	--	725.4	725.4
3	1	934.5	--	934.5	934.5
4	1	837.9	--	837.9	837.9
5	9	1084.8	657	392.1	2273.7
6	1	709.2	--	709.2	709.2
7	9	980.0	602	369.3	2062.4
8	1	455.8	--	455.8	455.8
9	9	749.4	477	155.9	1714.8
10	1	217.7	--	217.7	217.7
11	7	540.8	383	83.9	1052.9
12	1	149.6	--	149.6	149.6
13	7	388.9	328	72.8	976.0
14	1	90.1	--	90.1	90.1
15	7	265.3	253.4	38.5	623.3
16	1	43.5	--	43.5	43.5
17	7	225.6	204.8	35.7	602.2
18	1	55.4	--	55.4	55.4
19	7	155.5	125.2	33.0	346.5
20	1	29.2	--	29.2	29.2
21	7	143.9	132.4	22.3	357.3

所分析批次中之每一者的廢培養基中IL-16含量與天數之散點圖提供於圖124中，且盒狀圖提供於圖125中。擬合線圖（二次回歸模型）提供於本發明。於圖126中，散點圖展示對於所分析之各批次，廢培養基中IL-16含量在21天時程內降低。盒狀圖指示批次之間的廢培養基中IL-16含量之可變性通常隨著培養中所耗費的時間增加且隨著IL-16含量接近零而降低。來自回歸分析之經調節R ²值指示培養所耗費之時間解釋IL-16含量之可變性的57.3%。

強制降解樣品中IL-16含量之表徵

批次MFG-053及批次MFG-054.

在批次-053（1、3及5）及批次-054（1-8）之強制降解處理期間廢培養基中IL-16含量呈現於表36中，且資料之散點圖提供於圖127中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均IL-16結果之曲線圖（參見表35）。 表36：強制降解研究中IL-16含量（pg/mL）-批次MFG-053及批次MFG-054

樣品	處理	天數
5	7	9
MFG-053-1	對照	1024.16	740.06	571.75
MFG-053-3	55℃，4小時	517.51	206.78	46.89
MFG-053-5	-20℃，4小時	1005.73	699.75	370.09
MFG-054-1	對照	639.94	560.26	498.05
MFG-054-2	室溫，24小時	810.36	550.57	558.29
MFG-054-3	脫水，24小時	540.44	677.36	531.92
MFG-054-4	脫水，48小時	857.18	456.11	684.26
MFG-054-5	生理鹽水，24小時	644.22	614.86	477.22
MFG-054-6	生理鹽水，48小時	683.34	664.17	412.90
MFG-054-7	10× PBS，24小時	506.42	572.40	138.87
MFG-054-8	1% DMSO，24小時	740.35	427.49	551.14

批次MFG-066.

在批次-066（4-7）之強制降解處理期間廢培養基中IL-16含量呈現於表37中且資料之散點圖提供於圖128中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均IL-16結果之曲線圖（參見表36）。在LOD處繪製小於LOD之結果。

IGFBP-1

IGFBP2-6為已知的待由表現之胸腺上皮細胞，其不表現IGFBP-1（Gosteli-Peter1994；Ketcha1999）。

在21天培養期間IGFBP-1之表徵.

在21天時程內，廢培養基中IGFBP-1含量之描述性統計呈現於表37中。包括來自強制降解研究（批次MFG-053、MFG-054及MFG-066）之對照樣品的資料以及來自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036及MFG-038之結果。 表37：21天內廢培養基中IGFBP-1含量之描述性統計

天數	N	平均值 （ pg/mL ）	標準差 （ pg/mL ）	最小值 （ pg/mL ）	最大值 （ pg/mL ）
1	6	5901.3	3312.8	2427.2	11012.9
2	1	124.1	--	124.1	124.1
3	1	76.0	--	76.0	76.0
4	1	39.2	--	39.2	39.2
5	9	383.4	504.1	29.5	1598.7
6	1	28.9	--	28.9	28.9
7	9	247.2	238.0	11.9	695.1
8	1	18.2	--	18.2	18.2
9	9	106.9	130.8	5.4	352.6
10	1	17.8	--	17.8	17.8
11	7	88.3	46.8	14.1	135.0
12	1	19.6	--	19.6	19.6
13	7	54.5	37.3	13.4	111.4
14	1	11.7	--	11.7	11.7
15	7	37.5	24.0	12.7	79.4
16	1	7.3	--	7.3	7.3
17	7	53.8	32.7	7.7	92.5
18	1	5.4	--	5.4	5.4
19	7	37.1	30.1	6.4	91.3
20	1	5.4	--	5.4	5.4
21	7	45.9	42.5	6.9	128.4

所分析批次中之每一者的廢培養基中IGFBP-1含量與天數之散點圖提供於圖129中，且盒狀圖提供於圖130中。三次回歸模型提供於圖131中。散點圖展示對於所分析之各批次，廢培養基中IGFBP-1含量在21天時程內增加。盒狀圖指示批次之間的廢培養基中IGFBP-1含量之可變性通常隨著培養中所耗費的時間增加且隨著IGFBP-1含量接近零而降低。來自回歸分析之經調節R ²值指示培養所耗費之時間解釋IGFBP-1含量之可變性的61.2%。

強制降解樣品中IGFBP-1含量之表徵.

批次MFG-053及批次MFG-054.

在批次-053（1、3及5）之強制降解處理期間廢培養基中IGFBP-1含量呈現於表38中，且資料之散點圖提供於圖132中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均IGFBP-1結果之曲線圖（參見表37）。在LOD處繪製小於LOD之結果。 表38：強制降解研究中IGFBP-1含量（pg/mL）-批次MFG-053及 批次MFG-054

樣品	處理	天數
5	7	9
MFG-053-1	對照	107.06	27.13	14.11
MFG-053-3	55℃，4小時	54.51	26.53	＜ LOD
MFG-053-5	-20℃，4小時	81.52	27.37	6.31
MFG-054-1	對照	29.49	11.88	＜ LOD
MFG-054-2	室溫，24小時	68.75	6.69	10.44
MFG-054-3	脫水，24小時	59.99	41.37	7.65
MFG-054-4	脫水，48小時	213.65	55.75	26.13
MFG-054-5	生理鹽水，24小時	30.71	12.24	9.74
MFG-054-6	生理鹽水，48小時	46.47	22.17	＜ LOD
MFG-054-7	10× PBS，24小時	26.93	10.21	＜ LOD
MFG-054-8	1% DMSO，24小時	43.13	13.87	＜ LOD

批次MFG-066.

在批次-066（4-7）之強制降解處理期間廢培養基中IGFBP-1含量呈現於表39中，且資料之散點圖提供於圖133中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均IGFBP-1結果之曲線圖（參見本發明。表38）。在LOD處繪製小於LOD之結果。 表39：強制降解研究中IGFBP-1含量（pg/mL）-批次MFG-066

天數	處理
MFG-066-4 對照	MFG-066-5 -20℃ ， 4 小時	MFG-066-6 55℃ ， 4 小時	MFG-066-7 10× PBS ， 24 小時
2	124.11	147.13	81.00	172.87
3	75.96	129.04	48.30	N/A
4	39.24	87.02	30.21	35.07
5	45.41	20.74	13.85	17.70
6	28.85	23.26	9.45	14.23
7	12.56	＜ LOD	7.92	7.31
8	18.17	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
9	14.32	9.65	＜ LOD	＜ LOD
10	17.85	9.58	＜ LOD	＜ LOD
11	14.11	25.07	＜ LOD	＜ LOD
12	19.60	36.21	＜ LOD	＜ LOD
13	13.39	41.61	＜ LOD	＜ LOD
14	11.66	41.36	＜ LOD	＜ LOD
15	12.71	33.28	＜ LOD	＜ LOD
16	7.27	27.77	＜ LOD	＜ LOD
17	7.72	22.93	＜ LOD	＜ LOD
18	＜ LOD	50.22	＜ LOD	＜ LOD
19	6.43	44.51	＜ LOD	＜ LOD
20	＜ LOD	34.44	＜ LOD	＜ LOD
21	6.87	43.82	＜ LOD	＜ LOD

MIF.

MIF為其圖案對應於假設用於胸腺細胞之趨化介素。

在21天培養期間MIF之表徵.

在21天時程內，廢培養基中MIF含量之描述性統計呈現於表40中。包括來自強制降解研究（批次MFG-053、MFG-054及MFG-066）之對照樣品的資料以及來自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036及MFG-038之結果。 表40：21天內廢培養基中MIF含量之描述性統計

天數	N	平均值 （ pg/mL ）	標準差 （ pg/mL ）	最小值 （ pg/mL ）	最大值 （ pg/mL ）
5	3	2300	908	1468	3268
7	3	1977	563	1445	2567
9	8	2512	791	1312	3341
10	1	3087	--	3087	3087
11	7	2152	642	912	3089
12	1	3308	--	3308	3308
13	7	1378	638	492	1950
14	1	2280	--	2280	2280
15	7	1378	528	416	2023
16	1	913	--	913	913
17	7	868	339	469	1185
18	1	970	--	970	970
19	7	844	226	584	1115
20	1	721	--	721	721
21	7	829	305	435	1211

所分析批次中之每一者的廢培養基中MIF含量與天數之散點圖提供於圖134中且盒狀圖提供於圖135中。線性回歸模型提供於圖136中。散點圖展示對於所分析之各批次，廢培養基中MIF含量在21天時程內降低。盒狀圖指示批次之間的廢培養基中MIF含量之可變性通常隨著培養中所耗費的時間增加且隨著MIF含量接近零而降低。來自回歸分析之經調節R ²值指示培養所耗費之時間解釋MIF含量之可變性的49.2%。

在批次-053（1、3及5）及批次-054（1-8）之強制降解處理期間廢培養基中MIF含量呈現於表41中且資料之散點圖提供於圖137中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均MIF結果之曲線圖（參見表36）。未繪製大於ULOQ之結果。 表41：強制降解中MIFF含量（pg/mL）-批次-053及批次-054

樣品	處理	天數
5	7	9
MFG-053-1	對照	＞ ULOQ	＞ ULOQ	3233.27
MFG-053-3	55℃，4小時	＞ ULOQ	＞ ULOQ	1104.83
MFG-053-5	-20℃，4小時	＞ ULOQ	＞ ULOQ	1649.46
MFG-054-1	對照	＞ ULOQ	2567.42	2464.25
MFG-054-2	室溫，24小時	＞ ULOQ	3612.80	3374.70
MFG-054-3	脫水，24小時	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ
MFG-054-4	脫水，24小時	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ
MFG-054-5	生理鹽水，24小時	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ
MFG-054-6	生理鹽水，48小時	＞ ULOQ	＞ ULOQ	3316.32
MFG-054-7	10× PBS，24小時	＞ ULOQ	＞ ULOQ	3637.27
MFG-054-8	1% DMSO，24小時	＞ ULOQ	＞ ULOQ	3668.38

批次MFG-066.

在批次-066（4-7）之強制降解處理期間廢培養基中MIF含量呈現於表42中，且資料之散點圖提供於圖138中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均MIF結果之曲線圖（參見表41）。未繪製大於ULOQ之結果。 表42：強制降解研究中MIF含量（pg/mL）-批次MFG-066

天數	處理
MFG-066-4 對照	MFG-066-5 -20℃ ， 4 小時	MFG-066-6 55℃ ， 4 小時	MFG-066-7 10× PBS ， 24 小時
2	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ
3	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ	N/A
4	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ
5	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ
6	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ
7	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ	＞ ULOQ
8	＞ ULOQ	3756.95	2724.06	＞ ULOQ
9	3341.28	3129.52	2230.04	＞ ULOQ
10	3086.91	2153.04	1543.57	＞ ULOQ
11	2090.07	1458.60	946.02	2042.93
12	3307.79	1655.69	1334.31	3553.31
13	1949.83	1776.58	3170.68	1706.88
14	2280.45	1237.27	875.61	1604.87
15	1421.79	921.58	795.98	877.94
16	912.75	780.77	489.52	647.60
17	999.58	498.76	398.93	421.43
18	970.10	925.19	731.72	906.22
19	1098.03	752.08	410.44	399.31
20	721.44	585.77	205.49	361.21
21	1080.61	578.89	164.08	213.77

CCL25（TECK）.

CCL25（TECK）為已展示對胸腺細胞具有趨化性之趨化介素（劉2005）。已知其由胸腺樹突狀細胞及FoxN1 ⁺及FoxN1 ^-TE細胞表現（Bunting 2011）；然而，其活性似乎對基於其中缺失CCR9（此趨化介素之唯一受體）之小鼠的研究之胸腺發育不重要（Wurbel 2001）。

在21天培養期間CCL25之表徵.

在21天時程內，廢培養基中CCL25含量之描述性統計呈現於表43中。包括來自強制降解研究（批次MFG-053、MFG-054及MFG-066）之對照樣品的資料以及來自批次MFG-025、MFG-026、MFG-027、MFG-035、MFG-036及MFG-038之結果。 表43：21天內廢培養基中CCL25含量之描述性統計

天數	N	平均值 （ pg/mL ）	標準差 （ pg/mL ）	最小值 （ pg/mL ）	最大值 （ pg/mL ）
1	6	85.5	24.2	63.9	113.6
2	1	242.2	--	242.2	242.2
3	1	242.2	--	242.2	242.2
4	1	242.2	--	242.2	242.2
5	9	138.4	80.3	63.9	242.2
6	1	242.2	--	242.2	242.2
7	9	138.4	80.3	63.9	242.2
8	1	242.2	--	242.2	242.2
9	9	138.4	80.3	63.9	242.2
10	1	242.2	--	242.2	242.2
11	7	132.8	89.7	63.9	277.5
12	1	242.2	--	242.2	242.2
13	7	108.8	63.0	63.9	242.2
14	1	242.2	--	242.2	242.2
15	7	121.4	69.0	63.9	242.2
16	1	242.2	--	242.2	242.2
17	7	108.8	63.0	63.9	242.2
18	1	242.2	--	242.2	242.2
19	7	111.7	61.0	63.9	242.2
20	1	242.2	--	242.2	242.2
21	7	123.6	74.3	63.9	242.2

所分析批次中之每一者的廢培養基中CCL25含量與天數之散點圖提供於圖139中且盒狀圖提供於圖140中。線性回歸模型提供於圖141中。散點圖展示對於所分析之各批次，廢培養基中CCL25含量在21天時程內增加。盒狀圖指示，批次之間的廢培養基中CCL25含量之可變性通常隨著培養所耗費之時間的增加而增加。來自回歸分析之經調節R ²值指示培養所耗費之時間解釋CCL25含量之可變性的49.2%。

強制降解樣品中CCL25含量之表徵

批次MFG-053及批次MFG-054.

在批次-053（1、3及5）及批次-054（1-8）之強制降解處理期間廢培養基中CCL25含量呈現於表44中，且資料之散點圖提供於圖142中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均CCL25結果之曲線圖（參見表43）。在LOD處繪製小於LOD之結果。 表44：強制降解研究中CCL25含量（pg/mL）-批次MFG-053及批次MFG-054

樣品	處理	天數
5	7	9
MFG-053-1	對照	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-053-3	55℃，4小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-053-5	-20℃，4小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-1	對照	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-2	室溫，24小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-3	脫水，24小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-4	脫水，48小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-5	生理鹽水，24小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-6	生理鹽水，48小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-7	10× PBS，24小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
MFG-054-8	1% DMSO，24小時	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD

批次MFG-066.

在批次-066（4-7）之強制降解處理期間廢培養基中CCL25含量呈現於表45中，且資料之散點圖提供於圖143中。散點圖含有來自對照樣品之分析的平均CCL25結果之曲線圖（參見表44）。在LOD處繪製小於LOD之結果。 表45：強制降解研究中CCL25含量（pg/mL）-批次MFG-66。

天數	處理
MFG-066-4 對照	MFG-066-5 -20℃ ， 4 小時	MFG-066-6 55℃ ， 4 小時	MFG-066-7 10× PBS ， 24 小時
2	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
3	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	N/A
4	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
5	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
6	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
7	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
8	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
9	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
10	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
11	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
12	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
13	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
14	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
15	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
16	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
17	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
18	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
19	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
20	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD
21	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD	＜ LOD

附錄

附錄1： 表46. 21天培養表徵之生物標記物資料。批次MFG-025資料

天數	CCL11	IL-16	IGFBP-1	CCL21	CXCL16	MIF	CCL20	OPN	CXCL12	CCL25	L- 選擇素	uPAR
1	3.1	3039.5	3480.3	216.0	591.3	＞ 4000	12.8	2655.1	＜ 4.3	＜ 63.9	20322.8	1311.2
5	4.7	2273.7	239.5	7646.8	906.0	＞ 4000	6.6	7147.3	＜ 4.3	＜ 63.9	4768.4	3956.7
7	40.2	1470.5	170.8	12787.3	2219.8	＞ 4000	4.5	8800.9	＜ 4.3	＜ 63.9	4590.3	6475.0
9	81.9	949.8	41.7	12791.6	2317.4	2829.6	2.9	7838.6	＜ 4.3	＜ 63.9	3133.3	7145.7
11	102.4	791.2	55.0	19295.9	2607.5	2296.3	2.5	9507.4	＜ 4.3	＜ 63.9	1792.8	9765.5
13	113.5	456.5	22.6	15618.0	2721.2	1332.7	1.6	9764.4	＜ 4.3	＜ 63.9	1261.9	8664.8
15	126.5	378.9	＜ 18.5	23809.5	4739.1	1222.2	2.4	10424.8	6.5	72.4	1144.6	10071.4
17	135.9	178.2	41.7	16747.1	2628.4	599.1	＜ 1.1	9615.1	15.7	＜ 63.9	891.4	7324.9
19	109.5	98.6	52.9	18783.3	2495.7	621.1	＜ 1.1	11514.1	37.4	＜ 63.9	1316.4	8900.9
21	146.3	98.3	64.1	15618.6	2295.9	659.0	＜ 1.1	11163.2	32.3	＜ 63.9	693.3	10138.6

表47. 21天培養表徵之生物標記物資料。批次MFG-026資料。

天數	CCL11	IL-16	IGFBP-1	CCL21	CXCL16	MIF	CCL20	OPN	CXCL12	CCL25	L- 選擇素	uPAR
1	＜ 1.3	2251.4	8588.2	238.8	1487.3	＞ 4000	54.1	6811.7	＜ 4.3	＜ 63.9	27797.8	1417.8
5	7.9	459.9	207.1	3314.4	1066.8	2165.6	9.4	9773.0	＜ 4.3	＜ 63.9	2305.7	1658.3
7	45.1	493.2	148.5	8526.8	2735.3	1918.5	13.0	11388.9	＜ 4.3	＜ 63.9	4011.4	4648.4
9	60.4	420.6	44.9	12138.9	3044.0	1316.6	7.6	11736.5	＜ 4.3	＜ 63.9	3862.2	8738.9
11	72.6	208.6	53.8	15708.8	3476.5	911.6	6.2	12228.6	＜ 4.3	＜ 63.9	4169.7	14194.9
13	54.7	91.6	＜ 18.5	12209.1	3343.8	492.0	3.2	11332.6	＜ 4.3	＜ 63.9	1601.7	11235.8
15	62.4	57.1	＜ 18.5	16698.5	3718.1	416.2	2.2	13547.0	7.2	＜ 63.9	1629.4	14894.4
17	77.1	65.2	＜ 18.5	14276.9	3776.6	477.2	1.8	12756.0	12.3	69.9	473.3	14092.6
19	106.1	71.5	＜ 18.5	18004.7	4770.0	651.3	1.7	15975.3	30.1	84.4	1714.4	14362.4
21	101.4	46.5	＜ 18.5	14976.8	3875.2	434.7	1.4	11138.3	20.3	＜ 63.9	709.6	13016.9

表48. 21天培養表徵之生物標記物資料。批次MFG-027資料。

天數	CCL11	IL-16	IGFBP-1	CCL21	CXCL16	MIF	CCL20	OPN	CXCL12	CCL25	L- 選擇素	uPAR
1	＜ 1.3	2972.5	5893.5	256.7	1162.9	＞ 4000	21.4	3612.7	＜ 4.3	＜ 63.9	35738.2	1026.1
5	＜ 1.3	1951.9	629.1	7652.5	693.5	＞ 4000	10.7	10758.7	＜ 4.3	＜ 63.9	6685.3	4767.6
7	12.1	2062.4	357.7	11056.7	1364.7	＞ 4000	6.1	10985.0	＜ 4.3	＜ 63.9	3937.7	5262.3
9	47.0	1127.3	81.3	13434.9	1783.4	2927.2	5.0	11227.9	＜ 4.3	＜ 63.9	2897.3	8194.7
11	90.5	1052.9	135.0	17599.4	2226.2	2325.3	2.7	10714.1	＜ 4.3	＜ 63.9	3065.3	9295.3
13	125.2	976.0	60.6	22579.7	2753.5	1950.4	2.4	13367.5	6.6	＜ 63.9	1921.8	13471.9
15	125.1	567.3	32.7	23637.2	2463.1	1319.4	＜ 1.1	13023.8	14.7	＜ 63.9	2195.0	13678.3
17	180.4	359.2	82.8	21395.9	2737.2	1173.2	＜ 1.1	12720.5	29.7	＜ 63.9	1098.7	15640.8
19	178.9	314.6	53.2	25506.7	2932.2	1114.8	1.1	12447.5	33.5	＜ 63.9	1826.7	15449.1
21	172.9	155.0	51.6	27366.0	2710.8	899.4	1.7	10874.7	50.2	＜ 63.9	＜ 288.7	13585.4

表49. 21天培養表徵之生物標記物資料。批次MFG-035資料。

天數	CCL11	IL-16	IGFBP-1	CCL21	CXCL16	MIF	CCL20	OPN	CXCL12	CCL25	L- 選擇素	uPAR
1	＜ 2.4	1711.3	4005.8	118.2	591.9	＞ 4000	8.1	2483.1	＜ 4.9	＜ 109.2	43398.9	972.9
5	5.3	1365.1	534.5	11062.5	1077.8	＞ 4000	23.7	11167.6	＜ 4.9	＜ 109.2	12218.9	5028.7
7	34.7	1604.8	304.4	13864.8	1885.0	＞ 4000	44.0	11319.2	＜ 4.9	＜ 109.2	12573.3	8553.5
9	53.0	911.8	100.1	15084.4	2345.3	2672.3	39.5	11533.4	＜ 4.9	＜ 109.2	9924.4	8717.3
11	125.6	702.3	112.5	16587.6	2778.5	2138.7	42.1	10908.4	＜ 4.9	＜ 109.2	9297.0	10260.6
13	175.0	589.9	79.5	18225.6	2814.2	1623.0	38.0	10378.6	＜ 4.9	＜ 109.2	10396.4	10335.1
15	246.4	623.3	49.0	20254.9	2907.1	1318.9	32.7	10998.3	＜ 4.9	＜ 109.2	9385.0	11838.6
17	209.4	273.3	77.7	16463.8	2669.5	1185.3	19.9	9030.6	＜ 4.9	＜ 109.2	7169.9	11185.4
19	233.8	346.5	21.9	17536.0	2949.5	889.2	13.3	10862.7	5.7	＜ 109.2	5934.2	7542.2
21	263.3	357.3	42.5	18157.2	3316.7	1029.1	12.0	9639.3	8.2	＜ 109.2	6755.4	8659.6

表50. 21天培養表徵之生物標記物資料。批次MFG-036資料。

天數	CCL11	IL-16	IGFBP-1	CCL21	CXCL16	MIF	CCL20	OPN	CXCL12	CCL25	L- 選擇素	uPAR
1	＜ 2.4	1755.0	2427.2	608.3	2919.1	＞ 4000	25.6	12083.9	＜ 4.9	113.6	30773.2	1275.9
5	131.3	814.1	59.4	16977.2	2642.8	1467.7	40.3	9295.7	＜ 4.9	＜ 109.2	3730.5	8284.6
7	66.0	1041.3	695.1	2886.3	1938.6	＞ 4000	54.2	11436.4	12.3	＜ 109.2	3206.4	3260.5
9	190.2	1714.8	307.5	2871.3	2938.0	＞ 4000	61.9	9787.9	5.3	＜ 109.2	1956.0	5128.1
11	234.3	789.7	128.5	3798.2	2237.0	3089.5	44.5	10757.3	＜ 4.9	＜ 109.2	1610.9	6531.0
13	257.4	407.7	111.4	3517.8	2866.5	1796.6	30.2	11336.1	＜ 4.9	＜ 109.2	1240.1	7761.4
15	265.9	117.7	79.4	4039.8	3353.5	1921.6	32.5	12110.2	＜ 4.9	＜ 109.2	1156.0	8272.5
17	384.6	602.2	92.5	5219.5	3380.9	1175.0	19.6	12693.3	8.2	＜ 109.2	1185.0	11488.1
19	414.7	152.3	91.3	4140.5	2777.9	951.0	12.0	10699.5	6.6	＜ 109.2	1224.3	11109.2
21	441.9	291.3	128.4	6156.5	3550.4	1211.5	14.1	12773.7	11.0	212.8	1108.4	13987.1

表51. 21天培養表徵之生物標記物資料。批次MFG-038資料。

天數	CCL11	IL-16	IGFBP-1	CCL21	CXCL16	MIF	CCL20	OPN	CXCL12	CCL25	L- 選擇素	uPAR
1	＜ 2.4	1280.0	11012.9	177.6	559.7	＞ 4000	14.8	5907.6	＜ 4.9	＜ 109.2	14966.5	1001.6
5	26.5	392.1	1598.7	7884.9	2139.7	3268.1	89.6	13716.5	＜ 4.9	＜ 109.2	2521.2	3221.0
7	48.5	369.3	497.0	9224.8	2724.7	1445.4	84.5	13942.3	＜ 4.9	＜ 109.2	1577.3	6094.5
9	33.6	155.9	352.6	15056.1	3380.5	1312.2	72.8	14906.8	＜ 4.9	＜ 109.2	2072.6	9476.4
11	22.7	83.9	119.2	30946.6	4153.6	2212.1	52.0	28981.8	8.3	277.5	1525.3	13747.2
13	37.8	72.8	75.8	24110.2	3267.1	502.7	29.9	11577.3	＜ 4.9	＜ 109.2	1393.2	15015.5
15	54.1	38.5	51.6	28862.9	3843.4	2023.0	18.2	28982.0	20.5	189.4	1374.0	16983.8
17	87.2	35.7	56.0	23833.9	3199.4	469.3	9.6	14821.0	6.1	＜ 109.2	1570.4	16818.3
19	108.1	33.0	15.5	25243.3	3445.8	584.3	6.1	16660.4	13.5	＜ 109.2	1252.4	18078.0
21	123.5	22.3	＜ 9.1	24625.4	3842.7	485.7	3.8	14642.2	15.2	＜ 109.2	1134.2	17772.4

前述實施例及優勢僅為例示性的且不應理解為限制本發明。本教示內容可易於應用於其他類型之設備、實驗及手術程序。此外，本發明之實施例之描述意欲為說明性的且不意欲限制申請專利範圍之範疇。許多替代方案、修改及變化對於熟習此項技術者而言將為顯而易見的。

應瞭解，雖然本發明已結合其實施方式描述，但前述描述意欲說明且不限制本發明之範疇，本發明之範疇係由隨附申請專利範圍之範疇界定。其他態樣、優勢及修改在以下申請專利範圍之範疇內。

本申請案中所論述之參考出於其預期目的而以全文引用之方式併入，其基於其上下文為清楚的。

本文中引用之所有專利、專利申請案及公開案特此以全文引用之方式併入。此等公開案之揭示內容特此以全文引用之方式併入本申請案中。

本文所引用之每一專利、專利申請案、公開案及寄存編號之揭示內容特此以全文引用的方式併入本文中。

儘管已參考各種實施例揭示本發明，但顯而易見熟習此項技術者可在不背離本發明之真實精神及範疇的情況下設計此等其他實施例及變化形式。所附申請專利範圍意欲理解為包括所有此類實施例及等效變化形式。

認為前述書面說明書足以使熟習此項技術者實踐實施例。前述描述及實例詳述某些實施例且描述發明人所涵蓋之最佳方式。然而，應瞭解，無論以文字呈現之前述內容如何詳細，實施例可以許多方式實踐，且應根據所附申請專利範圍及其任何等效物解釋。

參考文獻

Ahonen, P., 1985, 「《自體免疫性多內分泌腺病-念珠菌病-外胚層營養不良（APECED）：體染色體隱性遺傳（Autoimmune polyendocrinopathy - candidosis - ectodermal dystrophy (APECED): autosomal recessive inheritance）》」, 《臨床遺傳（Clinical Genetics）》, 27: 535-542Ahonen, P.等人, 1987, 「《患有自體免疫性多腺疾病I型患者之腎上腺及類固醇細胞抗體及腎上腺皮質及卵巢衰竭之風險（Adrenal and steroidal cell antibodies in patients with autoimmune polyglandular disease type I and risk of adrenocortical and ovarian failure）》」， 《臨床內分泌與代謝雜誌（ J. Clin. Endocrinology and Metabolism）》, 64: 494-500。

Ahonen, P.等人, 1987, 「《患有自體免疫性多腺疾病I型患者之腎上腺及類固醇細胞抗體及腎上腺皮質及卵巢衰竭之風險》」, 《臨床內分泌與代謝雜誌》, 64: 494-500。

Ahonen, P.,等人, 1988, 《臨床內分泌與代謝雜誌》, 66, 1152-1157。

Ahonen, P.等人, 1990, 「《一系列68名患者之自體免疫性多內分泌腺病-念珠菌病-外胚層營養不良（APECED）之臨床變異（Clinical variation of autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APECED) in a series of 68 patients）》」, 《新英格蘭醫學雜誌（ New Engl. J. Med.）》322: 1829-1836。

Arulanantham, K.等人, 1979, 「《家族性念珠菌病內分泌病綜合症之缺陷免疫調節的證據（Evidence for Defective Immunoregulation in the Syndrome of Familial Candidiasis Endocrinopathy）》」, 《新英格蘭醫學雜誌》300:164-168。

Bennett AR, Farley A, Blair NF, Gordon J, Sharp L, Blackburn CC., 2002, 「《胸腺上皮祖細胞之鑑別及表徵（Identification and characterization of thymic epithelial progenitor cells）》」, 《免疫》 ,16: 803-814。

Bernstock, Joshua D, Totten, AH, and Atkinson, T. Prescott, 「《染色體2p11.2處之復發性微缺失（Recurrent microdeletions at chromosome 2p11.2）》」,  Bernstock, Joshua D, Totten, AH及Atkinson, T. Prescott, 《過敏與臨床免疫學雜誌（JACI）》145:358-367。

Biron-Pain K, Grosset AA, Poirier F, Gaboury L, St-Pierre Y (2013)《半乳糖凝集素-7在人類及鼠類黑色素瘤中之表現及功能（Expression and functions of galectin-7 in human and murine melanomas）》科學公共圖書館綜合卷8:e63307數位物件識別碼：10.1371/journal.pone.0063307。

Blizzard, R. M. and Kyle M., 1963, 「《阿狄森氏病之腎上腺抗原及抗體的研究（Studies of the Adrenal Antigens and Antibodies in Addison‘s Disease）》」, 《臨床研究雜誌（ J. Clin. Invest.）》42: 1653-1660Boehm T, Takahama Y.2014.《胸腺發育及T淋巴球之選擇（Thymic Development and Selection of T Lymphocytes）》.海德堡：斯普林格出版社。

Boehm T, Takahama Y.2014.《胸腺發育及T淋巴球之選擇》.海德堡：斯普林格出版社。

Bunting MD, Comerford I, McColl SR.《發現其生態棲位：引導胸腺中之細胞遷移的趨化介素（Finding their niche: chemokines directing cell migration in the thymus）》.《免疫細胞生物學（Immunol Cell Biol.）》89:185-196, 2011。

美國聯邦法規第21條；1271種人類細胞、組織及基於細胞及組織之產物

Chinn I, Devlin B, Li YJ等人, 2008.「《對完全DiGeorge氏畸形中之同種異體胸腺移植的長期耐受性（Long-term tolerance to allogeneic thymus transplants in complete DiGeorge anomaly）》」, 《臨床免疫學》126(3): 277-281。

Davis CM, McLaughlin TM, Watson TJ, Buckley RH, Schiff SE, Hale LP等人, 1997, 「《DiGeorge氏症候群之出生後胸腺移植之後外周血T細胞受體V-β譜系的歸一化（Normalization of peripheral blood T cell receptor V-beta repertoire after postnatal thymic transplantation in DiGeorge syndrome）》」, 《臨床免疫學雜誌（ J. Clinical Immunol.）》, 17: 167-175。

Davies, EG, Cheung M, Gilmour K, Maimaria J, Curry J, Furmanski A等人, 2017, 「《完全DiGeorge氏症候群之胸腺移植：歐洲經驗（Thymus transplantation for complete DiGeorge syndrome: European experience）》」, 《過敏與臨床免疫學雜誌（ J Allergy Clin Immunol.）》140: 1660-1670。

Dudal S等人（2015）《食蟹獼猴MAb中抗CCL21單株抗體之整合藥物動力學、藥效動力學及免疫原性分析（Integrated pharmacokinetic, pharmacodynamic and immunogenicity profiling of an anti-CCL21 monoclonal antibody in cynomolgus monkeys MAbs）》7:829-837數位物件識別碼：10.1080/19420862.2015.1060384。

Fitzhugh DJ, Shan S, Dewhirst MW, Hale LP（2008）《鳳梨蛋白酶治療減少嗜中性白血球遷移至發炎部位（Bromelain treatment decreases neutrophil migration to sites of inflammation）》《臨床免疫學》128:66-74數位物件識別碼：10.1016/j.clim.2008.02.015。

Flores KG, Li J, Sempowski GD, Haynes, BF, Hale LP.《衰老期間人體血管周圍空間之分析（Analysis of the human perivascular space during aging）》.《臨床研究雜誌》104:1031-1039, 1999。

Gosteli-Peter MA, Winterhalter KH, Schmid C, Froesch FR, Zapf J.《輸注IGF-1及生長激素之垂體切除大鼠組織中胰島素樣生長因子-1（IGF-1）及IGF-結合蛋白信使核糖核酸含量的表現及調節（Expression and regulation of insulin-like growth factor -1 (IGF-1) and IGF-binding protein messenger ribonucleic acid levels in tissues of hypophysectomized rats infused with IGF-1 and growth hormone）》.《內分泌學》135:2558-2567, 1994。

Gridley DS, Mao XW, Stodieck LS, Ferguson VL, Bateman TA, Moldovan M等人《自太空STS-135任務返回後小鼠胸腺及脾臟之變化（Changes in mouse thymus and spleen after return from the STS-135 mission in space）》科學公共圖書館綜合卷：e75097, 2013.數位物件識別碼：10.1371/journal.pone.007509。

Gruver AL, Hudson LL, Sempowski GD（2007）《衰老之免疫老化（Immunosenescence of ageing）》《病理學雜誌（J Pathol）》211:144-156數位物件識別碼：10.1002/path.2104。

Hafezi-Moghadam A, Thomas KL, Prorock AJ, Huo Y, Ley K（2001）《L-選擇素脫落調節白血球募集（L-selectin shedding regulates leukocyte recruitment）》《實驗醫學雜誌》193:863-872數位物件識別碼：10.1084/jem.193.7.863。

Hale LP, Markert ML., 2004, 「《皮質類固醇調節人類胸腺中之上皮細胞分化及胸腺小體形成（Corticosteroids regulate epithelial cell differentiation and Hassall body formation in the human thymus）》」, 《免疫學雜誌》, 172:617-624。

Hernandez-Lopez C, Varas A, Sacedon R, Jimenez E, Munoz JJ, Zapata AG, Vicente A.《基質細胞衍生因子1/CXCR4信號傳導對早期人類T細胞發育至關重要（Stromal cell-derived factor 1/CXCR4 signaling is critical for early human T-cell development）》.《血液》.99:546-554, 2002。

Heron I., 1971, 「輔助家兔及大鼠之頸部心臟移植的技術（A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats）」, 《微生物病理學學報（Acta Pathol Microbiol Scand A ）》79(4):366-372。

Hong R, Schulte-Wissermann H, Jarrett-Toth E, Horowitz SD, Manning DD, 1979, 「《經培養胸腺片段之移植.II.裸小鼠中之結果》, 《實驗醫學雜誌》149(2): 398-415。

Hong R, Moore, AL.1996, 「《用於胸腺移植之器官培養物》」, 《移植》， 61: 444-448。

Hu Z, Lancaster JN, Ehrlich LI（2015）《趨化介素及遷移對胸腺中之中心耐受性誘導之貢獻（The Contribution of Chemokines and Migration to the Induction of Central Tolerance in the Thymus）》《免疫學前沿（Front Immunol）》6:398數位物件識別碼：10.3389/fimmu.2015.00398。

Hun M, Barsanti M,  Wong K, Ramshaw J, Werkmeister J,  Chidgey AP., 2017,「《天然胸腺胞外基質提高活體內胸腺類器官T細胞輸出且驅動活體外胸腺上皮細胞分化（Native thymic extracellular matrix improves in vivo thymic organoid T cell output, and drives in vitro thymic epithelial cell differentiation）》」, 《生物材料（ Biomaterials）》, 118: 1-15。

Ito, R., Hale, L.P., Geyer, S.M., Li, J., Sornberger, A., Kajimura, J., Kusunoki, Y., Yoshida, K., van den Brink, M.R.M., Kyoizumi, S., Manley, N.R., Nakachi, K., Sempowski, G.D.：《年齡及暴露於電離輻射對人類胸腺形態及功能之影響》.《輻射研究》, 187:589-598, 2017。

Ito R等人（2017）《暴露於電離輻射及年齡對人類胸腺形態及功能之晚期影響（Late Effects of Exposure to Ionizing Radiation and Age on Human Thymus Morphology and Function）》《輻射研究》187:589-598數位物件識別碼：10.1667/RR4554.1。

Ivetic A, Hoskins Green HL, Hart SJ（2019）《L-選擇素：白血黏附、遷移及信號傳導之主要調節因子（L-selectin: A Major Regulator of Leukocyte Adhesion, Migration and Signaling）》《免疫學前沿》10:1068數位物件識別碼：10.3389/fimmu.2019.01068。

Ketcha O, Martens H, Franchimont N, Achour I, Hazee-Hagelstein M-T, Charlet-Renard C等人《胰島素樣生長因子軸在人類胸腺中之表徵（Characterization of the insulin-like growth factor axis in the human thymus）》.《神經內分泌學雜誌（J Neuroendocrinol.）》11:435-440, 1999。

Kozai M等人（2017）《CCL21在T細胞中建立中心自身耐受性中之基本作用（Essential role of CCL21 in establishment of central self-tolerance in T cells）》《實驗醫學雜誌》214:1925-1935數位物件識別碼：10.1084/jem.20161864。

Krohn, K.等人, 1992, 「《藉由分子選殖鑑別與阿狄森氏病相關之自體抗原為類固醇17α-羥化酶（Identification by molecular cloning of an autoantigen associated with Addison's disease as steroid 17α-hydroxylase）》」, 《柳葉刀（ Lancet）》339:770-773。

Kuwabara I等人（2002）《半乳糖凝集素-7（PIG1）經由JNK活化及粒線體細胞色素C釋放來展現促細胞凋亡功能（Galectin-7 (PIG1) exhibits pro-apoptotic function through JNK activation and mitochondrial cytochrome c release）》《生物化學雜誌（J Biol Chem）》277:3487-3497數位物件識別碼：10.1074/jbc.M109360200。

Kuwabara I, Kuwabara Y, Yang R-Y, Schuler M, Green DR, Zuraw BI等人《半乳糖凝集素-7（PIG1）經由展現促細胞凋亡功能（Galectin-7 (PIG1) exhibits pro-apoptotic function through）》JNK Lee EN, Park JK, Lee J-R, Oh S-O, Baek S-Y, Kim B-S等人, 2011, 「《在急性胸腺退化後胸腺再生期間小鼠胸腺上皮細胞中之細胞角蛋白5、8及14之表現的表徵》」, 《解剖學與細胞生物學》44: 14-24。

Kwun, Jean, Li, Jie,  Rouse, Clay, Park, Jae Berm, Farris, Alton B., Kuchibhatla, Maragatha, Turek, Joseph W. Knechtle, Stuart J. Kirk, Allan D.及Markert, M Louise, 《經培養之胸腺組織植入促進對同種異體心臟移植之供體特異性耐受》, 《JCI洞察》.2020年6月4日;5(11):e129983.數位物件識別碼：10.1172/jci.insight.129983。

Le PT, Kurtzberg J, Brandt SJ, Niedel JE, Haynes BF, Singer KH（1988）《人類胸腺上皮細胞產生粒細胞及巨噬細胞菌落-刺激因子（Human thymic epithelial cells produce granulocyte and macrophage colony-stimulating factors）》《免疫學雜誌》141:1211-1217。

Lee EN, Park JK, Lee J-R, Oh S-O, Baek S-Y, Kim B-S等人, 2011, 「《在急性胸腺退化後胸腺再生期間小鼠胸腺上皮細胞中之細胞角蛋白5、8及14之表現的表徵》」《解剖學與細胞生物學》44: 14-24。

Li B, Li J, Hsieh CS, Hale LP, Li YJ, Devlin BH, Markert ML.2009「《用於移植之經培養胸腺組織的表徵，強調甲狀腺組織特異性基因之混雜表現》」, 2009, 《免疫學研究》2009, 44(1-3):71-83。

Li B, Li J, Devlin BH, Markert ML.2011, 「《在出生後人類胸腺移植之後的胸腺微環境重建》」, 《臨床免疫學》9月; 140(3): 244-59。

Liu C, Ueno T, Kuse S, Saito F, Nitta T, Piali L等人《CCL21在為胎兒胸腺募集T-前體細胞中之作用（The role of CCL21 in recruitment of T-precursor cells to fetal thymi.）》《血液》.105:31-39, 2005。

Lkhagvasuren E, Sakata M, Ohigashi I, Takahama Y（2013）《淋巴毒素β受體調節表現出生後髓質胸腺上皮細胞之亞群的CCL21發育（Lymphotoxin beta receptor regulates the development of CCL21-expressing subset of postnatal medullary thymic epithelial cells）》《免疫學雜誌》190:5110-5117數位物件識別碼：10.4049/jimmunol.1203203。

Loughner CL, Bruford EA, McAndrews MS, Delp EE, Swamynathan S, Swamynathan SK.《人類及小鼠Ly6/uPAR家族基因之組織、進化及功能（Organization, evolution and functions of the human and mouse Ly6/uPAR family genes）》.《人類基因體學（Human Genomics）》10:10, 2016。

Markert ML, Kostyu DD, Ward FE, McLaughlin TM, Watson TJ, Buckley RH, Schiff SE, Ungerleider RM, Gaynor JW, Oldham KT, Mahaffey SM, Ballow M, Driscoll DA, Hale LP, Haynes BF.「《移植部分HLA匹配之出生後胸腺後成功形成嵌合人類胸腺同種異體移植物（Successful formation of a chimeric human thymus allograft following transplantation of partially HLA-matched postnatal thymus）》」, 1997, 《免疫學雜誌 Journal of Immunology》, 158 998-1005。

Markert ML, Watson TJ, Kaplan I, Hale LP, Haynes BF, 「《在器官培養期間之人類胸腺微環境》」, 1997, 《臨床免疫學及免疫病理學》, 1月;82(1): 6354-6364。

Markert ML, Boeck A, Hale LP, Kloster AL, McLaughlin TM, Batchvarova MN等人, 「《在完全DiGeorge氏症候群中移植胸腺組織》」, 1999, 《新英格蘭醫學雜誌（ N Engl J Med.）》341(16): 1180-9。

Markert ML等人（2003）《完全DiGeorge氏症候群中之胸腺移植：對12名患者之免疫及安全性評估（Thymus transplantation in complete DiGeorge syndrome: immunologic and safety evaluations in 12 patients）》《血液》102:1121-1130數位物件識別碼：10.1182/blood-2002-08-2545。

Markert ML等人, 2004, 「《出生後胸腺移植與免疫抑制用於治療DiGeorge氏症候群》」, 《血液》104(8):2574-2581。

Markert ML, Devlin BH, Alexieff MJ, Li J, McCarthy EA, Gupton SE等人, 「《綜述54名參加胸腺移植方案之完全DiGeorge氏畸形的患者：44名連續移植之結果》」, 2007, 《血液》, 109(10): 4539-47。

Markert ML, Devlin BH., 2008, 「《胸腺重建》」.參見：Rich RR, Shearer WT, Fleischer T, Schroeder HW, Weyand CM, Frew A編.《臨床免疫學第3版》.愛丁堡：愛思唯爾；第2008頁.第1253-1261頁。

Markert ML, Li J, Devlin BH, Hoehner JC, Rice HE, Skinner MA, 2008, 「《使用同種異體移植活組織檢查以評定胸腺移植之後的胸腺生成》」， 《免疫學雜誌》, 180: 6354-6364。

Markert ML, Devlin BH, McCarthy EA, 2010, 「《胸腺移植》」, 《臨床免疫學》, 135(2): 236-46。

Markert ML, Marques JG, Neven B, Devlin BH, McCarthy EA, Chinn IK, 2011, 「《首次使用胸腺移植療法用於FOXN1缺乏症（裸/SCID）：2例報告（First use of thymus transplantation therapy for FOXN1 deficiency (nude/SCID): A report of 2 cases）》」, 《血液》, 117: 688-696。

Markert ML, Devlin BH, McCarthy EA.《第84章胸腺重建》.2013.參見：Fleisher TA, Shearer WT, Schroeder HW, Frew AJ, Wey and CM編.《臨床免疫學（第四版）》.London第1032-8頁。

Markert ML.2014.「《胸腺移植》」, 《Stiehm之免疫缺陷》, Sullivan KE及Stiehm ER編（美國學術出版社），第1版，第1059-1067頁。

Neufeld, M.等人, 1981, 「兩種類型之自體免疫性阿狄森氏病與不同的多腺自體免疫性（PGA）綜合征相關（Two types of autoimmune Addison's disease associated with different polyglandular autoimmune (PGA) syndromes）」, 《醫學（ Medicine）》60: 355-362。

Palmer S, Albergante L, Blackburn CC, Newman TJ（2018）《胸腺退化及疾病發病率隨著年齡增長（Thymic involution and rising disease incidence with age）》《美國國家科學院院刊》115:1883-1888數位物件識別碼：10.1073/pnas.1714478115。

Parker W, Yu PB, Holzknecht ZE, Lundberg K, Buckley RH, Platt JL, 「《『天然』抗體在免疫缺陷受試者中之特異性及功能：B細胞譜系及發育的線索（Specificity and function of ‘natural’ antibodies in immunodeficient subjects: Clues to B cell lineage and development）》」, 1997, 《臨床免疫學雜誌》, 17:311-321。

Patel DD, Whichard LP, Radcliffe G, Denning SM, Haynes BF.《人類胸腺上皮細胞表面抗原之表徵：胸腺上皮細胞與表皮角質細胞之相似性（Characterization of human thymic epithelial cell surface antigens: Similarity of thymic epithelial cells to epidermal keratinocytes）》.《臨床免疫學雜誌》15:80-92, 1995。

Perheentupa J., 2002, 《北美內分泌學與代謝臨床（ Endocrinol. Metab. Clin. North Am.）》31: 295-320Rota IA及Dhalla F.《FOXN1缺乏症裸嚴重複合免疫缺陷（FOXN1 deficiency nude severe combined immunodeficiency）》.《Orphanet罕見病雜誌（Orphanet Journal of Rare Diseases）》.2017; 12:6。

Rendell VR, Giamberardino C, Li J, Markert ML及Brennan TV, 2014, 「《使用非侵入性氣管內插管之成人大鼠的完全胸腺切除術》」, 《視覺試驗雜誌》(94)。

Rice HE, Skinner MA, Mahaffey SM, Oldham KT, Ing RJ, Hale LP, 2004, 「《針對完全DiGeorge氏症候群：醫療及手術考慮因素》」, 《美國小兒外科雜誌》, 39: 1607-1615。

Schmid C, Binder J, Heemann U及Tilney NL, 1994, 「《大鼠中之成功異位心臟移植》」, 《顯微手術》15(4):279-281。

Schoenecker JG, Hauck RK, Mercer MC, Parker W, Lawson J, 2000, 「《手術中暴露於局部牛類凝血酶引起對異種碳水化合物半乳糖α1-3半乳糖之反應（Exposure to topical bovine thrombin during surgery elicits a response against the xenogeneic carbohydrate galactose α1-3Galactose）》」, 《臨床免疫學雜誌》, 20:434-444。

Sun DP等人（2016）《成人之成熟B細胞淋巴瘤化療後胸腺增生及其對胸腺輸出及CD4(+) T細胞再生之影響（Thymic hyperplasia after chemotherapy in adults with mature B cell lymphoma and its influence on thymic output and CD4(+) T cells repopulation）》《腫瘤免疫學（Oncoimmunology）》5:e1137417數位物件識別碼：10.1080/2162402X.2015.1137417。

Ucar A, Ucar O, Klug P, Matt S, Brunk F, Hofmann TG, 2014, 「《成人胸腺含有FoxN1(-)上皮幹細胞，對髓質及皮質胸腺上皮譜系具有雙能性（Adult thymus contains FoxN1(-) epithelial stem cells that are bipotent for medullary and cortical thymic epithelial lineages）》」, 《免疫》, 41: 257-269。

Uibo R.等人, 1994, 「《細胞色素P450酶P450scc、P450c17及P450c21在自體免疫性多腺疾病I型及II型中及經分離之阿狄森氏病中之自體抗體（Autoantibodies to cytochrome P450 enzymes P450scc, P450c17, and P450c21 in autoimmune polyglandular disease types I and II and in isolated Addison's disease）》」, 《臨床內分泌與代謝雜誌（ J. Clin. Endocrinol. Metab.）》78: 323-328。

Ulyanchenko S, O'Neill KE, Medley T, Farley AM, Vaidya HJ, Cook AM, 2016, 「《鑑別成人胸腺中之雙能上皮祖細胞群》」, 《細胞報告》14: 2819-2832。

Wang KX, Shi YF, Ron Y, Kazanecki CC, Denhardt DT.《血漿骨橋蛋白藉由調節應激激素來調節慢性抑制應激誘導之胸腺萎縮：藉由抗骨橋蛋白單株抗體抑制（Plasma osteopontin modulates chronic restraint stress-induced thymus atrophy by regulating stress hormones: Inhibition by an anti-osteopontin monoclonal antibody）》《免疫學雜誌》182:2485-2491, 2009。

Weiss JM, Cuf P, Bismuth J, Eymard B, Fadel E, Berrih-Aknin S等人《SDF-1/CXCL12將B細胞及抗原呈遞細胞募集至自體免疫性重症肌無力患者之胸腺（SDF-1/CXCL12 recruits B cells and antigen-presenting cells to the thymus of autoimmune myasthenia gravis patients）》.《免疫生物學（Immunobiol.）》218:373-381, 2013。

Wickemeyer JL, Sekhsaria S（2014）《胸腺切除術及輻射後嚴重免疫缺陷：病例報告（Prolonged severe immunodeficiency following thymectomy and radiation: a case report）》《醫學病例報告雜誌（J Med Case Rep）》8:457數位物件識別碼：10.1186/1752-1947-8-457。

Wong K, Lister NL, Barsanti M, Lim JMC, Hammett MV, Khong DM, 2014, 「《多系潛力及自體更新限定成人胸腺中之上皮祖細胞群》」, 《細胞報告》8:1198-1209。

Wurbel M-A, Malissen M, Guy-Grand D, Meffre E, Nussenzweig MC, Richelme M, Carrier A, Malissen B. 《缺乏CCR9 CC趨化介素受體之小鼠展示早期T細胞及B細胞發育之輕度損傷及T細胞受體γδ+腸道上皮內淋巴球之減少（Mice lacking the CCR9 CC-chemokine receptor show a mild impairment of early T- and B-cell development and a reduction in T-cell receptor γδ+ gut intraepithelial lymphocytes）》.《血液》98:2626-2632, 2001。

Yu X, Almeida JR, Darko S, van der Burg M, DeRavin SS, Malech H, 2014, 「《人類免疫缺陷及調節異常綜合征之特徵在於T細胞受體譜系發育之明顯缺陷（Human syndromes of immunodeficiency and dysregulation are characterized by distinct defects in T-cell receptor repertoire development）》」, 《過敏與臨床免疫學雜誌》133: 1109-1115。

Zaitseva M, Kawamura T, Loomis R, Goldstein H, Blauvelt A, Golding H.《基質衍生因子在人類胸腺中之表現（Stromal-derived factor 1 expression in the human thymus）》.《免疫學雜誌》168:2609-2617, 2002。

Zlotogora, J.等人, 1992, 「《伊朗猶太人中之I型多腺自體免疫性綜合症（Polyglandular autoimmune syndrome type I among Iranian Jews）》」, 《醫學遺傳學雜誌（ J. Med. Genet）》， 29, 824-826。

縮寫

AIRE：自體免疫性調節基因。

Ab：抗體。

Ag：抗原。

ALCAM，活化白血球細胞黏附分子。

ANG-1，血管生成素1。

APC：抗原呈遞細胞。

ATG：胸腺球蛋白。

BCMA，B細胞成熟抗原/腫瘤壞死因子受體超家族成員17（TNFRSF17）。

b.i.d.：每天兩次。

BMI：體重指數。

BSA：體表面積。

BSC：生物安全櫃。

CCL11，伊紅趨素。

CCL20，趨化介素（C-C模體）配位體20；MIP-3a。

CCL21/6Ckine，趨化介素（C-C模體）配位體21。

cDGA：完全DiGeorge氏畸形。

CEACAM-1，癌胚抗原相關細胞黏附分子1。

CFR：聯邦法規。

cGMP：當前良好作業規範。

CK：細胞角蛋白。

CNI：鈣調神經磷酸酶抑制劑。

CTACK，CCL27，C-C模體趨化介素配位體27。

CTT：同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物。

CVVHD/F：連續靜脈-靜脈血液透析過濾。

CXCL12/SDFF-1a，基質細胞衍生因子1。

CXCL16，趨化介素配位體16。

DC：樹突狀細胞。

DSA：供體特異性抗體。

DGF：延遲移植功能。

DKK-1，Dickkopf相關蛋白1。

DMSO：二甲亞碸。

EBV：埃-巴二氏病毒。

EGF R，表皮生長因子接受者

EU：內毒素單位。

FBS：胎牛血清。

FDA：食品和及藥物管理局。

FSGS：局灶節段性腎小球硬化。

半乳糖凝集素-7。

GAPDH：3-磷酸甘油醛脫氫酶。

GCP-2，粒細胞趨化蛋白-2，（或C-X-C模體趨化介素配位體6）。

GDF-15，生長分化因子-15。

GDNF，神經膠細胞株衍生神經營養因子。

H&E：蘇木精及曙紅。

HD：血液透析。

HEPES：N-2-羥乙基哌

N'-2-乙烷-磺酸。

HI：HI -熱滅活。

HIP：腹膜內。

HIV：人類免疫缺陷病毒。

HVEM，疱疹病毒侵入介體。

ICAM-1，細胞間黏附分子1，CD54。

ICAM-3，細胞間黏附分子3。

IBW：理想體重。

IDDM：胰島素依賴型糖尿病。

IGFBP-1，胰島素株生長因子結合蛋白1。

IGFBP-6，胰島素樣生長因子結合蛋白6。

IL-1b，介白素1 β。

IL-2Ra，介白素-2受體α鏈。

IL-2Rg，介白素2受體次單元γ。

IL-12p40，介白素-12次單元β。

IL-16，前介白素-16。

ISHLT：國際心肺移植學會。

ISO：國際標準化組織。

LAL：鱟變形細胞溶菌液。

LIGHT，在經活化T細胞及不成熟DC上表現之TNF超家族成員。

LOD：偵測下限。

M-CSF，巨噬細胞群落刺激因子。

MC3：Marcus細胞治癒中心。

mAb：單株抗體。

MHC：主要組織相容複合體。

MICA，MHC I類多肽相關序列A。

MIF，巨噬細胞遷移抑制因子。

MIP-3b，巨噬細胞發炎蛋白-3 β（CCL 19，趨化介素配位體19）。

MIP-1b，巨噬細胞發炎蛋白-1β。

MST：平均存活時間。

NRGi-B1，神經調節蛋白。

OPN，骨橋蛋白

PBMC：外周血液單核細胞。

PBS：磷酸鹽緩衝鹽水。

PDGF-AA，血小板衍生生長因子AA。

PECAM-1，血小板內皮細胞黏附分子-1（CD31）。

PF4，血小板因子4。

PIGF，磷脂醯肌醇-聚醣生物合成F類蛋白。

POD：術後日。

PRA：組反應性抗體。

RANTES，在活化時調節，正常T細胞表現且可能分泌。

SCF R，幹細胞因子受體。

SL：舌下。

TBW：總體重。

TC：組織培養。

Tfh：T濾泡輔助細胞。

TOM：胸腺器官培養基。

uPAR（CD87），尿激酶纖維蛋白溶酶原活化因子受體。

USP：美國藥典。

ULOQ：定量上限。

USP：美國藥典。

無

為了更全面地理解本文所揭示之原理及其優勢，參考結合隨附圖式進行的以下描述，其中：

圖1描述經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物（例如，CTT、RVT-802）在植入之後在先天無胸腺症中提供免疫重建之方式。

圖2展示用於重建大鼠中之免疫系統之步驟的示意圖，如實例5中他處所描述，藉由移除免疫學上正常的路易斯大鼠（Lewis rat）中之胸腺，投與抗體以殺死接受者大鼠之T細胞，將來自供體大鼠之經培養的新生胸腺組織植入接受者大鼠中，投與免疫抑制劑約4個月及評估接受者大鼠中之T細胞發育。值得注意的係，在停止環孢素之前，治療組中之所有大鼠具有超過10%原生T細胞。

圖3展示實例5之兩隻實驗接受者大鼠（右側之上升線）與未接受胸腺組織植入體之兩隻對照大鼠（基線處的粗線）中之原生T細胞之發育。

圖4展示自供體採集胸腺、將用手動薄片切片機製備之供體胸腺組織的薄片培養至多21天及將培養的胸腺組織植入接受者之四頭肌中的製造過程之示意圖。

圖5A展示用於表徵測試之胸腺組織之切片的示意圖，如部分[00766]中所論述。圖5B為展示如用於胸腺之培養中之組織培養盤中的手術海綿之纖維素過濾器上之胸腺組織之切片的圖式。

圖6A-H描繪在自供體採集胸腺之後第5、9、12及21天對來自一批（MFG-056）培養的胸腺組織之胸腺組織切片的組織學測試。分別在第5天（圖6A、圖6B）、第9天（圖6C、圖6D）、第12天（圖6E、圖6F）及第21天（圖6G、圖6H）展示蘇木精及曙紅染色切片（左圖）及其與抗細胞角蛋白抗體AE1/AE3之混合物的相應反應性（右圖；棕色表示陽性反應性）。各圖之左下方的條形表示100 μm。帶有H&E之圖展示T細胞隨時間之逐漸耗乏。圖6E及圖6F主要為上皮細胞。當胸腺細胞隨著時間耗乏時，發生囊下皮層之上皮細胞的凝聚。類似凝聚發生在胸腺之髓質區域中。相片由杜克大學病理學系醫學博士Laura P. Hale拍攝。

圖7A及圖7B分別以5 mm（圖7A）及100 µm（圖7B）之標度描繪時程之第0天的胸腺組織切片之組織學。此展示第0天在低功率（條形圖5 mm）及高功率（條形圖100 μm）下之胸腺及胸腺細胞。此為正常胸腺。此時皮質及髓質均具有大量帶有深藍色細胞核之胸腺細胞，從而有助於組織之整體深藍色外觀。相片由杜克大學病理學系醫學博士Laura P. Hale拍攝。

圖8A及圖8B為來自H&E染色載玻片之影像，其分別以5 mm（圖8A）及100 µm（圖8B）之標度描繪時程之在第5天的胸腺組織切片之組織學。胸腺細胞耗乏之進展導致組織出現更多嗜伊紅血球（粉紅色）。相片由杜克大學病理學系醫學博士Laura P. Hale拍攝。

圖9A及圖9B分別以5 mm（圖9A）及100 µm（圖9B）之標度描繪在時程之第12天的胸腺組織切片之H&E染色。吾等發現胸腺細胞之逐漸耗乏。更高放大倍數展示許多缺少細胞核之嗜伊紅血球性細胞體，其為已經歷核溶解（細胞核溶解）之壞死細胞的診斷。此時在培養物中預期有此程度之壞死。相片由杜克大學病理學系醫學博士Laura P. Hale拍攝。

圖10A及圖10B分別以5 mm（圖10A）及100 µm（圖10B）之標度描繪在時程之第21天的胸腺組織切片之H&E染色。應注意，保存組織之整體架構，包括圖10B中含有大量胸腺小體之囊下皮質、皮質區域及髓質區域。小型深色細胞大部分為尚未進行核溶解之壞死胸腺細胞。相片由杜克大學病理學系醫學博士Laura P. Hale拍攝。

圖11A-E描繪代表性胸腺切片，其用抗細胞角蛋白抗體（AE1/AE3）之混合物免疫染色。圖11A.第0天；圖11B.第5天；圖11C.第9天；圖11D.第12天；及圖11E.第21天。胸腺上皮網路之結構隨著培養進展而保持 完整。條形圖表示400 μm。相片由杜克大學病理學系醫學博士Laura P. Hale拍攝。

圖12A及圖12B描繪在暴露於10× PBS之強制降解條件之後胸腺組織載玻片之組織學。圖12A描繪在暴露於強制降解條件之後第9天的皮質。圖12B描繪在暴露於強制降解條件之後第21天的皮質。在圖12A中，藍色塗片為自細胞釋放之DNA。儘管可鑑別具有完整細胞核之小細胞病灶，但大多數細胞展示降解之跡象。相片由杜克大學病理學系醫學博士Laura P. Hale拍攝。

圖13描繪臨床樣品MLM247之H&E染色組織學切片。此為培養之第0天。條形圖為200 μm。此為第0天之冷凍切片。因為此為冷凍的，所以組織在第0天看起來不同於石蠟包埋福馬林固定組織。相片由杜克大學病理學系醫學博士Laura P. Hale拍攝。

圖14冷凍切片，臨床樣品MLM219之H&E染色組織學切片。此為冷凍切片，因此組織看起來不同於上文培養且展示之石蠟包埋福馬林固定組織。然而，很好地呈現胸腺細胞耗乏之重要組織學特徵及TEC之強健生存力。相片由杜克大學病理學系醫學博士Laura P. Hale拍攝。

圖15為新鮮採集之胸腺組織的像片。

圖16為描述在大鼠腎囊下植入CTT之採集、培養、植入及活組織檢查之示意圖，如實例5中所呈現。

圖17A-D展示自切分為四片之3日齡F1（LWxDA）大鼠採集胸腺組織之像片，如實例5中所描述（圖17A）。在37℃ CO ₂培育箱中在含有胸腺器官培養基之無菌混合纖維素酯過濾器上培養5至7天之胸腺片的像片，如實例5中所描述（圖17B）。圖17C為在LW大鼠之腎囊下植入之CTT的像片。圖17D為在植入之後6個月採集之胸腺移植物的像片。箭頭指示腎囊下之CTT。

圖18A-D為描繪新鮮胸腺組織（頂部框架）及CTT（底部框架）在100×放大倍數下之組織學外觀的像片。圖18A展示H&E染色的新鮮胸腺組織（頂部框架）及培養5天之CTT（底部框架）中的髓質分化之比較，如實例5中所描述。圖18B展示與新鮮胸腺組織（頂部框架）相比，當對細胞角蛋白染色時，培養5天之CTT（底部框架）中可觀察到典型花邊圖案，如實例5中所描述。圖18C展示當對Ki-67染色時之新鮮胸腺組織（頂部框架）及耗乏T細胞之CTT（底部框架）。圖18D展示對CD3染色之新鮮胸腺組織（頂部框架）及培養5天且接著對CD3染色之CTT胸腺組織（底部框架）。在CD3染色之CTT中注意到的棕色染色（圖18D，底部框架）有可能表示一些活細胞加上尚未自組織洗出的死亡T細胞之碎屑。

圖19A-D為描繪新鮮胸腺組織（頂部框架）及CTT（底部框架）在600×放大倍數下之組織學外觀的像片。圖19A展示H&E染色的新鮮胸腺組織（頂部框架）及培養5天之CTT（底部框架）中的髓質分化之比較，如實例5中所描述。圖19B展示與新鮮胸腺組織（頂部框架）相比，當對細胞角蛋白染色時，培養5天之CTT（底部框架）中可觀察到典型花邊圖案，如實例5中所描述。圖19C展示當對Ki-67染色時之新鮮胸腺組織（頂部框架）及耗乏T細胞之CTT（底部框架）。圖19D展示對CD3染色之新鮮胸腺組織（頂部框架）及培養5天且接著對CD3染色之CTT胸腺組織（底部框架）。在CD3染色之CTT中注意到的棕色染色（圖19D，底部框架）有可能表示一些活細胞加上尚未自組織洗出的死亡T細胞之碎屑。

圖20為實例5中所報導之實驗之實驗設計的示意圖。此圖式呈現在Kwun， J.等人, 《JCI洞察》（2020）6月4日;5(11)中。

圖21展示在CTT非同種異體移植之後在右下象限中發現再生接受者型T細胞。此圖式呈現在Kwun， J.等人, 《JCI洞察》（2020）6月4日;5(11)中。

圖22A及圖22B展示植入後8.5月移植之所植入胸腺展示陽性細胞角蛋白染色（圖22A），以及類似於天然胸腺之T細胞染色（圖22B）。原始放大倍數× 400。此圖式呈現在Kwun， J.等人, 《JCI洞察》（2020）6月4日;5(11)中。

圖23展示與未植入CTT之對照動物相比，循環CD4及CD8 T細胞數目顯著增加之曲線圖。其亦展示，與未接受CTT之對照組相比，培養的胸腺組織植入（CTT）組中原生CD4及原生CD8 T細胞數目顯著增加，且與未接受CTT之對照組相比，培養的胸腺組織植入（CTT）組中CD4及CD8近期胸腺移植物（RTE）數目顯著增加。此圖式呈現在Kwun， J.等人, 《JCI洞察》（2020）6月4日;5(11)中。

圖24A展示在第180天移植之所植入CTT的免疫組織學分析，展示腎囊下之正常胸腺組織學（圖24A之右側）。圖24B展示H&E上之外植移植物。展示活T細胞（CD3）、T細胞增殖（Ki67）及細胞角蛋白（由兔多株抗體偵測）之菌株。在對細胞角蛋白染色之組中，觀察到在TEC上具有胸腺小體形成（箭頭）之花邊圖案。此圖式呈現在Kwun， J.等人, 《JCI洞察》（2020）6月4日;5(11)中。

圖25展示在使用具有CTT（實心三角形，藍線）及不具有CTT（倒三角形，紅線）移植體（CTT）之DA心臟移植的胸腺切除術及免疫抑制之後LW大鼠的存活率百分比。具有CTT之LW大鼠耐受；不具有CTT之LW大鼠為免疫缺乏的且因此不會排斥DA心臟。   對照展示LW未處理大鼠對DA心臟移植之完全排斥（空心方塊）。LW對照動物亦不排斥LW心臟移植物（具有水平線之空心圓）（n=9）。此圖式呈現在Kwun， J.等人, 《JCI洞察》（2020）6月4日;5(11)中。

圖26A及圖26B為來自植入有（圖26A）及未植入（圖26B）CTT之動物的移植同種異體移植物（DA心臟）之像片，展示由2004年國際心肺移植學會（International Society for Heart &Lung Transplantation；ISHLT）在圖26C（實心藍色方塊及實心紅色三角形）中描繪之單核細胞浸潤而無排斥跡象。此圖式呈現在Kwun， J.等人, 《JCI洞察》（2020）6月4日;5(11)中。

圖27為在具有CTT之LW大鼠（其為免疫活性的且排斥頸部同種異體BN心臟）及相較於BN對照物（排斥頸部BN心臟的LW大鼠）及同基因型對照組（LW大鼠不會排斥頸部LW心臟）之未插入CTT之對照LW動物（其由於缺乏胸腺而免疫缺乏且不可排斥頸部BN心臟）中以頸部百分比動物存活率表示之BN心臟移植物存活率相較於移植物存活率天數的曲線圖。此圖式呈現在Kwun， J.等人, 《JCI洞察》（2020）6月4日;5(11)中。

圖28A及圖28B分別為在11天及46天時具有（圖28A）及不具有（圖28B）CTT插入之BN心臟組織的像片。此等圖像為圖27及圖29中之資料的基礎。   圖28A中之心臟由於耐受性而不被排斥。圖28B中之心臟由於缺乏胸腺之免疫缺乏而不被排斥。此圖式呈現在Kwun， J.等人, 《JCI洞察》（2020）6月4日;5(11)中。

圖29展示頸部BN心臟之排斥分級。置放於LW大鼠中之同基因型LW心臟（空心圓）未被排斥。置放於LW大鼠中之BN心臟（實心圓）被排斥。   置放於接受CTT之LW大鼠中的BN心臟被排斥（實心方塊）。置放於未接受CTT之LW大鼠中的BN心臟在2隻大鼠中被弱排斥（陰影三角形）且未由其他三隻大鼠排斥。此等資料展示，具有CTT之大鼠即使在其接受DA心臟時亦能夠強烈排斥第3方心臟（圖26C），因為CTT表現DA。不具有CTT之大鼠為免疫缺乏的且並不排斥DA（圖26C）或BN心臟。此圖式呈現在Kwun， J.等人, 《JCI洞察》（2020）6月4日;5(11)中。

圖30A及圖30B分別為相比於LW及DA心臟，其中大鼠接受或不接受CTT插入之BN心臟的像片。在圖30A中，在移除免疫抑制且移植BN心臟之後，BN心臟快速被排斥且因此由於所有炎症而極其大。LW心臟經正常設定大小以使心臟將血液泵送通過身體。DA心臟由於其置於腹部且並不需要泵送血液而較小。在圖30B中，大鼠為免疫缺乏且無法在移除免疫抑制之後排斥BN或DA心臟。此圖式呈現在Kwun， J.等人, 《JCI洞察》（2020）6月4日;5(11)中。

圖31A及圖31B為來自具有或不具有CTT插入之大鼠相較於BN對照及同基因型對照大鼠之移植頸部BN心臟的排斥分級之曲線圖。圖31A描繪原發性腹部DA心臟同種異體移植物中之發炎細胞的定量。同基因型對照展示LW大鼠不排斥LW心臟。DA對照展示LW大鼠確實排斥DA心臟。CTT組由於耐受性而不排斥DA心臟。由於缺乏胸腺之免疫缺乏，不具有CTT之組不會排斥DA心臟。圖31B描繪繼發性頸部BN心臟同種異體移植物中之發炎細胞的定量。同基因型對照展示LW大鼠不排斥LW心臟。BN對照展示LW大鼠確實排斥BN心臟。CTT組排斥BN心臟，此係因為其為免疫活性的。由於缺乏胸腺之免疫缺乏，不具有CTT之組不會排斥BN心臟。圖31C展示在頸部BN心臟排斥時，自LW接受者採集之DA及BN心臟大鼠以及天然LW心臟。右下圖展示導致其排斥反應之BN心臟中的T細胞（棕色）。圖31D展示來自未插入CTT之對照動物之LW、DA及BN心臟中的T細胞浸潤。不存在T細胞浸潤，此係因為動物為免疫缺乏的。此圖式呈現在Kwun， J.等人, 《JCI洞察》（2020）6月4日;5(11)中。

圖32A至圖32C：CTT之後的體液耐受性。圖32A展示藉由T細胞流動交叉配對量測之移植後供體特異性同種抗體（抗DA及抗BN抗體）之代表性直方圖。圖32A之左上圖（DA對照）展示在接受異位腹部DA心臟移植之後正常LW大鼠中抗DA抗體（粗線）之發展。圖32A之中上圖展示在接受CTT之LW大鼠中缺乏抗DA抗體；此指示耐受性。右上圖展示無CTT之LW大鼠沒有反應；此反映大鼠在胸腺切除及沒有接受供體胸腺的T細胞耗乏之後大鼠之免疫缺乏。圖32A之左下圖展示藉由正常LW大鼠接受頸部BN心臟形成之正常抗BN抗體。圖32A之中下圖展示接受頸部BN心臟移植後具有CTT之LW大鼠對BN的正常反應，展示免疫能力及排斥第3方之能力。圖32A之右下圖展示已接受頸部BN心臟移植之後無CTT之LW大鼠對BN沒有反應，展示免疫功能不全及缺乏排斥第3方的能力。圖32B展示原發性DA心臟移植之後抗DA抗體之含量。具有來自LWxDA胸腺供體之CTT的LW大鼠在DA心臟移植之後不會產生抗DA抗體，此係因為其對DA具有耐受性。無CTT之LW大鼠在DA心臟移植之後不會產生抗DA抗體，此係因為其為免疫缺乏的。圖32C展示繼發性頸部BN心臟移植之後抗BN抗體之含量。具有來自LWxDA供體之CTT的LW大鼠製備針對BN之抗體，展示對第3方之免疫能力。無CTT之LW大鼠不會製造針對BN之抗體，展示免疫功能不全。此圖式呈現在Kwun， J.等人, 《JCI洞察》（2020）6月4日;5(11)中。

圖33A-J呈現來自8個月大的NHP之新鮮及培養的非人類靈長類動物（NHP）胸腺組織之免疫組織化學評定的顯微照片。頂列為採集當天之NHP胸腺且底列為培養12天之後的NHP胸腺。組織用蘇木精及曙紅（圖33A及圖33F）、CD3（圖33B及圖33G）、泛細胞角蛋白（CK）抗體AE1/AE3（圖33C及圖33H）、Ki-67（圖33D及圖33I）及CK14（圖33E及圖33J）染色。所有圖像在20×放大倍數下。

圖34A-P展示在培養12天之後，來自8個月大的非人類靈長類動物（NHP）之經冷凍保存培養之胸腺組織的分析。頂列為採集時（圖34A）、培養第6天（圖34B）、培養第12天（圖34C）及培養12天之後，隨後冷凍保存35天，接著解凍以用於相片（圖34D）之細胞角蛋白。圖34D中之細胞角蛋白（AE1/AE3）類似於圖34C中之細胞角蛋白。第二列展示CK14染色，其時間點分別與圖34E（採集）、圖34F（培養第6天）、圖34G（培養第12天）及圖34H（在培養12天之後，隨後冷凍保存35天，接著解凍）相同。圖34H中之CK14極其類似於圖34G中之CK14。第三列展示在相同時間點之圖34I、圖34J、圖34K及圖34L中之CD3染色，其具有預期的活T細胞隨時間推移之損失。圖34L類似於圖34K具有極少T細胞。第四列圖34M、圖34N、圖34O及圖34P展示在相同時間點增殖T細胞之Ki-67染色。在第6天不存在用Ki-67染色（圖34N）因為T細胞大部分地死亡。此圖展示類似於如何為患者冷凍保存培養的胸腺組織之冷凍保存非人類靈長類動物胸腺的能力。所有圖像在40×放大倍數下。

圖35展示使用最大MHC錯配之無CMV恆河猴之實驗移植策略的示意圖。接受者動物（Y）經歷完全胸腺切除術。供體動物（X）供予經培養胸腺組織及置於異位位置之心臟至接受者Y（第一Tx及第二Tx）中。接著撤回免疫抑制藥物且供體特異性耐受係藉由i）供體心臟持續搏動，ii）對第三方具有反應性之nMLR中之供體的耐受性及iii）來自第3方供體動物Z（第三Tx）之皮膚移植的排斥反應來證明。

圖36顯示描述用於鑑別近期胸腺移植物（RTE）之通用閘控策略的流式細胞量測術實驗之結果圖。收集非人類靈長類動物外周血液單核細胞且使用多色流式細胞量測術分析。第一步驟為鑑別第一組頂列中之單細胞。「單重態」用於鑑別第二組的頂列中之淋巴球（低SSC、側面散射及高CD45）。淋巴球中之CD3 T細胞在第3組的頂列中鑑別。CD4及CD8細胞與CD3細胞隔開，如第4組之頂列中所示。在第1組之底列中，CD28及CD95用於使用CD4閘來鑑別CD4+原生亞群、中樞記憶體亞群及效應子記憶體亞群。在底列之第2組中，CD31用於展示作為RTE之CD4+原生細胞的百分比。底列上之第3及第四組展示與RTE相同的方法但用於CD8原生T細胞。如可看出，RTE為CD4及CD8原生亞群之99.6%及95.2%。

圖37展示所培養嬰兒胸腺中之顯微攝影影像及CCL21評定之圖示。CCL21藉由所培養之嬰兒胸腺以高含量產生。左圖中展示在培養第16天與CCL21抗體（Ab）（棕色染色）之免疫組織化學反應性（左上圖，2×放大倍數；左下圖，20×放大倍數）。對於3種嬰兒胸腺培養物（R&D Systems Duo-Set ELISA），在右側展示量測每天CCL21分泌至培養基中之相應時程。因此，經培養胸腺組織可產生功能上重要的生物分子CCL21，負責將不成熟胸腺細胞前驅體吸引至胸腺之趨化介素。

圖38展示實例8之實驗設計之概述，其針對評定成功移植經培養胸腺組織，隨後對所匹配心臟耐受且排斥無CMV NHP模型中之不匹配皮膚。特定言之，在接受者之胸腺切除（階段2之第1週）及確認完全胸腺切除之後，接受者T細胞耗乏且開始使用他克莫司進行免疫抑制。在階段3之第3週將來自不相關NHP之不匹配的所培養供體胸腺組織植入至接受者中。在階段3之第10週進行胸腺移植物之活組織檢查以評估胸腺生成。在後期原生T細胞發育幾個月之後，接受者應對供體具有耐受性。接受者接著給與來自胸腺供體之異位心臟移植體（階段4之第4週）。停止免疫抑制。遵循心臟搏動（證實耐受性）。且在階段4之第10週進行混合淋巴球反應，以展示對冷凍保存的供體細胞之耐受性及對第三方細胞之排斥反應。若原生T細胞需要更多時間發育，則使用階段5。若沒有產生耐受性，則使用階段6。接受者胸腺將移植至接受者NHP中以證明胸腺組織移植程序在NHP中起作用。 已知如何格式化圖38為有幫助的。實驗具有3隻猴。請注意，原始試算表具有一頁寬、多頁長之文檔中所有三隻動物之程序。因為總分析表寬於本專利申請案中所允許之寬度，所以將總分析表之各列劃分為3頁。第一隻猴為胸腺及心臟供體；關於此猴之程序在第1、第4、第7等頁面之左側行。第二隻猴為胸腺及心臟接受者；中行中之資訊為第2、第5、第8等頁面）。第三隻猴為對照組；右側行中之資訊在第3、第6、第9等頁面上）。

圖39展示實例9之實驗設計之概述，除了添加額外免疫抑制藥物黴酚酸酯（MMF）以外，其與實例8中之概述相同。藥物MMF通常用於心臟移植。此研究將評定MMF是否對所培養之胸腺組織移植體存在任何有害影響。

圖40A-D展示新鮮胸腺、培養物d0之切片的顯微照片，展示胸腺架構。在圖40A-B中，蘇木精及曙紅（H&E）染色展示界限清楚的皮質及染色較淺的髓質區域，如正常小兒胸腺所預期。圖40C展示與泛細胞角蛋白抗體（AE1/AE3）之混合物一起偵測所有類型之上皮細胞的免疫組織化學表明胸腺上皮細胞存在於囊下方及皮質及髓質兩者中之淺色花邊網路中（棕色染色展示陽性抗體反應）。圖40B及圖40C中之箭頭指向胸腺小體。圖40D展示細胞角蛋白14（CK14）抗體染色（棕色）CK14抗體與囊下及髓質中之胸腺上皮細胞以及皮質中之分散的胸腺上皮細胞反應。虛線突出顯示由皮質包圍之髓質區域。SCC表示囊下皮質，Cor表示皮質，且M表示髓質。圖40A中之比例尺表示1 mm；圖40B-D中之比例尺表示500 μm。

圖41A-D展示顯微照片，其展示所培養胸腺切片中之胸腺小體之實例。在培養第0天（圖41A-B）及第9天（圖41C-D）展示胸腺小體之組織學外觀。圖41A及圖41C展示蘇木精及曙紅（H&E）染色；圖41B及圖41D展示與泛細胞角蛋白（AE1/AE3）抗體之反應性（棕色指示陽性反應）。圖41A-D中之箭頭指出代表性胸腺小體，其由於周圍胸腺細胞之耗乏及壞死而在所培養胸腺之H&E染色切片上顯得較不突出。然而，仍然可藉由仔細檢查或藉由使用免疫組織化學容易地鑑別胸腺小體。圖41A-D中之比例尺表示100 μm。

圖42A-D呈現展示第7天培養之胸腺之架構的顯微照片。圖42A-B中之蘇木精及曙紅（H&E）染色展示胸腺細胞之顯著耗乏，儘管一些皮質區域（Cor）仍然含有大量具有保留細胞核之胸腺細胞。圖42C中之泛細胞角蛋白（AE1/AE3）及圖42D中之細胞角蛋白14（CK14）免疫組織化學展示胸腺上皮細胞在囊下皮質（SCC）及髓質（M）中之凝聚。圖42C-D中之棕色指示與抗體之陽性反應。比例尺在圖42A中表示1 mm且在圖42B-D中表示500 μm。

圖43A-D呈現展示第9天所培養之胸腺之架構的顯微照片。圖43A-B展示蘇木精及曙紅（H&E）染色。若存在任何活T細胞或胸腺上皮細胞，則極少存在於圖43A中由虛線包圍之淺染色區域中，該區域幾乎完全壞死（Necr）。以前存在於此區域中之大部分細胞核已經由核溶解而降解。來自殘餘胸腺細胞之細胞核尚未完全降解之其他區域繼續用蘇木精染成深藍色。圖43B中之箭頭指向胸腺小體。圖43C展示泛細胞角蛋白（AE1/AE3）免疫反應性（棕色）；圖43D展示細胞角蛋白14（CK14）免疫反應性（棕色）。比例尺在圖43A中表示1 mm且在圖43B-D中表示500 μm。

圖44A-D顯示展示第12天所培養之胸腺之架構的顯微照片。圖44A-B展示蘇木精及曙紅（H&E）染色。此時，許多胸腺細胞已自組織損失或已死亡且其細胞核已溶解，使得組織更加嗜伊紅血球性（粉紅色）。一些區域保持正常未培養之胸腺之架構特徵，其具有染色更嗜鹼性（藍色）之皮質樣區域（Cor）及髓質樣區域（M），儘管胸腺細胞細胞性極大地降低。圖44C展示泛細胞角蛋白（AE1/AE3）免疫反應性（棕色）；圖44D展示細胞角蛋白14（CK14）免疫反應性（棕色）。此時，囊下皮質（SCC）已增厚且上皮細胞由於存在之胸腺細胞數目降低而顯得更突出。箭頭指向代表性胸腺小體。條形圖在圖44A中表示1 mm且在圖44B-D中表示500 μm。

圖45A-D顯示展示第20天所培養之胸腺之架構的顯微照片。圖45A-B展示蘇木精及曙紅（H&E）染色。此時，大部分胸腺細胞已自組織損失或已死亡且其細胞核已溶解，使得組織更加嗜伊紅血球性（粉紅色）。儘管具有胸腺細胞之細胞核特徵之分散細胞顯而易見，但大量殘餘胸腺細胞很少見。圖45C展示泛細胞角蛋白（AE1/AE3）免疫反應性（棕色）。先前髓質區域（M）中存在之許多上皮細胞由於髓質胸腺細胞損失而凝聚，但分散上皮細胞指示仍保留胸腺上皮細胞之殘餘淺色花邊三維網路。在圖45D中，細胞角蛋白14（CK14）免疫組織化學（棕色）突出顯示前髓質區域及囊下皮質。箭頭指向代表性胸腺小體。比例尺在圖45A中表示1 mm且在圖45B-D中表示500 μm。

圖46A-B呈現展示胸腺切片中之完整細胞核之實例的顯微照片。完整胸腺上皮細胞核（箭頭）之實例展示於第9天之囊下皮質（圖46A）及第21天之髓質（圖46B）中。蘇木精及曙紅染色；比例尺表示50 μm。

圖47A-E呈現展示在不同時間點所培養的胸腺組織之胸腺上皮網路之比較的顯微照片。圖47A展示第0天，圖47B展示第5天，圖47C展示第9天，圖47D展示第12天，且圖47E展示第21天。儘管胸腺細胞耗乏及壞死量存在時間點相關之差異，使得組織隨時間變得較不嗜鹼性（藍色），但胸腺上皮網路（棕色）之結構隨著培養發展而保持完整。皮質及髓質上皮細胞兩者可隨著介入胸腺細胞耗乏而凝聚。棕色指示與抗細胞角蛋白抗體（AE1/AE3)之混合物的陽性在之情況下；蘇木精複染色。比例尺表示400 μm。

圖48A-K呈現展示胸腺切片中之CD3免疫組織化學隨著培養時間而變化之實例的顯微照片。圖48A-B展示在第0天，皮質中之基本上所有不成熟T細胞及髓質中之更成熟細胞與CD3抗體強烈反應。更高放大倍數（圖48B）展示由棕色免疫反應性之環包圍之淺藍色細胞核，與CD3之膜表現一致。在圖48C-E中，組織在第7天仍展示與CD3抗體之廣泛反應性。然而，圖48D-E展示，當在更高放大倍數下觀察時，大部分免疫反應（棕色）與來自死胸腺細胞之碎片相關，因為大部分棕色病灶缺乏細胞核證據（圖48D）。展現完整細胞核及膜染色（箭頭）之細胞之小病灶仍可在遠離碎片之區域中鑑別（圖49E）。隨著培養進展至第9天（圖48F-G）、第12天（圖48H-I）及第21天（圖48J-K），與胸腺細胞細胞碎片之反應性仍然強，使得難以可靠地偵測碎片中潛在的完整細胞。所展示之切片皆來自表示此等時間點處檢驗之多個批次的單一批次。比例尺在圖48A、圖48C、圖48F、圖48H及圖48J中表示500 μm，且在圖48B、圖48D、圖48E、圖48G、圖48I及圖48K中表示50 μm。

圖49A-K呈現展示胸腺切片中之Ki-67免疫組織化學隨著培養時間而變化之實例的顯微照片。所展示之切片皆來自表示類似時間點處檢驗之多個批次的單一批次。圖49A-B展示在第0天，皮質（Cor）中之大部分不成熟T細胞之細胞核與對Ki-67具特異性之抗體強烈反應。更高放大倍數（圖49B）展示與皮質胸腺細胞（棕色）之細胞核強陽性反應性，然而髓質（M）中僅有罕見淋巴球與Ki-67抗體反應。圖49C-E展示截至第7天，保留在皮質區域中之大多數胸腺細胞之細胞核較小，具有與細胞凋亡一致之不明顯的細胞核邊界，且其無法與Ki-67特異性抗體反應。與抗體反應之細胞（圖49E，箭頭）具有較大細胞核，表明其為胸腺上皮細胞。在第9天（圖49F-G）、第12天（圖49H-I）及第21天（圖49J-K）發現殘餘胸腺細胞核之Ki-67標記的類似缺乏。比例尺在圖49A、圖49C、圖49E、圖49G及圖49I中表示500 μm且在圖49B、圖49D、圖49F、圖49H及圖49J中表示50 μm。

圖50A至圖50H展示來自人類胸腺器官培養物之條件培養基中所偵測之所選擇的可溶性分子之曲線圖。圖50A為以Ln/pg為單位之L-選擇素與培養天數之曲線圖；圖50B為以Ln/pg為單位之M-CSF與培養天數之曲線圖；圖50C為以Ln/pg為單位之半乳糖凝集素-7與培養天數之曲線圖；圖50D為以Ln/pg為單位之IL-16與培養天數之曲線圖；圖50E為以Ln/pg為單位之CCL21與培養天數之曲線圖；圖50F為以Ln/pg為單位之CXCL16與培養天數之曲線圖；圖50G為以Ln/pg為單位之CCL11與培養天數之曲線圖；且圖50H為以Ln/pg為單位之CXCL12與培養天數之曲線圖。

圖51展示評定自培養過程之第1天至第21天人類胸腺之培養切片中的以pg/mL為單位之胸腺細胞含量之曲線圖。

圖52展示人類胸腺組織之培養切片中活胸腺細胞之免疫組織化學評定隨時間變化之相片。圖52A為免疫組織化學之相片，其中抗CD3抗體鑑別細胞為T譜系且抗Ki-67抗體細胞增殖性細胞，表明在培養早期胸腺細胞生存力之快速損失。圖52B為描繪皮質中之基本上所有不成熟T細胞之質膜在第0天的相片，且髓質呈現與膜圖案中之抗CD3強的反應性。圖52C描繪使用對Ki-67增殖標記物具有特異性之抗體的免疫組織化學，展示一天與皮質胸腺細胞之豐富反應性。圖52D展示使用蘇木精及曙紅染色在第9天所培養的胸腺之組織學。降低的嗜鹼性(藍色)指示在培養期間供體胸腺細胞損失；圖52E描繪在培養數天之後，大部分棕色係歸因於在死胸腺細胞經歷核溶解/細胞核溶解之後仍然存在的無核但仍具有免疫反應性之碎片。圖52F描繪在器官培養期間發生之胸腺細胞死亡，僅產生Ki-67免疫反應性，其中較大細胞在培養期間之稍後時間點與TE細胞形態一致。

圖53A展示來自培養的胸腺組織之條件培養基的以pg/mL為單位之CCL21含量與培養天數之曲線圖。圖53B為用於待經歷預處理之胸腺組織之切片程序的圖示。圖53C為胸腺器官組織培養物之切片隨時間變化分泌CCL21之曲線圖。

圖54A至圖54D為描繪經培養及未培養之胸腺組織中之免疫反應性的像片。圖54A為髓質區域之像片，且亦包括在培養第0天遍及皮質分散之TEC；圖54B為髓質區域之像片，且亦包括在培養第16天遍及影像分散之TEC；圖54C為在培養第0天的髓質區域中以及皮質區域中分散的TEC中之TEC的像片。圖54D為在培養第16天髓質區域中以及皮質區域中分散之TEC中之TEC的像片。

圖55A至圖55F為在整個生命期內之胸腺組織中所選擇之mRNA之表現的曲線圖。根據製造商之說明，使用QuantiGene分析（賽默飛世爾（Thermo Fisher）定量存在於胸腺組織之FFPE切片中之目標mRNA的相對量。呈現各目標mRNA之資料以歸一化至GAPDH（「未調節」），接著進一步歸一化為含有胸腺上皮細胞之面積%（「由TE調節」）或歸一化為含有CD1a陽性皮質胸腺細胞之面積%（「由Cor調節」）。所展示之資料係獲自來源於5天至78歲之年齡範圍之供體的47個胸腺樣本。圖55A及圖55B為獲自小於或等於18歲（n = 25）供體之胸腺組織，當與大於18歲之供體相比時，分別展示編碼T細胞標記物CD3ε及皮質胸腺細胞標記物CD1a（圖55A，B）之mRNA相對於GAPDH的更高表現。圖55C及圖55D為描繪分別編碼細胞角蛋白8（KRT8）及14（KRT14）之mRNA相對於與老年人相比小於或等於18歲的供體中之GAPDH減少的相片（圖55C，D）。圖55E為描繪來自小於或等於18歲供體之胸腺中相對於GAPDH一致較低之未調節的CCL21基因表現之相片。圖55F為描繪來自小於或等於18歲供體之胸腺中相對於GAPDH一致較低之未調節的CXCL21基因表現之相片。

圖56為胸腺器官培養物之廢培養基中存在之蛋白質表，如藉由多重抗體陣列所測定。

圖57A至圖57C為胸腺組織之形態量測之像片。根據製造商說明書使用由ImageScope軟體（阿普瑞奧技術（Aperio Technologies），徠卡生物系統成像公司（Leica Biosystems imaging, Inc.））提供之「筆工具」勾勒出各量測中所包括的區域。圖57A展示以綠色勾勒之H&E染色載玻片上之胸腺組織的總區域。含有淋巴球之此區域之比例進一步以淺綠色勾勒。圖57B為展示在與AE1/AE3混合物反應以鑑別泛細胞角蛋白之切片上以黃色勾勒之含有胸腺上皮細胞之區域（「TE區域」）的相片。圖57C為展示在與CD1a抗體反應該切片上衣紅色勾勒之含有不成熟胸腺細胞之區域（「皮質區域」）的相片。所展示之胸腺來源於在主動脈瓣替換手術時的32歲女性。各圖之比例尺= 4 mm。在圖57B及圖57C之面板中，棕色指示與抗體之陽性反應。

圖58A至圖58C為描繪培養21天之胸腺組織切片中之少數活胸腺細胞的像片。圖58A為描繪在培養第21天含有極少完整胸腺細胞之胸腺切片的相片，如由H&E切片中明顯缺乏嗜鹼性球（藍色）所指示。圖58B為描繪經培養胸腺組織切片之相片，其中用CD3免疫組織化學發現之大部分強棕色免疫反應與無核細胞碎片相關，儘管展現尚未經歷核溶解（插圖）之壞死細胞的細胞核及細胞質染色特徵之死胸腺細胞並不少見。圖58C為描繪在第21天之Ki-67免疫反應性限於具有作為胸腺上皮細胞之特徵的較大細胞核之細胞之相片。條形圖在主圖中表示300 μm且在插圖中表示50 μm。

圖59A至圖59C為展示用於基因表現分析之人類胸腺組織之特徵的圖示。圖59A描繪所研究之胸腺組織之年齡及性別分佈，其中下部黑色實心圓形指示女性，上部空心圓指示男性，且中間灰色圓形指示一位未知性別之供體。圖59B繪製含有胸腺上皮細胞之面積隨此組胸腺組織之年齡而變化。圖59C繪製由CD1a陽性胸腺細胞界定之具有活性胸腺生成的面積%隨此組胸腺組織之年齡而變化。

圖60為新鮮採集之胸腺組織的像片。

圖61A及圖61B描繪在暴露於10× PBS之強制降解條件之後胸腺組織載玻片之組織學。圖61A描繪在暴露於強制降解條件之後第9天的皮質。圖61B描繪在暴露於強制降解條件之後第21天的皮質。在圖61A中，藍色塗片為自細胞釋放之DNA。儘管可鑑別具有完整細胞核之小細胞病灶，但大多數細胞展示降解之跡象。相片由杜克大學病理學系醫學博士Laura P. Hale拍攝。

圖62A展示用於表徵測試之胸腺組織之切片的示意圖，如部分[00520]中所論述。圖62B為展示如用於胸腺之培養中之組織培養盤中的手術海綿之纖維素過濾器上之胸腺組織之切片的圖式。

圖63A至圖63H描繪在自供體採集胸腺之後第5、9、12及21天對來自一批（MFG-056）培養的胸腺組織之胸腺組織切片的組織學測試。分別在第5天（圖63A、圖63B）、第9天（圖63C、圖63D）、第12天（圖63E、圖63F）及第21天（圖63G、圖63H）展示蘇木精及曙紅染色切片（左圖）及其與抗細胞角蛋白抗體AE1/AE3之混合物的相應反應性（右圖；棕色表示陽性反應性）。各圖之左下方的條形表示100 μm。帶有H&E之圖展示T細胞隨時間之逐漸耗乏。圖63E及圖63F主要為上皮細胞。當胸腺細胞隨著時間耗乏時，發生囊下皮層之上皮細胞的凝聚。類似凝聚發生在胸腺之髓質區域中。相片由杜克大學病理學系醫學博士Laura P. Hale拍攝。

圖64A及圖64B分別以5 mm（圖64A）及100 µm（圖64B）之標度描繪時程之第0天的胸腺組織切片之組織學。此展示在第0天在低功率（條形圖5 mm）及高功率（條形圖100 μm）下之胸腺及胸腺細胞。此為正常胸腺。此時皮質及髓質均具有大量帶有深藍色細胞核之胸腺細胞，從而有助於組織之整體深藍色外觀。相片由杜克大學病理學系醫學博士Laura P. Hale拍攝。

圖65A及圖65B為來自H&E染色載玻片之影像，其分別以5 mm（圖65A）及100 µm（圖65B）之標度描繪時程之第5天的胸腺組織切片之組織學。胸腺細胞耗乏之進展導致組織出現更多嗜伊紅血球（粉紅色）。相片由杜克大學病理學系醫學博士Laura P. Hale拍攝。

圖66A及圖66B分別以5 mm（圖66A）及100 µm（圖66B）之標度描繪時程之第12天的胸腺組織切片之H&E染色。吾等發現胸腺細胞之逐漸耗乏。更高放大倍數展示許多缺少細胞核之嗜伊紅血球性細胞體，其為已經歷核溶解（細胞核溶解）之壞死細胞的診斷。此時在培養物中預期有此程度之壞死。相片由杜克大學病理學系醫學博士Laura P. Hale拍攝。

圖67A及圖67B分別以5 mm（圖67A）及100 µm（圖67B）之標度描繪在時程之第21天的胸腺組織切片之H&E染色。應注意，保存組織之整體架構，包括圖67B中含有大量胸腺小體之囊下皮質、皮質區域及髓質區域。小型深色細胞大部分為尚未進行核溶解之壞死胸腺細胞。相片由杜克大學病理學系醫學博士Laura P. Hale拍攝。

圖68A-E描繪代表性胸腺切片，其用抗細胞角蛋白抗體（AE1/AE3）之混合物免疫染色。圖68A.第0天；圖68B.第5天；圖68C.第9天；圖 68D.第12天；及圖68E.第21天。胸腺上皮網路之結構隨著培養進展而保持 完整。條形圖表示400 μm。相片由杜克大學病理學系醫學博士Laura P. Hale拍攝。

圖69展示所培養的嬰兒胸腺中之顯微攝影影像及CCL21評定之圖示。CCL21藉由所培養之嬰兒胸腺以高含量產生。左圖中展示在培養第16天與CCL21抗體（Ab）（棕色染色）之免疫組織化學反應性（左上圖，2×放大倍數；左下圖，20×放大倍數）。對於3種嬰兒胸腺培養物（R&D Systems Duo-Set ELISA），在右側展示量測每天CCL21分泌至培養基中之相應時程。因此，經培養胸腺組織可產生功能上重要的生物分子CCL21，負責將不成熟胸腺細胞前驅體吸引至胸腺之趨化介素。

圖70A至圖70D展示新鮮胸腺、培養物d0之切片的顯微照片，展示胸腺架構。在圖70A-B中，蘇木精及曙紅（H&E）染色展示界限清楚的皮質及染色較淺的髓質區域，如正常小兒胸腺所預期。圖70C展示與泛細胞角蛋白抗體（AE1/AE3）之混合物一起偵測所有類型之上皮細胞的免疫組織化學表明胸腺上皮細胞存在於被膜下方及皮質及髓質兩者中之淺色花邊網路（棕色染色展示陽性抗體反應）。圖70B及圖70C中之箭頭指向胸腺小體。圖70D展示細胞角蛋白14（CK14）抗體染色（棕色）。CK14抗體與囊下及髓質中之胸腺上皮細胞以及皮質中之分散的胸腺上皮細胞反應。虛線突出顯示由皮質包圍之髓質區域。SCC表示囊下皮質，Cor表示皮質，且M表示髓質。圖70A中之比例尺表示1 mm；圖70B-D中之比例尺表示500 μm。

圖71A至圖71D呈現展示所培養胸腺切片中之胸腺小體之實例的顯微照片。在培養第0天（圖71A-B）及第9天（圖71C-D）展示胸腺小體之組織學外觀。圖71A及圖71C展示蘇木精及曙紅（H&E）染色；圖71B及圖71D展示與泛細胞角蛋白（AE1/AE3）抗體之反應性（棕色指示陽性反應）。圖71A-D中之箭頭指出代表性胸腺小體，其由於周圍胸腺細胞之耗乏及壞死而在所培養胸腺之H&E染色切片上顯得較不突出。然而，仍然可藉由仔細檢查或藉由使用免疫組織化學容易地鑑別胸腺小體。圖71A-D中之比例尺表示100 μm。

圖72A至圖72D呈現展示第7天培養之胸腺之架構的顯微照片。圖72A-B中之蘇木精及曙紅（H&E）染色展示胸腺細胞之顯著耗乏，儘管一些皮質區域（Cor）仍然含有大量具有保留細胞核之胸腺細胞。圖72C中之泛細胞角蛋白（AE1/AE3）及圖72D中之細胞角蛋白14（CK14）免疫組織化學展示胸腺上皮細胞在囊下皮質（SCC）及髓質（M）中之凝聚。圖72C-D中之棕色指示與抗體之陽性反應。比例尺在圖72A中表示1 mm且在圖72B-D中表示500 μm。

圖73A至圖73D呈現展示第9天所培養之胸腺之架構的顯微照片。圖73A-B展示蘇木精及曙紅（H&E）染色。若存在任何活T細胞或胸腺上皮細胞，則極少存在於圖73A中由虛線包圍之淺染色區域中，該區域幾乎完全壞死（Necr）。以前存在於此區域中之大部分細胞核已經由核溶解而降解。來自殘餘胸腺細胞之細胞核尚未完全降解之其他區域繼續用蘇木精染成深藍色。圖73B中之箭頭指向胸腺小體。圖73C展示泛細胞角蛋白（AE1/AE3）免疫反應性（棕色）；圖73D展示細胞角蛋白14（CK14）免疫反應性（棕色）。比例尺在圖73A中表示1 mm且在圖73B-D中表示500 μm。

圖74A至74D顯示展示第12天所培養之胸腺之架構的顯微照片。圖74A-B展示蘇木精及曙紅（H&E）染色。此時，許多胸腺細胞已自組織損失或已死亡且其細胞核已溶解，使得組織更加嗜伊紅血球性（粉紅色）。一些區域保持正常未培養之胸腺之架構特徵，其具有染色更嗜鹼性（藍色）之皮質樣區域（Cor）及髓質樣區域（M），儘管胸腺細胞細胞性極大地降低。圖74C展示泛細胞角蛋白（AE1/AE3）免疫反應性（棕色）；圖74D展示細胞角蛋白14（CK14）免疫反應性（棕色）。此時，囊下皮質（SCC）已增厚且上皮細胞由於存在之胸腺細胞數目降低而顯得更突出。箭頭指向代表性胸腺小體。條形圖在圖74A中表示1 mm且在圖74B-D中表示500 μm。

圖75A-B展示蘇木精及曙紅（H&E）染色。此時，大部分胸腺細胞已自組織損失或已死亡且其細胞核已溶解，使得組織更加嗜伊紅血球性（粉紅色）。儘管具有胸腺細胞之細胞核特徵之分散細胞顯而易見，但大量殘餘胸腺細胞很少見。圖75C展示泛細胞角蛋白（AE1/AE3）免疫反應性（棕色）。先前髓質區域（M）中存在之許多上皮細胞由於髓質胸腺細胞損失而凝聚，但分散上皮細胞指示仍保留胸腺上皮細胞之殘餘淺色花邊三維網路。在圖75D中，細胞角蛋白14（CK14）免疫組織化學（棕色）突出顯示前髓質區域及囊下皮質。箭頭指向代表性胸腺小體。比例尺在圖75A中表示1 mm且在圖75B-D中表示500 μm。

圖76A-B呈現展示胸腺切片中之完整細胞核之實例的顯微照片。完整胸腺上皮細胞核（箭頭）之實例展示於第9天之囊下皮質（圖76A）及第21天之髓質（圖76B）中。蘇木精及曙紅染色；比例尺表示50 μm。

圖77A至圖77E呈現展示在不同時間點所培養胸腺組織之胸腺上皮網路之比較的顯微照片。圖77A展示第0天，圖77B展示第5天，圖77C展示第9天，圖77D展示第12天，且圖77E展示第21天。儘管胸腺細胞耗乏及壞死量存在時間點相關之差異，使得組織隨時間變得較不嗜鹼性（藍色），但胸腺上皮網路（棕色）之結構隨著培養發展而保持完整。皮質及髓質上皮細胞兩者可隨著介入胸腺細胞耗乏而凝聚。棕色指示與抗細胞角蛋白抗體（AE1/AE3)之混合物的陽性在之情況下；蘇木精複染色。比例尺表示400 μm。

圖78A-K呈現展示胸腺切片中之CD3免疫組織化學隨著培養時間而變化之實例的顯微照片。圖78A-B展示在第0天，皮質中之基本上所有不成熟T細胞及髓質中之更成熟細胞與CD3抗體強烈反應。更高放大倍數（圖78B）展示由棕色免疫反應性之環包圍之淺藍色細胞核，與CD3之膜表現一致。在圖78C-E中，組織在第7天仍展示與CD3抗體之廣泛反應性。然而，圖78D-E展示，當在更高放大倍數下觀察時，大部分免疫反應（棕色）與來自死胸腺細胞之碎片相關，因為大部分棕色病灶缺乏細胞核證據（圖78D）。展現完整細胞核及膜染色（箭頭）之細胞之小病灶仍可在遠離碎片之區域中鑑別（圖78E）。隨著培養進展至第9天（圖78F-G）、第12天（圖78H-I）及第21天（圖78J-K），與胸腺細胞細胞碎片之反應性仍然強，使得難以可靠地偵測碎片中潛在的完整細胞。所展示之切片皆來自表示此等時間點處檢驗之多個批次的單一批次。比例尺在圖78A、圖78C、圖78F、圖78H及圖78J中表示500 μm，且在圖78B、圖78D、圖78E、圖78G、圖78I及圖78K中表示50 μm。

圖79A-K呈現展示胸腺切片中之Ki-67免疫組織化學隨著培養時間而變化之實例的顯微照片。所展示之切片皆來自表示類似時間點處檢驗之多個批次的單一批次。圖79A-B展示在第0天，皮質（Cor）中之大部分不成熟T細胞之細胞核與對Ki-67具特異性之抗體強烈反應。更高放大倍數（圖79B）展示與皮質胸腺細胞（棕色）之細胞核強陽性反應性，然而髓質（M）中僅有罕見淋巴球與Ki-67抗體反應。圖79C-E展示截至第7天，保留在皮質區域中之大多數胸腺細胞之細胞核較小，具有與細胞凋亡一致之不明顯的細胞核邊界，且其無法與Ki-67特異性抗體反應。與抗體反應之細胞（圖79E，箭頭）具有較大細胞核，表明其為胸腺上皮細胞。在第9天（圖79F-G）、第12天（圖79H-I）及第21天（圖79J-K）發現殘餘胸腺細胞核之Ki-67標記的類似缺乏。比例尺在圖79A、圖79C、圖79E、圖79G及圖79I中表示500 μm且在圖79B、圖79D、圖79F、圖79H及圖79J中表示50 μm。

圖80為在來自人類胸腺器官培養物之條件培養基中偵測之uPAR的曲線圖。

圖81為在來自人類胸腺器官培養物之條件培養基中偵測之OPN的曲線圖。

圖82為在來自人類胸腺器官培養物之條件培養基中偵測之MIP3a的曲線圖。

圖83為在來自人類胸腺器官培養物之條件培養基中偵測之IGFBP-1的曲線圖。

圖84為在來自人類胸腺器官培養物之條件培養基中偵測之MIF的曲線圖。

圖85為廢培養基中CCL21濃度與天數之散點圖。

圖86為廢培養基中CCL21濃度與天數之盒狀圖。

圖87為圖4之圖示：強制降解研究-批次MFG-053及批次-054中CCL21含量（pg/mL）。

圖88為強制降解研究-批次MFG-066中CCL21含量（pg/mL）之圖示。

圖89為廢培養基中CXCL16濃度與天數之散點圖。

圖90為廢培養基中CXCL16濃度與天數之盒狀圖。

圖91為強制降解研究-批次MFG-053及批次MFG-054中CXCL16含量（pg/mL）之散點圖。

圖92為強制降解研究-批次MFG-066中CXCL21含量之散點圖。

圖93為廢培養基中L-選擇素濃度與天數之散點圖。

圖94為廢培養基中L-選擇素濃度與天數之盒狀圖。

圖95為強制降解研究-批次MFG-053及批次MFG-054中L-選擇素含量（pg/mL）之散點圖。

圖96為強制降解研究-批次MFG-066中L-選擇素含量之散點圖。

圖97為廢培養基中uPAR濃度與天數之散點圖。

圖98為廢培養基中uPAR濃度與天數之散點圖。

圖99為強制降解研究-批次MFG-053及批次MFG-054中uPAR含量（pg/mL）之散點圖。

圖100為強制降解研究-批次MFG-066中uPAR含量之散點圖。

圖101為CXCL16與CCL21之散點圖。

圖102為CCL21與uPAR之二次回歸模型。

圖103為CXCL16與uPAR之二次回歸模型。

圖104為廢培養基中CCL11濃度與天數之散點圖。

圖105為廢培養基中CCL11濃度與天數之散點圖。

圖106為廢培養基中CCL11濃度與天數之線性回歸模型。

圖107為強制降解研究-批次MFG-053及批次MFG-054中CCL11含量（pg/mL）之曲線圖。

圖108為強制降解研究-批次MFG-066中之CCL11含量之曲線圖。

圖109為廢培養基中OPN濃度與天數之散點圖。

圖110為廢培養基中OPN濃度與天數之盒狀圖。

圖111為廢培養基中OPN濃度與天數之二次回歸模型。

圖112為強制降解研究-批次MFG-053及批次MFC-054中OPN含量（pg/mL）之曲線圖。

圖113為強制降解研究-批次MFG-066中OPN含量之曲線圖。

圖114為廢培養基中CXCL12濃度與天數之散點圖。

圖115為廢培養基中CXCL12濃度與天數之盒狀圖。

圖116為廢培養基中CXCL12濃度與天數之擬合線圖。

圖117為強制降解研究-批次MFG-053及批次MFG-054中CXCL12含量（pg/mL）之散點圖。

圖118為強制降解研究-批次MFG-066中CXCL12含量之散點圖。

圖119為廢培養基中CCL20濃度與天數之散點圖。

圖120為廢培養基中CCL20濃度與天數之盒狀圖。

圖121為廢培養基中CCL20濃度與天數之三次回歸模型。

圖122為強制降解研究-批次MFG-053及批次MFG-054中CCL20含量（pg/mL）之散點圖。

圖123為強制降解研究-批次MFG-066中CCL20含量之散點圖。

圖124為廢培養基中IL-16濃度與天數之散點圖。

圖125為廢培養基中IL-16濃度與天數之盒狀圖。

圖126為廢培養基中IL-16濃度與天數之擬合線圖。

圖127為強制降解研究-批次MFG-053及批次MFG-054中IL-16含量（pg/mL）之散點圖。

圖128為強制降解研究-批次MFG-066中IL-16含量之散點圖。

圖129為廢培養基中IGFBP-1濃度與天數之散點圖。

圖130為廢培養基中IGFBP-1濃度與天數之盒狀圖。

圖131為廢培養基中IGFBP-1濃度與天數之擬合線圖。

圖132為強制降解研究-批次MFG-053中IGFBP-1含量（pg/mL）之散點圖。

圖133為強制降解研究-批次MFG-066中OGFBP-1含量之散點圖。

圖134為廢培養基中MIF濃度與天數之散點圖。

圖135為廢培養基中MIF濃度與天數之盒狀圖。

圖136為廢培養基中MIF濃度與天數之線性回歸模型。

圖137為強制降解研究-批次MFG-053及批次MFG-054中MIF含量（pg/mL）之散點圖。

圖138為強制降解研究-批次MFG-066中MIF含量之散點圖。

圖139為廢培養基中CCL25濃度與天數之散點圖。

圖140為廢培養基中CCL25濃度與天數之盒狀圖。

圖141為廢培養基中MIF濃度與天數之線性回歸模型。

圖142為強制降解研究-Lot-053及Lot-054中CCL25含量（pg/mL）之散點圖。

圖143為強制降解研究-批次MFG-066中CCL25含量之散點圖。

Claims (126)

1. 一種生產適用於植入人體之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物的方法，其包含以下步驟：使一供體胸腺經歷一預處理方案持續約6天至約21天的時段；其中用於該供體胸腺組織之該預處理方案包含在一胸腺器官培養基中無菌處理該供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；更包含偵測在該預處理方案之時程期間該胸腺器官培養基中CCL21之含量增加；及回收該部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片作為適用於植入的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物。
2. 如請求項1所述之方法，其更包含在液氮中冷凍保存該經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物以用於將來植入的步驟。
3. 如請求項1或2所述之方法，其更包含偵測在該預處理方案之時程期間該胸腺器官培養基中L-選擇素之含量降低。
4. 如請求項1至3中任一項所述之方法，其更包含偵測在該預處理方案之時程期間該胸腺器官培養基中 M-CSF、半乳糖凝集素-7或IL-16中之一或多者的含量降低。
5. 如請求項4所述之方法，其中在該胸腺器官培養基中M-CSF在該預處理方案之時程期間減少。
6. 如請求項4所述之方法，其中半乳糖凝集素-7在該預處理方案之時程期間在該胸腺器官培養基中減少。
7. 如請求項4所述之方法，其中IL-16在該預處理方案之時程期間在該胸腺器官培養基中減少。
8. 如請求項1至7中任一項所述之方法，其更包含偵測在該預處理方案之時程期間該胸腺器官培養基中 CXCL12、CXCL16或CCL11中之一或多者的含量增加。
9. 如請求項8所述之方法，其中CXCL12在該預處理方案之時程期間在該胸腺器官培養基中增加。
10. 如請求項8所述之方法，其中CXCL16在該預處理方案之時程期間在該胸腺器官培養基中增加。
11. 如請求項8所述之方法，其中CCL11在該預處理方案之時程期間在該胸腺器官培養基中增加。
12. 如請求項1至11中任一項所述之方法，其中該預處理方案持續6天或7天、或8天、或9天、或10天、或11天、或12天、或13天、或14天、或15天、或16天、或17天、或18天或19天、或20天、或21天之時段；或持續5至6天、或5至7天、或5至8天、或5至9天、或5至10天、或6至7天、或6至8天、或6至9天、或6至10天、或6至11天、或6至12天、或6至21天、或7至21天、或8至21天、或9至21天、或10至21天、或11至21天、或12至21天、13至21天或14至21天、或15至21天、或16至21天或17至21天或18至21天、或19至21天、或20至21天之時段。
13. 如請求項8所述之方法，其中CCL21之含量接近圖50E中之含量。
14. 如請求項8所述之方法，其中L-選擇素之含量接近圖50A中之含量。
15. 如請求項8所述之方法，其中M-CSF之含量接近圖50B中之含量。
16. 如請求項8所述之方法，其中半乳糖凝集素-7之含量接近圖50C中之含量。
17. 如請求項8所述之方法，其中IL-16之含量接近圖50D中之含量。
18. 如請求項8所述之方法，其中CXCL16之含量接近圖50F中之含量。
19. 如請求項8所述之方法，其中CCL11之含量接近圖50G中之含量。
20. 如請求項8所述之方法，其中CXL21之含量接近圖50H中之含量。
21. 一種生產適用於植入人體內之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物的方法，其包含以下步驟：使一供體胸腺經歷一預處理方案持續約6天至約21天的時段；其中用於該供體胸腺組織之該預處理方案包含在一胸腺器官培養基中無菌處理該供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；更包含偵測在該預處理方案之時程期間該胸腺器官培養基中選自以下之至少一種生物標記物的含量：L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素（Eotaxin）、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1；及回收該部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片作為適用於植入的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物。
22. 如前述請求項中任一項所述之方法，其更包含以下步驟：判定在該預處理方案期間在該供體胸腺組織切片中對分散於整個該供體胸腺組織切片中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域、至少一種胸腺小體（Hassall body）之存在、分散於整個該供體胸腺組織切片中之CK14染色及完整細胞核之存在。
23. 一種用於判定經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物是否適用於植入人體內之方法，該方法包含以下步驟：將一供體胸腺組織切片在ㄧ胸腺器官培養基中預處理約6天至約21天之時段；其中用於該供體胸腺組織之該預處理方案包含在該胸腺器官培養基中無菌處理該供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；及偵測在該預處理方案之時程期間該胸腺器官培養基中選自以下之至少一種標記物的含量：L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1。
24. 如請求項24所述之方法，其中該至少一種標記物係選自L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16及CCL11。
25. 如請求項23或24所述之方法，其中該至少一種標記物為L-選擇素。
26. 如請求項25所述之方法，其中該胸腺器官培養基中L-選擇素之含量在該預處理方案之時程期間降低。
27. 如請求項23或24所述之方法，其中該至少一種標記物為M-CSF。
28. 如請求項27所述之方法，其中該胸腺器官培養基中M-CSF之含量在該預處理方案之時程期間降低。
29. 如請求項23或24所述之方法，其中該至少一種標記物為半乳糖凝集素-7。
30. 如請求項29所述之方法，其中該胸腺器官培養基中半乳糖凝集素-7之含量在該預處理方案之時程期間降低。
31. 如請求項23或24所述之方法，其中該至少一種標記物為IL-16。
32. 如請求項31所述之方法，其中該胸腺器官培養基中IL-16之含量在該預處理方案之時程期間降低。
33. 如請求項23或24所述之方法，其中該至少一種標記物為CCL21。
34. 如請求項33所述之方法，其中該胸腺器官培養基中CCL21之含量在該預處理方案之時程期間增加。
35. 如請求項23或24所述之方法，其中該至少一種標記物為CXCL12。
36. 如請求項35所述之方法，其中該胸腺器官培養基中CXCL12之含量在該預處理方案之時程期間增加。
37. 如請求項23或24所述之方法，其中該至少一種標記物為CXCL16。
38. 如請求項37所述之方法，其中該胸腺器官培養基中CXCL16之含量在該預處理方案之時程期間增加。
39. 如請求項23或24所述之方法，其中該至少一種標記物為CCL11。
40. 如請求項39所述之方法，其中該胸腺器官培養基中CCL11之含量在該預處理方案之時程期間增加。
41. 如前述請求項23至40中任一項所述之方法，其更包含以下步驟：判定在該預處理方案期間在該供體胸腺組織切片中對分散於整個該供體胸腺組織切片中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域、至少一種胸腺小體之存在、分散於整個該供體胸腺組織切片中之CK14染色及完整細胞核之存在。
42. 一種用於判定經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物是否適用於植入人體內之方法，該方法包含以下步驟：將一供體胸腺組織切片在一胸腺器官培養基中預處理約6天至約21天之時段；其中用於該供體胸腺組織之該預處理方案包含在該胸腺器官培養基中無菌處理該供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；及偵測在該預處理方案之時程期間該胸腺器官培養基中選自圖56中之標記物的至少一種標記物之含量。
43. 一種用於判定經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物是否適用於植入人體內之方法，該方法包含以下步驟：將一供體胸腺組織切片在一胸腺器官培養基中預處理約6天至約21天之時段；其中用於該供體胸腺組織之該預處理方案包含在該胸腺器官培養基中無菌處理該供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；及偵測在該預處理方案之時程期間該胸腺器官培養基中選自以下之至少一種標記物的含量：L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1。
44. 如請求項23至43中任一項所述之方法，其中偵測在培養方案期間該胸腺器官培養基中至少一種標記物之含量，或至少兩種、或至少三種、或至少四種、或至少五種、或至少六種、或至少七種標記物之含量，或偵測在該預處理方案期間該胸腺器官培養基中之至少八種標記物，該等標記物係選自L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16及CCL11。
45. 一種治療受試者之胸腺病症之方法，其改良包含將在一胸腺器官培養基中經歷一預處理方案約6天至約21天之時段的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生切片植入患有胸腺病症之受試者中；其中用於該供體胸腺組織之該預處理方案包含在該胸腺器官培養基中無菌處理該供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；及偵測在該預處理方案之時程期間該胸腺器官培養基中選自以下之至少一種標記物的含量：L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1。
46. 如請求項45所述之方法，其中該至少一種標記物係選自L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16及CCL11。
47. 如請求項45或46所述之方法，其中該至少一種標記物為L-選擇素。
48. 如請求項47所述之方法，其中該胸腺器官培養基中L-選擇素之含量在該預處理方案之時程期間降低。
49. 如請求項45或46所述之方法，其中該至少一種標記物為M-CSF。
50. 如請求項49所述之方法，其中該胸腺器官培養基中M-CSF之含量在該預處理方案之時程期間降低。
51. 如請求項45或46所述之方法，其中該至少一種標記物為半乳糖凝集素-7。
52. 如請求項51所述之方法，其中該胸腺器官培養基中半乳糖凝集素-7之含量在該預處理方案之時程期間降低。
53. 如請求項45或46所述之方法，其中該至少一種標記物為IL-16。
54. 如請求項53所述之方法，其中該胸腺器官培養基中IL-16之含量在該預處理方案之時程期間降低。
55. 如請求項45或46所述之方法，其中該至少一種標記物為CCL21。
56. 如請求項55所述之方法，其中該胸腺器官培養基中CCL21之含量在該預處理方案之時程期間增加。
57. 如請求項45或46所述之方法，其中該至少一種標記物為CXCL12。
58. 如請求項57所述之方法，其中該胸腺器官培養基中CXCL12之含量在該預處理方案之時程期間增加。
59. 如請求項45或46所述之方法，其中該至少一種標記物為CXCL16。
60. 如請求項59所述之方法，其中該胸腺器官培養基中CXCL16之含量在該預處理方案之時程期間增加。
61. 如請求項45或46所述之方法，其中該至少一種標記物為CCL11。
62. 如請求項61所述之方法，其中該胸腺器官培養基中CCL11之含量在該預處理方案之時程期間增加。
63. 如前述請求項45至62中任一項所述之方法，其更包含以下步驟：判定在該預處理方案期間在該供體胸腺組織切片中對分散於整個該供體胸腺組織切片中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域、至少一種胸腺小體之存在、分散於整個該供體胸腺組織切片中之CK14染色及完整細胞核之存在。
64. 如請求項45至63中任一項所述之方法，其中該胸腺病症為與完全DiGeorge氏症候群相關之先天無胸腺症。
65. 如請求項45至63中任一項所述之方法，其中該胸腺病症為與22q11.2缺失相關之先天無胸腺症。
66. 如請求項45至63中任一項所述之方法，其中該胸腺病症為與CHARGE （缺損、心臟缺陷、鼻後孔閉鎖、生長或智力遲鈍、生殖器發育不全及耳畸形或耳聾）相關之先天無胸腺症。
67. 如請求項45至63中任一項所述之方法，其中該胸腺病症為與 chd7（染色域-解旋酶-DNA-結合蛋白7）基因突變相關之先天無胸腺症。
68. 如請求項45至63中任一項所述之方法，其中該胸腺病症為與叉頭框蛋白N1（FOXN1）缺乏相關之先天無胸腺症。
69. 如請求項45至63中任一項所述之方法，其中該胸腺病症為與 TBX-1或TBX-2基因突變相關之先天無胸腺症。
70. 如請求項45至63中任一項所述之方法，其中該胸腺病症為年齡相關之胸腺退化。
71. 如請求項45至63中任一項所述之方法，其中該胸腺病症與胸腺瘤相關。
72. 如請求項71所述之方法，其中該胸腺瘤為惡性的。
73. 如請求項71所述之方法，其中該胸腺瘤為非惡性的。
74. 如請求項45至63中任一項所述之方法，其中該胸腺病症與重症肌無力（MG）、純紅血球發育不全及低γ球蛋白血症相關。
75. 一種用於在人類受試者中提供免疫能力之方法，其改良包含以下步驟：將一供體胸腺組織切片在一胸腺器官培養基中預處理約6天至約21天之時段；其中用於該供體胸腺組織之該預處理方案包含在該胸腺器官培養基中無菌處理該供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；及偵測在該預處理方案之時程期間該胸腺器官培養基中至少一種標記物之含量，該至少一種標記物係選自以下標記物：L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1；及將該部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片植入該人類受試者中。
76. 如請求項75所述之方法，其中該至少一種標記物係選自L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中若該標記物為L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7或IL-1，則含量降低，或若該標記物為CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，則含量增加；及將該部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片植入該人類受試者中。
77. 一種用於在經歷實體器官移植之人類受試者中提供免疫能力之方法，該方法包含以下步驟：移除該人類受試者之胸腺；自匹配該實體器官中之HLA-I類及HLA-II類對偶基因之供體獲得胸腺組織；將該供體胸腺切片；將該供體胸腺組織切片在一胸腺器官培養基中預處理約6天至約21天之時段；其中用於該供體胸腺組織之該預處理方案包含在該胸腺器官培養基中無菌處理該供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；偵測在該預處理方案之時程期間該胸腺器官培養基中至少一種標記物之含量，該至少一種標記物係選自標記物L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1；植入該實體器官；及將該部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片植入該人類受試者中。
78. 如請求項77所述之方法，其中該至少一種標記物係選自L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中若該標記物為L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7或IL-1，則含量降低，或若該標記物為CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，則含量增加；植入該實體器官；及將該部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片植入該人類受試者中。
79. 一種用於在經歷實體器官移植之人類受試者中提供免疫能力之方法，該方法包含以下步驟：移除該人類受試者之胸腺；自匹配該實體器官中之HLA-I類及HLA-II類對偶基因之供體獲得胸腺組織；將該供體胸腺切片；將該供體胸腺組織切片在一胸腺器官培養基中預處理約6天至約21天之時段；其中用於該供體胸腺組織之該預處理方案包含在該胸腺器官培養基中無菌處理該供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；偵測在該預處理方案之時程期間該胸腺器官培養基中至少一種標記物之含量，該至少一種標記物係選自標記物L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1；植入該實體器官；及將該部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片植入該人類受試者中。
80. 如請求項79所述之方法，其中該至少一種標記物係選自L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中若該標記物為L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7或IL-1，則含量降低，或若該標記物為CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，則含量增加；植入該實體器官；及將該部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片植入該人類受試者中。
81. 一種促進需要實體器官移植之接受者中獲自已故供體之同種異體實體器官移植的供體特異性耐受之方法，該方法包含以下步驟： （a）移除該接受者之胸腺； （b）用包含一或多種免疫抑制劑之誘導免疫抑制方案治療該接受者以耗乏該接受者之T細胞及/或抑制該接受者之T細胞排斥所移植之實體器官； （c）提供來自已故供體之適合實體人類器官及胸腺； （d）將該實體人類器官移植至該接受者中； （e）用一維持免疫抑制方案治療該接受者； （f）提供一經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其中該經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在胸腺器官培養基中經歷預處理方案約6天至約21天之時段以產生經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物切片；另其中用於該供體胸腺組織之該預處理方案包含在該胸腺器官培養基中無菌處理該供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；偵測在該預處理方案之時程期間該胸腺器官培養基中至少一種標記物之含量，該至少一種標記物係選自該等標記物L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1；及 （g）在預處理方案長至21天之後將該經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物植入該接受者中，其中胸腺組織切片之劑量為約1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織表面積/接受者體表面積，且另其中所植入之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在該接受者中誘導胸腺生成及耐受性。
82. 如請求項81所述之方法，其中該至少一種標記物係選自該胸腺器官培養基中之L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中若該標記物為L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7或IL-1，則該胸腺器官培養基中該標記物之含量降低，或若該標記物為CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，則含量增加；及 （g）在預處理方案長至21天之後將該經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物植入該接受者中，其中胸腺組織切片之劑量為約1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織表面積/接受者體表面積，且另其中所植入之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在該接受者中誘導胸腺生成及耐受性。
83. 一種促進需要實體器官移植之接受者中獲自活人類供體之同種異體實體器官移植的供體特異性耐受之方法，該方法包含以下步驟： （a）移除該接受者之胸腺； （b）用包含一或多種免疫抑制劑之誘導免疫抑制方案治療該接受者以耗乏該接受者之T細胞及/或抑制該接受者之T細胞排斥所移植之實體器官； （c）提供來自活人類供體之適合實體器官； （d）將該實體器官移植至該接受者中； （e）用一維持免疫抑制方案治療該接受者； （f）提供保持在冷凍保存之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物庫中之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；其中該冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物係由來自胸腺供體之胸腺組織處理所得，該胸腺組織取自表現HLA-I類及HLA-II類對偶基因匹配但不存在於該實體器官移植體中之HLA對偶基因之接受者；其中使該供體胸腺組織經歷一預處理方案約6天至約21天之時段；另其中用於該供體胸腺組織之該預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理該供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之胸腺組織切片；偵測在該預處理方案之時程期間該胸腺器官培養基中至少一種標記物之含量，該至少一種標記物係選自該胸腺器官培養基中之該等標記物L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1；其中該胸腺器官培養基中該標記物之含量根據圖7中之該標記物的含量而增加或降低； （g）解凍該冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，及 （h）將解凍之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物植入該接受者中，其中該冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之劑量為約1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織表面積/接受者體表面積，且另其中所植入之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在該接受者中誘導胸腺生成及耐受性。
84. 如請求項83所述之方法，其中該至少一種標記物係選自該胸腺器官培養基中之L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中若該標記物為L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7或IL-1，則該胸腺器官培養基中該標記物之含量降低，或若該標記物為CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，則含量增加； （g）解凍該冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，及 （h）將解凍之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物植入該接受者中，其中該冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之劑量為約1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織表面積/接受者體表面積，且另其中所植入之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在該接受者中誘導胸腺生成及耐受性。
85. 如請求項83或84所述之方法，其中HLA匹配允許第二區域中之該等對偶基因之胺基酸序列的微小變化。
86. 根據請求項83或84所述之方法，其中HLA匹配允許第二區域中之HLA-DP對偶基因的錯配。
87. 如請求項83或84所述之方法，其中將約一半的經解凍之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物移植至該接受者中且剩餘部分經冷凍保存以供將來使用。
88. 如請求項83或84所述之方法，其中步驟（h）在移植該實體器官之後約一個月或更長時間進行。
89. 一種用於促進需要實體器官移植之人類接受者中獲自已故人類供體之同種異體實體器官移植的供體特異性耐受之方法，該方法包含以下步驟： （a）移除該接受者之胸腺； （b）用包含一或多種免疫抑制劑之誘導免疫抑制方案治療該接受者以耗乏該接受者之T細胞及/或抑制該接受者之T細胞排斥所移植之實體器官； （c）提供來自活人類供體之適合實體器官； （d）將該實體器官移植至該接受者中； （e）用維持免疫抑制方案治療該接受者； （f）提供保持在冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物庫中之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；其中該冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物係由來自胸腺供體之胸腺組織處理所得，該胸腺組織表現與該接受者中之HLA對偶基因匹配但不存在於該實體器官移植體中之HLA對偶基因；其中使該供體胸腺組織經歷預處理方案約6天至約21天之時段；另其中用於該供體胸腺組織之該預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理該供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之胸腺組織切片，偵測在該預處理方案之時程期間該胸腺器官培養基中至少一種標記物之含量，該至少一種標記物選自該等標記物L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1；其中該胸腺器官培養基中該標記物之含量根據圖56中之含量而增加或降低； （g）解凍該冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；及 （h）將解凍之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物植入該接受者中，其中該冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之劑量為約1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織表面積/接受者體表面積，且另其中所植入之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在該接受者中誘導胸腺生成及耐受性。
90. 如請求項89所述之方法，其中該至少一種標記物係選自該胸腺器官培養基中之L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11；其中若該標記物為L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7或IL-1，則該胸腺器官培養基中該標記物之含量降低，或若該標記物為CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，則含量增加； （g）解凍該冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物；及 （h）將解凍之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物植入該接受者中，其中該冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物之劑量為約1,000 - 22,000 mm ²之以m ²為單位的胸腺組織表面積/接受者體表面積，且另其中所植入之經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物在該接受者中誘導胸腺生成及耐受性。
91. 一種冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其藉由包含以下步驟之方法製備： （a）自一供體獲得適合之胸腺組織； （b）對HLA對偶基因進行分型：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB 1、HLA-DQB 1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DPB1、HLA-DPA1； （c）使該胸腺組織經歷一預處理方案約6天至約21天之時段；其中用於該供體胸腺組織之該預處理方案包含在胸腺器官培養基中無菌處理該供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片； （d）偵測在該預處理方案之時程期間該胸腺器官培養基中至少一種標記物之含量，該至少一種標記物選自該等標記物L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1；其中該胸腺器官培養基中該標記物之含量根據圖7中之含量而增加或降低； （e）取回該部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片作為經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物； （f）將該經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物冷凍保存在液氮中；及 （g）將液氮中之該冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物保持在冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物庫中。
92. 如請求項91所述之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其中該至少一種標記物係選自L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7或IL-1，若該標記物為CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11，則含量增加； （e）取回該部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片作為經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物； （f）將該經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物冷凍保存在液氮中；及 （g）將液氮中之該冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物保持在冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物庫中。
93. 如請求項77至89中任一項所述之方法，其中該實體器官移植為心臟移植、腎臟移植、肝臟移植、肺移植、心臟/肺移植、胰臟移植、腸移植、胃移植、腹壁移植、顱面移植、頭皮移植、陰莖移植、子宮移植、單側或雙側上肢移植、單側血管化複合同種異體移植或其組合。
94. 如請求項93所述之方法，其中該實體器官移植為心臟移植。
95. 如請求項93所述之方法，其中該心臟移植為小兒心臟移植。
96. 如請求項93所述之方法，其中該心臟移植為成人心臟移植。
97. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該預處理方案為5天。
98. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該預處理方案為6天。
99. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該預處理方案為7天。
100. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該預處理方案為8天。
101. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該預處理方案為9天。
102. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該預處理方案為10天。
103. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該預處理方案為11天。
104. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該預處理方案為12天。
105. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該預處理方案為13天。
106. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該預處理方案為14天。
107. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該預處理方案為15天。
108. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該預處理方案為16天。
109. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該預處理方案為17天。
110. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該預處理方案為18天。
111. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該預處理方案為19天。
112. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該預處理方案為20天。
113. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該預處理方案為21天。
114. 一種適用於植入人體內之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其包含以下步驟： （a）   自一人類供體獲得適合之胸腺組織； （b）   使該胸腺組織經歷一預處理方案約6天至約21天之時段；其中用於該供體胸腺組織之該預處理方案包含在一胸腺器官培養基中無菌處理該供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；其中該胸腺器官培養基中L-選擇素及/或M-CSF及/或半乳糖凝集素-7及/或IL-16之含量在該預處理方案之時程期間降低；另其中該胸腺器官培養基中CCL21及/或CXCL12及/或CXCL16及/或CCL11之含量在該預處理方案之時程期間增加； （c）   採集該部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片作為經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物； （d）   將該經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物冷凍保存在液氮中；及 （e）   將液氮中之該冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物保持在冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物庫中。
115. 一種適用於植入人體內之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其包含以下步驟： （a）   自一人類供體獲得適合之胸腺組織； （b）   使該胸腺組織經歷預處理方案約6天至約21天之時段；其中用於該供體胸腺組織之該預處理方案包含在一胸腺器官培養基中無菌處理該供體胸腺組織以產生部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片；其中該胸腺器官培養基中L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1之含量在該預處理方案之時程期間根據圖56中之含量而增加或降低； （c）   採集該部分T細胞耗乏之供體胸腺組織切片作為經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物； （d）   將該經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物冷凍保存在液氮中；及 （e）   將液氮中之該冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物保持在冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物庫中。
116. 如請求項114或115所述之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其中該胸腺器官培養基中CCL21之含量在該預處理方案之時程期間增加。
117. 如請求項114至116所述之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其中該胸腺器官培養基中L-選擇素之含量在該預處理方案之時程期間降低。
118. 如請求項114至117所述之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其中該胸腺器官培養基中M-CSF、半乳糖凝集素-7及IL-16中之一或多者的含量在該預處理方案之時程期間降低。
119. 如請求項114至118所述之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其中該胸腺器官培養基中CXCL12、CXCL16及CCL11中之一或多者的含量在該預處理方案之時程期間增加。
120. 如前述請求項114至119中任一項所述之冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物，其更包含以下步驟：判定在該預處理方案之約6天至約21天期間在該供體胸腺組織切片中對分散於整個該供體胸腺組織切片中之角蛋白AE1/AE3呈陽性的區域、至少一種胸腺小體之存在、分散於整個該供體胸腺組織切片中之CK14染色及完整細胞核之存在。
121. 一種用於執行如前述請求項中任一項所述之方法的套組，其與使用說明書一起用於判定經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物是否適用於植入人體內。
122. 一種用於執行如前述請求項中任一項所述之方法的套組，其中該套組包含特異性結合以下標記物之至少一種抗體：L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/（Ckin）、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1。
123. 如請求項122所述之套組，其中該抗體特異性結合至L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11。
124. 一種用於與使用說明書一起判定根據請求項115至120中任一項培養的冷凍保存的經同種異體培養之出生後胸腺組織衍生產物是否適用於植入人體內的套組。
125. 如請求項110所述之套組，其中該套組包含特異性結合以下標記物之至少一種抗體：L-選擇素、CXCL16、M-CSF、CCL21/6Ckine、半乳糖凝集素-7、MIF、GDNF、CTACK、MIP-3b、ICAM-1、PECAM-1、IL-2Rg、SCF R、IL-16、GDF-15、PDGF-AA、CXCL12/SDFF-1a、MIP-3a、IL-2Ra、ICAM-3、LIGHT、IGFBP-1、BCMA、EGF R、uPAR、MIP-1b、PIGF、PF4、CCL11/伊紅趨素、HVEM、IGFBP-6、IL-6R、IL-12p40、RANTES、MICA、GCP-2、OPN、ALCAM、NRG1-B1、CEACAM-1、IL-1b、DKK-1及ANG-1。
126. 如請求項125所述之套組，其中該標記物係選自L-選擇素、M-CSF、半乳糖凝集素-7、IL-16、CCL21、CXCL12、CXCL16或CCL11。

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