KR20160119609A - 지방 조직으로부터 지방줄기세포를 수득하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인체로부터 수득한 지방 조직으로부터 간편하게 지방줄기세포를 수득하는 방법 및 인체로부터 수득한 지방 조직으로부터 지방이식용 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 지방줄기세포 및 지방이식용 조성물의 제조방법은 제조과정이 간단하여 제조시간을 단축할 수 있는바, 성형외과 등에서 지방이식시 유용하게 응용될 수 있다. 또한, 상기 제조된 지방줄기세포 및 지방이식용 조성물은 생착률이 우수하고 뭉쳐지는 현상이 없어 부작용 없이 보다 안전하게 지방이식에 사용될 수 있다.

Description

지방 조직으로부터 지방줄기세포를 수득하는 방법{METHOD FOR OBTAINING STROMAL VASCULAR FRACTION FROM ADIPOSE TISSUE}

본 발명은 지방 조직으로부터 지방줄기세포를 수득하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인체로부터 수득한 지방 조직으로부터 간편하게 지방줄기세포를 수득하는 방법 및 인체로부터 수득한 지방 조직으로부터 지방이식용 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

얼굴 성형, 유방 성형 및 상처로 인한 흔적의 제거 등을 위하여, 피검자 자신의 피하지방을 사용한 이식이 성형외과 등에서 통상적으로 행해지고 있다.

이러한 이식에 사용되는 지방 조직에는 지방유래 줄기세포(adipose-derived stem cells, ASCs)가 존재한다. 지방 조직은 많은 양의 조직 채취가 용이하여 줄기세포를 수확하는데 유리하며, ASC는 배양시 안정적인 성장과 증식을 보여주고 분화를 유도하였을 때 골수줄기세포와 같이 다양한 세포로의 분화가 가능하다. 현재 ASC는 지방 조직의 성숙 지방세포, 적혈구 등을 제거한 나머지 기질세포(stromal vascular fraction, SVF, 지방줄기세포)를 분리 배양하여 얻는다. 그러나 이 SVF에는 지방전구세포, 지방모세포 등의 지방세포의 각 분화 단계에 따른 여러 가지 성분들이 포함되어 있다. 이를 위해, 세포막 표면에 존재하는 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 분리하는 방법이 개발되었지만 고비용으로 인하여 제한적이고 대중적으로 사용하기 어려운 단점이 있다. 또한, 인간과 동물의 장기 및 조직에서 생존율과 순도가 높은 세포를 분리하기 위한 방법으로 세포의 크기와 밀도에 기초한 방법들이 활용되고 있는데 제조과정이 복잡하고 시간이 많이 소요되는 단점이 있다.

종래와 같이 피하지방을 채취하여 이식을 수행하는 경우, 피하지방의 채취과정에서 약 50% 이상의 지방세포가 손상될 뿐 아니라, 다양한 크기의 세포 덩어리가 잔존함으로써 이식 부위에 원하는 함량을 정밀하게 이식하는 것이 곤란하고, 피부가 얇고 피하지방이 적은 이식 부위(예를 들어, 눈아래부위 등)에서는 덩어리들이 만져지는 등의 문제가 발생한다. 또한, 피하지방의 덩어리만을 이식한 경우에는 지방 조직 덩어리의 내부에 존재하는 지방세포들이 주변의 환경으로부터 필요한 양분을 받거나 또는 노폐물을 배출하는데 어려움을 겪게 되어 쉽게 괴사하는 문제가 발생한다. 또한, 종래의 지방이식용 조성물을 제조하는 과정은 매우 복잡하고 시간이 많이 소요된다.

지방세포, 지방줄기세포 및 지방 조직은 공지의 방법, 예를 들어, 국제특허공개 제WO2000/53795호 및 제WO2005/042730호에 개시된 바와 같이, 지방 조직(adipose tissue)으로부터 지방흡인(liposuction) 및 침강, 콜라게네이즈(collagenase) 등의 효소처리, 원심분리에 의한 적혈구 등의 부유 세포 제거 등의 과정을 통하여 분리될 수 있다. 또한, 국제특허공개 제WO2006/084284호에 개시된 바와 같이, 피하 저장고의 인간 지방 조직을 지방 흡입 및 침강으로 침전혈액 제거, 크렙스-링거(Krebs-Ringer) 완충액을 이용한 지방 조직의 세척, 콜라게네이즈 처리 후 원심분리로 오일 및 지방 세포층 제거를 통한 지방 조직 스트로마 세포의 단리, 배지에 현탁하여 조직배양 디쉬 또는 플라스크에 부착하거나 배양하여 부유세포를 제거하여 얻을 수 있다.

얼굴 성형, 상처로 인한 흔적의 제거 등에 사용되는 지방줄기세포와 지방세포는, 채취된 지방 조직을 콜라게네이즈를 이용하여 지방을 분리하고 남은 세포 덩어리에 존재하며, 이를 피하지방 결손 부위의 개선을 목적으로 성형외과 등에서 사용되고 있다. 이러한 지방줄기세포와 지방세포는 지방 조직의 채취과정에서 약 50% 이상의 지방세포가 손상될 뿐 아니라, 효소처리 과정에서도 물리적인 스트레스를 받아 지방세포가 손상되는 등의 문제가 발생하여, 이식 후 피하지방에서의 생착율이 떨어지는 문제점이 있다. 이러한 세포의 활성 감소 및 생착율의 저하 등의 문제는 분리한 성체 지방유래 줄기세포의 세포괴사(necrosis)를 야기할 수 있다.

따라서, 종래의 방법과는 달리 간편하게 생착률이 우수한 지방줄기세포를 수득하고 지방이식용 조성물을 제조하는 방법의 개발이 요구된다.

1. 국제특허공개 제WO2000/53795호 2. 국제특허공개 제WO2005/042730호 3. 국제특허공개 제WO2006/084284호

본 발명의 목적은 인체로부터 유래한 지방 조직으로부터 생착률이 우수한 지방줄기세포를 간편하게 수득하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인체로부터 유래한 지방 조직으로부터 생착률이 우수한 지방이식용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

하나의 실시양태에서, 본 발명은 (1) 지방 조직을 생리식염수, 겐타마이신 및 세팔로스포린과 혼합하는 단계; (2) 상기 지방 혼합물을 마그네틱 교반기로 100 내지 500 rpm에서 5 내지 20분간 교반하여 지방 및 섬유질을 분리하는 단계; 및 (3) 상기 분리된 섬유질에 콜라게네이즈를 첨가한 후, 시소교반기가 구비된 배양기 내에서 36 내지 38℃에서 20분 내지 40분간 교반하면서 배양하여, 지방줄기세포(SVF)를 분리하는 단계를 포함하는, 지방 조직으로부터 지방줄기세포를 수득하는 방법을 제공한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 (1) 지방 조직을 생리식염수, 겐타마이신 및 세팔로스포린과 혼합하는 단계; (2) 상기 지방 혼합물을 마그네틱 교반기로 100 내지 500 rpm에서 5 내지 20분간 교반하여 지방 및 섬유질을 분리하는 단계; (3) 상기 분리된 섬유질에 콜라게네이즈를 첨가한 후, 시소교반기가 구비된 배양기 내에서 36 내지 38℃에서 20분 내지 40분간 교반하면서 배양하여, 지방줄기세포(SVF)를 분리하는 단계; (4) 상기 단계 (2)에서 분리된 지방을 원심분리하여 탈수시키는 단계; (5) 혈액을 원심분리하여 혈소판-풍부 혈장(platelet-rich plasma; PRP)을 수득하는 단계; 및 (6) 상기 단계 (3)에서 수득된 지방줄기세포, 상기 단계 (4)에서 수득된 탈수된 지방, 및 상기 단계 (5)에서 수득된 혈소판-풍부 혈장을 혼합하는 단계를 포함하는, 지방이식용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 지방줄기세포 및 지방이식용 조성물의 제조방법은 제조과정이 간단하여 제조시간을 단축할 수 있는바, 성형외과 등에서 지방이식시 유용하게 응용될 수 있다. 또한, 상기 제조된 지방줄기세포 및 지방이식용 조성물은 생착률이 우수하고 뭉쳐지는 현상이 없어 부작용 없이 보다 안전하게 지방이식에 사용될 수 있다.

본 발명은 미용성형 등에 사용될 수 있는 지방줄기세포 및 지방이식용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 하나의 실시양태는, (1) 지방 조직을 생리식염수, 겐타마이신 및 세팔로스포린과 혼합하는 단계; (2) 상기 지방 혼합물을 마그네틱 교반기로 100 내지 500 rpm에서 5 내지 20분간 교반하여 지방 및 섬유질을 분리하는 단계; 및 (3) 상기 분리된 섬유질에 콜라게네이즈를 첨가한 후, 시소교반기가 구비된 배양기 내에서 36 내지 38℃에서 20분 내지 40분간 교반하면서 배양하여, 지방줄기세포(SVF)를 분리하는 단계를 포함하는, 지방 조직으로부터 지방줄기세포를 수득하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 실시양태는, (1) 지방 조직을 생리식염수, 겐타마이신 및 세팔로스포린과 혼합하는 단계; (2) 상기 지방 혼합물을 마그네틱 교반기로 100 내지 500 rpm에서 5 내지 20분간 교반하여 지방 및 섬유질을 분리하는 단계; (3) 상기 분리된 섬유질에 콜라게네이즈를 첨가한 후, 시소교반기가 구비된 배양기 내에서 36 내지 38℃에서 20분 내지 40분간 교반하면서 배양하여, 지방줄기세포(SVF)를 분리하는 단계; (4) 상기 단계 (2)에서 분리된 지방을 원심분리하여 탈수시키는 단계; (5) 혈액을 원심분리하여 혈소판-풍부 혈장(platelet-rich plasma; PRP)을 수득하는 단계; 및 (6) 상기 단계 (3)에서 수득된 지방줄기세포, 상기 단계 (4)에서 수득된 탈수된 지방, 및 상기 단계 (5)에서 수득된 혈소판-풍부 혈장을 혼합하는 단계를 포함하는, 지방이식용 조성물의 제조방법을 제공한다.

먼저, 본 발명의 하나의 실시양태에 따른, 지방 조직으로부터 지방줄기세포를 수득하는 방법을 설명한다.

상기 지방줄기세포의 수득방법에 있어서, 본 단계 (1)에서는 지방 조직을 생리식염수, 겐타마이신 및 세팔로스포린과 혼합한다.

상기 지방 조직은 지방이식을 하고자 하는 대상의 인체로부터 수득된 것일 수 있으며, 예를 들어, 허벅지 앞, 앞복부, 허벅지 뒤 등에서 수득되는 잉여 지방일 수 있다. 상기 지방 조직은 통상적인 지방 흡입 방법에 따라 수득될 수 있으며, 예를 들면, 국소마취 혹은 수면마취로 지방 흡입이 가능하도록 만들어진 팽창용액 및 마취용액을 지방을 흡입하고자하는 부위에 흡입하고자 하는 지방의 양만큼 주입한 후, 통상적인 지방 흡입에 의해 수득될 수 있다. 구체적으로, 상기 팽창용액 및 마취용액으로 투메센트가 사용될 수 있다. 일반적으로 국소마취제로 사용하는 리도카인과 프롤로카인은 단독 사용시 흡수율이 높고 빨라서 많은 양을 사용할 수 없는 반면, 투메센트는 흡수율이 지연되어 사용량이 5배 이상 되어도 안전하게 사용할 수 있다. 예를 들어, 1000 cc의 지방을 흡입하고자 하는 경우, 투메센트 1000 cc를 주입하여 지방을 흡인한다.

상기 흡입된 지방은 멸균된 적절한 용기, 예를 들면 3000 cc 용기(bowl)에 담긴 후, 생리식염수, 겐타마이신 및 세팔로스포린과 혼합된다.

상기 생리식염수는 지방 조직을 현탁시키고, 후술한 항생제가 작용할 수 있는 환경을 제공한다. 상기 생리식염수는 지방 조직 500 내지 1000 cc 당 400 내지 1000 cc의 양으로 사용될 수 있다.

상기 겐타마이신은 아미노글라이코사이드 계열의 항생물질로서, 그람 음성 및 양성균의 세포질내 단백합성을 억제하여 항생 작용을 나타낸다. 상기 겐타마이신은 지방 조직 500 내지 1000 cc 당 0.5 내지 2 cc의 양으로 사용될 수 있다.

상기 세팔로스포린은 β-락탐 계열의 항생제로서, 다양한 균에 대해 항생 작용을 나타낸다. 상기 세팔로스포린은 지방 조직 500 내지 1000 cc 당 0.5 내지 2 cc의 양으로 사용될 수 있다.

전술한 겐타마이신 및 세팔로스포린은 흡입한 지방 조직 내에 존재할 수 있는 병원균을 제거하는 역할을 한다.

본 단계에서는 대표적인 항생제로서 겐타마이신 및 세팔로스포린을 언급하였으나, 본 발명의 숙련가라면 이들 항생제 외에 다른 항생제를 사용할 수 있음을 인식할 것이다.

본 단계 2에서는 상기 지방 혼합물을 마그네틱 교반기로 100 내지 500 rpm에서 5 내지 20분간 교반하여 지방 및 섬유질을 분리한다.

인체로부터 흡입한 지방 조직에는 지방 세포 외에도 섬유질과, 적혈구, 백혈구 등의 혈구세포가 존재하며, 이러한 섬유질과 혈구세포는 지방이식시 불순물로 작용하여 이식 생착률을 저하시키므로, 이를 제거하는 것이 필요하다. 하지만, 종래 방법들은 이러한 불순물을 제거하는 기술을 제시하고 못하고 있으며, 단지 흡입된 지방 조직을 생리 식염수로 세척하여 지방 세포를 얻기 때문에, 상기 지방 세포를 이식에 사용하는 경우 높은 이식 생착률을 달성하지 못하고 있다. 이에 반해, 본 발명은 마그네틱 교반기를 사용한 교반 및 원심분리 방법에 의해 간단하게 지방 조직으로부터 섬유질 및 혈구세포를 제거하는 것을 특징으로 한다. 더욱이, 본 발명은 상기 제거된 섬유질로부터 지방줄기세포(SVF)를 수득하고, 이를 지방이식시 사용함으로써, 섬유질을 재활용할 수 있고, 지방이식 효과를 극대화할 수 있다.

구체적으로, 단계 1에서 수득한 지방 혼합물을 용기, 예를 들면 3000 cc의 바울에 넣은 다음, 마그네틱 교반기로 저속, 즉 100 내지 500 rpm으로 5 내지 20분간 교반한다. 이 과정에서, 원심분리에 의해 섬유질이 용기의 중심부에 모이게 되고, 혈구세포는 상기 교반 과정에서 파괴 및 응축되어 용기 바닥에 모이게 되며, 사멸 직전의 성숙 지방세포에 충격이 가해지면 생성되는 유리 오일(free oil)은 상층부에 모이게 된다. 이후, 상층부에 모인 유리 오일은 거즈 등을 이용하여 제거하고, 중심부에 모여진 섬유질은 손이나 주걱과 같은 기구를 이용하여 건져내어 제거한 후, 바닥에 침전된 혈구세포를 제외한 나머지 순수한 지방을 분리할 수 있다. 상기 분리된 섬유질은 이후 단계에서 지방줄기세포를 수득하는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 분리된 지방은 본 발명의 다른 실시양태에 따른 지방이식용 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 나아가, 상기 분리된 유리 오일은 화장품의 보습/기능성 원료로서 사용될 수 있다.

종래 기계를 사용하여 섬유질을 분리하는 방법이 알려져 있으나, 상기 방법은 지방을 다시 분리하거나, 나누어야 하므로 이 부분에서 시간이 걸리고 오염의 가능성이 있는 반면, 본 방법은 바울 가운데 자연스럽게 모아진 섬유질을 건져내기만 하면 되므로, 필요한 지방이 모자랄 것을 걱정하지 않아도 되며, 분리를 위해 기계가 스톱되지 않고 자연스럽게 과정이 진행될 수 있다.

본 단계 3에서는 상기 분리된 섬유질에 콜라게네이즈를 첨가한 후, 시소교반기가 구비된 배양기 내에서 36 내지 38℃에서 20분 내지 40분간 교반하면서 배양하여, 지방줄기세포(SVF)를 분리한다.

상기 단계에서는 일종의 불순물인 섬유질로부터 지방줄기세포를 분리한다.

구체적으로, 단계 2에서 분리된 섬유질에 콜라게네이즈(collagenase)를 첨가한다. 상기 콜라게네이즈는 콜라겐의 가수분해를 촉진하는 효소로서, 섬유질의 콜라겐을 분해하여 지방줄기세포를 분리시키는 역할을 한다. 상기 콜라게네이즈는 시판중인 콜라게네이즈를 이용할 수 있으며, 그 예로써 NB4 효소가 사용될 수 있다.

이후, 상기 콜라게네이즈가 처리된 섬유질을 시소교반기가 구비된 배양기 내에서 36 내지 38℃에서 20분 내지 40분간 교반하면서 배양하여, 지방줄기세포(SVF)를 분리한다. 상기 시소교반기가 구비된 배양기는 통상적인 배양기 내에 시소 방식의 교반기가 포함된 것으로서, 시소 교반기에 의한 교반과 배양기에서의 배양을 동시에 수행할 수 있다. 통상 지방줄기세포의 경우 지방 조직에 콜라게네이즈를 처리하여 반응시킨 다음, 이를 원심분리하여 지방줄기세포를 수득하게 되는데, 지방은 공기에 노출후 1시간이 경과하면 산화되므로, 통상적인 방식으로는 생착률이 우수한 지방줄기세포를 수득하기 어렵다. 하지만, 본 발명은 단계 3에서 교반과 배양을 동시에 진행함으로써 지방줄기세포를 수득하는데 소요되는 시간을 단축시켜 지방의 산화를 막을 수 있다. 통상 지방줄기세포 수득에 1시간이 넘게 걸리는 것을 본 단계에서는 20-30분 이상 단축시킬 수 있다. 상기 배양은 36 내지 38에서 20분 내지 40분간 수행될 수 있으며, 상기 배양 후 원심분리를 수행하여 상부에 위치한 지방줄기세포를 분리할 수 있다.

상기 분리된 지방줄기세포는 단독으로 지방 이식시 사용되거나, 하기 설명할 인체로부터 얻은 지방 조직과 혼합된 이식용 조성물로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 지방줄기세포의 수득 방법은 마그네틱 교반기에 의한 섬유질 분리 및 상기 섬유질로부터 시소교반기에 의한 교반과 배양을 동시에 수행함으로써 간편하게 생착률이 우수한 지방줄기세포를 수득할 수 있게 한다.

다음으로, 본 발명의 다른 실시양태에 따른, 지방 조직으로부터 지방이식용 조성물을 제조하는 방법을 설명한다.

상기 제조방법은 전술한 방법에 의해 수득한 지방줄기세포와 이하 설명할 방법에 의해 수득한 지방을 혼합함으로써 제조된다.

상기 지방이식용 조성물의 제조방법은, (1) 지방 조직을 생리식염수, 겐타마이신 및 세팔로스포린과 혼합하는 단계; (2) 상기 지방 혼합물을 마그네틱 교반기로 100 내지 500 rpm에서 5 내지 20분간 교반하여 지방 및 섬유질을 분리하는 단계; (3) 상기 분리된 섬유질에 콜라게네이즈를 첨가한 후, 시소교반기가 구비된 배양기 내에서 36 내지 38℃에서 20분 내지 40분간 교반하면서 배양하여, 지방줄기세포(SVF)를 분리하는 단계; (4) 상기 단계 (2)에서 분리된 지방을 원심분리하여 탈수시키는 단계; (5) 혈액을 원심분리하여 혈소판-풍부 혈장(platelet-rich plasma; PRP)을 수득하는 단계; 및 (6) 상기 단계 (3)에서 수득된 지방줄기세포, 상기 단계 (4)에서 수득된 탈수된 지방, 및 상기 단계 (5)에서 수득된 혈소판-풍부 혈장을 혼합하는 단계를 포함한다.

상기 단계 (1) 내지 (3)은 전술한 바와 같으므로, 단계 (4) 내지 (6)에 대해 구체적으로 설명한다.

본 단계 4에서는 단계 2에서 분리된 지방을 원심분리하여 탈수시킨다. 상기 과정은 지방 중에 함유된 물을 제거하는 과정으로서, 통상적인 원심분리 방법에 의해 수행될 수 있다.

상기 단계에서, 물이 제거된 지방은 필터, 예를 들면 시판중인 퓨어시스를 이용한 필터링 과정을 거칠 수 있다.

본 단계 5에서는 혈액을 원심분리하여 혈소판-풍부 혈장(platelet-rich plasma; PRP)을 수득한다.

혈소판 풍부 혈장은 다량의 혈소판을 가지는 자가 혈액의 혈장 성분으로 정의된다. 우리 몸에서 정상적인 혈소판의 농도는 200,000개/ul인데, 이것보다 최소 4배 이상의 농도에서 혈소판-풍부 혈장의 임상적 효과를 기대할 수 있다고 보고되고 있다. 혈소판-풍부 혈장은 자가 혈액의 원심 분리 과정을 통해 얻어지며, 전혈(whole blood)에 비해 높은 농도의 혈소판(platelet)을 함유하고 있다. 초기에는 혈소판이 혈액 응고 과정에만 작용하는 것으로 알려져 왔으나, 상처 치유에 대한 이해가 깊어지면서 혈소판이 함유하고 있는 풍부한 성장 인자(growth factors)와 싸이토카인(cytokines)의 작용을 통해 조직 재생과 치유 과정에도 작용하는 것이 밝혀지게 되었다. 혈소판-풍부 혈장은 1970년대에 처음 분리되었고, 1987년도에 Ferrari 등이 과도한 수혈을 피하기 위해 개흉 수술에 처음 이용한 이래 점차 그 영역이 확대되어 정형외과, 성형외과, 신경외과, 피부과, 치과, 안과, 이비인후과 등 다양한 영역에서 다양한 적응증을 가지고 폭넓게 사용되고 있다.

상기 혈소판-풍부 혈장은 지방이식용 조성물에 성장인자 및 싸이토카인을 제공하는 역할을 한다.

본 단계 6에서는 상기 단계 (3)에서 수득된 지방줄기세포, 상기 단계 (4)에서 수득된 탈수된 지방, 및 상기 단계 (5)에서 수득된 혈소판-풍부 혈장을 혼합함으로써 지방이식용 조성물을 제조한다.

상기 단계 (3)에서 수득된 지방줄기세포는 원심분리 과정을 추가로 거쳐 지방이 다시 분리될 수 있으며, 상기 분리된 지방은 PDRN(polydeoxyribonucleotide) 주사액 및 킬레이션 주사액과 혼합될 수 있다. 상기 PDRN은 지방이식의 생착률을 높이고, 섬유아세포 성장, 세포 재생, 상처 치유 등의 역할을 한다. 또한, 상기 킬레이션 주사액은 세포 내에 존재하는 중금속, 콜레스테롤, 혈전 등을 제거하는 역할을 한다.

상기 지방줄기세포, 지방 및 혈소판-풍부 혈장의 혼합비는 0.5~1 : 0.5~1 : 0.5~1의 부피비일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 지방이식용 조성물은 섬유질로부터 분리된 지방줄기세포, 지방 조직으로부터 분리된 지방 및 혈액으로부터 분리된 혈소판-풍부 혈장을 포함함으로써 이식후 생착률이 우수하다.

또한, 현재 시중에서 하베스젯, 휴리셀, 차스테이션 등과 같은 장비가 사용되고 있으나, 하베스트젯은 지방세포에서 찌꺼기만 걸러줄뿐 줄기세포를 수득하는 장비가 아니며, 휴리셀과 차스테이션은 흡입후 모아진 지방을 자체 세척 및 농축, 지방줄기세포 추출을 한번에 해주는 장비이긴 하나, 7-8000천만원의 고가이고 지방세포를 걸러내는 필터링이 약한 단점이 있으며, 시간이 2시간 가량 소비된다. 상기 장비들은 최소 4-5천만원에서 2억 가까이 소요되나, 필터링이 약해 생성된 조성물의 생착률이 떨어진다.

이에 반해, 본 발명에 따라 제조된 지방이식용 조성물은 지방 이식술시 70% 이상의 생착률을 보이며, 다른 여타 기계로 작업한 지방이식수술보다 생착률이 높고 수술시간은 1시간 이상 더 단축할 수 있는 장점이 있다. 나아가, 지방이식후 석회화 또는 지방이 뭉쳐서 가슴이나 엉덩이 이식 후 뭉쳐지는현상이 전혀 생기지 않아, 지방이식에 매우 안전하고 효율적이다.

이하, 다음의 실시 태양을 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시 태양에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리범위를 이들에 기재된 내용으로 한정하거나 제한해석하고자 의도하는 것은 아니다.

실시예 1: 지방 조직으로부터 지방줄기세포(SVF)의 분리

흡입한 지방 600cc를 3000cc 병에 넣고, 생리식염수 500cc, 겐타마이신 1 앰플 및 1세대 세팔로스포린 1 바이알을 혼합하였다. 상기 지방 혼합물을 마그네틱 교반기를 이용하여 200 rpm으로 10분간 교반하였다. 교반 후 상층부에 형성된 오일층을 거즈를 이용하여 제거한 다음, 중심부에 생성된 섬유질을 건져내었다. 이후, 바닥에 침전된 혈구 세포를 제외한 지방을 조심스럽게 분리하였다.

상기 섬유질을 50 cc 튜브에 25 cc씩 나누어 담은 후, 여기에 NB4 효소를 첨가하였다. 상기 효소가 첨가된 섬유질을 시소교반기가 내부에 위치한 배양기에 넣어 36℃에서 30분간 교반하면서 배양하였다. 상기 배양물을 원심분리하여 상층액으로서 SVF를 분리하였다.

실시예 2: 지방 조직으로부터 지방이식용 조성물의 제조

실시예 1에서 분리된 지방을 원심분리하여 물을 제거하였다. 상기 탈수 및 농축된 지방은 60 cc 실린지 크기로 6-7개 정도였다.

한편, 실시예 1에서 분리된 SVF를 원심분리하여 지방을 제거한 후, 다시 원심분리하여 튜브 아래에 5 cc 정도의 SVF 2개의 튜브를 얻었다. 상기 10 cc의 용액을 따로 모아서 PDRN 주사액 1 앰플 및 킬레이션 주사액 1 앰플과 혼합하였다.

한편, 미리 채취한 혈액 60 cc를 원심분리하여 혈소판-풍부 혈장 용액 20 cc를 수득하였다.

상기 수득된 혈소판-풍부 혈장 용액 20 cc를 상기 수득된 SVF 20cc 및 지방 20 cc와 혼합하여 지방이식용 조성물을 수득하였다.

시험예 1: 지방이식용 조성물의 이식효과

상기 실시예 2의 지방이식용 조성물을 20명의 피검자에게 가슴이나 엉덩이에 이식하고, 면역거부반응이 있는지 여부와 지방 조직이 유지되는지 여부를 3, 6, 9개월 동안 관찰하였다.

통상, 지방이식 후 석회화 또는 지방이 뭉쳐서 가슴이나 엉덩이 이식 후 뭉쳐지는 현상이 생기는데, 이는 지방을 아무리 균일하게 이식한다고 하더라도 이동 및 혈관생성 후 생착과정에서 일부 뭉쳐질 수 있다.

하지만, 본 발명의 지방이식용 조성물을 이식한 결과, 초기 투여된 지방 조직의 양에서 90% 정도가 유지됨을 확인하였고, 뭉쳐지는 현상 등이 전혀 없음을 알 수 있었다.

Claims (7)

1. (1) 지방 조직을 생리식염수, 겐타마이신 및 세팔로스포린과 혼합하는 단계;
   (2) 상기 지방 혼합물을 마그네틱 교반기로 100 내지 500 rpm에서 5 내지 20분간 교반하여 지방 및 섬유질을 분리하는 단계; 및
   (3) 상기 분리된 섬유질에 콜라게네이즈를 첨가한 후, 시소교반기가 구비된 배양기 내에서 36 내지 38℃에서 20분 내지 40분간 교반하면서 배양하여, 지방줄기세포(SVF)를 분리하는 단계
   를 포함하는, 지방 조직으로부터 지방줄기세포를 수득하는 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 지방 조직이 인체로부터 수득된 것을 특징으로 하는, 방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 생리식염수, 겐타마이신 및 세팔로스포린이 각각 지방 조직 500 내지 1000 cc 당 400 내지 1000 cc, 0.5 내지 2 cc 및 0.5 내지 2 cc의 양으로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 단계 (2)에서 섬유질이 교반에 의해 용기의 중심부에 형성된 후 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. (1) 지방 조직을 생리식염수, 겐타마이신 및 세팔로스포린과 혼합하는 단계;
   (2) 상기 지방 혼합물을 마그네틱 교반기로 100 내지 500 rpm에서 5 내지 20분간 교반하여 지방 및 섬유질을 분리하는 단계;
   (3) 상기 분리된 섬유질에 콜라게네이즈를 첨가한 후, 시소교반기가 구비된 배양기 내에서 36 내지 38℃에서 20분 내지 40분간 교반하면서 배양하여, 지방줄기세포(SVF)를 분리하는 단계;
   (4) 상기 단계 (2)에서 분리된 지방을 원심분리하여 탈수시키는 단계;
   (5) 혈액을 원심분리하여 혈소판-풍부 혈장(platelet-rich plasma; PRP)을 수득하는 단계; 및
   (6) 상기 단계 (3)에서 수득된 지방줄기세포, 상기 단계 (4)에서 수득된 탈수된 지방, 및 상기 단계 (5)에서 수득된 혈소판-풍부 혈장을 혼합하는 단계
   를 포함하는, 지방이식용 조성물의 제조방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 단계 (3)에서 분리된 지방줄기세포가 PDRN(polydeoxyribonucleotide) 주사액 및 킬레이션 주사액과 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
7. 제5항에 있어서, 단계 (6)에서 지방줄기세포, 지방 및 혈소판-풍부 혈장의 혼합비가 0.5~1 : 0.5~1 : 0.5~1의 부피비인 것을 특징으로 하는 방법.