CN103060269A - 一种提取及培养间充质干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种提取及培养间充质干细胞的方法，包括步骤：1)富含血小板的血浆的制备；2)脂肪间充质干细胞的分离提取；3)脂肪间充质干细胞的培养；提供了一种安全、稳定、快速、高质量扩增间充质干细胞的培养体系，避免了使用胎牛血清带来的各种弊端，且解决了现有技术中完全培养基的配置费时费力，培养状态容易受单一成分的影响，质量低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是指一种提取及培养间充质干细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞最初在骨髓中发现，目前已经可以从多种组织中分离出间充质干细胞，包括骨膜、松质骨、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐带血中等，因其具有多向分化潜能、支持造血和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。自从2001年发现脂肪来源干细胞以来，由于其具有数量巨大，对患者损伤较小，获取相对容易，更重要的是脂肪间充质干细胞不易受到肿瘤细胞污染，更容易进行体外净化，病人可以用自体细胞，并且移植细胞更易被患者自身组织所接受，更快的整合到自身组织系统以发挥作用，克服来自骨髓或者脐带血所存在诸如难以收集、成本高以及必须通过组织相容性验证发现合适匹配的缺陷，同时避免了一系列的伦理问题和异体细胞的免疫排斥等移植副反应，所以在临床应用上有极大的优势和广阔的前景。
目前，从脂肪组织提取间充质干细胞一般通过水浴酶消化30～60分钟，一次性离心收集单个核细胞，并进行贴壁培养去除红细胞等非贴壁细胞，从而得到较纯的间充质干细胞，然而，这种一次性酶消化得到的间充质干细胞的数量和质量往往不能同时保证，消化时间过短不能从组织中完全解离单个干细胞，消化时间过长，最初解离出的单个干细胞受到消化酶的过渡作用，对细胞状态造成伤害，最终得到的间充质干细胞状态好坏不均，为了防止消化酶的过度作用以得到良好的匀质细胞就必须通过对大量的脂肪组织(一般需要200ml以上)短时间作用，因此，为了保证从脂肪中成功提取间充质干细胞需要大量的脂肪组织，这就需要通过无菌条件下湿性抽脂法抽取200ml以上脂肪，抽脂过程中需要大面积的局部麻醉，并在抽脂部位切一个口，导致患者抽脂面积较大，手术时间较长，出血较多或导致发热现象，如果后期护理不好容易引发炎症对病人造成一定的创伤和痛苦。所以急需改进脂肪间充质干细胞的提取技术，减少脂肪组织的用量，以减少抽脂过程对病人造成的痛苦。
目前，间充质干细胞体外扩增培养体系中一般都含有一定浓度的胎牛血清，使用浓度至少10％才能保证细胞的正常生长传代。然而，间充质干细胞在高浓度血清培养时，随着传代次数增加，细胞增殖能力下降，形态由长梭形变为宽大扁平，逐渐丧失多向分化能力。另外，动物血清可能存在动物携带的潜在病毒或支原体污染，对以后可能的临床应用构成威胁。尽管研究人员尝试了很多的无血清培养基方案，但间充质干细胞在无血清培养基中普遍存在生长缓慢，多向分化能力逐渐消失的问题，为了提高细胞的增殖速度必须通过添加大量的非血清添加剂，例如CNI02634482A(专利申请号201210010246.8，申请公布日2012.08.15)添加了近十种成分，完全培养基的配置费时费力，且培养状态容易受单一成分的影响，至今无血清培养基仍未能获得重大突破。所以，急需开发一种安全、稳定、快速、高质量扩增间充质干细胞的培养体系。
发明内容
本发明提出一种提取及培养间充质干细胞的方法，解决了现有技术必须从200ml以上脂肪组织才能提取干细胞的问题，大大降低了提取成本，同时将病人的创伤降到接近零，二是避免了使用胎牛血清带来的各种弊端，且解决了现有技术中完全培养基的配置费时费力，且培养状态容易受单一成分的影响，质量低的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：一种提取及培养间充质干细胞的方法，包括下列步骤：
1)将150～250ml血液，放在肝素钠抗凝管中，在2～8℃保存；
2)将上述制得的抗凝血1500～2100r/min离心8～12min，血液分层，取上层液体部分得到富含血小板的血浆，将所述富含血小板的血浆在2～8℃下保存1～7天备用或在-75～-85℃下长期保存备用；
3)将5～10mL的脂肪组织静置8～12min后分层，移除下层红细胞聚集区的液体；
4)用添加有抗生素的磷酸盐缓冲液30～40ml重悬脂肪组织，1200～1800r/min离心3～7min洗涤上述去除红细胞后的脂肪组织一次；
5)用质量浓度为0.05～0.15％的I型胶原酶悬浮上述洗涤后的脂肪组织，其中所述胶原酶和所述洗涤后的脂肪组织的体积比为1.5∶1～2.5∶1，混匀后置于37℃水浴中消化，开始计时，并每隔1～3分钟振荡该悬液；
6)上述消化18～22min后，加磷酸盐缓冲液15～30ml稀释，1400～1600r/min/min离心3～7min，未消化好的脂肪组织聚集在上层，吸出未消化好的脂肪组织重复步骤(5)，消化下来的单个细胞沉淀在离心管底部，将中间层液体倒出，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1300～1700r/min离心4～8min，弃上清液，底部细胞加入8～12ml的DMEM培养基，吹打均匀；
7)将步骤6)中第二次消化的脂肪组织于消化后13～17min，加磷酸盐缓冲液20～30ml稀释，1400～1600r/min离心3～7min，未消化好的脂肪组织聚集在上层，吸出未消化好的脂肪组织重复步骤(5)，消化下来的单个细胞沉淀在离心管底部，将中间层液体倒出，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1300～1700r/min离心4～8min，弃上清液，底部细胞加入8～12ml的DMEM培养基，吹打均匀；
8)将步骤7)中第三次消化的脂肪组织于消化后8～12min，加磷酸缓充液20～30ml稀释，1400～1600r/min离心5～7min，倒掉上层脂肪油滴和液体，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1400～1600r/min离心5～7min，底部细胞加入8～12ml的DMEM培养基，吹打均匀；
9)将步骤6)、7)和8)中收集的细胞悬液汇合，1400～1600r/min离心4～6min；弃上清液，加入完全培养基吹打均匀，台盼蓝染色，用计数板计数后，按1×105/mL的密度接种于25cm2培养瓶中，在37℃、5％CO2、95％湿度条件下培养；
10)培养24～48小时后，收集培养瓶中1/2的细胞培养基1400～1600r/min离心4～6min，红细胞沉淀在离心管底部，收集上层培养基并按1∶1的比例添加新配制的完全培养基并替代培养瓶中剩余1/2的培养基，以后每2～3.5天换液，记为P0代。
抗凝血采用的血液选用病人自身的血液，脂肪组织选用腹部脂肪组织。
作为优选的技术方案，所述磷酸盐缓冲液PH为7～7.4，并且所述磷酸盐缓冲液中不含有Ca2+和Mg2+。
作为优选的技术方案，步骤5)中所述胶原酶和所述洗涤后的脂肪组织的体积比为2∶1。
作为对上述技术方案的改进，将培养的所述P0代细胞达到80～90％汇合时，以质量浓度0.25％的胰酶和质量浓度0.02％的EDTA消化细胞，按1∶3比例传代到75cm2培养瓶中，并标记为P1，8ml培养基/瓶，第二天按4ml原培养基：7ml新培养基的比例换液，最终总培养基达12ml，扩增用培养基：基础培养基α-MEM，含有5％的富含血小板的血浆、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、0.5μg/ml庆大霉素，从P1代开始传代采用高比例传代方法：从原来的1∶3改为1∶6，并换用细胞工厂进行培养。
作为优选的技术方案，所述细胞工厂为Corning的多层细胞培养器。
作为优选的技术方案，所述完全培养基为基础培养基α-MEM，含有5％的富含血小板的血浆、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、0.5μg/ml庆大霉素。
脂肪间充质干细胞的鉴定
(1)脂肪间充质干细胞的形态特征：倒置相差显微镜下观察培养的细胞呈梭形的成纤维细胞样，局部呈漩涡状(如图1所示)。
(2)人脂肪间充质干细胞的表型检测：用直接免疫荧光法检测以上得到的梭形细胞的表面标志的表达，细胞用藻红蛋白(PE)CD44和异硫氰酸荧光素(FITC)CD34标记后进行流式检测，流式细胞仪为BD FACScan(BectonDickinson)。结果表明这种梭形细胞表达间充质干细胞的表面标志CD44，不表达造血干细胞的表面标志CD34(如图2所示)。
(3)人脂肪间充质干细胞向脂肪细胞分化及油红O染色检测
细胞传至第3代时将其以2X107/L的细胞数转入成脂诱导培养基中进行培养。诱导培养后不同时间段，对成脂诱导组进行油红O脂肪颗粒染色。成脂诱导培养基包含：基础培养基DMEM，10％胎牛血清、0.5mM IBMX(isobulyl-1-methylxanthione)、0.1mM消炎痛、1uM地塞米松。在第6天、第12天和第16天分别进行油红O染色。结果显示：培养12天可见到折光度增加的液泡充满整个细胞；油红O染色发现培养中约60～80％细胞富含脂肪滴(如图3A所示)。说明干细胞亚群可在体外诱导分化成脂肪细胞。
(4)人脂肪间充质干细胞向骨细胞分化及茜素红染色检测
取第三代人间充质干细胞，培养在6孔板中，待细胞长到80％左右时换用成骨诱导液培养，诱导液的成分包含：基础培养基DMEM，10％胎牛血清、10Mmβ-磷酸甘油、0.1mM抗坏血酸磷酸盐Vc、0.1uM地塞米松。每三天换液，培养3周，于2周、3周分别进行茜素红染色观察。结果显示：成骨诱导培养中细胞形态由原来的梭形变成了立方形，随着细胞生长密度的增长形成多层的结节结构，而对照组中细胞仍是梭形且呈单层生长；2周之后已有矿化结节形成了，3周后结节比较多，染色比较明显(如图3B所示)。说明干细胞亚群可在体外诱导分化为成骨细胞。
由于采用了上述技术方案，一种培养间充质干细胞的方法，包括步骤：
1)将150～250ml血液，放在肝素钠抗凝管中，在2～8℃保存；2)将上述制得的抗凝血1500～2100r/min离心8～12min，血液分层，取上层液体部分得到富含血小板的血浆，将所述富含血小板的血浆在2～8℃下保存1～7天备用或在-75～-85℃下长期保存备用；3)将5～10mL的脂肪组织静置8～12min后分层，移除下层红细胞聚集区的液体；4)用添加有抗生素的磷酸盐缓冲液30～40ml重悬脂肪组织，1200～1800r/min离心3～7min洗涤上述去除红细胞后的脂肪组织一次；5)用质量浓度为0.05～0.15％的I型胶原酶悬浮上述洗涤后脂肪组织，其中所述胶原酶和所述洗涤后的脂肪组织的体积比为1.5∶1～2.5∶1，混匀后置于37℃水浴中消化，开始计时，并每隔1～3分钟振荡该悬液；6)上述消化18～22min后，加磷酸盐缓冲液15～30ml稀释，1400～1600r/min离心3～7min，未消化好的脂肪组织聚集在上层，吸出未消化好的脂肪组织重复步骤(5)，消化下来的单个细胞沉淀在离心管底部，将中间层液体倒出，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1300～1700r/min离心4～8min，弃上清液，底部细胞加入8～12ml的DMEM培养基，吹打均匀；7)将步骤6)中第二次消化的脂肪组织于消化后13～17min，加磷酸盐缓冲液20～30ml稀释，1400～1600r/min离心3～7min，未消化好的脂肪组织聚集在上层，吸出未消化好的脂肪组织重复步骤(5)，消化下来的单个细胞沉淀在离心管底部，将中间层液体倒出，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1300～1700r/min离心4～8min，弃上清液，底部细胞加入8～12ml的DMEM培养基，吹打均匀；8)将步骤7)中第三次消化的脂肪组织于消化后8～12min，加磷酸盐缓充液20～30ml稀释，1400～1600r/min离心5～7min，倒掉上层脂肪油滴和液体，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1400～1600r/min离心5～7min，底部细胞加入8～12ml的DMEM培养基，吹打均匀；9)将步骤6)、7)和8)中收集的细胞悬液汇合，1400～1600r/min离心4～6min；弃上清液，加入完全培养基吹打均匀，台盼蓝染色，用计数板计数后，按1×105/mL的密度接种于25cm2培养瓶中，在37℃、5％CO2、95％湿度条件下培养；10)培养24～48小时后，收集培养瓶中1/2的细胞培养基1400～1600r/min离心4～6min，红细胞沉淀在离心管底部，收集上层培养基并按1∶1的比例添加新配制的完全培养基并替代培养瓶中剩余1/2的培养基完，以后每2～3.5天换液，记为P0代；本发明的技术方案提供了一种安全、稳定、快速、高质量扩增间充质干细胞的培养体系。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明人脂肪间充质干细胞的形态特征图；
图2为本发明人脂肪间充质干细胞的表型检测图；
图3为本发明人脂肪间充质干细胞向脂肪细胞分化及油红O染色检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种提取及培养间充质干细胞的方法，包括下列步骤：
1)将150～250ml血液，放在肝素钠抗凝管中，在2～8℃保存；
2)将上述制得的抗凝血1500～2100r/min离心8～12min，血液分层，取上层液体部分得到富含血小板的血浆，将所述富含血小板的血浆在2～8℃下保存1～7天备用或在-75～-85℃下长期保存备用；
3)将5～10mL的脂肪组织静置8～12min后分层，移除下层红细胞聚集区的液体；
4)用添加有抗生素的磷酸盐缓冲液30～40ml重悬脂肪组织，1200～1800r/min离心3～7min洗涤上述去除红细胞后的脂肪组织一次；
5)用质量浓度为0.05～0.15％的I型胶原酶悬浮上述洗涤后脂肪组织，其中所述胶原酶和所述洗涤后的脂肪组织的体积比为1.5∶1～2.5∶1，混匀后置于37℃水浴中消化，开始计时，并每隔1～3分钟振荡该悬液；
6)上述消化18～22min后，加磷酸盐缓冲液15～30ml稀释，1400～1600r/min离心3～7min，未消化好的脂肪组织聚集在上层，吸出未消化好的脂肪组织重复步骤(5)；消化下来的单个细胞沉淀在离心管底部，将中间层液体倒出，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1300～1700r/min离心4～8min，弃上清液，底部细胞加入8～12ml的DMEM培养基，吹打均匀；
7)将步骤6)中第二次消化的脂肪组织于消化后13～17min，加磷酸盐缓冲液20～30ml稀释，1400～1600r/min离心3～7min，未消化好的脂肪组织聚集在上层，吸出未消化好的脂肪组织重复步骤(5)；消化下来的单个细胞沉淀在离心管底部，将中间层液体倒出，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1300～1700r/min离心4～8min，弃上清液，底部细胞加入8～12ml的DMEM培养基，吹打均匀；
8)将步骤7)中第三次消化的脂肪组织于消化后8～12min，加磷酸盐缓充液20～30ml稀释，1400～1600r/min离心5～7min，倒掉上层脂肪油滴和液体，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1400～1600r/min离心5～7min，底部细胞加入8～12ml的DMEM培养基，吹打均匀；
9)将步骤6)、7)和8)中收集的细胞悬液汇合，1400～1600r/min离心4～6minn弃上清液，加入完全培养基吹打均匀，台盼蓝染色，用计数板计数后，按1×105/mL的密度接种于25cm2培养瓶中，在37℃、5％CO2、95％湿度条件下培养；
10)培养24～48小时后，收集培养瓶中1/2的细胞培养基1400～1600r/min离心4～6min，红细胞沉淀在离心管底部，收集上层培养基并按1∶1的比例添加新配制的完全培养基并替代培养瓶中剩余1/2的培养基完，以后每2～3.5天换液，记为P0代。
所述磷酸盐缓冲液PH为7～7.4，并且所述磷酸盐缓冲液中不含有Ca2+和Mg2+。
步骤5)中所述胶原酶和所述洗涤后的脂肪组织的体积比为2∶1。
将培养的所述P0代细胞达到80～90％汇合时，以质量浓度0.25％的胰酶和质量浓度0.02％的EDTA消化细胞，按1∶3比例传代到75cm2培养瓶中，并标记为P1，8ml培养基/瓶，第二天按4ml原培养基：7ml新培养基的比例换液，最终总培养基达12ml，扩增用培养基：基础培养基α-MEM，含有5％的富含血小板的血浆、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、0.5μg/ml庆大霉素，从P1代开始传代采用高比例传代方法：从原来的1∶3改为1∶6，并换用细胞工厂进行培养。
所述细胞工厂为Corning的多层细胞培养器。
所述完全培养基为基础培养基α-MEM，含有5％的富含血小板的血浆、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、100U/ml的青-链霉素、0.5μg/ml庆大霉素。
实施例一
一种提取及培养间充质干细胞的方法，包括下列步骤：
1)将150ml血液，放在肝素钠抗凝管中，在2-8℃保存；
2)将上述制得的抗凝血1500r/min离心8min，血液分层，取上层液体部分得到富含血小板的血浆，将所述富含血小板的血浆在2℃下保存1天备用或在-75℃下长期保存备用；
3)将5mL的脂肪组织静置8min后分层，移除下层红细胞聚集区的液体；
4)用添加有抗生素的磷酸盐缓冲液30ml重悬脂肪组织，1200r/min离心3min洗涤上述去除红细胞后的脂肪组织一次；
5)用质量浓度为0.05％的I型胶原酶悬浮上述洗涤后脂肪组织，其中所述胶原酶和所述洗涤后的脂肪组织的体积比为2.5∶1，混匀后置于37℃水浴中消化，开始计时，并每隔3分钟振荡该悬液；
6)上述消化18min后，加磷酸盐缓冲液30ml稀释，1400r/min离心3min，未消化好的脂肪组织聚集在上层，吸出未消化好的脂肪组织重复步骤(5)；消化下来的单个细胞沉淀在离心管底部，将中间层液体倒出，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1300r/min离心4min，弃上清液，底部细胞加入8ml的DMEM培养基，吹打均匀；
7)将步骤6)中第二次消化的脂肪组织于消化后13min，加磷酸盐缓冲液20ml稀释，1400r/min离心3min，未消化好的脂肪组织聚集在上层，吸出未消化好的脂肪组织重复步骤(5)；消化下来的单个细胞沉淀在离心管底部，将中间层液体倒出，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1300r/min离心4min，弃上清液，底部细胞加入8ml的DMEM培养基，吹打均匀；
8)将步骤7)中第三次消化的脂肪组织于消化后8min，加磷酸盐缓充液20ml稀释，1400r/min离心5min，倒掉上层脂肪油滴和液体，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1400r/min离心5min，底部细胞加入8ml的DMEM培养基，吹打均匀；
9)将步骤6)、7)和8)中收集的细胞悬液汇合，1400r/min离心4min；弃上清液，加入完全培养基吹打均匀，台盼蓝染色，用计数板计数后，按1×105/mL的密度接种于25cm2培养瓶中，在37℃、体积含量5％CO2、95％湿度条件下培养；
10)培养24小时后，收集培养瓶中1/2的细胞培养基1400r/min离心4min，红细胞沉淀在离心管底部，收集上层培养基并按1∶1的比例添加新配制的完全培养基并替代培养瓶中剩余1/2的培养基完，以后每2～3.5天换液，记为P0代。
所述磷酸盐缓冲液PH为7，并且所述磷酸盐缓冲液中不含有Ca2+和Mg2+。
步骤5)中所述胶原酶和所述洗涤后的脂肪组织的体积比为2∶1。
将培养的所述P0代细胞达到80～90％汇合时，以质量浓度0.25％的胰酶和质量浓度0.02％的EDTA消化细胞，按1∶3比例传代到75cm2培养瓶中，并标记为P1，8ml培养基/瓶，第二天按4ml原培养基：7ml新培养基的比例换液，最终总培养基达12ml，扩增用培养基：基础培养基α-MEM，含有5％的富含血小板的血浆、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、0.5μg/ml庆大霉素，从P1代开始传代采用高比例传代方法：从原来的1∶3改为1∶6，并换用细胞工厂进行培养。
所述细胞工厂为Corning的多层细胞培养器。
所述完全培养基为基础培养基α-MEM，含有5％的富含血小板的血浆、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、100U/ml的青-链霉素、0.5μg/ml庆大霉素。
实施例二
一种提取及培养间充质干细胞的方法，包括下列步骤：
1)将200ml血液，放在肝素钠抗凝管中，在2-8℃保存；
2)将上述制得的抗凝血1700r/min离心10min，血液分层，取上层液体部分得到富含血小板的血浆，将所述富含血小板的血浆在6℃下保存4天备用或在-80℃下长期保存备用；
3)将7mL的脂肪组织静置10min后分层，移除下层红细胞聚集区的液体；
4)用添加有抗生素的磷酸盐缓冲液35ml重悬脂肪组织，1600r/min离心5min洗涤上述去除红细胞后的脂肪组织一次；
5)用质量浓度为0.1％的I型胶原酶悬浮上述洗涤后脂肪组织，其中所述胶原酶和所述洗涤后的脂肪组织的体积比为2∶1，混匀后置于37℃水浴中消化，开始计时，并每隔2分钟振荡该悬液；
6)上述消化20min后，加磷酸盐缓冲液25ml稀释，1500r/m离心5min，吸出上层未消化好的脂肪组织，未消化好的脂肪组织聚集在上层，吸出未消化好的脂肪组织重复步骤(5)；消化下来的单个细胞沉淀在离心管底部，将中间层液体倒出，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1500r/m离心6min，弃上清液，底部细胞加入10ml的DMEM培养基，吹打均匀；
7)将步骤6)中第二次消化的脂肪组织于消化后15min，加磷酸盐缓冲液25ml稀释，1500r/m离心5min，未消化好的脂肪组织聚集在上层，吸出未消化好的脂肪组织重复步骤(5)；消化下来的单个细胞沉淀在离心管底部，将中间层液体倒出，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1500r/min离心6min，弃上清液，底部细胞加入10ml的DMEM培养基，吹打均匀；
8)将步骤7)中第三次消化的脂肪组织于消化后10min，加磷酸盐缓充液25ml稀释，1500r/m离心6min，倒掉上层脂肪油滴和液体，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1500r/min离心6min，底部细胞加入10ml的DMEM培养基，吹打均匀；
9)将步骤6)、7)和8)中收集的细胞悬液汇合，1500r/min离心5min；弃上清液，加入完全培养基吹打均匀，台盼蓝染色，用计数板计数后，按1×105/mL的密度接种于25cm2培养瓶中，在37℃、体积含量5％CO2、95％湿度条件下培养；
10)培养24～48小时后，收集培养瓶中1/2的细胞培养基1400～1600r/min离心4～6min，红细胞沉淀在离心管底部，收集上层培养基并按1∶1的比例添加新配制的完全培养基并替代培养瓶中剩余1/2的培养基完，以后每2～3.5天换液，记为P0代。
所述磷酸盐缓冲液PH为7.2，并且所述磷酸盐缓冲液中不含有Ca2+和Mg2 + 。
步骤5)中所述胶原酶和所述洗涤后的脂肪组织的体积比为2∶1。
将培养的所述P0代细胞达到80～90％汇合时，以质量浓度0.25％的胰酶和质量浓度0.02％的EDTA消化细胞，按1∶3比例传代到75cm2培养瓶中，并标记为P1，8ml培养基/瓶，第二天按4ml原培养基：7ml新培养基的比例换液，最终总培养基达12ml，扩增用培养基：基础培养基α-MEM，含有5％的富含血小板的血浆、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、0.5μg/ml庆大霉素，从P1代开始传代采用高比例传代方法：从原来的1∶3改为1∶6，并换用细胞工厂进行培养。
所述细胞工厂为Corning的多层细胞培养器。
所述完全培养基为基础培养基α-MEM，含有5％的富含血小板的血浆、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、100U/ml的青-链霉素、0.5μg/ml庆大霉素。
实施例三
一种提取及培养间充质干细胞的方法，包括下列步骤：
1)将250ml血液，放在肝素钠抗凝管中，在8℃保存；
2)将上述制得的抗凝血2100r/min离心12min，血液分层，取上层液体部分得到富含血小板的血浆，将所述富含血小板的血浆在8℃下保存7天备用或在-85℃下长期保存备用；
3)将10mL的脂肪组织静置12min后分层，移除下层红细胞聚集区的液体；
4)用添加有抗生素的磷酸盐缓冲液40ml重悬脂肪组织，1800r/min离心7min洗涤上述去除红细胞后的脂肪组织一次；
5)用质量浓度为0.15％的I型胶原酶悬浮上述洗涤后脂肪组织，其中所述胶原酶和所述洗涤后的脂肪组织的体积比为2.5∶1，混匀后置于39℃水浴中消化，开始计时，并每隔3分钟振荡该悬液；
6)上述消化22min后，加磷酸盐缓冲液30ml稀释，1600r/min离心7min，未消化好的脂肪组织聚集在上层，吸出未消化好的脂肪组织重复步骤(5)；消化下来的单个细胞沉淀在离心管底部，将中间层液体倒出，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1700r/min离心8min，弃上清液，底部细胞加入12ml的DMEM培养基，吹打均匀；
7)将步骤6)中第二次消化的脂肪组织于消化后17min，加磷酸盐缓冲液30ml稀释，1600r/m离心7min，未消化好的脂肪组织聚集在上层，吸出未消化好的脂肪组织重复步骤(5)；消化下来的单个细胞沉淀在离心管底部，将中间层液体倒出，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1700r/min离心8min，弃上清液，底部细胞加入12ml的DMEM培养基，吹打均匀；
8)将步骤7)中第三次消化的脂肪组织于消化后12min，加磷酸盐缓充液(30m1)稀释，1600r/m离心7min，倒掉上层脂肪油滴和液体，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1600r/min离心7min，底部细胞加入12ml的DMEM培养基，吹打均匀；
9)将步骤6)、7)和8)中收集的细胞悬液汇合，1600r/m离心6min；弃上清液，加入完全培养基吹打均匀，台盼蓝染色，用计数板计数后，按1×105/mL的密度接种于25cm2培养瓶中，在37℃、体积含量5％CO2、95％湿度条件下培养；
10)培养24～48小时后，收集培养瓶中1/2的细胞培养基1600r/m离心4～6min，红细胞沉淀在离心管底部，收集上层培养基并按1∶1的比例添加新配制的完全培养基并替代培养瓶中剩余1/2的培养基完，以后每2～3.5天换液，记为P0代。
所述磷酸盐缓冲液PH为7.4，并且所述磷酸盐缓冲液中不含有Ca2+和Mg2+。
步骤5)中所述胶原酶和所述洗涤后的脂肪组织的体积比为2.5∶1。
将培养的所述P0代细胞达到80～90％汇合时，以质量浓度0.25％的胰酶和质量浓度0.02％的EDTA消化细胞，按1∶3比例传代到75cm2培养瓶中，并标记为P1，8ml培养基/瓶，第二天按4ml原培养基：7ml新培养基的比例换液，最终总培养基达12ml，扩增用培养基：基础培养基α-MEM，含有5％的富含血小板的血浆、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、0.5μg/ml庆大霉素，从P1代开始传代采用高比例传代方法：从原来的1∶3改为1∶6，并换用细胞工厂进行培养。
所述细胞工厂为Corning的多层细胞培养器。
所述完全培养基为基础培养基α-MEM，含有5％的富含血小板的血浆、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、100U/ml的青-链霉素、0.5μg/ml庆大霉素。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种提取及培养间充质干细胞的方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)将150～250ml血液，放在肝素钠抗凝管中，在2～8℃保存；
2)将上述制得的抗凝血1500～2100r/min离心8～12min，血液分层，取上层液体部分得到富含血小板的血浆，将所述富含血小板的血浆在2～8℃下保存1～7天备用或在-75～-85℃下长期保存备用；
3)将5～10mL的脂肪组织静置8～12min后分层，移除下层红细胞聚集区的液体；
4)用添加有抗生素的磷酸盐缓冲液30～40ml重悬脂肪组织，1200～1800r/min离心3～7min洗涤上述去除红细胞后的脂肪组织一次；
5)用质量浓度为0.05～0.15％的I型胶原酶悬浮上述洗涤后脂肪组织，其中所述胶原酶和所述洗涤后的脂肪组织的体积比为1.5∶1～2.5∶1，混匀后置于37℃水浴中消化，开始计时，并每隔1～3分钟振荡该悬液；
6)上述消化18～22min后，加磷酸盐缓冲液20～30ml稀释，1400～1600r/min离心3～7min，未消化好的脂肪组织聚集在上层，吸出未消化好的脂肪组织重复步骤(5)；消化下来的单个细胞沉淀在离心管底部，将中间层液体倒出，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1300～1700r/min离心4～8min，弃上清液，底部细胞加入8～12ml的DMEM培养基，吹打均匀；
7)将步骤6)中第二次消化的脂肪组织于消化后13～17min，加磷酸盐缓冲液20～30ml稀释，1400～1600r/min离心3～7min，未消化好的脂肪组织聚集在上层，吸出未消化好的脂肪组织重复步骤(5)；消化下来的单个细胞沉淀在离心管底部，将中间层液体倒出，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1300～1700r/min离心4～8min，弃上清液，底部细胞加入8～12ml的DMEM培养基，吹打均匀；
8)将步骤7)中第三次消化的脂肪组织于消化后8～12min，加磷酸盐缓充液20～30ml稀释，1400～1600r/min离心5～7min，倒掉上层脂肪油滴和液体，下层沉淀加DMEM悬浮，100目筛网过滤去除杂质，1400～1600r/min离心5～7min，底部细胞加入8～12ml的DMEM培养基，吹打均匀；
9)将步骤6)、7)和8)中收集的细胞悬液汇合，1400～1600r/min离心4～6min；弃上清液，加入完全培养基吹打均匀，台盼蓝染色，用计数板计数后，按1×105/mL的密度接种于25cm2培养瓶中，在37℃、体积含量5％CO2、95％湿度条件下培养；
10)培养24～48小时后，收集培养瓶中1/2的细胞培养基1400～1600r/min离心4～6min，红细胞沉淀在离心管底部，收集上层培养基并按1∶1的比例添加新配制的完全培养基以替代培养瓶中剩余1/2的培养基完，以后每2～3.5天换液，记为P0代。
2.如权利要求1所述的一种提取及培养间充质干细胞的方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液PH为7～7.4，并且所述磷酸盐缓冲液中不含有Ca2+和Mg2+。
3.如权利要求1所述的一种提取及培养间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤5)中所述胶原酶和所述洗涤后的脂肪组织的体积比为2∶1。
4.如权利要求1所述的一种提取及培养间充质干细胞的方法，其特征在于：将培养的所述P0代细胞达到80～90％汇合时，以质量浓度0.25％的胰酶和质量浓度0.02％的EDTA消化细胞，按1∶3比例传代到75cm2培养瓶中，并标记为P1，8ml培养基/瓶，第二天按4ml原培养基：7ml新培养基的比例换液，最终总培养基达12ml，扩增用培养基：基础培养基α-MEM，含有5％的富含血小板的血浆、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、0.5μg/ml庆大霉素，从P1代开始传代采用高比例传代方法：从原来的1∶3改为1∶6，并换用细胞工厂进行培养。
5.如权利要求4所述的一种提取及培养间充质干细胞的方法，其特征在于：所述细胞工厂为Corning的多层细胞培养器。
6.如权利要求1所述的一种提取及培养间充质干细胞的方法，其特征在于：所述完全培养基为基础培养基α-MEM，含有5％的富含血小板的血浆、10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、0.5μg/ml庆大霉素。
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