CN113564109A - 一种经血间充质干细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种经血间充质干细胞的制备方法，本发明细胞来源是从女性月经血中分离、培养出的新型成体干细胞，细胞来源丰富，分离和培养过程安全简单，可以大量的研究和使用,从女性月经血中分离、培养出的干细胞具备间充质干细胞所有的特征，且极易扩增，同时经血间充质干细胞可以被诱导分化为多种组织细胞，包括神经细胞、脂肪细胞、胰岛细胞和卵巢细胞等，还可以被诱导成多功能干细胞，研究价值高,经血间充质干细胞基于自我更新能力强，易于获得，体外培养稳定，而且自体移植可以减少患者的精神和心里压力，在临床应用的前景远超骨髓间充质干细胞,多次传代后，染色体核型无异常变化，表明经血干细胞在临床应用领域的安全性。

Description

一种经血间充质干细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及干细胞制备技术领域，尤其涉及一种经血间充质干细胞的制备方法。

背景技术

经血干细胞来源于女性月经期间随经血脱落的子宫内膜组织，属于成体干细胞中的一类，并有着接近胚胎干细胞的多向分化潜能，在骨损伤、脊髓损伤、神经损伤、肝病、糖尿病、血管疾病等重大疾病上有着广阔的临床应用前景。研究发现，经血来源的干细胞较之胚胎、骨髓、厮血等干细胞有着无可比拟的优势如:采集方法简单安全，不具有侵入性，完全可自行采集，对供者不会造成伤害；分离的干细胞数量是骨髓来源的30倍，可为疾病治疗提供丰富的干细胞来源；体外增殖能力强，一般24-36小时扩增一倍，可传代高达50次；增殖能力是骨髓干细胞的10多倍，能在短时间内提供治疗所需的足够细胞；分化潜能性大，除具备间充质干细胞一般特征外，还能表达〇ct-4、SSEA-4和c-Kit/CD117等胚胎干细胞表面标志物，表明经血来源干细胞在再生医学上的巨大潜能；多次传代后，染色体核型无异常变化，动物实验显示无致瘤性，表明经血来源干细胞在临床应用领域的安全性。

虽然不同来源的MSCs的抗癌作用的研究已被广泛报道，但很少有人关注人经血间充质干细胞。人经血间充质干细胞易于获取分离及扩增，可供异体移植而无免疫排斥风险等优点，此外，经血干细胞来源广泛，理论上绝经前的大部分健康女性都可作为潜在的供者，且不存在伦理道德争议。目前这种经血间充质干细胞不仅在基因治疗和组织工程中得到广泛应用，而且在临床各种治疗中涉及各个器官、系统的疾病，尤其是对卵巢和子宫的一些疾病。由于经血间充质干细胞是近几年才开始大规模发展，与之配套的培养体系和制备体系还不成熟，在制备培养中可能会有潜在的病毒和支原体污染，对以后的临床应用构成威胁。

发明内容

本发明的目的是解决上述经血间充质干细胞培养体系和制备体系还不成熟，在制备培养中可能会有潜在的病毒和支原体污染，对以后的临床应用构成威胁的问题而提供的一种经血间充质干细胞的制备方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种经血间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)收集健康的月经期妇女的月经血样，将血液收集到含抗生素保存液的经血采集管中；

2)在采集管中加入EDTA或肝素抗凝，再用PBS稀释血液；

3)在离心管中加入适量的Ficoll-Plus分离液，再将稀释后的血液平铺到分离液液面上；

4)在室温下，水平转子离心转速为1000rpm，离心20min；

5)离心后，细胞层在血浆层和分离层之间，移除最上层的血浆层，收集透明分离液层上方的细胞层；

6)收集的细胞层到洁净的离心管中，再加入10ml的PBS洗涤细胞，离心转速为300rpm，离心10min；

7)第二次离心后移除上清，细胞沉淀用培养液重悬，接种与细胞培养基，置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养；

8)当细胞长满，去除培养液，用PBS进行洗涤，在加入0.25％的胰蛋白酶置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养，当细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入培养液终止消化，反复吹打瓶壁形成细胞悬液，将细胞悬液吸入离心管，离心，移除上清；沉淀用完全培养液调整细胞浓度，接种于细胞培养皿中，置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养。

优选的，所述Ficoll-Plus分离液是一种无毒、低内毒素水平的密度梯度分离液，所述Ficoll-Plus分离液的密度为1.077±0.001g/ml。

优选的，加入适量的Ficoll-Plus分离液时，当稀释后血液小于3ml时，加入3ml的Ficoll-Plus分离液；大于等于3ml时，加入等体积Ficoll-Plus分离液，且二者的总体积不能超过离心管的三分之二。

优选的，所述Ficoll-Plus分离液使用时始终保持室温18℃～25℃。

优选的，收集健康的月经期妇女的月经血样为新鲜的血液，为保持细胞活性，不能冷冻和冷藏，且血样采血在2h以内。

优选的，稀释后的血液平铺到分离液液面上，注意保持两液面的界面清晰，可以使用吸管吸取血液，在小心的平铺在分离液上。

优选的，所述PBS稀释血液或者洗涤细胞时，不能使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养液。

优选的，所述离心管不使用塑料制品，避免细胞挂壁，影响分离效果。

优选的，所述培养液为含有10％人体血清或胎牛血清的DMEM-F12培养液，且培养液无菌。

优选的，所述DMEM-F12培养液含有200mM的L-谷氨酰胺、100U/ml的青霉素、100ug/ml的链霉素。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明细胞来源是从女性月经血中分离、培养出的新型成体干细胞，细胞来源丰富，分离和培养过程安全简单，可以大量的研究和使用；

2、本发明从女性月经血中分离、培养出的干细胞具备间充质干细胞所有的特征，且极易扩增，同时经血间充质干细胞可以被诱导分化为多种组织细胞，包括神经细胞、脂肪细胞、胰岛细胞和卵巢细胞等，还可以被诱导成多功能干细胞，研究价值高；

3、经血间充质干细胞基于自我更新能力强，易于获得，体外培养稳定，而且自体移植可以减少患者的精神和心里压力，在临床应用的前景远超骨髓间充质干细胞,多次传代后，染色体核型无异常变化，动物实验显示无致瘤性，表明经血干细胞在临床应用领域的安全性。

附图说明

图1为本发明一种经血间充质干细胞的制备方法的流程图。

具体实施方式

现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。附图为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。

11.请参照图1，一种经血间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、收集健康的月经期妇女的月经血样，将血液收集到含抗生素保存液的经血采集管中。收集健康的月经期妇女的月经血样为新鲜的血液，为保持细胞活性，不能冷冻和冷藏，且血样采血在2h以内。收集月经血样时，要在志愿捐赠者知情并同意的情况下使用月经杯收集，并且可以招募不同年龄段的月经期女性，且收集时间最好在月经期的第二天或者第三天。月经杯的血收集到含抗生素的采集管中，并做标号记录。

步骤二、在采集管中加入EDTA或肝素抗凝，再用PBS稀释血液。做好标号记录后加入EDTA或肝素抗凝，避免血液凝结，PBS稀释血液时，不能使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养液。

步骤三、在离心管中加入适量的Ficoll-Plus分离液，再将稀释后的血液平铺到分离液液面上。一般可以取稀释后的血液5ml，分离液5ml。Ficoll-Plus分离液是一种无毒、低内毒素水平的密度梯度分离液，Ficoll-Plus分离液的密度为1.077±0.001g/ml。加入适量的Ficoll-Plus分离液时，当稀释后血液小于3ml时，加入3ml的Ficoll-Plus分离液；大于等于3ml时，加入等体积Ficoll-Plus分离液，且二者的总体积不能超过离心管的三分之二。Ficoll-Plus分离液使用时始终保持室温18℃～25℃。稀释后的血液平铺到分离液液面上，注意保持两液面的界面清晰，可以使用吸管吸取血液，在小心的平铺在分离液上。离心管不使用塑料制品，避免细胞挂壁，影响分离效果。

步骤四、在室温下，水平转子离心转速为1400rpm，离心20min。根据实际血液和分离液的量可以调整离心转速，最高不能超过1600rpm。

步骤五、离心后，细胞层在血浆层和分离层之间，移除最上层的血浆层，收集透明分离液层上方的细胞层。离心后，离心管内有四层，最上层为血浆层，其次为细胞层，再其次为分离液层，最下层为红细胞层，只需要小心收集第二层的细胞层。

步骤六、收集的细胞层到洁净的离心管中，再加入10ml的PBS洗涤细胞，离心转速为300rpm，离心10min；PBS洗涤细胞时，不能使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养液。

步骤七、第二次离心后移除上清，细胞沉淀用培养液重悬，接种与细胞培养基，置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养。移除上清后，对上清液可按照常规方式进行微生物检测和传染疾病病原体安全检测，常见的如HIV、HBV、HCV和梅毒病原体等检测，若结果为阳性，则结束整个经血干细胞的分离培养。细胞沉淀用5ml培养液重悬，加入培养箱后培养约两周，每两天跟黄为新鲜配置的5ml培养液，培养过程中通过显微镜观察。

步骤八、当细胞长满，去除培养液，用PBS进行洗涤，在加入0.25％的胰蛋白酶置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养，当细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入培养液终止消化，反复吹打瓶壁形成细胞悬液，将细胞悬液吸入离心管，离心，移除上清。步骤八的要点是当细胞贴壁长满80-90％，吸除培养液，加入3ml的PBS轻轻摇动培养瓶，洗去残留的培养液，移除PBS后在加入PBS重复两次洗涤操作，在瓶内加入预热至37℃的0.25％的胰蛋白酶2ml，轻摇瓶身，使胰蛋白酶流变所有细胞的表面，在37℃培养箱中培养3min，在显微镜下观察，发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，在加入2ml培养液种植消化。反复吹打瓶壁形成细胞悬液，将细胞悬液吸入离心管，1200rpm离心10min，移除上清。沉淀用完全培养液调整细胞浓度，接种于细胞培养皿中，置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养。就会得到经血间充质干细胞的原代。培养液为含有10％人体血清或胎牛血清的DMEM-F12培养液，且培养液无菌，DMEM-F12培养液含有200mM的L-谷氨酰胺、100U/ml的青霉素、100ug/ml的链霉素。

细胞传代培养时，将上述得到的原代细胞去除培养液，再用不含Ca、Mg离子的PBS洗涤。PBS可以先做好在高压蒸汽灭菌后放入4℃冰箱保存待用。加入2ml胰酶，在5％CO₂、95％湿度、37℃下孵育2min。然后加入2ml经血干细胞的培养液使胰酶失活。轻柔的反复吹打，使贴壁细胞脱落并形成单细胞状态。按照1:3的比例传代，从3ml的细胞悬液中取1ml至新的10cm的培养皿中，在加入6ml的培养液摇均匀。放入到5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养。每3-4天传代细胞一次，操作如上所述。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种经血间充质干细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)收集健康的月经期妇女的月经血样，将血液收集到含抗生素保存液的经血采集管中；

2)在采集管中加入EDTA或肝素抗凝，再用PBS稀释血液；

3)在离心管中加入适量的Ficoll-Plus分离液，再将稀释后的血液平铺到分离液液面上；

4)在室温下，水平转子离心转速为1000rpm，离心20min；

5)离心后，细胞层在血浆层和分离层之间，移除最上层的血浆层，收集透明分离液层上方的细胞层；

6)收集的细胞层到洁净的离心管中，再加入10ml的PBS洗涤细胞，离心转速为300rpm，离心10min；

7)第二次离心后移除上清，细胞沉淀用培养液重悬，接种与细胞培养基，置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养；

8)当细胞长满，去除培养液，用PBS进行洗涤，在加入0.25％的胰蛋白酶置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养，当细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入培养液终止消化，反复吹打瓶壁形成细胞悬液，将细胞悬液吸入离心管，离心，移除上清；沉淀用完全培养液调整细胞浓度，接种于细胞培养皿中，置于5％CO₂、95％湿度、37℃培养箱中培养。

2.根据权利要求1所述的一种经血间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述Ficoll-Plus分离液是一种无毒、低内毒素水平的密度梯度分离液，所述Ficoll-Plus分离液的密度为1.077±0.001g/ml。

3.根据权利要求1所述的一种经血间充质干细胞的制备方法，其特征在于：加入适量的Ficoll-Plus分离液时，当稀释后血液小于3ml时，加入3ml的Ficoll-Plus分离液；大于等于3ml时，加入等体积Ficoll-Plus分离液，且二者的总体积不能超过离心管的三分之二。

4.根据权利要求1所述的一种经血间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述Ficoll-Plus分离液使用时始终保持室温18℃～25℃。

5.根据权利要求1所述的一种经血间充质干细胞的制备方法，其特征在于：收集健康的月经期妇女的月经血样为新鲜的血液，为保持细胞活性，不能冷冻和冷藏，且血样采血在2h以内。

6.根据权利要求1所述的一种经血间充质干细胞的制备方法，其特征在于：稀释后的血液平铺到分离液液面上，注意保持两液面的界面清晰，可以使用吸管吸取血液，在小心的平铺在分离液上。

7.根据权利要求1所述的一种经血间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述PBS稀释血液或者洗涤细胞时，不能使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养液。

8.根据权利要求1所述的一种经血间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述离心管不使用塑料制品，避免细胞挂壁，影响分离效果。

9.根据权利要求1所述的一种经血间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述培养液为含有10％人体血清或胎牛血清的DMEM-F12培养液，且培养液无菌。

10.根据权利要求9所述的一种经血间充质干细胞的制备方法，其特征在于：所述DMEM-F12培养液含有200mM的L-谷氨酰胺、100U/ml的青霉素、100ug/ml的链霉素。

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