CN114990060B - 一种促脐带组织块贴壁的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种促脐带组织块贴壁的方法，属于干细胞技术领域。采用本发明所述的培养瓶预处理方法用于脐带间充质干细胞的培养，促进了脐带组织块的贴壁率，同时对组织内细胞损伤小，可更大范围的保护间充质干细胞的活性，缩短制备时间。本申请所述的制备方法具有操作简便、成本低、重复性好的优点，能够明显促进间充质干细胞的增殖。
Description
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种促脐带组织块贴壁的方法。
背景技术
间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，在1966年首先由Friedenstein等从骨髓中发现。人脐带间充质干细胞(Human Umbilical CordMesenchymal Stem Cells，UC-MSCs)来源于早期中胚层，具有跨胚层向多型组织细胞分化的潜能，在适宜的微环境里具有向血管、脂肪、神经、软骨、骨等多个胚层组织细胞分化的潜能。根据研究，与胎盘干细胞及其他组织特异性干细胞如血液干细胞、神经干细胞相比，脐带间充质干细胞，是从新生儿脐带华通氏胶分离提取的一种间充质干细胞，具有易获得、易培养、低免疫原性、UC-MSC不具致瘤性，在成骨及其他组织器官修复方面均表现出优良的种子细胞特征，具有更强的扩增能力及低免疫原性，其成集落生长潜能及成骨时间早于骨髓等其他来源的间充质干细胞，能在不同的诱导条件及合适的体内生长微环境中，安全地定向分化为不同的组织细胞系，参与组织修复，已作为种子细胞广泛应用于组织工程、细胞移植、基因治疗及器官移植等领域，具有广阔的临床应用前景。
人脐带间充质干细胞作为一种有潜力的种子细胞来源，其优势在于：①脐带收集取材范围广，其过程比从骨髓或胚胎获取干细胞简单，非侵入性，对于新生儿及产妇均无任何痛苦和不良作用，易于接受，可利用储存库长期保存。②具有较强的分裂增殖能力。③脐带受胎盘屏障的保护，其成分被病毒、细菌污染的概率低，可避免获得性免疫缺陷综合征和肝炎等血缘性传播。④脐带免疫系统的原始性，降低了移植后受体的排斥反应，有异体移植及产业化的潜能。⑤不涉及社会、伦理及法律方面的更多争论。
通常脐带原代组织细胞的培养方法包括酶消化培养法和组织块培养法。酶消化培养法的经济成本高，通常需要使用专用的消化设备，消化时间长，一般需2-6h，甚至过夜。酶消化培养法很难控制消化时间、操作困难、过程复杂，若时间过短，细胞消化时间不够，无法得到足够数量的细胞；消化时间过久，消化酶对细胞的损伤大，得到的细胞增殖活性不佳，无法在体外快速扩增从而不能获得大量脐带间充质干细胞。同时操作过程繁琐致污染机率增加。而且消化液较为黏稠，离心时不易分离出细胞，在消化胶原基质时，胶原酶对细胞有直接毒性作用，细胞传至三四代后随着细胞代数的增高常常出现细胞的形态宽大而不规则，细胞不易贴壁，死亡率高。使用组织块贴壁培养法时，通常采用倒置培养瓶的方法来进行MSCs的培养，铺瓶后倒置培养2-8h(或过夜)后再加入培养基正置培养。时间长，操作繁琐，而且组织块贴壁不够牢固，不利于细胞较快的从组织块爬出和增殖。
例如，专利CN201110344464.0公开了一种人富血小板血浆的制备及其在人间充质干细胞分离培养中的应用，制备得到的人富血小板血浆(PRP)和/或人脐血富血小板血浆(cbPRP)用于人间充质干细胞的体外分离、培养具有更理想的效果。专利CN201911047631.8则公开了一种分离培养间充质干细胞的方法，其包括高温诱导的步骤，能够缩短间充质干细胞的分离时间，提高间充质干细胞的产量，增强其增殖能力以及生物学效力。
间充质干细胞的贴壁对于细胞的分离和培养具有重要的意义，因此，提供一种促进脐带组织块贴壁的方法，对于间充质干细胞的制备具有重要的意义。
发明内容
针对上述不足，本发明提供了一种促脐带组织块贴壁的方法。采用本发明所述的促脐带组织块贴壁的方法，促进细胞贴壁的同时，对组织内细胞损伤小，可更大范围的保护间充质干细胞的活性，缩短制备时间。同时，本申请所述的方法具有操作简便、成本低、重复性好，能够保持、促进间充质干细胞的增殖。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种培养瓶预处理方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)配制培养基：在间充质干细胞培养基中加入PRP(富血小板血浆)和桃胶提取物，摇匀；
(2)取细胞培养瓶加入步骤(1)制备的培养基，使培养基浸润培养瓶底部内表面，弃去培养基；
(3)将处理后的培养瓶置于37-39℃静置备用。
所述的桃胶提取物的制备方法为：
(1)提取：将原桃胶除去杂质，粉碎，取500g粉末，加入20倍量超纯水70℃加热搅拌5小时。晾凉，过100目筛，收集滤液。此过程连续2次。每次5小时，合并提取的滤液，离心，上清液真空浓缩至0.5L。
(2)除蛋白：将三氯甲烷和正丁醇溶液混合液(5：1，体积比)加入浓缩液中，振荡，460g离心20分钟，除去水层和溶液层交界处的变性蛋白质。重复此步骤2次，至交界处无明显蛋白沉淀为止，得除蛋白多糖溶液。
(3)醇提：将无水乙醇加入到除蛋白多糖溶液中，使乙醇体积分数为80％，冰箱4℃静置过夜。400g离心10分钟，取沉淀。将获得的沉淀依次用无水乙醇、丙酮、石油醚洗涤，减压抽滤后干燥，得桃胶粗多糖粉末。
具体地，步骤(1)中所述间充质干细胞培养基为MEM-α或DMEM/F12培养基。
具体地，所述的按照PRP为间充质干细胞培养基体积的5-20％，优选为10％。
具体地，所述的桃胶提取物的浓度为0.1-10mg/mL，优选为1mg/mL。
具体地，步骤(2)中所述的浸润时间为20-40min，优选为30min。
具体地，步骤(3)中所述的温度为38℃，静置时间为20-120min，优选为30min。
进一步具体地，步骤(3)中所述的培养瓶置于5％CO2培养箱中。
另一方面，本发明提供了上述培养瓶预处理方法在间充质干细胞制备中的应用。
又一方面，本发明提供了一种间充质干细胞的制备方法，所述的方法为：取含有间充质干细胞的组织置于上述经预处理的培养瓶中，在间充质干细胞培养基中培养。
具体地，所述的含有间充质干细胞的组织为脐带组织。
具体地，所述的脐带组织去除动脉、静脉和外膜，并剪成2-3cm的小段。
具体地，所述的间充质干细胞培养基为MEM-α或DMEM/F12培养基。
具体地，所述的方法包括以下步骤：
(1)取脐带组织铺到培养瓶底部，加入3-7mL培养基，正置放入38℃，5％CO2培养箱中培养；
(2)第2天，将培养箱参数设置为37℃，5％CO2，之后每3d换液，观察细胞生长情况并传代。
另一方面，本发明提供了上述培养瓶预处理方法在促进脐带间充质干细胞贴壁中的应用。
又一方面，本发明提供了上述培养瓶预处理方法在缩短脐带间充质干细胞培养时间中的应用。
又一方面，本发明提供了上述培养瓶预处理方法在提高脐带间充质干细胞增殖能力中的应用。
在某些实施例中，本发明所述的间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：
(1)培养瓶预处理
1)配制培养基：按照5-20％比例往MEM-α培养基中加入PRP，同时加入桃胶提取物，其中，桃胶提取物的终浓度为0.1-10mg/mL，摇匀备用。
2)取T75培养瓶加入10mL上述培养基，浸润培养瓶底部内表面30min，弃去培养基。
3)将培养瓶水平放入38℃，体积百分比为5％的CO2培养箱中静置30min。备用。
(2)脐带间充质干细胞的制备
1)脐带的清洗与处理
a.清洗：75％的酒精消毒脐带保存瓶后，放入安全柜内，取出脐带，用PBS清洗2遍；
b.浸泡：加入75％的酒精浸泡脐带30秒；
c.分段：将脐带置于无菌培养皿中，用无菌手术剪剪成2-3cm的小段；
d.处理：去除动脉、静脉和外膜；
e.收集组织块于50mL离心管中，500-1000g离心5min。弃上清。
f.铺瓶：取出预处理的培养瓶，用无菌钝口镊子夹取组织块，均匀平铺到T75培养瓶底部；
g.加液：加入3-7mL培养基；
h.培养：将平铺好脐带组织块的培养瓶正置放入38℃，体积百分比为5％的CO2培养箱中培养。
2)培养
a.第2天，将CO2培养箱参数设为37℃，CO2体积百分比为5％，继续培养。前2天不要动培养瓶。而后每3天换液1次，观察组织块边缘细胞生长情况，待组织块细胞爬出且生长至70-90％融合时，可对脐带间充质干细胞传代。
3)传代
a.细胞融合达70-90％时传代，按5000-10000cells/cm2的密度接种于T175培养瓶中，加入30mL的配制好的培养基；将培养瓶水平放入37℃，体积百分比为5％的CO2培养箱中培养。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
(1)采用本发明所述的培养瓶预处理方法，用于脐带间充质干细胞的培养，促进了脐带组织块的贴壁率，同时对组织内细胞损伤小，可更大范围的保护间充质干细胞的活性，缩短制备时间。
(2)本申请所述的制备方法具有操作简便、成本低、重复性好的优点，能够明显促进间充质干细胞的增殖。
附图说明
图1为实验例3细胞生长曲线结果图。
图2为实验例4细胞成脂能力检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1.一种培养瓶预处理方法
所述的方法包括以下步骤：
(1)配制培养基：按照10％比例往MEM-α培养基中加入PRP，同时加入桃胶提取物，其中，桃胶提取物的终浓度为1mg/mL，摇匀；
(2)取细胞培养瓶加入步骤(1)制备的培养基，使培养基浸润培养瓶底部内表面，室温浸润30min后弃去培养基；
(3)将处理后的培养瓶置于38℃，5％CO2培养箱中静置30min，备用。
所述的桃胶提取物的制备方法为：
(1)提取：将原桃胶除去杂质，粉碎，取500g粉末，加入20倍量超纯水70℃加热搅拌5小时。晾凉，过100目筛，收集滤液。此过程连续2次。每次5小时，合并提取的滤液，离心，上清液真空浓缩至0.5L。
(2)除蛋白：将三氯甲烷和正丁醇溶液混合液(5：1，体积比)加入浓缩液中，振荡，460g离心20分钟，除去水层和溶液层交界处的变性蛋白质。重复此步骤2次，至交界处无明显蛋白沉淀为止，得除蛋白多糖溶液。
(3)醇提：将无水乙醇加入到除蛋白多糖溶液中，使乙醇体积分数为80％，冰箱4℃静置过夜。400g离心10分钟，取沉淀。将获得的沉淀依次用无水乙醇、丙酮、石油醚洗涤，减压抽滤后干燥，得桃胶粗多糖粉末。
实施例2.一种培养瓶预处理方法
所述的方法包括以下步骤：
(1)配制培养基：按照5％比例往MEM-α培养基中加入PRP，同时加入桃胶提取物，其中，桃胶提取物的终浓度为0.1mg/mL，摇匀；
(2)取细胞培养瓶加入步骤(1)制备的培养基，使培养基浸润培养瓶底部内表面，室温浸润30min后弃去培养基；
(3)将处理后的培养瓶置于37℃，5％CO2培养箱中静置30min，备用。
桃胶提取物的制备方法同实施例1。
实施例3.一种培养瓶预处理方法
所述的方法包括以下步骤：
(1)配制培养基：按照20％比例往MEM-α培养基中加入PRP，同时加入桃胶提取物，其中，桃胶提取物的终浓度为10mg/mL，摇匀；
(2)取细胞培养瓶加入步骤(1)制备的培养基，使培养基浸润培养瓶底部内表面，室温浸润30min后弃去培养基；
(3)将处理后的培养瓶置于39℃，5％CO2培养箱中静置30min，备用。
桃胶提取物的制备方法同实施例1。
对比例1.一种培养瓶预处理方法
所述的方法包括以下步骤：
(1)配制培养基：按照10％比例往MEM-α培养基中加入PRP，摇匀；
(2)取细胞培养瓶加入步骤(1)制备的培养基，使培养基浸润培养瓶底部内表面，室温浸润30min后弃去培养基；
(3)将处理后的培养瓶置于38℃，5％CO2培养箱中静置30min，备用。
桃胶提取物的制备方法同实施例1。
对比例2.一种培养瓶预处理方法
所述的方法包括以下步骤：
(1)配制培养基：按照10％比例往MEM-α培养基中加入PRP，同时加入桃胶提取物，其中，桃胶提取物的终浓度为1mg/mL，摇匀；
(2)取细胞培养瓶加入步骤(1)制备的培养基，使培养基浸润培养瓶底部内表面，室温浸润30min后弃去培养基，备用。
桃胶提取物的制备方法同实施例1。
对比例3.一种培养瓶预处理方法
(1)配制培养基：按照10％比例往MEM-α培养基中加入PRP，同时加入桃胶提取物，其中，桃胶提取物的终浓度为0.01mg/mL，摇匀；
(2)取细胞培养瓶加入步骤(1)制备的培养基，使培养基浸润培养瓶底部内表面，室温浸润30min后弃去培养基；
(3)将处理后的培养瓶置于35℃，5％CO2培养箱中静置30min，备用。
桃胶提取物的制备方法同实施例1。
对比例4.一种培养瓶预处理方法
(1)配制培养基：按照10％比例往MEM-α培养基中加入PRP，同时加入桃胶提取物，其中，桃胶提取物的终浓度为12mg/mL，摇匀；
(2)取细胞培养瓶加入步骤(1)制备的培养基，使培养基浸润培养瓶底部内表面，室温浸润30min后弃去培养基；
(3)将处理后的培养瓶置于40℃，5％CO2培养箱中静置30min，备用。
桃胶提取物的制备方法同实施例1。
对比例5.一种培养瓶预处理方法
所述的方法包括以下步骤：
(1)配制培养基：按照10％比例往MEM-α培养基中加入PRP，同时加入桃胶提取物，其中，桃胶提取物的终浓度为1mg/mL，摇匀；
(2)取细胞培养瓶加入步骤(1)制备的培养基，使培养基浸润培养瓶底部内表面，室温浸润30min后弃去培养基；
(3)将处理后的培养瓶置于38℃，5％CO2培养箱中静置30min，备用。
所述的桃胶提取物的制备方法为：
(1)取500g桃胶，挑除杂物后，加适量纯化水浸泡过夜。
(2)按照料液比1:20加入超纯水，加热至70℃热水搅拌提取2小时。提取2次。提取完成后晾凉、过滤。得到上清液。
(3)将收集的上清液减压旋转蒸发浓缩至体积约为原来的1/3。加入无水乙醇至乙醇浓度为80％，静置过夜。
(4)弃去上层清液，取下层沉淀。将获得的沉淀依次用无水乙醇、丙酮、石油醚洗涤，减压抽滤后干燥，得桃胶粗多糖粉末。
实验例1.一种间充质干细胞的制备方法
(1)培养瓶预处理：分别按照实施例1-3、对比例1-5的方法预处理细胞培养瓶。
(2)脐带间充质干细胞的制备
1)脐带的清洗与处理
a.清洗：75％的酒精消毒脐带保存瓶后，放入安全柜内，取出脐带，用PBS清洗2遍；
b.浸泡：加入75％的酒精浸泡脐带30秒；
c.分段：将脐带置于无菌培养皿中，用无菌手术剪剪成2-3cm的小段；
d.处理：去除动脉、静脉和外膜；
e.收集组织块于50mL离心管中，500-1000g离心5min。弃上清。
f.铺瓶：取出预处理的培养瓶，用无菌钝口镊子夹取组织块，均匀平铺到T75培养瓶底部；
g.加液：加入3-7mL培养基；
h.培养：将平铺好脐带组织块的培养瓶正置放入38℃，体积百分比为5％的CO2培养箱中培养。
2)培养
a.第2天，将CO2培养箱参数设为37℃，CO2体积百分比为5％，继续培养。前2天不要动培养瓶。而后每3天换液1次，观察组织块边缘细胞生长情况，待组织块细胞爬出且生长至70-90％融合时，可对脐带间充质干细胞传代。
3)传代
a.细胞融合达70-90％时传代，按5000-10000cells/cm2的密度接种于T175培养瓶中，加入30mL的配制好的培养基；将培养瓶水平放入37℃，体积百分比为5％的CO2培养箱中培养。
实验例2.细胞贴壁检测
组织块细胞培养至第5d，倒置显微镜下观察细胞形态，实施例1组织块周围爬出细胞最多，所得的细胞在传代后第2天形态无明显变化，性质稳定，在显微镜下观察，细胞成长梭状，单核，成放射或漩涡状排列。并计算传代后第2d时的细胞贴壁率(细胞融合度)，具体如下表1所示。
表1
同时，记录组织块细胞传代后融合度达到80％的时间，具体如下表2所示。
表2
实验例3.细胞增殖能力检测
取P3代细胞，融合度达70-90％时，用0.25％的胰蛋白酶消化人脐带间充质干细胞，离心后去上清，加入含体积分数5-20％的PRP的MEM-α培养液重悬细胞，调整细胞浓度至1×105/mL，接种于24孔细胞培养板，每孔1mL细胞悬液。将培养板置于CO2恒温细胞培养箱中，每3d更换培养基1次。在第2，4，6，8，10和12天分别取3孔细胞，采用CCK-8法于490nm测吸光度值，以培养时间为横轴、吸光度值为纵轴，绘制人脐带间充质干细胞的生长曲线，详见附图1。
采用实验例1制备获得的人脐带间充质干细胞生长曲线呈“滞缓-对数生长-平台”模式。细胞在培养前2d生长稍慢，为细胞适应期(滞缓期)；第2-8天生长较快，为对数生长期；第8天之后进入平台期。而在本申请所述的培养瓶预处理条件下，制备获得的人脐带间充质干细胞细胞增值能力更强。
实验例4.细胞成脂能力检测
取P4代细胞接种至12孔板中，细胞融合度至80％时加入成脂诱导液，每周换液2次，2周后使用油红O染色，并置于显微镜下观察，拍照。检测结果如图2所示。
由图2可知，采用本发明实施例1制备获得的间充质干细胞经成脂诱导后，红色的脂滴明显多于对比例4和对比例5，表明本发明所述的实施例1制备获得的间充质干细胞的成脂能力明显优于对比例4和对比例5。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种培养瓶预处理方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：
(1)配制培养基：在间充质干细胞培养基中加入PRP和桃胶提取物，摇匀；
(2)取细胞培养瓶加入步骤(1)制备的培养基，使培养基浸润培养瓶底部内表面；
(3)将处理后的培养瓶置于37-39℃中静置备用；
所述的步骤(1)中的间充质干细胞培养基为MEM-α或DMEM/F12培养基；所述的PRP为间充质干细胞培养基体积的5-20％；所述的桃胶提取物的终浓度为0 .1-10mg/mL；
所述的步骤(2)中浸润时间为20-40min，浸润后弃去培养基；
所述的步骤(3)中培养瓶置于5％CO2培养箱中；所述静置时间为20-120min；
所述的步骤(1)中桃胶提取物的制备方法为：
(a)提取：将原桃胶除去杂质，粉碎，取500g粉末，加入20倍量超纯水70℃加热搅拌5小时，晾凉，过100目筛，收集滤液，此过程连续2次，每次5小时，合并提取的滤液，离心，上清液真空浓缩至0 .5L；
(b)除蛋白：将体积比为5：1的三氯甲烷和正丁醇溶液混合液加入浓缩液中，振荡，460g离心20分钟，除去水层和溶液层交界处的变性蛋白质，重复此步骤2次，至交界处无明显蛋白沉淀为止，得除蛋白多糖溶液；
(c)醇提：将无水乙醇加入到除蛋白多糖溶液中，使乙醇体积分数为80％，冰箱4℃静置过夜；400g离心10分钟，取沉淀；将获得的沉淀依次用无水乙醇、丙酮、石油醚洗涤，减压抽滤后干燥，得桃胶粗多糖粉末。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的PRP为间充质干细胞培养基体积的10％；所述的桃胶提取物的终浓度为1mg/mL；
所述的步骤(2)中浸润时间为30min；
所述的步骤(3)中温度为38℃，静置时间为30min。
3.权利要求1-2任一项所述的培养瓶预处理方法在间充质干细胞制备中的应用。
4.一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述的方法为：取含有间充质干细胞的脐带组织置于经权利要求1-2任一项所述的方法预处理过的培养瓶中，在MEM-α或DMEM/F12培养基中培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：
(1)取脐带组织铺到培养瓶底部，加入3-7mL培养基，正置放入38℃，5％CO2培养箱中培养；
(2)第2天，将培养箱参数设置为37℃，5％CO2，之后每3d换液，观察细胞生长情况并传代。
6.权利要求1-2任一项所述的培养瓶预处理方法在促进脐带间充质干细胞贴壁或提高脐带间充质干细胞增殖能力中的应用。
7.权利要求1-2任一项所述的培养瓶预处理方法在缩短脐带间充质干细胞培养时间中的应用。
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