CN113786474B - 含有干细胞的卵巢抗衰的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有干细胞的卵巢抗衰的药物组合物。本发明通过分离制备获得了卵巢干细胞，同时从何首乌中分离得到了能够具有抗衰老作用的活性肽，将所述干细胞与活性肽一起用于卵巢衰老模型的治疗后发现能够有效的促进卵泡的分泌以及促进E2分泌，具有较好的抗卵巢衰老的效果。

Description

含有干细胞的卵巢抗衰的药物组合物
技术领域
本发明涉及生物领域，更具体的涉及含有干细胞的卵巢抗衰的药物组合物。
背景技术
女性从胎儿到老年是渐进的生理过程，卵巢作为性腺器官，行使着周期性排卵与分泌性激素的重要生理功能。随着年龄增长，卵巢功能逐渐衰退，生殖器官亦开始萎缩、衰老，并影响身体其他系统的功能。卵巢衰老是一个多因素相互作用、逐渐累积的复杂的生物过程。随着年龄渐长，卵泡不断消耗，卵泡数目下降是卵巢衰老的主因；而机体内代谢产物堆积，卵巢微环境改变，剩余卵泡质量的降低亦与衰老息息相关。卵巢衰老以绝经为标志，40岁以前绝经称为卵巢早衰，即病理性卵巢衰老。
干细胞是一类早期未分化细胞，具有自我更新、自我复制、无限增殖及多向分化潜能等特点，从来源角度可分为成体干细胞和胚胎干细胞。成体干细胞广泛存在于人体全身组织，易分离培养、扩增，免疫原性低，具有强大的迁移、免疫调节能力，对于修复组织缺陷及组织工程中作为种子细胞等方面都具有独特的优势。因此，MSCs已在细胞治疗、基因治疗及组织工程等领域被广泛地研究与应用。
MSCs不但对免疫损伤型卵巢早衰具有一定的修复作用，对化学损伤的卵巢早衰也具有一定程度的修复作用。有研究者用10％的双氧水损伤卵巢建立卵巢早衰小鼠模型，对模型小鼠和对照小鼠分别腹腔移植MSCs及输注等量的磷酸盐缓冲液，通过观察外观和病理切片的方法研究MSCs是否对化学损伤卵巢有修复作用，发现移植MSCs组较对照组卵巢功能恢复更快，同时各级生长的卵泡数量也明显多于对照组。有研究者还使用局部注射方法将MSCs悬液注入去氧乙烯基环己烯所致的卵巢早衰模型小鼠双侧卵巢，观察MSCs分布及探讨卵巢早衰治疗的可行性；该研究观察了小鼠动情周期的变化、FSH与促黄体生成素的比值水平及移植后MSCs的分布等，结果显示，注入卵巢的MSCs主要分布在卵巢间质区，少量分布在卵巢泡膜细胞区；MSCs组动情周期较对照组缩短，FSH/促黄体生成素水平较对照组低，差异有统计学意义；即MSCs可以改善小鼠卵巢内分泌功能，并长时间存在于卵巢组织，一方面可能是MSCs分泌的细胞因子抑制了卵巢细胞的凋亡，并促进分泌类固醇激素细胞，另一方面可能是部分MSCs分化为卵巢细胞，替代受损细胞并促进组织修复。综上所述，MSCs不仅对人为建立的卵巢早衰有修复作用，还能修复环境毒素对卵巢的损伤。
除此之外，正常生理状态下机体中存在的自由基与抗氧化系统相互平衡，一旦平衡打破，机体对自由基清除能力降低，造成过量堆积，即可出现氧化应激反应。新近研究表明，随着年龄增长，卵巢OS增加，抗OS相关基因表达水平下降。且卵巢中卵母细胞成熟与排卵、卵巢激素分泌、黄体形成及溶解过程都受到自由基的调节与影响。在正常女性月经周期中，存在各类OS的生物标记；而在卵泡发育的各个阶段都可以检测到抗氧化物超氧化物歧化酶(SOD)的表达。并且有研究表明，在不同发育阶段窦状卵泡中SOD家族表达谱有所不同。而国内学者的研究则发现，传统中药天年饮可明显提高衰老大鼠卵巢组织中的SOD进而发挥其抗衰老作用。同时，ROS对卵母细胞的损伤作用也不容忽视，直接影响卵母细胞的质量，导致女性随着年龄增长生产先天异常儿比率增加。
但是目前采用干细胞与抗氧化药物一起用于治疗卵巢早衰的药物还不多，市场存在迫切的需求。
发明内容
本发明根据现有技术的需求，提供一种预防和或治疗卵巢早衰的药盒。
一方面，本发明提供的预防和或治疗卵巢早衰的药盒，其中含有卵巢干细胞和LC-5多肽。
进一步的，所述卵巢干细胞采用如下的方法分离培养制备得到：取离体的卵巢组织，PBS冲洗3遍，随后切成大约0.1*0.1cm3的组织块，将3倍于组织体积的胶原酶加入皿中，吹打并转移至离心管，放入37℃培养箱。消化约30min，每隔10min充分吹打，直至组织块溶解，消化液变浑浊。加入DMEM+10％胎牛血清+1％青霉素、链霉素充分混匀，以1500r/min离心5min，弃上清，加入适量PBS重悬细胞3次，用200目滤网过滤，离心后加入5ml干细胞培养液于培养皿，37℃、O.5％CO2，培养箱培养，其中干细胞培养液组成为1000mL：150mLKnockOut血清替代物+10mL HyClone非必须氨基酸+7g谷氨酰胺+1mLβ-巯基乙醇+4mgβ-FGF+10mL青霉素-链霉素溶液100X+2mg辅酶Q10，DMEM补足到1000mL；隔天换液；待皿中细胞长到80％汇合度时即消化传代。弃除培养液，加入PBS洗3次，加入O.25％胰酶覆盖皿底，置于37℃培养箱中待大部分贴壁细胞变圆变亮，加入等量含10％胎牛血清的DMEM+10％胎牛血清+1％青霉素、链霉素中止消化，用吸管反复轻柔吹打皿底，使呈单细胞悬液。以1500r/min离心5min，弃上清，加入适量PBS重悬细胞3次，加入前述的干细胞培养液，按1：3的比例传代到P3代，收获所述集落细胞即为卵巢干细胞。
进一步的，所述LC-5多肽的序列为LC-5：GLHCESMNEKQAAYKPLPQQ，该多肽是通过从何首乌中通过水提、酶解后通过层析分离制备得到。
根据本发明的所有前述方面，LC-5多肽共享FQGIVQLPYWPSFAMW的序列至少65％的氨基酸序列，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，或74％，优选至少75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％或84％，甚至更优选与(i)的肽在其整个序列上具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％或94％，最优选至少95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。
本发明的多肽还可以包括结构修饰，所述结构修饰可以例如增强多肽的治疗功效或帮助临床医生监测使用所述多肽的治疗过程。可以在多肽翻译或化学合成期间或之后进行结构修饰。例如，多肽可以被酰胺化。可选地，或者另外，多肽可以包括可检测的标记。只要多肽保持足够的生物活性以保持有用，可检测标记的形式和位置都可以变化。所述标记可以是例如光亲和配体，放射性同位素，或荧光或化学发光化合物。
除了本文所述的多肽之外，本发明的特征在于包含这些多肽的药物制剂，编码它们的核酸，表达它们的宿主细胞，以及包含一种或多种这些组合物的试剂盒。所述核酸，含有它们的载体和宿主细胞也可以配制成药物制剂。
编码给定多肽的核酸的构建方法是本领域公知的。编码片段或其生物学活性变体的核酸包括密码子优化的那些。为了表达，核酸可以容易地掺入载体(例如质粒或病毒载体)中，并且这些载体包括在本发明中。所述核酸可操作地连接到适于在原核或真核系统中使用的调节区，所述原核或真核系统中的许多是本领域已知的并且可用于产生本文所述的多肽。在特定的实施方案中，调控区可以是例如启动子或增强子。有用的启动子包括细胞类型特异性启动子，组织特异性启动子，组成型活性启动子和广泛表达的启动子。如上所述，本发明还包括宿主细胞，所述宿主细胞包括表达本发明多肽的载体，并且这些细胞可以是原核细胞(例如细菌)或真核细胞(例如哺乳动物)。
在一些方面，本发明所述的药盒在对受试者口服，吸入，鼻内给药，局部给药，静脉内给药，皮下给药，关节内给药，肌肉内给药，腹膜内给药，滑膜内给药，阴道给药，直肠给药，肺部给药，眼部给药，颊部给药，舌下给药，鞘内给药或其任意组合后显示出特征。
本发明的多肽，核酸，载体和宿主细胞可以与干细胞一起配制成药物组合物。例如，这些组合物可以配制成用于胃肠外(例如静脉内)给药的无毒制剂。所述药物组合物可以包括一个以上序列的多肽。如上所述，本发明的多肽包含在较长多肽内的多肽，并且这种多聚体，无论是组装成融合蛋白还是偶联物，也可以被配制用于给予患者。可以加入载体和稳定剂以促进药物递送并确保货架期。例如，将多肽包封在合适的递送载体(例如，聚合物微粒，可植入装置，或用于定时，延迟或控制释放的任何结构)中可提高递送效率。
跟进一步的，本发明所述的药盒或者药物组合物还添加药学上可接受的载体。
有益效果
本发明通过分离制备获得了卵巢干细胞，同时从何首乌中分离得到了能够具有抗衰老作用的活性肽，将所述干细胞与活性肽一起用于卵巢衰老模型的治疗后发现能够有效的促进卵泡的分泌以及促进E2分泌，具有较好的抗卵巢衰老的效果。
附图说明
图1细胞存活率结果图
图2 p53和p16蛋白表达量结果图
具体实施方式
下面的详细描述通过举例说明的方式指的是其中可以实施本发明的具体细节和实施例。这些实施例被充分详细地描述，以使本领域技术人员能够实施本发明。在不脱离本发明的范围的情况下，可以使用其它实施例，并且可以进行结构上和逻辑上的改变。由于一些实施例可以与一个或多个其它实施例组合以形成新的实施例，所以各个实施例不一定是相互排斥的。
实施例1卵巢干细胞的分离制备
取离体的卵巢组织，PBS冲洗3遍，随后切成大约0.1*0.1cm3的组织块，将3倍于组织体积的胶原酶加入皿中，吹打并转移至离心管，放入37℃培养箱。消化约30min，每隔10min充分吹打，直至组织块溶解，消化液变浑浊。加入DMEM+10％胎牛血清+1％青霉素、链霉素充分混匀，以1500r/min离心5min，弃上清，加入适量PBS重悬细胞3次，用200目滤网过滤，离心后加入5ml干细胞培养液于培养皿，37℃、O.5％CO2，培养箱培养，其中干细胞培养液组成为(1000mL)：150mL KnockOut血清替代物+10mL HyClone非必须氨基酸(货号：SH30238.01)+7g谷氨酰胺+1mLβ-巯基乙醇+4mgβ-FGF+10mL青霉素-链霉素溶液(100X)+2mg辅酶Q10，DMEM补足到1000mL。隔天换液。
待皿中细胞长到80％汇合度时即消化传代。弃除培养液，加入PBS洗3次，加入O.25％胰酶覆盖皿底，置于37℃培养箱中待大部分贴壁细胞变圆变亮，加入等量含10％胎牛血清的DMEM+10％胎牛血清+1％青霉素、链霉素中止消化，用吸管反复轻柔吹打皿底，使呈单细胞悬液。以1500r/min离心5min，弃上清，加入适量PBS重悬细胞3次，加入前述的干细胞培养液，按1：3的比例传代到P3代，收获所述集落细胞即为卵巢干细胞。
取收集的卵巢干细胞，加入碱性磷酸酶，染色30min后集落开始着色，35min弃掉培养液终止染色，加入PBS液，镜下观察细胞团为紫蓝色，由于碱性磷酸酶是作为干细胞的鉴定标志物，这说明所述细胞是干细胞。
此外，免疫荧光法检测0ct-4表达情况(1)将无菌盖玻片置入培养皿中进行细胞爬片培养，待细胞占爬片80％左右，用PBS洗5min。(2)4％多聚甲醛室温固定20min，PBS洗3次，每次5min。(3)O.5％PBST破膜5min，PBS洗3次，每次5min。(4)5％羊血清37℃封闭30min，PBS洗2次，每次5min。分别加入兔抗人0ct-4抗体IgG及PBS(作为空白对照)，湿盒内4℃孵育过夜。(5)PBS洗3次，每次10min，加入山羊抗兔IgG，室温避光孵育60min。(6)PBS洗3次，每次5min，用含DAPI的封片剂封片。(7)荧光显微镜下观察并拍照，细胞核呈红色的为阳性结果，细胞核不着色的是阴性结果。结果显示，培养收集的集落细胞0ct-4染色核呈红色，这也说明分离培养的细胞是干细胞。
实施例2抗卵巢衰老多肽的制备
取何首乌5g，加5倍蒸馏水浸泡2h，文火煮沸30min，滤过。药渣再加3倍量的水继续煎煮20min，50w功率超声破碎条件超声10min后，滤过。两次滤液混和，8000r/min离心10min，取上清液。在37℃条件下加入0.5％的复合蛋白酶进行酶解1h后终止酶解。依次上柱CM—Sepharose Fast Flow、Sephadex G-50层析，根据然后反相高效液相色谱层析，得到不同多肽组分，根据多肽抑制P53、Rb以及P16的特性，筛选获得6个具有下调P53、Rb以及P16基因表达特性的多肽，采用MALDI-ToFMS测定其中效果较好的2个多肽，其氨基酸序列分别是LC-2：FQGIVQLPYWPSFAMW，LC-5：GLHCESMNEKQAAYKPLPQQ。
实施例3多肽的抗衰老细胞实验
IMR-90(人胚肺成纤维细胞)(货号：CL-0538，武汉普诺赛生命科技有限公司)用含10％胎牛血清的DMEM完全培养基培养细胞生长至90％融合时，按照1：4进行传代培养。LC-5多肽处理组及对照组采用传自55代的IMR-90细胞(模拟衰老细胞组)。
LC-5多肽处理组为多肽作用细胞2h后正常培养，每天作用1次，连续作用4次；对照组常规培养细胞不做任何处理。
MTI法测定多肽的最佳促生长浓度：90％融合的单层IMR-90细胞用0.25％胰蛋白酶消化后，调整细胞悬液的密度，接种至96孔板中，每孔接种5x103个，孵育培养24h后弃去上清液，每孔加人100μL的多肽溶液，作用48h后以MTT法测细胞存活率。多肽的给药浓度分别为0、1、10、20、50、100、200、500μg/mL，每组设6个复孔，实验重复三遍。结果如图1所示。
由图1可见，以多肽的浓度为横坐标，细胞存活率(给药组吸光度/对照组吸光度x100％)为纵坐标绘制曲线，随着多肽剂量的增加，细胞存活率先增加后降低，最佳促生长浓度为100μg/mL。
Western blot检测多肽作用后的p53和p16蛋白的表达情况。取上述分组作用48h后的细胞，胰酶消化后离心收集细胞。经RIPA裂解液后，4℃12000r/min离心收集上清液，BCA蛋白定量后，加蛋白上样缓冲液煮沸蛋白，-20℃冻存备用。制备12％的聚丙烯酞胺凝胶，上样量为20μg进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后湿法转膜(PVDF)，用脱脂奶粉封闭2h后。一抗为兔抗人p53,p16(1:1000)及α-actin(1:800)单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物标记的山羊抗兔抗体(l:10000)，加ECL发光液后成像系统进行分析。结果如图2所示。
由图2可见，细胞的衰老可使P3和p16蛋白的表达明显增强；但多肽表现出显著的下调p53和p16蛋白的表达作用。其结果表明，LC-5多肽延缓细胞的衰老，其中P16抑制率达到78.6％左右。
实施例4小鼠卵巢早衰模型实验
将正常动情周期的ICR小鼠随机分为模型组、干细胞移植组、多肽治疗组以及干细胞联合多肽治疗组和空白对照组，每组30只。模型组、干细胞移植组、多肽治疗组以及干细胞联合多肽治疗组一次性腹腔注射环磷酰胺溶液(120mg·kg)和白消安溶液(12mg/kg)0.1mL，每日用棉签轻取阴道分泌物涂片，巴氏染色，观察阴道脱落细胞变化，当连续10d观测到持续动情间期，视为卵巢早衰建模成功。干细胞移植组于建模第14天经尾静脉注射0.1mL实施例1的卵巢干细胞悬液(1x108个/mL)，每4d重复1次，共5次。多肽组于建模第14天经尾静脉注射LC-5多肽(10mg/kg)0.1mL，每4d重复1次，共5次。干细胞联合多肽治疗组于建模第14天经尾静脉注射0.1mL实施例1的卵巢干细胞悬液(1x108个/mL)和LC-5多肽(10mg/kg)0.1mL，每4d重复1次，共5次。建模组和空白对照组经尾静脉每次注射等量生理盐水。
生殖激素测定：剪尾法获取各组小鼠血清，化学发光法检测小鼠卵泡刺激素(FSH)和雌二醇(E2)水平，所有血清均用同一批试剂检测。结果如表1所示。
表1各组小鼠FSH和E2的比较
组别 FSH/(mIU/mL) E<sub>2</sub>/(pg/mL)
模型组 4.76±0.30 33.79±2.55
空白对照组 2.84±0.20 43.79±3.40
干细胞移植组 3.52±0.25 38.49±2.74
多肽治疗组 3.75±0.19 36.67±2.08
干细胞联合多肽治疗组 2.90±0.21 43.12±2.96
从表1的结果可以看出，相对于对照，小鼠模型组的E2分泌减少，FSH分泌增加，表明小鼠卵巢功能衰竭，经过多肽或者干细胞治疗后，小鼠E2分泌有所增加，FSH分泌减少，与正常大鼠激素分泌水平接近，特别是干细胞联合多肽治疗组提高效果明显E2达到了43.12±2.96pg/mL，说明二者联合可以有效的改善卵巢功能。
将取血的小鼠各组颈椎脱臼法处死，取双侧卵巢组织，冰冻切片荧光显微镜(x400)下观察卵巢组织学变化。结果如表2所示。
表2各组卵泡数比较
组别 总卵泡数
模型组 14.79±2.02
空白对照组 41.40±4.13
干细胞移植组 30.52±2.71
多肽治疗组 30.17±2.42
干细胞联合多肽治疗组 40.78±2.98
从表2的结果可以看出，模型组的总卵泡数明显比空白对照组的总卵泡数要少，但是模型组经过各组治疗后，总卵泡数得到显著的提高。其中，采用干细胞联合多肽组一起治疗后，总卵泡数达到了40.78±2.98个，与正常小鼠的卵泡数量基本相近，表明具有较好的恢复卵巢功能的效果。
应当理解，以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.卵巢干细胞和LC-5多肽在制备治疗卵巢早衰的药盒中的用途，其特征在于：所述LC-5多肽的序列如GLHCESMNEKQAAYKPLPQQ所示。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述卵巢干细胞采用如下的方法分离培养制备得到：取离体的卵巢组织，PBS冲洗3遍，随后切成大约0.1*0.1cm3的组织块，将3倍于组织体积的胶原酶加入皿中，吹打并转移至离心管，放入37℃ 培养箱；消化约30min， 每隔10min充分吹打，直至组织块溶解，消化液变浑浊；加入DMEM+10％胎牛血清+1％青霉素、链霉素充分混匀，以1500r/min离心5min，弃上清，加入适量PBS重悬细胞3次，用200目滤网过滤，离心后加入5ml 干细胞培养液于培养皿，37℃、O.5％CO2，培养箱培养，其中干细胞培养液组成为1000mL：150mL KnockOut血清替代物+10mL HyClone非必须氨基酸+7g谷氨酰胺+1mLβ-巯基乙醇+4mg β-FGF+10mL青霉素-链霉素溶液100X+2mg辅酶Q10，DMEM补足到1000mL；隔天换液；待皿中细胞长到80％汇合度时即消化传代；弃除培养液，加入PBS洗3次，加入O.25％胰酶覆盖皿底，置于37℃培养箱中待大部分贴壁细胞变圆变亮，加入等量含10％胎牛血清的DMEM+10％胎牛血清+1％青霉素、链霉素中止消化，用吸管反复轻柔吹打皿底，使呈单细胞悬液；以1500r／min离心5min，弃上清，加入适量PBS重悬细胞3次，加入前述的干细胞培养液，按1：3的比例传代到P3代，收获集落细胞即为卵巢干细胞。
3.如权利要求1-2任一项所述的用途，其特征在于所述药盒中还含有药学上可接受的载体。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于载体包括赋形剂。
5.如权利要求1-2或4所述的用途，其特征在于所述药盒还与治疗卵巢早衰的药物一起使用。
6.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述药盒还与治疗卵巢早衰的药物一起使用。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009012357A2 (en) * 2007-07-17 2009-01-22 The General Hospital Corporation Methods to identify and enrich for populations of ovarian cancer stem cells and somatic ovarian stem cells and uses thereof
CN112569261A (zh) * 2020-10-16 2021-03-30 中科细胞科技(广州)有限公司 一种改善卵巢功能的组合物及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007008377A1 (en) * 2005-07-06 2007-01-18 University Of Tennessee Research Foundation Oocytes derived from ovarian culture initially containing no oocytes

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009012357A2 (en) * 2007-07-17 2009-01-22 The General Hospital Corporation Methods to identify and enrich for populations of ovarian cancer stem cells and somatic ovarian stem cells and uses thereof
CN112569261A (zh) * 2020-10-16 2021-03-30 中科细胞科技(广州)有限公司 一种改善卵巢功能的组合物及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
人卵巢干细胞体外培养方法的初步探讨;赵琰誉等;《中国优生与遗传杂志》;20150425;第23卷(第04期);108-110 *
卵巢干细胞巢对卵巢生殖衰老影响的研究进展;叶海峰等;《重庆医学》;20180120;第47卷(第02期);265-268 *

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