CN110343661B - 一种人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，包含人体脂肪干细胞的提取步骤和人体脂肪干细胞的培养扩增步骤；人体脂肪干细胞的提取通过人脂肪消化液实现，所述的人脂肪消化液包含：胆酸、甘氨酸、α1‑抗胰蛋白酶、二甲基亚砜、0.9%生理盐水、氯化镁、氯化胆碱、Trypsin‑EDTA；人体脂肪干细胞的培养扩增通过脂肪干细胞培养基实现，所述的脂肪干细胞培养基包含：DMEM/F12基础培养基、甲状腺素、胰岛素、谷氨酰胺、葡萄酸铁、硒酸钠、维生素C、成纤维细胞生长因子、L‑脯氨酸、氯化胆碱、青霉素；本发明所述人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，可显著提高所获得的干细胞的数量、成活率和活性。

Description

一种人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法。
背景技术
干细胞是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的原始细胞，在特定条件下，还可以增殖并定向分化成不同的功能细胞。因此干细胞的研究对生命体各个组织器官的更新和损伤修复有重要意义，逐渐成为许多无法治愈的疾病，特别是细胞及组织缺失或损伤性疾病的唯一希望。而脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)、ADSC多能细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。主要恢复组织细胞的修复功能，促进细胞的再生，恢复年轻面容的同时，身体机能也得到充分改善，有效改善亚健康、早衰等疾病，由内而外真正的有效抵抗衰老。
目前常用的脂肪干细胞的分离培养方法是从脂肪组织分离获取细胞，经机械和酶处理方法除去红细胞等成熟细胞后，利用饲养层细胞与采用含10％胎牛血清的培养基进行培养。这种培养干细胞方法的缺点是方法复杂，提取的干细胞数量少，纯度不高，继代增殖缓慢。现有常规培养技术采用外源血清(如胎牛血清)促进脂肪干细胞增殖，此种技术虽然能达到增殖目的，但是原代培养费时较长，且外源血清其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。
因此，需要寻求一种可有效提取和培养扩增人体脂肪干细胞的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，所述人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法可显著提高所获得的干细胞的数量、成活率。
本发明所要解决的上述技术问题，通过如下技术方案予以实现：
一种人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，包含如下步骤：人体脂肪干细胞的提取步骤和人体脂肪干细胞的培养扩增步骤。
作为一种优选方案，人体脂肪干细胞的提取通过一种人脂肪消化液实现，所述的人脂肪消化液包含：0.3～0.8mg/ml胆酸、0.5～1.5mg/ml甘氨酸、0.5～2.5mg/mlα1-抗胰蛋白酶、3～25μl/ml二甲基亚砜、175～220mg/mL 0.9％生理盐水、60～85mg/ml氯化镁、10～30mg/mL氯化胆碱、2.5～7.5mg/ml Trypsin-EDTA。
作为一种优选方案，人体脂肪干细胞的提取通过一种人脂肪消化液实现，所述的人脂肪消化液包含：0.5～0.7mg/ml胆酸、0.8～1.2mg/ml甘氨酸、1～2mg/mlα1-抗胰蛋白酶、10～18μl/ml二甲基亚砜、200～210mg/mL 0.9％生理盐水、70～80mg/ml氯化镁、15～25mg/mL氯化胆碱、4～6mg/ml Trypsin-EDTA。
作为一种优选方案，人体脂肪干细胞的提取通过一种人脂肪消化液实现，所述的人脂肪消化液包含：0.6mg/ml胆酸、1mg/ml甘氨酸、1.5mg/mlα1-抗胰蛋白酶、15μl/ml二甲基亚砜、205mg/mL 0.9％生理盐水、75mg/ml氯化镁、20mg/mL氯化胆碱、5mg/ml Trypsin-EDTA。
作为一种优选方案，所述的人体脂肪干细胞的培养扩增通过一种脂肪干细胞培养基实现，所述的脂肪干细胞培养基包含：DMEM/F12基础培养基、8～20μg/ml甲状腺素、5～10μg/ml胰岛素、8～12mmol/L谷氨酰胺、100～300ng/ml葡萄酸铁、10～25mg/ml硒酸钠、5～18mg/ml维生素C、20～30mg/ml成纤维细胞生长因子、5～13mg/ml L-脯氨酸、0.5～4.5mg/ml氯化胆碱、1～2mg/ml青霉素。
作为一种优选方案，所述的人体脂肪干细胞的培养扩增通过一种脂肪干细胞培养基实现，所述的脂肪干细胞培养基包含：DMEM/F12基础培养基、12～16μg/ml甲状腺素、6～9μg/ml胰岛素、9～11mmol/L谷氨酰胺、150～250ng/ml葡萄酸铁、15～20mg/ml硒酸钠、10～15mg/ml维生素C、22～28mg/ml成纤维细胞生长因子、7～10mg/ml L-脯氨酸、1～3.5mg/ml氯化胆碱、1.2～1.8mg/ml青霉素。
作为一种优选方案，所述的人体脂肪干细胞的培养扩增通过一种脂肪干细胞培养基实现，所述的脂肪干细胞培养基包含：DMEM/F12基础培养基、14μg/ml甲状腺素、8μg/ml胰岛素、10mmol/L谷氨酰胺、200ng/ml葡萄酸铁、18mg/ml硒酸钠、12mg/ml维生素C、25mg/ml成纤维细胞生长因子、9mg/ml L-脯氨酸、2.5mg/ml氯化胆碱、1.5mg/ml青霉素。
作为一种优选方案，人体脂肪干细胞的提取通过包含如下步骤的方法实现：
将人脂肪组织置于入离心分离装置中，再加入生理盐水置完全浸没后充分搅拌均匀，使用离心装置分离人体脂肪组织，得上层油层、中层脂肪层、下层沉积层；将中层脂肪层置于离心分离装置中，添加等体积的人脂肪消化液混合均匀，离心分离后去浮游脂肪并取上层液体，再向上层液体中加入Dulbecco’s磷酸盐缓冲液，然后离心，取下层沉积细胞，使用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液重复离心洗涤2次，下层沉积细胞即为人体脂肪干细胞；将下层沉积层置于离心分离装置中，加入等体积的脂肪组织消化剂混合均匀，离心后的下层沉积细胞即为人脂肪干细胞；最后将中层脂肪层得到的人体脂肪干细胞与下层沉积层得到的人体脂肪干细胞合并。
作为一种优选方案，人体脂肪干细胞的培养扩增通过包含如下步骤的方法实现：取第13～16代传代人脂肪干细胞以1.5×104/cm2的密度接种于含DMEM/F12基础培养基的培养瓶中，在设定培养条件，培养一段时间后；然后更换为本发明所述干细胞培养基，控制培养条件，继续培养，得扩增后的人体脂肪干细胞。
作为一种优选方案，所述人体脂肪干细胞的培养扩增条件为：先在DMEM/F12基础培养基的培养瓶中，35～38℃下，5～7％CO2培养10～15小时；然后更换为本发明所述干细胞培养基，35～38℃下，5～7％CO2继续培养30～35小时。
有益效果：本发明所述人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，在人体脂肪干细胞的提取过程中，采用所述通过合理配比的人脂肪消化液，可显著提高所提取得到的干细胞的数量、成活率；另外，在人体脂肪干细胞的培养扩增过程中，通过采用所述经过科学配比的脂肪干细胞培养基，可有效提高所获得的脂肪干细胞的数量、成活率及活性；本发明所述的人脂肪消化液和脂肪干细胞培养基，都是一个有机的整体，各组分之间会产生协同效应，可显著提升所获得的脂肪干细胞的数量、成活率。
附图说明
图1为一种人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法的效果示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1人体脂肪干细胞的提取方法
人脂肪消化液包含：0.6mg/ml胆酸、1mg/ml甘氨酸、1.5mg/mlα1-抗胰蛋白酶、15μl/ml二甲基亚砜、205mg/mL 0.9％生理盐水、75mg/ml氯化镁、20mg/mL氯化胆碱、5mg/mlTrypsin-EDTA。
人体脂肪干细胞的提取通过包含如下步骤的方法实现：
将人脂肪组织置于入离心分离装置中，再加入生理盐水置完全浸没后充分搅拌均匀，使用离心装置分离人体脂肪组织，得上层油层、中层脂肪层、下层沉积层；将中层脂肪层置于离心分离装置中，添加等体积的人脂肪消化液混合均匀，离心分离后去浮游脂肪并取上层液体，再向上层液体中加入Dulbecco’s磷酸盐缓冲液，然后离心，取下层沉积细胞，使用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液重复离心洗涤2次，下层沉积细胞即为人体脂肪干细胞；将下层沉积层置于离心分离装置中，加入等体积的脂肪组织消化剂混合均匀，离心后的下层沉积细胞即为人脂肪干细胞；最后将中层脂肪层得到的人体脂肪干细胞与下层沉积层得到的人体脂肪干细胞合并。
实施例2人体脂肪干细胞的培养扩增方法
脂肪干细胞培养基包含：DMEM/F12基础培养基、14μg/ml甲状腺素、8μg/ml胰岛素、10mmol/L谷氨酰胺、200ng/ml葡萄酸铁、18mg/ml硒酸钠、12mg/ml维生素C、25mg/ml成纤维细胞生长因子、9mg/ml L-脯氨酸、2.5mg/ml氯化胆碱、1.5mg/ml青霉素。
人体脂肪干细胞的培养扩增通过包含如下步骤的方法实现：
取第15代传代人脂肪干细胞以1.5×104/cm2的密度接种于含DMEM/F12基础培养基的培养瓶中，37℃下，6％CO2培养13小时，更换为本发明所述干细胞培养基，37℃下，6％CO2继续培养34小时。
对比例1
对比例1与实施例1的不同之处在于，人脂肪消化液中不添加氯化胆碱，其余组分与实施例1相同；人体脂肪干细胞的提取步骤与实施例1相同。
对比例2
对比例2与实施例1的不同之处在于，人脂肪消化液中不添加胆酸，其余组分与实施例1相同；人体脂肪干细胞的提取步骤与实施例1相同。
对比例3
对比例3与实施例1的不同之处在于，人脂肪消化液中不添加甘氨酸，其余组分与实施例1相同；人体脂肪干细胞的提取步骤与实施例1相同。
对比例4
对比例4与实施例2的不同之处在于，脂肪干细胞培养基为DMEM/F12基础培养基，不添加其余成分；人体脂肪干细胞的培养扩增步骤与实施例1相同。
对比例5
对比例5与实施例1的不同之处在于，脂肪干细胞培养基中不添加氯化胆碱，其余组分与实施例1相同；人体脂肪干细胞的培养扩增步骤与实施例1相同。
对比例6
对比例6与实施例1的不同之处在于，人体脂肪干细胞的培养扩增条件与实施例1不同，对比例6的培养条件为：先在DMEM/F12基础培养基的培养瓶中，30℃下，4％CO2培养8小时；然后更换为本发明所述干细胞培养基，32℃下，4％CO2继续培养25小时。
对比例7
对比例7与实施例1的不同之处在于，人体脂肪干细胞的培养扩增条件与实施例1不同，对比例6的培养条件为：先在DMEM/F12基础培养基的培养瓶中，40℃下，8％CO2培养18小时；然后更换为本发明所述干细胞培养基，40℃下，8％CO2继续培养38小时。
实施例1与对比例1～3脂肪干细胞的数量对比：
分别按实施例1与对比例1～3的方法提取脂肪干细胞，重复3次，每次进行5个样本的提取，统计细胞数量以及成活率，结果见表1所示。
表1脂肪干细胞数量对比
组别 总数×10<sup>6</sup> 活细胞数×10<sup>6</sup> 成活率(％)
实施例1 2.57 2.44 0.95
对比例1 1.64 1.39 0.85
对比例2 1.58 1.27 0.80
对比例3 1.61 1.35 0.84
由表1数据可见，实施例1的人体脂肪干细胞提取方法最佳，所得人体脂肪干细胞数量最多且成活率最高；从实施例1与对比例1的对比可看出，若人脂肪消化液中不添加氯化胆碱，所得人体脂肪干细胞数量及细胞成活率会有所下降；由实施例1与对比例2可见，若人脂肪消化液中不添加胆酸，所得人体脂肪干细胞数量及细胞成活率会降低；从实施例1与对比例3可得，若人脂肪消化液中不添加甘氨酸，所得人体脂肪干细胞数量及细胞成活率也有所降低。本发明所述的人脂肪消化液的每种组分及含量均经过科学合理配比，作为一个有机整体，各组分之间会产生协同效应，可有效提高所提取得到的人体脂肪干细胞的数量、成活率。
实施例2与对比例4～7人体脂肪干细胞的增长率比较：
分别计算实施例2与对比例4～7在培养扩增前后的干细胞浓度，计算出实施例2与对比例4～7的脂肪干细胞增殖率(％)，脂肪干细胞增殖率＝(扩增后脂肪干细胞浓度-扩增前脂肪干细胞浓度)/扩增前脂肪干细胞浓度×100％，结果见图1所示。
由图1可知，实施例2的人体脂肪干细胞的培养扩增技术方案最佳，人体脂肪干细胞的增殖率最高；由实施例2与对比例4可见，若脂肪干细胞培养基为DMEM/F12基础培养基，不添加其余成分，所得人体脂肪干细胞的增殖率较实施例1低；从实施例2与对比例5的可看出，若脂肪干细胞培养基中不添加氯化胆碱，所得人体脂肪干细胞的增殖率较实施例1低，但比对比例4要高；由实施例2与对比例6～7可得，若人体脂肪干细胞的培养扩增条件与实施例1不同，所得的人体干细胞增殖率也要差于实施例2。本发明所述的脂肪干细胞培养基的每种组分及含量均通过科学合理配比，作为一个有机整体，各组分之间会产生协同效应，可有效提高了所培养扩增的脂肪干细胞增殖率；此外，人体脂肪干细胞的培养扩增条件也经过长期试验得到，其中实施例2的培养扩增条件最佳，本发明所述的人体干细胞培养基在实施例2所述的培养扩增条件下可显著提高人体脂肪干细胞的增殖率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一种人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，其特征在于，包含如下步骤：人体脂肪干细胞的提取步骤和人体脂肪干细胞的培养扩增步骤；
人体脂肪干细胞的提取通过包含如下步骤的方法实现：将人脂肪组织置于入离心分离装置中，再加入生理盐水置完全浸没后充分搅拌均匀，使用离心装置分离人体脂肪组织，得上层油层、中层脂肪层、下层沉积层；将中层脂肪层置于离心分离装置中，添加等体积的人脂肪消化液混合均匀，离心分离后去浮游脂肪并取上层液体，再向上层液体中加入Dulbecco’s磷酸盐缓冲液，然后离心，取下层沉积细胞，使用Dulbecco’s磷酸盐缓冲液重复离心洗涤2次，下层沉积细胞即为人体脂肪干细胞；将下层沉积层置于离心分离装置中，加入等体积的人脂肪消化液混合均匀，离心后的下层沉积细胞即为人脂肪干细胞；最后将中层脂肪层得到的人体脂肪干细胞与下层沉积层得到的人体脂肪干细胞合并；
所述的人脂肪消化液包含：0.3~0.8 mg/ml胆酸、0.5~1.5 mg/ml甘氨酸、0.5~2.5 mg/ml α1-抗胰蛋白酶、3~25μl/ml二甲基亚砜、175~220mg/mL 0.9% 生理盐水、60~85 mg/ml氯化镁、10~30mg/mL氯化胆碱、2.5~7.5mg/mlTrypsin-EDTA；
人体脂肪干细胞的培养扩增通过包含如下步骤的方法实现：取第13~16代传代人脂肪干细胞以1.5×104/cm2的密度接种于含DMEM/F12基础培养基的培养瓶中，先在DMEM/F12基础培养基的培养瓶中，35~38℃下，5~7%CO2培养10~15小时；然后更换脂肪干细胞培养基，35~38℃下，5~7% CO2继续培养30~35小时；得扩增后的人体脂肪干细胞；
所述的脂肪干细胞培养基包含：DMEM/F12基础培养基、8~20μg/ml甲状腺素、5~10μg/ml胰岛素、8~12mmol/L谷氨酰胺、100~300ng/ml葡萄酸铁、10~25mg/ml硒酸钠、5~18mg/ml维生素C、20~30mg/ml成纤维细胞生长因子、5~13mg/ml L-脯氨酸、0.5~4.5mg/ml氯化胆碱、1~2mg/ml青霉素。
2.根据权利要求1所述人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，其特征在于，所述人体脂肪干细胞的提取通过一种人脂肪消化液实现，所述的人脂肪消化液包含：0.5~0.7 mg/ml胆酸、0.8~1.2 mg/ml甘氨酸、1~2 mg/ml α1-抗胰蛋白酶、10~18μl/ml二甲基亚砜、200~210mg/mL 0.9%生理盐水、70~80 mg/ml氯化镁、15~25 mg/mL氯化胆碱、4~6mg/ml Trypsin-EDTA。
3.根据权利要求1所述人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，其特征在于，所述人体脂肪干细胞的提取通过一种人脂肪消化液实现，所述的人脂肪消化液包含：0.6 mg/ml胆酸、1 mg/ml甘氨酸、1.5mg/ml α1-抗胰蛋白酶、15μl/ml二甲基亚砜、205 mg/mL 0.9%生理盐水、75 mg/ml氯化镁、20 mg/mL氯化胆碱、5 mg/ml Trypsin-EDTA。
4.根据权利要求1所述人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，其特征在于，所述的人体脂肪干细胞的培养扩增通过一种脂肪干细胞培养基实现，所述的脂肪干细胞培养基包含：DMEM/F12基础培养基、12~16μg/ml甲状腺素、6~9μg/ml胰岛素、9~11mmol/L谷氨酰胺、150~250ng/ml葡萄酸铁、15~20mg/ml硒酸钠、10~15mg/ml维生素C、22~28mg/ml成纤维细胞生长因子、7~10mg/ml L-脯氨酸、1~3.5mg/ml氯化胆碱、1.2~1.8mg/ml青霉素。
5.根据权利要求1所述人体脂肪干细胞的提取及培养扩增方法，其特征在于，所述的人体脂肪干细胞的培养扩增通过一种脂肪干细胞培养基实现，所述的脂肪干细胞培养基包含：DMEM/F12基础培养基、14μg/ml甲状腺素、8μg/ml胰岛素、10 mmol/L谷氨酰胺、200 ng/ml葡萄酸铁、18mg/ml硒酸钠、12mg/ml维生素C、25mg/ml成纤维细胞生长因子、9mg/ml L-脯氨酸、2.5mg/ml氯化胆碱、1.5 mg/ml青霉素。
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Denomination of invention: A Method for Extracting and Cultivating Human Adipose Stem Cells

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Granted publication date: 20210824

Pledgee: Hunan Pingjiang Rural Commercial Bank Co.,Ltd.

Pledgor: Chen Zhongping|Lancy Purcell Biotechnology (Guangzhou) Co.,Ltd.

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